DE60014887T3

DE60014887T3 - Analyseverfahren zur feststellung der prädisposition eines patienten auf mindesens eine erkrankung sowie geeignete amplifizierung für ein solches verfahren

Info

Publication number: DE60014887T3
Application number: DE60014887T
Authority: DE
Inventors: Bruno Mougin; Jean-Marie Tiercy
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1999-05-20
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2009-09-24
Anticipated expiration: 2020-05-20
Also published as: DE60014887T2; BR0010739A; DE60014887D1; EP1179091B2; FR2793809A1; WO2000071750A1; ATE279535T1; FR2793809B1; EP1179091A1; AU772175B2; EP1179091B1; ES2230109T3; JP2003500067A; CA2374440A1; CN1351672A; ES2230109T5; US7060438B1; AU4766000A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse der genetischen Prädisposition eines Patienten für mindestens rheumatoide Polyarthritis.
Jedes Individuum verfügt über ein eigenes genetisches Erbe, das es von seinen Vorfahren geerbt hat. Dieser besondere genetische Kontext kann manchmal aktiv an dem Auftreten und/oder an der Entwicklung bestimmter Erkrankungen beteiligt sein: Infektionen durch ein pathogenes Mittel (zum Beispiel AIDS-Virus), Autoimmunerkrankungen (zum Beispiel rheumatische Erkrankungen). Die Gene des Haupt-Histokompatibilitätskomplexes (MHC), insbesondere die Gene, welche für die HLA-Antigene (humane Leukozytenantigene) codieren, spielen bei der Entwicklung von Gelenksautoimmunerkrankungen wie der rheumatoiden Polyarthritis (Lawrence, 1970; Stastny, 1978; Khan, 1979; Stastny, 1983; Gregersen, 1986; Gregersen, 1987; Stastny, 1988; Todd, 1988; Wordsworth, 1989; Nepom, 1989; Hiraiwa, 1990; Nepom, 1991) oder der Spondylitis ankylosans (Brewerton, 1973; Schlosstein, 1973; Benjamin, 1990) eine maßgebliche Rolle.
Ein wichtiger Teil des genetischen Bestandteils der Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis konnte mit den HLA-DRB-Genen in Zusammenhang gebracht werden, welche für die β-Kette der HLA-DR-Moleküle codieren, die bei der Präsentation der Peptide gegenüber den T-Lymphozyten beteiligt sind, wobei es sich hierbei um eine entscheidende Funktion im Bereich der Mechanismen zur Regulierung der Immunreaktion handelt. Genauer gesagt wurde nachgewiesen, dass das Vorhandensein einer speziellen Sequenz von fünf Aminosäuren, welche den Positionen 70 bis 74 der dritten hypervariablen Region der HLA-DRβ1-Moleküle entsprechen, bei verschiedenen Allelen festgestellt wurde, von welchen berichtet wurde, dass sie mit rheumatoider Polyarthritis in Zusammenhang stehen. Die Einbindung dieses „geteilten Epitops”, das den Sequenzen QKRAA oder QRRAA oder RRRAA Einbuchstabencode der Aminosäuren) entspricht, ist von nun an gut dokumentiert. Diese molekulare Erklärung ist auch mit der Beobachtung einer allmählichen Ernsthaftigkeit der Erkrankung kohärent, wenn der Genotyp kein, eines oder zwei Empfänglichkeits-Allele umfasst, die allgemeinhin als Dosiswirkung bezeichnet werden.
Spondylitis ankylosans ist eine weitere Entzündungskrankheit, bei der ein sehr starker Zusammenhang mit dem HLA-B27-Antigen (relatives Risiko: 69,1) festgestellt wird (Baarsma, 1992). Im Jahr 1977 hat Schlosstein den starken Zusammenhang zwischen HLA-B27 und verschiedenen Spondylarthropathien (Schlosstein, 1977) veröffentlicht. Verschiedene Hypothesen werden angeführt, um diesen Zusammenhang zu erklären, wobei wieder die Präsentationsfunktion von spezifischen Peptiden der HLA-B27-Moleküle einbezogen wird.
Ein positiver Zusammenhang wurde auch zwischen HLA-B27 und akuter vorderer Uveitis (relatives Risiko: 8,2) veröffentlicht.
Der Nachweis von HLA-B27-Antigen(en) ist von bestimmtem klinischem Interesse, wie die gängige Praxis dieser Analyse bei Rheumatologie-Untersuchungen belegt.
Der Nachweis von HLA-B*27-Allel(en) ist auch unter Verwendung der Techniken der Molekularbiologie zur Amplifikation und zur Analyse der spezifischen Regionen möglich, die von Interesse sind.
So hat Weiss im Jahre 1985 die Organisation, die Sequenz und die Expression des HLA-B27-Gens veröffentlicht. Im Jahre 1991 hat Hill eine Amplifikationstechnik durch PCR der polymorphen Regionen des HLA-B-Gens und den Nachweis von HLA-B*2703 durch Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde (Hill, 1991) veröffentlicht. Im Jahre 1992 hat Dominguez die Beschreibung des ersten Verfahrens zur Genotypisierung von B27 nach Amplifikation durch PCR der polymorphen Regionen des HLA-B-Gens veröffentlicht.
Zurzeit erfolgt in Bezug auf die rheumatoide Polyarthritis die Identifikation von Empfänglichkeits-Allel(en) im Allgemeinen routinemäßig im Laufe einer HLA-DR-Typisierung mit schwacher Auflösung oder generisch, was insbesondere den Nachweis von HLA-DR4-Antigen(en) oder HLA-DRB1*gr04-Allel(en) ermöglicht.
Diese Tests werden von Zentren durchgeführt, die auf die Studie von HLA-Genen spezialisiert sind, wie Zentren zur Bluttransfusion oder bestimmte Spezialkrankenhäuser. Diese Identifikation erfordert somit das Verschicken einer Probe und die Verwendung einer ziemlich schweren Technologie. Daraus ergeben sich zahlreiche negative Folgen, wie zum Beispiel:

– das Risiko, die Probe zu verlieren,
– die lange Dauer der Identifikation,
– die relativ hohen Kosten für die Identifikation und
– das Fehlen von Kontrolle durch den Auftraggeber gegenüber dem Leistungserbringer.

Der Stand der Technik ist in Bezug auf die Zusammenhänge zwischen HLA-DR und rheumatoider Polyarthritis, welche eine Molekularbiologie-Technologie verwenden, sehr begrenzt.
Im Rahmen der Spondylitis ankylosans besteht der Stand der Technik im Wesentlichen aus Immunologie-Techniken. Das ist bei der Patentanmeldung WO-A-95/30152 der Fall, welche die Identifikation des B27-Antigens ermöglicht.
Somit wird in Bezug auf die Spondylitis ankylosans eine einfache Suche nach dem HLA-B27-Antigen für gewöhnlich unter Verwendung einer serologischen Technik durchgeführt (Flusscytometrie oder Cytotoxizität, mit einem spezifischen Anti-B27-Antikörper).
Diese Techniken sind schnell, aber manchmal werden aufgrund der Maskierung der B27-Antigene durch Autoantikörper oder Peptide (Neumüller, 1993; Kirveskari, 1997) fälschlich negative Reaktionen beobachtet. Zudem sind, wie bei jeder Technik zur Analyse von Antigenen, die an der Oberfläche der Lymphozyten exprimiert sind, Vorkehrungsmaßnahmen zur ordnungsgemäßen Aufbewahrung der Zellen erforderlich, und manchmal sind diese Maßnahmen einschränkend.
Ferner besteht auf diesem Gebiet der Stand der Technik auch aus Molekularbiologie-Techniken. Somit betrifft die US-Patentschrift US-A-4,971,902 diagnostische Sonden für die Prädisposition eines Patienten für rheumatoide Polyarthritis. Diese Sonden beruhen auf der Erkennung der Gruppe der DRB1*gr04-Allele.
Wenngleich diese Gruppe von DRB1*gr04-Allelen in der Tat mit rheumatoider Polyarthritis zusammenhängt, stehen nicht alle zurzeit bekannten Allele (DRB1*gr0401 bis DRB1*gr0427) unbedingt mit dieser Erkrankung in Zusammenhang. Daraus kann sich ergeben, dass – wenn man sich auf eine Typisierung der Gruppe der DRB1*gr04-Allele beschränkt, in Funktion der vorhandenen Allele – man abgesehen von echten positiven oder echten negativen falsche positive Ergebnisse erzielen kann, welche unnötigerweise den Arzt und den Patienten beunruhigen.
Ob es sich nun um eine serologische Technik (Analyse der DR-Antigene mit Hilfe einer Batterie an Seren mit bekannter Spezifizität: Resultate dargelegt gemäß der Nomenklatur DR1 bis DR10) oder um eine Molekularbiologietechnik (Analyse der DRB1:Allele: Resultate darge legt gemäß der Nomenklatur DRB1*01 bis DRB1*10) handelt, der Kliniker interessiert sich im Wesentlichen für das Vorhandensein von DR4-Antigen(en) oder DRB1*gr04-Allel(en), eventuell mit der Information „Wirkungsdosis”.
Im Fall von Resultaten, welche eine Prädisposition für eine Erkrankung vermuten lassen, wird im Allgemeinen ein zweiter Test unter Anwendung einer Molekularbiologietechnik mit hoher Auflösung als Subtypisierung von DR4 durchgeführt, um das Allel DRB1*gr04 (DRB1*gr0401 bis gr0427 gemäß der offiziellen Nomenklatur im Jahr 1998) zu präzisieren, wobei nur von den Allelen DRB1*gr0401, gr0404, gr0405 und gr0408 berichtet wird, dass sie mit der Erkrankung in Zusammenhang stehen.
Diese Tests sind verlässlich, dauern aber lange, mehrere Tage, und sind teuer.
Das beanspruchte Analyseverfahren ermöglicht eine vereinfachte Analyse in der Praxis, das schneller durchgeführt werden kann, in weniger als zwei Stunden, nach der Zubereitung der Amplikons, und das wenig kostet.
Vor diesem Hintergrund betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Analyse der genetischen Prädisposition eines Patienten für rheumatoide Polyarthritis, umfassend: das Einsetzen einer flüssigen Probe, die mindestens einen Typ von Amplikons enthält, die aus der Amplifikation mindestens einer polymorphen Region von Interesse im Hinblick auf rheumatoide Polyarthritis hervorgehen, in Gegenwart von Sonden, die auf folgende Weise ausgewählt werden:

– mindestens eine Sonde mit schwacher Auflösung, die mit der Gruppe der DRB1*gr04-Allele hybridisieren kann,
– mindestens eine Sonde mit hoher Auflösung, die mit der genetischen Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis zusammenhängt und die mit den folgenden Allelen hybridisieren kann: DRB1*0101, DRB1*gr0401, DRB1*gr0404, DRB1*gr0405, DRB1*gr0408 und DRB1*1402,
– mindestens eine Sonde mit hoher Auflösung, die mit der genetischen Resistenz gegen rheumatoide Polyarthritis zusammenhängt und die mit den folgenden Allelen hybridisieren kann: DRB1*gr0402, DRB1*gr0403, DRB1*gr0406 und DRB1*gr0407,

Zum Nachweis des Vorliegens eines anderen Allels, wenn ein einziges Allel des Gens oder der Gruppe von Allelen dieses Gens nachgewiesen wurde, durch mindestens eine spezifische Typisierungssonde mit schwacher Auflösung, die der/den anderen Gruppe(n) von Allelen entspricht, umfasst das Verfahren das Einsetzen der Amplikons in Gegenwart mindestens einer Sonde, die für das mindestens eine andere Allel spezifisch ist, das dem Polymorphismus des Gens oder der Gruppe von Allelen dieses Gens entspricht, das/die von der oder den schwach auflösenden Sonde(n) nachgewiesen wurde.
Jede Sonde mit schwacher oder hoher Auflösung, die für die gesuchte(n) Erkrankung(en) spezifisch ist, umfasst mindestens ein für die gesuchte(n) Erkrankung(en) spezifisches Motiv.
Ferner wird mindestens eine Sonde mit schwacher Auflösung verwendet, die mit der Gruppe der DRB1*01-Allele und dem Allel DRB1*10 hybridisieren kann.
Für den Fall, dass gewünscht wird, das Vorliegen eines anderen Allels nachzuweisen, wenn ein einziges Allel der Gruppe der DRB1*gr04-Allele nachgewiesen wurde, verwendet man mindestens eine Sonde, die mit folgenden Allelen hybridisieren kann: DRB1*02, DRB1*03, DRB1*07, DRB1*08, DRB1*09, DRB1*11, DRB1*12, DRB1*13 und DRB1*14.
Was die Sonden im Hinblick auf diese Allelen anbelangt, verwendet man:

– eine Sonde SEQ ID NR 3 zur Typisierung von DRB1*gr04,
– zwei Sonden mit hoher Auflösung, die mit der genetischen Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis zusammenhängen:
– SEQ ID NR 4 für DRB1*gr0401,
– SEQ ID NR 7 für DRB1*0101, DRB1*gr0404, DRB1*gr0405 und DRB1*gr0408, DRB1*1402,
– zwei Sonden mit hoher Auflösung, die mit der genetischen Resistenz gegen rheumatoide Polyarthritis zusammenhängen:
– SEQ ID NR 5 für DRB1*gr0402 und
– SEQ ID NR 6 für DRB1*gr0403, DRB1*gr0406, DRB1*gr0407.

Genauer gesagt wird auch eine Sonde mit hoher Auflösung, SEQ ID NR 8, verwendet, die für DRB1*gr0405 spezifisch ist, das mit der genetischen Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis zusammenhängt.
Ferner werden zur Typisierung die beiden folgenden Sonden verwendet:

– SEQ ID NR 11 für die Gruppe der DRB1*01-Allele und
– SEQ ID NR 15 für das Allel DRB1*10.

Für den Fall, dass gewünscht wird, das Vorliegen eines anderen Allels nachzuweisen, wenn ein einziges Allel der Gruppe der DRB1*gr04-Allele nachgewiesen wurde, werden die folgenden vier Typisierungssonden verwendet:

– SEQ ID NR 13 für DRB1*02,
– SEQ ID NR 14 für DRB1*07, DRB1*09,
– SEQ ID NR 16 für DRB1*08, DRB1*12 und
– SEQ ID NR 12 für DRB1*03, DRB1*11, DRB1*13, DRB1*14.

Jedenfalls trägt jede Sonde mit schwacher oder hoher Auflösung, die für Allele der genetischen Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis und andere, damit zusammenhängende Erkrankungen spezifisch ist, eines der folgenden charakteristischen Motive: QKRAA, QRRAA oder RRRAA.
Mindestens eine Kontrollsonde, die mit der Gesamtheit der DRB1-Gene hybridisieren kann, wird verwendet, um den Nachweis aller DRB1-Gene zu ermöglichen, zum Beispiel SEQ ID NR 1: TTC GAC AGC GAC GTG GGG.
Wenn ferner Allele der genetischen Empfänglichkeit für Spondylitis ankylosans und andere, damit zusammenhängende Erkrankungen nachgewiesen werden sollen, wird mindestens eine Sonde mit schwacher Auflösung verwen det, wie SEQ ID NR 10, die mit dem Gen HLA-B hybridisieren kann und die für die Gruppe der HLA-B27-Allele spezifisch ist.
Wenn ferner die genetische Empfänglichkeit in Zusammenhang mit disseminiertem Lupus erythematodes, Konnektivitiden, Sjögren-Syndrom und anderen, damit zusammenhängenden Erkrankungen nachgewiesen werden soll, wird mindestens eine Sonde mit schwacher Auflösung verwendet, wie SEQ ID NR 19, die mit dem Gen HLA-DR hybridisieren kann und die für die Gruppe der HLA-DRB1*03-Allele spezifisch ist.
Ungeachtet des gesuchten Nachweises werden höchstens 38,89% der Basen einer gleichen Sonde mit schwacher Auflösung oder mit hoher Auflösung durch mindestens eine analoge Base, wie Inosin, ersetzt.
Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens wird jede spezifische Sonde mit schwacher Auflösung oder hoher Auflösung unabhängig von den anderen Sonden in einen Brunnen einer Mikrotiterplatte eingebracht.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens werden alle Reaktionen gleichzeitig durchgeführt.
Vor dem oben dargestellten Verfahren wird mindestens eine Amplifikation der polymorphen Region(en) von Interesse durchgeführt.
Eine Amplifikation der polymorphen Region(en) von Interesse, die mit HLA-DR zusammenhängt/zusammenhängen, und eine Amplifikation der polymorph(en) Region(en) von Interesse, die mit HLA-B zusammenhängt/zusammenhängen, werden gleichzeitig durchgeführt.
Gemäß einer Ausführungsform wird eine zweite Amplifikation mindestens einer gezielteren Region als die bereits an der polymorphen Region durchgeführte durch geführt, wobei die gezieltere Region eine Region von Interesse im Hinblick auf rheumatoide Polyarthritis ist, und es werden die in Anwesenheit der vorstehend definierten Sonden erhaltenen Amplikons eingesetzt.
Gemäß dieser Ausführungsform wird die erste Amplifikation gleichzeitig mit oder vor der zweiten gezielteren Amplifikation durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Amplifikation einer Sequenz, die den Gruppen der DRB1*gr04-Allele entspricht, im Hinblick auf ihre Verwendung bei einem Verfahren zur Analyse der genetischen Prädisposition eines Patienten für rheumatoide Polyarthritis, umfassend die Verwendung von SEQ ID NR 20-Fragmenten in Kombination mit SEQ ID NR 21-Fragmenten.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine zusätzliche Amplifikation einer Sequenz, die dem Allel B27 entspricht, im Hinblick auf ihre Verwendung bei einem Verfahren zur Analyse der genetischen Prädisposition eines Patienten für Spondylitis ankylosans, umfassend die Verwendung von SEQ ID NR 22-Fragmenten, SEQ ID NR 23-Fragmenten und/oder SEQ ID NR 25-Fragmenten in Kombination mit SEQ ID NR24-Fragmenten und/oder SEQ ID NR 26-Fragmenten.
Darüber hinaus kann die Erfindung darin bestehen, die zwei in den beiden vorhergehenden Absätzen beschriebenen Amplifikationen im Hinblick auf ihre Verwendung bei einem Verfahren zur Analyse der genetischen Prädisposition eines Patienten für rheumatoide Polyarthritis und/gegebenenfalls Spondylitis ankylosans zu kombinieren.
In diesem Fall ist die Amplifikation, bei der die Endkonzentration an Fragmenten, welche die Amplifikation der Sequenz ermöglicht, die den Gruppen der DRB1*gr04-Allele entspricht, größer als die Endkonzentration an Fragmenten, welche die Amplifikation der Sequenz ermöglicht, die dem B27-Allel entspricht.
In einer Ausführungsform hängt die vorstehende Amplifikation mit der Amplifikation einer Sequenz zusammen, welche einer gezielteren Region entspricht, die im Allel DRB1*gr04 enthalten ist, umfassend die Verwendung der SEQ ID NR 21-Fragmente in Kombination mit SEQ ID NR 27-Fragmenten.
Die beiliegenden Beispiele werden beispielhaft und zur Erläuterung angeführt und haben somit keinerlei einschränkenden Charakter. Sie erleichtern das Verständnis der Erfindung.
Es handelt sich hierbei um ein Verfahren zur Analyse von genetischen Prädispositionen eines Individuums für rheumatoide Polyarthritis, mit Hilfe einer Molekularbiologietechnik, welche die gleichzeitige Analyse mehrerer Gene ermöglicht. Dieses Verfahren kann vorteilhafterweise bei der Analyse von genetischen Prädispositionen eines Individuums für diese Erkrankung und gegebenenfalls eine Gesamtheit von verwandten Erkrankungen verwendet werden, die mit einem oder mehreren Genen zusammenhängt/zusammenhängen. Dieses Verfahren kann bei der Analyse von genetischen Prädispositionen eines Individuums für rheumatoide Polyarthritis und gegebenenfalls für Spondylitis ankylosans verwendet werden.
Die Aufgabe des Verfahrens besteht darin, in einem Schritt mit einem einzigen Mehrfachtest eine vollständige Gesamtheit an Informationen zu erhalten, die von klinischem (diagnostischem, prognostischem Interesse und von Interesse für die therapeutische Ausrichtung) Interesse sind. Das Verfahren setzt sich aus mehreren Schritten zusammen:

1) Extraktion von Nukleinsäuren ausgehend von einer biologischen Probe, die dem Individuum entnommen wird,
2) Amplifikation der Regionen von Interesse, für welche ein Polymorphismus, der mit einer genetischen Prädisposition für eine Erkrankung in Zusammenhang steht, beschrieben wurde, und
3) gleichzeitige Analyse der Amplikons, unter Verwendung einer Gesamtheit von Hybridisierungsreaktionen, wobei ein Satz an Molekularsonden verwendet wird, welche die genaue Analyse von Allelen oder bestimmten Gruppen von Allelen ermöglichen.

I – BEISPIEL FÜR DIE GLEICHZEITIGE ANALYSE DER GENETISCHEN PRÄDISPOSITIONEN EINES INDIVIDUUMS FÜR RHEUMATOIDE POLYARTHRITIS UND SPONDYLITIS ANKYLOSANS:
1) EXTRAKTION VON DESOXYRIBONUKLEINSÄUREN (DNS) AUSGEHEND VON EINER PERIPHEREN BLUTPROBE
Diese Extraktion wird auf durchwegs klassische Weise durchgeführt. In der Tat kann eine beliebige Technik zur DNS-Extraktion verwendet werden, die es ermöglicht, aus dem Material, das geeignet ist, durch ein Amplifikationsverfahren wie die Polymerasekettenreaktion (PCR) weiter amplifiziert zu werden. Diese Techniken zum Lysieren von Zellen, mit Extraktion und anschließender Reinigung der Nukleinsäuren, sind für gewöhnlich jene, die für genetische Analysen empfohlen werden, oder schnelle Techniken, bei denen kommerzielle Produkte verwendet werden, wie zum Beispiel QIAmp Blood Kit (eingereichte Marke) von QIAGEN S. A.
2) GLEICHZEITIGE AMPLIFIKATION DURCH PCR
Diese Amplifikation betrifft folgende Genorte:

– Genort HLA-DR: enthält die Region des Exons 2, entsprechend den Codonen 5 bis 94 gemäß offizieller Nomenklatur, der Gene HLA-DRB,
– Genort HLA-B: enthält die Region des Exons 2, entsprechend den Codonen 25 bis 114 gemäß offizieller Nomenklatur, des Gens HLA-B.

Untenstehende Tabelle 1 beschreibt die Fragmente, die bei der Amplifikation der zwei zuvor beschriebenen Genorte verwendet werden. Ferner wird darin die Gesamtheit der physikalisch-chemischen Bedingungen angeführt, welche die Durchführung der Amplifikation ermöglichen.
Tabelle 1: gleichzeitige Amplifikation der Regionen von Interesse HLA-DR und HLA-B

(*): Puffer 10X TEMAG: 500 mM TrisHCl pH-Wert 8,8, 150 mM Sulfatammonium, 15 mM MgCl₂, 500 μM EDTA, 0,1 Gelatine

3) GLEICHZEITIGE ANALYSE DER AMPLIKONS
Bei dieser Analyse wird eine Gesamtheit von Hybridisierungsreaktionen verwendet, bei denen ein Satz an Oligonukleotidsonden zum Einsatz kommt, welche eine genaue Analyse von Allelen oder Gruppen von Allelen HLA-DRB1 und HLA-B*27 ermöglichen, die insbesondere für die Untersuchung der genetischen Prädisposition für rheumatoide Polyarthritis und Spondylitis ankylosans wichtig sind.
Tabelle 2 beschreibt die Gesamtheit der Sonden, die verwendet werden, um die zwei Erkrankungen nachzuweisen. Die darin gemachten Angaben sind von links nach rechts wie folgt:

– die Referenz der in der HLA-Nomenklatur zugewiesenen Sonde,
– die in diesem Dokument zugewiesene Nummer der Sequenz,
– das betreffende HLA-Gen,
– die Sequenz, welche die Sonde darstellt und
– die Lokalisierung der Codone (drei Nukleotide) auf den HLA-Genen.

(*) Sonde, die dem nicht-codierenden Zusatzstrang entspricht

Bei bestimmten Sonden wird durch eine zweite Sequenz in Kursivschrift die natürliche Sequenz präzisiert, das heißt die Sequenz, die ausschließlich aus den vier Nukleotiden Adenosin (A), Thymin (T), Guanin (G) und Cytosin (C) besteht. Die anderen Sequenzen übernehmen dieselben Nukleotide, außer, dass einige durch andere Nukleotide ersetzt werden. Im vorliegenden Fall handelt es sich um Inosin.
Bestimmte Sequenzen enthalten kein Inosin, das ist der Fall bei SEQ ID NR 1, 2, 3, 8, 9, 11, 12, 13, 15, 17 und 18. Andere enthalten wenig davon, das ist der Fall bei SEQ ID NR 19, wo ein Inosin auf insgesamt sechzehn Nukleotide kommt, das sind 6,25% Unterschied im Hinblick auf die Basissequenz. Andere enthalten viel mehr davon, wie zum Beispiel SEQ ID NR 6, wo sieben Inosine auf insgesamt achtzehn Nukleotide kommen, das sind ungefähr 38,89% Unterschied im Hinblick auf die Basissequenz.

Die Verwendung der Inosine ermöglicht es, die Spezifizität der Sonden gegenüber den Sequenzen, mit denen sie hybridisieren, noch weiter zu verbessern. Die Spezifizität der Fangsonden wird in nachstehender Tabelle 3 genau angeführt.

Sonde	SEQ ID NR	Spezifizität
C+	1	alle DRB1*
C–	2	keine
4	3	DRB1*gr04
QK71	4	DRB1*gr041, insbesondere ein Allel mit dem Motiv QKRAA, das dem geteilten Epitop entspricht
IDE71	5	insbesondere DRB1*gr0402
E74	6	insbesondere DRB1*gr0403, gr0406 und gr0407
QR71	7	DRB1*0101, gr0404, gr0405, gr0408 und 1402, insbesondere ein Allel mit dem Motiv QRRAA, welches dem geteilten Epitop entspricht
S57	8	insbesondere DRB1*gr0405
C + (B)	9	alle B*
327	10	insbesondere B*27
1	11	DRB1*01
52	12	insbesondere DRB1*03, 11, 13 und 14
2	13	DRB1*02
7 + 9	14	DRB1*07 und 09
10	15	DRB1*10
3	19	insbesondere DRB1*03
8 + 12	16	insbesondere DRB1*08 und 12

TABELLE 3: HAUPTSPEZIFIZITÄTEN DER FANGSONDEN

In der Tabelle 3 steht der Begriff „insbesondere” manchmal in Zusammenhang mit bestimmten Allelen. Dies erklärt sich dadurch, dass es andere Allele gibt. So wird bei SEQ ID NR 5 DRB1*gr0402 nachgewiesen, aber auch DRB1*gr0414. Letzteres ist sehr selten, so selten, dass bis dato keine Untersuchung durchgeführt wurde, um seine Gegenwart mit jener von rheumatoider Polyarthritis in Verbindung zu bringen. Dennoch besteht, da die Motive dieser zwei Allele im Bereich der polymorphen Regionen von Interesse ähnlich sind, eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass ihre Empfänglichkeit gegenüber dieser Erkrankung identisch ist.
Die Sonden D1 und D6, welche den SEQ ID NR 17 und 18 entsprechen, sind Nachweissonden.
Sie erkennen die beobachteten Regionen bei allen Allelen eines gleichen Gens. Somit wird die Sonde SEQ ID NR 17 in einer konservierten Region des HLA-DR-Gens ausgewählt, während die Sonde SEQ ID NR 18 in einer konservierten Region des HLA-B-Gens ausgewählt wird.
Diese Analyse der Sonden kann auf Mikrotiterplatten oder Mikroplatten durchgeführt werden, deren Format genormt ist. Diese Platten weisen isolierte Streifen mit acht Brunnen auf, die gemäß der Anzahl der auszuführenden Tests zusammengefügt werden können. Aus Gründen der Bequemlichkeit und aus Kostengründen ist die Verwendung von zwei Streifen pro Test vorteilhaft.
Das Ziel besteht darin, Resultate mit einem Minimum an Streifen zu erhalten, da die Herstellungskosten so gering wie möglich sein sollen, während gleichzeitig ein hohes Leistungsniveau erreicht werden muss. Das Minimum sind zwei Streifen.

Im Fall von rheumatoider Polyarthritis und Spondylitis ankylosans können somit zwei Streifen verwendet werden, die als R1 bzw. R2 bezeichnet werden. Während für den Streifen R1 eine Möglichkeit vorgeschlagen wird, sind im Fall von R2 zwei Möglichkeiten denkbar.

Streifen R1		Streifen R2		Streifen R2bis
C+	SEQ ID NR 1	C + (B)	SEQ ID NR 9	C + (B)	SEQ ID NR 9
C–	SEQ ID NR 2	B27	SEQ ID NR 10	B27	SEQ ID NR 10
4	SEQ ID NR 3	1	SEQ ID NR 11	1	SEQ ID NR 11
QK71	SEQ ID NR 4	52	SEQ ID NR 12	52	SEQ ID NR 12
IDE71	SEQ I NR 5	2	SEQ ID NR 13	2	SEQ ID NR 13
E74	SEQ ID NR 6	7 + 9	SEQ ID NR 14	3	SEQ ID NR 19
QR71	SEQ ID NR 7	10	SEQ ID NR 15	10	SEQ ID NR 7
S57	SEQ ID NR 8	8 + 12	SEQ ID NR 16	7 + 9 + 8+ 12	SEQ ID NR 14 und 16

TABELLE 4: ORGANISATION VON MEHRFACHTESTS (AUFTEILUNG DER SONDEN IN DEN BRUNNEN)

Der Streifen R1 umfasst eine positive Kontrolle (SEQ ID NR 1), welche es ermöglicht, alle Allele des DRB1*-Gens nachzuweisen, was wiederum ermöglicht, zu kontrollieren, ob die Amplifikation auch die Region von Interesse betroffen hat, die zwischen den Fragmenten P1 und P2 angeordnet ist, welche in Tabelle 1 beschrieben werden. Die negative Kontrolle (SEQ ID NR 2) hat keine diagnostische Aufgabe, sie ist nur da, um bestimmten Normen zu entsprechen. Diese Sequenz ist für HLA überhaupt nicht spezifisch und entspricht einer Zufallssequenz, die bei den HLA-Genen nicht gefunden wird.
Die SEQ ID NR 3 ermöglicht die Typisierung der Gesamtheit der Allele, welche die Gruppe DRB1*gr04 darstellt. Sie ermöglicht die Identifikation aller DRB1*gr04-Allele, der Allele, die zur Gruppe gehören, die durch die HLA-Typisierungstechniken mittels Serologie definiert werden, wie die Gruppe DR4. Es handelt sich um eine Sonde mit schwacher Auflösung, d. h., dass zahlreiche Allele durch sie erkannt werden können.
Die SEQ ID NR 4 bis 8 ermöglichen ihrerseits die Subtypisierung von bestimmten Allelen, welche die Gruppe DRB1*gr04 darstellen, genauer gesagt das oder die Allel(e), welche sich eine bestimmte Sequenz teilen. Es handelt sich um Sonden mit hoher Auflösung, d. h., dass einige Allele, sogar ein einzelnes, von einer der Sonden erkannt werden können.
Alle diese Sonden werden zum Nachweis von Allelen verwendet, welche das geteilte Epitop aufweisen, das mit der genetischen Prädisposition für rheumatoide Polyarthritis zusammenhängt. Genauer gesagt ermöglichen die Sonden SEQ ID NR 4 und 7 den Nachweis der Allele, die mit der Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis zusammenhängen, und die Sonden SEQ ID NR 5 und 6 ermöglichen den Nachweis der Allele, die mit der Resistenz gegen die rheumatoide Polyarthritis zusammenhängen. Die Sonde SEQ ID NR 8 ermöglicht es, das Vorliegen eines DRB1*gr0405-Allels zu bestätigen.
Der Streifen R2 umfasst eine positive Kontrolle (SEQ ID NR 9), welche es ermöglicht, die Amplikons nachzuweisen, welche dem Exon 2 des HLA-B Gens entsprechen, wodurch es möglich ist, zu kontrollieren, ob die Amplifikation tatsächlich die Region von Interesse betrifft, die zwischen den in Tabelle 1 beschriebenen Fragmenten P3 und P4 angeordnet ist.
Der Streifen umfasst weiterhin eine SEQ ID NR 10, welche den Nachweis der Gruppe der B*27-Allele ermög licht und die verwendet wird, um zu bestimmen, ob ein Individuum prädisponiert ist, eine Spondylitis ankylosans zu entwickeln.
Beim Rest besteht der Streifen aus Sonden mit schwacher Auflösung, nämlich den SEQ ID NR 11 bis 16, welche es ermöglichen, die Analyse der zwei Haplotypen jedes Individuums zu vervollständigen, insbesondere unter Angabe, ob das Vorliegen von Allelen für die Empfänglichkeit für oder die Resistenz gegen rheumatoide Polyarthritis, festgestellt durch den Streifen R1, einen oder beide Haplotypen betrifft (Dosiswirkung).
Gemäß dem Ausgleich zwischen dem Empfänglichkeits-Allel, dem Resistenz-Allel und dem neutralen Allel sind die Risiken in Bezug auf die Entwicklung einer mehr oder weniger starken rheumatoiden Polyarthritis unterschiedlich, und die zu ergreifenden therapeutischen Maßnahmen werden an die Diagnostik angepasst.
Im Fall des Streifens 2 bis wird im Wesentlichen dieselbe Konfiguration wie beim Streifen R2 übernommen, mit Ausnahme von zwei Modifikationen.
Erstens wurden zwei Reaktionen zusammengefasst. Somit enthält ein einziger Brunnen in seinem Inneren zwei unterschiedliche Sonden, nämlich SEQ ID NR 14 und SEQ ID NR 16.
Der somit befreite Brunnen ermöglicht die Zugabe einer neuen Sonde SEQ ID NR 19, die mit dem Vorliegen von DRB1*03 (DR3)-Allelen zusammenhängt. Es ist in der Tat ratsam, diese Gruppe von DRB1*03-Allelen getrennt identifizieren zu können, die – so wurde festgestellt – mit anderen Erkrankungen zusammenhängt, wie zum Beispiel mit disseminiertem Lupus erythematodes, Konnektivitiden, dem Sjögren-Syndrom, insulinabhängigem Diabetes.
4) ZUBEREITUNG DER REAGENZIEN, WELCHE DIE ANALYSE DER ZUBEREITETEN AMPLIKONS ERMÖGLICHEN
Das verwendete Prinzip der umgekehrten Hybridisierung ist jenes, das im Dokument WO-A-93/02213 der Anmelderin beschrieben wird. Kurz gesagt, werden die spezifischen Fangsonden passiv auf dem Polystyrol der Brunnen von auf Mikroplatten befestigten Streifen dank einer Modifikation ihres Endes 5' (Vorliegen einer Funktion-NH₂) absorbiert. Die Nachweissonden sind Oligonukleotide, die kovalent mit dem HRP-Enzym (Meerrettichperoxydase) dank einer Modifikation ihres Endes 5' (Vorliegen einer Funktion-NH₂) gekoppelt sind. Die Zusammensetzung des Hybridisierungspuffers wurde wie folgt modifiziert:

– 75 mM Na₂HPO₄, 2H₂O,
– 25 mM NaH₂PO₄, H₂O,
– pH-Wert 6,8,
– 500 mM NaCl,
– 2% PEG 4000,
– 0,65% Tween 20,
– 0,1% Gelatine,
– 0,14 g/l beschallte DNS,
– 0,001% Ciprofloxacinchlorhydrat und
– 0,02% Bromo-Nitro-Dioxan.

Ein Mehrfachtest besteht aus einem Streifen R1 und einem Streifen R2 oder R2bis, wie in Tabelle 4 beschrieben.
5) VERFAHRENSWEISE

1) Denaturierung der Amplikons: 100 μl Lösung zubereiteter Amplikons werden 10 μl Denaturierungsreagens (2 N NaOH) hinzugefügt. Inkubation über einen Zeitraum von 5 Minuten bei 18 bis 25°C.
2) Zugabe von 2 ml Hybridisierungspuffer, von 0,2 ml Lösemittel, welches die Nachweissonden enthält.
3) Verteilung des Gemisches zu 100 μl in jedem der sechzehn sensibilisierten Brunnen, welche einem Mehrfachtest entsprechen. Abdecken mit selbstklebender Folie.
4) Inkubation über einen Zeitraum von 60 Minuten im Trockenschrank bei 37°C (35 bis 39°C).
5) Beseitigung des nicht hybridisierten Materials durch Waschen bei 18 bis 25°C.
6) Entwickeln der enzymatischen Reaktion, indem 100 μl Substratlösemittel (OPD, Orthophenylendiamin) pro Brunnen aufgeteilt werden. Inkubieren über einen Zeitraum von 20 Minuten bei 18 bis 25°C, im Dunkeln.
7) Ablesen der Ergebnisse: direkt oder Registrierung der optischen Dichten (Ablesen bei 492 nm).
8) Interpretation der Ergebnisse.

II – BEISPIELE UND ERGEBNISSE
Die Ergebnisse, die mit unterschiedlichen Proben für die bekannte HLA-Typisierung erhalten wurden, werden nachstehend angeführt:
1) ERSTE PROBE

Die zwei folgenden Tabellen 5 und 6 stellen die Ergebnisse dar, die mit zwei Streifen, R1 und R2, erhalten wurden.

Streifen R1	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 1	> 2500	+
SEQ ID NR 2	-	–
SEQ ID NR 3	898	+
SEQ ID NR 4	256	+
SEQ ID NR 5	1	–
SEQ ID NR 6	0	–
SEQ ID NR 7	10	–
SEQ ID NR 8	9	–

TABELLE 5: STREIFEN R1

Streifen R2	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 9	> 2500	+
SEQ ID NR 10	0	–
SEQ ID NR 11	0	–
SEQ ID NR 12	0	–
SEQ ID NR 13	2044	+
SEQ ID NR 14	0	–
SEQ ID NR 15	1	–
SEQ ID NR 16	3	–

TABELLE 6: STREIFEN R2

Da ein Streifen R2 verwendet wird, sind zwei Analysen möglich.
Zunächst zeigt die HLA-DR-Analyse, dass:

– die Sonde SEQ ID NR 1 positiv ist: Die Amplifikation HLA-DR und der Hybridisierungstest haben ordnungsgemäß funktioniert;
– die Sonden SEQ ID NR 3 und SEQ ID NR 4 positiv sind: Ein DRB1*gr0401-Allel ist vorhanden, und
– die Sonde SEQ ID NR 13 positiv ist: Ein DRB1*02-Allel ist vorhanden.

Abschließend ist ein einziges Allel der Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis (DRB1*gr0401) vorhanden, wobei das zweite Allel DRB1*02 ist, was Neutralität gegenüber rheumatoider Polyarthritis beweist.
Zweitens zeigt die HLA-B-Analyse, dass:

– die Sonde SEQ ID NR 9 positiv ist: Die Amplifikation HLA-B und der Hybridisierungstest haben ordnungsgemäß funktioniert, und
– die Sonde SEQ ID NR 10 negativ ist: kein Vorliegen von Allel B*27.

Der Patient, dessen Probe getestet wurde, ist nicht für Spondylitis ankylosans empfänglich.
Die HLA-Typisierung dieser ersten Probe war:

– HLA-DRB1*gr0401/1602 und
– HLA-B*5701.

2) ZWEITE PROBE

Die zwei folgenden Tabellen 7 und 8 stellen die Ergebnisse dar, welche mit zwei Streifen, R1 und R2, erhalten wurden.

Streifen R1	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 1	> 2500	+
SEQ ID NR 2	0	–
SEQ ID NR 3	261	+
SEQ ID NR 4	0	–
SEQ ID NR 5	312	+
SEQ ID NR 6	0	–
SEQ ID NR 7	4	–
SEQ ID NR 8	0	–

TABELLE 7: STREIFEN R1

Streifen R2	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 9	> 2500	+
SEQ ID NR 10	0	–
SEQ ID NR 11	0	–
SEQ ID NR 12	0	–
SEQ ID NR 13	2300	–
SEQ ID NR 14	0	–
SEQ ID NR 15	0	–
SEQ ID NR 16	0	–

TABELLE 8: STREIFEN R2

Es gibt vier positive Sonden, und zwar:

– die Sonde SEQ ID NR 1: Die Amplifikation HLA-DR und der Hybridisierungstest haben gut funktioniert,
– die Sonde SEQ ID NR 3: Es liegt mindestens ein Allel DRB1*gr04 vor,
– die Sonde SEQ ID NR 5: Es liegt mindestens ein Allel DRB1*gr0402 vor, und
– die Sonde SEQ ID NR 9: Es liegt mindestens ein Allel B* vor, aber kein B*27, da die SEQ ID NR 10 negativ ist.

Es handelt sich somit um das Vorliegen eines DR4-Allels, aber eines Subtyps, der nicht an der genetischen Empfänglichkeit für die PR (DRB1*gr0402) beteiligt ist. Die Identifikation des zweiten Allels ermöglicht die Feststellung, dass es sich um DRB1*02 handelt.
Die HLA-Typisierung der dritten Probe ergab:

– HLA-DRB1*gr0402/02 und
– HLA-B, unterschiedlich von B*27.

3) DRITTE PROBE

Die folgenden zwei Tabellen 9 und 10 stellen die Ergebnisse dar, die mit zwei Streifen, R1 und R2, erhalten wurden.

Streifen R1	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 1	> 2500	+
SEQ ID NR 2	–	–
SEQ ID NR 3	4	–
SEQ ID NR 4	21	–
SEQ ID NR 5	1145	+
SEQ ID NR 6	0	–
SEQ ID NR 7	8	–
SEQ ID NR 8	0	–

TABELLE 9: STREIFEN R1

Streife R2bis	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 9	> 2500	+
SEQ ID NR 10	2228	+
SEQ ID NR 11	12	–
SEQ ID NR 12	1278	+
SEQ ID NR 13	877	+
SEQ ID NR 14	0	–
SEQ ID NR 15	0	–
SEQ ID NR 16	5	–

TABELLE 10: STREIFEN R2

Wie bei den zwei vorangegangenen Beispielen, sind zwei Analysen möglich.
Zunächst zeigt die HLA-DR-Analyse, dass:

– die Sonde SEQ ID NR 1 positiv ist: Die Amplifikation HLA-DR und der Hybridisierungstest haben ordnungsgemäß funktioniert,
– die Sonde SEQ ID NR 3 negativ ist: kein Vorliegen von DRB1*gr04-Allel,
– die Sonden SEQ ID NR 5 und SEQ ID NR 12 positiv sind: Ein Allel DRB1*11 oder 13 liegt vor, und
– die Sonde SEQ ID NR 13 positiv ist: Es liegt ein Allel DRB1*02 vor.

Abschließend gibt es kein Allel der Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis, die zwei DR-Allele wurden hingegen auf generischer Ebene identifiziert.
Zweitens zeigt die HLA-B-Analyse, dass:

– die Sonde SEQ ID NR 9 positiv ist: Die Amplifikation HLA-B und der Hybridisierungstest haben ordnungsgemäß funktioniert, und
– die Sonde SEQ ID NR 10 positiv ist: Es liegt mindestens ein Allel B*27 vor.

Die HLA-Typisierung dieser dritten Probe ergab:

– HLA-DRB1*02/1301 und
– HLA-B*27.

4) VIERTE PROBE
Die zwei folgenden Tabellen 11 und 12 stellen die Ergebnisse dar, die mit zwei Streifen, R1 und R2bis, erhalten wurden.

Die Konfiguration mit zwei Streifen, R1 und vor allem R2bis (siehe Tabelle 4), ermöglicht, zusätzlich zur Analyse der genetischen Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis und Spondylitis ankylosans, eine bessere Analyse der genetischen Empfänglichkeit für disseminierten Lupus erythematodes, Konnektivitiden, Sjögren-Syndrom und andere Erkrankungen, die während einer rheumatologischen Untersuchung festgestellt werden. Dies geschieht, indem in einem einzigen Brunnen die SEQ ID NR 14 und 16, welche die Sonden 7, 8, 9 und 12 enthalten, deren Spezifizitäten in Tabelle 3 beschrieben sind, kombiniert werden.

Streifen R1	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 1	> 2500	+
SEQ ID NR 2	0	–
SEQ ID NR 3	275	+
SEQ ID NR 4	241	+
SEQ ID NR 5	0	–
SEQ ID NR 6	0	–
SEQ ID NR 7	0	–
SEQ ID NR 8	0	–

TABELLE 11: STREIFEN R1

Streifen R2	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 9	> 2500	+
SEQ ID NR 10	0	–
SEQ ID NR 11	0	–
SEQ ID NR 12	1832	+
SEQ ID NR 13	2	–
SEQ ID NR 19	849	+
SEQ ID NR 15	0	–
SEQ ID NR 14 + 16	67	–

TABELLE 12: STREIFEN R2

Es gibt sechs positive Sonden, nämlich:

– die Sonde SEQ ID NR 1: Die Amplifikation HLA-DR und der Hybridisierungstest haben gut funktioniert,
– die Sonde SEQ ID NR 3: Es liegt mindestens ein Allel DRB1*gr04 vor,
– die Sonde SEQ ID NR 4: Es liegt mindestens ein Allel DRB1*gr0401 vor,
– die Sonde SEQ ID NR 9: Es liegt mindestens ein Allel B* vor, aber kein B*27, da die SEQ ID NR 10 negativ ist,
– die Sonde SEQ ID NR 12: Es liegt mindestens ein Allel DRB1*03, 11, 12 oder 14 vor, und
– die Sonde SEQ ID NR 19: Es liegt mindestens ein Allel DRB1*03 vor.

Es liegt somit ein Allel der genetischen Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis aufgrund des Vorliegens des Allels DRB1*gr0401 vor und ein Allel der genetischen Empfänglichkeit für dissemenierten Lupus erythematodes aufgrund des Vorliegens des Allels DRB1*03 beim Patienten. Es gibt kein Allel in Bezug auf B*27.
Die HLA-Typisierung der vierten Probe ergab:

– HLA-DRB1*gr0401/0301 und
– HLA-B, unterschiedlich von B*27.

III – OPTIMIERUNG DER ERGEBNISSE
Die Aufgabe bestand darin, die Bedingungen zu verbessern, unter denen die Amplifikation durchgeführt werden muss. Die optimalen Bedingungen werden in nachstehender Tabelle 13 angeführt.
Tabelle 13: gleichzeitige und optimierte Amplifikation

der Regionen von Interesse HLA-DR und HLA-B Die Unterschiede zwischen den Amplifikationsbedingungen der Tabelle 1 und der Tabelle 9 liegen somit in der Wahl der leicht geänderten Fragmente P3 und P4, in neuen Konzentrationen an Fragmenten P1, P2, P3 und P4 und in einer Änderung der Temperatur beim Amplifikationsprogramm. Die Auswirkungen dieser Modifikationen auf die Ergebnisse werden in den Tabellen 14, 15 und 16 genauer angeführt, welche jeweils einer anderen Probe von Patienten entsprechen.

	Ausgangsbedingungen	Optimierte Fragmente	Optimierte Amplifikation	Optimierte Fragmente und optimierte Amplifikation
SEQ ID NR 1	> 2500	> 2500	> 2500	> 2500
SEQ ID NR 2	0	0	0	0
SEQ ID NR 3	97	171	202	365
SEQ ID NR 4	52	95	59	42
SEQ ID NR 5	959	1552	966	1472
SEQ ID NR 6	0	0	0	0
SEQ ID NR 7	17	44	31	45
SEQ ID NR 8	0	16	0	3
SEQ ID NR 9	1237	1708	1627	1792
SEQ ID NR 10	211	363	394	414
SEQ ID NR 11	3	0	0	0
SEQ ID NR 12	882	895	737	791
SEQ ID NR 13	0	0	0	0
SEQ ID NR 14	0	0	0	0
SEQ ID NR 15	0	0	0	0
SEQ ID NR 16	0	0	0	0

Tabelle 14: vergleichende Untersuchung der ersten Probe

Die Typisierung der ersten Probe ergibt DRB1*gr0404/52.

	Ausgangsbedingungen	Optimierte Fragmente	Optimierte Amplifikation	Optimierte Fragmente und optimierte Amplifikation
SEQ ID NR 1	789	1335	1240	1914
SEQ ID NR 2	0	0	0	0
SEQ ID NR 3	353	649	635	944
SEQ ID NR 4	14	49	45	102
SEQ ID NR 5	104	232	228	463
SEQ ID NR 6	0	0	0	0
SEQ ID NR 7	0	0	0	0
SEQ ID NR 8	0	0	0	0
SEQ ID NR 9	1822	> 2500	2120	2240
SEQ ID NR 10	0	0	0	0
SEQ ID NR 11	0	0	0	0
SEQ ID NR 12	0	0	0	0
SEQ ID NR 13	1	5	2	1
SEQ ID NR 14	0	0	0	0
SEQ ID NR 15	0	0	0	0
SEQ ID NR 16	0	0	3	0

Tabelle 15: vergleichende Untersuchung der zweiten Probe

Die Typisierung der zweiten Probe ergibt DRB1*gr0401/gr0402.

	Ausgangsbedingungen	Optimierte Fragmente	Optimierte Amplifikation	Optimierte Fragmente und optimierte Amplifikation
SEQ ID NR 1	615	1156	1052	2098
SEQ ID NR 2	0	0	0	0
SEQ ID NR 3	429	691	679	1381
SEQ ID NR 4	0	0	0	0
SEQ ID NR 5	0	0	0	0
SEQ ID NR 6	8	23	17	66
SEQ ID NR 7	14	26	21	66
SEQ ID NR 8	64	174	131	405
SEQ ID NE 9	1348	2377	2089	2191
SEQ ID NR 10	296	622	567	490
SEQ ID NR 11	0	0	0	0
SEQ ID NR 12	0	0	0	0
SEQ ID NR 13	3	0	1	0
SEQ ID NR 14	0	0	0	0
SEQ ID NR 15	0	0	0	0
SEQ ID NR 16	0	2	0	0

Tabelle 16: vergleichende Untersuchung der dritten Probe

Die Typisierung der dritten Probe ergibt DRB1*gr0403/gr0405.
Alle diese Werte sind DO-Werte, multipliziert mit tausend (DO × 1000). Da der maximale lesbare Wert bei 2,5 liegt, wird – wenn die Ziffer über diesem Wert liegt – lediglich angezeigt, dass der Wert höher als 2500 ist (> 2500).
Es wird festgestellt, dass alle der am höchsten ausgefallenen entscheidenden Werte durch Fettdruck hervorgehoben sind. Es handelt sich dabei ausschließlich um positive Sonden. Bei der ersten Probe sind von den sieben entscheidenden Werten alle aus Bedingungen hervorgegangen, die im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen optimiert waren. Drei hängen mit der Optimierung der Fragmente und vier mit der Optimierung der Fragmente und der Amplifikation zusammen. Bei der zweiten Probe sind von den fünf entscheidenden Werten alle aus Bedingungen hervorgegangen, die im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen optimiert waren. Einer hängt mit der Optimierung der Fragmente zusammen und vier hängen mit der Optimierung der Fragmente und der Amplifikation zusammen. Bei der dritten Probe sind von den sieben entscheidenden Werten alle aus Bedingungen hervorgegangen, die im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen optimiert waren. Zwei hängen mit der Optimierung der Fragmente und fünf mit der Optimierung der Fragmente und der Amplifikation zusammen.
Die alleinige Optimierung der Amplifikation ist weniger gerechtfertigt als die alleinige Optimierung der Fragmente oder die Optimierung der Fragmente und der Amplifikation. Dennoch ist festzustellen, dass bei den Sequenzen, die den neunzehn entscheidenden Werten entsprechen, achtzehn zugunsten der Optimierung der Amplifikation im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen ausfallen.
Wenn man die Amplifikationstechniken gemäß Tabelle 1 und gemäß Tabelle 13 vergleicht, stellt man fest, dass die Amplifikation effizienter ist, wenn die Endkonzentration an Fragmenten, welche die Amplifikation der Sequenz ermöglicht, die den Allelgruppen DRB1*gr04 entspricht, größer als die Endkonzentration an Fragmenten ist, welche die Amplifikation der Sequenz ermöglichen, die dem Allel B27 entspricht.
IV – PERFEKTIONIERUNGEN
In bestimmten Fällen kann es zu Zweideutigkeiten kommen. Wenn also die Fragmente für DR4 nicht spezifisch sind, werden andere Allele amplifiziert, was zu Auslegungsschwierigkeiten führen kann. Das trifft zum Beispiel im Fall der drei unten genannten Beispiele zu, wobei die einzige Lösung dann darin besteht, eine gezieltere Amplifikation auf DR4 durchzuführen, mit Hilfe von speziellen Fragmenten, wie solchen, die in nachstehender Tabelle 17 beschrieben sind:
Tabelle 17: gezielte Amplifikation einer Region von Interesse HLA-DR
Im Folgenden werden Beispiele mit solchen Zweideutigkeiten und deren Lösung angeführt.
1) ERSTE PROBE:

Streifen R1	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 1	> 2500	+
SEQ ID NR 2	< 50	–
SEQ ID NR 3	197	+
SEQ ID NR 4	182	+
SEQ ID NR 5	1692	+
SEQ ID NR 6	0	–
SEQ ID NR 7	11	–
SEQ ID NR 8	3	–

TABELLE 18: STREIFEN R1

Streifen R2bis	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 9	> 2500	+
SEQ ID NR 10	0	–
SEQ ID NR 11	2	–
SEQ ID NR 12	1519	+
SEQ ID NR 13	0	–
SEQ ID NR 14	0	–
SEQ ID NR 15	0	–
SEQ ID NR 16	0	–

TABELLE 19: STREIFEN R2

In diesem Fall ist es nicht möglich, ohne ein Risiko einzugehen, in der Gruppe DRB1*gr04 (SEQ ID NR 3 ist positiv) zwischen DRB1*gr0401 (SEQ ID NR 4 ist positiv) und DRB1*gr0402 (SEQ ID NR 5 ist positiv) zu unterscheiden. Das andere Allel ist ein gr52 (SEQ ID NR 12 ist positiv). Ferner neigen die Bruttozahlen dazu, DRB1*gr0402 zu bevorzugen, da die SEQ ID NR 5 einen positiven Wert von 1692 hat, während für DRB1*gr0401 die SEQ ID NR 4 nur mit einem Wert von 182 positiv ist.

Dennoch wird die zweite Analyse eine Unterscheidung zwischen den zwei Allelen ermöglichen. Dies wird in den Tabellen 20 und 21 deutlich gezeigt.

Streifen R1	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 1	2181	+
SEQ ID NR 2	< 50	–
SEQ ID NR 3	1281	+
SEQ ID NR 4	200	+
SEQ ID NR 5	0	–
SEQ ID NR 6	0	–
SEQ ID NR 7	1	–
SEQ ID NR 8	0	–

TABELLE 20: STREIFEN R1

Streifen R2bis	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 9	ND	?
SEQ ID NR 10	ND	?
SEQ ID NR 11	0	–
SEQ ID NR 12	0	–
SEQ ID NR 13	0	–
SEQ ID NR 14	0	–
SEQ ID NR 15	0	–
SEQ ID NR 16	0	–

TABELLE 21: STREIFEN R2

Bei dieser zweiten Analyse sieht man somit gut, dass es sich um DRB1*gr0401 (SEQ ID NR 4 ist positiv) handelt, während DRB1*gr0402 (SEQ ID NR 5) negativ ist. Die Unterscheidung zwischen DRB1*gr0401 und DRB1*gr0402 ist somit möglich, was von großer Bedeutung ist, da die zwei Allele nicht dieselbe Auswirkung auf rheumatoide Polyarthritis haben. Somit hängt DRB1*gr0401 mit der genetischen Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis zusammen und DRB1*gr0402 mit der genetischen Resistenz gegen rheumatoide Polyarthritis.
Somit ist die Typisierung der ersten Probe DRB1*gr0401/gr52.
2) ZWEITE PROBE

Streifen R1	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 2	> 2500	+
SEQ ID NR 2	< 50	–
SEQ ID NR 3	193	+
SEQ ID NR 4	21	–
SEQ ID NR 5	0	–
SEQ ID NR 6	0	–
SEQ ID NR 7	72	+
SEQ ID NR 8	137	+

TABELLE 22: STREIFEN R1

Streifen R2bis	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 9	> 2500	+
SEQ ID NR 10	1	–
SEQ ID NR 11	1	–
SEQ ID NR 12	1827	+
SEQ ID NR 13	0	–
SEQ ID NR 14	0	–
SEQ ID NR 15	0	–
SEQ ID NR 16	3	–

TABELLE 23: STREIFEN R2

In diesem Fall ist es nicht möglich, ohne ein Risiko einzugehen, in der Gruppe DRB1*gr04 (SEQ ID NR 3 ist positiv) zwischen DRB1*gr0404 (SEQ ID NR 7 ist positiv) und DRB1*gr0405 (SEQ ID NR 7 und SEQ ID NR 8 sind beide positiv) zu unterscheiden. Das andere Allel ist ein gr52 (SEQ ID NR 12 ist positiv).

Dennoch wird die zweite Analyse die Unterscheidung zwischen den beiden Allelen ermöglichen. Dies wird in den Tabellen 24 und 25 deutlich gezeigt.

Streifen R1	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 1	> 2500	+
SEQ ID NR 2	< 50	–
SEQ ID NR 3	> 2500	+
SEQ ID NR 4	0	–
SEQ ID NR 5	0	–
SEQ ID NR 6	0	–
SEQ ID NR 7	773	+
SEQ ID NR 8	560	+

TABELLE 24: STREIFEN R1

TABELLE 25: STREIFEN R2

Man sieht somit bei dieser zweiten Analyse gut, dass es sich um DRB1*gr0405 (SEQ ID NR 7 und SEQ ID NR 8 sind positiv) handelt, während die SEQ ID NR 8 negativ hätte sein müssen, wenn es sich um DRB1*gr0404 handeln würde. Die Unterscheidung zwischen DRB1*gr0404 und DRB1*gr0405 ist somit möglich, was von geringerer Bedeutung ist als im vorhergehenden Beispiel, weil, gemäß unserem aktuellen Wissen, die zwei Allele dieselbe Auswirkung auf rheumatoide Polyarthritis haben. Somit hängen sowohl DRB1*gr0404 als auch DRB1*gr0405 mit der genetischen Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis zusammen. Natürlich kann sich die Wichtigkeit der zweiten Analyse ändern, wenn unsere zukünftigen Kenntnisse belegen, dass eines der Allele im Vergleich zum jeweils anderen eine größere Auswirkung hat.
Die Typisierung der zweiten Probe ist somit DRB1*gr0405/gr52.
3) DRITTE PROBE

Streifen R1	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 1	> 2500	+
SEQ ID NR 2	< 50	–
SEQ ID NR 3	237	+
SEQ ID NR 4	1	–
SEQ ID NR 5	0	–
SEQ ID NR 6	0	–
SEQ ID NR 7	156	+
SEQ ID NR 8	563	+

TABELLE 26: STREIFEN R1

Streife R2bis	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 9	> 2500	+
SEQ ID NR 10	637	+
SEQ ID NR 11	2	–
SEQ ID NR 12	4	–
SEQ ID NR 13	0	–
SEQ ID NR 14	0	–
SEQ ID NR 15	0	–
SEQ ID NR 16	248	+

TABELLE 27: STREIFEN R2

In diesem Fall ist es nicht möglich, ohne ein Risiko einzugehen, in der Gruppe DRB1*gr04 (SEQ ID NR 3 ist positiv) zwischen DRB1*gr0404 (SEQ ID NR 7 ist positiv) und DRB1*gr0405 (SEQ ID NR 7 und SEQ ID NR 8 sind beide positiv) zu unterscheiden. Das andere Allel ist ein gr8 + 12 (SEQ ID NR 16 ist positiv), das für rheumatoide Polyarthritis oder Spondylitis ankylosans gemäß unseren aktuellen Kenntnissen neutral ist. Es ist ferner anzumerken, dass – im Gegensatz zu den beiden vorangegangenen Beispielen – ein Allel B*27 vorliegt.

Die zweite Analyse wird wieder die Unterscheidung zwischen den beiden Allelen ermöglichen. Dies wird in den Tabellen 28 und 29 deutlich gezeigt.

Streifen R1	DO × 1000	+/–
SEQ ID NR 1	> 2500	+
SEQ ID NR 2	< 50	–
SEQ ID NR 3	1453	+
SEQ ID NR 4	0	–
SEQ ID NR 5	0	–
SEQ ID NR 6	0	–
SEQ ID NR 7	467	+
SEQ ID NR 8	1	–

TABELLE 28: STREIFEN R1

TABELLE 29: STREIFEN R2

Man sieht somit bei dieser zweiten Analyse gut, dass es sich um DRB1*gr0404 handelt, weil die SEQ ID NR 7 positiv und SEQ ID NR 8 negativ ist, wobei – falls es sich um DRB1*gr0405 handeln würde – die SEQ ID NR 8 positiv hätte sein müssen, wie im vorhergehenden Beispiel. Die Unterscheidung zwischen DRB1*gr0404 und DRB1*gr0405 ist somit möglich, was weniger Bedeutung hat als im ersten Beispiel, weil die beiden Allele dieselbe Auswirkung auf rheumatoide Polyarthritis haben. Somit hängen sowohl DRB1*gr0404 und DRB1*gr0405 mit der genetischen Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis zusammen. Dennoch lassen sich die für die zweite Probe gemachten Äußerungen wiederholen.
Die Typisierung der dritten Probe ist somit DRB1*gr0404/gr8 + 12, mit Vorliegen von mindestens einem Allel B*27.
V – SCHLUSSFOLGERUNGEN
Wie die Beispiele belegen, ermöglicht das beanspruchte Verfahren gleichzeitig, in einem oder in zwei Schritten, die Suche nach genetischer Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis auf der Grundlage einer Analyse, die vollständig den von dem Kliniker erwarteten Informationen gewidmet ist (DR1, DR4, DR10, Subtyp von DRB1*gr04, Vorliegen des Motivs QKRAA, QRRAA und RRRAA, Wirkungsdosis), und ferner die Suche nach HLA-B*27 durchzuführen, die bei einer rheumatologischen Untersuchung oft informativ ist.
Die Richtigkeit der HLRA-DR- und HLA-B27-Information ist während einer rheumatologischen Untersuchung gefragt. Einfachheit, Praktikabilität und Schnelligkeit des Tests, mit einer damit einher gehenden wichtigen finanziellen Auswirkung, sind die Vorteile des Verfahrens gemäß der Erfindung.
BIBLIOGRAPHIE

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Analyse der genetischen Prädisposition eines Patienten für rheumatoide Polyarthritis, umfassend: das Einsetzen einer flüssigen Probe, die mindestens einen Typ von Amplikons enthält, die aus der Amplifikation mindestens einer polymorphen Region von Interesse im Hinblick auf rheumatoide Polyarthritis hervorgehen, in Gegenwart von Sonden, die auf folgende Weise ausgewählt werden: – mindestens eine Sonde mit schwacher Auflösung, die mit der Gruppe der DRB1*gr04-Allele hybridisieren kann, – mindestens eine Sonde mit hoher Auflösung, die mit der genetischen Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis zusammenhängt und die mit den folgenden Allelen hybridisieren kann: DRB1*0101, DRB1*gr0401, DRB1*gr0404, DRB1*gr0405, DRB1*gr0408 und DRB1*1402, – mindestens eine Sonde mit hoher Auflösung, die mit der genetischen Resistenz gegen rheumatoide Polyarthritis zusammenhängt und die mit den folgenden Allelen hybridisieren kann: DRB1*gr0402, DRB1*gr0403, DRB1*gr0406 und DRB1*gr0407, wobei die Sonden mit hoher Auflösung anhand ihrer Hybridisierung oder Nichthybridisierung eine Unterscheidung ermöglichen zwischen dem oder den Allel(en), das/die mit der Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis zusammenhängt/zusammenhängen, und/oder dem oder den Allel(en), das/die mit der Resistenz gegen rheumatoide Polyarthritis zusammenhängt/zusammenhängen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Sonde mit schwacher Auflösung verwendet wird, die mit der Gruppe der DRB1*01-Allele und dem Allel DRB1*10 hybridisieren kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zum Nachweis des Vorliegens eines anderen Allels, wenn ein einziges Allel der Gruppe der DRB1*gr04-Allele nachgewiesen wurde, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Sonde verwendet wird, die mit den folgenden Allelen hybridisieren kann: DRB1*02, DRB1*03, DRB1*07, DRB1*08, DRB1*09, DRB1*11, DRB1*12, DRB1*13 und DRB1*14.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man verwendet: – eine Sonde SEQ ID NR 3 zur Typisierung von DRB1*gr04, – zwei Sonden mit hoher Auflösung, die mit der genetischen Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis zusammenhängen: – SEQ ID NR 4 für DRB1*gr0401, – SEQ ID NR 7 für DRB1*0101, DRB1*gr0404, DRB1*gr0405 und DRB1*04gr08, DRB1*1402, – zwei Sonden mit hoher Auflösung, die mit der genetischen Resistenz gegen rheumatoide Polyarthritis zusammenhängen: – SEQ ID NR 5 für DRB1*gr0402 und – SEQ ID NR 6 für DRB1*gr0403, DRB1*gr0406, DRB1*gr0407.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass auch eine Sonde mit hoher Auflösung, SEQ ID NR 8, verwendet wird, die für DRB1*gr0405 spezifisch ist, das mit der genetischen Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis zusammenhängt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Typisierung die beiden folgenden Sonden verwendet werden: – SEQ ID NR 11 für die Gruppe der DRB1*01-Allele und – SEQ ID NR 15 für das Allel DRB1*10.
Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis des Vorliegens eines anderen Allels, wenn ein einziges Allel der Gruppe der DRB1*gr04-Allele nachgewiesen wurde, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden vier Typisierungssonden verwendet werden: – SEQ ID NR 13 für DRB1*02, – SEQ ID NR 14 für DRB1*07, DRB1*09, – SEQ ID NR 16 für DRB1*08, DRB1*12 und – SEQ ID NR 12 für DRB1*03, DRB1*11, DRB1*13, DRB1*14.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass jede Sonde mit schwacher oder hoher Auflösung, die für Allele der genetischen Empfänglichkeit für rheumatoide Polyarthritis spezifisch ist, eines der folgenden charakteristischen Motive trägt: QKRAA, QRRAA oder RRRAA.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Kontrollsonde, die mit der Gesamtheit der DRB1-Gene hybridisieren kann, verwendet wird, um den Nachweis aller DRB1-Gene zu ermöglichen, zum Beispiel SEQ ID NR 1: TTC GAC AGC GAC GTG GGG.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass darüberhinaus Allele der genetischen Empfänglichkeit für Spondylitis ankylosans und andere, damit zusammenhängende Krankheiten nachgewiesen werden, und dass mindestens eine Sonde mit schwacher Auflösung verwendet wird, wie SEQ ID NR 10, die mit dem Gen HLA-B hybridisieren kann und die für die Gruppe der HLA-B27-Allele spezifisch ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass darüberhinaus Allele der genetischen Empfänglichkeit im Zusammenhang mit disseminiertem Lupus erythematodes, Konnektivitiden, Sjögren-Syndrom und anderen, damit zusammenhängenden Krankheiten nachgewiesen werden, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Sonde mit schwacher Auflösung verwendet wird, wie SEQ ID NR 19, die mit dem Gen HLA-DR hybridisieren kann und die für die Gruppe der DRB1*03-Allele spezifisch ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass höchstens 38,89% der Basen einer gleichen Sonde mit schwacher Auflösung oder mit hoher Auflösung durch mindestens eine analoge Base, wie Inosin, ersetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass jede spezifische Sonde mit schwacher Auflösung oder hoher Auflösung unabhängig von den anderen Sonden in einen Brunnen einer Mikrotiterplatte eingebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass alle Reaktionen gleichzeitig durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass zuvor mindestens eine Amplifikation der polymorphen Region(en) von Interesse durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass zuvor eine Amplifikation der polymorphen Region(en) von Interesse, die mit HLA-DR zusammenhäng(t/en), und eine Amplifikation der polymorphen Region(en) von Interesse, die mit HLA-B zusammenhäng(t/en), gleichzeitig durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine zweite Amplifikation mindestens einer gezielteren Region als die bereits an der polymorphen Region durchgeführte durchgeführt wird, wobei die gezieltere Region eine Region von Interesse im Hinblick auf die gesuchte(n) Erkrankung(en) ist, und dass die in Anwesenheit der vorstehend definierten Sonden erhaltenen Amplikons eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Amplifikation gleichzeitig mit oder vor der zweiten gezielteren Amplifikation durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass eine zweite Amplifikation mindestens einer gezielteren Region durchgeführt wird, die in den Gruppen der DRB1*gr04-Allele enthalten ist, in dem man die SEQ ID NR 27-Fragmente in Kombination mit den SEQ ID NR 21-Fragmenten verwendet.
Verfahren nach Anspruch 10, und gegebenenfalls nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine Sequenz, die dem Allel B27 entspricht, amplifiziert wird, in dem man die SEQ ID NR 22-Fragmente, SEQ ID NR 23-Fragmente und/oder SEQ ID NR 25-Fragmente in Kombination mit den SEQ ID NR 24-Fragmenten und/oder SEQ ID NR 26-Fragmenten verwendet.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass amplifiziert wird: • eine Sequenz, die den Gruppen der DR-Allele entspricht, in dem man die SEQ ID NR 20-Fragmente in Kombination mit den SEQ ID NR 21-Fragmenten verwendet, und • eine Sequenz, die dem Allel B27 entspricht, in dem man die SEQ ID NR 22-Fragmente, SEQ ID NR 23-Fragmente und/oder SEQ ID NR 25-Fragmente in Kombination mit den SEQ ID NR 24-Fragmenten und/oder SEQ ID NR 26-Fragmenten verwendet.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Endkonzentration an SEQ ID NR 20-Fragmenten und SEQ ID NR 21-Fragmenten, welche die Amplifikation der Sequenz ermöglichen, die den Gruppen der DR-Allele entspricht, größer ist als die Endkonzentration an SEQ ID NR 22-Fragmenten, SEQ ID NR 23-Fragmenten und/oder SEQ ID NR 25-Fragmenten in Kombination mit den SEQ ID NR 24-Fragmenten und/oder SEQ ID NR 26-Fragmenten, welche die Amplifikation der Sequenz ermöglichen, die dem Allel B27 entspricht.