ES2230109T5 - Procedimiento de analisis de la predisposicion genetica de un paciente a por lo menos una enfermedad y amplificacion adaptada a un procedimiento de este tipo. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de análisis de la predisposición genética de un paciente a por lo menos una enfermedad, consistente en relacionar una muestra líquida que contiene por lo menos un tipo de amplicones resultantes de la amplificación de por lo menos una región de interés, con la enfermedad o enfermedades buscadas o investigadas, en presencia de sondas elegidas de la forma siguiente: - por lo menos, una sonda específica de tipificación, denominada de reducida resolución, capaz de hibridar sobre la región polimorfa de interés, de por lo menos un gen o un grupo de alelos de este gen, portado por el amplicón, y asociado a la citada o a las citadas enfermedades, y - por lo menos, una sonda específica de sub-tipificación, denominada de alta resolución, capaz de hibridar sobre la citada región polimorfa de interés del alelo o del grupo de alelos específico de la sonda de tipificación, denominada de reducida resolución, permitiendo, la sonda o las sondas de alta resolución, el descriminar el o los alelosasociados a la susceptibilidad y/ o el alelo o alelos asociados a la resistencia a la citada enfermedad o a las citadas enfermedades, según su hibridación o su no hibridación.
Description
Procedimiento de análisis de la predisposición
genética de un paciente a por lo menos una enfermedad y
amplificación adaptada a un procedimiento de este tipo.
La presente invención, se refiere a un
procedimiento de análisis de la predisposición genética de una
paciente a por lo menos la poliartritis reumatoidea.
Cada individuo, dispone de un patrimonio
genético propio, heredado de sus ascendientes. Este contexto
genético particular, puede a veces participar de una forma activa,
a la aparición y/o al desarrollo de ciertas afecciones: infecciones
por un agente patógeno (virus del SIDA, por ejemplo), enfermedades
autoinmunes (enfermedades reumáticas, por ejemplo). Los genes del
Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH), principalmente, los
genes que codifican para la antígenos HLA (Human
Leukociy-Antigens-Antígenos de los
leucocitos humanos), juegan un rol interpretativo preponderante en
el desarrollo de las patologías autoinmunes articulares, como la
poliartris reumatoidea. (Lawrance, 1970; Stastny, 1978; Khan, 1979;
Stastny, 1983; Gregersen, 1986; Gregersen, 1987; Stastny, 1988;
Todd, 1988; Wordswoth, 1989; Nepom, 1989, Hiraiwa, 1990; Nepom,
1991), o la espondilartritis anquilosante (Brewerton, 1973;
Schlosstein, 1973, Benjamin, 1990).
Una parte importante del componente genético, de
la susceptibilidad a la poliartritis reumatoidea, ha podido
asociarse a los genes HLA-DRB, que codifican para la
cadena \beta de las moléculas HLA-DR, implicadas
en la presentación de los péptidos a los linfocitos T, función de
base en el núcleo de los mecanismos de regulación de la respuesta
inmunitaria. Se ha mostrado, de una forma más precisa, el hecho de
que, la presencia de una secuencia particular de cinco aminoácidos,
correspondientes a las posiciones 70 a 74 de la tercera región
hipervariable de las HLA-DR\beta1, se encontraba
para diferentes alelos, reportados como estando asociados a la
poliartritis reumatoide. La implicación de este "epítope
compartido", correspondiente a la secuencias QKRAA ó QRRAA ó
RRRAA (código de una letra para los aminoácidos), se encontraba, en
lo sucesivo, bien documentada. Esta explicación molecular, es
igualmente coherente con la observación de una gravedad gradual de
la enfermedad, cuando el genotipo, no comprende ningún alelo de
susceptibilidad, o comprende uno o dos, comúnmente denominado efecto
dosis.
La espondilartritis anquilosante, es una
enfermedad inflamatoria, para la cual, se observa una fuerte
asociación con el antígeno HLA-B27 (riesgo
relativo: 69,1)(Baarsma, 1992). En 1977, Schlosstein, ha publicado
la fuerte asociación entre HLA-B27, y diferentes
espondilartropatías (Schlosstein, 1977). Se ha avanzado diferentes
hipótesis, para explicar esta asociación, implicando, en ellas, la
función de representación de péptidos específicos, de las moléculas
HLA-B27.
Se ha publicado, también, una asociación
positiva, ente HLA-B27, y la uveitis anterior aguda
(riesgo relativo: 8,2).
La detección de antígeno(s)
HLA-B27, presenta un interés clínico cierto, como
atestigua la práctica corriente y de análisis de la regiones
específicas de interés.
La detección de alelo(s)
HLA-B*27, es igualmente posible, utilizando las
técnicas de biología molecular de amplificación y de análisis de las
regiones específicas de interés.
Así, de este modo, en 1985, Weiss, publicó la
organización, la secuencia y la expresión del gen
HLA-B27. En 1991, Hill, publicó una técnica de
amplificación por PCR, de la regiones polimorfas del gen
HLA-B y la detección del
HLA-B*2703, mediante hibridación con una sonda
específica (Hill, 1991). En 1992, Domínguez, publicó la descripción
del primer método de clasificación del genotipo (genotipificación)
del B27, después de la amplificación por PCR de las regiones
polimorfas del gen HLA-B.
Actualmente, en cuanto a lo concerniente a la
poliartritis reumatoidea, la identificación de alelo(s) de
susceptibilidad, se hace generalmente de una forma rutinaria,
durante el transcurso de la genotipificación HLA-DR
de reducida resolución do genotipo, que permite principalmente la
detección de antígeno(s) HLA-DR4 o de
alelo(s) HLA-DRB1*gr04.
Estos tests de ensayo, se efectúan por parte de
centros especializados en el estudio de los genes HLA, tales como
los centros de transfusión sanguínea o en ciertos hospitales
especializados. Esta identificación, necesita por lo tanto el envío
de una muestra y la utilización de una tecnología bastante pesada.
Las consecuencias negativas, son por lo tanto muy numerosas, tales
como:
- -
- los riesgos de pérdida de la muestra,
- -
- la larga duración de esta identificación,
- -
- el coste relativamente elevado de la citada identificación, y
- -
- la ausencia de control por parte del solicitante, sobre la prestataria de los servicios.
El estado actual de la técnica, se encuentra muy
limitado, en cuanto a lo que respecta a las asociaciones
HLA-DR y poliartritis reumatoidea, las cuales
utilizan una tecnología de biología molecular.
En el ámbito de la espondilartritis
anquilosante, el estado actual de la técnica, se encuentra
esencialmente constituido por técnicas de inmunologia. Éste es el
caso del documento de solicitud de patente internacional
WO-A-95/30 152, el cual permite la
identificación del antígeno B27. Así, de este modo, en cuanto a lo
concerniente a la espondilartritis anquilosante, se practica una
simple búsqueda o investigación del antígeno
HLA-B27, procediendo a utilizar un técnica
serológica (citometría de flujo o citotoxicidad, con un anticuerpo
específico anti-B27).
Estas técnicas son rápidas, pero a veces, se
observan reacciones falsamente negativas, debido al enmascaramiento
u ocultación de los antígenos B27, por autoanticuerpos o péptidos
(Neumüller, 1993; Kirveskari, 1997). Además, como toda técnica de
análisis de antígenos expresada en la superficie de los linfocitos,
son necesarias unas precauciones de buena conservación de las
células, a veces, apremiantes.
Siempre dentro de este sector, el estado actual
de la técnica, se encuentra igualmente constituido por técnicas de
biología molecular. Así, de esta forma, la patente estadounidense
US-A-4.971.902, concierne a sondas
de diagnóstico de la predisposición de un paciente a la poliartritis
reumatoide. Estas sondas, se basan sobre el reconocimiento del grupo
de alelos DRB*1gr04.
No obstante, si este grupo de alelos DRB1*gr04
se encuentra efectivamente asociado a la poliartritis reumatoidea,
todos los alelos actualmente conocidos (DRB1*gr0401 a DRB1*gr0427),
no se encuentran necesariamente asociados a esta enfermedad. Puede
resultar, de ello, el hecho de que, si nos limitamos a una
tipificación de grupo de los alelos DRB1*gr04, en función de los
alelos presentes, se podrá obtener, además de verdaderos positivos o
de verdaderos negativos, falsos positivos, los cuales van a alarmar
inútilmente al médico y al paciente.
Bien se trate de una técnica serológica
(análisis de los antígenos DR con la ayuda de una batería de sueros
de especificidad conocida: resultados proporcionados según la
nomenclatura DR1 a DR10), o bien se trate de una técnica biológica
molecular (análisis de alelos DRB1: resultados proporcionados según
la nomenclatura DRB1*01 a DRB1*02), el médico, se interesa
esencialmente en la presencia de antígeno(s) DR4 ó de
alelo(s) DRB1*04, con la información "efecto dosis",
eventualmente.
En el caso de unos resultados que sugieran una
predisposición a la enfermedad, se practica, generalmente, un
segundo test de ensayo, utilizando una técnica de biología
molecular, denominada de alta resolución, denominada de
sub-tipificación del SR4, para precisar el alelo
DRB1*gr04 (DRB1*gr0401 a DRB1*gr0427, según la nomenclatura oficial
en 1998), en la que solamente se reportan los alelos DRB1*gr0401,
gr0404, gr0405 y gr0408, como encontrándose asociados a la
enfermedad.
Estos tests de ensayo, son fiables, pero de
larga duración, de varios días, y costosos.
El procedimiento de análisis reivindicado,
permite un análisis simplificado sobre el plano técnico, más rápido,
de una duración de menos de dos horas, después de la preparación de
los amplicones, y de poco coste.
A dicho efecto, la presente invención, se
refiere a un procedimiento de análisis de la predisposición genética
de un paciente a la poliartritris reumatoidea, según el cual:
se procede a poner una muestra líquida que
contiene por lo menos un tipo de amplicón, procedente de la
amplificación de por lo menos una región polimorfa de interés en
relación con la poliartritis reumatoidea, en presencia de sondas
elegidas de la siguiente forma:
- -
- por lo menos una sonda de reducida resolución, capaz de hibridarse sobre el grupo de alelos DRB1*gr04,
- -
- por lo menos una sonda de alta resolución, asociada a la susceptibilidad genética a la Poliartritis Reumatoidea, capaz de hibridarse con los siguientes alelos: DRB1*0101, DRB1*gr0401, DRB1*gr0404, DRB1*gr0405, DRB1*gr0408 y DRB1*1402,
- -
- por lo menos una sonda de alta resolución, asociada a la resistencia genética a la Poliartris Reumatoidea, capaz de hibridarse con los siguientes alelos: DRB1*gr0402, DRB1*gr0403, DRB1*gr0406 y DRB1*gr0407,
permitiendo discriminar, la sonda o
las sondas de alta resolución, el alelo o alelos asociados a la
susceptibilidad a la Poliartritis Reumatoidea; y/o el alelo o alelos
asociados a la resistencia a la Poliartritis Reumatoidea, según su
hibridación o su no
hibridación.
Con el fin de detectar la presencia de otro
alelo, cuando se ha detectado un solo alelo del género o del grupo
de alelos de este género, mediante por lo menos una sonda específica
de tipificación de reducida resolución, correspondiente al otro
grupo o a los otros grupos de alelos, el procedimiento, consiste en
poner los amplicones en presencia de por lo menos una sonda
específica de por lo menos otro alelo, correspondiente al
poliformismo del citado gen o del citado grupo de alelos de este
gen detectado mediante la sonda o las sondas de reducida
resolución.
Cada sonda de reducida o de alta resolución,
específica de la enfermedad o enfermedades investigadas, comporta
por lo menos una formación característica de la citada o de las
citadas enfermedades investigadas.
Además, se utiliza, por lo menos, una sonda de
reducida resolución, capaz de hibridar sobre el grupo de alelos
DRB1*01 y sobre el alelo DRB*10.
En el caso en el que se desee detectar la
presencia de otro alelo, cuando sólo se ha detectado un solo alelo
del grupo de alelos DRB1*gr04, se utiliza entonces, por lo menos,
una sonda capaz de hibridar sobre los alelos siguientes: DRB1*02,
DRB1*03, DRB1*07, DRB1*08, DRB1*09, DRB1*11, DRB1*12, DRB1*13 y
DRB1*14.
En cuanto a lo concerniente a las sondas en
relación con estos alelos, se utiliza:
- una sonda SEQ ID NO 3, para la tipificación de
DRB1*gr04,
- dos sondas de alta resolución, asociadas a la
susceptibilidad genética a la poliartritis reumatoidea:
- -
- SEQ ID NO 4, para DRB1*gr0401, y
- -
- SEQ ID NO 7, para DRB1*0101, DRB1*gr0404, DRB1*gr0405, DRB1*gr0408, DRB1*gr1402,
\vskip1.000000\baselineskip
- dos sondas de alta resolución, asociadas a la
resistencia genética a la poliartritis reumatoidea:
- -
- SEQ ID NO 5, para DRB1*gr0402, y
- -
- SEQ ID NO 6, para DRB1*gr0403, DRB1*gr0406, DRB1*gr0407,
\vskip1.000000\baselineskip
De una forma más precisa, se utiliza igualmente
una sonda de alta resolución, SEQ ID NO 8 específica de DRB1*gr04,
asociada a la susceptibilidad genética a la poliartritis
reumatoidea.
Además, se utilizan las dos sondas siguientes
para la tipificación:
- -
- SEQ ID NO 11, para el grupo de alelos DRB1*01, y
- -
- SEQ ID NO 15, para el alelo DRB1*10.
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso en el que se desee el detectar la
presencia de otro alelo, cuando se ha detectado un solo alelo del
grupo de alelos DRB1*gr04, se utilizan cuatro sondas de tipificación
siguientes:
- -
- SEQ ID NO 13, para DRB1*02,
- -
- SEQ ID NO 14, para DRB1*07, DRB1*09,
- -
- SEQ ID NO 16, para DRB1*08, DRB1*12, y
- -
- SEQ ID NO 12, para DRB1*03, DRB1*11, DRB1*13, DRB1*14.
\vskip1.000000\baselineskip
Sea cual fuere el caso de configuración, cada
sonda de reducida o de alta resolución, específica de los alelos de
susceptibilidad genética a la poliartritis reumatoidea y otras
enfermedades asociadas, comporta una de las formaciones
características siguientes: QKRAA, QRRAA ó RRRAA.
Se utiliza por lo menos una sonda de control,
capaz de hibridar, con el conjunto de los genes DRB1, para permitir
la detección de todos los genes DRB1, tal como la SEQ ID NO 1: TTC,
GAC, AGC, GAC, GTG, GGG.
Si se quiere además detectar alelos de
susceptibilidad genética a la espondilartritis anquilosante y otras
enfermedades asociadas, se utiliza, por lo menos, una sonda de
reducida resolución, tal como la SEQ ID NO 10, capaz de hibridar
sobre el gen HLA-B, específico del grupo de alelos
HLA-B27.
Si se quiere además detectar alelos de
susceptibilidad genética al lupus eritematoso diseminado, a la
conectividad, al síndrome de Sjögren y otras enfermedades
asociadas, se utiliza, por lo menos, una sonda de reducida
resolución, tal como la SEQ ID NO 19, capaz de hibridar sobre el
gen HLA-DR, específico del grupo de alelos
HLA-DRB1^{+}03.
Sea cual fuere la detección investigada, como
mucho, se reemplazan un 38,89% de las bases de una misma sonda de
reducida resolución o de alta resolución, mediante por lo menos una
base análoga, tal como la inosina.
Según una variable de realización del
procedimiento según la invención, cada sonda específica de reducida
resolución o de alta resolución, se emplaza en un hoyo de una placa
de microfiltración, independientemente de las otras sondas.
Según otra variable del procedimiento en
concordancia con la invención, todas las reacciones, se realizan
simultáneamente.
Previamente al procedimiento anteriormente
expuesto, arriba, se efectúa por lo menos una amplificación de la
región o regiones polimorfas de interés.
Se procede a efectuar, de una forma simultánea,
una amplificación de la región o de las regiones polimorfas de
interés asociadas a la HLA-DR, y una amplificación
de la región o de las regiones polimorfas de interés asociadas a las
HLA-B.
Según una variante de realización, se precede a
realizar una segunda amplificación de por lo menos una región más
pretendida como diana que aquélla ya efectuada sobre la región
polimorfa, siendo, esta región más pretendida como diana, una
región de interés, en relación con la poliartritis reumatoidea y,
los amplicones obtenidos, se ponen en presencia de las sondas
anteriormente definidas.
Según esta variante de realización, la primera
amplificación, se efectúa al mismo tiempo que la segunda secuencia
de amplificación más pretendida como diana, o previamente a
ella.
La presente invención, se refiere igualmente a
una amplificación de una secuencia correspondiente a los grupos de
alelos DRB1^{+}gr04, en vistas a su utilización en un
procedimiento de análisis de la predisposición genética de un
paciente a la poliartritis reumatoidea, la cual consiste en utilizar
los cebadores SEQ ID NO 20, en combinación con los cebadores SEQ ID
NO 21.
La presente invención, se refiere a una
amplificación suplementaria de una secuencia correspondiente a los
grupos de alelos B27, en vistas a su utilización en un procedimiento
de análisis de la predisposición genética de un paciente a la
spondilartritis anquilosante, la cual consiste en utilizar los
cebadores SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23 y/o SEQ IND NO 25, en
combinación con los cebadores SEQ ID NO 24 y/o SEQ IND NO 26.
Además, la presente invención, puede consistir
en combinar las dos amplificaciones descritas en los dos párrafos
anteriores, en vistas a su utilización en un procedimiento de
análisis de la predisposición genética de un paciente a la
poliartritis reumatoidea y a la espondilartritis anquilosante.
En este caso, la amplificación, en la cual, la
concentración final en cebadores, permite la amplificación de la
secuencia correspondiente a los grupos de alelos DRB1* gr04, es
superior a la concentración final en cebadores que permite la
amplificación de la secuencia correspondiente al alelo B27.
En una variante de realización, la amplificación
precedente, se encuentra asociada a la amplificación de una
secuencia correspondiente a un a región más diana, incluso en el
alelo DRB1*gr04, la cual cosiste en utilizar los cebadores SEQ ID NO
21, en combinación con los cebadores SEQ ID N0 27.
Los ejemplos que se facilitan a continuación, se
facilitan a título de ejemplo explicativo, y no tienen ningún
carácter limitativo. Éstos permiten el comprender mejor la
invención.
Éste, se trata de un procedimiento dedicado al
análisis de las predisposiciones genéticas de un individuo a la
poliartritis reumatoidea, mediante una técnica de biología molecular
que permite el análisis simultáneo de varios genes. Este
procedimiento, puede aplicarse, de una forma ventajosa, al análisis
de las predisposiciones genéticas de un individuo, para esta
enfermedad y, eventualmente, un conjunto de enfermedades
emparentadas, asociada(s) a uno o varios genes. Este
procedimiento, puede aplicarse al análisis de las predisposiciones
genéticas de un individuo a la poliartritis reumatoidea y,
eventualmente, a la espondilartritis anquilosante.
El interés de este procedimiento, es el de
obtener, en una etapa, con un test de ensayo múltiple, pero único,
un conjunto completo de informaciones pertinentes de interés clínico
(diagnóstico, pronóstico y de orientación terapéutica). El
procedimiento, de descompone en varias etapas:
1) extracción de ácidos nucleicos, a partir de
una extracción biológica del individuo,
2) amplificación de las regiones de interés,
para las cuales, se ha descrito un polimorfismo asociado a una
predisposición genética a una patología, y
3) análisis simultáneo de los amplicones,
utilizando un conjunto de reacciones de hibridación, aplicando un
juego de sondas moleculares que permiten el análisis preciso de
alelos o de grupos de alelos dados.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta extracción, se realiza de una forma del
todo clásica. En efecto, puede utilizarse cualquier tipo de técnica
de extracción de ADN, la cual permita obtener un material
susceptible de poderse amplificar posteriormente, mediante un
procedimiento de amplificación, como la Polymersa Chain
Reaction-Reacción en cadena de la polimerasa -
(PCR). Éstas técnicas, de lisis de las células, con una extracción
más purificación de los ácidos nucleicos, son habitualmente aquéllas
recomendadas para los análisis genéticos, o técnicas rápidas que
utilizan productos comerciales, tales como QIAmp Blood Kit (marca
registrada) de la firma QIAGEN S.A.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta amplificación, concierne a los loci
(sitios) siguientes:
- el locus HLA-DR: que incluye
la región del exón 2 correspondiente a los codones 5 a 94, según la
nomenclatura oficial de los genes HLA-DRB
- el locus HLA-B: que incluye la
región del exón 2 correspondiente a los codones 25 a 114, según la
nomenclatura oficial de los genes HLA-B.
La tabla 1, la cual se facilita a continuación,
describe los cebadores utilizados en el momento de la amplificación
de los dos loci anteriormente descritos, arriba. Ésta facilita,
igualmente, el conjunto de las condiciones
físico-químicas que permiten la realización de esta
amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Este análisis, utiliza un conjunto de reacciones
de hibridación, aplicando un juego de sondas oligonucleótidas que
permiten un análisis preciso de alelos o de grupos de alelos
HLA-DRB y HLA-B*27, mportantes para
el estudio de la predisposición genética a la poliartritis
reumatoidea y a la espondilartritis anquilosante,
principalmente.
La tabla 2, describe el conjunto de sondas que
se utiliza para la detección de estas dos enfermedades. Las
indicaciones, las cuales se facilitan de izquierda a derecha, son
las siguientes:
- la referencia de la sonda atribuida en la
nomenclatura HLA,
- el número de la secuencia atribuido en este
documento
- el gen HLA concernido
- la secuencia constituyente de esta sonda,
y
- la localización de los codones (tres
nucleoótidos) sobre los genes HLA.
\hskip0.5cm(*) Sonda correspondiente a la hebra complementaria no codificante
Para ciertas sondas, una segunda secuencia de
caracteres itálicos, precisa la secuencia natural, es decir,
únicamente constituida por los cuatro nucleótidos adenosina (A),
Timina (T), guanina (G) y citosina (C). Las otras secuencias,
representan los mismos nucleótidos, con la excepción de la
sustitución de ciertos de éstos por nucleótidos diferentes. En el
presente caso, se trata de la inosina.
Algunas secuencias, no contienen inosina, siendo
éste el caso de las SEQ ID NO 1, 2, 3, 8, 9, 11, 12, 13, 15, 17 ó
18. Otras, contienen poca, siendo éste el caso de la SEQ ID NO 19,
en donde hay una inosina sobre un total de dieciséis nucleótidos,
es decir, un 6,25% de diferencia, con respecto a la secuencia de
base. Otras, contienen mucho más, como es el caso para la SEQ ID NO
6, en donde hay siete inosinas, sobre un total de dieciocho
nucleótidos, es decir, aproximadamente un 38,89% de diferencias, con
relación a la secuencia de base.
La utilización de inosinas, permite mejorar
todavía la especificidad de las sondas, con respecto a las
secuencias a la cuales éstas se van a hibridar. La especificidad de
las sondas de capturas, se precisa bien, en la tabla 3 que se
facilita a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta tabla 3, el término
"principalmente", se encuentra a veces asociado a ciertos
alelos. La explicación, reside en el hecho de que existen otros
alelos. Así, de esta forma, con la SEQ ID NO 5, se detecta el
DRB1*gr0402 pero, igualmente, el DRB1*gr0414. Este último, es muy
raro, tan raro, que no se ha llevado a cabo ningún estudio hasta el
día de hoy, para asociar su presencia a la de la poliatritis
reumatoidea. Sin embargo, al ser semejantes las formaciones de
estos dos alelos, al nivel de las regiones polimorfas de interés,
existe una fuerte posibilidad de que su susceptibilidad sea
idéntica, con respecto a esta enfermedad.
Las sondas D1 y D6, correspondientes a las SEQ
ID NO 17 y 18, son sondas de detección.
Estas reconocen las regiones observadas en todos
los alelos del mismo género. Así, de este modo, la sonda SEQ ID NO
17, se elige en la región conservada del género HLA DR, mientras
que, la sonda SEQ ID NO 18, se elige en una región conservada del
género HLA B.
Este análisis de las sondas, puede efectuarse
sobre placas de micro-titración o
micro-placas, en donde, el formato, se encuentra
normalizado. Esas placas, comportan barras aisladas de ocho hoyos,
los cuales pueden reunirse, según el número de tests de ensayo a
realizar. Por imperativos de comodidad y de coste, la utilización de
estas dos barras, para tests de ensayo, pueden ser ventajosas.
El objetivo, es el de obtener resultados con un
mínimo de barras, debido al hecho de que, el coste de fabricación,
debe ser los más reducido posible, al mismo tiempo que deben
conservarse unas prestaciones de muy alto nivel. Este mínimo,
corresponde a dos barras.
En el caso de la poliartritis reumatoidea y de
la espondilartritis anquilosante, se pueden por lo tanto utilizar
dos barras, las cuales se denominan, respectivamente, R1 y R2. Si
para la barra R1, una posibilidad, es la de proponer, entonces, son
posibles dos casos de figura, en cuanto a lo que concierne a R2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La barra R1, comporta un control positivo (SEQ
ID NO 1), el cual permite detectar todos los alelos del género
DRB1*, lo cual permit controlar el hecho de que, la amplificación,
se ha referido bien a la región de interés, comprendida entre los
cebadores P1 y P2, descritos en la tabla 1. El control negativo (SEQ
ID NO 2) no tiene objetivo de diagnóstico, éste no se encuentra
presente más que para responder a ciertas normas. Esta secuencia, no
es en absoluto específica del HLA, y corresponde a una secuencia
aleatoria no encontrada en los genes de HLA.
La SEQ ID NO 3, permite la tipificación del
conjunto de los alelos que constituyen el grupo DRB1*gr04. Ésta
permite la identificación de todos los alelos DRB1*gr04, alelos que
pertenecen al grupo definido mediante las técnicas de tipificación
del HLA para la serología, como el grupo DR4. Se trata de una sonda
de reducida resolución, es decir que, mediante ésta, se pueden
reconocer numerosos alelos.
En cuanto a las SEQ ID NO 4 a 8, éstas permiten,
la sub-tipificación de ciertos alelos que
constituyen el grupo DRB1*gr04, precisando el alelo o los alelos
pertenecientes a una secuencia en particular. Se trata de sondas de
alta resolución, es decir que, algunos alelos, o incluso uno solo,
pueden reconocerse mediante una de estas sondas.
\newpage
Todas las sondas, se utilizan para detectar los
alelos que poseen el epítope compartido, asociados a la
predisposición genética a la poliartritis reumatoidea. De una
forma más particular, las sondas SEQ ID NO 4 y 7, permiten detectar
los alelos asociados a la susceptibilidad a la poliartritis
reumatoidea y, las sondas SEQ ID NO 5 y 6, permiten detectar lo
alelos asociados a la resistencia a la citada poliartritis
reumatoidea. La sonda SEQ ID NO 8, permite el confirmar la presencia
de un alelo DRB1*gr045.
La barra R2, comporta un control positivo (SEQ
ID NO 9), el cual permite el detectar los amplicones
correspondientes al eón 2 del género HLA-B, lo cual
permite el controlar el hecho de que, la amplificación, se ha
referido bien, a la región de interés comprendida entre los
cebadores P3 y P4, descritos en la tabla 1.
Ésta comporta, por otra parte, una secuencia SEQ
ID NO 10, la cual permite detectar el grupo de los alelos B*27,
utilizados para determinar si un individuo está predispuesto a
desarrollar una espondilartris anquilosante.
Para el resto, esta barra, se encuentra
constituida por sondas de reducida resolución, a saber, las SEQ ID
NO 11 a 16, las cuales permiten el completar el análisis de los dos
haplotipos de todo individuo, especialmente, indicando el hecho de
si la presencia de alelos de susceptibilidad o de resistencia a la
poliartritis reumatoidea, reveladas por la barra R1, concierne a
uno u otro de los haplotipos (efecto dosis).
Según el balance o equilibrio entre alelo de
susceptibilidad, alelo de resistencia y alelo neutro, los riesgos de
desarrollar una poliartritis reumatoidea más o menos grave, son
diferentes y, los medios terapéuticos a aplicar, se adaptarán a este
diagnóstico.
En el caso de la barra 2bis, se vuelve a tomar
sensiblemente la misma configuración que la barra R2, con la
excepción de dos modificaciones.
En primer lugar, se han reagrupado dos
reacciones. Así, de esta forma, un solo hoyo, contiene, en su seno,
dos sondas diferentes, a saber, la SEQ ID NO 14 y la SEQ ID NO
16.
Los hoyos de esta forma liberados, permiten la
adición de una nueva sonda SEQ ID NO 19, la cual se encuentra
asociada a la presencia de alelos DRB1*03(DR3). Es en efecto
juicioso, el poder identificar de una forma independiente este
grupo de alelos DRB1*03, encontrado como asociado a otras
enfermedades, como el lupus eritematoso diseminado, la
conectividad, el síndrome de Sjören y la diabetes
insulino-dependiente.
\vskip1.000000\baselineskip
El principio de la hibridación inversa
utilizado, es aquél que se describe en el documento internacional de
patente WO-A-93/02213 del
solicitante. En resumen, las sondas específicas de captura, se
adsorben de forma pasiva sobre el poliestireno de los hoyos de las
barras montadas en micro-placas, gracias a una
modificación del extremo 5'(presencia de una función -NH_{2}).
Las sondas de detección, son oligonucleótidos acoplados de forma
covalente a la enzima HRP (Horse Radish
Peroxidase-Peroxidasa del rábano picante), gracias a
la modificación de su extremo 5' (presencia de la función
-NH_{2}). La composición del tampón de hibridación, se ha
modificado de la siguiente forma:
- -
- 75 mM Na_{2}HPO_{4}\cdot2H_{2}O,
- -
- 25 mM Na_{2}HPO_{4}\cdot2H_{2}O,
- -
- pH 6,8,
- -
- 500 mM NaCl,
- -
- 2% PEG 400,
- -
- 0,65% de Tween 20,
- -
- 0,1% de gelatina,
- -
- 0,14 g/l de ADN sonificado (tratado por ultrasonidos)
- -
- 0,001% de ciprofloxacina clorhidrato y,
- -
- 0,01% de bromo-nitro-dioxano.
Un test de ensayo múltiple, se encuentra
constituido por una barra R1 y una barra R2, ó R2 bis, tal y como se
encuentra descrito en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
1) Desnaturalización de los amplicones: a los
100 \mul de solución de amplicones preparados, se añaden 10 \mul
de reactivo de desnaturalización (NaOH, 2N). Incubación, 5 minutos a
18-25ºC.
2) Adición de 2 ml de tampón de hibridación, de
0,2 ml de solución que contiene las sondas de detección.
3) Repartición de la mezcla, a razón de 100
\mul, en cada uno de los seis pozos sensibilizados que
corresponden a un test de ensayo múltiple. Cubrir con una hoja
autoadhesiva.
4) Incubación, 60 minutos, en una estufa, a 37ºC
(35-39ºC).
5) Eliminación del material no hibridado,
mediante lavado, a una temperatura de 18-25ºC.
6) Revelación de la reacción enzimática,
repartiendo 100 \mul por hoyo, de solución de substrato (OPD,
ortofenilendiamina)). Incubar durante 20 minutos a una temperatura
de 18-25ºC, en la oscuridad.
7) Lectura de los resultados; directa, o
registro de las densidades ópticas (lectura a 492 nm).
8) Interpretación de los resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos con diferentes muestras
de tipificación de HLA conocida, se presentan a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Las dos tablas, 5 y 6 que se facilitan a
continuación, representan los resultados obtenidos con las dos
barras R1 y R2.
Debido al hecho de la utilización de una barra
R2, son posibles dos análisis
En primer lugar, el análisis del
HLA-DR, muestra que;
- la sonda SEQ ID NO 1, es positiva: la
amplificación HLA-DR, y el test de ensayo de
hibridación, han funcionado correctamente,
- las sondas SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4, son
positivas: se encuentra presente un alelo DRB1*gr02, y
- la sonda SEQ ID NO 13, es positiva: se
encuentra presente un alelo DRB1*gr02.
\vskip1.000000\baselineskip
En conclusión, existe una presencia de una solo
alelo de susceptibilidad a la poliartritis reumatoidea (DRB*gr0401),
siendo, el segundo alelo, el DRB1*gr02, el cual prueba la
neutralidad con respecto a la poliartritis reumatoidea.
En segundo lugar, el análisis del
HLA-B, muestra que;
- la sonda SEQ ID NO 9, es positiva: la
amplificación HLA-B, y el test de ensayo de
hibridación, han funcionado correctamente, y
- la sonda SEQ ID NO 10, es negativa: existe
ausencia de alelo B*27.
\vskip1.000000\baselineskip
El paciente cuya muestra se ha sometido a test
de ensayo, no es susceptible a la espondilartritis anquilosante.
La tipificación HLA, de este primer tipo de
muestra, era:
- HLA-DRB1*gr0401/1602, y
- HLA-B*5701.
\vskip1.000000\baselineskip
Las dos tablas, 7 y 8 que se facilitan a
continuación, representan los resultados obtenidos con las dos
barras R1 y R2.
Hay cuatro sondas positivas, las cuales son:
- la sonda SEQ ID NO 1, es positiva: la
amplificación HLA-DR, y el test de ensayo de
hibridación, han funcionado bien,
- la sonda SEQ ID NO 3: se encuentra presente
por lo menos un alelo DRB1*gr04,
- la sonda SEQ ID NO 5: se encuentra presente
por lo menos un alelo DRB1*gr02, y
- la sonda SEQ ID NO 9: se encuentra presente
por lo menos un alelo B*, pero no el B*, debido al hecho de que, la
SEC ID NO 10, es negativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se trata, por lo tanto, de una presencia de un
sub-tipo no implicado en la susceptibilidad genética
a la PR (DRB1*gr0402). La identificación del segundo alelo, permite
establecer el hecho de que éste se trata del DRB1*gr02.
La tipificación HLA de esta tercera muestra,
era:
- HLA-DRB1*gr0402/02, y
- HLA-B, diferente de B*27.
\vskip1.000000\baselineskip
Las dos tablas, 9 y 10 que se facilitan a
continuación, representan los resultados obtenidos con las dos
barras R1 y R2.
Como en los dos ejemplos precedentes, son
posibles dos análisis.
En primer lugar, el análisis de
HLA-DR, muestra que:
- la sonda SEQ ID NO 1, es positiva: la
amplificación HLA-DR, y el test de ensayo de
hibridación, han funcionado correctamente,
- la sondas SEQ ID NO 3 es negativa: existe
ausencia de un alelo DRB*gr04,
- las sonda SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 12, son
positivas: se encuentra presente un alelo DRB1*11 ó 13, y
- la sonda SEQ ID NO 9: se encuentra presente
un alelo DRB1*02.
\vskip1.000000\baselineskip
En conclusión, no hay ningún alelo de
susceptibilidad a la poliartritis reumatoidea, los dos alelos DR, se
han identificado, mientras tanto, al nivel genérico.
En segundo lugar, el análisis de
HLA-B, muestra que:
- la sonda SEQ ID NO 9, es positiva: la
amplificación HLA-B, y el test de ensayo de
hibridación, han funcionado correctamente, y
- la sonda SEQ ID NO 10, es positiva: existe
presencia de por lo menos un alelo B*27.
\vskip1.000000\baselineskip
La tipificación HLA, de este primer tipo de
muestra, era:
- HLA-DRB1*02/1301, y
- HLA-B*27.
\vskip1.000000\baselineskip
Las dos tablas, 11 y 12 que se facilitan a
continuación, representan los resultados obtenidos con las dos
barras R1 y R2 bis.
La configuración, con estas dos barras, R1 y,
sobre todo, R2 bis (véase la tabla 2), permite, además de un
análisis de la susceptibilidad genética a la poliartritis
reumatoidea y a la espondilartritis anquilosante, el analizar mejor
la susceptibilidad genética del lupus eritematoso diseminado, al
síndrome de Sjögren, y otras enfermedades encontradas al producirse
una consulta de reumatología. Ello, se realiza procediendo a
combinar, en un solo hoyo, las SEQ ID NO 14 Y 16, las cuales
contienen las sondas 7, 8, 9 y 12, cuyas especificidades, se
describen en la tabla 3.
Hay seis sondas positivas, las cuales son:
- la sonda SEQ ID NO 1: la amplificación
HLA-DR, y el test de ensayo de hibridación, han
funcionado bien,
- la sondas SEQ ID NO 3: se encuentra presente
por lo menos un alelo DRB1*gr04,
- la sonda SEQ ID NO 4: se encuentra presente
por lo menos un alelo DRB1*gr0401,
- la sonda SEQ ID NO 9: se encuentra presente
por lo menos un alelo B*, pero no el B*27, debido al hecho de que,
la SEC ID NO 10, es negativa.
- la sonda SEQ ID NO 12: se encuentra presente
por lo menos un alelo DRB1*gr03, 11, 13 ó 14, y
- la sonda SEQ ID NO 19: se encuentra presente
por lo menos un alelo DRB1*03.
\vskip1.000000\baselineskip
Existe, por lo tanto, una presencia de un alelo
de susceptibilidad genética a la poliartritis reumatoidea, debido al
hecho de la presencia del alelo DRB1*gr0401 y del un alelo de
susceptibilidad genética al lupus eritematoso diseminado, debido al
hecho de la existencia del alelo DRB1*gr03, en el paciente. No
existe un alelo que concierna al B*27.
La tipificación HLA de esta cuarta muestra,
era:
- HLA-DRB1*gr0401/0301, y
- HLA-B, diferente de B*27.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo, era el de mejorar las condiciones
mediante las cuales debe realizarse la amplificación. Las
condiciones óptimas, se recopilan en la tabla 13 que se facilita
abajo, a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Las diferencias entre las condiciones de
amplificación de la tabla 1 y de la tabla 9, residen, por lo tanto,
en la elección de los cebadores P3 y P4 ligeramente modificados, de
nuevas concentraciones en cebadores P1, P2, P3 y P4, y una variación
de la temperatura en el programa de amplificación. El aporte, en los
resultados, de estas modificaciones, se precisa en las tablas 14, 15
y 16, las cuales corresponden, cada una de ellas, a una muestra
diferente de pacientes.
\vskip1.000000\baselineskip
La tipificación de esta primera muestra, es de
DB1*gr0404/52.
La tipificación de esta segunda muestra, es de
DB1*gr0401/gr0402.
\vskip1.000000\baselineskip
La tipificación de esta tercera muestra, es de
DB1*gr0403/gr0405.
Todos estos valores, son valores de DO,
multiplicados por mil (DO x 1000). Puesto que, el valor máximo
visible, es de 2,5, cuando la cifra es superior a este valor, se
indica únicamente que el valor es superior a 2500 (> 2500).
Se remarca el hecho de que, todos los valores
que son los más elevados, se han puesto de manifiesto mediante el
espesamiento de la línea. Se trata únicamente de sondas positivas.
Para la primera muestra, sobre los siete valores significativos,
todos parten de las condiciones optimizadas con relación a las
condiciones iniciales. Tres, se encuentran asociados a la
optimización de los cebadores y, cuatro, a la optimización de los
cebadores y la amplificación. Para la segunda muestra, sobre los
cinco valores significativos, todos ellos han nacido de las
condiciones optimizadas con relación a las condiciones iniciales.
Una, se encuentra asociada a la optimización de los cebadores, y
cuatro, a la optimización de los cebadores y de la amplificación.
Para la tercera muestra, sobre los siete valores significativos,
todos ellos parten de la condiciones optimizadas con relación a las
condiciones iniciales. Dos, se encuentran asociados a la
optimización de los cebadores y, cinco, a la optimización de los
cebadores y de la amplificación.
La optimización de la amplificación, solamente,
se justifica menos que la optimización de los cebadores, solamente,
o la optimización de los cebadores y de la amplificación. No
obstante, se remarca que, sobre las secuencias correspondientes a
diecinueve valores significativos, dieciocho, se encuentran a favor
de la optimización con relación a las condiciones iniciales.
\newpage
Comparando las técnicas de amplificación según
la tabla 1, y según la tabla 13, se percibe que, la amplificación,
es más eficaz cuando la concentración inicial en cebadores que
permiten la amplificación de la secuencia correspondiente a los
grupos de alelos DRB1*gr04, es superior a la concentración final en
cebadores que permiten la amplificación de la secuencia
correspondiente al alelo B27.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertos casos, pueden aparecer ambigüedades.
Así, de esta forma, al no ser, los cebadores, específicos del DR4,
se amplifican otros alelos, lo cual puede conllevar dificultades de
interpretación. Este es, por ejemplo el caso, en los tres ejemplos
que se facilitan posteriormente, a continuación, siendo entonces, la
única solución, la de efectuar una amplificación mayormente
pretendida como diana, sobre la DR4, con la ayuda de cebadores
particulares, tales como los descritos en la tabla 17, la cual se
facilita a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los ejemplos que muestran tales tipos de
ambigüedad y su resolución, son los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
En este caso, no es posible, sin tomar un riesgo
de diferenciar, en el grupo DRB1*gr04 (SEQ ID NO 3, es positiva),
entre DRB1*gr0401 (SEQ ID NO 4, es positiva), y DRB1*gr0402 (SEQ ID
NO 5, es positiva). El otro alelo, es un gr52 (SEQ ID NO 12, es
positiva). Además, las cifras brutas, tienden a privilegiar
DRB1*gr0402, debido al hecho de que, SEQ ID NO 5, tiene un valor
positivo de 1692, mientras que, para DRB1*gr0401, la SEQ ID NO 4, no
es positiva, más que con un valor de 182.
No obstante, el segundo análisis, permitirá
diferenciar estos dos alelos. Lo cual, se encuentra bien
representado en las tablas 20 y 21.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se ve bien, por lo tanto, sobre este segundo
análisis, el hecho de que se trata de DRB1*gr0401 (SEQ ID NO 4, es
positiva), mientras que, DRB1*gr0402 (SEQ ID NO 5, es negativa). La
diferenciación entre DRB1*gr041 y DRB1*gr0402, es por lo tanto
posible, lo cual tiene una gran incidencia, debido al hecho de que,
estos dos alelos, no tienen el mismo impacto sobre la poliartritis
reumatoidea. Así, de este modo, el DRB1*gr0401, se encuentra
asociado a la susceptibilidad genética a la poliartritis
reumatoidea y, DRB1*gr0402, se encuentra asociado a la resistencia
genética a la poliartritis reumatoidea.
La tipificación de esta primara muestra es, por
lo tanto, DRB1*gr0401/gr52.
\vskip1.000000\baselineskip
En este caso, no es posible, sin tomar un riesgo
de diferenciar, en el grupo DRB1*gr04 (SEQ ID NO 3, es positiva),
entre DRB1*gr040 (SEQ ID NO 7, es positiva), y DRB1*gr0405 (SEQ ID
NO 7 y SEQ ID NO 8, son las dos positivas). El otro alelo, es un
gr52 (SEQ ID NO 12, es positiva).
No obstante, el segundo análisis, permitirá
diferenciar estos dos alelos. Lo cual, se encuentra bien
representado en las tablas 24 y 25.
Se ve bien, por lo tanto, sobre este segundo
análisis, el hecho de que se trata de DRB1*gr0405 (SEQ ID NO 7 y
SEQ ID NO 8, son positivas), mientras que, si se tratara de
DRB1*gr0404, la SEQ ID NO 8, hubiera tenido que ser negativa. La
diferenciación entre DRB1*gr041 y DRB1*gr0405, es por lo tanto
posible, lo cual tiene una menor incidencia que en el ejemplo
precedente, debido al hecho de que, según nuestros conocimientos
actuales, estos dos alelos, tienen el mismo impacto sobre la
poliartritis reumatoidea. Así, de este modo, los DRB1*gr0401 y
DRB1*gr045, se encuentran ambos asociados a la susceptibilidad
genética a la poliartritis reumatoidea. En el bien entendido, la
importancia de este segundo análisis, podrá variar, si nuestros
conocimientos futuros, prueban un impacto más importante de uno de
estos dos alelos, con relación al otro.
La tipificación de esta segunda muestra es, por
lo tanto, DRB1*gr0405/gr52.
\vskip1.000000\baselineskip
En este caso, no es posible, sin tomar un riesgo
de diferenciar, en el grupo DRB1*gr04 (SEQ ID NO 3, es positiva),
entre DRB1*gr0404 (SEQ ID NO 7, es positiva), y DRB1*gr0405 (SEQ ID
NO 7 y SEQ ID NO 8, son las dos positivas). El otro alelo, es un
gr8 + 12 (SEQ ID NO 16, es positiva), el cual es neutro, para la
poliartritis reumatoidea o para la espondilartritis anquilosante,
según los conocimientos actuales. Debe notarse, igualmente, el hecho
de que, contrariamente a los dos ejemplos precedentes, se encuentra
presente un alelo B*27. El segundo análisis, permitirá diferenciar
estos dos alelos. Lo cual, se encuentra bien representado en las
tablas 28 y 29.
Se ve bien, por lo tanto, sobre este segundo
análisis, el hecho de que se trata de DRB1*gr0404, debido al hecho
de que, SEQ ID NO 7, es positiva y, SEQ ID NO 8, es negativa,
mientras que, si se tratara de DRB1*gr0405, la SEQ ID NO 8, hubiera
tendido que ser positiva, como en el ejemplo precedente. La
diferenciación entre DRB1*gr0404 y DRB1*gr0405, es por lo tanto
posible, lo cual tiene una menor incidencia que en el primer
ejemplo, debido al hecho de que, estos dos alelos, tienen el mismo
impacto sobre la poliartritis reumatoidea. Así, de este modo, la
DRB1*gr0404 y DRB1*gr045, se encuentran ambas asociadas a la
susceptibilidad genética a la poliartritis reumatoidea. No
obstante, se pueden reiterar las observaciones realizadas para la
segunda muestra.
La tipificación de esta tercera muestra es, por
lo tanto, DRB1*gr0404/gr8 + 12, con la presencia de por lo menos un
alelo B*27.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como lo demuestran estos ejemplos, el
procedimiento reivindicado, permite el practicar, de una forma
simultánea, en una o más etapas, la investigación de la
susceptibilidad genética a la poliartritis reumatoidea, basada sobre
un análisis totalmente dedicado a las informaciones esperadas por
parte del experto clínico (DR1, DR4, DR10, subtipos del DRB1*gr04,
presencia de la formación OKRAA, QRRAA y RRRAA, efecto dosis) e,
igualmente, la búsqueda del HLA-B*27, a menudo
informativa, en el momento de una consulta en reumatología.
La pertenencia de la información
HLA-DR y HLA-B27, se solicita, en el
momento de una consulta en reumatología. La simplicidad,
practicabilidad y rapidez del test de ensayo, en resumen, con un
impacto financiero importante, son las ventajas de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Baarsma, 1992:
Baarsma GS, Current Eye Research,
1992, suplementos 1-9.
\vskip1.000000\baselineskip
Benjamín, 1990:
Benjamin R, Parham P,
Immunology Today, 1990, 11, 137-142:
HLA-B27 and ankylosing spondylitis.
\vskip1.000000\baselineskip
Brewerton, 1973:
Brewerton DA, Caffrey M,
Hart FD et al., Lancet, 1973. 1,
904-907. Ankylosing spondylitis and
HLA-27.
\vskip1.000000\baselineskip
Domínguez, 1992:
Domínguez O. Coto E, Martínez
Naves E. CHOO SY, Lopez-Larrea C,
Immunogenetics, 1992, 36, 277-282.
Molecular typing of HLA-B27 alleles (RM H #
311).
\vskip1.000000\baselineskip
Gregersen, 1986:
Gregersen PK, Shen M. Song
QL, Merryman P, Degar S, Seki T, Maccari
J, Goldberg D, Murphy H, Schwenzer J, Wang CY,
Winchester RJ, Nepom GT, Silver J, Proc.
Natl. Sci. USA, 1986, 83, 2642-2646.
Molecular diversity of HLA-DRA haplotypes.
\vskip1.000000\baselineskip
Gregersen, 1987:
Gregersen PK, Silver J,
Winchester RJ, Arthritis Rheum., 1987, 30,
1205-1213. The shared epitope hypothesis. An
approach to understanding the molecular genetics of susceptibility
to rheumatoid arthritis.
\vskip1.000000\baselineskip
Hill, 1991:
Hill AVS et al., The Lancet,
1991, Marzo 16,
337-640-642).
\newpage
Hiraiwa, 1990:
Hiraiwa A, Yamanaka K, KwoK
WW, Mickelson EM, Masewicz S, Hansen JA,
Radka SF, Nepom GT, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1990, 87, 8051-8055. Structural requierements
for recognition of the HLA-Dw 14 class II epitope: a
key HLA determinat associated with rheumatoid arthritis.
\vskip1.000000\baselineskip
Khan, 1979:
Khan MA, Kushner I, Ballou
SP et al., Lancet, 1979, 921-922,
Familial rheumatoid arthritis and HLA-DRW4.
\vskip1.000000\baselineskip
Kirsveskari, 1997:
Kirsveskari H, Kellner H,
Wuorela M. Soini H, Frankenberger B,
Leirisalo-Repo M, Weiss EH,
Granfors K, Br. J. Rheumatol., 1997, 36,
185-189. False-negative serological
HLA-B27 typing results may be due to altered
antigenic epitopes and can be detected by polymerasa chain
reaction.
\vskip1.000000\baselineskip
Lawrance, 1970:
Lawrance J. Ann. Rheum. Dis.
1970, 29, 357-379.
\vskip1.000000\baselineskip
Nepom, 1989:
Nepom GT, Byers P, Seyfried
C. Haley LA, Wiske KR, Stage D, Nepo BS,
Arthritis Rheum., 1989, 32, 15-21. HLA
genes associated with rheumatoid arthritis. Identification of
susceptibility alleles using specific oligonucleotide probes.
\vskip1.000000\baselineskip
Nepom, 1991:
Nepom GT, Erlich H, Annu. Rev.
immmunol., 1991, 9, 493-525. MHC
class-II molecules and autoimmunity.
\vskip1.000000\baselineskip
Neumüller, 1993:
Neumüller J, Fischer M,
Elbert R, Rheumatol. Int. 1993, 13,
163-167. Faillure of the serological determination
of HLA-B27, du to antigen masking in patients with
ankylosing spondylitis.
\vskip1.000000\baselineskip
Schlosstein, 1973:
Schlosstein L, Terasaki PI,
Bluestone R, Pearson CM, N. Engl. J. Med.,
1973, 288, 704-706: High association of a
HL-A antigen, w27, with ankylosing spondylitis.
\vskip1.000000\baselineskip
Stastny, 1978:
Stastny P, N. Engl. J. Med.,
1978, 298, 869-871. Association of the
B-cell alloantigen DRw4 with rheumatoid
arthritis.
\vskip1.000000\baselineskip
Stastny, 1983:
Stastny P, Ball EJ, Dry PJ,
Nunez G. Immunol. Rev., 1983, 70,
113-154. The human immune response region
(HLA-D) and disease susceptibility.
\vskip1.000000\baselineskip
Stastny, 1988:
Stastny P, Ball E, Kahn M,
Olsen N. Pincus T, Gao X, Br. J.
Rheumatol., 1988, 27, 132-138.
HLA-DR4 and other genetic markers in rheumatoid
arthritis.
\newpage
Todd, 1988:
Todd JA,
Acha-Orbea H, Bell JI, Chao N,
Fronek Z, Jacob CO, McDermott M, Sinha
AA, Timmerman L, McDevitt HO, Science,
1988, 240, 1003-1009.
\vskip1.000000\baselineskip
Weiss, 1985:
Weiss EH, Kuon W, Doemer C,
Lang M, Riethmüller G. Immunobiolgy,
1985, 170, 367-380. A molecular approach to
analyze HLA and disease associations.
\vskip1.000000\baselineskip
Wordsworth, 1989:
Wordsworth BP, Lanchbury JS, LI,
Weish KI, Panayi GS, Bell JI, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1989, 86,
10049-10053.
<110> bioMerieux
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de análisis de la
predisposición genética de un paciente a por lo menos una enfermedad
y amplificación adaptada a un procedimiento de este tipo.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> HLASICK2
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Vers. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcgacagcg acgtgggg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatgaaactt atggggatac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatacttcta tcacca
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagcagaanc ggncc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggaagacg ancgg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcanangcn ggncnann
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagaggcgng nnncngtg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcctagcgcc gagta
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaatacctca tggagtggga gcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgccttngcc ttncagat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggcagctta agtttgaa
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptactctacgt ctgagt
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcctaaga gggagtg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnaggtngaca ncgtgtgc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaggaggtt aagtt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctacgggn gagt
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaacagccag aaggac
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgctctgg ttgtagtag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgggtggac aacnac
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggatcctt cgtgtcccca cagcacg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgccgctgc actgtgaag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggaggagcg aggggacccc ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggaggagcg aggggaccgc ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatctcggacc cggagact
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggggaccgc a
\hfill11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatctcggacc cggagactcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtttcttgga gcaggttaaa c
\hfill21
Claims (22)
1. Procedimiento de análisis de la
predisposición genética de un paciente a la poliartritris
reumatoidea, según el cual:
se procede a poner una muestra líquida que
contiene por lo menos un tipo de amplicón, procedente de la
amplificación de por lo menos una región polimorfa de interés en
relación con la poliartritis reumatoidea, en presencia de sondas
elegidas de la siguiente forma:
- -
- por lo menos una sonda de reducida resolución, capaz de hibridarse sobre el grupo de alelos DRB1*gr04,
- -
- por lo menos una sonda de alta resolución, asociada a la susceptibilidad genética a la Poliartritis Reumatoidea, capaz de hibridarse con los siguientes alelos: DRB1*0101, DRB1*gr0401, DRB1*gr0404, DRB1*gr0405, DRB1*gr0408 y DRB1*1402,
- -
- por lo menos una sonda de alta resolución, asociada a la resistencia genética a la Poliartris Reumatoidea, capaz de hibridarse con los siguientes alelos: DRB1*gr0402, DRB1*gr0403, DRB1*gr0406 y DRB1*gr0407,
permitiendo discriminar, la sonda o
las sondas de alta resolución, el alelo o alelos asociados a la
susceptibilidad a la Poliartritis Reumatoidea; y/o el alelo o alelos
asociados a la resistencia a la Poliartritis Reumatoidea, según su
hibridación o su no
hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que, se utiliza, por lo menos,
una sonda de reducida resolución, capaz de hibridarse sobre el grupo
de alelos DRB1*01 y DRB1*10.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2,
con el fin de detectar la presencia de otro alelo, cuando sólo se ha
detectado un solo alelo del grupo de alelos DRB1*gr04,
caracterizado por el hecho de que se utiliza, por lo menos,
una sonda capaz de hibridarse sobre los alelos siguientes: DRB1*02,
DRB1*03, DRB1*07, DRB1*08, DRB1*09, DRB1*11, DRB1*12, DRB1*13 y
DRB1*14.
4. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que, se
utiliza:
- una sonda SEQ ID NO 3, para la tipificación de
DRB1*gr04,
- dos sondas de alta resolución, asociadas a la
susceptibilidad genética a la poliartritis reumatoidea:
- \circ
- SEQ ID NO 4, para DRB1*gr0401, y
- \circ
- SEQ ID NO 7, para DRB1*0101, DRB1*gr0404, DRB1*gr0405, y DRB1*gr0408, DRB1*gr1402,
- dos sondas de alta resolución, asociadas a la
resistencia genética a la poliartritis reumatoidea:
- \circ
- SEQ ID NO 5, para DRB1*gr0402, y
- \circ
- SEQ ID NO 6, para DRB1*gr0403, DRB1*gr0406, DRB1*gr0407.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Procedimiento, según la reivindicación 4,
caracterizado por el hecho de que, se utiliza igualmente una
sonda de alta resolución, SEQ ID NO 8 específica de DRB1*gr0405,
asociada a la susceptibilidad genética a la Poliartritis
Reumatoidea.
6. Procedimiento, según la reivindicación 2
caracterizado por el hecho de que, se utilizan las dos sondas
siguientes para la tipificación:
- -
- SEQ ID NO 11, para el grupo de alelos DRB1*01, y
- -
- SEQ ID NO 15, para el alelo DRB1*10.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Procedimiento, según la reivindica 2, con el
fin de detectar la presencia de otro alelo, cuando se ha detectado
un solo alelo del grupo de alelos DRB1*gr04, caracterizado
por el hecho de que se utilizan cuatro sondas de tipificación
siguientes:
- -
- SEQ ID NO 13, para DRB1*02,
- -
- SEQ ID NO 14, para DRB1*07, DRB1*09,
- -
- SEQ ID NO 16, para DRB1*08, DRB1*12, y
- -
- SEQ ID NO 12, para DRB1*03, DRB1*11, DRB1*13, DRB1*14.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por el hecho de que,
cada sonda de reducida o de alta resolución, específica de los
alelos de susceptibilidad genética a la poliartritis reumatoidea y
otras enfermedades asociadas, comporta una de las formaciones
características siguientes: QKRAA, QRRAA ó RRRAA.
9. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por el hecho de que, se
utiliza por lo menos una sonda de control, capaz de hibridarse, con
el conjunto de los genes DRB1, para permitir la detección de todos
los genes DRB1, tal como la SEQ ID NO 1: TTC GAC AGC GAC GTG
GGG.
10. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que se
detectan, además, alelos de susceptibilidad genética a la
Espondilartritis Anquilosante y otras enfermedades asociadas, y que,
se utiliza, por lo menos, una sonda de reducida resolución, tal como
la SEQ ID NO 10, capaz de hibridarse sobre el gen
HLA-B, específico del grupo de alelos
HLA-B27.
11. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por el hecho de que,
se detectan, además, alelos de la susceptibilidad genética al Lupus
Eritematoso Diseminado, a las Conectividadades, al Síndrome de
Sjögren y otras enfermedades asociadas, caracterizado por el
hecho de que, se utiliza, por lo menos, una sonda de reducida
resolución, tal como la SEQ ID NO 19, capaz de hibridarse sobre el
gen HLA-DR, específico del grupo de alelos
HLA-DRB1^{+}03.
12. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por el hecho de que,
como mucho, se reemplazan un 38,89% de las bases de una misma sonda
de reducida resolución o de alta resolución, mediante por lo menos
una base análoga, tal como la inosina.
13. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por el hecho de que,
cada sonda específica de reducida resolución o de alta resolución,
se emplaza en un hoyo de una placa de microtítulo,
independientemente de las otras sondas.
14. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por el hecho de que,
todas las reacciones, se realizan simultáneamente.
15. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por el hecho de que,
previamente, se efectúa por lo menos una amplificación de la región
o regiones polimorfas de interés.
16. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado por el hecho de que,
previamente, se efectúan, de una forma simultánea, una amplificación
de la región o de las regiones polimorfas de interés
aso-
ciadas a la HLA-DR, y una amplificación de la región o de las regiones polimorfas de interés asociadas a las HLA-B.
ciadas a la HLA-DR, y una amplificación de la región o de las regiones polimorfas de interés asociadas a las HLA-B.
17. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, caracterizado por el hecho de que,
se efectúa una segunda amplificación de por lo menos una región más
pretendida como diana que aquélla ya efectuada sobre la región
polimorfa, siendo, esta región más pretendida como diana, una región
de interés, en relación con la enfermedad o enfermedades
investigadas y que, los amplicones obtenidos, se ponen en presencia
de las sondas anteriormente definidas.
18. Procedimiento, según la reivindicación 17,
caracterizado por el hecho de que, la primera amplificación,
se efectúa al mismo tiempo que la segunda amplificación más
pretendida como diana, o previamente a ella.
19. Procedimiento, según la reivindicación 17 ó
18, caracterizado por el hecho de que se efectúa una segunda
amplificación de por lo menos una región más pretendida como diana,
incluida en el grupo de alelos DBR1*gr04, utilizando el cebador SEQ
ID NO 27, en combinación con el cebador SEQ ID NO 21.
20. Procedimiento, según la reivindicación 10 y,
eventualmente, una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19,
caracterizado por el hecho de que se amplifica una secuencia
correspondiente del alelo B27, utilizando los cebadores SEQ ID NO
22, SEQ ID NO 23 y/o SEQ IND NO 25, en combinación con los cebadores
SEQ ID NO 24 y/o SEQ IND NO 26.
21. Procedimiento, según la reivindicación 20,
caracterizado por el hecho de que se procede a
amplificar:
- una secuencia correspondiente a los grupos de
alelos DR, utilizando el cebador SEQ ID NO 20, en combinación con el
cebador SEQ ID NO 21 y
- una secuencia correspondiente del alelo B27,
utilizando los cebadores SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23 y/o SEQ ID NO
25, en combinación con los cebadores SEQ ID NO 24 y SEQ ID NO
26.
22. Procedimiento, según la reivindicación 21,
en el cual, la concentración final en cebadores SEQ ID NO 20 y SEQ
ID NO 21, que permiten la amplificación de la secuencia
correspondiente a los grupos de alelos DR, es superior a la
concentración final en cebadores SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23 y/o SEQ
ID NO 25, en combinación con los cebadores SEQ ID NO 24 y/o SEQ ID
NO 26, que permiten la amplificación de la secuencia que permite la
amplificación de la secuencia correspondiente del alelo B27.
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