ES2276016T3 - Cebadores y sondas de doble uso para la mejora de ensayos de hibridaciones mediante la interrupcion de la formacion de estructuras secundarias. - Google Patents
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Abstract
Uso de un cebador de doble propósito para amplificar una secuencia de nucleótido diana en una molécula diana, conteniendo la secuencia de nucleótido diana un sitio de interés próximo o contenido dentro de una región que forma una estructura secundaria que, en ausencia del cebador, tiene como resultado una estructura secundaria no deseada en un amplicón formado en condiciones de amplificación de manera que se impide la detección del sitio de interés, comprendiendo el cebador: (a) una secuencia de cebador complementaria con un segmento de la secuencia de nucleótido diana distinta a la región que forma una estructura secundaria; y (b) una secuencia de bloqueo sustancialmente complementaria con un segmento de la región que forma la estructura secundaria para impedir la formación de la estructura secundaria no deseada.
Description
Cebadores y sondas de doble uso para la mejora
de ensayos de hibridaciones mediante la interrupción de la formación
de estructuras secundarias.
La presente invención se refiere de manera
general al uso de cebadores y sondas en ensayos de hibridación de
ácido nucleico, en particular, reacción en cadena de polimerasa
(PCR) y otros ensayos de amplificación, pudiéndose utilizar dicho
método en la detección y cuantificación de polimorfismos de un solo
nucleótido.
La hibridación de ácido nucleico es un método
muy extendido para identificar secuencias específicas de ácidos
nucleicos. La hibridación se basa en el emparejamiento entre hebras
de ácido nucleico complementarias. Se pueden utilizar
oligonucleótidos de hebra única que tienen secuencias conocidas como
sondas de hibridación para identificar secuencias diana de analitos
de ácido nucleico, exponiendo las sondas a soluciones de muestra
que contienen el analito de ácido nucleico de interés. Si un analito
de ácido nucleico hibrida con una sonda, el analito contiene
necesariamente la secuencia diana. Se han estudiado diversos
aspectos de este método en detalle. En esencia, todas las
variaciones permiten el emparejamiento de secuencias de base
complementarias y la formación de moléculas de doble hebra, y se
conoce una serie de métodos dentro de la técnica para determinar si
ha tenido lugar o no el emparejamiento, como por ejemplo los
descritos en la patente EE.UU. Nº 5.622.822 para Ekeze y cols. y la
patente EE.UU. Nº 5.256.535 para Ylikoski y cols.
Otro método para detectar la unión de una sonda
a una secuencia diana es el descrito por Whitcombe y cols. (1999),
"Detection o PCR products using self-probing
amplicons and fluorescence", Nature Biotechnology,
17:804-807. Dicho método implica el uso de una sonda
que contiene una secuencia de nucleótido que no se amplifica
durante la reacción en cadena de polimerasa (PCR), designándose la
sonda para formar una estructura de horquilla, en la que están en
proximidad de auto-extinción un fluoroforo y un
extintor de fluorescencia. Tras la desnaturalización e hibridación
con una secuencia de nucleótido diana, sin embargo, el segmento de
la sonda que estaba anteriormente en la estructura de horquilla se
hibrida con la secuencia diana amplificada y se puede detectar por
la mayor fluorescencia. Esta sonda "Escorpio"combina las
funciones de un cebador de PCR y una sonda de detección y
proporciona una mejor amplificación y detección, en parte gracias a
la naturaleza unimolecular de la reacción de unión de la sonda
fluorescente con la secuencia de nucleótido diana, que aumenta la
velocidad y el grado de reacción. Esta tecnología se describe
también en la patente EE.UU. Nº 5.525.494 para Newton.
La detección de la variación genética entre
individuos es otra aplicación de las tecnologías de hibridación
específicas de secuencia. La detección y el análisis de variaciones
alélicas o SNPs en ADN implica típicamente la extensión de cadena y
la amplificación con el uso de cebadores dirigidos para una
secuencia específica. El ADN amplificado se utiliza entonces como
diana para diversas sondas de oligonucleótido etiquetado para
identificar mutuaciones puntuales y variación de secuencia alélica.
Si, no obstante, el ADN diana forma estructuras secundarias
intramoleculares, es posible que el ADN no se hibride con el cebador
o las sondas de etiquetado de forma eficaz o en absoluto con el
resultado de una ausencia de la señal de la presencia o ausencia de
un SNP en la localización de la estructura secundaria.
Dichas estructuras secundarias intramoleculares
en un ácido nucleico de una sola hebra, como por ejemplo rARN o ADN
desnaturalizado, surgen de la formación intramolecular de enlaces de
hidrógeno entre las secuencias de nucleótido complementarias dentro
del propio ácido nucleico de una sola hebra. Esta estructura
secundaria residual puede inhibir estéricamente, o incluso
bloquear, la formación de híbrido entre un oligonucleótido, como
por ejemplo un oligómero de ADN o ARN que se utilice como sonda, y
su secuencia complementaria en el ARN o ADN (v.g., ARN ribosómico,
ARNm o ADN) que son diana de la sonda.
Existen numerosos casos en los que se topa con
dificultades para determinar la presencia o ausencia de SNPs en un
ácido nucleico diana concreto. Por ejemplo, citocromo P450 existe en
distintas variaciones alélicas, que están asociadas con el
metabolismo alterado de fármacos y/o susceptibilidad al cáncer. Una
variante de citocromo P450, el citocromo P450 CYP2D6, tiene un SNP
en cada uno de los cuatro exones del gen P450 CYP2D6. En los
experimentos realizados para determinar por ensayo la presencia de
estos SNPs, se ha topado con dificultades para detectar SNPs en los
exones 1 y 2, debido a una estructura secundaria significativa en
las regiones de interés analítico en estos exones. Si bien se
pueden amplificar los exones 1 y 2 con grupos de cebadores
convencionales, no se puede detectar el producto en el ensayo de
SNP. Los problemas para detectar por sonda los exones 1 y 2
tuvieron relación finalmente con la estructura secundaria
intra-molecular en estos dos amplicones. Dicha
estructura secundaria excluye la hibridación de las sondas de
discriminación específicas para alelo que podrían utilizarse en un
ensayo para estos SNPs. Las estructuras de estos exones se muestran
en la figura 1, en la que se puede observar que los exones 6 y 9
presentan una dificultad relativamente reducida para PCR e
hibridación con sondas de discriminación, mientras que los exones 1
y 2 presentan una estructura secundaria significativa en la región
del SNP. La región de análisis y el SNP se muestran en rojo en la
figura 1.
Una solución para este problema de potenciar la
hibridación de una sonda en una secuencia de nucleótido diana
cuando la secuencia diana forma estructuras secundarias
intramoleculares ha sido propuesta en la patente EE.UU. Nº
5.030.557 para Hogan y cols. En esta patente, Hogan y cols.
describen cómo la adición de una secuencia de ácido nucleico
colaboradora (helper) en un exceso molar (al menos aproximadamente 5
veces más el de la sonda y hasta 100 veces más o superior el de la
sonda) a la secuencia sonda de ácido nucleico ayuda a la hibridación
de la secuencia de sonda para obtener la secuencia diana. De hecho,
Hogan y cols., demuestran la eficacia de su método con el empleo de
relaciones molares del oligonucleótido colaborador al
oligonucleótido de sonda de 60:1, 100:1 y 250:1. Por otra parte,
Hogan y cols., señalan que los oligonucleótidos colaboradores
deberían ser de una longitud superior a la comprendida entre
aproximadamente 20 y aproximadamente 50 nucleótidos para ser
efectivos para bloquear la formación de la estructura
secundaria.
Por consiguiente, existe la necesidad dentro de
la especialidad de contar con mejores sondas de hibridación y
métodos para detectar secuencias contenidas dentro de las regiones
de una molécula diana que suelen formar una estructura secundaria
no deseada. El método descrito por Hogan y cols., proporciona una
solución de este tipo. Dicho método, sin embargo, presenta el
inconveniente de requerir un gran exceso de oligonucleótido
colaborador en relación con el oligonucleótido sonda, y de limitar
la longitud de los oligonucleótidos colaboradores.
Wilton y cols., Human Mutation, 1988, vol. 11,
pp 252-258, y Honeyman y cols., American Journal of
Veterinary Research, 1999, vol. 60, pp 734-737
describen el desarrollo de un método de vuelta a cero (sanpback) de
un análisis de polimorfismo de conformación de una sola hebra.
La presente invención está dirigida a cubrir la
necesidad que existe en la especialidad tal como se ha mencionado.
En un primer modo de realización, la invención proporciona el uso de
un cebador de doble propósito para amplificar una secuencia de
nucleótido diana en una molécula diana, conteniendo la secuencia de
nucleótido diana un sitio de interés próximo o contenido dentro de
una región que forma una estructura secundaria que, en ausencia del
cebador, tiene como resultado una estructura secundaria no deseada
en un amplicón formado en las condiciones de amplificación de
manera que se impide la detección del sitio de interés,
comprendiendo el cebador: una secuencia de cebador complementaria
con el segmento de la secuencia de nucleótido diana distinta a la
región de formación de estructura secundaria y una secuencia de
bloqueo sustancialmente complementaria con un segmento de la
estructura secundaria que forma la región para prevenir la formación
de la estructura secundaria no deseada. Un cebador que presenta
estas características combinadas es útil en un método para detectar
la presencia o ausencia de un sitio de interés (v.g., un SNP)
contenido dentro o próximo a la región de formación de estructura
secundaria, ocultándose el sitio de interés, en ausencia del
cebador, por la formación de la estructura secundaria no deseada.
En contraste con los métodos anteriores para detectar secuencias de
ácido nucleico que se "esconden" potencialmente dentro de una
estructura secundaria, como pueda ser en los métodos que se han
explicado, la presente invención da cabida a una amplificación
mediante el uso de un oligonucleótido de cebador, conteniendo el
cebador una secuencia de bloqueo que puede ser sustancialmente más
corta que las sondas de bloqueo de la técnica anterior (v.g., las
descritas por Hogan y cols.), y que no tiene que tener una
complementaridad perfecta con la región en la molécula diana que
forma la estructura secundaria no deseada.
En otro modo de realización, se proporciona un
método para el uso del cebador de doble propósito en un método para
amplificar una secuencia de nucleótido diana en una molécula diana,
conteniendo la secuencia de nucleótido diana un sitio de interés
próximo o contenido dentro de una región que forma una estructura
secundaria que puede de formar una estructura secundaria no deseada
en un amplicón formado en las condiciones de amplificación de
manera que se impida la detección del sitio de interés, y dicho
método comprende: contacto de la secuencia de nucleótido diana en
las condiciones de hibridación, a la vez o de forma sucesiva con un
cebador de doble propósito de la invención que es complementario con
un término de una primera hebra de la molécula diana, un segundo
cebador complementario con el término opuesto de la segunda hebra de
la molécula diana, nucleótidos apropiados para la amplificación y
un agente para la polimerización de los nucleotidos (v.g., una
polimerasa), no conteniendo los amplicones formados durante el
método la estructura secundaria no deseada, de manera que el sitio
de interés es accesible a un oligonucleótido de hibridación.
En otro modo de realización, la invención
proporciona el uso de una sonda de hibridación en un ensayo de
hibridación para detectar la presencia de una secuencia de
nucleótido diana en una molécula diana, comprendiendo la sonda de
hibridación (a) una secuencia de nucleótido sonda complementaria con
una primera sonda de nucleótido en la molécula diana y (b) una
secuencia de bloqueo que es sustancialmente complementaria con una
segunda secuencia de nucleótido en la molécula diana, impidiendo la
hibridación de la secuencia de bloqueo con la segunda secuencia de
nucleótido la formación de una estructura secundaria en la segunda
secuencia de nucleótido que podría interferir si no con la
hibridación de la secuencia de sonda con la primera secuencia de
nucleótido. La sonda de hibridación puede utilizarse en cualquier
formato de ensayo. La invención proporciona además un método para
llevar a cabo un ensayo de hibridación para detectar la presencia de
una secuencia de nucleótido diana en una molécula diana, estando
próxima la secuencia de nucleótido diana, o contenida dentro de una
región de formación de estructura secundaria que puede formar una
estructura secundaria que podría impedir la detección de la
secuencia de nucleótido diana, comprendiendo el método el contacto
de la molécula diana en condiciones de hibridación con dicha sonda
de hibridación, de manera que dicha hibridación de la sonda con la
molécula diana impide la formación de la estructura secundaria no
deseada y permite la detección de la secuencia de nucleótido
diana.
La figura 1 ilustra de manera esquemática la
estructura de los exones 1, 2, 6 y 9 (SEQ ID Nos:
24-27, respectivamente) del citocromo P450 CYP2D6,
presentándose el sitio en cada región SNP sombreada en gris.
La figura 2 ilustra de manera esquemática un
gráfico esquemático global de los cebadores y las sondas utilizados
para detectar un SNP en modo multiplex, y la detección utilizando
microsferas Luminex^{TM}.
La figura 3 ilustra de manera esquemática la
estructura secundaria de inferferencia que contiene el SNP en el
exon 1 (radicales 142-195 de SEQ ID NO:24) del
citocromo P450 CYP2D6, que demuestra que el SNP está relacionado
con una horquilla de una sola hebra (estando la región SNP sombreada
en gris). Un oligonucleótido de bloque (SEQ ID NO: 28) se hibridará
con los nucleótidos relacionados con la estructura secundaria
intramolecular potencial para inhibir su formación y permitir así
la detección del SNP.
La figura 4 es un gráfico en el que se muestra
la señal de detección para el SNP en el exon 1 del citocromo P450
CYP2D6 cuando está presente la secuencia de bloqueo y la
correspondiente señal de detección cuando está ausente la secuencia
de bloqueo.
La figura 5 ilustra de manera esquemática la
estructura y el mecanismo de acción de un cebador de doble
propósito según la invención. La secuencia de bloqueo (que se
denomina "región de bloqueo" y "B" en la figura) y la
secuencia de cebador (denominada "región de cebador" y "P"
en la figura) están unidos a través de una región espaciadora
"S", en la que la base opcional "O" aparece entre S y P.
La base opcional impide el cebado no deseado 5' con la secuencia de
cebador P. La secuencia de cebador es complementaria con uno de los
términos de la molécula diana que contiene el sitio SNP (designado
"X") y la secuencia de bloqueo es sustancialmente
complementaria con la secuencia B' inmediatamente adyacente a X,
siendo B' el segmento de la molécula diana responsable de generar
una estructura secundaria intramolecular que, en ausencia del
cebador de doble propósito, ocultaría el sitio de SNP desde la
secuencia complementaria (impidiendo de este modo la hibridación y
la detección). Después de la amplificación de la secuencia de
nucleótido diana y el reanillado, B se hibrida con B' en el
amplicón, bloqueando la formación de la estructura secundaria no
deseada. La detección del sitio de SNP se completa utilizando una
sonda de etiqueta (denominada en las figuras como "Sonda de
Etiqueta ASH").
La figura 6 presenta un gel de análisis que
demuestra que los cebadores de doble propósito con los insertos de
secuencia bloqueadora de 8, 10 y 12 nucleótidos generaran todos
ellos una banda principal del tamaño esperado.
La figura 7 ilustra de manera esquemática la
hibridación diferencial multiplex con los cebadores de doble
propósito de la invención.
La figura 8 es un gráfico de barras en el que se
comparan los resultados del ensayo PCR multiplex utilizado para
detectar los SNP en el exon 1 del gel del citocromo P450 CYP2D2
(ensayo de SNP) utilizando los cebadores de doble propósito de la
invención que tienen insertos de 8, 10 y 12 nucleótidos, cebadores
convencionales y cebadores convencionales utilizados en combinación
con un oligonucleótido de bloqueo.
La figura 9 es un gráfico de barras con el que
se demuestran los resultados de genotipo del citocromo P450 de un
ensayo de SNP multiplex llevado a cabo en cuatro muestras de
pacientes individuales.
La figura 10 ilustra de manera esquemática una
sonda de doble propósito que impide la formación de una estructura
secundaria no deseada y que también permite la detección por
ligación de SNP.
Antes de describir la presente invención en
detalle, debe entenderse que, a no ser que se indique de otro modo,
la presente invención no se limita a fuentes de ADN específicas,
secuencias específicas o formatos de ensayo específicos, ya que
éstos pueden variar. También debe entenderse que la terminología
utilizada en el presente documento tiene como propósito describir
modos de realización concretos solamente, no pretendiéndose que sea
limitativa.
Debe entenderse que, tal como se utiliza en la
presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas,
las formas en singular "un", "una" y las plurales
"los" "las" incluyen referentes plurales a no ser que se
señale de forma clara por el contexto. Por lo tanto, por ejemplo, la
expresión "un oligonucleótido" debe entenderse como un solo
oligonucleótido o como dos o más oligonucleótidos que pueden ser
iguales o diferentes, y similares.
Al describir y reivindicar la presente
invención, se utilizará la siguiente terminología con arreglo a las
definiciones que se indican a continuación.
Debe apreciarse que, tal como se utilizan aquí,
los términos "nucleósido" y "nucleotido" se refieren a
nucleósidos y nucleótidos que contienen no solamente las base de
purina y pirimidina convencionales, es decir adenina (A), timidina
(T), citosina (C), guanina (G) y uracilo (U), sino también a
nucleósidos y nucleótidos modificados. Dichas modificaciones
incluyen, sin limitarse sólo a ellas, metilación o acilación de una
fracción de purina o pirimidina, sustitución por una estructura de
anillo heterocíclico diferente de un anillo de pirimidina o uno o
ambos anillos en el sistema de piridina, y protección de una o más
funcionalidades, v.g., utilizando un grupo protector como acetilo,
difluoroacetilo, trifluoroacetilo, isobutirilo, benzoílo y
similares. Los nucleósidos y nucleótidos modificados también
incluyen modificaciones en la fracción azúcar, v.g., estando uno o
más de los grupos hidroxilo reemplazados con sustituyentes haluro
y/o hidrocarbilo (típicamente, grupos alifáticos, en este último
caso), o funcionalizados como éteres, aminas o similares. Entre los
análogos comunes se incluyen, sin limitarse sólo a ellos,
1-metiladenina, 2-metiladenina,
N^{6}-metiladenina,
N^{6}-isopentil-adenina,
2-metiltio-N^{6}-isopentiladenina,
N,N-dimetiladenina, 8-bromoadenina,
2-tiocitosina, 3-metilcitosina,
5-metilcitosina, 5-etilcitosina,
4-acetilcitosina, 1-metilguanina,
2-metilguanina, 7-metilguanina,
2,2-dimetilguanina,
8-bromo-guanina,
8-cloroguanina, 8-aminoguanina,
8-metilguanina, 8-tioguanina,
5-fluoro-uracilo,
5-bromouracilo, 5-clorouracilo,
5-yodouracilo, 5-etiluracilo,
5-propiluracilo, 5-metoxiuracilo,
5-hidroximetiluracilo,
5-(carboxihidroximetil)uracilo,
5-(metil-aminometil)uracilo,
5-(carboximetilaminometil)-uracilo,
2-tiouracilo,
5-metil-2-tiouracilo,
5-(2-bromovinil)uracilo, ácido
uracil-5-oxiacético, éster metílico
de ácido uracil-5-oxiacético,
pseudouracilo, 1-metilpseudouracilo, querosina,
inosina, 1-metilinosina, hipoxantina, xantina,
2-aminopurina, 6-hidroxiaminopurina,
6-tiopurina, y 2,6-diaminopurina.
Se pueden incorporar iso-guanina e
iso-citosina en los oligonucleótidos para reducir
la reactividad cruzada potencial entre secuencias cuando no se desea
la hibridación.
Tal como se utiliza aquí, el término
"oligonucleótido" abarca polidesoxirribonucleótidos (que
contienen
2-desoxi-D-ribosa),
polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa),
cualquier otro tipo de polinucleótido que sea una
N-glucosida de una base purina o pirimidina, y otros
polímeros que contienen estructuras no nucleotídicas (v.g., ácidos
nucleicos de proteína y polímeros de ácido nucleico específicos para
secuencia sintética que que están distribuidos en el comercio por
Anti-Gene Development Group, Corvallis, Oregon, como
polímeros Neugene^{TM}) o uniones no estándar, siempre y cuando
los polímeros contengan núcleobases en una configuración que dé
cabida a un emparejamiento de bases y un apilado de bases, tal como
se encuentra en ADN y ARN. Por lo tanto, "oligonucleótidos"
aquí incluyen ADN de doble hebra y hebra simple, así como ARN de
doble hebra y de hebra simple e híbridos ADN: ARN, y también
incluye los tipos conocidos de oligonucleótidos modificados, como
por ejemplo oligonucleótidos en los que está sustituido uno o más
nucleótidos naturales con un análogo; oligonucleótidos que contienen
modificaciones de internucleótido como, por ejemplo, las uniones
sin carga (v.g., fosfonatos de metilo, fosfotriésteres,
fosforamidas, carbamatos, etc.), enlaces de carga negativa (v.g.,
fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.) y uniones de carga positiva
(v.g., aminoalquilfosforamidatos, aminoalquilfosfotriésteres), los
que contienen fracciones pendientes, como por ejemplo proteínas
(incluyendo nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal,
poli-L-lisina, etc.), los que tienen
intercaladores (v.g., acridina, psoralen, etc.), los que contienen
queladores (v.g., metales, metales radioactivos, boro, metales
oxidantes, etc.) y los que contienen agentes de alquilación. No se
pretende establecer una distinción de longitud entre los términos
"polinucleótido" y "oligonucleótido", y estos términos se
utilizaran indistintamente. Estos términos se refiere únicamente a
la estructura primaria de la molécula. Tal como se utilizan aquí,
los símbolos para los nucleótidos y polinucleótidos se ajustan a
las recomendaciones de nomenclatura de la comisión de bioquímica de
la IUPAC-IUB (Biochemistry: 9:4022,
1970).
Los oligonucleótidos se pueden sintetizar a
través de métodos conocidos. Entre los documentos de referencia de
la técnica anterior que se refieren de forma general a los métodos
para sintetizar oligonucleótidos se incluyen aquellos que están
relacionados con la síntesis 5'- a 3' en función del uso de grupos
protectores de \beta-cianoetil fosfato, v.g.,
Napoli y cols. (1984) Gazz Chim Ital 114:65; Rosenthal y
cols. (1983) Tetrahedron Lett 24:1691; Belagaje y Brush
(1977) Nuc Acids Res 10:6295; en documentos de referencia
que describen la síntesis de 5'-a 3' en fase
solución incluyen Hayatsu y Khorana (1957) J Am. Chem.
Soc. 89:3880; Gait y Sheppard (1977) Nuc Acids Res
4:1135; Cramer y Koster (1968) Angew Chem. Int. Ed. Engl.
7:473; y Blackburn y cols. (1967) J. Chem. Soc. Part C., en
2438. Adicionalmente Matteucci y Caruthers (1981) J. Am. Chem.
Soc. 103:3185-91 describen el uso de
fosfocloriditas en la preparación de oligonucleótidos. Beaucage y
Caruthers (1981) Tetrahedron Lett.
22:1859-62, y patente EE.UU. Nº 4.415.732 describen
el uso de fosforamiditas para la preparación de oligonucleótidos.
Smith, Am. Biotech Lab (ABL) 15-24
(diciembre 1983) describe la sintesis de
oligodesoxirribonucleótido en fase sólida automatica. Ver también
los documentos de referencia aquí citados, y Warner y cols., (1984)
ADN 3:401-11, cuyas descripciones se
incorporan en el presente documento como referencia. T. Horn y M.S.
Urdea (1986) ADN 5:421-25 describen la
fosforilación de fragmentos de ADN soportados en sólido utilizando
bis(cianoetoxi)-N,N-diisopropil-aminofosfina.
Ver también. T. Horn y M.S. Urdea (1986) Tetrahedron Lett.
27:4705-08.
Tal como se utiliza aquí, el término
"sonda" se refiere a una estructura que comprende un
polinucleótido que forma una estructura híbrida con una secuencia
diana contenida en la molécula (una "molécula diana") en una
muestra que se está sometiendo a análisis, debido a la
complementaridad de al menos una secuencia en la sonda con la
secuencia diana. Los nucleótidos de cualquier sonda en particular
pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o análogos de
nucleótido sintéticos. El término "cebador" se refiere a un
oligonucleótido, ya se produzca de manera natural, como por ejemplo
un digesto de restricción purificado, o se produzca por síntesis,
que es capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis cuando se
coloca en condiciones en las que se induce la síntesis de un
producto de extensión de cebador que es complementario con la hebra
de ácido nucleico, es decir, en presencia de los nucleótidos
apropiados y un agente para la polimerización, como por ejemplo ADN
polimerasa, en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada.
El término "soporte" se refiere a cualquier
superficie sólida (incluyendo superficies
semi-sólidas) a las que se puede anclar una sonda,
una molécula de analito o cualquier otra entidad química. Entre los
materiales de soporte adecuados se incluyen, sin limitarse sólo a
ellos, soportes que se utilizan típicamente para síntesis química
en fase sólida, v.g., materiales poliméricos (v.g., poliestireno,
poliacetato de vinilo, policloruro de vinilo, polivinil
pirrolidona, poliacrilonitrilo, poliacrilamida, polimetacrilato de
metilo, politetrafluoroetileno, polietileno, polipropileno,
polifluoruro de vinilideno, policarbonato, polímeros a base de
divinilbenceno estireno), agarosa (v.g., Sepharosa®), dextrano
(v.g., Sephadex®), polímeros celulósicos y otros polisacáridos,
sílice y materiales a base de sílice, vidrio (en particular vidrio
de poro controlado o "CPG") y vidrios funcionalizados y
cerámicas. Entre los soportes preferibles se incluyen sustratos
sólidos en forma de perlas o partículas, incluyendo micropartículas
y nanopartículas.
Se entiende por "PCR" en el presente
documento la técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR)
descrita por Mullis en la patente EE.UU. Nº 4.683.195 (Mulis y
cols.) y 4.683.202, que se incorpora en el presente documento como
referencia. En la técnica PCR, se preparan cebadores de
oligonucleótido cortos que ajustan extremos opuestos de una
secuencia deseada. La secuencia entre los cebadores no tiene por qué
ser conocida. Se extrae una muestra de ADN (o ARN) y se
desnaturaliza (preferiblemente por calor). A continuación, se
añaden los cebadores de oligonucleótido en un exceso molar, junto
con dNTP y una polimerasa (preferiblemente, Taq polimerasa, que es
estable al calor). Se replica el ADN, y luego se vuelve a
desnaturalizar. Esto tiene como resultado dos "productos
largos" que empiezan con los cebadores correspondientes, y las
dos hebras originales (la molécula de ADN por duplicado). A
continuación, se retorna a las condiciones de polimerización la
mezcla de reacción (v.g., reduciendo la temperatura, inactivando el
agente de desnaturalización, o añadiendo más polimerasa) y se
inicia un segundo ciclo. El segundo ciclo proporciona las dos hebras
originales, los dos productos largos del ciclo 1, dos nuevos
productos largos (replicados de las hebras originales) y dos
"productos cortos" replicados de los productos largos. Los
productos cortos tienen la secuencia de la secuencia diana (sentido
y antisentido) con un cebador en cada extremo. En cada ciclo
adicional, se producen dos productos largos adicionales, y una
serie de productos cortos igual al número de productos largos y
cortos que queda en el extremo del ciclo anterior. Según esto, el
número de productos cortos crece exponencialmente con cada ciclo.
Esta ampli-
ficación de una secuencia de analito específico permite la detección de cantidades de ADN extremadamente pequeñas.
ficación de una secuencia de analito específico permite la detección de cantidades de ADN extremadamente pequeñas.
El término "3SR" tal como se utiliza aquí
se refiere a un método de amplificación de ácido nucleico diana, y
también es conocido como sistema de "replicación de secuencia
auto-sostenida", tal como se describe en la
publicación de patente europea Nº 373.960 (publicada el 20 de junio
de 1990).
El término "LCR" tal como se utiliza aquí
se refiere a un método de amplificación de ácido nucleico diana
también conocido como "reacción en cadena de ligasa" tal como
lo describe Barany (1991) Proc. Nat. Acad. Sci.
88:189-193.
La expresión "condiciones de hibridación"
se refiere a las condiciones de tiempo, temperatura y pH, y las
cantidades y concentraciones de reactivos y agentes de reacción
necesarias, suficientes para permitir el anillamiento de al menos
una porción de secuencias complementarias entre sí. Tal como se
conoce en la especialidad, el tiempo, la temperatura y las
condiciones de pH necesarias para llevar a cabo la hibridación
dependen del tamaño de la sonda de oligonucleótido que se va a
hibridar, el grado de complementaridad entre la sonda de
oligonucleótido y la diana y la presencia de otros materiales en la
mezcla de reacción de hibridación. Las condiciones reales
necesarias para cada etapa de hibridación son conocidas en la
especialidad o se pueden determinar sin excesiva
experimentación.
Las condiciones de hibridación típicas incluyen
el uso de soluciones tamponadas a un pH de aproximadamente 7 a
aproximadamente 8,5 y temperaturas comprendidas entre
aproximadamente 30ºC y aproximadamente 60ºC, preferiblemente de
aproximadamente 37ºC a aproximadamente 55ºC durante un período de
tiempo comprendido entre aproximadamente un segundo y
aproximadamente un día, preferiblemente, de aproximadamente 15
minutos a aproximadamente 16 horas, siendo sobre todo preferible de
aproximadamente 15 minutos a aproximadamente tres horas.
Las "condiciones de hibridación" también
incluyen un tampón efectivo. Es posible utilizar cualquier tampón
que sea compatible, es decir, químicamente inerte, en relación con
las sondas y otros componentes, y que además permita la hibridación
entre los pares de base complementarios. Un tampón preferible en
particular comprende 3X SSC, 50% de formamida, 10% de sulfato de
dextrano (PM 500.000), 0,2% de casína, 10 \mug/mL de poly A, y
100 \mug/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, siendo 1X
SSC cloruro sódico 0,15 M y citrato sódico 0,015 M. Un tampón
particularmente preferible comprende 5X SSC, dodecil sulfato sódico
al 0,1 a 0,3%, sulfato de dextrano al 10%, ZnCl_{2} 1 mM, y
MgCl_{2} 10 mM, siendo 1X SSC como se ha definido antes. Otros
tampones adecuados son conocidos entre las personas especializadas
en la técnica.
El término "molécula diana" se refiere a
una molécula que contiene un segmento nucleotídico, ya sea
oligomérico o polimérico, o que esté compuesto enteramente de un
oligonucleótido o polinucleótido. Un "genoma diana" tal como
se utiliza aquí, se refiere a un polinucleótido que codifica una o
más proteínas destinadas a ser analizadas según el método de la
presente invención. El genoma diana es generalmente un genoma de
mamífero, preferiblemente, un genoma humano, aunque también puede
ser viral o bacteriano. Entre los genomas diana se incluyen, sin
limitarse sólo a ellos virus de la hepatitis A humana (HAV), virus
de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la
hepatitis D (HDV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus
de papiloma humano (HPV), citomegalovirus (CMV), virus herpes
simplex (HSV) y virus de papiloma bovino (BPV).
El término "singleplex" se refiere a un
ensayo único que no se lleva a cabo simultáneamente con ningún otro
ensayo. No obstante, un ensayo "singleplex" se utiliza para
referirse a ensayos individuales que se llevan a cabo
sucesivamente. Generalmente, los ensayos son ensayos de
hibridación.
El término "multiplex" se refiere a ensayos
múltiples que se llevan a cabo de manera simultánea, en los que las
etapas de detección y análisis se llevan a cabo en paralelo
generalmente. Como en el caso anterior, los ensayos son típicamente
ensayos de hibridación.
Los términos "complementario" y
"sustancialmente complementario" se refiere a emparejamiento de
bases entre nucleótidos y ácidos nucleicos, como por ejemplo, entre
dos hebras de una molécula de ADN de doble hebra o entre un cebador
de oligonucleótido y un sitio de unión de cebador en un primer ácido
nucleico de hebra simple que se va a secuenciar o amplificar. Los
nucleótidos complementarios son generalmente A y T (o A y U), o C y
G. Se dice que dos moléculas de ARN o ADN de hebra simple son
"complementarias" cuando los nucleótidos de una hebra,
óptimamente alineada y comparada y con inserciones o supresiones de
nucleótido apropiadas, se empareja con al menos un 90% o 95% y más
preferiblemente al menos aproximadamente 98 a 99,5%. Se dice que
las dos moléculas de ADN o ARN de hebra simple son
"sustancialmente complementarias" cuando los nucleótidos de
una hebra, óptimamente alineados y comparados con inserciones y
supresiones de nucleótido apropiadas, se emparejan con al menos
aproximadamente un 80% de los nucléotidos de la otra hebra.
El término "ligador de arresto" tal como se
utiliza aquí se refiere a un ligador nucleotídico o no nucleotídico
en una sonda o un cebador, que no se amplifica mediante enzima de
amplificación.
La expresión "etiqueta detectable" tal como
se utiliza aquí se refiere a un átomo o molécula que se puede
utilizar para proporcionar una señal detectable (preferiblemente
cuantificable) y que se puede unir a un ácido nucleico o proteína a
través de un enlace covalente o una interacción no covalente (v.g.,
a través de una unión iónica o de hidrógeno, o través de
inmovilización, adsorción o similares). Las etiquetas proporcionan
generalmente señales detectables por fluorescencia,
quimioluminiscencia, radioactividad, colorimetría, espectrometría
de masa, difracción o absorción de rayos X, magnetismo, actividad
enzimática, o similares. Entre las etiquetas adecuadas se incluyen
fluoroforos, cromoforos, átomos radioactivos (en particular ^{32}P
y ^{125}I), reactivos con densidad de electrones, enzimas y
ligandos que tienen socios de unión específicos. Las enzimas se
detectan típicamente por su actividad. Por ejemplo, peroxidasa de
rábano picante (HRP) se detecta normalmente por su capacidad para
convertir 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) en un
pigmento azul, que se puede cuantificar con un espectrofotómetro.
Debe entenderse que con la descripción indicada no se pretende
categorizar las distintas etiquetas en clases diferentes, ya que se
puede detectar una etiqueta única utilizando dos o más métodos
diferentes. Por ejemplo, ^{125}I puede servir como etiqueta
radioactiva y como reactivo de densidad de electrones. HRP puede
servir como enzima o como antígeno para un anticuerpo monoclonal
(MAb). Por otra parte, se pueden combinar varias etiquetas para
conseguir un efecto deseado. Por ejemplo, MAbs y avidina también
requieren etiquetas en la práctica de la presente invención: según
esto, se podría etiquetar una sonda con biotina, y detectar su
presencia con avidina etiquetada con ^{125}I, o con una
anti-biotina Mab etiquetada con HRP, o con una
molécula de HRP conjugada con avidina o estreptavidina. Otras
permutaciones y posibilidades serán evidentes enseguida para las
personas especializadas en la técnica, y se consideran como
equivalentes.
Tal como se utiliza aquí, el término
"secuencias de solapamiento" se refiere a dos secuencias de
oligonucleótido que comparten una secuencia común parcial. Por
ejemplo, los oligonucleótidos GAATTC y AATTCC se solapan en su
secuencia común AATTC. Dado que estos dos oligonucleótidos se
derivan ambos de la secuencia GAATTCC, pero tienen un punto de
partida de un nucleótido de diferencia, se dice que los dos
nucleótidos se solapan en un nucleótido.
Tal como se utiliza aquí, el término "sonda
discontinua" se refiere a una sonda de oligonucleótido que tiene
dos o más regiones que corresponden a dos o más regiones no
continuas de un ácido nucleico diana. Las dos o más regiones de la
sonda están unidas covalentemente, ya sea directamente, a través de
una secuencia de nucleótido de intervención, o a través de una
fracción de unión orgánica (refiriéndose la "fracción de unión
orgánica" a una molécula orgánica espaciadora esencialmente
lineal capaz de unirse en sus dos extremos a dos oligonucleótidos
distintos.
El término "amplicon" se refiere al
producto de amplificación que es el resultado de la amplificación
de una secuencia de ácido nucleico utilizando reacción en cadena de
polimerasa (PCR), reacción en cadena de ligasa (LCR) o una técnica
de amplificación alternativa.
Para su uso en el método de la presente
invención, el amplicón debe estar etiquetado. En una primera
técnica, se utilizan cebadores etiquetados durante la etapa de
amplificación, en virtud de lo cual se incorporan los amplicones
etiquetados como cebadores etiquetados en los amplicones. Los
cebadores etiquetados se distribuyen en el comercio por proveedores
como CPG, Inc (Lincoln Park, Nueva Jersey) o se pueden preparar por
conjugación de una etiqueta con un cebador no etiquetado. El
etiquetado de oligonucleótidos, como por ejemplo cebadores, se
puede llevar a cabo empleando los procedimientos de acoplamiento
convencionales. No obstante, los procedimientos de acoplamiento
específicos variarán dependiendo del grupo reactivo o los grupos
presentes en la etiqueta y/o el oligonu-
cleotido.
cleotido.
Por ejemplo, se dispone de los procedimientos de
traducción nick conocidos entre las personas especializadas en la
técnica, para sustituir un nucleótido sin etiquetar por un
nucleótido etiquetado a través del uso de ADNasa I y otras enzimas,
proporcionando de este modo un amplicon etiquetado. Otro método para
etiquetado incluye la adición de una desoxinucleotidilo transferasa
terminal de desoxinucleotido etiquetada (TdT, comercializada por
proveedores como PanVera Corp., Madison, Wisconsin), una ADN
polimerasa que puede catalizar la adición de desoxinucleótidos
etiquetado a extremo 3' de fragmentos de ADN.
Una segunda técnica para preparar amplicones
etiquetados implica una etapa de etiquetado por separado en la que
se acoplan sucesivamente amplicones sin etiquetar a una etiqueta.
Las técnicas descritas en relación con los cebadores de etiquetado
se pueden utilizar también para unir etiquetas a amplicones sin
etiquetar.
Se puede unir cualquier tipo de etiqueta al
amplicón. Entre las etiquetas preferibles se incluyen las
fracciones detectables por medios de espectroscopía, fotoquímicos,
bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Dichas etiquetas incluyen,
sin limitación, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes,
colorantes, biotina, haptenos, enzimas, sustratos de enzima,
cofactores de enzima, inhibidores de enzima, subunidades de enzima,
iones metálicos, reactivos de densidad de electrones e isótopos
radioactivos (v.g., ^{32}P). La fracción de etiqueta puede estar
unida directa o indirectamente al amplicón. Preferiblemente, la
etiqueta deberá seleccionarse para soportar las condiciones de
desnaturalización si ha de unirse directamente al cebador.
Preferiblemente, aunque no es necesario, la etiqueta es biotina,
que se puede detectar a través de la unión con estreptavidina a un
fluorescente, v.g., un conjugado
estreptavidina-ficoeritrina.
Tal como se utiliza aquí, el término
"muestra" se refiere a un fluido o tejido obtenido de un
organismo (v.g., un organismo mamífero, como por ejemplo el ser
humano) que contiene el analito de ácido nucleico que se va a
caracterizar. Dichas muestras son conocidas dentro de la
especialidad e incluyen, sin limitación: sangre; plasma, suero;
fluido espinal, fluido linfático, lisatos celulares, semen,
secreciones de la piel o los tractos respiratorio, intestinal o
genitourinario, lágrimas, saliva, leche y glóbulos blancos.
El término "polimorfismo de un solo
nucleótido" (o "SNP") se refiere a una secuencia de ácido
nucleico que difiere en la secuencia en tan sólo un ácido nucleico
con respecto a una secuencia de ácido nucleico de referencia,
estando asociada la presencia del SNP con una enfermedad u otro
estado patológico distintivo y, sirviendo así como una importante
función de diagnóstico. Tal como se ilustra en la figura 1, puede
estar dispuesto un sitio de interés, como por ejemplo SNP, dentro o
cerca de una estructura secundaria intramolecular y, por tanto, no
estar disponible para la hibridación con una sonda de hibridación
específica para secuencia. Para interrumpir la estructura
secundaria y hacer que se puedan detectar las secuencias
"enmascaradas", es deseable interrumpir la región de la
secuencia de nucleótido objetivo utilizando una sonda de bloqueo, de
manera que la secuencia de interés no participe en una estructura
secundaria no deseable y se "oculte" esencialmente de una
sonda de hibridación. En la patente EE.UU. Nº 5.030.557 para Hogan y
cols. se sugiere que la adición de una sonda de bloqueo extraña es
efectiva para prevenir la formación de dicha estructura secundaria y
permitir la detección de la secuencia de interés. No obstante,
deben estar presentes las sondas de bloqueo extrañas en un exceso
molar grande en relación con la concentración de la secuencia de
nucleotido diana para ser efectivas, y por tanto, presentan el
inconveniente de establecer limitaciones en el tamaño de la
secuencia de bloqueo que sea efectiva. En contraste, la presente
invención emplea cebadores y sondas que son efectivas para impedir
la formación de la estructura secundaria no deseada sin necesidad de
una molécula "bloqueadora" distinta. Los cebadores y sondas de
la invención incluyen una combinación de una secuencia de bloqueo y
una secuencia de hibridación (es decir, "una secuencia de
cebador" en un cebador y una "secuencia de unión diana" en
una sonda). Los cebadores de combinación, o cebadores de "doble
propósito" proporcionan al menos un aumento 100 veces mayor de
la señal en relación con el uso de los cebadores convencionales y al
menos un aumento de 5 a 7 veces mayor de la señal en relación con
el proceso de amplificación correspondiente llevado a cabo con una
sonda de bloqueo externa tal como se ha descrito antes (ver ejemplo
1). Se puede utilizar una sonda que comprende una secuencia de
bloqueo para detectar cualquier sitio de interés específico y no se
limita a SNPs o variantes alélicas, si bien estas son por lo
general los sitios de interés preferibles dentro de una secuencia
de nucleótido diana. Si bien se puede utilizar una sonda que
comprende una secuencia de bloqueo con cualquier secuencia de
nucleótido diana, es sobre todo útil cuando la secuencia de
nucleótido diana forma una estructura secundaria intramolecular que
enmascara la detección de la secuencia específica.
Para aumentar la sensibilidad de detección de
una secuencia de nucleótido diana específica (v.g., una secuencia
asociada con una variante alélica o un SNP), se ha designado un
cebador que comprende una secuencia de bloqueo, hibridándose la
secuencia de bloqueo con una región de estructura secundaria
intramolecular en el amplicón (que corresponde a la región que
forma una estructura secundaria intramolecular en la secuencia de
nucleótido diana) de manera que la formación de la estructura
secundaria intramolecular de interferencia es interrumpida por el
agente de bloqueo. Se puede utilizar entonces una sonda de
hibridación específica, como por ejemplo una sonda de hibridación
específica de alelo, para detectar la secuencia de interés en el
amplicón.
A continuación, se describen con mayor detalle
los cebadores y sondas utilizados en la invención, así como los
métodos para utilizar los cebadores y sondas.
En este modo de realización, se proporciona un
cebador de doble propósito que se utiliza para amplificar una
secuencia de nucleótido diana en una molécula diana, cuyo producto
se denomina "amplicón". La secuencia de nucleótido diana
contiene un sitio de interés próximo o contenido dentro de la región
que forma estructura secundaria que, en ausencia de un cebador de
doble propósito, tiene como resultado una estructura secundaria no
deseada en el amplicón que oculta el sitio de interés, v.g., impide
el acceso al sitio de interés por un oligonucleótido hibridante. El
sitio de interés es una secuencia de ácido nucleico de dos o más
nucleótidos, típicamente tres o más nucleótidos. Frecuentemente, el
sitio de interés es una secuencia de tres nucleótidos que
corresponde a un posible polimorfismo de un solo nucleótido.
Tal como se ilustra en la figura 5, el cebador
de propósito doble es complementario de un término de la molécula
diana que contiene la secuencia de nucleótido diana. El cebador
contiene una secuencia de cebador (P) complementaria con un
segmento de la secuencia de nucleótido diana distinta a la
estructura secundaria que forma la región (B'), y una secuencia de
bloqueo (B) sustancialmente complementaria con un segmento de la
región que forma estructura secundaria para impedir la formación de
la estructura secundaria no deseada. La secuencia de cebador es
relativamente corta, generalmente, del orden de 10 a 30 bases de
longitud. La secuencia de bloqueo también puede ser relativamente
corta, significativamente más corta que las sondas de bloqueo
utilizadas en los métodos anteriores, tal como se ha explicado aquí
en otra ocasión. Por ejemplo, la secuencia de bloqueo puede ser de
tan sólo aproximadamente 8 a 12 bases de longitud.
El cebador incluye además un espaciador opcional
entre la secuencia de cebador y la secuencia de bloqueo,
designándose el espaciador para no hibridarse o interferir con los
eventos de hibridación necesarios para llevar a cabo lo métodos de
la presente invención y, como tal, se denomina en el presente
documento como espaciador "no hibridante". El espaciador puede
ser nucleotídico, v.g., consistente en una secuencia de nucleótidos
no naturales como iso-guanina e
iso-citosina, o una secuencia de un único nucleótido
recurrente. El espaciador puede ser también no nucleotídico, v.g.,
consistente en un oligómero hidrófilo sintético, como por ejemplo
una cadena de poli(óxido de alquileno). Los métodos adecuados para
preparar el espaciador opcional son conocidos dentro de la
bibliografía. La preparación de espaciadores de polietilen glicol se
describe por ejemplo en Kern y cols. (1979) Mackromol. Chem.
150:2539. Se pueden preparar otros espaciadores de una manera
similar.
En un modo de realización preferible, el cebador
incluye un medio para detener la transcripción entre la secuencia
de sonda y el espaciador nucleotídico. En general, el medio para
detener la transcripción consiste en un ligador que une los dos
segmentos de cebador que impide que la polimerasa utilizada continúe
la replicación a lo largo de la unión secuencia de sonda-
espaciador nucleotídico. Dichos ligadores se denominan aquí
"ligadores de arresto". Los ligadores de arresto preferibles
comprenden al menos un nucleótido modificado para actuar del modo
que se ha mencionado, consistiendo la modificación en un segmento
molecular que se extiende desde el núcleo molecular de un
nucleósido, típicamente desde un átomo de nitrógeno contenido dentro
de una estructura de anillo de purina o pirimidina. Entre los
ejemplos de ligadores de arresto particularmente preferibles se
incluyen, sin limitación, pirimidinas modificadas en N^{4} como
por ejemplo
5-metil-N^{4}-(O-6-oxihexilo)-2'-desoxicitidina,
5-metil-N^{4}-(O-FMOC-6-oxihexil)-2'-desoxicitidina,
5-metil-N^{4}-(O-levulinil-6-oxihexil)-2'-desoxicitidina
y
5-metil-N^{4}-(O-6-oxihexil)-2'-timidina,
que generalmente, pero no necesariamente, se introducen durante la
síntesis de cebador utilizando el nucleósido sustituido en 3' y 5'
correspondiente, v.g. un nucleósido sustituido en la posición 3'
con DMT y en la posición 5' con una fosforamidita. Se puede
encontrar otra información adecuada en relación con los ligadores
de arresto adecuados, incluyendo procedimientos detallados para la
incorporación en un oligonucleótido cebador, en la patente EE.UU. Nº
5.200.314 para Urdea.
El cebador puede incluir una etiqueta
detectable, si bien se puede introducir también una etiqueta, v.g.,
a través de una sonda de etiqueta, durante el ensayo de
amplificación. En este último caso, el cebador etiquetado tendrá
como resultado un amplicón etiquetado, ya que los cebadores
etiquetados se incorporan en los amplicones. Los cebadores
etiquetados se distribuyen en el comercio por proveedores como CPG,
Inc. (Lincoln Park, Nueva Jersey) o se pueden preparar a través de
la conjugación de una etiqueta con un cebador sin etiquetar. El
etiquetado de oligonucleótidos, como por ejemplo cebadores, se puede
llevar a cabo aplicando procedimientos de acoplamiento
convencionales. Los procedimientos de acoplamiento específicos, sin
embargo, pueden variar dependiendo del grupo o grupos reactivos
presentes en la etiqueta y/o en el oligonucleótido. Entre las
etiquetas preferibles se incluyen las fracciones detectables por
medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos
o químicos. Entre dichas etiquetas se incluyen, sin limitarse sólo a
ellas, fluorescentes, quimioluminiscentes, colorantes, biotinas,
haptenos, enzimas, sustratos de enzima, cofactores de enzima,
inhibidores de enzima, subunidades de enzima, iones metálicos,
reactivos de densidad de electrones e isótopos radioactivos (v.g.,
^{32}P). La fracción de etiqueta se puede unir directa o
indirectamente al cebador. Preferiblemente, la etiqueta se deberá
seleccionar para que soporte las condiciones de desnaturalización si
ha de unirse directamente al cebador. Es preferible, aunque no es
necesario, que la etiqueta sea biotina, que se puede detectar a
través de la unión con estreptavidina acoplada con un fluorescente,
v.g., un conjugado de
estreptavidina-ficoeritrina.
Tal como se ha indicado anteriormente, el
cebador de doble propósito es útil en un método para amplificar una
secuencia de nucleótido diana en una molécula diana, conteniendo la
secuencia de nucleótido diana un sitio de interés próximo o
contenido dentro de región de formación de estructura secundaria que
puede formar una estructura secundaria no deseada en un amplicón
formado en las condiciones de amplificación. La amplificación se
puede llevar a cabo utilizando técnicas convencionales, si bien se
puede utilizar cualquier método de amplificación conocido,
incluyéndose entre los métodos preferibles PCR, 3SR y LCR,
prefiriéndose entre ellos sobre todo PCR.
La amplificación por PCR con el empleo de
cebadores de doble propósito según la invención se lleva a cabo en
una mezcla que comprende la molécula diana, un cebador de doble
propósito complementario con un término de una hebra de una
molécula diana de doble hebra, un segundo cebador de oligonucleótido
complementario con el término opuesto de la segunda hebra de la
molécula diana, un exceso de los cuatro monómeros de oligonucleótido
(dNTP) y agua que contiene un tampón adecuado para llevar a cabo la
PCR (incluyendo tampones convencionales que comprenden
Tris-HCl, HCl y MgCl_{2}) y un agente para la
polimerización de los nucleótidos, v.g., una polimerasa como Taq
polimerasa. A continuación, se expone la mezcla a una serie de
ciclos de replicación basados en la temperatura. Por ejemplo, se
calienta la mezcla a aproximadamente 94-96ºC durante
varios minutos durante los cuales se desnaturaliza el ADN de doble
hebra en un ADN de hebra simple. A continuación, se reduce la
temperatura de la mezcla a aproximadamente 50-60ºC,
durante lo cual se hibridan los cebadores de oligonucleótido a
través de uniones hidrógeno para dar secuencias complementarias.
Finalmente, se aumenta la temperatura de la mezcla a
aproximadamente 72ºC durante lo cual se une la polimerasa y extiende
una hebra complementaria desde cada cebador. Dado que la secuencia
que se está amplificando se dobla después de cada muestra, se puede
obtener una amplificación teórica de un billón proporcionándose de
este modo un analito de ácido nucleico amplio para el método de la
presente invención.
En la figura 2 se ilustra un método en el que se
utiliza el cebador para la amplificación de una secuencia de
nucleótido diana. La secuencia de bloqueo proporcionada en el
amplicón interrumpe la formación de la estructura secundaria no
deseada en el amplicón y por lo tanto facilita el sondeo del sitio
de interés (ahora en el amplicón) utilizando la sonda denominada en
la figura 2 como "Sonda de Hibridación Diferencial" (ver
también figura 5). Cuando el sitio de interés contiene una
variación alélica o un sitio SNP, el cebador amplificará la región
de la secuencia de nucleótido diana que contiene la variación
alélica o sitio SNP y a continuación, se puede detectar la
variación alélica o sitio SNP utilizando una sonda de hibridación
diferencial que comprende una etiqueta detectable o similar. Por lo
tanto, los cebadores y métodos de la invención son también útiles en
un método para determinar el genotipo de un individuo. Un método
particularmente preferible es el descrito por los autores de la
solicitud en la solicitud de patente europea Nº
03255859-5
(EP-A-1400601) para un "Método
para la detección de variaciones de secuencia de ácido nucleico
multiples" ("Method for Detection of Multiple Nucleic Acid
Sequence Variatons"), registrada en la misma fecha.
En la amplificación de la secuencia de
nucleótido diana, mediada por el cebador y un agente de
polimerización, v.g., una ADN polimerasa u otra enzima capaz de
generar un complemento para la secuencia de nucleótido diana, los
amplicones son detectables por la presencia de una etiqueta
detectable tal como se ha descrito anteriormente, y los cebadores
se utilizan para amplificar secuencias de nucleótido diana derivadas
de ADN genómico de un individuo que se va a someter a la prueba,
que se pueden utilizar en un método para determinar el genotipo de
un individuo.
Para la detección de una secuencia de nucleótido
diana específica, se utilizan las sondas específicas de alelo de la
invención para detectar un SNP u otra secuencia de interés dentro
del producto amplificado generado mediante el uso del cebador con
la secuencia de nucleótido diana como plantilla, tal como se ha
mencionado anteriormente. La invención facilita asimismo la
detección y análisis de un SNP u otra secuencia de nucleótido diana
en un modo multiplex, es decir, se llevan a cabo de manera
simultánea experimentos de hibridación paralelos, en los que se
etiqueta cada una de las sondas hibridación específicas de alelo con
una etiqueta única, tal como se ilustra en la figura 2. En un modo
de realización preferible, la etiqueta única unida a cada sonda de
hibridación específica de alelo es una microesfera que puede
detectarse y analizarse ventajosamente utilizando un citómetro de
flujo.
Óptimamente, se utiliza un citómetro de flujo
conectado con a uno o más medios de detección para detectar los
complejos, si bien se pueden utilizar también otros medios de
detección y recuento de los complejos capturados, dependiendo del
tipo de etiqueta y señal. Se pasan los complejos de la solución de
hibridación a través del citómetro de flujo, permitiendo así la
detección de cada complejo. Preferiblemente, se conecta el citómetro
de flujo con un primer medio de detección para detectar la etiqueta
(del amplicón etiquetado) además de un segundo medio de detección
para detectar la señal asociada con el sustrato sólido. El equipo
adecuado y los métodos para detectar las etiquetas y señales
mediante el uso de citometría de flujo, que presentan la capacidad
de realizar análisis multiplex, se describen en las patentes EE.UU.
Nº 5.981.180 para Chandler y cols., y 6.046.807 y 6.139.800 para
Chandler. Lo sistemas disponibles en el comercio también se
distribuyen por Luminex Corp. (Austin, Texas) y entre ellos se
incluye, por ejemplo, Luminex^{TM} 100 machine. En un modo de
realización sobre todo preferible, las microesferas son
microesferas Luminex^{TM}. No obstante, para determinar el
genotipo de un individuo para una variación alélica única, son
suficientes dos etiquetas únicas para diferenciar entre la unión de
la sonda de hibridación específica de alelo con el alelo de tipo
silvestre en comparación con la unión de la sonda de hibridación
específica de alelo con el alelo
variante.
variante.
Se podrá apreciar que las secuencias de sonda y
cebador no tienen necesitan tener una complementaridad perfecta
para hibridarse con el nucleótido diana o amplicón del mismo en las
condiciones de hibridación. Al utilizar la sonda de la invención
como sonda de hibridación para detectar una secuencia específica que
puede estar presente en una secuencia de nucleótido diana, es
deseable que la estabilidad de la hibridación de la secuencia de
bloqueo con la secuencia de nucleótido diana sea aproximadamente la
misma que la estabilidad de la hibridación de la porción específica
para secuencia de la sonda con la secuencia de nucleótido diana. En
este modo de realización, la secuencia de bloqueo se hibrida con la
región de formación de estructura secundaria de la secuencia de
nucleótido diana y bloquea la estructura secundaria que interfiere
con la hibridación de la porción específica de secuencia de la
sonda, sin proporcionar un resultado positivo falso para la
hibridación de la porción específica de secuencia de la sonda. En
la práctica, se preparan dos sondas que se designan para
discriminar entre dos secuencias de nucleótido diana similares, como
puedan ser un alelo de tipo silvestre y mutante que se desea
detectar. Las sondas comprenden además una etiqueta de
identificación única y una porción específica de secuencia
designada para hibridarse específicamente con la secuencia de la
secuencia de nucleótido diana que se desea detectar.
Alternativamente, la secuencia de bloqueo de la
estructura secundaria de la sonda se puede hibridar con mayor
fuerza con la secuencia de nucleótido diana que con la porción
específica de secuencia de la sonda. Para evitar la aparición de un
resultado positivo falso, la porción específica de secuencia de la
sonda de hibridación debe indicar o señalar que está hibridada con
la secuencia de nucleótido diana. La presencia de una etiqueta,
como por ejemplo una sonda fluorescente en la que la fluorescencia o
bien se potencia o bien se extingue a través de la presencia de un
nucleótido doble, completaría este resultado. Otra señal útil sería
un par fluoroforo de
auto-extinción-extintor de
fluorescencia en la porción específica de secuencia de la sonda,
asumiendo la secuencia que contiene el par
fluoroforo-extintor, tras la unión con la secuencia
de nucleótido diana, una configuración lineal en la que la
fluorescencia deja de extinguirse.
Además de los cebadores que se han descrito, la
invención proporciona también nuevas sondas de hibridación de
"doble propósito". Dichas sondas incluyen: 1) una primera
secuencia de nucleótido sonda complementaria con una primera
secuencia de nucleótido diana, y 2) una segunda secuencia de sonda
sustancialmente complementaria con una segunda secuencia de
nucleótido diana, bloqueando la hibridación de la segunda secuencia
de sonda con la segunda secuencia de nucleótido diana la formación
de estructura secundaria en la secuencia de nucleótido diana que
podría interferir si no con la unión de la primera secuencia de
sonda con la primera secuencia de nucleótido. Las sondas de doble
propósito se pueden utilizar en conjunción con cualquier ensayo de
hibridación conocido dentro de la especialidad. Las sondas de
propósito doble son particularmente útiles cuando la secuencia de
nucleótido diana, ya sea ARN o ADN, forma estructuras secundarias no
deseadas, tal como se ha descrito anteriormente, enmascarando las
estructuras secundarias efectivamente el sitio de interés contenido
dentro de la secuencia de nucleótido diana. La segunda secuencia
(bloqueo) de la sonda interrumpe la formación de la estructura
secundaria en la secuencia de nucleótido diana y facilita el sondeo
del sitio de interés con la primera secuencia de nucleótido de
sonda. La sonda es particularmente útil cuando la secuencia de
interés contiene una variación alélica o sitio de SNP, que no
podría detectarse de otro modo y, proporciona por lo tanto un
método mejorado para determinar el genotipo de un individuo.
La nueva sonda de la presente invención puede
utilizarse para el doble propósito de la interrupción de la
estructura secundaria unido a una detección de ligación. Los ensayos
de ligación se describen en la patente EE.UU. de propiedad común Nº
5.800.994 para Martinelli y cols., que se incorpora en el presente
documento como referencia. En la figura 10, se expone una
representación esquemática de este procedimiento.
Puede estar presente una etiqueta detectable en
las sondas de hibridación de doble propósito, o unirse al
completarse el ensayo de hibridación.
La invención incluye asimismo sondas específicas
para una porción de la secuencia de una secuencia de nucleótido
diana. Las sondas preferibles son específicas de secuencia para un
alelo o SNP en particular y se pueden utilizar para detectar un
genotipo en particular en un individuo. Una sonda de hibridación
específica para alelo (ASH) es un ejemplo de una sonda preferible.
Cuando se amplifica una secuencia de nucleótido diana utilizando un
cebador de doble propósito según la invención, la secuencia de
bloqueo del cebador se hibrida con la región de formación de
estructura secundaria de la secuencia de nucleótido diana
amplificada que contiene el alelo concreto o SNP. Dado que la
secuencia de bloqueo se hibrida con la secuencia de nucleótido
diana, la sonda ASH es capaz de hibridarse con la región de la
secuencia de nucleótido diana que contiene el alelo o SNP, dando
cabida así a la detección del alelo o SNP.
Las nuevas sondas pueden comprender además un
dominio de secuencia de captura designada para hibridarse con una
sonda detectable. Las sondas ASH preferibles comprenden una
secuencia que se hibrida con un dominio de secuencia de captura que
se hibrida con secuencias únicas unidas a un medio de detección, tal
como se describe con mayor detalle más adelante.
La detección de las sondas hibridadas de la
invención se puede llevar a cabo aplicando un método conocido
dentro de la especialidad. Por ejemplo, se puede utilizar la
presencia de una sonda fluorescente, o la falta de señal
fluorescente, como pueda ser en la extinción de fluorescencia. En
otro método de detección, se puede etiquetar una sonda con una
etiqueta radiactiva y detectarse con un agente de centelleo, por
ejemplo. En un método preferible, se puede unir una sonda a un
fluoroforo u otro colorante, o se puede unir la sonda a un sustrato
sólido etiquetado con un fluoroforo u otro colorante. En un método
de realización preferible, las sondas contienen una secuencia de
nucleótido que es complementaria con una secuencia de nucleótido
etiquetada con una etiqueta detectable, como por ejemplo, una sonda
de ácido nucleico etiquetada con un fluoroforo. En un método
especialmente preferible, la detección se lleva a cabo en un ensayo
multiplex utilizando microesferas Luminex^{TM}.
Puede ser deseable amplificar la señal generada
por sondas etiquetadas. La amplificación de señal puede implicar el
uso de multímeros de ácido nucleico, tal como se describe en las
patentes EE.UU. de propiedad común Nº 5.200.314; 5.124.246;
5.624.802; 5.710.264; y 5.849.481, que describen la preparación de
multímeros de polinucleótido ramificados de tipo peine grandes para
su uso en el ensayo en fase de solución que se ha descrito. Los
peines proporcionan una mayor potenciación de la señal en los
ensayos con respecto a los multímeros más pequeños. Los multímeros
de ácido nucleico son polinucleótidos ramificados que están
construidos para tener un segmento que se hibrida específicamente
con el ácido nucleico analito o un ácido nucleico (ramificado o
lineal) que está unido al analito, e interacciones con un segundo
segmento que se hibrida específicamente con la sonda etiquetada. En
el ensayo en el que se emplea el multímero, las etapas iniciales van
seguidas de la hibridación del analito con la etiqueta o grupos de
sondas amplificadores, grupos de sonda de captura del primer
recipiente, y la transferencia del complejo a otro recipiente que
contiene ácido nucleico inmobilizado que se hibridará con un
segmento de las sondas de captura. A continuación, se hibrida el
multímero con el complejo inmovilizado y, a su vez, se hibridan las
sondas etiquetadas con las segundas interacciones de segmento en el
multímero. Dado que los multímeros proporcionan un gran número de
sitios para la unión de la sonda de etiqueta, se amplifica la
señal.
Las sondas de la invención se puede utilizar con
secuencias de nucleótido diana sin amplificar si la sensibilidad de
la detección es suficientemente alta. Por ejemplo, utilizando los
multímeros que se han descrito para detectar la sonda unida a una
secuencia de nucleótido diana, tal como se ha descrito en la patente
EE.UU. Nº 5.624.802, la sensibilidad puede ser suficiente para
detectar unas cuantas copias de la secuencia diana.
En el modo de realización que se prefiere sobre
todo, la detección de las sondas de hibridación específicas de
alelo hibridadas se completa utilizando partículas detectables que
están unidas covalentemente a una sonda de hibridación específica
de alelo, pudiendo ser las partículas micropartículas, microesferas,
nanopartículas, perlas funcionalizadas con partícula, etc. Se
obtiene una mayor facilidad de uso al emplear sondas de hibridación
específicas de alelo que comprenden una secuencia de captura única
que se hibrida después con secuencias complementarias que se unen
covalentemente con las microesferas o micropartículas.
Entre las micropartículas detectables adecuadas
se incluyen, sin limitación, las descritas en la patente EE.UU. Nº
6.268.222 en la que se describen partículas que tienen un diámetro
inferior a un milímetro, preferiblemente, de un tamaño que oscila
entre aproximadamente 0,1 y 1.000 \mum de diámetro,
preferiblemente de 1 a 100 \mum, más preferiblemente de 2 a 50
\mum, siendo incluso más preferible de 3 a 25 \mum, siendo sobre
todo preferible aproximadamente 6 a 12 \mu. Las micropartículas
se obtienen preferiblemente a partir de un material polimérico como
poliestireno. No obstante, entre los materiales poliméricos útiles
se incluyen, sin limitarse sólo a ellos, poliestireno bromado,
poliácido acrílico, poliacrilonitrilo, poliamida, poliacrilamida,
poliacroleína, polibutadieno, policaprolactona, policarbonato,
poliéster, polietileno, politereftalato de etileno,
polidimetilsiloxano, poliisopreno, poliuretano, poliacetato de
vinilo, policloruro de vinilo, polivinilpiridina, policloruro de
vinil bencilo, poliviniltolueno, policloruro de vinilideno,
polidivinilbenceno, polimetacrilato de metilo, poliactida,
poliglicolida,
poli(lactida-co-glicolida),
polianhídrido, poliortoéster, polifosfaceno, polifosofaz,
polisulfona, o combinaciones de ellos. Otros materiales de polímero
(como hidrato de carbono, v.g., carboximetil celulosa, hidroxietil
celulosa, polímero proteináceo, polipéptido, así como agar, gel,
células eucarióticas y procarióticas, virus, lípidos, metal, resina,
látex, caucho, silicona (v.g., polidimetildifenil siloxano),
vidrio, cerámica, carbón, caolinita, bentonita y similares, pueden
utilizarse indistintamente. Estos polímeros llevar incorporados
también óxido de metal magnético o magnéticamente sensible
seleccionados del grupo que consiste en óxido de metal
superparamagnético, paramagnético, ferromagnético,
antiferromagnético o ferromagnético.
Las micropartículas comprenden además colorantes
fluorescentes o de color para facilitar la detección.
Preferiblemente, dichos colorantes son hidrófobos y pueden manchar
las micropartículas. Los colorantes preferibles son colorantes de
cianina. Los colorante pueden unirse covalentemente a las
micropartículas o adsorberse. Por otra parte, se puede utilizar una
mezcla de colorantes para crear una etiqueta única para una
aplicación en particular o para una secuencia de sonda en
particular.
Asimismo, tal como se describe en la patente
EE.UU. Nº 6.268.222, una micropartícula puede llevar en su
superficie una o más poblaciones de nanopartículas manchadas con
fluorescencia, tiñiéndose todas las nanopartículas de una población
dada con la misma concentración de un colorante. La unión de una
cantidad conocida de estas nanopartículas, de un color igual o
diferente al de la micropartícula, tiene como resultado una
microesfera de varios colores o multifluorescente. Al variar la
cantidad y relación de las diferentes poblaciones de nanopartículas,
es posible establecer y distinguir un gran número de poblaciones
discretas de partículas vehículo con espectros de emisión únicos.
Las micropartículas de vehículo pueden estar manchadas además de
proporcionar un color o señal adicional. Dichas micropartículas
etiquetadas de forma única son particularmente útiles para análisis
multiplex de secuencias y se pueden detectar y analizar
convenientemente utilizando citometría de flujo. Naturalmente, el
uso de combinaciones de colorantes unidos a secuencias de nucleótido
o sustratos sólidos distintos a micropartículas o microesferas
funcionarían de una manera similar y no requerirían el uso de
micropartículas.
Los cebadores y sondas de la invención pueden
detectarse también empleando espectrometría de masa para detectar
secuencias etiquetadas con etiquetas de masa. Por ejemplo, se pueden
utilizar secuencias de captura únicas que se hibriden con
secuencias específicas unidas covalentemente con las etiquetas de
masa. La presencia de etiquetas de masa indicaría entonces la
presencia de la secuencia de captura específica y, por consiguiente,
el cebador o la sonda de hibridación específica de alelo que
contiene la secuencia de captura en concreto. Las etiquetas de masa
se describen y han sido revisadas por Mir and Southern (2000),
"Sequence Variation in Genes and Genomic DNA: Methods for
Large-Scale Analysis", Ann. Rev.
Genomics Hum. Genet. 1:329-360.
En la práctica de la presente invención, se
emplearán, a no ser que se indique de otro modo, técnicas
convencionales de biología molecular, microbiología, ADN
recombinante e inmunología, que son conocidas dentro de la
especialidad. Dichas técnicas se explican de forma más exhaustiva en
la bibliografía. Ver, v.g., Sambrook y cols., Molecular Cloning;
a Laboratory Manual, Tercera Edición (2001); DNA Cloning,
volúmenes I y II (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide
Synthesis (M.J. Gait ed., 1984); Nucleic Acid
Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds., 1984);
Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins
eds., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986);
Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press 1986); B. Perbal,
A Practical Guide to Molecular Cloning, la serie, Methods
in Enzimology (Academic Press, 1984); Gene Transfer Vectors
for Mammalian Cells (J. H. Miller and M.P. Calos Eds., Cold
Spring Harbor Laboratory, 1987); Methods in Enzimology,
volúmenes 154 y 155 (ediciones Wu and Grossman y Wu,
respectivamente, Academic Press); Immunochemical Methods in Cell
and Molecular Biology (Academic Press, Londres); Scopes (Mayer
and Walker, eds., 1987), Proteín Purification; Principles and
Practice, segunda edición (Springer-Verlag,
N.Y.); y Handbook of Experimental Immunology, volúmenes
I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986).
Debe entenderse que, si bien se ha descrito la
invención en conjunto con los modos de realización específicos
preferibles de la misma, la descripción que se ha expuesto, así como
los ejemplos que se dan a continuación, tienen como único fin
ilustrar sin limitar el marco de la invención. Otros aspectos,
ventajas y modificaciones dentro del marco de la
invención se pondrán de manifiesto para las personas especializadas en la técnica en la que se encuadra la invención.
invención se pondrán de manifiesto para las personas especializadas en la técnica en la que se encuadra la invención.
Todas las patentes, solicitudes de patente y
publicaciones que se mencionen, tanto anteriormente como más
adelante, se incorporan al presente documento como referencia.
A continuación, se exponen los siguientes
procedimientos experimentales para ofrecer a las personas
especializadas en la técnica una exposición y descripción completa
de cómo fabricar y utilizar las sondas de hibridación y los
cebadores que aquí se describen y reivindican, además de cómo llevar
a cabo los métodos con su utilización; no se pretende limitar el
marco de lo que los autores de la invención consideran como su
invención con los ejemplos. Se ha dedicado un gran esfuerzo para
garantizar la precisión en relación con los números (v.g.,
cantidades, temperatura, etc.), pero debe tenerse en cuenta ciertos
errores y desviaciones. A no ser que se indique de otro modo, todas
las partes son en peso, las temperaturas son en grados Celsius (ºC)
y las presiones son cercanas a la presión atmosférica al nivel del
mar.
En los modos expuestos y a lo largo de la
memoria descriptiva, las abreviaturas empleadas tienen el
significado generalmente aceptado, del siguiente modo:
- C
- Celsius (o centígrado)
- mM
- milimolar
- \muM
- micromolar
- pmol
- picomol (10^{-12} moles)
- mg
- miligramo
- \mug
- microgramo
- mL
- mililitro
- \muL
- microlitro
- \mum
- micrómetro
- Tm
- temperatura de fusión
- U
- unidades.
Para llevar a cabo los procedimientos que se
exponen a continuación, se utilizó una serie de programas
informáticos para el diseño de cebador y la predicción de la Tm,
incluyendo Primer3, GCG®, VNTI, Primer Express® e Hybsimulator. Se
cocluyó que Hybsimulator era el programa informático preferible para
la predicción de la Tm.
Se llevaron a cabo los siguientes procedimientos
con el fin de comparar el sistema de cebador de doble propósito con
y sin un bloqueador independiente.
Se extrajo el ADN genómico humano de 200 \muL
de sangre completa tratada con EDTA utilizando un mini equipo de
extracción de sangre QIAamp® ADN según las instrucciones del
fabricante (Qiagen).
Se diseñaron secuencias de cebador para
amplificar las regiones específicas de ADN correspondientes al gen
de citocromo P450 CYP2D6, exones 1, 2, 6 y 9, que contenía los
cuatro sitios SNP de interés. Las secuencias biotiniladas también
operan como sondas de hibridación específicas para alelo para los
cuatro sitios de SNP.
Se llevaron a cabo reacciones multiplex y
singleplex utilizando 2 \mug (5070 ng) de ADN genómico aislado.
25 microlitros de volúmenes de reacción contenían 1 x tampón PCR Taq
titanio, 2,5 mM de cada dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP); 0,2 \muM
de cada cebador directo (biotiniliado) e inverso, y 2,5 U de Taq ADN
polimerasa de titanio. Se utilizó un termociclador PE 9600. Las
condiciones del ciclo térmico fueron 94ºC durante 2 minutos,
seguido de 30 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 68ºC durante un
minuto, seguido de una extensión final de 5 minutos a 68ºC.
Se preparó el reactivo activo multiplex
mezclando 0,1 pmoles de la sonda de hibridación específica de alelo
(ASH) por cada una de las cuatro regiones de SNP y 2000 de las
distintas microesferas de Luminex^{TM} por cada 25 \muL de
Hepes 50 mM (con un contenido de 500 mM de LiCl, 1% de LSD, 1% de
albúmina de suero bovino, 10 mM de MgCl_{2}, 0,01 mM de
ZnCl_{2}, 0,5% de azida sódica y Proclin-300 como
conservante (VIH 3,0 Label Diluent, Bayer Diagnostics), con un pH
final de 7,5).
Una vez completada la reacción de PCR tal como
se ha expuesto anteriormente, se añadieron 25 \muL de reactivo
activo multiplex (que tenía sondas ASH) a los distintos pocillos
individuales que contenían los productos PCR multiplex. Se selló la
placa con Mylar y se continuó la incubación en el termociclador PE
9600. Se incubó la placa de PCR con el reactivo activo multiplex
durante 10 minutos a 95ºC para disociar el ADN de doble hebra,
seguido de 30 minutos de incubación a 50ºC para conseguir la
hibridación específica de alelo. Se separó la placa y se añadieron
100 \mul de tampón de lavado a cada uno de los pocillos (VIH 3,0
Wash A, Bayer Diagnostics). Se transfirió el contenido de los
pocillos a una placa de filtro pre-humedecida de 96
pocillos (Multiscreen®-BV, 1,2 \mum, Millipore, Bedford, MA). Se
hizo avanzar el tampón de lavado con un vacío suave y se repitió un
lavado de 200 \muL. Se volvieron a suspender las microesferas en
una mezcla de tampón TTL estreptavidina-ficoeritrina
(0,05 \mug/50 \muL) (50 mM Tris, 400 mM LiCl, 0,1% Tween 20, pH
8,0). A continuación, se envolvió la placa en una hoja de aluminio
y se incubó durante 15 minutos a 25ºC con agitación suave (Titer
Plate Shaker, Labline Instruments). Se repitió la etapa de lavado
previa y se volvieron a suspender las microesferas en 80 \mul de
tampón TTL y se realizó la lectura en Luminex^{TM} 100 en la que
se detectó la presencia de ficoeritrina (y por tanto el cebador
directo original) y la microesfera específica para ASH en
particular.
Para determinar la efectividad de la molécula de
bloqueo independiente en los productos de PCR convencionales antes
expuestos, se añadió 1 pmol/25 \muL de bloqueador en el reactivo
activo multiplex al producto de PCR de exón 1 de citocromo P450
CYP2D6 convencional. Tal como se muestra en la figura 4, la adición
de la molécula bloqueadora al reactivo activo multiplex aumentó la
señal 30 veces más con respecto a la señal generada cuando no se
añadió ningún bloqueador al reactivo activo multiplex.
Tal como se puede observar en la figura 1, el
exon 1 del gen de citocromo P450 CYP2D6 tiene la mayor cantidad de
estructura secundaria en el SNP. El gel de la figura 6 muestra que
el exon 1 no genera una banda de producto de SNP detectable. Para
aumentar la señal del exon 1, se insertaron las secuencias de
bloqueo de los nucleótidos 8, 10 y 12 en los cebadores directos
biotinilados del exon 1 del gen de citocromo P450 CYP2D6 tal como
se muestra a continuación; el cuarto cebador de exón 1 representa el
cebador inverso.
Para determinar la efectividad de las moléculas
de cebador de doble propósito en interrumpir la estructura
secundaria formada dentro del amplicón por PCR del exon 1 del
citocromo P450 CPY2D2, se añadieron 1 pmol/25 \muL de las
moléculas de cebador de doble propósito individuales que tenían
secuencias de bloqueo de 8, 10 y 12 nucleótidos, tal como se ha
expuesto anteriormente, al reactivo activo multiplex. Se añadieron
moléculas bloqueadoras de control en la misma concentración. A
continuación, se llevó a cabo el ensayo de SNP del citocromo P450
tal como se ha expuesto utilizando los cebadores de doble propósito.
La figura 7 es una representación esquemática de este protocolo.
Tal como se muestra en la figura 8, la señal neta detectada en el
ensayo de SNP aumentó al aumentar la longitud de las secuencias de
bloqueo. En contraposición, cuando no se utilizó secuencia de
bloqueo, se generó una escasa señal (ver columna marcada como
"convencional" en la figura 8). Cuando se utilizó la secuencia
de bloqueo externa de 25 nucleótidos con el cebador convencional, se
observó un aumento 15-20 veces mayor en relación
con el cebador que no tenía bloqueador (ver columna marcada como
"convencional+bloqueador" en la figura 8); no obstante, la
efectividad del bloqueador externo de 25 nucleótidos fue
significativamente inferior en la efectividad del cebador de doble
propósito con el inserto de bloqueador de 12 nucleótidos; éste
último presenta un aumento dos veces mayor neto en la señal con
respecto al bloqueador externo de 25 nucleótidos.
Para detectar los alelos de tipo silvestre o
mutante para los exones 1, 2, 6 y 9 del gen de citocromo P450
CPY2FD6, se utilizó el ensayo PCR multiplex antes expuesto para
detectar los SNPs en cada uno de los cuatro exones. Para llevar a
cabo este procedimiento, se designaron grupos de cebador para
amplificar las regiones específicas correspondientes a los exones
1, 2, 6 y 9 del gen de citocromo P450 CYP2D6. Se hibridaron los
amplicones resultantes a través de la captura directa para sondas
ASH específicas para los alelos de tipo silvestre y mutantes.
Cuando fue apropiado, se utilizaron cebadores de doble propósito
para interrumpir la estructura secundaria. Cada una de las sondas
ASH contenía dominios de secuencia única complementarios de una
secuencia diana en una microesfera Luminex^{TM} codificada con
color específica. Para reducir la reactividad cruzada potencial
entre las secuencias de captura en las sondas ASH y las microesferas
Luminex^{TM}, se incorporaron bases de
iso-citosina e iso-guanina no
naturales en las secuencias de captura en las sondas ASH y las
microesferas Luminex^{TM}. Utilizando este ensayo multiplex, los
alelos multantes y de tipo silvestre fueron identificables
fácilmente con arreglo al color de las microesferas
Luminex^{TM}.
A continuación, se exponen las sondas ASH y Tm
para cada uno de los alelos de tipo silvestre (arriba) y mutante
(abajo) de los exones 1, 2, 6 y 9 del gen de citocromo P450 CPY2D6.
La Tm para las sondas ASH diseñadas para hibridarse con las
secuencias de amplicon de tipo silvestre es al menos 10ºC más
estable (es decir, se funden a al menos 10ºC más) que las sondas
ASH diseñadas para hibridarse con las secuencias de amplicon
mutantes. Estas temperaturas de fusión se corresponden con la
diferencia predicha de 10ºC en las temperaturas de fusión para una
secuencia desparejada de par de base. Según esta rúbrica, la sonda
de hibridación específica de alelo para secuencias de amplicón
mutante será más estable en al menos 10ºC cuando están presentes las
secuencias de amplicón mutantes.
La figura 2 muestra una representación
esquemática del ensayo PCR multiplex y la captura de los alelos de
tipo mutante y tipo silvestre para sus microesferas Luminex^{TM}
correspondientes; la figura 7 presenta de manera esquemática la
interacción del cebador de doble propósito en el ensayo SNP; y la
figura 9 presenta los resultados del ensayo PCR multiplex para
detectar el genotipo de los exones 1, 2, 6 y 9 del gen del citocromo
P450 CYP2D2 para cuatro pacientes individuales.
<110> BAYER HEALTHCARE LLC
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> CEBADORES DE DOBLE PROPÓSITO Y
SONDAS PARA PROPORCIONAR ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN MEJORADOS MEDIANTE
LA INTERRUPCIÓN DE LA FORMACIÓN DE ESTRUCTURA SECUNDARIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1300-0007 EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/412.263
\vskip0.400000\baselineskip
<151>2002-09-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente In Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagtggccat cttcctgctc
\hfill20
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<210> 2
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<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctggtaggg gagcctcag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcggggac gtgttcag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccacggaa atctgtctct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccgttctgt cccgagtat
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtttcccaga tgggctcac
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatggtgtc tttgctttcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggggtaag caggaatgag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaccagc
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagtggccat cttcctgctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccaccagc
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagtggccat cttcctgctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtccacca gc
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagtggccat cttcctgctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctggtaggg gagcctcag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtatgcgcgc tgctatgccg cctggtgggt agccggcgcc tggacgatcc tatct
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtatgcgcgc tgctatgccg cctggtgagt agccaaggtg gcaaggaccg tgcct
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtatgcgcgc tgctatgccg atctgggtga tggggaggca cgtcggatgc atcgct
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtatgcgcgc tgctatgccg atctggatga tggggatcgg caacgcaccc tggtgt
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtatgcgcgc tgctatgccg gatgggctca ccaagcactc gagtgcgatg tacggt
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 268
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artiricial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggtgcatca ggtccaccag g
\hfill21
Claims (27)
1. Uso de un cebador de doble propósito para
amplificar una secuencia de nucleótido diana en una molécula diana,
conteniendo la secuencia de nucleótido diana un sitio de interés
próximo o contenido dentro de una región que forma una estructura
secundaria que, en ausencia del cebador, tiene como resultado una
estructura secundaria no deseada en un amplicón formado en
condiciones de amplificación de manera que se impide la detección
del sitio de interés, comprendiendo el cebador:
(a) una secuencia de cebador complementaria con
un segmento de la secuencia de nucleótido diana distinta a la
región que forma una estructura secundaria; y
(b) una secuencia de bloqueo sustancialmente
complementaria con un segmento de la región que forma la estructura
secundaria para impedir la formación de la estructura secundaria no
deseada.
2. Uso de la reivindicación 1, siendo el sitio
de interés una secuencia de ácido nucleico.
3. Uso de la reivindicación 2, siendo el sitio
de interés un polimorfismo de nucleótido simple.
4. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a
3, en el que la secuencia de cebador es complementaria con un
término de la molécula diana que contiene la secuencia de nucleótido
diana.
5. Uso de cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, que incluye además un espaciador hibridante entre la
secuencia de cebador y la secuencia de bloqueo.
6. Uso de la reivindicación 5, siendo el
espaciador no nucleotídico.
7. Uso de la reivindicación 6, consistiendo el
espaciador en un oligómero hidrófilo sintético.
8. Uso de la reivindicación 7, consistiendo el
espaciador en 3 a 50 unidades de óxido de alquileno seleccionadas
entre óxido de etileno y combinaciones de óxido de etileno y óxido
de propileno.
9. Uso de la reivindicación 5, siendo el
espaciador nucleotídico.
10. Uso de la reivindicación 9, consistiendo el
espaciador en una secuencia de nucleótidos no naturales.
11. Uso de la reivindicación 10, siendo los
nucleótidos no naturales iso-guanina o
iso-citosina.
12. Uso de la reivindicación 9, siendo el
espaciador un segmento oligomérico que consiste en un nucleótido
único recurrente.
13. Uso de la reivindicación 9, estando la
secuencia de sonda y el espaciador separados entre sí por medio de
una trascripción de detención entre los mismos.
14. Uso de la reivindicación 13, siendo el medio
para detener la transcripción un ligador de arresto.
15. Uso de la reivindicación 14, comprendiendo
el ligador de arresto al menos un nucleósido modificado.
16. Uso de la reivindicación 15, siendo el
nucleósido modificado una pirimidina modificada en N^{4}.
17. Uso de cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, que comprende además una etiqueta detectable.
18. Uso de la reivindicación 17, siendo la
etiqueta detectable un fluorescente, un quimioluminiscente, un
colorante, biotina, hapteno, una enzima, sustrato de enzima,
co-factor de enzima, inhibidor de enzima, subunidad
de enzima, ión metálico, reactivo de densidad de electrones o
isótopo radioactivo.
19. Un método para amplificar una secuencia de
nucleótido diana en una molécula diana, conteniendo la secuencia de
nucleótido diana un sitio de interés próximo o contenido dentro de
la región que forma una estructura secundaria que puede formar una
estructura secundaria no deseada en un amplicón formado en
condiciones de amplificación de manera que se impida la detección
del sitio de interés, comprendiendo dicho método:
contacto de la secuencia de nucleótido diana en
condiciones de hibridación, a la vez o de forma sucesiva, con un
cebador de doble propósito complementario con un término de una
primera hebra de la molécula diana, un segundo cebador
complementario con el término opuesto de la segunda hebra de la
molécula diana, nucleótidos apropiados para dicha amplificación, y
un agente para la polimerización de los nucleótidos, comprendiendo
el cebador de doble propósito:
\newpage
(a) una secuencia de cebador complementaria con
el segmento de la secuencia de nucleótido diana distinta a la
región que forma la estructura secundaria; y
(b) una secuencia de bloqueo sustancialmente
complementaria con un segmento de la región de formación de
estructura secundaria para impedir la formación de una estructura
secundaria no deseada y,
no conteniendo los amplicones formados durante
dicho método la estructura secundaria no deseada, de manera que el
sitio de interés es accesible para un oligonucleótido
hibridante.
20. El método de la reivindicación 19, en el que
el agente para la polimerización es ADN polimerasa, ADN ligasa, ARN
polimerasa o una ARN transcriptasa inversa.
21. Uso de una sonda de hibridación en un ensayo
de hibridación para detectar la presencia de una secuencia de
nucleótido diana en una molécula diana, comprendiendo la sonda de
hibridación:
(a) una secuencia de nucleótido sonda
complementaria con una primera secuencia de nucleótido en la
molécula diana; y
(b) una secuencia de bloqueo sustancialmente
complementaria con una segunda secuencia de nucleótido en la
molécula diana;
impidiendo la hibridación de la secuencia de
bloqueo con la segunda secuencia de nucleótido la formación de una
estructura secundaria, en la segunda secuencia de nucleótido que
interferiría si no con la hibridación de la secuencia de sonda con
la primera secuencia de nucleótido.
22. Uso de la reivindicación 21, comprendiendo
la sonda de hibridación además una etiqueta detectable.
23. Uso de la reivindicación 22, siendo la
etiqueta detectable una etiqueta quimioluminiscente, etiqueta
fluorescente, etiqueta radioactiva, etiqueta de ADN multimérico,
colorante, enzima, modulador de enzima, sustrato sólido detectable
o ión metálico.
24. Un método para llevar a cabo un ensayo de
hibridación para detectar la presencia de una secuencia de
nucleótido diana en una molécula diana, estando próxima la
secuencia de nucleótido diana o contenida dentro de una región de
formación de estructura secundaria que puede formar una estructura
secundaria no deseada que impediría la detección de la secuencia de
nucleótido diana, comprendiendo dicho método:
contacto de la molécula diana en condiciones de
hibridación con una sonda de hibridación que comprende:
(a) una secuencia de nucleótido sonda
complementaria con una primera secuencia de nucleótido en la
molécula diana; y
(b) una secuencia de bloqueo sustancialmente
complementaria con una segunda secuencia de nucleótido en la
molécula diana;
de manera que la hibridación de la sonda con la
molécula diana impide la formación de la estructura secundaria no
deseada y permite la detección de la secuencia de nucleótido
diana.
25. El método de la reivindicación 24, en el que
la molécula diana se obtiene a partir de un individuo humano.
26. El método de la reivindicación 24, en el que
la molécula diana tiene un origen vírico o bacteriano.
27. El método de la reivindicación 26, en el que
la hibridación de la primera secuencia de sonda de hibridación con
la secuencia de nucleótido diana sirve para el diagnóstico de una
enfermedad causada por el virus.
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