ES2884474T3

ES2884474T3 - Determinación del genotipo subyacente al fenotipo S-s-U- del sistema de grupo sanguíneo MNSs

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Publication number: ES2884474T3
Application number: ES17811231T
Authority: ES
Inventors: Christoph Gassner
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-11-23
Filing date: 2017-11-23
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2037-11-23
Also published as: US20190316189A1; EP3545102A1; EP3545102B1; US11549137B2; WO2018096043A1; HUE055630T2

Abstract

Un método para probar la presencia de dos polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB, donde la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB tiene una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2, en una muestra que comprende ADN genómico o un producto de amplificación del mismo, que comprende poner en contacto el ADN genómico o un producto de amplificación del mismo de la muestra con una o más sondas polinucleotídicas capaces de hibridar al menos parcial o completamente con la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB, en condiciones rigurosas, y detectar cualquier hibridación de dichas una o más sondas polinucleotídicas con la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB.

Description

DESCRIPCIÓN

Determinación del genotipo subyacente al fenotipo S-s-U- del sistema de grupo sanguíneo MNSs

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos y kits capaces de detectar secuencias de nucleótidos híbridas representativas de una doble mutación de deleción del gen GYPB que son causantes del fenotipo S-s-U-.

Técnica anterior

El sistema de grupos sanguíneos MNSs humano se basa en dos genes: Glucoforina A (GYPA) y Glucoforina B (GYPB), que están ambos localizados en el cromosoma 4. En la actualidad, se encuentran 46 antígenos en el sistema de grupo sanguíneo MNSs, pero los más importantes se llaman M, N, S, s y U. Tanto los genes de glucoforina A como de glucoforina B codifican una sialoglucoproteína, y la glucoforina B en particular es responsable de los determinantes antigénicos de los antígenos de los grupos sanguíneos S y s. En el mismo locus del cromosoma 4, hay un tercer gen de Glucoforina, llamado GYPE, que es altamente homólogo a GYPA y GYPB. El gen de la glucoforina B tiene una homología de secuencia del 97 % con el gen de la glucoforina A desde el 5'-UTR aproximadamente 1 kb en dirección 5' del exón que codifica las regiones transmembrana a la porción de la secuencia codificante que codifica los primeros 45 aminoácidos.

El antígeno U, descubierto en 1953 (Wiener AS, Unger LJ, Gordon EB. Fatal hemolytic transfusion reaction caused by sensitization to a new blood factor U. Report of a case. J Am Med Ass. 1953; 153:1444-6) es un antígeno de muy alta incidencia, y hasta ahora se consideraba que estaba presente universalmente. Se ha descubierto recientemente que, si bien el antígeno U se encuentra en más del 99,9 % de la población global, no está presente universalmente. En algunos individuos raros, el gen de la glucoforina B no es funcional (mutantes nulos), y esto da como resultado el fenotipo S-s-U-.

Aunque los individuos que exhiben tal fenotipo son muy raros en las poblaciones humanas caucásicas, se encuentran con mayor frecuencia en seres humanos de ascendencia africana negra. Sin embargo, a diferencia de los caucásicos, el trasfondo genético de S-s-U- en los africanos negros está provocado lo más frecuentemente por una gran deleción de GYPB (Rahuel C, London J, Vignal A, Ballas SK, Cartron JP. Erythrocyte glycophorin B deficiency may occur by two distinct gene alterations. Am J Hematol. mayo de 1991;37(1):57-8.)

Los anticuerpos anti-U por tanto pueden formarse por individuos que presentan el fenotipo S-s-U- después de la exposición (a través del embarazo o transfusión con hemoderivados de un donante U+) y, por tanto, pueden dar lugar a complicaciones clínicas como reacciones hemolíticas graves tras una transfusión de sangre o enfermedad hemolítica del feto y el recién nacido según el fenotipo de la madre y el niño.

Debido a la baja incidencia mencionada anteriormente del fenotipo S-s-U-, puede ser difícil proporcionar opciones de transfusión de sangre adecuadas, sencillamente por no encontrar e identificar donantes apropiados que tengan el mismo fenotipo. Este problema se ve agravado por la elevada prevalencia de la enfermedad de células falciformes en seres humanos de ascendencia africana, que requieren transfusiones de sangre frecuentes para paliar la anemia resultante de la enfermedad de células falciformes.

La identificación serológica de individuos que exhiben el fenotipo S-s-U- es un proceso técnicamente exigente y que requiere mucho tiempo. El proceso serológico se complica aún más por la presencia de fenotipos Uvar (U+W), también observados predominantemente en negros africanos (Storry JR, Reid Me, Fetics S, Huang CH. Mutations in GYPB exon 5 drive the S-s-U+(var) phenotype in persons of African descent: implications for transfusion. Transfusion. dic de 2003;43(12): 1738-47.). Estos antígenos solo exhiben una ligera positividad de antígenos remanente para S y U y, por tanto, son difíciles de diferenciar de los fenotipos S-s-U- verdaderos. La diferenciación de la heterocigosidad S-s-U- junto con una s expresada de heterocigosidad con s Uvar (U+W) es de importancia crítica para la provisión de componentes sanguíneos completamente negativos al antígeno S para todos los receptores de sangre con aloanticuerpos anti-S.

Como resultado, existe una gran necesidad de un método que permita identificar de forma segura, de forma conveniente, de forma fiable y de forma exacta el fenotipo de un individuo con respecto al sistema de grupo sanguíneo MNSs y, en particular, un método para identificar individuos que exhiben el fenotipo S-s-U-, cuyo método es independiente de la disponibilidad de anticuerpos anti-S y anti-s, con el fin de reducir la incidencia de complicaciones clínicas derivadas de dicho fenotipo.

Como un resultado adicional, existe una fuerte necesidad de un método que permita identificar de forma segura, de forma conveniente, de forma fiable y de forma exacta el genotipo de un individuo con respecto al sistema de grupo sanguíneo MNSs y, en particular, un método para identificar a los individuos que son homocigotos o heterocigotos con respecto a una deleción del gen de la glucoforina B, con el fin de reducir las complicaciones clínicas derivadas de dicho genotipo.

Los inventores han descubierto los antecedentes genéticos y un método que permite identificar rápidamente el genotipo en todos los estados de cigosidad y el fenotipo resultante de un individuo con respecto al sistema de grupo sanguíneo MNSs y, en particular, con respecto a la deleción del gen de la glucoforina B y el fenotipo S-s-U-resultante.

El documento WO 2014/053463 A1 se refiere al campo técnico de la determinación de grupos sanguíneos, en particular a la tipificación de grupos sanguíneos VEL y específicamente a herramientas y métodos para discriminar entre individuos que exhiben los fenotipos Vel+ o Vel-. Los individuos que presentan un fenotipo Vel- son susceptibles de formar anticuerpos Anti-Vel al recibir una transfusión de sangre de un donante que exhibe un fenotipo Vel+, es decir, tienen células sanguíneas que muestran el antígeno Vel+ en su superficie y, por lo tanto, la determinación tanto del receptor como del donante con respecto a su grupo sanguíneo es esencial. El fenotipo Velse debe a una deleción de 17 pb en el exón 3 del gen SMIM1 ubicado en el Cromosoma 1 que desplaza el marco de lectura 5' de la región que codifica el dominio transmembrana, dando como resultado un alelo nulo, donde no se expresa antígeno Vel en los eritrocitos. El método descrito en el documento WO 2014/053463 A1 para identificar un individuo Vel- negativo comprende las etapas de amplificar un polinucleótido de una célula del sujeto con un cebador apropiado que tiene una secuencia que es complementaria de al menos diez nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que codifica el antígeno Vel y posteriormente detectar el amplicón generado en la etapa anterior. La detección del amplicón identifica al individuo como un individuo que exhibe un fenotipo Vel- o Vel+, opcionalmente junto con la determinación de la longitud del amplicón. El documento WO 2014/053463 A1 desvela un método en el que tanto el genotipo causante del fenotipo Vel+ como Vel- producen amplicones, pero donde los amplicones pueden tener diferentes longitudes.

El documento EP 0791 076 B1 se refiere a un método para determinar el genotipo del grupo sanguíneo K1/K2 Kell. Una muestra de ácido nucleico que comprende el polimorfismo K1/K2 que codifica la proteína Kell se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa y después se digiere con la enzima de restricción BsmI específica para la secuencia de uno de los polimorfismos, que después permite determinar el genotipo en función de los fragmentos de digestión. El uso de la digestión con enzimas de restricción requiere una etapa adicional en el método de diagnóstico que complica aún más la caracterización de la muestra de ácido nucleico.

El documento EP 1226 169 B1 se refiere a la detección de moléculas de ácido nucleico que llevan una deleción del gen RHD. Los antígenos del grupo sanguíneo Rh son transportados por proteínas codificadas por 2 genes, RHD y RHCE, que se encuentran en el cromosoma 1 a menos de una distancia de 45.000 pb. En la gente blanca, la gran mayoría de los haplotipos D negativos se debe a la deleción del gen RHD: esta supresión gasta todo el gen RHD porque las secuencias específicas de RHD que van desde el exón 1 a la región no traducida 3' están ausentes. Sin embargo, dado que se desconoce la estructura del haplotipo D negativo prevalente, una detección específica de la deleción RHD es difícil y la discriminación de individuos homocigotos RHD+/RHD+ de heterocigotos RHD+/RHD- se basa en métodos indirectos. En el documento EP1 226 169 B1, se desvela que se resuelve este problema detectando la mutación de deleción responsable del haplotipo RHD- que por lo tanto se detecta mediante PCR de longitud de fragmento de restricción, PCR cebada de secuencia específica o PCR de largo alcance con digestión con enzimas de restricción posterior.

El documento EP 1047777 B1 se refiere a un kit útil para probar la presencia de un fenotipo D débil al proporcionar cebadores específicos que son capaces de detectar el fenotipo D débil que está provocado por una mutación puntual errónea en el gen responsable de codificar el antígeno resus D. Cuando la mutación puntual está presente, se produce un amplicón de PCR y si no, no hay amplicón presente. Los resultados de la reacción en cadena de la polimerasa pueden validarse además mediante digestión con enzimas de restricción de endonucleasas posterior. Rahuel C et al. "Erythrocyte Glycophorin B deficiency may occur by two distinct gene alterations", Americal Journal of Hematology, Vol. 37, N.° 1, 1991 páginas 57-58, XP9193851 desvela e informa dos tipos de variantes genéticas, tipo I y tipo II, que se identificaron en individuos que muestran el genotipo S-s-U- a través de enzimas de restricción y/o metodologías de transferencia Southern. El tipo I se genera por una gran deleción génica que se extiende desde los exones B2 a B4 del gen de la Glucoforina B, mientras que el tipo II corresponde al gen completo con solo cuatro mutaciones puntuales.

Huang C-H et al., "Delta Gylcophorin Glycophorin B gene deletion in two individuals homozygous for the S-s- U-blood group phenotype", Blood, vol. 70, n.° 6, 1987, páginas 1830-1835, desvela una sola deleción responsable del fenotipo del grupo sanguíneo S-s-U-.

Ballas S K et al. "The blood group U antigen is not located on glycophorin B", Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -General subjects, Elsevier, Amsterdam, NL, vol. 884, N.° 2, 19 de noviembre de 1986, páginas 337-343, XP025854393 es un estudio histológico sobre la presencia del antígeno U en la proteína Glucoforina B. Los descubrimientos del documento Ballas S K et al. han sido refutados mientras tanto, ya que se ha confirmado que el antígeno U está presente en la proteína Glucoforina B en contradicción con Ballas S K et al.

Sumario de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para probar la presencia de dos polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB, donde la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB tiene una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2, en una muestra que comprende ADN genómico o un producto de amplificación del mismo, que comprende poner en contacto el ^aDⁿgenómico o un producto de amplificación del mismo de la muestra con una o más sondas polinucleotídicas capaces de hibridar al menos parcial o completamente con una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB o una porción del mismo y que tiene una secuencia como se mencionó anteriormente, en condiciones rigurosas; y detectar cualquier hibridación de las sondas polinucleotídicas con una secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia nucleotídica híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB y que tiene una secuencia como se mencionó anteriormente.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para determinar si un ser humano es un portador homocigoto o heterocigoto compuesto, de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, que comprende las etapas de a. proporcionar una muestra de ADN genómico de dicho ser humano; b. llevar a cabo reacciones de amplificación tales como PCR usando dicho ADN genómico o un producto de amplificación del mismo como un ADN molde usando i) un primer par de cebadores de cebadores de orientación opuesta, donde los cebadores son capaces de hibridar con el ADN molde en una región en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 y en una región en dirección 3' de dicha secuencia de nucleótidos híbrida, respectivamente, en condiciones rigurosas y/o usando ii) un segundo par de cebadores de cebadores orientados de manera opuesta, donde los cebadores son capaces de hibridar con el ADN molde en una región en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 2 y en una región en dirección 3' de dicha secuencia de nucleótidos híbrida, respectivamente, en condiciones rigurosas; y usando iii) un par de cebadores de control de cebadores de control orientados de manera opuesta capaces de hibridar con la secuencia de tipo silvestre sin deleción no representada en ninguna de las secuencias de nucleótidos híbridos, tales como por ejemplo el gen GYPB intacto.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un kit para identificar un ser humano portador homocigoto o heterocigoto compuesto, de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, que comprende, a. un primer recipiente que comprende un primer par de cebadores de cebadores orientados de manera opuesta, donde los cebadores son capaces de hibridar con un ADN molde en una región en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 y en una región en dirección 3' de dicha secuencia de nucleótidos híbrida, respectivamente, en condiciones rigurosas; b. un segundo recipiente que comprende un segundo par de cebadores de cebadores orientados de manera opuesta, donde los cebadores son capaces de hibridar con un ADN molde en una región en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 2 y en una región en dirección 3' de dicha secuencia de nucleótidos híbrida, respectivamente, en condiciones rigurosas; c. opcionalmente, y un tercer recipiente que comprende un tercer un par de cebadores de control de cebadores de control orientados de manera opuesta capaces de hibridar con la secuencia de tipo silvestre sin deleción no representada en ninguna de las secuencias de nucleótidos híbridos, tales como por ejemplo el gen GYPB intacto.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para determinar si un paciente que necesita una transfusión de sangre debe recibir una transfusión de sangre de un donante de fenotipo S-s-U-, que comprende la etapa de analizar una muestra del ADN genómico del paciente para detectar la presencia de dos polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para determinar si la sangre de un donante puede usarse para la transfusión de un paciente de un fenotipo S-s-U- que lo necesita, que comprende la etapa de analizar una muestra del ADN genómico del donante para detectar la presencia de dos polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para evaluar el riesgo de una madre con un fenotipo S-s-U- de concebir o tener un feto de un fenotipo U+ o el riesgo de una madre que tenga un título anti-U de concebir o tener un feto con riesgo de desarrollar enfermedad hemolítica del recién nacido, que comprende analizar una muestra del ADN genómico del padre del feto o del propio feto para detectar la presencia de dos polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para determinar si un ser humano es un portador homocigoto o heterocigoto compuesto, de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, que comprende las etapas de a. obtener las secuencias de nucleótidos de al menos el locus GYP en ambos cromosomas maternos y paternos de dicho individuo o preferentemente de todo el genoma de dicho individuo, en un formato legible por máquina, b. determinar si las secuencias obtenidas comprenden dos secuencias de nucleótidos híbridas representativas de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 en el cromosoma materno y paterno, y c. proporcionar el resultado correspondiente, por ejemplo, elegido del grupo de designaciones "103k homocigoto", "110k heterocigoto", "compuesto heterocigoto", "103k heterocigoto", "110k homocigoto" o "tipo silvestre".

Las realizaciones adicionales de la invención se establecen en las reivindicaciones dependientes.

Breve descripción de los dibujos

Las realizaciones preferidas de la invención se describen a continuación con referencia a los dibujos, que tienen el fin de ilustrar las presentes realizaciones preferidas de la invención y no el fin de limitar las mismas. En los dibujos, la Figura 1 muestra una vista esquemática de los genes GYPA, GYPB y GYPE en el cromosoma 4 de Homo sapiens en escala como recuadros sombreados. Para cada gen, el codón de inicio "ATG" y la orientación de lectura de la transcripción se indica mediante una flecha. La vista esquemática abarca aproximadamente 265,3 kpb (265321 pb). El dibujo más superior muestra un locus GYPA; B, E normal, sin mutar, tipo silvestre. El dibujo del medio muestra un locus GYPA, B, E mutado, con una deleción genómica de aproximadamente 103,3 kpb (103255 pb) de GYPB, comenzando aproximadamente 16,4 kpb (16420 pb) después del codón de parada de GYPA y terminando aproximadamente 4,5 kpb (4580 pb) después del codón de parada de GYPB, correspondiente a SEQ ID NO 1. El dibujo más inferior muestra un locus GYPA, B, E mutado, con una deleción genómica de aproximadamente 110,2 kpb (110238 pb) de GYPB, comenzando aproximadamente 87,1 kpb (87142 pb) después del codón de parada de GYPA y terminando aproximadamente 82,3 kpb (82285 pb) después del codón de parada de GYPB, correspondiente a SEQ ID NO 2. En el dibujo medio y más inferior, las deleciones del gen GYPB se indican mediante recuadros blancos que indican la posición original de GYPB y las deleciones de secuencias genómicas adicionales se indican por una línea de puntos.

la Figura 2 muestra, en una columna de la izquierda, resultados teóricos previstos de las reacciones de amplificación llevadas a cabo utilizando los pares de cebadores 1 a 6 enumerados en la sección de Ejemplos, y en la columna de la derecha, resultados experimentales reales de las reacciones de amplificación correspondientes. En los resultados experimentales, el carril "M" indica la posición de un marcador de tamaño de fragmento. Tanto en resultados teóricos como experimentales, la numeración de los carriles corresponde a los pares de cebadores como se muestra en la Tabla 2 de la sección de Ejemplos. Las cinco filas corresponden a 5 individuos analizados que tienen fenotipos determinados serológicamente como se indica por "fenotipo". El genotipo determinado a partir del análisis cualitativo del patrón de bandas se indica mediante "genotipo".

Descripción de realizaciones preferidas

En el contexto de la presente invención, el término "polinucleótido" se refiere a un polímero compuesto por 13 o más monómeros de (desoxi)ribonucleótidos unidos covalentemente a través de enlaces fosfodiéster.

En el contexto de la presente invención, y en aras de la brevedad, el término "(desoxi)ribonucleótido" designa tanto desoxirribonucleótido como ribonucleótido.

En el contexto de la presente invención, el término "mutación de deleción" se usa indistintamente con "deleción" y se refiere al fenómeno en el cual una secuencia de nucleótidos de ADN tal como un gen, con o sin secuencias de nucleótidos circundantes, o una parte de dicho gen se retira de dicha secuencia de nucleótidos de ADN.

En el contexto de la presente invención, la expresión "secuencia de nucleótidos híbrida" se refiere a una secuencia en la cual una secuencia en dirección 5' y una secuencia en dirección 3', que de otra manera habría estado separada por una secuencia que se eliminó, se unen como resultado de la deleción de dicha secuencia.

En el contexto de la presente invención, se entiende que cualquier polinucleótido proporcionado en el presente documento puede proporcionarse como una molécula aislada o dentro de un polinucleótido tal como un plásmido u otro vector y además también puede proporcionarse como una molécula derivada químicamente.

Al dilucidar la genética en la raíz del fenotipo S-s-U-, los inventores de la presente invención han descubierto, la secuencia exacta y la posición de dos deleciones de GYPB causantes del fenotipo S-s-U-, y que dichas deleciones pueden producirse en dos versiones diferentes o haplotipos nulos; una en la cual un segmento de 103 kpb que incluye el gen GYPB está eliminado y una en la cual un segmento de 110 kpb ligeramente más largo que también incluye el gen GYPB está eliminado.

Cada versión de las dos deleciones da como resultado la retirada completa del gen GYPB del cromosoma afectado y produce una secuencia de nucleótidos híbrida que es característica de la versión de la deleción que se produjo. Cuando tanto el cromosoma materno como el paterno se ven afectados por dos idénticos de uno de los dos (es decir, homocigotos), o los dos diferentes en combinación (es decir, heterocigotos compuestos) del tipo de deleción de 103 kpb o 110 kpb respectivamente, el individuo de ese genotipo muestra un fenotipo S-s-U-. Dicho de otra forma, un individuo portador de una deleción homocigota del gen GYPB o una combinación heterocigota compuesta por los dos tipos de deleción, muestra un fenotipo S-s-U-.

Los inventores han identificado ahora cada secuencia de nucleótidos híbrida resultante de cualquier versión de la deleción y, por lo tanto, ha sido posible probar la presencia y/o ausencia de tales secuencias de nucleótidos híbridas representativas de una deleción del gen GYPB en una muestra usando sondas adecuadas. Como resultado, ahora es posible probar a un paciente humano, un feto, su madre o padre, y donantes de sangre para un fenotipo S-s-U-sin tener que recurrir a métodos serológicos que consumen tiempo, complicados y costosos, empleando sondas polinucleotídicas que están fácilmente disponibles a bajos costes.

La presente divulgación proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB, donde dicha secuencia representativa de una mutación de deleción del gen GYPB es una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 1, o una secuencia complementaria a la misma.

La secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 1 es únicamente representativa de la deleción de un segmento de 103 kpb que incluye el gen GYPB y no existe en el haplotipo de tipo silvestre y consiste en un segmento en dirección 5' y un segmento en dirección 3'. Los segmentos en dirección 5' y en dirección 3' representan los segmentos que se han puesto en estrecha proximidad o se han unido directamente, por la mutación de deleción de 103 kpb del gen GYPB y juntos forman la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB.

La presente divulgación proporciona igualmente un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB, donde dicha secuencia representativa de una mutación de deleción del gen GYPB es una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 2, o una secuencia complementaria a la misma.

La secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 2 es únicamente representativa de la deleción de un segmento de 110 kpb que incluye el gen GYPB y no existe en el haplotipo de tipo silvestre y consiste en un segmento en dirección 5' y un segmento en dirección 3'. Los segmentos en dirección 5' y en dirección 3' representan los segmentos que se han puesto en estrecha proximidad o se han unido directamente, por la mutación de deleción de 110 kpb del gen GYPB y juntos forman la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB.

El polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB, ya sea de la deleción de 103 kpb o 110 kpb, puede obtenerse por métodos biotecnológicos o bien métodos sintéticos. Los métodos biotecnológicos incluyen la expresión de la secuencia de nucleótidos híbrida en un sistema hospedador tales como, por ejemplo, un sistema hospedador vegetal, animal o microbiológico. Los métodos sintéticos incluyen amplificación mediante, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa o síntesis de polinucleótidos en fase sólida. El polinucleótido puede además modificarse químicamente mediante la unión covalente de restos químicos a los extremos 5' o 3' del polinucleótido, por ejemplo fluoróforos. El polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB, ya sea de la deleción de 103 kpb o 110 kpb, puede usarse, por ejemplo, en el estudio adicional de la mutación por deleción del gen GYPB proporcionando organismos modelo transgénicos tales como ratones.

La presente divulgación proporciona además un polinucleótido capaz de hibridar al menos parcial o completamente con una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB, en donde dicha secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB tiene una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2, o una secuencia complementaria a las mismas, en condiciones rigurosas.

En el contexto de la presente invención, la expresión "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones en las que se evita la hibridación inespecífica. El establecimiento de estrictas condiciones de hibridación está bien descrito, por ejemplo, en Sambrook et al, "Molecular Cloning, A Laboratory Handbook"CSH Press, Cold Spring Harbor 1989 o Hames y Higgins, "Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRL Press, Oxford (1985).

Se entiende que en general, por ser indicativo de una mutación de deleción del gen GYPB, un polinucleótido debe ser capaz de hibridar al menos parcialmente con la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB que va a detectarse.

Por ejemplo, sería deseable en general que el polinucleótido sea capaz de hibridar al menos con el segmento en dirección 5' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB y al menos parcialmente al segmento en dirección 3' que se ha acercado puesto en proximidad, o se ha unido directamente, al segmento en dirección 5'; o en la alternativa que el polinucleótido se hibride al menos con el segmento en dirección 3' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB y al menos parcialmente al segmento en dirección 5' que se ha acercado puesto en proximidad, o se ha unido directamente, al segmento en dirección 3'.

Por lo tanto en el caso en que un polinucleótido deba ser capaz de hibridar al menos parcial o completamente con la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la mutación de deleción de 103 kpb del gen GYPB de acuerdo SEQ ID NO 1, sería deseable que el polinucleótido pudiera hibridar al menos con el segmento en dirección 5' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB.

Por lo tanto en el caso en que un polinucleótido deba ser capaz de hibridar al menos parcial o completamente con la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la mutación de deleción de 110 kpb del gen GYPB de acuerdo SEQ ID NO 2, sería deseable que el polinucleótido pudiera hibridar al menos con el segmento en dirección 5' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB.

La presente invención proporciona además un método para probar la presencia o ausencia de dos polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB y que tiene una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 o una secuencia complementaria a la misma, en una muestra que comprende ADN genómico o un producto de amplificación del mismo, que comprende poner en contacto el ADN genómico de la muestra o un producto de amplificación del mismo con una o más sondas polinucleotídicas capaces de hibridar al menos parcial o completamente con la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB y que tiene una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2, o una porción de las mismas, en condiciones rigurosas, y detectar cualquier hibridación de dicha una o más sondas polinucleotídicas con la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB y que tiene una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2.

La muestra puede, en general, ser cualquier muestra a partir de la cual pueda aislarse el ADN genómico del individuo que proporciona dicha muestra con el fin de someterlo al método de prueba, tal como por ejemplo una muestra de sangre, muestra de moco, muestra de tejido, muestra de líquido amniótico, muestra de vellosidades coriónicas, ADN fetal libre de células de una muestra de sangre materna y similares. Una persona experta en la materia sabrá cómo aislar el ADN genómico de tales muestras para usarlo en los métodos de la presente invención y además sabrá cómo amplificar el ADN genómico, ya sea de forma específica o genérica, de dichas muestras mediante el uso de métodos de amplificación como la reacción en cadena de la polimerasa.

Se entiende que, en general, para que este método sea indicativo de una mutación de deleción del gen GYPB, la sonda polinucleotídica debe ser capaz de hibridar al menos parcialmente con la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB que va a detectarse. Por ejemplo, sería deseable en general que la sonda polinucleotídica sea capaz de hibridar al menos con el segmento en dirección 5' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB y al menos parcialmente al segmento en dirección 3' que se ha acercado puesto en proximidad, o se ha unido directamente, al segmento en dirección 5'; o en la alternativa que el polinucleótido se hibride al menos con el segmento en dirección 3' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB y al menos parcialmente al segmento en dirección 5' que se ha acercado puesto en proximidad, o se ha unido directamente, al segmento en dirección 3'.

Por lo tanto en el caso donde el método prueba la deleción de 103 kpb, la sonda polinucleotídica deba ser capaz de hibridar al menos parcial o completamente con la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la mutación de deleción de 103 kpb del gen GYPB de acuerdo SEQ ID NO 1. En una realización preferida del método, la sonda polinucleotídica deba ser capaz de hibridar completamente con la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la mutación de deleción de 103 kpb del gen GYPB de acuerdo SEQ ID NO 1.

Por lo tanto en el caso donde el método prueba la deleción de 110 kpb, la sonda polinucleotídica deba ser capaz de hibridar al menos parcial o completamente con la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la mutación de deleción de 110 kpb del gen GYPB de acuerdo SEQ ID NO 2. En una realización preferida del método, la sonda polinucleotídica deba ser capaz de hibridar completamente con la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la mutación de deleción de 110 kpb del gen GYPB de acuerdo SEQ ID NO 2.

El contacto del ADN genómico de la muestra o un producto de amplificación del mismo con una o más sondas polinucleotídicas capaces de hibridar al menos parcial o completamente con la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB, en condiciones rigurosas, puede llevarse a cabo poniendo en contacto sondas polinucleotídicas libres o inmovilizadas con el ADN genómico o un producto de amplificación del mismo. Los ejemplos de sondas polinucleotídicas inmovilizadas son sondas en una micromatriz o chip de ADN o perlas magnéticas y el experto en la materia sabrá cómo inmovilizar sondas polinucleotídicas en dichos sustratos.

La detección de la hibridación menos parcial o completa de dicha una o más sondas polinucleotídicas con una secuencia nucleotídica híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB, o una parte del mismo, puede llevarse a cabo, por ejemplo, visualizando la hibridación uniendo covalentemente restos químicos detectables a los extremos 5' o 3' de las sondas polinucleotídicas o del producto de amplificación del ADN genómico. Los ejemplos de restos químicos son restos químicos radiactivos como se usan en transferencia, o restos químicos fluorescentes como se usan en análisis óptico de micromatrices o chips. Un ejemplo de fluoróforo adecuado es la carboxifluoresceína (FAM).

La presente invención proporciona adicionalmente un kit para probar la presencia de secuencias de nucleótidos híbridas representativas de una doble mutación de deleción del gen GYPB y que tiene una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 en una muestra, por ejemplo, que comprende ADN genómico o un producto de amplificación del mismo, que comprende una o más sondas polinucleotídicas capaces de hibridar al menos parcial o completamente con dicha secuencia nucleotídica híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB y que tiene una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 en condiciones rigurosas, o una parte de las mismas, en recipientes separados.

En general, las sondas polinucleotídicas y los cebadores pueden proporcionarse en solución o en un sólido, por ejemplo en un estado liofilizado.

La presente divulgación también proporciona en general un par de cebadores para su uso en una reacción de amplificación tal como la PCR de un polinucleótido molde, que comprende un cebador directo y otro inverso, donde el cebador directo es capaz de hibridar con una región en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 en condiciones rigurosas, y donde el cebador inverso es capaz de hibridar con una región en dirección 3' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 en condiciones rigurosas. Por lo tanto, la reacción de amplificación producirá un producto de amplificación en el caso de que el polinucleótido molde, por ejemplo, ADN genómico o un producto de amplificación del mismo, comprenda una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB, dado que la región en dirección 5' que flanquea la secuencia de nucleótidos híbrida y la región en dirección 3' que flanquea la secuencia de nucleótidos híbrida se acercan a través de la mutación de deleción. Por tanto, cuando se usa un par de cebadores como se describe anteriormente en una reacción de amplificación, la presencia de un producto de amplificación es, por lo tanto, indicativa de una mutación de deleción del gen GYPB. Dependiendo del tipo de reacción de amplificación usada, puede usarse un cebador directo del par de cebadores que sea capaz de hibridar con una región adicional o más cerca en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB. Por ejemplo, cuando la reacción de amplificación es una PCR de largo alcance, es posible producir productos de amplificación de 15 o 20 kb y más, mientras que la PCR basada en polimerasa Taq regular produce productos de amplificación de 60 a 3000 pb. La secuencia del clúster que abarca los genes GYP (GYPA, B y E) se conoce y un experto en la materia sabrá cómo diseñar pares de cebadores que permitan la amplificación de un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con las limitaciones y requisitos de una reacción de amplificación elegida. En general, el extremo 5' del cebador directo hibrida preferentemente hasta 4000 pb en dirección 5' del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la respectiva mutación de deleción del gen GYPB y el extremo 3' del cebador inverso hibrida hasta 4000 pb en dirección 3' del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la respectiva mutación de deleción del gen GYPB. Preferentemente, el par de cebadores se elige de modo que la longitud del producto de amplificación esté en el intervalo de aproximadamente 250 pb a aproximadamente 4500 pb, más preferentemente en el intervalo de aproximadamente 250 pb a aproximadamente 1000 pb.

La reacción de amplificación puede ser cualquier reacción capaz de amplificar una sola copia o algunas copias de un polinucleótido molde, por ejemplo ADN genómico, a través de varios órdenes de magnitud. Un ejemplo de tal reacción es la conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en sus muchos formatos.

Por lo tanto en el caso de la deleción de 103 kpb, el cebador directo es capaz de hibridar con una región en dirección 5' de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 en condiciones rigurosas, y donde el cebador inverso es capaz de hibridar con una región en dirección 3' de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 en condiciones rigurosas. En una realización preferida, el extremo 5' del cebador directo hibrida hasta 4000 pb en dirección 5' del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la mutación de deleción de 103 kpb del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 y el extremo 3' del cebador inverso hibrida hasta 4000 pb en dirección 3' del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la mutación de deleción de 103 kpb del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1.

En una realización preferida, el cebador directo es, en particular, capaz de hibridar con una región en dirección 5' de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción de 103 kpb del GYPB gen de acuerdo con SEQ ID NO 1 en condiciones rigurosas mientras que el cebador inverso es, en particular, capaz de hibridar con una región en dirección 3'. Un ejemplo de un par de cebadores adecuado es el par de cebadores que consiste en un cebador directo y uno inverso que tiene una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 3 y 4, respectivamente. En el caso de que el cebador directo e inverso tengan una secuencia de acuerdo con SEQ ID N^o3 y 4, respectivamente, el extremo 5' del cebador directo híbrida 1200 pb en dirección 5' del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la mutación de deleción de 103 kpb del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1, mientras que el extremo 3' del cebador inverso hibrida 1277 pb en dirección 3' del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la mutación de deleción de 103 kpb del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1. Esto significa que para producir el producto de amplificación esperado de 2700 pb de longitud, la PCR debe puentear 2650 pb (1200 pb+173 pb+1277 pb).

Los ejemplos adicionales de pares de cebadores adecuados son el par de cebadores que consiste en un cebador directo y uno inverso que tiene una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 7 y 8, respectivamente. Se entiende que la persona experta en la materia podrá proporcionar variantes adicionales de pares de cebadores adecuadas usando el conocimiento, en particular la secuencia de nucleótidos híbrida de acuerdo con SEQ ID NO 1, desvelada en el presente documento y que tales variantes están incluidas dentro del alcance de la presente invención.

Por lo tanto en el caso de la deleción de 110 kpb, el cebador directo es capaz de hibridar con una región en dirección 5' de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción de 110 kpb del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 2 en condiciones rigurosas, y donde el cebador inverso es capaz de hibridar con una región en dirección 3' de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 2 en condiciones rigurosas. En una realización preferida, el extremo 5' del cebador directo hibrida hasta 4000 pb en dirección 5' del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la mutación de deleción de 110 kpb del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 2 y el extremo 3' del cebador inverso hibrida hasta 4000 pb en dirección 3' del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la mutación de deleción de 110 kpb del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 2.

En una realización preferida, el cebador directo es, en particular, capaz de hibridar con una región en dirección 5' de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción de 110 kpb del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 2, mientras que el cebador inverso es, en particular, capaz de hibridar con una región en dirección 3' de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción de 110 kpb del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 2. Los ejemplos de pares de cebadores adecuados son el par de cebadores que consiste en un cebador directo y uno inverso que tiene una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 5 y 6, respectivamente. En el caso de que el cebador directo e inverso tengan una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 5 y 6, respectivamente, el extremo 5' del cebador directo hibrida 1536 pb en dirección 5' del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la mutación de deleción de 110 kpb del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 2, mientras que el extremo 3' del cebador inverso hibrida 727 pb en dirección 3' del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de la mutación de deleción de 110 kpb del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 2. Esto significa que para producir el producto de amplificación esperado de 2531 pb de longitud, la PCR debe puentear 2477 pb.

Los ejemplos adicionales de pares de cebadores adecuados son el par de cebadores que consiste en un cebador directo y uno inverso que tiene una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 11 y 12, respectivamente. Se entiende que la persona experta en la materia podrá proporcionar variantes adicionales de pares de cebadores adecuadas usando el conocimiento, en particular la secuencia de nucleótidos híbrida de acuerdo con SEQ ID NO 2, desvelada en el presente documento y que tales variantes están incluidas dentro del alcance de la presente invención.

La presente invención proporciona un método para determinar si un ser humano es portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, que comprende las etapas de: a. proporcionar una muestra de ADN genómico de dicho ser humano; b. llevar a cabo reacciones de amplificación usando dicho ADN genómico como un ADN molde; i. usar un primer par de cebadores de cebadores orientados de manera opuesta, donde los cebadores son capaces de hibridar con el ADN molde en una región en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 y en una región en dirección 3' de dicha secuencia de nucleótidos híbrida, respectivamente, en condiciones rigurosas; ii. usar un segundo par de cebadores de cebadores orientados de manera opuesta, donde los cebadores son capaces de hibridar con el ADN molde en una región en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 2 y en una región en dirección 3' de dicha secuencia de nucleótidos híbrida, respectivamente, en condiciones rigurosas; iii. opcionalmente, usar un par de cebadores de control de cebadores de control orientados de manera opuesta, donde al menos uno de dichos cebadores de control orientados de manera opuesta es capaz de hibridar con el ADN molde dentro de una porción del gen GYPB; iv. identificar los productos de amplificación obtenidos.

En seres humanos, el fenotipo S-s-U- está causado por una mutación de deleción del gen GYPB en el cromosoma 4 tanto paterno como materno, es decir, el individuo afectado es homocigoto con respecto a la deleción del gen GYPB. Las dos deleciones principales, la deleción de 103 kpb y 110 kpb, pueden producirse juntas o independientemente entre sí; es decir, un individuo puede ser homocigoto para la deleción de 103 kpb o la de 110 kpb del gen GYPB o es posible que sea portador o portadora de la deleción de 103 kpb en un cromosoma y la deleción de 110 kpb en el otro cromosoma. Con el fin de proporcionar un método que pueda detectar los tres posibles genotipos de deleciones dobles causantes de un fenotipo S-s-U-, es por lo tanto necesario que dicho método pruebe al menos la deleción de 103 kpb y la deleción de 110 kpb. En principio, la prueba para la deleción de 103 kpb y la deleción de 110 kpb por sí sola puede producir la información deseada por sí sola, ya que para los individuos que portan la deleción de 103 kpb en un cromosoma y la deleción de 110 kpb en el otro cromosoma, la reacción de amplificación que usa el primer par de cebadores de cebadores orientados de manera opuesta y la reacción de amplificación que usa el segundo par de cebadores de cebadores orientados de manera opuesta dan un producto de amplificación que puede identificarse. Para individuos que son homocigotos para la deleción de 103 kpb o 110 kpb del gen GYPB, la cantidad del producto de amplificación debe ser el doble que en el caso en el que solo haya una copia de la secuencia de nucleótidos híbrida correspondiente resultante de la deleción presente en la muestra. Las reacciones de amplificación que permiten la evaluación cuantitativa de la reacción de amplificación son, por ejemplo, PCR en tiempo real, también conocida como PCR cuantitativa.

En una realización preferida del método para determinar si un ser humano es portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, en el primer par de cebadores de cebadores orientados de forma opuesta capaces de hibridar con el ADN molde en una región en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 y en una región en dirección 3' de dicha secuencia de nucleótidos híbrida, respectivamente, en condiciones rigurosas, el cebador directo es capaz de hibridar con una región en dirección 5', mientras que el cebador inverso es, en particular, capaz de hibridar con una región en dirección 3'. Los ejemplos de pares de cebadores adecuados son el par de cebadores que consiste en un cebador directo y uno inverso que tienen una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 3 y 4 o SEQ ID NO 7 y 8, respectivamente.

En una realización preferida del método para determinar si un ser humano es portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, en el primer par de cebadores de cebadores orientados de forma opuesta capaces de hibridar con el ADN molde en una región en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 2 y en una región en dirección 3' de dicha secuencia de nucleótidos híbrida, respectivamente, en condiciones rigurosas, el cebador directo es capaz de hibridar con una región en dirección 5'. Los ejemplos de pares de cebadores adecuados son el par de cebadores que consiste en un cebador directo y uno inverso que tienen una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 5 y 6 o SEQ iD NO 11 y 12, respectivamente.

Para determinar si un ser humano es solo heterocigoto para la deleción de 103 kpb o 110 kpb, o para confirmar aún más si un ser humano es portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, puede llevarse a cabo una reacción de ampliación usando un par de cebadores de control de cebadores de control orientados de manera opuesta capaces de hibridar con la secuencia de tipo silvestre sin deleción no representada en ninguna de las secuencias de nucleótidos híbridos, tal como por ejemplo el gen GYPB intacto. En el caso de que el individuo examinado lleve una copia del gen GYPB de tipo silvestre, se producirá un producto de amplificación por esa reacción de amplificación, mientras que en el caso de que el individuo analizado sea portador de una doble mutación de deleción homocigota del gen GYPB, no se produce ningún producto de amplificación. En una realización preferida, los cebadores de control orientados de manera opuesta del par de cebadores de control se eligen de tal manera que en el clúster de genes GYP, son capaces de hibridar dentro de 15, 10, 5 o 1 kpb entre sí. En una realización preferida adicional, el uno de dichos cebadores de control orientados de manera opuesta que es capaz de hibridar con el ADN molde dentro de una porción del gen GYPB puede usarse con un cebador de orientación opuesta elegido entre los cebadores capaces de hibridar con el ADN molde en una región en dirección 5' o en dirección 3' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción de la gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2. Los ejemplos de cebadores de control orientados de manera opuesta adecuados pueden ser los pares de cebadores de acuerdo con SEQ ID NO 9 y 10 o SEQ ID NO 13 y 14.

En una realización preferida del método para determinar si un ser humano es portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, se usan dos o más pares de cebadores de control de cebadores de control de orientación opuesta para producir un resultado de prueba más robusto y fácil de interpretar. Este es en particular el caso donde los dos o más pares de cebadores de control de cebadores de control orientados de manera opuesta incluyen pares de cebadores de acuerdo con SEQ ID NO 9 y 10 o SEQ ID NO 13 y 14. Otra posible combinación de pares de cebadores que dan un resultado de prueba más sólido y fácil de interpretar son los 6 pares de cebadores utilizados en la sección Experimental (es decir, números de reacción del 1 al 6 en la Tabla 1).

En una realización preferida del método para determinar si un ser humano es portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, los productos de amplificación obtenidos se identifican de acuerdo con su peso molecular o longitud molecular. Los métodos típicos en los cuales puede evaluarse el peso molecular o la longitud molecular son la electroforesis en gel o la espectrometría de masas. Es por lo tanto posible, por ejemplo, determinar de forma fiable el genotipo de un individuo analizando cualitativamente el patrón de los productos de amplificación obtenidos por electroforesis en gel.

En otra realización igualmente preferida del método para determinar si un ser humano es portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, los productos de amplificación obtenidos se identifican de acuerdo con su secuencia. Los métodos típicos en los cuales puede determinarse la secuencia son los métodos de secuenciación de ADN tales como la secuenciación de Sanger o la pirosecuenciación.

La presente invención también proporciona un kit para identificar un ser humano portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, que comprende, a. un primer recipiente que comprende un primer par de cebadores de cebadores orientados de manera opuesta, donde los cebadores son capaces de hibridar con un ADN molde en una región en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 y en una región en dirección 3' de dicha secuencia de nucleótidos híbrida, respectivamente, en condiciones rigurosas; b. un segundo recipiente que comprende un segundo par de cebadores de cebadores orientados de manera opuesta, donde los cebadores son capaces de hibridar con un ADN molde en una región en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 2 y en una región en dirección 3' de dicha secuencia de nucleótidos híbrida, respectivamente, en condiciones rigurosas; c. opcionalmente, un tercer recipiente que comprende un tercer par de cebadores de cebadores de control orientados de manera opuesta, capaces de hibridar con la secuencia no eliminada, de tipo silvestre no representada en ninguna de las secuencias de nucleótidos híbridos, tales como por ejemplo el gen GYPB intacto. Las sondas polinucleotídicas pueden proporcionarse en solución o en un sólido, por ejemplo liofilizadas.

La presente invención proporciona además un método de determinar si un ser humano es portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, que comprende realizar una prueba del ADN genómico de dicho ser humano para detectar la presencia de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2. En el caso de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, el método de la invención puede reemplazar la clasificación serológica del fenotipo S-s-U-. En esencia, la prueba de la muestra del ADN genómico de dicho ser humano se realiza de la misma forma que el método para determinar que un humano es portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U- descrito anteriormente.

La presente invención proporciona además un método para determinar si un paciente que necesita una transfusión de sangre debe recibir una transfusión de sangre de un donante de fenotipo S-s-U-, que comprende la etapa de analizar una muestra del ADN genómico del paciente para detectar la presencia de dos polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2. También aquí, el método de la invención puede reemplazar la clasificación serológica del fenotipo S-s-U- que puede ser costoso y llevar mucho tiempo. En esencia, la prueba de la muestra del ADN genómico del paciente se realiza de la misma forma que el método para determinar que un humano es portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-descrito anteriormente.

La presente invención proporciona además un método para determinar si la sangre de un donante puede usarse para la transfusión de un paciente de un fenotipo S-s-U- que lo necesita, que comprende la etapa de analizar una muestra del ADN genómico del donante para detectar la presencia de dos polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2. También aquí, el método de la invención puede reemplazar la clasificación serológica del fenotipo S-s-U- que puede ser costoso y llevar mucho tiempo. En esencia, la prueba de la muestra del ADN genómico del donante se realiza de la misma forma que el método para determinar que un humano es portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U- descrito anteriormente.

La presente invención proporciona además un método para evaluar el riesgo de una madre con un fenotipo S-s-U-de concebir o tener un feto de un fenotipo U+ o el riesgo de una madre que tenga un título anti-U de concebir o tener un feto con riesgo de desarrollar enfermedad hemolítica del recién nacido, que comprende analizar una muestra del ADN genómico del padre del feto o del propio feto para detectar la presencia de dos polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2. En este caso, la determinación del genotipo del padre del feto proporciona información valiosa que de otro modo no podría obtenerse mediante la clasificación serológica de una muestra de sangre del padre del feto, ya que un análisis serológico no puede ayudar a determinar el riesgo de que el recién nacido tenga fenotipo S-s-U- o U+ y el riesgo de desarrollar enfermedad hemolítica del recién nacido. En esencia, la prueba de la muestra del ADN genómico del padre del feto se realiza de la misma forma que el método para determinar que un humano es portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U- descrito anteriormente.

En el contexto de la invención, la expresión "fenotipo S-s-U- clasificado serológicamente" describe una muestra que se ha probado para detectar la presencia de antígeno U usando, por ejemplo, ensayos serológicos de rutina en los que el resultado de dichos ensayos fue negativo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para determinar si un ser humano es un portador homocigoto o heterocigoto compuesto, de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, que comprende las etapas de a. obtener las secuencias de nucleótidos de al menos el locus GYP en ambos cromosomas maternos y paternos de dicho individuo o preferentemente de todo el genoma de dicho individuo, en un formato legible por máquina, b. determinar si las secuencias obtenidas comprenden dos secuencias de nucleótidos híbridas representativas de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 en el cromosoma tanto materno como paterno o ambos y c. proporcionar el genotipo correspondiente, por ejemplo, elegido del grupo de designaciones "103k homocigoto", , "heterocigoto compuesto" u "110k homocigoto".

Las secuencias de nucleótidos de al menos el locus GYP en ambos cromosomas maternos y paternos de dicho individuo o preferentemente de todo el genoma de dicho individuo, puede obtenerse mediante métodos de secuenciación de ADN conocidos. Un método ilustrativo se conoce como secuenciación del genoma completo o secuenciación del genoma completo. Una ventaja de tal determinación "in silico" es que una vez que se obtienen las secuencias de nucleótidos de al menos el locus GYP en los cromosomas maternos y paternos de dicho individuo, por ejemplo, en el contexto de una secuenciación del genoma completo, el fenotipo de dicho individuo puede predecirse prácticamente sin coste alguno sobre la base del genotipo subyacente usando únicamente herramientas bioinformáticas, es decir, sin necesidad de volver a tomar una muestra y su consiguiente análisis bioquímico.

Listado de secuencias

<110> Gassner Christoph

Blutspende Zurich

<120> DETERMINACIÓN DEL GENOTIPO SUBYACENTE AL FENOTIPO S-s-U- DEL SISTEMA DE GRUPO SANGUÍNEO MNSs

<130> MUSTER

<160> 16

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 173

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

gagtgaataa attctcacat aatctgatag ttttataaag gagcttcccc cttcactcag 60

ctctcattct tctccttcct gccactatgt aagaaagatg tgtttgtttc ccctttggtc 120

atgattgtaa gtattctaag accttccaag ccatgcaaaa ctgtagatca act 173

<210> 2

<211> 212

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 2

ctttcctgat ttattcctgc agtcaaagtt catgatacaa gcctccacac gctgctttgt 60

ctgttcaagt gggagctgca atccagtcct gcctcccatc caccatgatc tctggaatac 120

atctgaaatg ttctatgtct tgatttgagt gacagtttca cacatatact catgtatgtg 180

tgtgtatatg tgtgtatata tatataagtt ac 212 <210> 3

<211> 23

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> usado como cebador de amplificación para PCR

<400>3

ggttttcatg cctctgggat ggt 23 <210>4

<211> 27

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> usado como cebador de amplificación para PCR

<400> 4

tgcagcctta gcacattgga tattctc 27 <210> 5

<211> 29

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> usado como cebador de amplificación para PCR

<400> 5

ttataggtta actcgtcctt ttaccgcaa 29 <210> 6

<211> 27

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> usado como cebador de amplificación para PCR

<400> 6

tcactacaat ggtgatgtag acagcgg 27 <210> 7

<211> 24

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> usado como cebador de amplificación para PCR

<400> 7

gaatcattgc ggtggtttcc ctta 24 <210>8

<211> 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> usado como cebador de amplificación para PCR

<400> 8

gtttagttga tctacagttt tgcatggctt 30 <210> 9

<211> 23

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> usado como cebador de amplificación para PCR <400>9

tgctttcacg ggctgttatc caa 23 <210> 10

<211> 30

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> usado como cebador de amplificación para PCR

<400> 10

agagaaatca ctcaatatgt ggaatggcta 30 <210> 11

<211> 22

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> usado como cebador de amplificación para PCR

<400> 11

tgggtgagca gggctgagat tc 22 <210> 12

<211> 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> usado como cebador de amplificación para PCR

<400> 12

caatgtctag gatatcaatt cattctgcga 30 <210> 13

<211> 37

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> usado como cebador de amplificación para PCR

<400> 13

aatgtaacac tcacaaacta agtgtataac tcatctg 37 <210> 14

<211> 24

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> usado como cebador de amplificación para PCR

<400> 14

cctccacacg ctgctttgtc tttc 24 <210> 15

<211> 22

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> usado como cebador de amplificación para PCR

<400> 15

tcctggcttt tggcctgctc tg 22

<210> 16

<211> 26

<212>ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> usado como cebador de amplificación para PCR

<400> 16

ccactcacgg atttctgttg tgtttc 26

Ejemplos

Se proporcionaron para su análisis muestras que contienen ADN genómico de cinco individuos humanos, cuyo fenotipo con respecto al sistema de grupo sanguíneo MNSs humano había sido previamente determinado por método serológico.

De cada muestra se amplificaron aproximadamente entre 10 y 50 ng de ADN genómico molde en una reacción en cadena de la polimerasa usando 0,4 unidades de polimerasa Taq (disponible en el mercado de Life Technologies Europe B.V. en Zug, Suiza) en 10 pl de una mezcla de reacción de MgCh 1,5 mM, KCl 50 mM, Tris/HCl 10 mM (pH 8,3), gelatina al 0,01 %, glicerol al 5,0 %, 100 pg por ml de rojo cresol, 200 pM de cada dNTP, (disponible en el mercado como solución madre concentrada de inno-train GmbH, Kronberg i. T, Alemania bajo la designación redPCR). Para cada muestra, se realizaron seis amplificaciones mediante reacciones en cadena de la polimerasa (numeradas del 1 al 6) por separado, usando cada una un par de cebadores (numerados del 1 al 6), como se resume en la Tabla 1. También, cada una de las amplificaciones incluía un par de cebadores como controles positivos de amplificación, dando un producto de amplificación que tiene una longitud de 480 pb.

Todas las amplificaciones se llevaron a cabo en el GeneAmp® PCR System 9700 o en los cicladores de placa de 96 pocillos Veriti® (de Life Technologies Europe B. V.) y comenzaron con una etapa de desnaturalización inicial de 120 segundos a 94 °C, 5 ciclos de incubación durante 20 segundos a 94 °C para desnaturalización y 60 segundos a 70 °C para alargamiento, 10 ciclos de incubación durante 20 segundos a 94 °C para desnaturalización, 60 segundos a 65 °C para hibridación y 45 segundos a 72 °C para alargamiento, 20 ciclos de incubación durante 20 segundos a 94 °C para desnaturalización, 50 segundos a 61 °C para hibridación y 45 segundos a 72 °C para alargamiento, para terminar finalmente con un alargamiento a 72 °C durante 300 segundos.

Una vez completada la reacción en cadena de la polimerasa, los productos de amplificación de cada muestra se cargaron y se separaron uno al lado del otro usando electroforesis en gel en gel de agarosa al 2 %. Los resultados se muestran en la Figura 2.

Como puede observarse a partir de la Figura 2, para todas las muestras, el fenotipo previamente determinado por método serológico podría confirmarse y derivarse mediante la determinación del genotipo subyacente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para probar la presencia de dos polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB, donde la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB tiene una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2, en una muestra que comprende ADN genómico o un producto de amplificación del mismo, que comprende poner en contacto el ADN genómico o un producto de amplificación del mismo de la muestra con una o más sondas polinucleotídicas capaces de hibridar al menos parcial o completamente con la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB, en condiciones rigurosas, y detectar cualquier hibridación de dichas una o más sondas polinucleotídicas con la secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB.

2. Un método para determinar si un ser humano es portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, que comprende las etapas de:

a. proporcionar una muestra de ADN genómico de dicho ser humano;

b. llevar a cabo reacciones de amplificación usando dicho ADN genómico como un ADN molde

i. usar un primer par de cebadores de cebadores orientados de manera opuesta, donde los cebadores son capaces de hibridar con el ADN molde en una región en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 y en una región en dirección 3' de dicha secuencia de nucleótidos híbrida, respectivamente, en condiciones rigurosas;

ii. usar un segundo par de cebadores de cebadores orientados de manera opuesta, donde los cebadores son capaces de hibridar con el ADN molde en una región en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 2 y en una región en dirección 3' de dicha secuencia de nucleótidos híbrida, respectivamente, en condiciones rigurosas;

iii. opcionalmente, usar un par de cebadores de control de cebadores de control orientados de manera opuesta, donde al menos uno de dichos cebadores de control orientados de manera opuesta es capaz de hibridar con el ADN molde dentro de una porción del gen GYPB;

iv. identificar los productos de amplificación obtenidos.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, donde los productos de amplificación obtenidos se identifican de acuerdo con su peso molecular o longitud molecular o de acuerdo con su secuencia.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, donde un cebador directo y el inverso del primer par de cebadores tienen una secuencia de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NO 3 y 4 o SEQ ID NO 7 y 8, respectivamente y un cebador directo y el inverso del segundo par de cebadores tienen una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 5 y 6 o SEQ ID NO 11 y 12, respectivamente.

5. Un kit para identificar un ser humano portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, que comprende,

a. un primer recipiente que comprende un primer par de cebadores de cebadores orientados de manera opuesta, donde los cebadores son capaces de hibridar con un ADN molde en una región en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 y en una región en dirección 3' de dicha secuencia de nucleótidos híbrida, respectivamente, en condiciones rigurosas;

b. un segundo recipiente que comprende un segundo par de cebadores de cebadores orientados de manera opuesta, donde los cebadores son capaces de hibridar con un ADN molde en una región en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 2 y en una región en dirección 3' de dicha secuencia de nucleótidos híbrida, respectivamente, en condiciones rigurosas;

c. opcionalmente, y un tercer recipiente que comprende un tercer un par de cebadores de control de cebadores de control orientados de manera opuesta capaces de hibridar con una secuencia de nucleótidos de tipo silvestre sin deleción no representada en ninguna de las secuencias de nucleótidos híbridos, tales como por ejemplo el gen GYPB intacto.

6. El kit de acuerdo con la reivindicación 5, donde un cebador directo y el inverso del primer par de cebadores tienen una secuencia de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NO 3 y 4 o SEQ ID NO 7 y 8, respectivamente y un cebador directo y el inverso del segundo par de cebadores tienen una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO 5 y 6 o SEQ ID NO 11 y 12, respectivamente.

7. Un método para determinar si un paciente que necesita una transfusión de sangre debe recibir una transfusión de sangre de un donante de fenotipo S-s-U-, que comprende la etapa de probar una muestra del ADN genómico del paciente, o un producto de amplificación del mismo, para la presencia de dos polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2.

8. Un método para determinar si la sangre de un donante puede usarse para la transfusión de un paciente de un fenotipo S-s-U- que lo necesita, que comprende la etapa de probar una muestra del ADN genómico del donante, o un producto de amplificación del mismo, para la presencia de dos polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2.

9. Un método para evaluar el riesgo de una madre con un fenotipo S-s-U- de concebir o tener un feto de un fenotipo U+ o el riesgo de una madre que tenga un título anti-U de concebir o tener un feto con riesgo de desarrollar enfermedad hemolítica del recién nacido, que comprende analizar una muestra del ADN genómico, o un producto de amplificación del mismo, del padre del feto o del propio feto para detectar la presencia de dos polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2.

10. Un método para determinar si un ser humano es portador de una doble mutación de deleción del gen GYPB causante de un fenotipo S-s-U-, que comprende las etapas de a. obtener las secuencias de nucleótidos de al menos el locus GYP en ambos cromosomas maternos y paternos de dicho individuo o preferentemente de todo el genoma de dicho individuo, en un formato legible por máquina, b. determinar si las secuencias obtenidas comprenden una secuencia de nucleótidos híbrida representativa de una mutación de deleción del gen GYPB de acuerdo con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 en el cromosoma materno y paterno, y c. proporcionar el genotipo correspondiente.