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Technisches Gebiet
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Die Erfindung betrifft eine Anordnung zum schnellen Diagnostizieren der Tuberkulose und zum Testen der pharmazeutischen Wirkung, insbesondere eine Gen-Array-Anordnung, mit der ein Festlegen der Typen von Mycobacterium tuberculosis und eine Analyse der Arzneimittelresistenz durchgeführt werden können und gleichzeitig Mycobacterium tuberculosis und Arzneimittelresistenz-Gene getestet werden können.
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Stand der Technik
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Tuberkulose ist eine sehr alte virulente Krankheit. Durch die Bemühungen der Wissenschaftler aus aller Welt sind zwar Methoden zum Vorbeugen, Kontrollieren und Behandeln der Tuberkulose erfolgreich entwickelt worden, doch stellt diese Krankheit immer noch ein global wichtiges Thema bei der öffentlichen Gesundheitspflege dar. Tuberkulose stellt zugleich eine Infektionskrankheit dar, die durch einen einzigen Erreger die meisten Toten verursacht. Nach Schätzung der Weltgesundheitsorganisation ist über Eindrittel der Weltbevölkerung mit Mycobacterium tuberculosis infiziert; nach statistisch gesehen infizieren sich jährlich ca. 8 Millionen neue Tuberkulose-Patienten und 2 Millionen davon sterben an Tuberkulose.
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Tuberkulose zeichnet sich dadurch aus, dass die mit Mycobacterium tuberculosis infizierten normalerweise nicht sofort krank werden, wobei ca 10% der Infizierten daran erkranken und zu aktiven Tuberkulose-Patienten werden; außerdem kann bei den meisten mit Mycobacterium tuberculosis infizierten der Bakteriumstamm lange Zeit im Körper des Wirts bleiben und auf eine Gelegenheit warten, um den Wirt krank zu machen. Erst wenn der feine Ausgleich zwischen Mycobacterium tuberculosis und dem Abwehrmechanismus des Wirts zerstört ist, wird der latente Herd aktiviert, was einen infizierten zu einem aktiven Tuberkulose-Patienten macht. Generell findet der Wandel von einem latenten zu einem aktiven Tuberkulose-Patienten durch eine endogene Reinfektion oder eine endogene Reaktivierung statt.
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Tuberkulose hat verschiedene klinische Erscheinungsformen. Am Anfang der Erkrankung gibt es häufig keine eindeutige oder spezifische Symtome und der Vorgang der Erkranung entwickelt sich langsam, wobei der Zustand des anfänglichen Tuberkulose-Patienten mal gut und mal schlecht ist, was eine klinische Diagnose erschwert. Deswegen werden bei einer Diagnose der Tuberkulose die klinischen Erscheinungen des Patienten zusammengefasst und die Änderungen auf einem Röntgenfilm berücksichtigt; schließlich kann die Tuberkulose erst unter Einbeziehung von Laboruntersuchungen festgestellt werden.
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Die experimentale Diagnose der Tuberkulose basiert wesentlich auf Gewebepathologie, Färben von säurebeständigen Bakterien und die Kultur von Mycobacterium tuberculosis. Jedoch haben solche Teste ihre Testgrenzen. Konventionell stellt die Färbungsuntersuchung des Schleim-Abstriches unter dem Mikroskop die schnellste Methode zum Testen von säurebeständigen Bakterien dar, wobei die Schleimprobe mindestens 5000–10000 Bakterien pro Milliliter (ml) enthalten muss, um säurebeständige Bakterien auf einer gefärbten Abstrich-Linse erkennen zu können. Außerdem tritt bei dieser Technik eine hohe Prozentzahl von falsch positiven Ergebnissen auf, weil neben Mycobacterium tuberculosis nichttubberkulöse Mykobakterien (Non-Tuberculous Mycobacteria, NTM) und einige weitere Stäbchenbakterien nach dem Färben auch positiv erscheinen können. Die Kultur von Mycobacterium tuberculosis gehört traditionell zu den sicheren Methoden zum Dia-nostizieren der Tuberkulose und weist eine Empfindlichkeit von 80–85% und eine Genauigkeit von 98% auf, wobei das Testergebnis dieser Kulturmethode jedoch erst nach 4 bis 8 Wochen herauskommen kann, wobei dieser Zeitaufwand den klnischen Bedarf nicht erfüllen kann.
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Mit der Entwicklung und der breiten Anwendung der molekülaren biologischen Technik werden Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) und PCR-Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (PCR-RFLP) bei der klinischen Diagnose der Tuberkulose eingesetzt, um die Tuberkulose molekular zu diagnostizieren, was einen revolutionären Fortschritt für die klinische Diagnose der Tuberkulose darstellt. Am Anfang der Entwicklung detektieren die meisten Untersuchungseinrichtungen mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) direkt die Schleimprobe des Untersuchten, um festzustellen, ob darin molekulare Marker wie Desoxyribonnukleinsäure (Deoxyribonucleic Acid, DNA) oder Robonnukleinsäure (Ribonnucleic Acid, RNA) von Hitzeschockprotein 65 (hsp65) und des eingesetzten Fragments 6110 (IS6110) vorhanden sind. Dazu wird in Verbindung mit PCR-RFLP die molekulare Art der detektierten Nukleinsäure festgelegt. Mit dieser Methode ist zwar ein schnelles Feststellen von Mycobacterium tuberculosis möglich, jedoch wird die spezielle Äußerung der in Mycobacterium tuberculosis des untersuchten Probe des Wirts enthaltenen DNA oder mRNA (Messenger RNA) nicht berücksichtigt. So kann diese Methode bei der klinischen Diagnose noch keine befriedigende Genauigkeit erreichen.
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Dank der Dekodierung des gesamten Genoms von Mycobacterium tuberculosis haben Wissenschaftler eine Gendeletion zwischen in Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis BCG entdeckt und die Stelle des Deletion-Fragments als Regions-of-Difference (RD) bezeichnet. Viele Untersuchungsberichte haben darauf hingewiesen, dass ein Fehler bei einer DNA-Replikation oder das Einsetzen eines einzusetzenden Fragments im Genom zu einer Deletion, einem Einsetzen, einer Inversion oder einer Replikation eines Fragments des Genoms führen kann; dadurch entstehen schließlich die Regions-of-Difference (RD) zwischen den Bakterienarten.
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In den Regions-of-Difference (RD) existieren viele wichtige Gene und krankheitserregende Faktoren; das Existieren oder das Fehlen dieser Regions-of-Difference (RD) kann zu einem Unterschied zwischen Krankheitserregungen der Bakterienarten der TB-Komplexe führen. Somit können die Regions-of-Difference (RD) als Gegenstand zum Festlegen der Arten von Mycobacterium tuberculosis sowohl die Schnelligkeit und die hohe Empfindlichkeit der molekularen Diagnose bewahren, als auch den Nachteil wiedergutmachen, dass der traditionelle molekulare Test die Bakterienstämme der TB-Komplexe nicht feststellen kann. Daher stellen die Regions-of-Difference (RD) hochpotente molekulare Marker für die Diagnose der Tuberkulose dar.
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Huang et al haben im Jahre 2009 veröffentlicht, dass 14 spezifische Gene aus jeder Region-of-Difference (RD) ausgewählt und als Testgegenstand für die Konstruktion eines Tuberkulose-Gentest-Chips verwendet werden. Zudem wird eine technische Plattform zum Testen von Spurennukleinsäure eingesetzt, die gleichzeitig mehrere Gengegenstände testen kann, sodass eine Empfindlichkeit erreicht wird, bei der der Test bei nur 5 Zellen in 1ml Vollblut durchgeführt werden kann. Somit wird ein Tuberkulose-Gentest-Chip mit Schleimprobe als Testgegenstand hergestellt.
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Bei dem Experiment werden zunächst die Bakterienstämmde der krankheitserregenden TB-Komplexe von der klinischen Probe getrennt; nachdem das Trennen der Bakterienstämmde durch die traditionelle biochemische Reaktion und die Nukleotid-Sequenz festgestellt worden ist, wird das von jedem Patienten infizierte Mycobacterium tuberculosis als Referenzdaten aufgezeichnet. Weiter wird mit der gegenwärtigen molekularen Testtechnik PCR-RFLP und mit der Genchip-Testtechnik ein Detektieren des Mycobacterium tuberculosis in der Schleimprobe des Tuberkulose-Patienten direkt durchgeführt; des Weiteren werden die beiden Methoden hinsichtlich der Einstimmigkeit und des Ausführungskomforts verglichen. Nach dem Ergebnis kann direkt mit PCR-RFLP der TB-Komplex (TB Complex, TBC) in 62,5% der 246 angesammelten klinischen Schleimproben der Tuberkulose-Patienten festgestellt werden, und 85% davon kann mit der Genchip-Testtechnik festgestellt werden. Die Art der mit diesen beiden Methoden festgestellten Bakterienstämmde ist völlig einstimmig. Was die Korrelation zwischen den Testergebnissen der beiden Methoden und dem Färben des Schleims angeht, kann die Methode PCR-RFLP 39 von den 56 positiv kultivierten und beim Färben des Schleims positiv erscheindenden Proben detektieren, während die Genchip-Testtechnik 52 von 56, also über 90%, detektieren kann; von den 24 positiv kultivierten, aber beim Färben des Schleims negativ erscheindenden Proben kann die Methode PCR-RFLP 11 feststellen, während die Genchip-Testtechnik 16 von 24, also 67%, detektieren kann.
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Aufgrund der vorher beschriebenen Ergebnisse lässt sich feststellen, dass die Genchip-Testtechnik leicht ausführbar ist, einen geringeren Kraft- und Zeitaufwand beansprucht und eine viel höhere Empfindlichkeit als PCR-RFLP aufweist. Aus diesem Grund wird die Genchip-Testtechnik in Zukunft sehr wahrscheinlich bei der molekularen Diagnose der Tuberkulose eine breitere Anwendung finden.
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Auf dem Weltmarkt gibt es bereits Sätze, die den Test für Mycobacterium tuberculosis und den Test für die pharmazeutische Wirkung einschließen. Zu solchen Test-Sätzen gehören Spoligotyping Method (Isogen aus den Niederlanden), TB Ag Rapid Test (Formosa Biomedical Technology Corp. aus Taiwan), Amplified MTDR (Gene Probe aus den USA), DR. MTBC Screen Kit (DR. Chip Biotech, Inc. aus Taiwan) und GenoType MTBDRplus (Hain Lifescience aus Deutschland). Dabei dient die Spoligotyping Method zum Testen der Oligonukleotid-Kartierung der spezifischen Abstände von Mycobacterium tuberculosis und weiter zum Vergleichen der Arten auf Basis einer eingerichteten Datenbank, wobei das Vermögen von der Spoligotyping Method zum Unterscheiden der Bakterienstämmde jedoch nicht die Standardmethode erreichen kann, sodass die Spoligotyping Method nur ein geringes Identifizierungsvermögen zur Verfügung stellt, wobei die Spoligotyping Method außerdem keine Testfunktion zum Analysieren der Arzneimittelresistenz aufweist; bei TB Ag Rapid Test wird Mycobacterium tuberculosis durch die Reaktion des Antikörpers des spezifischen Antigens von Mycobacterium tuberculosis direkt detektiert, wobei die Kosten jedoch sehr hoch sind und eine Kultur von Mycobacterium tuberculosis erforderlich ist, sodass eine Vielzahl von Schritten und ein großer Zeitaufwand beansprucht werden, wobei TB Ag Rapid Test außerdem keine Testfunktion zum Analysieren der Arzneimittelresistenz aufweist; Amplified MTDR dient zum Testen von ribosomaler RNA (rRNA) und von spezifischer DNA-Sondenhybridisierung, wobei kaltes Licht zum Detektionszwecke eingesetzt wird, wobei eine Kultur von Mycobacterium tuberculosis erforderlich ist, sodass eine Vielzahl von Schritten und ein großer Zeitaufwand beansprucht werden, wobei Amplified MTDR gleichfalls keine Testfunktion zum Analysieren der Arzneimittelresistenz aufweist; DR. MTBC Screen Kit dient zum Vergrößern der speziellen Gensegmente in Mycobacterium tuberculosis mit PCR und zum Ausführen einer Hybridisierung mit Sonde mittels eines Chips, wobei der Test von Mycobacterium tuberculosis zwar mit Schleimproben ausführbar ist und das Arzeimittelresistenz-Gen Rifampicin der TB-Komplexe herausgefunden werden kann, doch kann Mycobacterium tuberculosis erst dann festgestellt werden, wenn 100,000 Bakterien in 1ml Schleim vorhanden sind, wobei die Empfindlichheit nur 65% beträgt und relativ gering ist; GenoType MTBDplus vervielfältigt die Arzeimittelresistenz-Gene von Mycobacterium tuberculosis mit PCR und führt eine Hybridisierungsreaktion mit einer Sonde aus, wobei die Arzeimittelresistenz-Gene von Ofloxacin, Streptomycin und Ethambutol von Mycobacterium tuberculosis zwar herausgefunden werden können, doch sind ein hoher Kostenaufwand, eine hoch komplizierte Technik, ein großer Zeitaufwand und eine dauernde Qualitätskontrolle erforderlich, wobei GenoType MTBDplus zudem nur die pharmazeutische Wirkung aufweist, aber keine Testfunktion für Mycobacterium tuberculosis.
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Des Weiteren ist aus der
TW 201005098 ein Verfahren zum Testen vom altiven Mycobacterium tuberculosis unter Verwendung eines Chips bekannt, wobei es sich um einen Diagnose-Chip handelt, mit dem Mycobacterium tuberculosis in der Schleimprobe des Wirts in der aktiven Phase direkt getestet wird. Jedoch kann der Diagnose-Chip lediglich Mycobacterium tuberculosis überprüfen und weist keine Genkomplexe für die Analyse der pharmazeutischen Wirkung auf.
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Aufgabe der Erfindung
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Gen-Array-Anordnung zu schaffen, mit der ein Festlegen der Typen von Mycobacterium tuberculosis und eine Analyse der Arzneimittelresistenz durchgeführt werden können und gleichzeitig Mycobacterium tuberculosis und Arzneimittelresistenz-Gene getestet werden können.
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Technische Lösung
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Anordnung zum schnellen Diagnostizieren der Tuberkulose und zum Testen der pharmazeutischen Wirkung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
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Die erfindungsgemäße Anordnung zum schnellen Diagnostizieren der Tuberkulose und zum Testen der pharmazeutischen Wirkung umfasst eine Gen-Array-Anordnung aus einem Testbereich für Mycobacterium tuberculosis und einem Testbereich für Arzneimittelresistenz, wobei der Testbereich für Mycobacterium tuberculosis eine Vielzahl von Gentestpunkten aufweist, die jeweils an bestimmte biologische Sonden angeschlossen sind und jeweils mit bestimmten biologischen Molekülen reagieren können und dadurch verschiedene Farbgebungen hervorbringen; die Gentestpunkte umfassen spezifische Genkomplexe von Mycobacterium tuberculosis aus 13 spezifischen Genen von Mycobacterium tuberculosis; der Testbereich für Arzneimittelresistenz weist eine Vielzahl von Gentestpunkten auf, die jeweils mit den Medikamenten gegen Tuberkulose wie Isoniazid, Rifampicin, Ofloxacin, Ethambutol und Streptomycin reagieren können und dadurch verschiedene Farbgebungen hervorbringen, wobei diese Gentestpunkte Arzneimittelresistenz-Genkomplexe aus 6 Arzneimittelresistenz-Genen umfassen. Bei der erfindungsgemäßen Anordnung wird mithilfe der spezifischen Gene von Mycobacterium tuberculosis und der Arzneimittelresistenz-Gene als Sonden für die Hybridisierungsreaktion eine Analyse durchgeführt und kann gleichzeitig ein Test von Mycobacterium tuberculosis und Arzneimittelresistenz-Genen durchgeführt werden, sodass die Tuberkulose schnell, kostengünstig diagnostiziert werden kann und die Arzneimittelresistenz von Medikamenten gegen Tuberkulose gleichzeitig getestet werden kann.
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Die oben genannten 13 spezifischen Gene von Mycobacterium tuberculosis sind hsp65, Rv0577, Rv3120, Rv2073c, Rv1970, Rv3875, Rv3347c, Rv1510, Rv0186, Rv0124, TbD1, mtp40 und mpb83.
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Die oben genannten 6 Arzneimittelresistenz-Gene sind katG, rpoB, gyrA, embB, rpsL und rrs.
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Kurze Beschreibung der Zeichnung
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1 zeigt eine schematische Darstellung der Testblöcke einer erfindungsgemäßen Gen-Array-Anordnung.
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2 zeigt eine schematische Darstellung der Anordnung der Gene der erfindungsgemäßen Gen-Array-Anordnung.
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3 zeigt eine schematische Darstellung der Interpretation eines Testbereiches für Mycobacterium tuberculosis gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung.
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4 zeigt eine schematische Darstellung der Interpretation eines Testbereiches für Arzneimittelresistenz gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung.
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Wege der Ausführung der Erfindung
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Im Folgenden werden Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung anhand der detaillierten Beschreibung eines Ausführungsbeispiels und der beigefügten Zeichnungen näher erläutert werden. Jedoch soll die Erfindung nicht auf die Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen beschränkt werden.
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Wie aus 1 und 2 ersichtlich, umfasst die erfindungsgemäße Anordnung zum schnellen Diagnostizieren der Tuberkulose und zum Testen der pharmazeutischen Wirkung mindestens eine Gen-Array-Anordnung 20 aus einem einem Testbereich für Mycobacterium tuberculosis 21 und einem Testbereich für Arzneimittelresistenz 22, wobei P für eine positive Kontrollgruppe, N für eine negative Kontrollgruppe und B für eine leere Kontrollgruppe steht.
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Der Testbereich für Mycobacterium tuberculosis
21 weist eine Vielzahl von Gentestpunkten
2a auf, die jeweils an bestimmte biologische Sonden angeschlossen sind und jeweils mit bestimmten biologischen Molekülen reagieren können und dadurch verschiedene Farbgebungen hervorbringen; die Gentestpunkte
2a umfassen spezifische Genkomplexe von Mycobacterium tuberculosis aus 13 spezifischen Genen von Mycobacterium tuberculosis, wobei die spezifischen Genkomplexe von Mycobacterium tuberculosis, die zum Diagnostizieren des Mycobacteriums tuberculosis fähig sind, die in Tabelle 1 angezeigten, aus den spezifischen Genen von Mycobacterium tuberculosis ausgewählten spezifischen Oligonukleotid-Sequenzen umfassen. Aus
1 ist ersichtlich, dass die 13 im spezifischen Genkomplex von Mycobacterium tuberculosis enthaltenen spezifischen Gene von Mycobacterium tuberculosis hsp65, Rv0577, Rv3120, Rv2073c, Rv1970, Rv3875, Rv3347c, Rv1510, Rv0186, Rv0124, TbD1, mtp40 und mpb83 sind.
Tabelle 1
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Der Testbereich für Arzneimittelresistenz
22 weist eine Vielzahl von Gentestpunkten
2b auf, die jeweils mit den Medikamenten gegen Tuberkulose wie Isoniazid, Rifampicin, Ofloxacin, Ethambutol und Streptomycin reagieren können und dadurch verschiedene Farbgebungen hervorbringen, wobei diese Gentestpunkte
2b Arzneimittelresistenz-Genkomplexe aus 6 Arzneimittelresistenz-Genen umfassen. Die Arzneimittelresistenz-Genkomplexe, die zum Testen der pharmazeutischen Wirkung der Arzneimittel gegen Mycobacterium tuberculosis fähig sind, umfassen die in Tabelle 2 angezeigten, aus den Arzneimittelresistenz-Genen ausgewählten Sequenzen. Aus
2 ist ersichtlich, dass die 6 im Arzneimittelresistenz-Genkomplex aus enthaltenen Arzneimittelresistenz-Gene katG, rpoB, gyrA, embB, rpsL und rrs sind.
Tabelle 2
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Die Gentestbereiche 2a, 2b sind arrayartig angeornet.
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Wie in 3 gezeigt, wird erfindungsgemäß eine Gen-Array-Anordnung aus 13 ausgewählten spezifischen Genen von Mycobacterium tuberculosis und 6 ausgewählten Arzneimittelresistenz-Genen auf einem Nylondünnfilm konstruiert, wobei der Testbereich für Mycobacterium tuberculosis 21 gemäß einem Ausführungsbeispiel mit den spezifischen Genen von Mycobacterium tuberculosis als Sonde für die Hybridisierungsreaktion analysiert wird; weiter wird mit der Farbgebungsreaktion die Hybridisierungsinformation getestet; wenn eine Farbgebungsreaktion vorliegt, bedeutet das, dass ein entsprechendes Gen vorhanden ist, wobei die Art des Mycobacteriums tuberculosis nach dem Unterschied des Verhaltens des Gens festgelegt wird. Wie in 3 gezeigt, stellt die Farbgebung des Mycobacteriums tuberculosis in der Gen-Array-Anordnung wie folgt dar: hsp65(+), Rv0577(+), Rv3120(–), Rv2073c(–), TbD1(+), Rv1970(–), Rv3875(+), Rv3347c(+), Rv1510(–), Rv0186(+), Rv0124(+), mtp40(+) und mpb83(+); dabei steht das Interpretationsergebnis (+) für eine positive Reaktion.
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Ein ausführlicherer Vergleich wird in folgender Tabelle 3 dargestellt:
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Wie in 4 gezeigt, wird erfindungsgemäß eine Gen-Array-Anordnung aus 13 ausgewählten spezifischen Genen von Mycobacterium tuberculosis und 6 ausgewählten Arzneimittelresistenz-Genen auf einem Nylondünnfilm konstruiert, wobei der Test der pharmazeutischen Wirkung von Ethambutol im Testbereich für Arzneimittelresistenz als Beispiel dargestellt wird. embB-W1 wird als embB-positive Kontrollgruppe eingestellt, bei der eine Farbgebung sicher stattfindet; embB-W306, embB-W319 und embB-W406 sind Wildtyp-Sonden embB condon 306, 319 und 406; embB-Q306, embB-Q319 und embB-Q406 sind die interne Kontrollgruppe embB condon 306, 319 und 406, die die leicht mutierenden Punkte enthält. Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird mit den Arzneimittel-Genen als Sonden für die Hybridisierungsreaktion eine Analyse durchgeführt; weiter wird anhand der Farbgebungsreaktion die Hybridisierungsinformation getestet, um festzustellen, ob die Arzneimittelresistenz-Gene mutiert sind oder nicht; beim Vorliegen einer Mutation kann das Arzneimittelresistenz-Gen nicht an eine Wildtyp-Sonde angeschlossen werden und deshalb keine Farbgebung hervorbringen.
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In der Zeichnung wird dargestellt, dass das Arzneimittelresistenz-Gen embB in der Gen-Array-Anordnung die Farbgebung wie folgt hervorbringt: condon 306(–), condon 319(+) und condon 306(+); eine Mutation von embB condon 306 wird interpretiert. Dies zeigt, dass sich Mycobacteriums tuberculosis gegen das Medikament Ethambutol resistent verhält.
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Bei der erfindungsgemäßen Anordnung wird mithilfe der spezifischen Gene von Mycobacterium tuberculosis und der Arzneimittelresistenz-Gene als Sonden für die Hybridisierungsreaktion eine Analyse durchgeführt und kann gleichzeitig ein Test von Mycobacterium tuberculosis und Arzneimittelresistenz-Genen durchgeführt, sodass die Tuberkulose schnell, kostengünstig diagnostiziert werden kann und die Arzneimittelresistenz von Medikamenten gegen Tuberkulose gleichzeitig getestet werden kann.
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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