CN106093420B - 一种用于结核病血清学诊断的elisa试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于结核病血清学诊断的ELISA试剂盒，该试剂盒中至少包括包被液、洗涤液、封闭液和终止液，还包含有：重组蛋白rRv2994，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；重组蛋白rRv3347c6238‑7278，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。两种重组蛋白均具有良好的免疫反应性，能与其诱导小鼠产生的抗体发生特异结合。并且两种重组蛋白均能与结核病患者血清发生特异结合，经间接ELISA法检测，与胶体金法(38‑16KDa)比较，rRv2994的特异性为96.5％，敏感性为100.0％，总符合率为98.4％；rRv3347c6238‑7278的特异性为94.7％，敏感性为98.6％，总符合率为96.9％。说明两种蛋白具有很好的敏感性与特异性，能够作为结核病血清学诊断的优选抗原。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够用于结核病血清学诊断的ELISA检测试剂盒，尤其涉及两种能与结核病患者血清发生特异结合的结核分枝杆菌抗原，属于生物工程和疾病诊断技术领域。
背景技术
结核病(Tuberculosis,TB)是由传染性病原体结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染引起的慢性传染性人兽共患病，是威胁人类健康的最主要传染性疾病之一。MTB主要分为人型、牛型、非洲型及鼠型，人类结核病90％以上由感染人型MTB引起，少数为牛型和非洲型所致。MTB可侵犯全身各器官系统，患病部位以肺脏最为常见，也可累及肝、骨和脑等其它器官。MTB感染分为潜伏性与活动性两种状态。活动性肺结核是指痰涂片阳性者：即体内有MTB排出，MTB繁殖活跃，毒力强。TB的传染源主要是活动性的肺结核患者，其主要通过呼吸道传播，也可用过破损的皮肤、粘膜和消化道等途径传染。MTB携带者感染HIV后，由潜伏期发展为活动性期的可能性远高于未感染HIV者，病程发展更快。2014年世界卫生组织公布全球约960万新发TB病例，110万人死于TB，其中40万为HIV阳性。
目前，TB的实验室诊断方法主要有以下几种：(1)细菌学诊断：痰涂片镜检法简单、快速可靠，但其敏感性差；痰样本培养是TB诊断的金标准，但传统固体培养时间需60～90d，液体培养及药敏试验约需20d，且约40％的成人肺结核患者的痰涂片标本检测为阴性。(2)血清学诊断：TB血清学诊断方法主要是利用免疫学技术检测血清中特异性抗MTB的抗体。(3)结核菌素皮肤试验：感染过MTB的机体产生相应的致敏淋巴细胞，再次注射PPD后，机体会在皮试试验后的2～3d产生迟发型超敏反应，局部出现红肿硬节。该试验—直被应用于TB的临床诊断，但其特异性差，常与环境分枝杆菌和卡介苗(BCG)产生交叉反应。(4)MTB核酸扩增检测：该方法敏感性好，即使标本中拷贝数低的细菌也能被检出，但临床应用会有偏差，如标本处理不当，靶序列或扩增产物交叉污染等易造成假阴性。(5)IFN-γ释放试验：该方法是体外免疫学检测的新方法，其商业化诊断试剂盒以EAST6和CFP10蛋白作为刺激抗原，一般釆用酶联免疫吸附测定或者酶联免疫斑点方法检测机体全血或者外周血单核细胞中产生IFN-γ的T细胞数量及细胞因子变化量。
所有这些诊断方法中，血清学检测是体外诊断TB的有效方法，其检测方法简单、快速、高效和低廉，成为近年来TB诊断的研究热点。该方法通过基因工程获取重组抗原，建立间接ELISA方法检测病人血清中的抗MTB的抗体，在TB的血清学诊断中显示出良好的应用价值，虽然目前已有基于重组抗原组合的商品化试剂盒如胶体金法试剂盒TB38-16KD，但在临床检验中其特异性与敏感性不甚理想，且不能诊断潜伏性结核病。
因此，寻找特异性强和敏感性高的MTB抗原是提高TB血清学诊断阳性率的关键。
发明内容
本发明解决了背景技术中的不足，提供了一种用于TB血清学诊断的ELISA试剂盒，该试剂盒中的两种重组蛋白(抗原)均能够与TB患者血清发生特异结合，敏感性和特异性高，且能诊断潜伏性结核病，具有较好的应用前景。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
一种用于TB血清学诊断的ELISA试剂盒，该试剂盒中至少包括包被液、洗涤液、封闭液和终止液，试剂盒中还包含以下组分：重组蛋白rRv2994，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；重组蛋白rRv3347c6238-7278，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明成功构建了2种原核表达重组载体pET-28a/Rv2994和pET-28a/Rv3347c6238-7278，将其分别转化到E.coliBL21中并用IPTG诱导表达，分别表达出其相应的两种重组融合蛋白，经镍柱亲和纯化后获得纯化的重组蛋白。
所述包被液为0.05M的碳酸盐缓冲液，其pH为9.6；所述的洗涤液为含0.05％Tween-20的PBST缓冲液，其pH为7.6；所述封闭液为含5％BSA的PBS缓冲液；所述的终止液为2mol/L的H2SO4溶液。
本发明所提供的重组蛋白rRv2994和rRv3347c6238-7278均能与TB患者血清发生特异结合，经间接ELISA法检测，两种蛋白的敏感性和特异性分别为100.0％和96.5％、98.6％和94.7％，具有良好的免疫反应性，能够作为TB血清学诊断的优选抗原。
附图说明
图1为实施例中PCR产物1.0％琼脂糖电泳分析图；
图2为实施例中两种重组质粒双酶切1.0％琼脂糖电泳分析图；
图3为实施例中两种重组质粒在E.coliBL21中的表达图；
图4为实施例中两种重组蛋白的纯化图；
图5为Western Blot法检测重组蛋白与临床血清的免疫反应性结果图；
图6为ELISA法检测重组蛋白与临床血清的免疫反应性结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
一、原核表达重组载体的构建
1、目的基因的PCR扩增
(1)引物设计与合成
根据GenBank中Rv2994和Rv3347c6238-7278两种基因的DNA序列，分别设计上下游引物(下划线为限制性内切酶酶切位点)，各基因的上下游引物及酶切位点、产物长度和退火温度如下表所示：
(2)目的基因的PCR扩增反应体系及程序
以TB的基因组DNA为模板，用PyrbestTM高保真DNA聚合酶进行PCR扩增目的基因。PCR反应体系均为：PyrbestTM DNAMix 12.5μL、上下游引物各1μL、MTB DNA模板2μL，去离子水8.5μL。Rv2994的扩增参数为：98℃30s；98℃10s，59℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸2min。Rv3347c6238-7278的扩增参数为：98℃30s；98℃10s，55℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸2min。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后观察结果。
结果显示如图1所示，分别扩增出大小为1338bp和1044bp的PCR产物，分别与Rv2994和Rv3347c6238-7278基因的片段大小一致。然后采用DNA纯化试剂盒对PCR产物进行纯化回收。
2、载体与目的基因的双酶切鉴定及纯化回收
(1)原核质粒pET-28a与目的基因Rv2994和Rv3347c6238-7278的双酶切体系
(2)原核质粒pET-28a与目的基因双酶切后的纯化回收
按25μL酶切体系加入各成分，600rpm点离10s，放至37℃水浴箱中保温酶切4h，然后65℃水浴15min终止酶切反应。纯化双酶切后的目的基因和原核表达质粒pET-28a。
3、载体与目的基因的连接
连接体系如下：
按上述体系将纯化好的目的基因和质粒双酶切产物及各反应物加到0.1mL EP管中，混匀后点离，22℃连接3h。
4、转化
(1)取10μL经65℃灭活10min的连接产物，加入到感受态细胞中混匀，冰浴30min；
(2)将菌液放置在42℃水浴箱中热激90s，迅速冰浴3min；
(3)转化物加入800μL LB液体培养基，180rpm、37℃振荡培养1h，4℃，14 000rpm离心1min；
(4)吸去800μL上清，将剩余成分轻轻吹打，重悬菌体；
(5)将重悬的菌液均匀铺于LB固体培养基(含卡那霉素)上，37℃倒置培养过夜。
5、阳性克隆的筛选与鉴定
(1)阳性克隆的筛选
过夜培养后，从LB固体培养基(含卡那霉素)上随机挑取5个单菌落，分别接种于1mL LB液体培养基(含卡那霉素)中，37℃、220rpm振荡培养过夜；
(2)阳性克隆的鉴定
两种重组质粒双酶切后，用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳分析(如图2所示)，图2中，M:DNA Marker；1:pET-28a/Rv2994PCR product；2:pET-28a/Rv3347c6238-7278PCRproduct。
将重组质粒的测序结果与GenBank公布的Rv2994和Rv3347c6238-7278序列进行BLAST比对，结果显示构建的各重组质粒基因Rv2994和Rv3347c6238-7278与GenBank公布的相应序列符合率均为100％，表明重组质粒构建成功。
二、两种重组蛋白的表达、纯化与鉴定
1、原核重组表达载体的诱导表达
(1)分别取含构建的重组质粒pET-28a/Rv2994和pET-28a/Rv3347c6238-7278的E.coli BL21接种于含卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜；
(2)分别挑取单个菌落接种于LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养过夜；
(3)重组菌Rv2994经培养后，加入IPTG至终浓度为1.5mmol/L，28℃下诱导培养12h。重组菌Rv3347c6238-7278经培养后，加入IPTG至终浓度为1.5mmol/L，37℃下诱导培养8h。
(4)离心收集菌体沉淀并重悬于PBS中，加入溶菌酶至终含量为4.0g/L；冰浴作用2h，超声波破碎菌液(每次10s，间歇10s；共计5次)。4℃，12 000rpm离心15min，分别收集上清和沉淀，取32μL上清与8μL的5×SDS上样缓冲液均匀混合；菌体沉淀中加入40μLPBS与10μL的5×SDS上样缓冲液混匀，煮沸5min，进行SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色以观察重组蛋白rRv2994和rRv3347c6238-7278的存在状态。
通过改变诱导时的温度、IPTG浓度和时间摸索蛋白最佳表达条件，rRv2994和rRv3347c6238-7278均以包涵体形式表达。两种重组质粒在E.coliBL21中的表达图如图3所示。28℃、1.5mmol/LIPTG、诱导12h时rRv2994表达水平最高；37℃、1.5mmol/LIPTG、诱导8h时rRV3347c6238-7278表达水平最高。
2、重组蛋白的鉴定
(1)将各重组蛋白经SDS-PAGE电泳，条件设置为90V电泳30min，待样品进入分离胶后，电压调至120V，电泳至合适位置后，在各重组蛋白相应的分子量处切胶；
(2)用半干转膜仪将胶上的蛋白经90mA 2h转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上；
(3)转膜完毕，将膜正面朝下浸泡于含5％BSA的封闭液中，4℃封闭过夜；
(4)加入TBST缓冲液洗膜3次，每次15min；
(5)PVDF膜浸泡于鼠源性抗His标签单克隆抗体(1:15000)中，室温孵育2小时；
(6)加入TBST缓冲液洗膜5次，每次15min；
(7)加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体(1:20000)室温孵育45min；
(8)加入TBST缓冲液洗膜5次，每次15min；
(9)把增强型ECL化学发光剂均匀加于PVDF膜上，使用全自动化学发光图像分析系统拍照并保存。
3、重组蛋白的大规模制备
按照上步骤中各蛋白表达条件进行大规模表达。10 000rpm离心15min，收集菌体沉淀。加适量PBS缓冲液洗涤菌体2次，洗涤后按每克湿菌体加入8mLPBS缓冲液，加入溶菌酶至终浓度为4.0g/L；样本置于冰盒内于摇床振荡过夜，超声波破碎(每次10s，间歇10s；共计60次)。4℃，12 000rpm离心20min收集包涵体沉淀。
4、包涵体洗涤和溶解
(1)取超声波破碎分离的包涵体，加入包涵体洗涤液Ⅰ(4％TritonX-100，60mmol/LEDTA，1.5mol/L NaCl，pH＝7.0)，漩涡振荡混匀，放置冰盒内摇床振荡30min，4℃，10000rpm离心15min，收集沉淀；
(2)加入包涵体洗涤液Ⅱ(0.1mol/L Tris-Cl，20mmol/LEDTA，2mol/L Urea，pH＝7.0)，混匀，冰浴摇床振荡30min，4℃，10 000rpm离心15min，收集洗涤后的包涵体；
(3)洗涤后的包涵体重悬于溶解液(0.1mol/L Tris-Cl，8mol/L Urea，5mmol/LDTT，pH＝8.0)，室温孵育过夜，使包涵体充分溶解。
5、重组蛋白的变性纯化
(1)获取溶解后的包涵体溶液，4℃，10000rpm离心15min收集上清液；
(2)用Buffer B缓冲液(8mol/LUrea，100mmol/LNaH2PO4，10mmol/LTris-Cl，pH＝8.0)预平衡Ni-NTA柱2min，弃去流出液，用PBS缓冲液将柱子润洗2次；
(3)将收集的包涵体溶解液上清加入Ni-NTA柱，摇床振荡1h，使蛋白充分挂柱；
(4)用Buffer C缓冲液(8mol/LUrea，100mmol/LNaH2PO4，10mmol/LTris-Cl，pH＝6.3)洗柱，收集流出液，反复洗涤3次；
(5)用Buffer D缓冲液(8mol/LUrea，100mmol/LNaH2PO4，10mmol/LTris-Cl，pH＝5.9)洗柱，收集流出液，反复洗涤3次；
(6)用Buffer E缓冲液(8mol/LUrea，100mmol/LNaH2PO4，10mmol/LTris-Cl，pH＝4.5)进行洗脱，收集流出液，反复洗涤3次。
收集大量诱导表达的rRv2994和rRv3347c6238-7278，超声破碎菌体获得包涵体，经洗涤和变性溶解后上Ni-NTA柱，用Buffer B、Buffer C、Buffer D和Buffer E进行洗脱。结果显示均能得到纯度较高的rRv2994和rRv3347c6238-7278，如图4所示。纯化后的rRv2994和rRv3347c6238-7278经透析袋透析复性，PEG800浓缩，用BCA蛋白定量试剂盒测定浓度分别为为450μg/ml和480μg/ml。
6、重组蛋白透析复性
(1)分别把纯化后的rRv2994和rRv3347c6238-7278加入透析袋内，透析袋放置于透析液(50mmol/L NaCl、0.5mmol/L EDTA、50mmol/L Tris、1mmol/L GSH、0.1mmol/L GSSG，50％甘油，pH＝8.0)内，4℃透析过夜；
(2)将透析液更换为(4mol/L Urea、2mmol/L GSH、0.2mmol/L GSSG、PBS pH＝7.4)，4℃透析过夜；
(3)向透析杯中分批加入共1L的PBS缓冲液，缓慢降低Urea浓度使重组蛋白自然复性；
(4)最后用聚乙二醇PEG800浓缩复性后的蛋白。
7、总结
本实施例中成功构建了含MTB Rv2994和Rv3347c6238-7278基因的两种原核表达载体pET-28a/Rv2994和pET-28a/Rv3347c6238-7278。分别对两种重组蛋白rRv2994和rRv3347c6238-7278的表达条件进行了摸索与优化，内容包括诱导剂IPTG浓度(0.2mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L和2.0mmol/L)、诱导温度(16℃、28℃、30℃和37℃)和诱导时间(3h、6h、8h、12和24h)。结果显示：rRv2994在IPTG浓度为1.5mmol/L，28℃时诱导12h在沉淀中表达水平最高，上清中无表达；rRv3347c6238-7278在IPTG浓度为1.5mmol/L，37℃时诱导8h在沉淀中表达水平最高，上清中无表达。说明两种重组蛋白均以包涵体形式表达，重组目的蛋白形成包涵体的可能原因如下：(1)在大量合成的目的蛋白rRv2994和rRv3347c6238-7278时，蛋白折叠过程中，大肠杆菌E.coliBL21内参与蛋白正确折叠的因子不能满足需求，因此产生包涵体；(2)当大肠杆菌E.coliBL21表达了对其有毒性的蛋白时，rRv2994和rRv3347c6238-7278所形成的包涵体是表达宿主菌的一种自身保护行为。本发明通过以下方法进行改进：(1)降低IPTG诱导物浓度；(2)降低诱导温度；(3)重新提取测序成功的阳性菌重组质粒，更换原核表达菌E.coliRosetta。但重组蛋白仍以包涵体形式进行表达。因此，本发明采用含8M尿素的溶解液溶解包涵体rRv2994和rRv3347c6238-7278，经过Ni柱纯化的重组蛋白为变性蛋白，将变性蛋白用含氧化性和还原性谷胱甘肽的透析液进行透析，使其折叠成正确的空间结构以恢复重组蛋白的生物学活性。
三、重组蛋白的免疫活性研究
将30只8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为PBS组、rRv2994组和rRv3347c6238-7278组。经实验研究，rRv2994和rRv3347c6238-7278均具有良好的免疫原性，能诱导小鼠产生特异性抗体。小鼠血清中特异性IgG抗体水平随免疫次数增加呈上升趋势。末次免疫小鼠两周后，rRv2994组和rRv3347c6238-7278组免疫组小鼠血清IgG抗体效价分别为1∶12800和1∶12800。Western blot检测结果表明两种重组蛋白均能与小鼠血清发生特异结合。
总结：将rRv2994和rRv3347c6238-7278重组蛋白经皮下多点注射法免疫雌性BALB/c小鼠，发现rRv2994和rRv3347c6238-7278蛋白均具有良好的免疫原性，能有效诱导免疫小鼠产生相应的IgG抗体，免疫第6周后其IgG抗体效价均达到1∶12800，明显高于对照组(P<0.01)。Western blot检测的结果表明，两种重组蛋白均能与免疫的小鼠血清发生特异结合。
四、重组蛋白免疫反应性的临床评价
1、本实施例中所采用的人体血清及来源如下：
(1)TB阳性血清(痰涂片抗酸染色阳性，经胶体金法检测其抗MTB抗体为阳性)70份，来自衡阳市第三人民医院检验科；
(2)肺炎支原体阳性血清(经胶体金法检测其抗MTB抗体为阴性)32份，由南华大学附属第一医院检验科提供；
(3)TB阴性血清(痰涂片抗酸染色为阴性，且经胶体金法检测MTB抗体和肺炎支原体抗体均为阴性)57份，来自衡阳市第三人民医院检验科。
2、Western Blot检测重组蛋白与临床血清的免疫反应性
将8份TB阳性血清混合，以1∶200的比例稀释作为一抗，Western Blot鉴定重组蛋白rRv2994和rRv3347c6238-7278与结核患者血清的反应性。
(1)将各蛋白在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，90V电泳30min，待样品进入分离胶后，调整电压至120V电泳至发明所需时间，分别在目的蛋白相应的分子量处切胶；
(2)用半干转膜仪将SDS-PAGE胶上的蛋白经90mA 2h转移至PVDF膜上；
(3)转膜完毕，用含5％BSA的封闭液4℃封闭过夜；
(4)加入TBST缓冲液洗膜3次，每次15min；
(5)PVDF膜与临床血清(1∶200稀释)结合，室温孵育2h；
(6)加入TBST缓冲液洗膜5次，每次15min；
(7)加入HRP标记的羊抗人IgG(1∶10 000稀释)，室温孵育45min；
(8)加入TBST缓冲液洗膜5次，每次15min；
(9)把增强型ECL化学发光剂均匀加在PVDF膜上，使用全自动化学发光图像分析系统拍照并保存。
3、间接ELISA法评价重组蛋白与临床血清的免疫反应性
以纯化、鉴定并测定后的rRv2994和rRv3347c6238-7278作为抗原包被ELISA微孔板，分别以临床收集的结核病阳性血清、阴性血清和肺炎支原体阳性血清做为一抗，间接ELISA法检测临床血清中特异性IgG，具体步骤如下：
(1)包被：分别将纯化的rRv2994和rRv3347c6238-7278用pH 9.6的碳酸盐缓冲液分别稀释至浓度为10μg/mL，100μL/孔，于4℃包被过夜；
(2)洗涤：甩去孔内液体，加入PBST缓冲液(含0.05％Tween-20的PBS缓冲液，pH7.6)，100μL/孔洗涤3次，拍干；
(3)封闭：按照200μL/孔加入含5％BSA的PBS缓冲液，37℃封闭2h；
(4)洗涤：重复步骤(2)；
(5)加一抗：将临床血清稀释(1∶500)后加入微孔板内，100μL/孔，37℃孵育2h；
(6)洗涤：重复步骤(2)；
(7)加二抗：向各孔内加入50μLHRP标记的羊抗人IgG抗体(1∶10 000)37℃孵育1h；
(8)洗涤：重复步骤(2)；
(9)显色：分别加TMB显色剂A液和B液各50μL，避光显色10min后加入终止液；
(10)测定：用酶标仪测定各待测孔的A450值；以结核病阴性血清做阴性对照，以其平均A450+2S为阳性临界值，测定孔A450值大于阳性界值为阳性，否则判为阴性；根据各重组蛋白与各临床血清的反应情况，评价重组蛋白的免疫反应性。
4、重组蛋白免疫反应性的临床评价结果
分别采用Western Blot和ELISA法检测rRv2994和rRv3347c6238-7278与临床血清的免疫反应性，检测结果如图5和图6所示，结果表明rRv2994和rRv3347c6238-7278用于检测临床血清具有较高的特异性和敏感性：与胶体金法(38-16KDa)比较，rRv2994的特异性为96.5％，敏感性为100.0％，总符合率为98.4％；rRv3347c6238-7278的特异性为94.7％，敏感性为98.6％，总符合率为96.9％。检测结果如下表所示：
间接ELISA法检测临床血清的敏感性和特异性
Claims (3)
1.一种用于结核病血清学诊断的ELISA试剂盒，该试剂盒中至少包括包被液、洗涤液、封闭液和终止液，其特征在于试剂盒中还包含以下组分：重组蛋白rRv2994，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；和重组蛋白rRv3347c6238-7278，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的用于结核病血清学诊断的ELISA试剂盒，其特征在于：所述包被液为0.05M的碳酸盐缓冲液，其pH为9.6；所述的洗涤液为含0.05％Tween-20的PBST缓冲液，其pH为7.6；所述封闭液为含5％BSA的PBS缓冲液；所述的终止液为2mol/L的H2SO4溶液。
3.权利要求1所述的结核病血清学诊断ELISA试剂盒在制备检测结核病病人血清中结核分枝杆菌抗体的试剂中的应用。
Priority Applications (1)
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| 结核分枝杆菌Rv2994 基因原核表达及鉴定;赵明才 等;《卫生研究》;20060331;第35卷(第2期);摘要，第1.1.5节至第3节 * |
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