CN105693831A - 家畜s2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的ielisa检测试剂 - Google Patents

家畜s2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的ielisa检测试剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂，所述IELISA检测试剂的有效成分为布鲁氏菌S2疫苗株基因GL_0002189编码的抗原蛋白以及布鲁氏菌BP26蛋白，或者它们的N端或C端融合有His标签的重组蛋白。本发明提供的IELISA检测试剂能鉴别布鲁氏菌主要流行株—羊种/牛种布鲁氏菌及市场上普遍使用的主流疫苗—S2疫苗。因此，能够在短时间内鉴别家畜血清中疫苗免疫与羊种/牛种布鲁氏菌自然感染抗体，解决免疫畜群中疫苗抗体干扰布病检测和畜群净化的难题。不仅可带来,社会经济效益，而且可为净化畜群中的布鲁氏菌病做出贡献。

Description

家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂
技术领域
本发明涉及基因工程及免疫学领域，具体地说，涉及一种家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂。
背景技术
布鲁氏菌病(brucellosis)是由布鲁氏杆菌(brucella)引起的全世界范围内广泛流行的人兽共患，OIE归为乙类传染病。布鲁氏菌分七个种，牛种(B.abortus)、羊种(B.melitensis)、猪种(B.suis)、犬种(B.cains)、绵羊种(B.ovis)、森林鼠种布鲁氏菌(B.neotomae)、海洋哺乳动物布鲁氏菌(B.meris)，羊种、牛种为主要流行病原种类，其中羊种毒力最强，危害最大。布鲁氏菌病传染方式为接触患病动物、未消毒的肉制品、乳制品，也可经呼吸道、消化道及皮肤黏膜等组织器官侵入体内引起感染。
布鲁氏菌一旦进入宿主体内，细菌侵入血液和淋巴管，繁殖并被巨噬细胞吞噬。家畜感染布鲁氏菌病常见的症状有母畜流产、公畜睾丸肿大、严重者肝脏和脾脏等内脏肿大。家畜感染布鲁氏菌多以淘汰为主，为此，严重影响了畜牧业的健康发展，而且威胁到了人类的健康。
近几年来，我国布鲁氏菌病的流行较为严重，已经受到各级政府部门、科研工作者和广大人民群众的广泛关注。传统疫苗很难达到理想的保护免疫水平，并且目前的诊断方法无法辨别布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染，而近年来研究的一些鉴别诊断方法不能很好地在生产实践中鉴别S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染，因此，很难做到在免疫畜群中净化布鲁氏菌自然感染病畜。
发明内容
本发明的目的是提供一种家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂。
本发明的另一目的是提供用于鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂盒。
为了实现本发明目的，本发明针对市场上普遍使用的布鲁氏菌主流疫苗—S2疫苗，对S2疫苗进行全基因组测序及生物信息学分析。找出与羊/牛种布鲁氏菌相比较S2疫苗株的特有基因，基因重组表达后，筛选出具有免疫原性的抗原蛋白，建立布鲁氏菌S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA鉴别方法。
本发明首先提供GL_0002189抗原蛋白，其氨基酸序列如SeqIDNo.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。该GL_0002189抗原蛋白由S2疫苗株基因GL_0002189(SeqIDNo.2)编码。
本发明还提供用于扩增S2疫苗株基因GL_0002189的特异性PCR引物。
本发明还提供所述GL_0002189抗原蛋白在制备家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂中的应用。
本发明中涉及的布鲁氏菌自然感染是指羊种和/或牛种布鲁氏菌自然感染。
本发明还提供一种鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的胶体金试纸条，所述试纸条上包被有GL_0002189抗原蛋白以及布鲁氏菌BP26蛋白，或者它们的N端或C端融合有His标签的重组蛋白。
本发明还提供含有上述IELISA检测试剂的家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂盒。
本发明进一步提供一种鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的方法，提取待测家畜的血清，用上述IELISA检测试剂进行检测，比较两种抗原蛋白的阳性检出率。如果IELISA检测结果为两种抗原蛋白均为阳性，则待测家畜血清中含有S2疫苗免疫产生的抗体；如果GL_0002189抗原蛋白检测为阴性，BP26蛋白检测为阳性，则待检家畜为羊种或牛种布鲁氏菌自然感染。上述鉴别方法同样适用于感染布鲁氏菌的人血清的检测。
实验表明，本发明建立的IELISA鉴别方法具有较好的重复性及较高的特异性和敏感性。
本发明提供的IELISA检测试剂能鉴别布鲁氏菌中毒力强、危害大的主要流行病原—羊种/牛种布鲁氏菌及市场上普遍使用的主流疫苗—S2疫苗。因此，能够在短时间内鉴别家畜血清中疫苗免疫与自然感染抗体，解决免疫畜群中疫苗抗体干扰布病检测(假阳性)和畜群净化的难题。不仅可带来社会经济效益，而且可为净化畜群中的布鲁氏菌做出贡献。
附图说明
图1为本发明实施例1中布鲁氏菌S2疫苗株基因GL_0002189的PCR检测结果；其中，M为DNAMarkerDL2000；1为S2疫苗；2为羊种菌；3为牛种菌。
图2为本发明实施例1中基因GL_0002189及BP26的PCR扩增电泳图；其中，M为DNAMarkerDL2000；1为基因GL_0002189；2为基因BP26；3为空白对照。
图3为本发明实施例1中重组克隆质粒GL_0002189双酶切鉴定结果；其中，M为DNAMarkerDL2000；1-3为基因GL_0002189。
图4为本发明实施例1中重组克隆质粒BP26双酶切鉴定结果；其中，M为DNAMarkerDL2000；1-3为基因BP26。
图5为本发明实施例1中重组表达质粒GL_0002189双酶切鉴定结果；其中，M1为DNAMarkerDL2000；M2为DNAMarkerDL15000；1-3为基因GL_0002189。
图6为本发明实施例1中重组表达质粒BP26双酶切鉴定结果；其中，M1为DNAMarkerDL2000；M2为DNAMarkerDL15000；1-3为基因BP26。
图7为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETGL_0002189)诱导时间优化SDS-PAGE电泳结果；其中，M为蛋白质marker；1为BL21空菌；2为pET30诱导前；3为pET30诱导后；4-9为pETGL_00021890h、1h、2h、3h、4h、6h诱导表达菌。
图8为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETBP26)诱导时间优化SDS-PAGE电泳结果；其中，M为蛋白质marker；1为BL21空菌；2为pET30诱导前；3为pET30诱导后；4-9为pETBP260h、1h、2h、3h、4h、6h诱导表达菌。
图9为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETGL_0002189)诱导剂浓度优化SDS-PAGE电泳结果；其中，M为蛋白质marker；1为BL21空菌；2为pET30诱导前；3为pET30诱导后；4-9为IPTG终浓度为0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM时BL21(pETGL_0002189)诱导表达。
图10为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETBP26)诱导剂浓度优化SDS-PAGE电泳结果；其中，M为蛋白质marker；1为BL21空菌；2为pET30诱导前；3为pET30诱导后；4-9为IPTG终浓度为0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM时BL21(pETBP26)诱导表达。
图11为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETGL_0002189)诱导剂温度优化SDS-PAGE电泳结果；其中，M为蛋白质marker；1为BL21空菌；2为pET30诱导前；3为pET30诱导后；4-6为BL21(pETGL_0002189)25℃、30℃、37℃诱导表达。
图12为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETBP26)诱导温度优化SDS-PAGE电泳结果；其中，M为蛋白质marker；1为BL21空菌；2为pET30诱导前；3为pET30诱导后；4-6为BL21(pETBP26)25℃、30℃、37℃诱导表达。
图13为本发明实施例1中重组菌在不同温度下生长情况。
图14为本发明实施例1中两个重组蛋白表达形式的SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M为蛋白质marker；1为BL21(pETGL_0002189)菌体裂解物上清；2为BL21(pETGL_0002189)菌体裂解物沉淀；3为BL21(pETBP26)上清；4为BL21(pETBP26)菌体裂解物沉淀。
图15为本发明实施例1中两个纯化的重组蛋白纯化的SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M为蛋白质marker；1为纯化的重组蛋白GL_0002189；2为纯化的重组蛋白BP26。
图16为本发明实施例1中重组蛋白His标签Western-bloting检测结果；其中，M为蛋白质marker；1为BL21(pETGL_0002189)；2为BL21(pETBP26)。
图17为本发明实施例1中纯化重组蛋白BL21(pETGL_0002189)与S2免疫血清反应检测结果；其中，M为蛋白质marker；1为BL21；2为BL21(pETGL_0002189)自然感染血清反应；3为BL21(pETGL_0002189)S2免疫血清反应。
图18为本发明实施例1中纯化蛋白BL21(pETBP26)与S2免疫血清反应检测结果；其中，M为蛋白质marker；1为BL21；2为BL21(pETBP26)自然感染血清反应；3为BL21(pETBP26)S2免疫血清反应。
图19为本发明实施例2中GL_0002189抗原IELISA敏感性和特异性分析。
图20为本发明实施例2中BP26抗原IELISA敏感性和特异性分析。
图21为本发明实施例2中GL_0002189抗原IELISA检测羊血清的ROC曲线图。
图22为本发明实施例2中BP26抗原IELISA检测羊血清的ROC曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1S2疫苗株基因GL_0002189以及布鲁氏菌BP26基因的克隆、原核表达
通过S2疫苗株全基因组测序，预测出的编码基因与已公布的布鲁氏菌基因组数据比对分析，找出与羊种和牛种布鲁氏菌相比较S2特有基因，用PCR方法从S2基因组中扩增出S2疫苗株的特有基因GL_0002189(SeqIDNo.2)，同时以布鲁氏菌BP26基因(SeqIDNo.3)作为对照基因，克隆测序后，构建到原核表达载体pET30中，转化至E.coliBL21(DE3)，进行诱导表达，用western-bloting法验证GL_0002189和BP26两个重组蛋白的免疫原性。
1.1实验方法：
1.1.1引物设计
根据GL_0002189和BP26基因序列，用Oligo6.0设计引物，分别在上游引物和下游引物中插入EcoRI、XhoI酶切位点，引物的合成由华大基因有限公司完成，引物序列见表1。
表1GL_0002189和BP26基因引物序列
1.1.2基因组DNA提取
按照Axygen核酸提取试剂盒步骤操作。
1.1.3GL_0002189基因PCR扩增
将S2疫苗株GL_0002189基因与NCBI公布的其它种布鲁氏菌进行BLAST比对分析，然后进行PCR扩增和特有性验证。PCR扩增反应条件为：预变性95℃5min；变性94℃1min，退火60℃1min，延伸72℃1.5min，35个循环；再延伸72℃10min。PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.1.4目的基因扩增
目的基因PCR扩增，进行凝胶琼脂糖电泳检测。具体反应条件如1.1.3描述。
1.1.5PCR产物回收
按照AxygenPCR产物回收试剂盒说明书步骤操作，回收GL_0002189和Bp26基因PCR产物。
1.1.6PCR回收产物与pMD19-TSimple载体的连接
取200μL离心管加1μLpMD19-TSimpleVector、4μLPCR回收产物、5μLSolutionⅠ，离心混匀，并在16℃过夜连接。
1.1.7重组质粒的转化
按照北京全式金(TransGenBiotech)生物技术有限公司Trans1-T1感受态细胞使用说明书操作步骤，将连接产物转化于Trans1-T1感受态细胞中，涂布于含抗生素(Amp)的固体LB培养基上，37℃培养过夜。
1.1.8重组克隆菌菌液PCR鉴定
挑取阳性菌落，接种到含抗生素(Amp)的液体LB培养基里中培养过夜，培养物做PCR扩增鉴定。
1.1.9重组克隆质粒的双酶切鉴定
按照Axygen质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒，用限制性内切酶XhoI和EcoRⅠ对重组质粒进行双酶切电泳检测。
1.1.10重组克隆菌测序
经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定后的重组克隆菌，送到北京华大基因公司进行双向测序。
1.1.11目的基因与表达载体pET30a的回收
将测序正确的克隆菌株和含有pET30a质粒的菌接种于LB培养基中培养过夜，提取质粒，回收目的基因片段和pET30a片段。
1.1.12目的基因与表达载体pET30a的连接
取200μL离心管加入6μL回收的目的片段、2μLpET30a表达载体片段、1μLT4DNA连接酶、1μLbuffer，16℃连接过夜。
1.1.13重组质粒转化于感受态细胞
按照北京全式金(TransGenBiotech)生物技术有限公司BL21(DE3)感受态细胞使用说明书操作步骤，将连接产物转化于BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含抗生素(Kan)固体LB培养基上37℃培养过夜。
1.1.14重组表达菌菌液PCR鉴定
具体步骤见1.1.8。
1.1.15重组表达质粒的双酶切鉴定
具体步骤见1.1.9。
1.1.16重组表达菌诱导表达
1.1.16.1诱导表达时间的优化
将重组表达菌BL21(pETGL_0002189)、BL21(pETBP26)涂布于含Kan的固体LB培养基上培养过夜，挑取单菌落接种在6mL含Kan液体培养基中，37℃培养过夜。第二天以1:100的比例接种于20mL含KanLB培养基中，37℃150r/min诱导培养，当OD600达到0.6～1.0时1mL菌液作为0h对照，其余的培养物里加入IPTG诱导剂，至终浓度1.0mM，37℃150r/min诱导培养。分别在0h、1h、2h、3h、4h、6h每个时间点各取2mL菌液，1mL测吸光值OD600，另1mL离心收集菌体，菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸变性10min，12％SDS-PAGE电泳检测。
1.1.16.2诱导剂IPTG浓度的优化
将重组表达菌BL21(pETGL_0002189)、BL21(pETBP26)涂布于含Kan固体LB培养基上培养过夜，挑取单菌落接种在6mL含Kan的液体培养基里，37℃培养过夜。第二天以1:100的比例接种于20mL含Kan的LB培养基中，37℃150r/min培养，当OD600达到0.6～1.0时，加入诱导剂IPTG至终浓度0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM。37℃150r/min继续培养4h，各取2mL菌液，1mL测吸光值OD600，另1mL离心收集菌体，菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸变性10min，12％SDS-PAGE电泳检测。
1.1.16.3诱导表达温度的优化
将重组表达菌BL21(pETGL_0002189)、BL21(pETBP26)涂布于含Kan固体LB培养基上培养过夜，挑取单菌落接种在6mL含Kan液体培养基里，37℃培养过夜。第二天以1:100接种于20mL含Kan的LB培养基中，37℃150r/min培养，当OD600达到0.6～1.0时加入IPTG诱导剂至终浓度1.0mM，分别在25℃、30℃、37℃150r/min培养4h后各取2mL菌液，1mL测吸光值OD600，另1mL离心收集菌体，菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸变性10min，12％SDS-PAGE电泳检测。
1.1.16.4重组蛋白表达形式的检测
确定重组蛋白最佳诱导条件后，诱导表达300mL重组菌，离心收集菌体，将菌体沉淀用PBS洗3遍后，用PBS重悬浮沉淀,加入溶菌酶，常温放置1h，在-20℃反复冻融，冰浴超声破碎10min，12000×g离心10min,收集沉淀和上清，加入蛋白上样缓冲液煮沸10min，12％SDS-PAGE电泳检测蛋白表达形式。
1.1.17重组蛋白包涵体溶解及纯化
按最佳诱导条件诱导重组表达表达菌500mL，12000×g离心10min收集菌体,按上述方法裂解重组表达菌，离心收集裂解物沉淀，将沉淀用8M尿素溶解，12000×g离心10min，收集上清，0.45μm孔径滤器过滤后按照上海生工Ni+柱蛋白纯化试剂盒操作步骤纯化重组蛋白。
1.1.18重组蛋白westernblotting检测
将纯化出的两个重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，从制胶板上将蛋白质胶取出，在夹子上放置滤纸、NC膜、蛋白胶、滤纸，按顺序放好夹住，进行100V60min转膜。取出NC膜TBST洗4min，重复3～4遍，用现配的封闭液常温微摇封闭1h。取出NC膜TBST洗4min，重复3～4遍，将NC膜在1：50稀释的S2免疫的绵羊血清和1:4000稀释的MouseAnti-His.tagIgG中4℃孵育过夜。取出NC膜TBST洗4min，重复3～4遍，将NC膜在驴抗绵羊IgG中常温微摇孵育1h。取出NC膜TBST洗4min，重复3～4遍，再用ECL显色3min后照相。
1.2实验结果
1.2.1.GL_0002189基因PCR扩增
S2编码GL_0002189基因序列与NCBI公布的6种布鲁氏菌基因序列进行BLAST比对，比对结果见表2。发现GL_0002189基因只在猪种、犬种、鼠种中存在，而在羊种、牛种、绵羊种中不存在。
表2GL_0002189BLAST比对结果
GL_0002189PCR扩增后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。结果表明：GL_0002189只在猪种布鲁氏菌核酸中扩增出约660bp条带，而在牛种和羊种布鲁氏菌核酸中GL_0002189均未扩增出条带。
1.2.2目的基因扩增
GL_0002189和BP26PCR扩增后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。结果显示：GL_0002189和BP26分别出现约660bp、753bp条带，与预期的目的条带大小相符。
1.2.3重组克隆菌PCR鉴定
目的片段与pMD19-T载体连接后转入感受态细胞，在固体培养基上培养12～16h，挑取3个菌落接种到LB液体培养基，培养12～16h，再以菌液为模板PCR扩增，并进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。GL_0002189和BP26基因克隆菌分别扩增出了约660bp、753bp条带，均获得了预期大小的目的条带。
1.2.4重组克隆质粒的双酶切鉴定
经菌液PCR鉴定呈阳性的菌株提取质粒，用限制性内切酶(EcoRI、XhoI)进行双酶切，酶切产物电泳检测，结果见图3、图4。结果均出现了两个条带，分别为GL_0002189(0.6kb、2.7kb)、BP26(0.7kb、2.7kb)，表明两个目的基因序列成功插入pMD19-T载体序列中。
1.2.5重组表达菌PCR鉴定
目的片段插入到pET30a载体后转化感受态菌体细胞，涂布在固体培养基上培养12～16h，挑取3个单菌落摇菌培养12～16h，以菌液为模板PCR扩增，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。GL_0002189和BP26分别扩增出约660bp、753bp的条带，与预期的目的条带大小相符。
1.2.6重组表达质粒的双酶切鉴定
经PCR鉴定呈阳性的菌株提取质粒(按照Axygen质粒提取试剂盒说明书操作)用限制性内切酶(EcoRI、XhoI)进行双酶切，酶切产物电泳检测，结果见图5、图6。结果均出现两个条带，分别为GL_0002189(0.6kb、5.4kb),BP26(0.7kb、5.4kb)，结果表明两个目的片段成功插入表达载体pET30a中。
1.2.7测序结果及分析
经PCR鉴定和双酶切鉴定呈阳性的菌液进行双向测序，为了确保测序结果的准确性，每个基因挑取3个独立的阳性菌株进行双向测序。双向测序得到的GL_0002189序列与全基因组测序得到的GL_0002189基因核苷酸序列比对同源性均为100％。双向测序得到的BP26序列在NCBI公布的序列同源性为100％。说明GL_0002189及BP26成功克隆至载体pMD19-T中，并成功构建重组表达载体。
1.2.8重组表达菌诱导条件优化
1.2.8.1重组表达菌诱导时间优化
重组表达菌BL21(pETGL_0002189)和BL21(pETBP26)培养至OD600达到0.6～1.0后，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，分别在0h、1h、2h、3h、4h、6h每个时间点各取2mL菌液，1mL测吸光值OD600，另1mL离心收集菌体，菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸10min，12％SDS-PAGE电泳检测，结果见图7、图8。结果表明：重组表达菌BL21(pETGL_0002189)和BL21(pETBP26)与空菌BL21(DE3)、pET30和未诱导的重组菌比较，分别在29KDa、32KDa处多出了一个条带，与预期的目的表达产物大小一致。
1.2.8.2重组表达菌IPTG诱导浓度优化
重组表达菌BL21(pETGL_0002189)和BL21(pETBP26)培养至OD600达到0.6～1.0之后，加入IPTG诱导剂至终浓度0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM继续培养4h，取2mL菌液，1mL测吸光值OD600，另1mL离心收集菌体，菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸10min，12％SDS-PAGE电泳检测，结果见图9、图10。结果表明：重组表达菌BL21(pETGL_0002189)、BL21(pETBP26)与空菌BL21(DE3)、pET30和未诱导的重组菌相比分别在29KDa、32KDa处多出了一个条带，这与预期的目的表达产物大小一致。从图可见，IPTG终浓度0.05mM时各个重组表达菌与其他浓度的IPTG诱导相比表达量明显低，而IPTG终浓度0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM时各个重组菌表达量没有明显差异，为保证重组蛋白的高效表达，诱导剂IPTG最佳诱导浓度确定为较高的浓度1.0mM。
1.2.8.3重组表达菌诱导温度优化
重组表达菌BL21(pETGL_0002189)、BL21(pETBP26)培养至OD6000.6～1.0时加入IPTG诱导剂至终浓度1.0mM，分别在25℃、30℃、37℃下，150r/min培养4h后各取2mL菌液，1mL测吸光值OD600，另1mL离心收集菌体，加入蛋白上样缓冲液煮沸10min，12％SDS-PAGE电泳检测，结果见图11、图12。从图可以看出2个重组蛋白在25℃诱导表达量明显比30℃、37℃诱导表达量低，从OD600和蛋白条带可见30℃、37℃诱导表达量没有明显差异。根据重组蛋白不同温度下生长情况，2个重组蛋白最佳诱导温度定为37℃，结果见图13。
1.2.9最佳诱导条件下重组蛋白表达形式的检测
确定重组蛋白最佳诱导条件后，诱导表达重组菌，离心收集菌体沉淀，裂解菌体，离心收集沉淀和上清，进行12％SDS-PAGE电泳，发现两个重组蛋白都以包涵体形式存在，结果见图14。
1.2.10重组蛋白包涵体溶解及蛋白纯化
两个基因重组表达诱导培养后，离心收集菌体，裂解，离心收集的沉淀用8M尿素溶解，再离心收集上清液，0.45μm孔径滤器过滤后按照上海生工Ni+柱蛋白纯化步骤过柱子纯化蛋白，得到了较纯的重组蛋白，结果见图15。
1.2.11重组蛋白Western-bloting检测
以MouseAnti-His.tagIgG为抗体做Western-Blotting检测，两个重组菌蛋白BL21(pETGL_0002189)及BL21(pETBP26)分别在29KDa、32KDa处出现了特异性条带，证明重组蛋白融合表达了pET30表达载体上的His标签，结果见图16。
以S2免疫绵羊血清作为抗体检测，重组蛋白GL_0002189及BP26与空菌BL21(DE3)比较，分别在29KDa、32KDa处出现了特异性条带，表明重组蛋白能够与S2免疫血清中的抗体发生特异性反应，具有较好的免疫原性。而重组蛋白GL_0002189与自然感染血清不反应，重组蛋白BP26与自然感染血清反应，说明GL_0002189基因是S2特有的，而在自然感染羊种/牛种流行株中不存在，结果见图17、图18。
实施例2IELISA鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的方法
2.1实验方法
2.1.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
按照棋盘滴定法，将实施例1中纯化好的两个重组蛋白用包被液进行稀释，稀释梯度为1：25、1：50、1：100、1:200四个梯度，抗原初始浓度分别为GL_0002189(0.421mg/mL)、BP26(0.553mg/ml)，每孔加100μl，4℃包被过夜，第二天弃掉孔内液体，用洗涤液洗三次，每次静置5min，洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。每孔加100μl封闭液，在37℃放置2h，用洗涤液洗三次，每次静置5min，洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。将已知阳性、阴性血清按1：50、1：100、1：200、1：400的四个梯度进行稀释，每孔加100μl稀释好的血清，37℃放置1h，用洗涤液洗三次，每次静置5min，洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。每孔加100μl按1：7000稀释的驴抗绵羊IgG-HRP,37℃放置30min,用洗涤液洗三次，每次静置5min，洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。每孔加100μlTMB显色液，37℃显色10min。显色结束后，每孔加100μl终止液终止反应，并在酶标仪上读取OD450值。根据OD450值计算每组的P/N值，P/N＝实验组/对照组＝OD阳性血清/OD阴性血清，P/N值最大时所对应的抗原稀释度和血清稀释度为最佳稀释度。
2.1.2二抗最佳最佳浓度的确定
按照棋盘滴定法，将纯化好的两个重组蛋白用包被液进行稀释，稀释梯度为1：25、1：50、1：100、1:200四个梯度，抗原初始浓度分别为GL_0002189(0.421mg/mL)、BP26(0.553mg/ml)，按上述操作方法进行抗原包被、洗涤、封闭和阴阳性血清的稀释，驴抗绵羊IgG-HRP按1：5000、1：7500、1：10000、1：15000四个梯度稀释，每孔加100μl，进行IELISA试验。根据OD450值计算每个二抗稀释度的P/N值，P/N值最大时所对应的二抗稀释度即为最佳二抗稀释度。
2.1.3重复性实验
对2份阳性血清和2份绵羊阴性血清进行检测，每个样品重复3次，计算每个样品标准差。
2.1.4判定点的确定
GL_0002189和BP26抗原检测20份背景清楚的自然感染血清及30份S2免疫血清，通过SPSS软件ROC分析，确认两个重组抗原IELISA判定点。
2.1.5敏感性和特异性实验
GL_0002189和BP26抗原检测20份背景清楚的自然感染血清及30份S2免疫血清，通过SPSS软件分析，确认两个重组抗原IELISA敏感性和特异性。
2.1.6田间实验
将待检的血清进行IELISA检测，比较两种抗原的阳性检出率。
2.2实验结果
2.2.1最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
将纯化好的GL_0002189和Bp26抗原按四个梯度稀释，已知阳性血清和阴性血清按四个梯度稀释，进行IELISA检测，根据IELISA显色后的颜色和OD450值能看出阳性、阴性血清颜色和OD450值大小存在明显差异，结果见表3、表4。根据P/N值计算出抗原最佳包被浓度为1:100，血清最佳稀释度为1:100，结果见表5、表6。
表3GL_0002189抗原棋盘滴定OD450值
表4BP26抗原棋盘滴定OD450值
表.5GL_0002189抗原对应的P/N值
表.6BP26抗原对应的P/N值
2.2.2酶标二抗最佳稀释度的确定
根据IELISA显色终止反应的颜色及计算P/N值大小，确定酶标二抗最佳稀释度为1:7500，结果见表7、表8。
表7GL_0002189酶标二抗最佳工作浓度的确定
表8BP26酶标二抗最佳工作浓度的确定
2.2.3重复实验
选取2份阳性血清和阴性血清，用两种重组抗原IELISA检测，每个样品重复3次。3次重复OD450差异不明显，表明两种重组抗原建立的IELISA检测方法均具有较好的重复性，结果如表9。
表9重组抗原重复实验OD450值及SD值
2.2.4判定点的确定
GL_0002189和BP26抗原用iELISA法检测血清，OD450值结果见表10、表11。利用SPSS软件根据OD450值进行ROC分析，确定重组抗原GL_0002189iELISA判定点为0.57，重组抗原BP26iELISA判定点为0.589，判定点分析见图19、图20。重组抗原GL_0002189ROC分析曲线下面积为0.987，重组抗原BP26ROC分析曲线下面积为0.987，2个重组抗原ROC分析曲线下面积均接近1，说明2个重组抗原iELISA检测法可靠性高，结果见图21、图22。
表.10GL_0002189判定点OD450值
表11BP26判定点OD450值
2.2.5特异性敏感性分析
GL_0002189和BP26抗原检测20份背景清楚的布鲁氏菌自然感染血清及30份布鲁氏菌S2免疫血清，通过SPSS软件分析发现重组抗原GL_0002189IELISA敏感性为95％、特异性为95％，重组抗原BP26IELISA敏感性为90％、特异性为86.7％,具体结果见图19、图20。
2.2.6田间实验
对180份SAT及RBPT检测呈阳性的布鲁氏菌感染血清进行IELISA检测，以GL_0002189抗原检测出61个阳性，BP26检测出176个阳性，说明180份血清中有61个为S2疫苗抗体阳性绵羊。GL_0002189抗原IELISA检测方法检出S2疫苗抗体阳性率为33.8％(61/180)，而BP26抗原IELISA检测方法检出阳性率为98.8％(176/180)，说明在SAT及RBPT检测呈阳性的家畜中，存在疫苗抗体干扰检测的假阳性。GL_0002189可用于布鲁氏菌S2疫苗感染与羊种/牛种布鲁氏菌自然感染的鉴别诊断，结果见表12。
表12田间实验结果
可见，本发明建立的IELISA鉴别检测方法能鉴别S2疫苗免疫与自然感染的布鲁氏菌病，且该方法具有较好的重复性及较高的特异性和敏感性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.GL_0002189抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SeqIDNo.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.权利要求1所述GL_0002189抗原蛋白的编码基因。
3.用于扩增权利要求2所述基因的特异性PCR引物。
4.权利要求1所述GL_0002189抗原蛋白在制备家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂中的应用。
5.家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂，其特征在于，所述IELISA检测试剂的有效成分为权利要求1所述GL_0002189抗原蛋白以及布鲁氏菌BP26蛋白，或者它们的N端或C端融合有His标签的重组蛋白。
6.鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条上包被有权利要求1所述GL_0002189抗原蛋白以及布鲁氏菌BP26蛋白，或者它们的N端或C端融合有His标签的重组蛋白。
7.家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求6所述的IELISA检测试剂。
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