CN106706904B

CN106706904B - 鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒及制备方法和应用

Info

Publication number: CN106706904B
Application number: CN201611058653.0A
Authority: CN
Inventors: 张腾飞; 李丽; 罗青平; 王红琳; 邵华斌; 温国元; 张蓉蓉; 罗玲; 卢琴; 汪宏才; 艾地云; 毛光明
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2018-06-29
Anticipated expiration: 2036-11-25
Also published as: CN106706904A

Abstract

本发明公开了一种鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒，包括沙门氏菌表面蛋白InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂和分泌蛋白SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂，InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂可通过乳胶凝集试验快速检测沙门氏菌抗体，SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂可通过乳胶凝集试验检测除鸡白痢以外血清型的沙门氏菌抗体，两者组合用于负筛选鸡白痢抗体阳性血液或血清样本；本发明还公开了沙门氏菌表面蛋白InvJ重组蛋白和分泌蛋白SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法。本发明具有抗原稳定、特异性强，敏感度高的优点，克服了现有鸡白痢凝集抗原生产菌种潜在的变异性及其培养条件变化导致的抗原不稳定性的问题。

Description

鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程和检测技术领域，具体涉及一种鸡白痢沙门氏菌抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒，同时涉及该检测试剂盒中InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂和SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法，还涉及该试剂盒在检测鸡白痢沙门氏菌感染抗体中的应用。

背景技术

沙门氏菌具有多种血清型，可感染鸡群的主要有鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等血清型。其中鸡白痢(Pullorum Disease,PD)是由鸡白痢沙门氏菌(SG)引起的一类传染疾病，是目前危害养鸡业的主要传染病之一。鸡白痢沙门氏菌可垂直传播和水平传播，对雏鸡危害很大，感染雏鸡表现为不吃饲料，怕冷，身体蜷缩，呼吸困难，精神沉郁或昏睡，排白色粘稠或淡黄、淡绿色稀便，肛门有时被硬结的粪块封闭，可引起较高的死亡率。成年鸡感染较少有临床症状，少数感染严重的病鸡表现精神萎靡，稀便，出现肝脏、脾脏肿大。产蛋鸡可见卵巢萎缩，卵子变性，病鸡产蛋停止。由于该病可水平和垂直传播，可引起雏鸡大面积死亡，难于根治，给养鸡业造成严重的经济损失。

目前的防控策略为净化，通过淘汰抗体阳性的种鸡，在鸡场中净化鸡白痢沙门氏菌，以达到防控的目的。因此高效的抗体检测方法对鸡白痢净化具有关键的作用。目前主要采取全血或血清玻板凝集试验，其抗原成分为灭活的全菌，我国已有用于检测鸡白痢的平板染色抗原产品，但灭活的全菌作为抗原在实际应用中受制备种子菌批次、生长状态和生产工艺等影响，可引起由于抗原成分不稳定而引起的非特异性反应，使得检测存在假阳性和假阴性，导致鸡白痢阳性鸡只淘汰不准确，给养殖者造成了严重的经济损失，因此亟需一种可以更准确高效鉴定鸡白痢沙门氏菌感染的检测方法。

常见感染鸡群的沙门氏菌包括了鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等多个血清型，其中鸡白痢沙门氏菌由于基因退化，导致其相比其它血清型沙门氏菌宿主单一。表面蛋白InvJ是沙门氏菌中高度保守的特异性蛋白之一。SopA为分泌蛋白，通过对多种血清型沙门氏菌的基因序列分析，我们发现sopA基因在沙门氏菌多种血清型中比较保守，但是特殊的是在所有鸡白痢沙门氏菌中，SopA基因中间有一个碱基发生突变，产生了终止密码子，导致鸡白痢沙门氏菌不能表达SopA蛋白C端，因此SopA蛋白C端可作为准确区分鸡白痢沙门氏菌与其它血清型沙门氏菌感染的负筛选诊断靶标。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒，通过沙门氏菌表面抗原InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂和分泌蛋白SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂的组合，用于鸡白痢抗体负筛选，重复性好，敏感性高。

本发明的另一个目的是在于提供了一种鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒的制备方法，优化了沙门氏菌表面蛋白InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂和沙门氏菌分泌蛋白SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法，所建立的制备方法偶联效率高，产品凝集效果好。

本发明还有一个目的是在于提供了一种鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒在检测鸡白痢沙门氏菌感染抗体中的应用，与现有的全血平板凝集检测方法相比，特异性强，重复性好，敏感性高。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种鸡白痢沙门氏菌抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒，它包括沙门氏菌表面抗原InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂和分泌蛋白SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂，所述的InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂是由水溶性碳二亚胺将原核表达和纯化后的沙门氏菌表面抗原InvJ重组蛋白共价偶联到羧化乳胶颗粒的表面而得，所述的SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂是由水溶性碳二亚胺将原核表达和纯化后沙门氏菌分泌蛋白SopA C端重组蛋白共价偶联到羧化乳胶颗粒的表面而得。

一种鸡白痢沙门氏菌抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒的制备方法：

1、沙门氏菌表面抗原InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法，其步骤是：

A、将1mL 10wt％的乳胶原液分别用碳酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液离心洗涤后，用0.625mL 0.01M磷酸缓冲盐溶液重悬羧化乳胶；

B、加入0.625mL 2wt％的水溶性碳二亚胺，37℃水平摇动3h，离心弃上清，用0.01M硼酸盐缓冲液洗涤沉淀后将羧化乳胶重悬至1wt％；

C、在上述羧化乳胶溶液中加入等体积0.1125mg/mL的重组InvJ/His-tag融合蛋白溶液进行偶联，37℃水平水平摇动6h；

D、偶联结束后用0.05mL 0.1M甘氨酸(用硼酸盐缓冲液配置)室温缓慢终止30min；离心，沉淀用1mL1wt％的BSA溶液封闭后，悬浮于0.5mL储存液(含0.01M磷酸盐缓冲液、5％甘油、0.01％牛血清白蛋白、0.1％叠氮钠)中保存，制得InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂。

2、沙门氏菌分泌蛋白SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法，其步骤是：

B、加入0.625mL 2wt％的水溶性碳二亚胺，37℃水平摇动3h，离心弃上清，用0.01M硼酸盐缓冲液洗涤沉淀后将羧化乳胶重悬1wt％；

C、在上述羧化乳胶溶液中加入等体积0.225mg/mL的重组SopA-C/His-tag融合蛋白溶液进行偶联，37℃水平水平摇动6h；

D、偶联结束后用0.05mL 0.1M甘氨酸(用硼酸盐缓冲液配置)室温缓慢终止30min；离心，沉淀用1mL1wt％的BSA溶液封闭后，悬浮于0.5mL储存液(含0.01M磷酸盐缓冲液、5％甘油、0.01％牛血清白蛋白、0.1％叠氮钠)中保存，制得SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂。

一种鸡白痢沙门氏菌抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒在检测鸡白痢沙门氏菌感染抗体中的应用，其方法是：

A、采样与检测：采集待检鸡群静脉血，分离血清；吸取2份10μL待检血清样品滴于载玻片上，分别加入等体积的InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂和SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂，搅拌均匀后摇动30秒，观察检测结果；阳性和阴性对照血清的处理方法与样品相同；

B、分别对InvJ蛋白乳胶凝集试验和SopA C端蛋白乳胶凝集试验进行判断：在阳性对照血清凝集程度为100％凝集(++++)，阴性对照血清无凝集现象时，对检测样品进行判断，检测样品出现50％凝集(++)及以上凝集时判为阳性结果，否则判为阴性，参照下表对检测结果进行判定：

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、本发明制备了沙门氏菌表面蛋白InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂，该致敏乳胶试剂可通过乳胶凝集试验对所有血清型沙门氏菌感染抗体进行快速检测，制备了沙门氏菌分泌蛋白SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂，该致敏乳胶试剂可通过乳胶凝集试验对鸡白痢沙门氏菌以外其它血清型沙门氏菌感染抗体进行快速检测，将2者组合并组装为鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒，可以用于鸡白痢抗体负筛选，为首创。

2、现有鸡白痢玻板凝集试验利用全菌灭活制备抗原，但灭活的全菌作为抗原在实际应用中受制备种子菌批次、生长状态和生产工艺等影响，可引起由于抗原成分不稳定而引起的非特异性反应，使得检测存在假阳性和假阴性检测。本试剂盒运用蛋白组合作为抗原，相比现有技术具有抗原稳定、特异性强的优点，而且可同时检测其它血清型沙门氏菌感染，摆脱了现有鸡白痢凝集抗原生产菌种传代可能导致的变异和不稳定性。

3、此外本发明对沙门氏菌表面蛋白InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂和沙门氏菌分泌蛋白SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法进行了探索和优化，敏感性高，可检测1：256倍稀释的血清。

附图说明

图1为InvJ基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA Marker，1、2为InvJ基因的扩增产物。

图2为重组载体pET-28a(+)-InvJ双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNAMarker，1、2为重组载体pET-28a(+)-InvJ经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切的产物。

图3为SopA C端基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA Marker，1、2为SopA C端基因的扩增产物。

图4为重组载体pET-32a(+)-SopA双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNAMarker，1、2为重组载体pET-32a(+)-SopA经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切的产物。

图5为表达的InvJ/His-tag重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图，其中M为蛋白分子量Marker，1为含空质粒pET-28a(+)的BL21(DE3)诱导后经超声破碎后收集的上清，2为含空质粒pET-28a(+)的BL21(DE3)诱导后经超声破碎后收集的沉淀，3为含重组质粒pET-28a(+)-InvJ的BL21(DE3)诱导后经超声破碎后收集的上清，4为含重组质粒pET-28a(+)-InvJ的BL21(DE3)诱导后经超声破碎后收集的沉淀。

图6为表达的SopA-C/His-tag重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图，其中M为蛋白分子量Marker，1为含空质粒pET-32a(+)的BL21(DE3)诱导后经超声破碎后收集的上清，2为含空质粒pET-32a(+)的BL21(DE3)诱导后经超声破碎后收集的沉淀，3为含重组质粒pET-32a(+)-SopA C端的BL21(DE3)诱导后经超声破碎后收集的上清，4为含重组质粒pET-32a(+)-SopA C端的BL21(DE3)诱导后经超声破碎后收集的沉淀。

图7为InvJ/His-tag重组蛋白乳胶凝集检测的结果判断示意图。

图8为SopA-C/His-tag重组蛋白乳胶凝集检测的结果判断示意图。

图9为鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒检测标准阳性血清(鸡白痢沙门氏菌阳性血清、肠炎沙门氏菌阳性血清和大肠杆菌病阳性血清)的结果图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1：

沙门氏菌表面蛋白InvJ与分泌蛋白SopA C端重组蛋白的制备方法

一、沙门氏菌表面蛋白InvJ重组蛋白的制备方法，其步骤是：

1、InvJ基因的克隆

肠炎沙门氏菌InvJ重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示(即登录号为：KOX81849.1的InvJ第1位至第336位氨基酸序列)，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示(即登录号为LIHI01000011.1的InvJ基因第1位至第1008位核苷酸序列)。

根据InvJ基因序列设计引物：上游引物InvJ F：5’-CGCGGATCCATGGGCGATGTGTCAGCTGT-3’，划线部分为BamHⅠ位点；下游引物InvJ R：5’-CCCAAGCTTGGCGTCATCCTCCTCGCA-3’，划线部分为Hind Ⅲ位点。

提取肠炎沙门氏菌(CVCC 3375，购自中国菌种保藏中心)的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，采用上述引物PCR扩增InvJ基因。PCR反应体系为：(primerSTAR 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH₂O 8.5μL，模板2μL)。将PCR产物进行1％浓度琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，获得了一条约1026bp的特异性DNA条带，与目标DNA片段大小相符。将PCR产物用OMGEA DNA凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

2、重组表达载体的构建

将回收纯化的InvJ基因片段和质粒pET-28a(+)(购自优宝生物)同时用BamH Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切，切胶回收后，将双酶切的基因片段和质粒用T₄连接酶进行连接，将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆。以InvJ F和InvJ R为引物，菌液PCR验证成功后，提取质粒，进行BamH Ⅰ/HindⅢ双酶切鉴定，结果如图2所示，质粒双酶切后得到两条DNA片段，其中一条DNA片段与1026bp的目的DNA片段大小相符。将酶切鉴定正确的重组质粒pET-28a(+)-InvJ送上海生工生物有限公司进行测序，测序结果显示，重组质粒中含有目的基因InvJ，且读码框正确，说明重组表达载体pET-28a(+)-InvJ构建成功。

3、重组蛋白的表达

将空载体pET-28a(+)和重组表达载体pET-28a(+)-InvJ转化至表达宿主菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞(购自Takara公司)，筛选阳性克隆。将单菌落接种于含Kan(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日取菌液按体积比1:100转接种于5mL含Kan(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.4时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷终浓度为1mM)诱导培养，诱导4小时后收集菌液，4℃、13000r/min离心5min，取上清，菌体沉淀用1mL的0.01M PBS缓冲液重悬，超声波(冰浴)间歇破碎菌体，4℃、10000r/min离心10min，取上清备用；沉淀用500μL 0.01M PBS缓冲液溶解。

4、SDS-PAGE鉴定重组蛋白

取上述处理好的上清和溶解的沉淀，加入5×SDS上样缓冲液，煮沸5min，冰浴2min，进行SDS-PAGE凝胶电泳(浓缩胶5％，分离胶10％)，电泳后经考马斯亮蓝染色，乙醇-冰醋酸脱色液脱色。结果如图5所示，空载体pET-28a(+)转化菌株BL21用IPTG诱导时没有特异性蛋白条带出现；而pET-28a(+)-InvJ转化菌株BL21用IPTG诱导后在约40kDa处出现一条特异性蛋白条带，与重组InvJ/His-tag融合蛋白大小相符，而且结果显示，重组InvJ/His-tag融合蛋白同时存在于经超声破碎后收集的上清和沉淀中。

5、重组InvJ/His-tag融合蛋白的纯化

收集经IPTG诱导表达后的菌液，离心集菌。将收集的菌液经超声波处理，12000rpm离心10min，收集沉淀并用0.01M PBS洗涤菌体，然后用1×Binding Buffer重悬菌体，将菌液过0.45μm滤器，按照Merck Millipore公司His*Bind Purification Kit说明书填柱材料，用3倍体积双蒸水洗涤后用3倍体积的结合缓冲液平衡，之后以一定的流速将含有目的蛋白的缓冲液上样。没有结合的蛋白用洗涤缓冲液除去，最后用洗脱缓冲液洗脱，获得纯化的重组InvJ/His-tag融合蛋白。

二、沙门氏菌SopA C端重组蛋白的制备

肠炎沙门氏菌SopA C端重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示(即登录号为AHW01691.1的SopA第448位至第782位氨基酸序列)，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示(即登录号为CP007507.1的SopA基因第1342位至第2432位核苷酸序列)。

1、SopA C端基因的克隆

根据SopA C端基因序列设计引物，上游引物SopA F：5’-CGCGGATCCCGCATACTGCCTGTGTTGCTGGA-3’，划线部分为BamH Ⅰ位点；下游引物SopA R：5’-CCCAAGCTTCAAAAAATGCATGGACTAAAACGGG-3’，划线部分为Hind Ⅲ位点。

提取肠炎沙门氏菌(CVCC 3375，购自中国菌种保藏中心)基因组DNA，以该基因组DNA为模板，采用上述引物PCR扩增SopA基因。PCR反应体系为：(primerSTAR 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH₂O 8.5μL，模板2μL)将PCR产物进行1％浓度琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图3所示，获得了一条约1109bp的特异性DNA条带，与目标DNA片段大小相符。将PCR产物用OMGEA DNA凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

2、重组表达载体的构建

将回收纯化的SopA基因片段和质粒pET-32a(+)(购自优宝生物)同时用BamH Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切，切胶回收后，将双酶切的基因片段和质粒用T₄连接酶进行连接，将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆。以SopA F和SopA R为引物，菌液PCR验证成功后，提取质粒，进行BamH Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切鉴定，结果如图4所示，质粒双酶切后得到两条DNA片段，其中一条DNA片段与1091bp的目的DNA片段大小相符。将酶切鉴定正确的重组质粒pET-32a(+)-SopA送上海生工生物有限公司进行测序，测序结果显示，重组质粒中含有目的基因InvJ，且读码框正确，说明重组表达载体pET-32a(+)-SopA构建成功。

3、重组蛋白的表达

将空载体pET-32a(+)和重组表达载体pET-32a(+)-SopA转化至表达宿主菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆。将单菌落接种于含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日取菌液按体积比1:100转接种于5mL含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.4时，加入IPTG(终浓度为1mM)诱导培养，诱导8小时后收集菌液，4℃、13000r/min离心5min，取上清，菌体沉淀用1mL的0.01M PBS缓冲液重悬，超声波(冰浴)间歇破碎菌体，4℃、10000r/min离心10min，取上清备用；沉淀用500μL 0.01MPBS缓冲液溶解。

4、SDS-PAGE鉴定重组蛋白

取上述处理好的上清和溶解的沉淀，加入5×SDS上样缓冲液，煮沸5min，冰浴2min，进行SDS-PAGE凝胶电泳(浓缩胶5％，分离胶10％)，电泳后经考马斯亮蓝染色，乙醇-冰醋酸脱色液脱色。结果如图6所示，空载体pET-32a(+)转化菌株BL21用IPTG诱导时没有特异性蛋白条带出现；pET-32a(+)-SopA转化BL21(DE3)未用IPTG诱导后也没有特异性蛋白条带出现，而pET-32a(+)-SopA转化菌株BL21用IPTG诱导后在约55kDa处出现一条特异性蛋白条带，与重组SopA/His-tag融合蛋白大小相符，此外，由于重组SopA/His-tag融合蛋白主要存在于经超声破碎后收集的沉淀中，说明重组SopA/His-tag融合蛋白在菌体中是以不溶的包涵体形式存在。

5、重组SopA(C)/His-tag融合蛋白的纯化

收集诱导表达后的菌液，离心集菌。将收集的菌液经超声波处理，12000rpm离心10min，收集包涵体。将包涵体用洗涤缓冲液(20mM Tris，1mM EDTA，1％Triton-100，pH8.5)洗涤后溶解于变性缓冲液(8M尿素)中，搅拌过夜，离心收集变性后的包涵体。将溶解后的包涵体溶液过0.45μm滤器，按照Merck Millipore公司His*Bind Purification Kit说明书填柱材料，用3倍体积双蒸水洗涤后用3倍体积的结合缓冲液平衡，之后以一定的流速将含有目的蛋白的缓冲液上样。没有结合的蛋白用洗涤缓冲液除去，最后用洗脱缓冲液洗脱，获得目的蛋白。将纯化后的变性蛋白装入透析袋中依次浸没在6M尿素缓冲液、4M尿素缓冲液、2M尿素缓冲液、0.01M PBS缓冲液中透析12h中进行复性。重新折叠后的蛋白在Tris-HCl缓冲液中以12000rpm离心15min，去除不溶蛋白，获得重组SopA(C)/His-tag融合蛋白。

实施例2：

沙门氏菌表面蛋白InvJ与分泌蛋白SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法优化

沙门氏菌表面蛋白InvJ与分泌蛋白SopA C端重组蛋白分别作为抗原制备致敏乳胶试剂，再通过乳胶凝集试验负筛选检测鸡白痢抗体。

1、乳胶凝集试验方法及结果判定

在洁净的载玻片上滴约10μL待检样品溶液，再加约10μL致敏乳胶试剂，搅拌混匀，摇动玻片，3分钟内在黑色背景下观察，同时设置阳性对照和阴性对照。++++为100％乳胶凝集，全部凝集，成絮状团块，液体清亮；+++为75％乳胶凝集成小的颗粒，液体稍有混浊；++为50％乳胶凝集成较细颗粒，液体较混浊；+为少许乳胶凝集成颗粒，液体混浊；－为不凝集，液滴呈原有的均匀乳状；以出现++以上者判为阳性。

图7、图8分别显示了InvJ乳胶凝集检测和SopA C端乳胶凝集检测的结果判断示意图

2、沙门氏菌表面蛋白InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法优化

取1mL 10wt％乳胶原液于离心管中，用1mL 0.1M的碳酸盐缓冲液(pH9.6)离心洗涤3次，再用1mL 0.01M PBS(pH 7.4)离心洗涤3次，用0.625mL 0.01M PBS(pH7.4)重悬，逐滴加入0.625mL 2wt％EDC(水溶性碳二亚胺)，37℃低速水平摇动3h后，离心弃上清，沉淀用1mL 0.01M BBS(pH8.0)离心洗涤3次后重悬至不同浓度，再加入不同浓度的重组InvJ/His-tag融合蛋白溶液，37℃低速水平摇动不同时间后，加入0.05mL 0.1M甘氨终止反应，离心收集上清进行蛋白测定，沉淀用1mL不同浓度的BSA溶液封闭后，悬浮于0.5mL储存液(含0.01M磷酸盐缓冲液、5％甘油、0.01％牛血清白蛋白、0.1％叠氮钠)中保存，制备完成重组InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂。

(1)羧化乳胶最佳偶联浓度的选择

将羧化乳胶用BBS重悬至不同浓度(3wt％、2wt％、1wt％、0.5wt％、0.1wt％)后与重组InvJ/His-tag融合蛋白偶联，制备致敏乳胶试剂。再以该致敏乳胶试剂与鸡白痢阳性血清进行乳胶凝集试验，通过测定偶联效率和凝集效果确定羧化乳胶的最佳偶联浓度。结果显示，当羧化乳胶浓度为1％时，偶联效率最高，凝集效果最好。

表1 羧化乳胶最佳偶联浓度的选择

备注：—乳胶不凝集；+25％乳胶凝集；++50％乳胶凝集；+++75％乳胶凝集；++++全部乳胶凝集

(2)沙门氏菌表面蛋白InvJ重组蛋白最佳偶联浓度的选择

将羧化乳胶与不同浓度(0.9、0.45、0.225、0.1125、0.05625、0.028mg/mL)的重组InvJ/His-tag融合蛋白偶联，制备致敏乳胶试剂，再以该致敏乳胶试剂与鸡白痢阳性血清进行乳胶凝集试验，通过测定偶联效率(偶联效率(％)＝(蛋白的初始加入量－剩余上清液中的蛋白量)/蛋白初始加入量×100％)和凝集效果选择重组蛋白最佳偶联浓度。结果显示，当沙门氏菌表面蛋白InvJ重组蛋白浓度为0.1125mg/mL时，与羧化乳胶的偶联效率较高，凝集效果最好。

表2 表面蛋白InvJ重组蛋白最佳偶联浓度的选择

(3)封闭液最佳浓度的选择

将偶联反应终止后离心得到的沉淀用不同浓度(0wt％、0.01wt％、0.1wt％、1wt％)的BSA溶液封闭，制备致敏乳胶试剂，再以该致敏乳胶试剂与鸡白痢阳性血清进行乳胶凝集试验，通过观察凝集效果选择封闭液最佳浓度。结果显示，当BSA溶液的浓度为1wt％时，凝集效果最好。

表3 封闭液最佳浓度的选择

(4)最佳偶联时间的选择

将羧化乳胶用BBS重悬，加入重组InvJ/His-tag融合蛋白溶液，置水平摇床37℃低速水平摇动不同时间(2h、4h、6h、8h、10h)，制备致敏乳胶试剂，再以该致敏乳胶试剂与鸡白痢阳性血清进行乳胶凝集试验，通过测定偶联效率和凝集效果选择最佳偶联时间。结果显示，当偶联时间为6h时，偶联效率较高，凝集效果最好。

表4 最佳偶联时间的选择

3、沙门氏菌表面蛋白InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂的质量鉴定

(1)自凝性

将采用前述最佳条件制备的重组InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂，分别与PBS、BBS、生理盐水进行乳胶凝集试验，观察致敏乳胶试剂是否发生自凝。结果显示，重组InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂与PBS、BBS、生理盐水反应均呈阴性，即不发生自凝。

(2)特异性

将重组InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂分别与10种阳性血清(鸡白痢沙门氏菌阳性血清、肠炎沙门氏菌阳性血清、禽伤寒沙门氏菌阳性血清、鼠伤寒沙门氏菌阳性血清、禽大肠杆菌病阳性血清、禽弯曲菌病阳性血清、禽巴氏杆菌病阳性血清、禽坏死性肠炎阳性血清、禽流感阳性血清、新城疫阳性血清)进行乳胶凝集试验。结果显示，重组InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂与鸡白痢沙门氏菌阳性血清、肠炎沙门氏菌阳性血清、禽伤寒沙门氏菌阳性血清、鼠伤寒沙门氏菌阳性血清均产生明显的凝集，而与禽大肠杆菌病阳性血清、禽弯曲菌病阳性血清、禽巴氏杆菌病阳性血清、禽坏死性肠炎阳性血清、禽流感阳性血清、新城疫阳性血清均不发生凝集，说明重组InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂具有良好的特异性。

(3)重复性

将同一批次的重组InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂保存于4℃，每月与鸡白痢阳性血清进行乳胶凝集试验，考察批内重复性；将不同批次的重InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂，分别与鸡白痢沙门氏菌感染阳性血清进行乳胶凝集试验，考察批间重复性。结果显示，同一批次制备的重组InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂在4个月内均与鸡白痢阳性血清保持很好的凝集；5批制备的重组InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂与与鸡白痢阳性血清也均产生明显的凝集；说明重组InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂具有较好的重复性。

(4)敏感性

将鸡白痢阳性血清按1:2、1:4、1:8、1:16、l:64、1:128、1:256、1:512体积倍比稀释，再与重组InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂进行乳胶凝集试验，考察敏感性。结果显示最低可检测到稀释倍数为1:256的鸡白痢阳性血清，说明重组InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂具有较好的敏感性。

4、沙门氏菌分泌蛋白SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法优化

取1mL 10wt％乳胶原液于离心管中，用1mL 0.1M的碳酸盐缓冲液(pH9.6)离心洗涤3次，再用1mL 0.01M PBS(pH 7.4)离心洗涤3次，用0.625mL 0.01M PBS(pH7.4)重悬，逐滴加入0.625mL 2wt％EDC(水溶性碳二亚胺)，37℃低速水平摇动3h后，离心弃上清，沉淀用1mL 0.01M BBS(pH8.0)离心洗涤3次后重悬至不同浓度，再加入不同浓度的重组InvJ/His-tag融合蛋白溶液，37℃低速水平摇动不同时间后，加入0.05mL 0.1M甘氨终止反应，离心收集上清进行蛋白测定，沉淀用1mL不同浓度的BSA溶液封闭后，悬浮于0.5mL储存液(含0.01M磷酸盐缓冲液、5％甘油、0.01％牛血清白蛋白、0.1％叠氮钠)中保存，制备完成重组SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂。

(1)羧化乳胶最佳偶联浓度的选择

将羧化乳胶用BBS重悬至不同浓度(3wt％、2wt％、1wt％、0.5wt％、0.1wt％)后与重组SopA-C/His-tag融合蛋白偶联，制备致敏乳胶试剂。再以该致敏乳胶试剂与鸡白痢阳性血清进行乳胶凝集试验，通过测定偶联效率和凝集效果确定羧化乳胶的最佳偶联浓度。结果显示，当羧化乳胶浓度为1％时，偶联效率最高，凝集效果最好。

(2)沙门氏菌分泌蛋白SopA C端重组蛋白最佳偶联浓度的选择

将羧化乳胶与不同浓度(0.9、0.45、0.225、0.1125、0.05625、0.028mg/mL)的重组SopA-C/His-tag融合蛋白偶联，制备致敏乳胶试剂，再以该致敏乳胶试剂与肠炎沙门氏菌阳性血清进行乳胶凝集试验，通过测定偶联效率和凝集效果选择重组蛋白最佳偶联浓度。结果显示，当蛋白浓度为0.225mg/mL时，与羧化乳胶的偶联效率较高，凝集效果最好。

表5 SopA C端重组蛋白最佳偶联浓度的选择

(3)封闭液最佳浓度的选择

将偶联反应终止后离心得到的沉淀用不同浓度(0wt％、0.01wt％、0.1wt％、1wt％)的BSA溶液封闭，制备致敏乳胶试剂，再以该致敏乳胶试剂与肠炎沙门氏菌阳性血清进行乳胶凝集试验，通过观察凝集效果选择封闭液最佳浓度。结果显示，当BSA溶液的浓度为1wt％时，凝集效果最好。

表6 封闭液最佳浓度的选择

(4)最佳偶联时间的选择

将羧化乳胶用BBS重悬，加入重组SopA-C/His-tag融合蛋白溶液，置水平摇床37℃低速水平摇动不同时间(2h、4h、6h、8h、10h)，制备致敏乳胶试剂，再以该致敏乳胶试剂与肠炎沙门氏菌阳性血清进行乳胶凝集试验，通过测定偶联效率和凝集效果选择最佳偶联时间。结果显示，当偶联时间为6h时，偶联效率较高，凝集效果最好。

表7 最佳偶联时间的选择

5、沙门氏菌表面蛋白SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂的质量鉴定

(1)自凝性

将采用前述最佳条件制备的重组SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂，分别与PBS、BBS、生理盐水进行乳胶凝集试验，观察致敏乳胶试剂是否发生自凝。结果显示，重组SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂与PBS、BBS、生理盐水反应均呈阴性，即不发生自凝。

(2)特异性

将重组SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂分别与10种阳性血清(鸡白痢沙门氏菌感染阳性血清、肠炎沙门氏菌感染阳性血清、禽伤寒沙门氏菌感染阳性血清、鼠伤寒沙门氏菌感染阳性血清、禽大肠杆菌病阳性血清、禽弯曲菌病阳性血清、禽巴氏杆菌病阳性血清、禽坏死性肠炎阳性血清、禽流感阳性血清、新城疫阳性血清)进行乳胶凝集试验。结果显示，重组SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂与肠炎沙门氏菌阳性血清、禽伤寒沙门氏菌阳性血清、鼠伤寒沙门氏菌阳性血清均产生明显的凝集，而与鸡白痢沙门氏菌阳性血清、禽大肠杆菌病阳性血清、禽弯曲菌病阳性血清、禽巴氏杆菌病阳性血清、禽坏死性肠炎阳性血清、禽流感阳性血清、新城疫阳性血清均不发生凝集，说明重组SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂具有良好的特异性，而且可以区分鸡白痢沙门氏菌阳性血清与其它血清学型沙门氏菌阳性血清。

(3)重复性

将同一批次的重组SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂保存于4℃，每月与肠炎沙门氏菌阳性血清进行乳胶凝集试验，考察批内重复性；将不同批次的重SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂，分别与肠炎沙门氏菌阳性血清进行乳胶凝集试验，考察批间重复性。结果显示，同一批次制备的重组SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂在4个月内均与肠炎沙门氏菌阳性血清保持很好的凝集；5批制备的重组SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂与与肠炎沙门氏菌阳性血清也均产生明显的凝集；说明重组SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂具有较好的重复性。

(4)敏感性

将肠炎沙门氏菌阳性血清按1:2、1:4、1:8、1:16、l:64、1:128、1:256、1:512体积倍比稀释，再与重组SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂进行乳胶凝集试验，考察敏感性。结果显示最低可检测到稀释倍数为1:256的肠炎沙门氏菌阳性血清，说明重组SopA-C/His-tagg融合蛋白致敏乳胶试剂具有较好的敏感性。

实施例3：

鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒的应用

1、鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒的应用方法

(1)采样与检测

采集待检鸡群静脉血，分离血清；吸取2份10μL待检血清样品滴于载玻片上，分别加入等体积的InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂和SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂，搅拌均匀后摇动30秒，观察检测结果。阳性和阴性对照血清的处理方法与样品相同。

(2)结果判定

分别对InvJ蛋白乳胶凝集试验和SopA C端蛋白乳胶凝集试验进行判断；在阳性对照血清凝集程度为100％凝集(++++)，阴性对照血清无凝集现象时，对检测样品进行判断。检测样品出现50％凝集(++)及以上凝集时判为阳性结果，否则判为阴性。

分别获得InvJ蛋白乳胶凝集试验和SopA C端蛋白乳胶凝集试验结果后，参考表8对检测结果进行判定。

表8 鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒的结果判定

注：对于重新检测仍然为InvJ蛋白乳胶凝集试验阴性，SopA C端蛋白乳胶凝集试验阳性的样本，判断为阴性。

2、鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒检测标准阳性血清

用上述检测方法分别检测鸡白痢沙门氏菌阳性血清、肠炎沙门氏菌阳性血清、大肠杆菌病阳性血清，检测结果如图9所示：鸡白痢沙门氏菌阳性血清与InvJ的反应为阳性，与SopA C端的反应为阴性；肠炎沙门氏菌阳性血清与InvJ的反应为阳性，与SopA C端的反应也为阳性；大肠杆菌病阳性血清与InvJ和SopA C端的反应均为阴性。检测结果与预期一致。

3、鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒在临床检测中的应用

(1)临床样品

2016年6月从湖北某家禽养殖场采集种鸡血样50份，血液自然凝固后，收集析出的血清。

(2)样品检测

每个样品吸取2份10μL待检血清样品分别滴于载玻片上，分别加入等体积的InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂和SopA C端蛋白致敏乳胶试剂，搅拌均匀后摇动30秒，观察检测结果。同时设阴阳性血清对照。

(3)检测结果

经检测，4份血清的检测结果为鸡白痢抗体阳性，经过细菌分离鉴定显示这4只鸡确实存在鸡白痢沙门氏菌感染，需要立即进行淘汰处理。

实施例4：

鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选试验与全血平板凝集试验的效果比对

用鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选试验与以灭活全菌作为抗原的全血平板凝集试验同时检测10份鸡白痢沙门氏菌阳性血清，10份肠炎沙门氏菌阳性血清和10份阴性血清。鸡白痢抗体负筛选乳胶凝集试剂盒检测10份鸡白痢阳性血清，与InvJ的反应均为阳性，与SopA C端的反应均为阴性，显示10份血清均为鸡白痢抗体阳性；检测10份肠炎沙门氏菌阳性血清，与InvJ和SopA C端的反应均为阳性，显示10份血清均为沙门氏菌抗体阳性；检测10份阴性血清均为阴性，检测结果与血清的免疫背景完全相符；全血平板凝集试验法检测10份鸡白痢阳性血清全为阳性，检测10份肠炎沙门氏菌阳性血清，出现2份血清呈现鸡白痢抗体阳性，阴性血清均为阴性。这说明该鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测方法与现有以鸡白痢沙门氏菌全菌制备抗原的全血平板凝集试验相比，可更好的避免不同血清型沙门氏菌之间的交叉反应，具有更高的特异性。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒及制备方法和应用

<130> 鸡白痢抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒及制备方法和应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 336

<212> PRT

<213> 肠炎沙门氏菌

<400> 1

Met Gly Asp Val Ser Ala Val Ser Ser Ser Gly Asn Ile Leu Leu Pro

1 5 10 15

Gln Gln Asp Glu Val Gly Gly Leu Ser Glu Ala Leu Lys Lys Ala Val

20 25 30

Glu Lys His Lys Thr Glu Tyr Ser Gly Asp Lys Lys Asp Arg Asp Tyr

35 40 45

Gly Asp Ala Phe Val Met His Lys Glu Thr Ala Leu Pro Val Leu Leu

50 55 60

Ala Ala Trp Arg His Gly Ala Pro Ala Lys Ser Glu His His Asn Gly

65 70 75 80

Asn Val Ser Gly Leu His His Asn Gly Lys Gly Glu Leu Arg Ile Ala

85 90 95

Glu Lys Leu Leu Lys Val Thr Ala Glu Lys Ser Val Gly Leu Ile Ser

100 105 110

Ala Glu Ala Lys Val Asp Lys Ser Ala Ala Leu Leu Ser Ser Lys Asn

115 120 125

Arg Pro Leu Glu Ser Val Ser Gly Lys Lys Leu Ser Ala Asp Leu Lys

130 135 140

Ala Val Glu Ser Val Ser Glu Val Ala Asp Asn Ala Thr Gly Ile Ser

145 150 155 160

Asp Asp Asn Ile Lys Ala Leu Pro Gly Asp Asn Lys Ala Ile Ala Gly

165 170 175

Glu Gly Val Arg Lys Glu Gly Ala Pro Leu Ala Arg Asp Val Ala Pro

180 185 190

Ala Arg Met Ala Ala Ala Asn Thr Gly Lys Pro Asp Asp Lys Asp His

195 200 205

Lys Lys Val Lys Asp Val Ser Gln Leu Pro Leu Gln Pro Thr Thr Ile

210 215 220

Ala Asp Leu Ser Gln Leu Thr Gly Gly Asp Glu Lys Met Pro Leu Ala

225 230 235 240

Ala Gln Ser Lys Pro Met Met Thr Ile Phe Pro Thr Ala Asp Gly Val

245 250 255

Lys Gly Glu Asp Ser Ser Leu Thr Tyr Arg Phe Gln Arg Trp Gly Asn

260 265 270

Asp Tyr Ser Val Asn Ile Gln Ala Arg Gln Ala Gly Glu Phe Ser Leu

275 280 285

Ile Pro Ser Asn Thr Gln Val Glu His Arg Leu His Asp Gln Trp Gln

290 295 300

Asn Gly Asn Pro Gln Arg Trp His Leu Thr Arg Asp Asp Gln Gln Asn

305 310 315 320

Pro Gln Gln Gln Gln His Arg Gln Gln Ser Gly Glu Glu Asp Asp Ala

325 330 335

<210> 2

<211> 335

<212> PRT

<213> 肠炎沙门氏菌

<400> 2

Arg Ile Leu Pro Val Leu Leu Asp Ser Phe Asp Arg Asn Ser Ala Ala

1 5 10 15

Met Thr Thr His Ser Gly Leu Phe Asn Gln Val Ile Leu His Cys Met

20 25 30

Thr Gly Val Asp Cys Thr Asp Gly Thr Arg Gln Lys Ala Ala Ala Leu

35 40 45

Tyr Glu Gln Tyr Leu Ala His Pro Ala Val Ser Pro His Ile His Asn

50 55 60

Gly Leu Phe Gly Asn Tyr Asp Gly Ser Pro Asp Trp Thr Thr Arg Ala

65 70 75 80

Ala Asp Asn Phe Leu Leu Leu Ser Ser Gln Asp Ser Asp Thr Ala Met

85 90 95

Met Leu Ser Thr Asp Thr Leu Leu Thr Met Leu Asn Pro Thr Pro Asp

100 105 110

Thr Ala Trp Asp Asn Phe Tyr Leu Leu Arg Ala Gly Glu Asn Val Ser

115 120 125

Thr Ala Gln Ile Ser Pro Val Glu Leu Phe Arg His Asp Phe Pro Val

130 135 140

Phe Leu Ala Ala Phe Asn Gln Gln Ala Thr Gln Arg Arg Phe Gly Glu

145 150 155 160

Leu Ile Asp Ile Ile Leu Ser Thr Glu Glu His Gly Glu Leu Asn Gln

165 170 175

Gln Phe Ile Ala Ala Thr Asn Gln Lys His Ser Thr Val Lys Leu Ile

180 185 190

Asp Asp Ala Ser Val Ser Arg Leu Ala Thr Ile Phe Ala Pro Leu Leu

195 200 205

Pro Glu Gly Lys Leu Ser Pro Ala His Tyr Gln His Ile Leu Ser Ala

210 215 220

Tyr His Leu Thr Asp Ala Thr Pro Gln Lys Gln Ala Glu Thr Leu Phe

225 230 235 240

Cys Leu Ser Thr Ala Phe Ala Arg Tyr Ser Ser Ser Ala Ile Phe Gly

245 250 255

Thr Glu His Asp Ser Pro Pro Ala Leu Arg Gly Tyr Ala Glu Ala Leu

260 265 270

Met Gln Lys Ala Trp Glu Leu Ser Pro Ala Ile Phe Pro Ser Ser Glu

275 280 285

Gln Phe Thr Asp Trp Ser Asp Arg Phe His Gly Leu His Gly Ala Phe

290 295 300

Thr Cys Thr Ser Val Val Ala Asp Ser Met Gln Arg His Ala Arg Lys

305 310 315 320

Tyr Phe Pro Ser Val Leu Ser Ser Ile Leu Pro Leu Ala Trp Ala

325 330 335

<210> 3

<211> 1026

<212> DNA

<213> 肠炎沙门氏菌

<400> 3

cgcggatcca tgggcgatgt gtcagctgtc agttcatccg ggaacatttt actgccgcag 60

caggatgagg ttggcggttt atcagaagca ttaaaaaaag cggtggaaaa acataagaca 120

gaatattccg gtgataaaaa agatcgcgac tatggcgatg ctttcgtaat gcataaagaa 180

acggctttac cggtattact ggcggcatgg cgacatggcg cgccagcgaa atcagaacat 240

cacaatggca acgtttctgg tctgcatcat aacggaaaag gcgaactcag gattgctgaa 300

aaactgttga aagtcactgc tgaaaaatct gtcggtttga tttctgcgga ggccaaagta 360

gataaatccg cagcgttgct atcgtctaaa aataggccgt tagaaagcgt aagcggtaaa 420

aaattatctg ctgatttaaa agccgtggag tccgttagtg aagtagccga taacgccacg 480

ggaatctctg acgataatat caaggcattg cctggggata ataaagccat cgcgggcgaa 540

ggcgttcgta aagagggcgc gccgctggcg cgggatgtcg cacctgcccg aatggccgca 600

gccaataccg gtaagcctga cgataaagat cataaaaagg ttaaagatgt ttctcagctt 660

ccgctgcaac caaccactat cgccgatctt agccaattaa ccggcggcga tgaaaaaatg 720

cctttagcgg cgcaatcaaa gccgatgatg actatttttc cgactgccga tggcgtgaaa 780

ggagaggata gctcgctgac ttaccgtttt cagcgctggg gaaatgacta ttccgtcaat 840

attcaggcgc ggcaagcagg ggagttttcg ttaataccgt caaatacgca ggttgaacat 900

cgtttgcatg atcaatggca aaacggtaat ccccagcgct ggcacctgac gcgagacgat 960

caacaaaatc cgcagcagca acagcacaga cagcaatctg gcgaggagga tgacgccaag 1020

cttccc 1026

<210> 4

<211> 1109

<212> DNA

<213> 肠炎沙门氏菌

<400> 4

cgcggatccc gcatactgcc tgtgttgctg gattcgtttg acaggaacag cgccgccatg 60

accactcaca gcggactctt taatcaggtg attttacact gtatgacagg cgtggactgc 120

actgatggca cccgccagaa agctgcagcg ctttatgaac agtatcttgc tcacccggcg 180

gtgtctcccc acatccataa tgggctcttc ggcaattatg acggcagccc ggactggaca 240

acccgcgctg cagataattt cctgctgctt tcctcccaag attcagacac ggcgatgatg 300

ctctccactg acacgctgtt aacaatgcta aaccctactc ctgacactgc atgggacaac 360

ttttacctgc tgcgagccgg agagaacgtt tccaccgcgc aaatctctcc ggtagagtta 420

ttccgtcatg actttccggt gtttctcgcc gcatttaatc agcaggccac gcagcgacgc 480

tttggggagc tgattgatat catcctcagc actgaagagc acggggagct gaaccagcag 540

tttattgccg ccacgaacca gaaacattcc accgtgaagt tgattgatga tgcctcagtg 600

tcgcgtctgg ccaccatttt tgcccccttg cttcctgaag gcaaactcag cccggcacac 660

taccagcaca tcctcagtgc ttatcacctg acggacgcca ccccacagaa gcaggcggaa 720

accctgttct gtctcagtac cgcattcgca cgctattcct ccagcgccat tttcggcact 780

gagcatgact ctccgccggc cctgagaggc tatgcggagg cgctgatgca gaaagcctgg 840

gagctgtctc cggcgatctt cccgtccagc gaacagttta ccgactggtc cgaccgtttt 900

cacggcctcc atggcgcctt tacctgtacc agcgttgtgg cggatagtat gcaacgtcat 960

gccagaaaat atttcccgag tgttctgtca tccatcctgc cactggcctg ggcctagtcc 1020

agcctcaacc cgcatgaaat taagggacac agcgttgtgt ccctctgtac atagacccgt 1080

tttagtccat gcattttttg aagcttccc 1109

Claims

1.一种鸡白痢沙门氏菌抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒，其特征在于，包括沙门氏菌表面抗原InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂和分泌蛋白SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂，所述的InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂是由水溶性碳二亚胺将原核表达和纯化后的沙门氏菌表面抗原InvJ重组蛋白共价偶联到羧化乳胶颗粒的表面而得，所述的SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂是由水溶性碳二亚胺将原核表达和纯化后的沙门氏菌分泌蛋白SopA C端重组蛋白共价偶联到羧化乳胶颗粒的表面而得。

2.根据权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒，其特征在于，所述的沙门氏菌表面抗原InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂由下述方法制成：

A、将1 mL 10 wt%的乳胶原液分别用碳酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液离心洗涤后，用0.625mL 0.01M磷酸缓冲盐溶液重悬羧化乳胶；

B、加入0.625 mL 2 wt %的水溶性碳二亚胺，37℃水平摇动3 h，离心弃上清，用0.01M硼酸盐缓冲液洗涤沉淀后将羧化乳胶重悬至1 wt%；

C、在步骤B所述的羧化乳胶溶液中加入等体积 0.1125mg/mL的重组InvJ/His-tag融合蛋白溶液进行偶联，37℃水平摇动6 h；

D、偶联结束后用 0.1M 甘氨酸0.05 mL室温缓慢终止30 min；离心，沉淀用1 mL1 wt %的BSA溶液封闭后，悬浮于0.5 mL储存液中保存，所述的储存液含0.01M磷酸盐缓冲液、5wt%甘油、0.01 wt%牛血清白蛋白、0.1 wt%叠氮钠，制得InvJ重组蛋白致敏乳胶试剂。

3.根据权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒，其特征在于，所述的沙门氏菌分泌蛋白SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂由下述方法制成：

（1）将1 mL 10 wt %的乳胶原液分别用碳酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液离心洗涤后，用0.625mL 0.01M磷酸缓冲盐溶液重悬羧化乳胶；

（2）加入0.625 mL 2 wt %的水溶性碳二亚胺，37℃水平摇动3 h，离心弃上清，用0.01M硼酸盐缓冲液洗涤沉淀后将羧化乳胶重悬至1 wt%；

（3）在步骤（2）所述的羧化乳胶溶液中加入等体积的0.225mg/mL的重组SopA-C/His-tag融合蛋白溶液进行偶联，37℃水平水平摇动6 h；

（4）偶联结束后用0.05 mL 0.1M 甘氨酸室温缓慢终止30 min；离心，沉淀用1 mL1 wt%的BSA溶液封闭后，悬浮于0.5 mL储存液中保存，所述的储存液含0.01M磷酸盐缓冲液、5wt%甘油、0.01 wt%牛血清白蛋白、0.1 wt%叠氮钠，制得SopA C端重组蛋白致敏乳胶试剂。

4.权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌抗体乳胶凝集负筛选检测试剂盒在检测鸡白痢沙门氏菌感染抗体中的应用。