CN103197078A - 鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的用途，它能够作为沙门菌感染宿主时的诊断生物学标志物，用于制备鸡白痢免疫检测用材料或诊断用材料。本发明进一步利用该蛋白建立了检测宿主体内产生的SpiC抗体的鸡白痢ELISA检测用材料，并给出了对应的鸡白痢ELISA检测方法。基于该蛋白建立了检测宿主体内产生的SpiC抗体ELISA方法特异性好，灵敏度高，可作机体免疫状态的评价及感染性疾病诊断相关的研究。

Description

鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及鸡白痢沙门菌分泌性蛋白质SpiC的用途。

背景技术

鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌引起的传染性疾病，世界各地均有发生，是危害养鸡业最严重的疾病之一。其排泄物是重要的传播媒介，同时也可通过鸡蛋垂直传播。患有鸡白痢的雏鸡表现不吃饲料，怕冷，身体蜷缩，翅膀下垂，精神沉郁或昏睡，排白色粘稠或淡黄、淡绿色稀便，肛门有时被硬结的粪块封闭，呼吸困难。成年鸡无临床症状，少数感染严重的病鸡表现精神萎靡，排黄绿色或蛋清样稀便，主要病变可见肝脏、脾脏肿大、脆弱，有坏死点，肾脏暗红充血或苍白贫血，常出现腹膜炎变化。产蛋鸡可见卵巢萎缩，卵子变性，病鸡产蛋停止。

玻板凝集实验在畜牧兽医诊断鸡白痢沙门氏菌的相关工作中有着广泛的应用，鉴于实验室诊断与临床病理变化，对鸡白痢沙门氏菌感染情况的做出相应的判断。但是相对准确性，特异性，精密性等方面，玻板凝集实验不能达到预期的效果，不能完全的达到良好的诊断目的。

应用不同的单抗标记物和检测技术，已经开发出多种方法，如反向被动血凝试验（RPH），酶免疫分析法（EIA），酶联免疫吸附法（ELISA），酶联免疫斑点法（ELISPOT），流式细胞术（FCM）分析法等。1971年建立的酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay，简称ELISA）技术具有高度的敏感性、特异性和应用广泛性，已成为近年来最吸引人的免疫检测方法之一，在疫苗的研发、临床诊断以及基础研究等方面得到广泛应用。迄今为止，尚未有针对鸡白痢沙门氏菌感染的相关免疫检测报道。

SpiC是第一个被鉴定出沙门氏菌毒力岛2编码的效应蛋白，其全长为133个氨基酸，分子量约为14kd，SpiC不含有任何保守的结构域。现有的研究表明，其在沙门氏菌得以存活于宿主吞噬细胞内起到必要性的作用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供SpiC的新用途。

本发明首先公开了鸡白痢沙门菌(Salmonella pullorum)分泌性蛋白SpiC或带融合标签的鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC在制备鸡白痢免疫检测用材料或诊断用材料中的用途。

所述鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC可直接用于制备鸡白痢免疫检测用材料或诊断用材料，或者所述鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC也可以带融合标签的鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的形式被用于制备鸡白痢免疫检测用材料或诊断用材料。

所述带融合标签的鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC含有所述鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC，并能与鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC抗体特异性结合。所述融合标签可选自：多聚组氨酸标签、GST标签、FLAG标签，HA标签，MBP（麦芽糖结合）标签，c-Myc标签，SNAP标签等。具体的，如实施例列举的6His-SpiC，序列为SEQ ID NO:2，其表现出对鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC抗体灵敏性高、特异性好、与抗体亲和力强。

所述鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的氨基酸序列为：

MLAVLKGIPLIQDIRAEGNSRSWIMTIDGHPARGEIFSEAFSISLFLNDLESLPKPCLAYVTLLLAAHPDVHDYAIQLTADGGWLNGYYTTSSSSELIAIEIEKHLALTCILKNVIRNHHKLYSGGV（SEQ ID NO:1）

所述鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC或带融合标签的鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC可利用常规的基因工程的方法制备，如将鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的编码基因克隆入适当的表达载体表达并分离获得。如利用原核蛋白表达载体pET-30表达融合蛋白6His-SpiC，再采用常规的Ni亲和层析柱纯化法分离获得6His-SpiC。

进一步的，所述鸡白痢免疫检测用材料或诊断用材料为ELISA检测用材料。

本发明进一步提供了一种鸡白痢ELISA检测用材料，包括以下任一：

a)鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC和固相载体；

b)包被有鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的固相载体。

所述固相载体可以事先包被有鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC或其融合蛋白，也可以只提供空白固相载体与鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC或其融合蛋白，在检测前由操作者自行采用常规方法在固相载体上包被特异性抗原。

所述固相载体可为各种常见规格的微量滴定板，如96孔式微量滴定板。

进一步的，所述鸡白痢ELISA检测用材料，还包括ELISA检测通用试剂。

所述ELISA检测通用试剂可选自下列试剂中的一种或多种：

1）碳酸盐包被缓冲液；

2）底物液；

3）洗涤液。

所述底物液可为ELISA检测中常用的通用底物液，如现配TMB底物液，现配OPD底物液。

所述洗涤液可为ELISA检测中常用的洗涤液，如0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液等。

进一步的，所述材料中还可以有选择地包括其他ELISA检测所需通用试剂，如封闭液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐吐温缓冲液等。

所述封闭液可为包被固相载体常用的封闭液，如10%小牛血清、BSA或脱脂乳液等。

通常情况下，本发明的材料，各试剂分别隔离储存。

ELISA检测通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需要进行选择，可由操作者自行配置或者单独购买。

所述鸡白痢ELISA检测用材料还可选择地包括：阴性对照和/或阳性对照。

所述阴性对照可选自：无沙门菌感染鸡的血清或SPF鸡的血清。

所述阳性对照可选自：鸡白痢沙门菌确定感染的鸡血清。

本发明的进一步提供了一种鸡白痢沙门氏菌的免疫学检测方法，为利用鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC或其融合蛋白通过ELISA法检测样本中的SpiC抗体，根据ELISA检测结果，判断样本供体是否感染了鸡白痢。

上述鸡白痢沙门氏菌的免疫学检测是在特异性抗SpiC的基础上建立的用于对样本中的SpiC抗体进行定性分析的实验方法。

本发明的技术效果：

本发明首次公开了可将鸡白痢沙门菌蛋白质SpiC作为沙门菌感染宿主时的生物学标志。并利用该蛋白建立了检测宿主体内产生的SpiC抗体ELISA方法及其在免疫检测和诊断领域的应用。与传统的玻板凝集实验相比，建立在免疫反应基础上的SpiC检测方法的灵敏度和特异性更高，可更好更快的诊断鸡白痢沙门氏菌。基于本发明建立的ELISA检测方法，在检测沙门氏菌感染鸡血清样品时，阳性样品/阴性样品OD值≧2.1，阴性样品OD值≦0.2.阳性样品OD值明显高于阴性样品值，表明该方法可以有效检测出鸡白痢沙门氏菌感染的鸡血清中分泌SpiC抗体，具有较好的灵敏度和特异性。另外，本方法通过对禽伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌感染鸡血清进行直接检测，结果显示同样可以检测出阳性孔中分泌SpiC抗体。而大肠杆菌、巴氏杆菌等非沙门氏菌细菌感染鸡血清进行直接检测，结果显示检测不到SpiC抗体。采用本发明的试验方法特异强，灵敏度高，极大提高了检测样品的准确率，可以为早期疾病预防与治疗提供依据，可以广泛应用于免疫学研究，用作鸡机体免疫状态的评价及感染性疾病诊断相关的研究。

附图说明

图1：PET30a-S06004-SpiC重组质粒鉴定结果。

M：λT14 Marker

1：PCR扩增

2：PET30a-S06004-SpiC质粒

3：PET30a-S06004-SpiC质粒Xho I单酶切

4：PET30a-S06004-SpiC质粒BamH I单酶切

5:PET30a-S06004-SpiC质粒Xho I,BamH I双酶切

图2：鸡白痢沙门菌S06004SpiC基因的原核表达

1:蛋白Marker

2：DE3(PET30a-SpiC)诱导组上清;

3：DE3(PET30a-SpiC)诱导组沉淀;

4：DE3(PET30a-SpiC)未诱导组上清;

5：DE3(PET30a-SpiC)未诱导组沉淀.

注：箭头指示为目的蛋白

图3：Western blot检测结果

1：预染Marker

2：重组蛋白

注：箭头指示为目的蛋白

图4重组蛋白的最佳包被浓度—方阵ELISA实验结果

图5：鸡白痢沙门氏菌感染鸡血清ELISA检测结果

1-7为鸡白痢阳性血清样品

空白：为健康对照

图6：ELISA鉴别检测野生株与突变株结果

图7：ELISA鉴别诊断大肠杆菌等其他沙门氏菌结果

1:大肠杆菌感染1号血清

2:大肠杆菌感染2号血清

3:巴氏杆菌感染血清

4:金黄色葡萄球菌感染血清

图8：ELISA检测采集样品结果

1:1-8为114样品中随机抽取样品

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例1

一、试验方法

1.重组质粒的构建及原核表达

1.1目的基因spiC的扩增根据NCBI检索，确定spiC的基因序列。使用Primer5软件设计引物P1:5’-TA

ATGCTGGCAGTTTTAAAAGGCATT-3’（SEQ ID NO:3）

P2:5’-TA

TTATACCCCACCCGAATAAAGTTTATG-3’（SEQ ID NO:4），酶切位点XhoI和BamHI。用引物P1和引物P2进行聚合酶链反应（PCR），以鸡白痢沙门氏菌野生株基因组DNA为DNA模板，模板可通过培养分离的鸡白痢沙门氏菌野生株，常规方法抽提其基因组DNA获得，所述鸡白痢沙门氏菌野生株可根据现有技术从沙门菌感染的鸡肉食品或鸡粪便中分离获得或直接从中国微生物菌种资源库购买。反应体系：10×buffer2.5μL、dNTP2μL、引物P1(10μM)和P2(10μM)各0.5μL、rTag酶1μL、DNA模板0.5μL加去离子水补充总体积至25μL。PCR扩增仪上进行反应：94℃,5min;94℃45s，58℃45s，72℃1min30个循环;72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物通过1%琼脂凝胶电泳进行检测与回收。

1.2原核表达载体的构建

PET30a原核表达载体的构建spiC基因PCR产物胶回收后与PMD20-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选；LB培养白色菌落，提取质粒，经XhoI和BamHI单酶切和双酶切鉴定，重组质粒经DNA测序鉴定正确，命名为PMD20-T-S06004-SpiC；质粒XhoI和BamHI双酶切，回收SpiC目的基因，连接入同样经XhoI和BamHI双酶切的PET30a质粒。按10μl反应体系：T4连接酶1μl，T4Buffer1μl，PET30a3μl，SpiC片段5μl，16℃连接过夜。连接产物转化表达菌BL21(DE3)，使用含终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB平板进行筛选。对平板上生长的单菌落进行PCR鉴定，挑选PCR阳性菌送金瑞斯生物科技有限公司测序，并将正确的克隆命名为PET30a-S06004-SpiC。

pGEX-6p-1原核表达载体的构建：采用前述方法获得PMD20-T-S06004-SpiC质粒，经XhoI和BamHI酶酶切后，回收SpiC目的基因，连接入同样经XhoI和BamHI酶酶切的pGEX-6p-1质粒。连接产物转化表达菌DE3，使用含氨苄霉素的LB平板进行筛选。对平板上生长的单菌落进行PCR鉴定，挑选PCR阳性菌测序，并将正确的克隆命名为PGEX-6P-1-SpiC。

1.3重组蛋白的优化诱导表达及鉴定

挑取筛选出的表达阳性BL21(DE3)（PET30a-S06004-SpiC）单克隆菌株，于含卡那霉素的新鲜LB液体培养基中过夜培养后，重新接种小量诱导，获得最佳诱导条件（IPTG浓度，诱导温度，诱导时间）。

1.4一抗制备

挑取筛选出的表达阳性DE3（PGEX-6P-1-SpiC）单克隆菌株，于氨苄霉素抗性的LB内过夜培养，次日，按1:100扩大培养于含有氨苄霉素的新鲜LB培养基的烧瓶中，.培养3h(至细菌OD达到0.4-0.6之间)，加入IPTG诱导（终浓度0.5mM），诱导5h之后收集菌体，用变复性溶液BufferA进行重悬（10ml/g），在冰浴条件下，进行超声波裂解，于4℃，8000rpm，10min收集沉淀，此时的沉淀即为粗制包涵体。

将包涵体溶解于5ml变性缓冲液中，置37℃、250rpm,4hr。然后于12000rpm，25min收集上清液，将上清按1:30比例用复性溶液BufferB稀释，置于4℃24h。用复性缓冲液BufferC进行透析，3次/12h，最后采用PEG8000进行浓缩，即时得到GST-SpiC蛋白。目的蛋白相对分子质量检测、N端测序均符合预期。根据重组质粒测序结果，推测该融合蛋白的氨基酸序列符合预期。

用原核表达质粒DE3(PGEX-6P-1-SpiC)表达的GST-SpiC蛋白免疫小鼠，免疫3次，每隔2周，采集免疫小鼠血清作为一抗。

1.5ELISA鉴定重组蛋白的免疫原性按1:100扩大培养于含卡那霉素的新鲜LB培养基的烧瓶中，置于摇床内37℃、180rpm,2hr后加入IPTG诱导（终浓度0.5mM）30℃，持续5hr，菌液离心后取菌体进行SDS-PAGE；ELISA鉴定重组质粒PET30a-S06004-SpiC表达的6His-SpiC蛋白的免疫原性，以DE3(PET30a-S06004-SpiC)原核表达的SpiC蛋白包被96板，用原核表达质粒DE3(PGEX-6P-1-SpiC)表达的GST-SpiC蛋白免疫小鼠制备抗体血清作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，ELISA鉴定重组蛋白的免疫原性。

2以SpiC蛋白为鸡白痢沙门菌感染检测抗原的ELISA方法的建立

2.1大量诱导目的蛋白并纯化方法同实施例1的1.4，

2.2最佳包被浓度－方阵试验

2.3检测鸡白痢沙门菌ELISA方法的建立以SpiC蛋白包被，4℃过夜，次日用PBST清洗3遍，每次5min，用10%小牛血清封闭，37℃孵育2h，PBST清洗3遍，每次5min，待检鸡白痢沙门菌阳性菌株血清按一定稀释度加入，同时设立阴性对照（无沙门菌感染或SPF鸡的血清）和空白对照（PBS缓冲液），37℃孵育2h后，PBST清洗4次；加入HRP标记的羊抗鸡IgG（工作浓度1:10,000），37℃作用1h后，PBST清洗5遍；加入底物OPD显色，37℃避光显色10min，用2M浓H₂SO₄终止反应后测OD492值。

3ELISA方法的应用

3.1ELISA鉴别检测野生株S06004与突变株（由野生株敲除spiC基因获得，可参考文献（刘男男硕士论文，中国期刊网CNKI）记载的方法制备）方法同实施例2的2.2，分别以攻毒组血清（以野生株感染鸡所获得的血清）和免疫组血清（spiC基因缺失株感染鸡所获得的血清）为一抗，同时设立阴性对照（无沙门菌感染或SPF鸡的血清）和空白对照（PBS缓冲液剂），测定OD492值。

3.2ELISA鉴别检测大肠杆菌及沙门菌等致病菌方法同2.2，分别以大肠杆菌攻毒组血清（以大肠杆菌感染鸡所获得的血清）及其他沙门菌攻毒组血清为一抗，同时设立阴性对照（无沙门菌感染或SPF鸡的血清）和空白对照（PBS缓冲液），测定OD492值。

3.3待检血清检测将采集144株鸡血清样品，进行玻板凝集实验，鉴定鸡白痢阳性菌株；应用所建立的ELISA方法进行检测，并将两者进行比较分析。

二.结果

1.SpiC蛋白原核表达载体构建及其免疫原性的鉴定。

1.1SpiC蛋白原核表达载体成功构建将鉴定正确的PMD20-T-SpiC重组质粒中SpiC基因亚克隆入PET30a载体中，重组质粒转入BL21(DE3)后，其重组子PET30a-S06004-SpiC经PCR、酶切鉴定（如图1）和测序结果都正确。

测序鉴定插入的SpiC编码基因序列为：

ATGCTGGCAGTTTTAAAAGGCATTCCATTAATTCAGGATATCAGGGCCGAAGGTAATAGCCGATCCTGGATAATGACTATTGATGGGCATCCTGCCAGAGGAGAAATTTTCTCAGAAGCATTTTCTATTTCTTTGTTCTTAAATGACCTGGAAAGCTTACCTAAGCCTTGTCTTGCCTATGTGACACTACTGCTTGCAGCACACCCGGACGTCCATGACTATGCTATACAGCTCACAGCGGATGGGGGATGGTTAAACGGTTATTATACCACAAGTAGTAGCTCTGAGCTTATTGCTATTGAGATAGAAAAACACCTGGCTTTAACTTGCATTTTAAAAAATGTAATACGCAATCACCATAAACTTTATTCGGGTGGGGTATAA（SEQ ID NO:5）

在本发明记载了质粒中插入的SpiC编码基因序列后，本领域技术人员除了可以采用从野生株基因组DNA中PCR获得该基因片段外，也可通过合成或者利用如拼接PCR等的方法来获得该基因片段。

1.2IPTG诱导表达BL21(DE3)菌株产物的SDS-PAGE检测PET30a-S06004-SpiC菌株在不同IPTG浓度，在不同的温度和不同的诱导时间诱导表达条件下，收集菌液离心后，取菌体进行SDS-PAGE检测，确定IPTG浓度0.5mM，最佳温度30℃，最佳时间5hr。如图2所示，目的蛋白相对分子质量为20kd，去除质粒PET30a表达的His标签蛋白为6kd后，与SpiC蛋白理论值（约14kd）相一致。融合蛋白经N端测序符合预期。

根据重组质粒测序结果，推测该融合蛋白的氨基酸序列为：

MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSEFELRRQACGRTRAPPPPPLRSGCMLAVLKGIPLIQDIRAEGNSRSWIMTIDGHPARGEIFSEAFSISLFLNDLESLPKPCLAYVTLLLAAHPDVHDYAIQLTADGGWLNGYYTTSSSSELIAIEIEKHLALTCILKNVIRNHHKLYSGGV（SEQ ID NO:2）

1.3重组蛋白的免疫原性的鉴定

表达菌DE3(PGEX-6P-1-SpiC)原核表达的GST-SpiC蛋白免疫7日龄SPF鸡（80μg/_只），一周之后进行二免（100μg/_只），二免之后心脏采血，置于4℃2-3h，收集血清；以原核表达的DE3(PET30a-S06004-SpiC)6His-SpiC蛋白作为抗原，二免SPF鸡血清作为一抗，HRP标记的羊抗鸡IgG为二抗，结果如图3所示，western blot鉴定重组蛋白有良好的免疫原性。

2以SpiC蛋白为抗原建立ELISA方法及其初步应用。

2.1重组蛋白的最佳包被浓度—方阵实验结果如图4所示，结果显示重组蛋白的最佳包被浓度5ug/ml。

2.2检测鸡白痢沙门菌ELISA方法的建立

以SpiC蛋白包被，运用ELISA方法检测判定为鸡白痢阳性的血清，结果如图5所示。

2.3ELISA鉴别检测野生株与突变株（S06004、S06004ΔSpiC）

结果如图6所示

2.4ELISA鉴别检测大肠杆菌及沙门菌等致病菌

结果如图7所示

2.1玻板凝集检测结果144株待检血清样品，122株为确诊为鸡白痢阳性样品，阳性率为84.7%。而运用ELISA检测方法，阳性率高于玻板凝集实验诊断结果。

两种诊断方法的比较图：

144份样品ELISA检测图如图8所示

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (11)

1.鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC或带融合标签的鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC在制备鸡白痢免疫检测用材料或诊断用材料中的用途。

2.如权利要求1所述鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC或带融合标签的鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的用途，其特征在于，所述带融合标签的鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC中，所述融合标签选自多聚组氨酸标签或GST标签。

3.如权利要求1所述鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC或带融合标签的鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的用途，其特征在于，所述鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的氨基酸序列为SEQ IDNO:1。

4.如权利要求1所述鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC或带融合标签的鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的用途，其特征在于，所述带融合标签的鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

5.如权利要求1所述鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC或带融合标签的鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的用途，其特征在于，所述鸡白痢免疫检测用材料或诊断用材料为ELISA检测用材料。

6.一种鸡白痢ELISA检测用材料，包括以下任一：

a)鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC和固相载体；

b)包被有鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的固相载体。

7.如权利要求6所述鸡白痢ELISA检测用材料，其特征在于，所述固相载体为微量滴定板。

8.如权利要求6所述鸡白痢ELISA检测用材料，其特征在于，所鸡白痢ELISA检测用材料还包括ELISA检测通用试剂。

9.如权利要求8所述鸡白痢ELISA检测用材料，其特征在于，所述ELISA检测通用试剂包括列试剂中的一种或多种：

1）碳酸盐包被缓冲液；

2）底物液；

3）洗涤液；

4）封闭液；

5）磷酸盐缓冲液；

6）磷酸盐吐温缓冲液。

10.如权利要求6所述鸡白痢ELISA检测用材料，其特征在于，所鸡白痢ELISA检测用材料选择性包括：阴性对照和/或阳性对照。

11.如权利要求10所述鸡白痢ELISA检测用材料，其特征在于，所述阴性对照选自：无沙门菌感染鸡的血清或SPF鸡的血清；所述阳性对照为鸡白痢沙门菌确定感染的鸡血清。

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