CN104928257A - 分泌沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分泌沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在免疫检测领域的应用。本发明的分泌沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO：C201563。本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，基于此建立的检测试剂盒，在检测鸡血清样品时，具有较好的灵敏度和特异性。采用本发明的试剂盒操作简便，极大缩短了检测时间，可以广泛应用于免疫学研究，用作鸡机体免疫状态的评价及感染性疾病诊断相关的研究。

Description

分泌沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于免疫检测及诊断领域，尤其涉及分泌沙门菌SpiC蛋白单抗的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及其应用。

背景技术

SpiC是第一个被鉴定出的由沙门氏菌毒力岛2编码的效应蛋白，SpiC全长为127个氨基酸，分子量约为14.7kDa，推测其有双重功能，与宿主蛋白TassC和Hook的相互作用，预测了SpiC在避免SCV与溶酶体融合机制中的重要作用，因为两个靶蛋白均为膜泡运输相关蛋白。

SpiC的免疫学检测是在特异性抗SpiC的单克隆抗体的基础上建立的用于对样本中的SpiC进行定性定量分析的实验方法。应用不同的单抗标记物和检测技术，已经开发出多种方法，如酶免疫分析法(EIA)，酶联免疫吸附法(ELISA)，酶联免疫斑点法(ELISPOT)，流式细胞术(FCM)分析法等。

竞争酶联免疫吸附试验(Competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assay，简称竞争ELISA)技术具有高度的敏感性和应用广泛性，已成为近年来最吸引人的免疫检测方法之一，在疫苗的研发、临床诊断以及基础研究等方面得到广泛应用。建立在免疫基础上的沙门菌检测方法的灵敏度和特异性更高。

发明内容

本发明的目的是提供一种分泌沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在免疫检测领域的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一方面提供了一种分泌沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO：C201563。

所述杂交瘤细胞株已于2015年4月26日在中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武汉大学)注册保藏，保藏号为CCTCC NO：C201563，分类命名为：杂交瘤细胞株5F8。

本发明的第二方面提供了一种沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体，由保藏号为CCTCC NO：C201563的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。

本发明的第三方面提供了前述分泌沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及前述沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体在制备鸡疫病的检测试剂或诊断试剂中的应用。

本发明第四方面提供了一种沙门菌检测试剂盒，所述试剂盒包括：

1.选自以下任一：

1)酶标板和检测原；

2)包被有检测原的酶标板；

所述检测原是沙门菌SpiC蛋白。

本发明的一个优选实施例中采用的检测原的制备方法详见耿士忠,刘欢,焦新安等.鸡白痢沙门菌SpiC蛋白原核表达及其间接ELISA方法的建立[J].细胞与分子免疫学杂志,2015,31(2):149-158。

2.HRP标记沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体；

所述试剂盒中，酶标板可以事先包被有检测原，也可以只提供空白酶标板与检测原，在检测前由操作者自行采用常规方法在酶标板上包被检测原。

所述酶标板可为各种常见规格的酶标板，如96孔酶标板。

HRP标记沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的方法采用常规。

进一步优选的，所述HRP标记沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体中的沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C201563的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。

保藏号为CCTCC NO：C201563的杂交瘤细胞株已于2015年4月26日在中国典型培养

物保藏中心(地址：湖北省武汉市武汉大学)注册保藏，分类命名为分类命名为：杂

交瘤细胞株5F8。

进一步的，所述试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：

1)底物液；

2)洗涤液。

上述试剂均为竞争ELISA检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需要有选择地加入试剂盒，也可由操作者自行配置或者单独购买。为方便操作者，最优的选择是试剂盒中，同时包括底物液和洗涤液。所述底物液可为竞争ELISA检测试剂盒中常用的通用底物液，如3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物液。

所述洗涤液可为竞争ELISA检测试剂盒中常用的洗涤液，如磷酸盐缓冲液等。可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。

进一步的，所述试剂盒中还可以有选择地包括其他竞争ELISA检测所需通用试剂，如封闭液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐吐温缓冲液等。

所述封闭液可为包被酶标板常用的封闭液，如脱脂乳液、FBS、BSA或酪蛋白等。

通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。

本发明进一步基于上述SpiC蛋白竞争ELISA检测试剂盒，建立了具有较好特异性和灵敏度的沙门菌的竞争ELISA检测方法，用于检测鸡血清，从而进行机体免疫状态评价及疾病诊断方面的研究。

本发明的试剂盒可用于检测感染沙门菌的鸡血清样品。

利用本发明的试剂盒检测感染沙门菌的鸡血清样品的检测方法包括下列步骤：

1、检测原包被酶标板；

2、制备鸡血清

3、检测

①将检测原用碳酸盐缓冲液稀释至最佳包被浓度，每孔100μL，轻轻混匀，4℃包被过夜。弃去，PBST洗3次。每孔加入200μL 1％BSA，37℃反应2h，弃去，PBST洗3次。

②在上述包被的酶标板中加入最佳稀释度的血清，每孔100μL，37℃孵育2h，

③弃去样品，PBST洗3次，加入HRP标记沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体100L/孔，37℃

孵育1h；

④弃去检测抗体，PBST洗6次，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光反应5min；

⑥加入2M H₂SO₄，50μL/孔，使用酶标仪于OD₄₅₀波长下测定吸光值。

上述方法通过离心分离鸡血清，以阳性鸡血清作为阳性样品，以阴性鸡血清作为对照样品，并以纯化的保藏号为CCTCC NO：C201563的杂交瘤细胞株分泌的单抗为检测抗体，结果显示，该方法可以有效检测出沙门菌。

本发明的有益效果为：

本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，基于此建立的检测试剂盒，在检测鸡血清样品时，具有较好的灵敏度和特异性。采用本发明的试剂盒操作简便，极大缩短了检测时间，可以广泛应用于免疫学研究，用作鸡机体免疫状态的评价及感染性疾病诊断相关的研究。

本发明杂交瘤细胞株保藏信息如下：

杂交瘤细胞株名称：杂交瘤细胞株5F8；

保藏号为：CCTCC NO：C201563；

保藏日期：2015年04月26日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏单位简称：CCTCC；

保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。

附图说明

图1：5F8Western Blotting鉴定图，其中，1为rHis-SpiC纯化蛋白；2为BL21(DE3)(pET)；3为rGST-SpiC纯化蛋白；4为BL21(pGEX-6p-l)。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS INENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。

实施例1保藏号为CCTCC NO：C201563的杂交瘤细胞株的获得

1.动物免疫

具体免疫程序如下：首次免疫，腹部皮下多点注射100μg经弗氏完全佐剂充分乳化的重组鸡白痢沙门菌SpiC纯化蛋白，2周后腹部皮下多点注射100μg经弗氏不完全佐剂充分乳化的纯化蛋白进行二次免疫，间隔2周后腹腔注射100μg不加佐剂的纯化蛋白进行第三次免疫，7天后眼眶采血测定血清抗体效价，选取效价较高的小鼠进行尾静脉加强免疫100μg不加佐剂的纯化蛋白。

2.细胞融合

具体步骤如下：尾静脉加强免疫3d后，采集少量血液，分离血清-20℃冻存，作为筛选时的阳性对照。按生物安全方法处死免疫鼠，75％酒精浸泡消毒5min，无菌取脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0在PEG(MW4000)作用下融合，用ICR小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，融合好的细胞及饲养细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃、6％CO2培养箱中培养。5d后加入新鲜HAT培养基，10d后改用HT培养基进行培养，定期观察，换液和检测。

3.间接ELISA检测方法的建立

采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆。方阵试验确定检测抗原的包被浓度。

检测抗原用包被缓冲液横向梯度稀释，每孔100μl包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200μl封闭液，4℃过夜；免疫鼠血清纵向倍比稀释，每孔100μl，正常小鼠血清同样倍数稀释作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗涤3次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔100μl，37℃孵育1h；PBST洗涤后，TMB显色，酶联检测仪测定OD₄₅₀的值，判定检测抗原的最佳包被浓度。

根据方阵试验确定的检测抗原的包被浓度，将稀释后的检测抗原100μl/孔加入酶标板中，4℃过夜，PBST洗液洗涤3次，5min/次，用含1％BSA的PBST洗液，37℃封闭2h，洗涤，拍干-20℃保存，用于筛选阳性细胞克隆。

4.筛选阳性克隆

采用建立好的间接ELISA方法检测杂交瘤细胞分泌抗体的情况。具体方法如下：

将杂交瘤细胞培养上清加入预先包被好的ELISA板中，100μl/孔，以SP2/0细胞上清作为阴性对照，免疫鼠多抗血清作为阳性对照，37℃水浴2h；PBST洗涤3次；加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，100μl/孔，37℃水浴1h；洗涤后，TMB显色5-10min，显色终止后酶标仪测定OD450读数。被测孔OD450读数大于阴性对照两倍以上判定为阳性。将筛选到的阳性克隆命名为杂交瘤细胞株5F8。

5.阳性杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法对筛选到的阳性细胞克隆5F8进行2-3次的亚克隆并进行保藏。阳性细胞克隆5F8对应保藏号为CCTCC NO：C201563的杂交瘤细胞株。

实施例2沙门菌SpiC蛋白单抗制备

1.腹水制备

采用体内诱生腹水法，按常规方法进行。10-12周龄健康BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3-0.5ml/只，7-10d后，分别腹腔接种经PBS稀释的培养至对数生长期的杂交瘤细胞3G9，3B2，4D9，4F7，5F8，5F8和6B9，5×10⁵个细胞/只；7d后收集腹水，离心去除沉淀，收集上清，间接ELISA法测定抗体效价，分装，-70℃保存。杂交瘤细胞株CCTCC NO：C201563(对应杂交瘤细胞5F8)分泌的单抗记为5F8。

2.抗体纯化标记

将制备的5F8腹水使用Protein G亲和层析方法进行纯化，并将单抗5F8进行辣根过氧化物酶标记。

将纯化5F8单抗采用标准辣根过氧化酶标记法进行标记。具体方法如下：

称取2mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。于上液中加入0.5ml新配的0.06M NaIO4溶液，4度避光30分钟。上液中加入160mM的乙二醇0.5ml，室温30分钟。上液中加入IgG 2mg，混匀。将上述溶液装入透析袋中，置2000ml的0.05mM CB Buffer中透析，4℃搅拌过夜。(0.05M CB Buffer：Na2CO33.18g+NaHCO35.88g，up to 2L蒸馏水)。透析液吸至15ml的离心管中，加0.2ml新配的5mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。加入等量的饱和硫酸铵溶液，4度30分钟，4度离心4000rpm，20分钟。弃上清，沥干。将沉淀溶于少量PBS中(0.02M，pH7.4)，装入透析袋中，对0.02M pH7.4PBS透析，4℃过夜(中途换PBS一次)。将透析液中液体吸至EP管中，离心，将上清液吸出，加等量甘油，混匀，-20度保存即可。

实施例3单克隆抗体特性检测

1.单抗亚类的鉴定

按单克隆抗体亚类试剂盒说明书进行，采用抗原介导的ELISA法。取细胞培养上清加入已包被检测原的ELISA板中，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，加入1:1000稀释的羊抗鼠IgA、IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM，l00μl/孔，每个亚类做两个重复孔，37℃孵育30min；PBST洗涤3次，加入1:5000稀释的兔抗羊酶标二抗，100μl/孔，37℃孵育15min；PBST洗涤3次，TMB显色l0min，2mol/L H₂S0₄终止反应，酶标仪读出OD₄₅₀nm的吸光值，OD₄₅₀nm吸光值最大者即为单抗的亚类。

结果显示，5F8为IgG1。

2.单抗腹水效价的测定

使用包被缓冲液将检测抗原稀释至一定浓度，每孔50μl包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h；将单抗腹水倍比稀释，每孔100μl，同样倍数稀释SP2/0腹水作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗涤3次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔100μl，37℃孵育1h；PBST洗涤后，TMB显色，酶联检测仪测定OD₄₅₀的值，以P/N值≥2.1为判定标准，测定单抗腹水效价。

结果显示，单抗5F8效价为1：4096000。

3.单抗特异性的鉴定

(1)以Western blotting鉴定单抗的特异性，具体步骤如下：将重组菌BL21(DE3)(pET)、BL21(DE3)(pET-spiC)裂解上清和rHis-SpiC纯化蛋白、以及重组菌BL21(pGEX-6p-l)、BL21(pGEX-6p-l-spiC)裂解上清和rGST-SpiC纯化蛋白，用5×SDS Loading Buffer稀释后，100℃沸煮l0min，进行SDS-PAGE电泳。然后在Bio-Rad semi-Dry transfer Cell系统中以0.8mA/cm2转印2小时，丽春红检验转印效果。转印有蛋白的NC膜浸没于1％BSA-PBST中，室温轻摇过夜封闭；PBST洗涤3次，每次l0min，加入细胞培养上清或1:200稀释的腹水，室温轻摇反应2h；PBST充分洗涤后，加入1:5000HRP-羊抗鼠IgG，室温轻摇反应1h；PBST充分洗涤后，ECL显色，终止，扫描仪拍照。

如图1所示，在Western blotting试验中，单抗与rHis-SpiC纯化蛋白和rGST-SpiC纯化蛋白，均有特异性免疫结合，分别在20KDa和40KDa处出现特异性条带，单抗均不与His标签、GST标签以及其他蛋白发生交叉反应。

(2)以间接ELSIA检测重组蛋白和标签蛋白与所制备的抗体之间的反应性。结果如表1所示，所获得的MAbs只与重组蛋白GST-SpiC和His-SpiC反应，而与其他蛋白GST-IL-2、His-IL-2以及His和GST蛋白均不反应，说明所获得的MAbs具有较好的特异性。

表1SpiC单抗特异性鉴定结果

+:positive；-:negative

实施例4试剂盒的组装

步骤：

1)HRP标记的SpiC蛋白单克隆抗体(记为HRP-5F8)的制备：

称取HRP 25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，与室温静置过夜。反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1min，收集棕色流出液。将5F8用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加到酶溶液中。用1M pH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3h。加0.2M赖氨酸0.25ml。混匀后室温静置2h。在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h。3000rpm离心30min，弃上清。沉淀用半饱和硫酸铵洗两次，最后沉淀溶于0.15M pH 7.4的PBS中。将上述液体装入透析袋，对0.15M pH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后，10000rpm离心30min，弃沉淀，上清即为酶结合物，分装后，以280nm的吸收值测定单抗蛋白含量，-20℃保存。

2)将96孔板、HRP标记的SpiC蛋白单克隆抗体分别包装组装成试剂盒。

进一步的，试剂盒中依据需要组装入：TMB显色液、浓缩PBS缓冲液、封闭液、磷酸盐缓冲液或磷酸盐吐温缓冲液中的一种或多种。

试剂盒中，96孔板、单抗5F8也可采用包被SpiC蛋白的96孔板替代。

包被SpiC蛋白的酶标板的制备方法：

①96孔酶标板中加入0.5μg/mL的GST-SpiC蛋白，100μL/孔，4℃过夜包被；

②弃包被液，使用含有0.05％吐温的灭菌PBST洗板3次，5min/次；

③加入含1％BSA的PBS溶液，200μL/孔，37℃孵育封闭2h；

④弃封闭液，使用PBST洗板1次，将96孔酶标板放于密封袋中，置4℃保存。

实施例5鸡血清样品的检测

1.检测抗原包被

本实施例所采用的检测原GST-SpiC蛋白的制备方法详见耿士忠,刘欢,焦新安等.鸡白痢沙门菌SpiC蛋白原核表达及其间接ELISA方法的建立[J].细胞与分子免疫学杂志,2015,31(2):149-158。

①96孔酶标板中加入0.5μg/mL的GST-SpiC蛋白，100μL/孔，4℃过夜包被；

②弃包被液，使用含有0.05％吐温的灭菌PBST洗板3次，5min/次；

③加入含1％BSA的PBS溶液，200μL/孔，37℃孵育封闭2h；

④弃封闭液，使用PBST洗板1次，将96孔酶标板直接用于检测，或放于密封袋中，置4℃保存，1周内使用。

2.制备鸡血清

3.检测

①在上述包被的96孔酶标板中加入下列试剂：100μL阳性鸡血清至每个阳性孔，100μL阴性血清至每个对照孔，37℃孵育45min，

②将96孔酶标板取出，弃培养上清，使用PBST洗板5次，5min/次，洗板后甩干。加入HRP标记5F8单克隆抗体100L/孔，置于37℃孵育1小时；

③用PBS洗板6次，5min/次，洗板后甩干，加入TMB显色液，100μL/孔，置于37℃孵育5min；2mol/L H₂S0₄终止反应，显色终止后酶标仪测定OD₄₅₀读数。

结果如表2所示：

表2竞争ELISA与玻板凝集结果比较

Table 1Detection rates of SpiC antibodies with cELISA and the slide agglutination test

结果显示，共检出121份阳性样品，检出率为81.21％，阴性样品28份，检出率为18.79％。玻板凝集试验共检出阳性样品数为70，阳性检出率为46.98％，阴性样品79，检出率为53.02％，我们建立的竞争ELISA方法比玻板凝集的检测灵敏度高、特异性强，能够广发的应用于大规模的沙门菌检测。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种分泌沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO：C201563。

2.一种沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体，由保藏号为CCTCC NO：C201563的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。

3.如权利要求1所述的分泌沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株或如权利要求2所述的沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体在制备沙门菌病的检测试剂或诊断试剂中的应用。

4.一种沙门菌检测试剂盒，所述试剂盒包括：

a.选自以下任一：

1)酶标板和检测原；

2)包被有检测原的酶标板；

b.HRP标记沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体；所述HRP标记沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体中的沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体为权利要求2所述沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体。

5.如权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，所述检测原是所述检测原是沙门菌SpiC蛋白。

6.如权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，所述酶标板是96孔酶标板。

7.如权利要求4-6任一所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：

1)底物液；2)洗涤液。

8.如权利要求7所述检测试剂盒，其特征在于，所述底物液为TMB。

9.如权利要求7所述检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液。

10.如权利要求4-8任一所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：封闭液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐吐温缓冲液。