CN103941020A - 一种检测副猪嗜血杆菌抗体的间接elisa试剂盒 - Google Patents
一种检测副猪嗜血杆菌抗体的间接elisa试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒。该试剂盒由副猪嗜血杆菌细胞致死性膨胀毒素C(cytolethal distending toxin，CDT-C)蛋白作为包被抗原的ELISA包被板、待检样品稀释板、阳性对照血清、阴性对照血清、20倍浓缩洗涤液、血清样本稀释液、酶标抗体工作液、显色液和终止液组装而成。判定标准：S/P值<0.200，判为阴性；S/P值≥0.200，判为阳性，S/P值=（待测样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）/（阳性样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）。通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验、符合率试验、与上市试剂盒比较试验、临床应用试验等，表明本试剂盒具有特异性好、敏感度高、重复性好等特点，与国外同类上市产品具有较高符合率，可用于副猪嗜血杆菌抗体的临床大规模检测和流行病学调查。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学、微生物学及动物传染病检测技术领域，具体的涉及一种检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒，属于副猪嗜血杆菌病防控领域。
背景技术
副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的一种传染病。副猪嗜血杆菌(H. parasuis)是一种NAD依赖型、不运动的革兰氏阴性杆菌，属于巴斯德菌科(Pastteurellaceae)嗜血杆菌属(Haemophilus)。该菌是猪上呼吸道的一种共栖菌，可在特定的条件下侵入机体而引起严重的全身性疾病——猪格拉氏病(Glasser’s Disease)，临床上主要表现为猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。H.parasuis易感染2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，发病率一般为10%～15%，严重时患病猪死亡率可达50%，给养猪业造成了巨大经济损失。该病在我国及世界上多个国家广泛存在，成为世界范围内危害养猪业的一种重要细菌性传染病，并在我国流行日趋严重。
为了有效预防和控制HPS，在加强免疫预防的同时，使用特异、敏感、快速、便于操作的诊断和检测方法，是有效预防和控制HPS发生的手段和重要的工具。但副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道中的一种常在菌，因此例如PCR方法、补体结合试验、southern杂交、间接血凝试验等检测HPS病原的一些检测方法，对于诊断和防控的意义不大。检测副猪嗜血杆菌抗体的ELISA方法可以反映猪体内的HPS的感染情况还可以显示抗体水平，对于临床免疫具有指导作用，同时操作简单便于临床检测和抗体监测。
目前国外仅有荷兰BioChek 公司和加拿大Biovet公司两家生产研制的ELISA 抗体检测试剂盒，但在国内没有批文批号，国内市场上尚无检测该病抗体的国产商品化试剂盒。国内学者建立的检测副猪嗜血杆菌抗体的ELISA方法采用的包被抗原主要有破碎的全菌、提取的荚膜多糖和脂多糖、表达的外膜蛋白P2和P5蛋白等。但副猪嗜血杆菌血清型众多，抗原成分复杂，采用全菌包被有可能导致非特异性反应。荚膜多糖和脂多糖的提取受分泌条件和提取量小等因素制约不能适应试剂盒大规模生产的需要，而且多糖成分比较复杂，容易造成检测的假阳性。因此利用基因工程技术重组表达特异性蛋白作为抗原是解决以上问题的理想途径，其中表达的外膜蛋白P2和P5作为包被抗原的研究比较多。但赵倩（2010）等通过副猪嗜血杆菌15个血清型菌株的外膜蛋白P2和P5基因克隆测序分析显示，外膜蛋白P5的基因序列在副猪嗜血杆菌15个血清型的细菌中同源性高，保守性好，而外膜蛋白P2同源性较低，且部分血清型基因序列出现成段碱基缺失和多个点突变，可能影响其作为包被蛋白的通用性。张斌（2013）等研究表明表达的外膜蛋白P5蛋白可以和副猪嗜血杆菌15个血清型参考菌株的阳性血清发生免疫印迹反应，外膜蛋白P5蛋白的通用性良好，但间接ELISA检测结果显示，表达外膜蛋白P5蛋白包被酶标板可以和巴氏杆菌、胸膜放线杆菌等细菌的阳性血清发生交叉反应，蛋白特异性差，可能造成假阳性结果。
因此为了满足我国副猪嗜血杆菌诊断和控制的需要，为防治副猪嗜血杆菌病提供有力技术支撑，针对国内无副猪嗜血杆菌抗体检测试剂产品的现状研制一种快速、特异、敏感的副猪嗜血杆菌ELISA
抗体检测试剂盒是十分迫切的。
发明内容
本发明目的在于解决现有技术的缺点和不足，针对目前国内没有商品化的检测试剂盒，提供一种检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒，该试剂盒快速、特异、敏感、稳定等优点。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
（1）一种检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒，是用副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白作为包被抗原。
（2）副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白的基因序列经克隆测序分析显示，在副猪嗜血杆菌15个血清型的细菌中同源性高，保守性好。
（3）副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白的氨基酸序列如下： MLKRFTLLMTLGLCQFSLAET
PPMPPAPRPTPSTYPDVVEIKPPIISLRSLNTGEPVSNRSYDRNDPREVQWRLVDAIVKNRRFVQFKVVDKEERCLVGDGGTLPCEQKDTLFRLVPTDTGAFILTEPNTGKCLTSENYGSYGFQNCLRTSSAEPSNIPLKHLWIIAPPFGPSRLL。
（4）副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白通过基因工程克隆表达得到，具体如下：
a.将如下所示的副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白的核苷酸序列克隆于大肠杆菌表达载体pcold-sumo中，得到pcold-sumo+CDTC质粒。副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白的核苷酸序列：ATGTTAAAGCGTTTTACTTTATTGATGACATTAGGACTATGCCAGTTTTCCCTTGCAGAAACACCACCGATGCCACCTGCACCTAGGCCAACACCATCAACTTATCCTGATGTTGTTGAAATAAAGCCCCCTATTATCTCTTTACGCAGTTTAAATACGGGGGAGCCAGTATCTAATCGGAGCTACGATCGGAATGATCCAAGAGAGGTGCAGTGGAGACTTGTCGATGCTATTGTTAAAAATCGTCGGTTCGTACAATTTAAAGTAGTTGATAAAGAAGAGCGTTGCTTGGTTGGAGATGGTGGTACTTTACCCTGTGAACAAAAAGACACTTTATTTAGGTTAGTCCCAACCGACACGGGAGCATTTATTCTGACAGAACCCAACACAGGAAAATGTTTAACCAGCGAGAATTATGGCAGTTATGGTTTTCAAAACTGCTTACGGACTTCTTCAGCAGAACCTAGCAATATTCCGTTAAAACATCTTTGGATTATTGCTCCGCCTTTTGGACCTAGTAGGTTATTATAA
b.根据表达载体pcold-sumo的操作说明，将pcold-sumo+CDTC质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)PlysS感受态细胞，进行表达、鉴定、纯化，得到副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白。
c.所述的步骤b通过优化具体如下：将携带pcold-sumo+CDTC质粒的大肠杆菌BL21(DE3)PlysS接种于含有氨苄的LB液体培养基中，在37℃环境下振荡培养，待菌液的OD600吸光值达到0.6是加入0.5mM的IPTG，在摇床中16℃诱导24h进行表达，收集菌体反复冻融3次后超声破碎300W，工作5s，间隔10s，70次，破碎菌液用HIS标签的纯化柱进行纯化，纯化后通过尿素进行透析复性，获得副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白。
（5）所述检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒的抗原最佳包被浓度为5μg/mL。
（6）所述检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒的判断标准为：S/P值=（待测样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）/（阳性样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）<0.200，判为阴性，≥0.200，判为阳性。
（7） 所述检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒，包被抗原为副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白，包含待检样品稀释板、阳性对照血清、阴性对照血清、浓缩洗涤液、血清样本稀释液、酶标抗体工作液、显色液和终止液。
本发明相对于现有技术具有如下的优点：
（1）本发明所用的包被抗原，即副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白的核酸序列，经过15个血清型的副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白的基因序列克隆测序分析显示，具有高度的同源性，保守性好，通用性好。
（2）本发明所用的包被抗原副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白可通过基因工程克隆表达获得，生物安全性高。目前国内外没有用此蛋白作为抗原建立HPS抗体间接ELISA检测方法的相关报道，具有广阔的应用前景。
（3）通过特异性、敏感性、稳定性、符合率试验、与上市试剂盒比较试验、临床应用试验等检测，证明本发明所述的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒具有特异性好，敏感性高，稳定性好等特点，与国外同类上市产品具有较高符合率，可用于副猪嗜血杆菌抗体的临床大规模检测和流行病学调查。
附图说明
图1：15个血清型的副猪嗜血杆菌CDT-C基因的PCR扩增结果。
其中：M: DL2 000 DNA
Marker; 1: 1R; 2 :2R; 3:3R; 4:4R; 5: 5R2; 6:6R; 7:7R; 8:8R; 9: 9R; 10:10R;
11:11R; 12:12R; 13:13R;:14R; 15:15R; 16: 阴性对照
图2：重组质粒pCold-SUMO+CDTC的双酶切鉴定
其中：M：DL5000
DNA Marker；1：pCold-SUMO+CDTC的BamHⅠ和SalⅠ双酶切图；
图3 重组蛋白的SDS-PAGE分析
其中：M:蛋白Marker;
1:诱导后空载体; 2:诱导前空载体; 3:诱导产物; 4:诱导前对照
图4 融合蛋白表达形式
其中：M:蛋白Marker;1:
空载体菌体裂解后沉淀;2：空载体菌体裂解后上清；3:细菌裂解后沉淀;4:细菌裂解后上清
图5 纯化的重组CDTC
SDS-PGAE电泳分析
其中：M：蛋白Marker；1：未纯化；2、3：纯化重组CDT-C
图6副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白的Western-blotting分析
其中：M：蛋白Marker；1：纯化重组CDT-C。
具体实施方式
下面结合实施实例和附图对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此：
实施例1
一、副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白的克隆测序分析、表达和纯化
1.1引物设计与合成
根据GenBank中的SH0165（登录号为CP001321）H. parasuis
CDT-C全基因序列，设计1对表达引物，P上(CDTC-BamHI-F)：CGCGGATCCATGCTAAAGCGTTTTACTTT、P下(CDTC-SalI-R)：ACGTGTCGACTTATAATAACCTACTAGGTC上下游引物中分别引入了BamHI和SalI酶切位点（以下划线表示），扩增CDT-C OFR序列，预期片段大小为531bp。
1.2副猪嗜血杆菌CDT-C基因的克隆测序分析
以提取的H. parasuis血清1-15型DNA为模板，引物采用P上和P下。总反应体系为25 μL, Taq 酶: 0.25 μL; MgCl2缓冲液: 2.5 μL; MgCl2: 2.5 μL ; dNTP: 2 μL;
F1: 1 μL; R1:1 μL;
ddH2O: 13.75 μL; DNA 模板2 μL。反应程序为：94 °C预变性 4 min，94 °C 30 sec，51 °C 50 sec，72 °C 1 min，30个循环，72 °C 10 min，16 °C结束反应，PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1，扩增片段大小与预期相符。以上扩增的所有片段进行产物回收后, 按照pMD18-T
vector连接试剂盒说明书进行连接、克隆, 挑取阳性克隆送上海生工测序，测得的基因序列用DNA
Star Lasergene 软件分析同源性，H. parasuis的15个参考菌株的CDT-C的相似性在94～100 %之间。
1.3副猪嗜血杆菌CDT-C基因表达载体的构建
用Plasmid Mini Kit
质粒提取试剂盒分别提取H. parasuis血清5型的CDT-C重组质粒和表达载体质粒pcold-sumo，用内切酶BamHI和SalI分别进行双酶切，酶切体系为（60 µL）：CDT-C重组质粒或pCold-SUMO载体20.0μL，10×Buffer T 9.0μL，BamHI 2.0μL，SalI2.0µL，用ddH2O补足60μL。各体系混匀后置于37 °C恒温水浴中酶切3h，于1.0 %琼脂糖凝胶电泳中检测酶切结果。CDT-C基因片段和质粒pCold-SUMO双酶切产物分别经1.0 %琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因。在10µL连接体系中依次加入连接组分，酶切回收CDT-C基因片段6.0μL，T4 DNA连接酶1.0µL，T4 Ligation
Buffer 1.0µL，pCold-SUMO酶切回收载体0.5μL，用ddH2O补足10μL，将各组分轻轻混匀，16 °C连接过夜。从-80°C冰箱取出JM109感受态细胞，于冰上融化后加入上一步骤得到的连接产物10μL，轻轻混匀后，立即冰浴30min，然后42 ºC热激90s，立即冰浴5min。每管加入400μL新鲜LB液体培养基，37 ºC缓慢摇动45min，取出后4000rpm/min离心2min。弃去上清400μL，取剩余100μL菌液涂布于含Amp(100μg/mL)的LB琼脂平板中，用L棒均匀涂布于琼脂表面，作好标记正面放置吸收10 min(37ºC培养箱中)，然后37ºC倒置培养12-16 h。将灭菌5mL EP管置于EP管架，每管加4mL LB 液体培养基并加入4μL氨苄西林钠（100mg/mL），每个平皿选取3个单菌落在超净台上用无菌镊子夹取200μL枪头来挑取置于EP管中。37ºC摇床培养过夜，次日取200μL菌液加到1.5mL Ep管中12000rpm/min，离心1-2min，弃上清后每管加ddH2O
50μL吹悬菌体，放沸水中煮10min。每管取2μL作为PCR反应模板进行PCR反应，反应结束后，取适量的PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。将筛选的阳性菌扩大培养。根据OMEGA公司的质粒小提试剂盒（E.Z.N.A®
Gel Extraction Kit I）使用说明，对重组质粒pCold-SUMO+CDTC进行抽提。抽提的重组质粒进行双酶切鉴定，结果见图2，对酶切鉴定阳性的质粒送大连宝生物工程有限公司进行测序。
1.4副猪嗜血杆菌CDT-C基因的表达
分别挑取经鉴定含有重组质粒pCold-SUMO+CDTC的单菌落于含Amp（100 µg/mL）LB液体培养基中，同时挑取含表达载体质粒pCold-SUMO的单菌落于含Amp（100µg/mL）LB液体培养基中作为阴性对照，37°C培养过夜，作为一级种子。次日分别取上述菌液按1:50比例接种于新鲜的含Amp（100µg/mL）LB培养液，37 ºC培养至OD600nm值为0.6，再加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，以诱导蛋白表达，于16ºC继续培养24h，然后取1mL培养菌液12000r/min离心1 min收集菌体，以100µL ddH2O重悬菌体，同时加入相同体积的2×SDS-PAGE Loading
Buffer，充分涡旋混匀，煮沸10min后，12000rpm/min离心10min，除去大的蛋白质碎片，其上清可立即进行SDS-PAGE蛋白质电泳，结果见图3。
吸取含阳性重组质粒pCold-SUMO+CDTC的BL21(DE3)pLysS菌液进行一级培养后，按1:50比例接种于100mL含Amp（100µg/mL）的新鲜LB液体培养基中，37ºC振荡培养至OD600nm值为0.6，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，16ºC继续振荡培养24h；4 ºC 5000rpm/min离心10min收集菌体。弃上清，按每100mL培养基所得菌体加入10mL 磷酸盐缓冲液比例重悬菌体；将重悬菌液置于冰浴中超声波破碎20min，每超声3s间隔5s；4 ºC 5000rpm/min离心10min，分别收集沉淀和上清，沉淀以10mLddH2O重悬，取适量加入等量1×SDS-PAGE Loading
Buffer，上清则直接取适量加入等量的1×SDS-PAGE
Loading Buffer，分别涡旋混匀，煮沸10min后进行SDS-PAGE分析，结果表明表达蛋白是以包涵体形式表达，结果见4。
1.5副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白的纯化
收集的蛋白用Octave™ Ni-NTA SF Columns亲和层析柱进行纯化，具体步骤按照说明书进行操作，步骤如下：取重悬液8000rpm/min离心20min，收集沉淀，将沉淀用含1%Triton-100的PBS溶液悬浮，静置30 min，8000rpm/min离心20min，收集沉淀。重复步骤(1)两次。用含8M尿素的PBS溶液溶解沉淀，静置30min，8000rpm/min离心30min收集上清去除沉淀。取上清，按照亲和层析柱Octave™
Ni-NTA SF Columns的说明书进行过柱纯化。取上清，分别用含6M、4M、2M尿素以及不含尿素的PBS溶液样品进行透析去除尿素，取重悬液进行SDS-PAGE电泳，检测提取蛋白纯度。
二、副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白抗原特性及特异性鉴定
1. 副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白的Western-blotting分析
SDS-PAGE结束后，取出凝胶，按下列顺序制备聚丙烯酰胺凝胶-膜“三明治”：滤纸-凝胶-NC膜-滤纸。用干净的玻棒轻轻滚过凝胶-膜“三明治”，以消除各层之间的气泡。海绵垫和滤纸、NC膜预先在转移缓冲液中平衡10min。将固定好的凝胶-膜“三明治”转移至电转仪中，凝胶侧朝向负极，NC膜侧朝向正极，并接好冷却装置，200mA恒流转移1h。转移完毕后取下NC膜，进行如下操作：
封闭：将NC膜放入大小适当的玻璃平皿中，用5 %脱脂奶粉-TBST 4 °C封闭过夜；洗膜Ⅰ：弃去封闭液，用TBST缓慢振摇洗膜三次，每次5 min；加一抗：将副猪嗜血杆菌5型阳性血清（1：100倍稀释）加入TBST中，缓慢振摇2 h；洗膜Ⅱ：弃去一抗，用TBST缓慢振摇洗膜3次，每次5min；加二抗：将辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（1：2000倍稀释）加入TBST中，缓慢振摇0.5 h；洗膜Ⅲ：弃去二抗，用TBST缓慢振摇洗膜3次，每次5min；显色：称取12 mg DAB溶于20mL TBS中，过滤后加入60µL浓度为30 %的H2O2，将PVDF膜置于显色液中显色，待出现特异性反应条带后，立即浸入双蒸水中洗膜终止反应。用吸水纸吸干膜上水分，Western-blotting分析结果显示，pCold-SUMO+CDTC重组蛋白能被H.
parasuis Nagasaki阳性血清所识别，结果见图6。
2.间接ELISA检测表达蛋白抗原的特异性
分别将H. parasuis（血清5型）、李斯特氏杆菌、波氏杆菌、空肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌，志贺氏菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、胸膜肺炎放线菌、巴氏杆菌注入豚鼠腹腔，1×108 CFU/只（巴氏杆菌为104
CFU/只），1周后采血分离血清，用HRP标记山羊抗鼠免疫球蛋白作为检测抗体，取纯化重组 CDT-C蛋白，用碳酸盐缓冲液（pH9.6）调至15μg/mL，4 ℃包过夜→洗涤后1%明胶封闭, 37 ℃温育2 h→加入系列稀释待检血清，37 ℃ 温育1 h →加入HRP标记山羊抗鼠免疫球蛋白，37 ℃ 温育1 h→加入TMB底物溶液显色，15 min→用2 mol/ L浓 H2SO4 终止反应，用酶标仪测定其 OD490
nm 吸光值。以上各步骤均需PBS-Tween20洗涤三次。以P/N值≥2.1为阳性，判断重组CDT-C蛋白的抗原特异性。结果显示，H. parasuis
CDT-C蛋白抗原只与副猪嗜血杆菌杆菌的阳性血清发生交叉反应，而与胸膜肺炎放线菌、志贺氏菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、李斯特氏杆菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌和波氏杆菌的阳性血清无交叉反应(表1)。
表1间接ELISA检测CDT-C抗原的特异性
Table 1 Recombinant CDT-C antigenic specificity detected by indirect ELISA
| 菌种 | P/N值 | 交叉反应 |
| 猪副嗜血杆菌HPS | 4.247 | + |
| 支气管败血波氏杆菌BB | 0.567 | － |
| 金黄色葡萄球菌SA | 0.831 | － |
| 空肠弯曲杆菌C. jejuni | 0.797 | － |
| 大肠杆菌E.coli | 0.961 | － |
| 巴氏杆菌 PM | 0.625 | － |
| 李斯特氏杆菌LM | 1.018 | － |
| 流感嗜血杆菌HI | 0.237 | － |
| 胸膜肺炎放线菌APP | 1.003 | － |
| 沙门氏菌Salmonella | 0.795 | － |
| 志贺氏菌Shigella | 0.428 | － |
Cutoff: P/N≥2.1，+：有交叉反应，－：无交叉反应
实施例2
检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒的研制
1. 副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒抗原的表达、提取、纯化、保存
取携带副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白的大肠杆菌生产用种子接种于LB液体培养基（含有100μg/mL氨苄西林钠），37 ℃培养过夜，按1：100的比例转种LB液体培养基（含有100μg/mL氨苄西林钠）中，37℃摇床振荡培养至OD600nm值达到0.6左右时，加入终浓度为0.5mM IPTG于菌液中，置摇床中16℃诱导表达24h，收集菌液，在-70度与37度反复冻融3次，然后超声破碎（300W，工作5 s，间隔10 s）70次。收集的蛋白用Octave™ Ni-NTA SF Columns亲和层析柱进行纯化。纯化蛋白置于-70℃保存。
2．抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
采取方阵滴定法来确定，取酶标板（8排×12列），横排用包被缓冲液将CDTC重组蛋白按照1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL进行稀释，100μL/孔加入酶标板中进行包被，4℃包被过夜，用PBST洗涤3次，150μL/孔加入封闭液，37℃温箱作用1h，PBST洗涤1次；1~6列将制备好的阳性血清从1:10、1:20、1:50、1:100、1: 200、1: 400进行梯度稀释，7~12列将制备好的阴性血清从1:10、1:20、1:50、1:100、1: 200、1: 400进行梯度稀释。以阴性血清OD450 nm值低于0.2，阳性OD450 nm值/阴性OD450 nm值（P/N值）最大的孔所对应抗原稀释度和血清稀释度为最佳抗原稀释度和血清稀释度。结果见表2。
表2 抗原和血清最适工作浓度的确定
从表中可以看出，当抗原稀释度为5μg/mL和血清稀释度为1:20时，其P/N值最大，达33.05，所以抗原最佳包被浓度为5μg/mL，待检血清最佳稀释度为1:20。
3．封闭液的选择
分别以含10%脱脂奶、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液，1%明胶、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液，含2%牛血清白蛋白（BSA）、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液，5%
BSA、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液作为封闭液，抗原包被浓度为5μg/mL，血清稀释度为1:20，按2.1的方法进行ELISA检测，比较使用不同封闭液后的 P/N值。在确定了抗原和血清稀释度后，分别用四种缓冲液进行了封闭液的比较，对比显示10%脱脂奶作为封闭液效果比较好，其P/N值最大，见表3。
表3 封闭液的选择
| 稀释液的种类 | 阳性血清OD450nm值(P) | 阴性血清OD450nm值(N) | P/N |
| 1%明胶、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液 | 1.980 | 0.063 | 31.28 |
| 2%BSA、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液 | 2.120 | 0.067 | 31.88 |
| 5%BSA、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液 | 2.078 | 0.063 | 33.14 |
| 10%脱脂奶、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液 | 1.981 | 0.056 | 35.63 |
4．不同样品稀释液的比较
分别采用下列三种溶液作为稀释液，即：(1)含1%BSA、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液，(2)含0.05%BSA、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液，(3)含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液，按2.1的方法进行检测，比较使用不同稀释液后的P/N值。待检血清分别用三种稀释液进行稀释，试验结果显示含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液效果比较好，其P/N值最大，见表4。
表4 样品稀释液的选择
| 稀释液的种类 | 阳性血清OD450nm值(P) | 阴性血清OD450nm值(N) | P/N |
| 1%BSA、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液 | 2.194 | 0.072 | 30.47 |
| 0.5%BSA、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液 | 1.889 | 0.063 | 29.98 |
| 0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液 | 1.979 | 0.058 | 34.12 |
5．血清最佳反应时间的确定
加入血清之后，分别在37℃作用15min、30min、45min、60min，按2.1的方法进行检测，选择血清最佳的反应时间。结果表明反应30min，检测的效果最好，其P/N值最大，因而确定最佳反应时间为30min，见表5。
表5 血清最佳反应时间的确定
| 反应时间 | 阳性血清OD450nm值(P) | 阴性血清OD450nm值(N) | P/N |
| 15min | 1.825 | 0.056 | 32.59 |
| 30min | 2.054 | 0.060 | 34.23 |
| 45min | 2.259 | 0.068 | 33.22 |
| 60min | 2.354 | 0.085 | 27.69 |
6．酶标二抗工作浓度的确定
将HRP标记的兔抗猪的IgG稀释至1:1000、1:1500、1:2000，应用2.2筛选出的抗原和血清工作浓度来优化酶标二抗的工作浓度。ELISA结果表明，酶标二抗最佳稀释度为1:1500，见表6。
表6 酶标二抗最佳稀释度的确定
| 酶标二抗稀释度 | 阳性血清OD450nm值(P) | 阴性血清OD450nm值(N) | P/N |
| 1 :1000 | 1.813 | 0.068 | 26.86 |
| 1 :1500 | 2.012 | 0.064 | 31.39 |
| 1 :2000 | 1.568 | 0.063 | 24.85 |
7．酶标二抗最佳反应时间的确定
将酶标二抗在37℃作用15min、30min、45min、60min，按2.1的方法进行检测，比较二抗不同反应时间的P/N值。结果表明(表7)随着反应时间的延长，无论是阳性对照血清还是阴性对照血清的OD值都逐渐升高，但是，在反应30min后，阳性血清和阴性血清OD值之间比值最大，因而确定酶标二抗的最佳反应时间为30min。
表7 酶标二抗最佳反应时间的确定
| 反应时间 | 阳性血清OD450nm值(P) | 阴性血清OD450nm值(N) | P/N |
| 15min | 1.725 | 0.069 | 25.00 |
| 30min | 2.086 | 0.077 | 27.09 |
| 45min | 2.434 | 0.098 | 24.84 |
| 60min | 2.510 | 0.101 | 24.85 |
8．底物最佳反应时间
加入底物后室温下分别反映5min、10min、15min及30min，用酶标仪测定，比较底物不同反应时间后的P/N值。结果表明(表8)加入底物15min后，阳性对照血清OD值升高，而阴性OD值升高，反应时间15min时的P/N值最大，因此底物的最佳反应时间确定为15min。
表8 酶标二抗最佳反应时间的确定
| 反应时间 | 阳性血清OD450nm值(P) | 阴性血清OD450nm值(N) | P/N |
| 5min | 1.416 | 0.046 | 30.78 |
| 10min | 1.770 | 0.054 | 32.78 |
| 15min | 2.002 | 0.058 | 34.52 |
| 30min | 2.110 | 0.098 | 21.53 |
9．间接ELISA制备和操作流程
（1）抗原包被：将CDTC重组蛋白浓度为5μg/mL抗原，以100μL/孔的量加入酶标板中，4℃包被过夜，用PBST洗涤3次。
（2）加封闭液：用10%脱脂奶粉封闭酶标板，150μL/孔，37℃温箱作用1h，PBST洗涤1次。
（3）洗板：加洗涤液200~300μL/孔，每次静置3min后甩干孔中液体，洗涤3次。
（4）加保护剂：150μL/孔，37℃作用1h。
（5）干燥：甩干保护剂，37℃干燥1h。
（6）加入待检血清：每孔加入100μL 1:20稀释的待检血清，37℃温育30min后弃去孔中血清。每孔加入200~300μL洗涤液，每次静置3min甩干孔中液体，共洗板4次。
（7）加入酶标二抗：每孔加入100μL的酶标二抗，37℃温育30min后弃去孔中液体。每孔加入200~300μL洗涤液，每次静置3min甩干孔中液体，共洗板5次。
（8）加入底物：每孔加入100μL显色液，室温（20~25）℃避光显示15min。
（9）加终止液：每孔加终止液50μL终止反应。
10. 副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒特异性研究
用按照以上方法试制的3批试剂盒检测经荷兰BioChek副猪嗜血杆菌抗体检测试剂盒验证为阴性的30份猪血清，以及猪多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、胸膜放线杆菌的阳性血清、阴性质控血清R1-R5，结果均为阴性。这些结果说明副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒的特异性良好，结果见表9-11。
表9 特异性血清检测结果
| 检测血清 | 平板凝集结果 | 副猪嗜血杆菌抗体检测试剂盒结果 |
| 猪多杀性巴氏杆菌 | + | 0.245（-） |
| 大肠杆菌 | + | 0.138（-） |
| 胸膜放线杆菌 | + | 0.227（-） |
注：阳性对照的平均值=0.823；阴性对照的平均值=0.119，S/P= (待检样品的平均值-阴性对照的平均值)/(阳性对照的平均值-阴性对照的平均值)样品S/P值大于等于0.5判为是阳性。
表10 三批试制的试剂盒检测5种常见传染病的阳性血清结果(OD450nm值)
注：1、本批试剂盒阳性对照平均值（P）= 2.184，阴性对照平均值（N）= 0.068 。判定标准为：阴性 S/P值<0.200，则判定为阴性；阳性 S/P值≥0.200，则判定为阳性。S/P的计算公式：S/P值=（待测样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）/（阳性样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）。
表11 三批试制试剂盒检测30份副猪嗜血杆菌阴性血清结果（OD450nm值）
注：1、本批试剂盒阳性对照平均值（P）= 2.100 ，阴性对照平均值（N）=0.0658 。
判定标准为：阴性 S/P值<0.200，则判定为阴性；阳性 S/P值≥0.200，则判定为阳性。S/P的计算公式：S/P值=（待测样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）/（阳性样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）。
2、“（-）”表示检测结果为阴性。
11. 副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒敏感性研究
取5份阳性血清按照1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640进行稀释，分别用3批次副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒、平板凝集以及荷兰BIOCH
EK生产的副猪嗜血杆菌抗体ELISA检测试剂盒进行检测，结果发现平板凝集检测的阳性血清效价在1:40，实验室试制的试剂盒检测的血清效价为1:160~1:320，荷兰BioChek生产的试剂盒检测的血清效价为1:160，结果见表12-16。取30份临床阳性样本（平板凝集检测为阳性），分别用3批次副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒和荷兰BioChek生产的副猪嗜血杆菌抗体ELISA检测试剂盒进行检测，结果显示二者的检出率均为100%，结果见表17。
表12 2012001批试剂盒检测结果（OD450nm值）
注：1、本批试剂盒阳性对照平均值（P）= 2.254 ，阴性对照平均值（N）=0.067 。
判定标准为：阴性 S/P值<0.200，则判定为阴性；阳性 S/P值≥0.200，则判定为阳性。S/P的计算公式：S/P值=（待测样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）/（阳性样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）。
2、“（+）”表示检测结果为阳性，“（-）”表示检测结果为阴性。
表13 2012002批试剂盒检测结果（OD450nm值）
注：1、本批试剂盒阳性对照平均值（P）= 2.294 ，阴性对照平均值（N）=0.0574。
判定标准为：阴性 S/P值<0.200，则判定为阴性；阳性 S/P值≥0.200，则判定为阳性。S/P的计算公式：S/P值=（待测样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）/（阳性样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）。
2、“（+）”表示检测结果为阳性，“（-）”表示检测结果为阴性。
表14 2012003批试剂盒检测结果（OD450nm值）
注：1、本批试剂盒阳性对照平均值（P）= 2.164 ，阴性对照平均值（N）=0.0542。
判定标准为：阴性 S/P值<0.200，则判定为阴性；阳性 S/P值≥0.200，则判定为阳性。S/P的计算公式：S/P值=（待测样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）/（阳性样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）。
2、“（+）”表示检测结果为阳性，“（-）”表示检测结果为阴性。
表15 平板凝集方法检测5份阳性参考血清的结果
注： “（+）”表示检测结果为阳性，“（-）”表示检测结果为阴性。
表16 荷兰BioChek的试剂盒检测5份阳性质控血清的结果
注：1、阳性对照的平均值=0.858；阴性对照的平均值=0.129
S/P= (待检样品的平均值-阴性对照的平均值)/(阳性对照的平均值-阴性对照的平均值)样品S/P值大于等于0.5判为是阳性。
2、“（+）”表示检测结果为阳性，“（-）”表示检测结果为阴性。
表17 两种方法50份血清结果比较
注：“（+）”表示检测结果为阳性。
12. 副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒可重复性研究
用试制的副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒分别检测已知背景血清30份，其中阴性血清10份，强阳性血清10份，弱阳性血清10份。用3批试剂盒，每批用5个试剂盒，对以上30份血清样本进行4次重复检测，计算4次重复平均值，得出批内变异系数在1.08%~ 8.45%之间；批间变异系数在1.09%~8.76%之间。实验表明该试剂盒的重复性良好。
12.1 批内可重复性试验
使用三批试剂盒分别检测30份血清，见表18-20。结果显示批内变异系数在1.08%~ 8.45%之间，说明该试剂盒的批内重复性良好。
表18 三批试剂盒检测10份强阳性样品4次重复的平均OD450nm值
表19 三批试剂盒检测10份弱阳性样品4次重复的平均OD450nm值
表20 三批试剂盒检测10份阴性样品4次重复的平均OD450nm值
12.2 批间可重复性试验
使用3个不同批次试剂盒检测30份血清。检测结果试剂盒批间变异系数在
1.42%~9.07%之间（见表21-23），表明该试剂盒的能进行较好的批次间重复。
表21 三批试剂盒检测10份强阳性样品的平均值
表22 三批试剂盒检测10份弱阳性样品OD450nm值
表23 三批试剂盒检测10份阴性样品OD450nm值
13.与已批准上市销售的同类诊断制品的临床应用比较试验
目前我国国内没有副猪嗜血杆菌抗体ELISA检测试剂盒上市，国外的同类产品有荷兰BioChek 公司生产的副猪嗜血杆菌OppA-抗体ELISA检测试剂盒和加拿大Biovet公司产的副猪嗜血杆菌抗体ELISA检测试剂盒，但都存在价格较高，且货期较长的缺点，不利于大量的推广和基层地区的应用。我们将自己试制的试剂盒与荷兰BioChek
公司生产的试剂盒进行了比较，检测200份临床猪血清，用试制的副猪嗜血杆菌抗体ELISA检测试剂盒检测200份血清，结果阳性率为81.50 %（163/200），阴性率为18.50%（37/200）；用荷兰BioChek 公司生产的试剂盒检测的阳性率为73.50%（147/200），阴性率为26.50%（53/200）；两者阳性符合率为90.18%(147/163)，阴性符合率为69.81%（37/53）,总符合率为92%(184/200)。
上述实施例子为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例子的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化等均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南民族大学
<120> 一种检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒
<160> 2
<210> 1
<211> 176
<212> PRT
<213> Haemphilus
parasuis
<400> 1
Met Leu Lys Arg Phe Thr Leu
Leu Met Thr Leu Gly Val Cys
Gln Phe
1
5
10
15
Ser Leu Ala Glu Thr Pro Pro Met Pro Pro Ala Pro Thr Pro Thr Pro
20
25
30
Ser Thr Tyr Pro Asp Val Val
Glu Ile Lys Pro Pro Val Ile
Ser Leu
35
40
45
Arg Ser Leu
Asn Thr Gly
Glu Pro Val Ser Asn Arg Ser Tyr Asp Arg
50
55
60
Asn Asp Pro Arg
Glu Val Gln Trp Arg Leu
Val Asp Val Ile Val Lys
65
70
75
80
Asn Arg Arg Phe Val Gln
Phe Lys Val Phe Asp Lys Glu Asp Arg Cys
85
90
95
Leu Val Gly
Asp Gly Gly Thr Leu Pro Cys
Gly Gln Thr
Asp Thr Leu
100
105
110
Phe Arg Leu Val Pro Thr Asp Thr Gly Ala Phe
Ile Leu Thr Asp Pro
115
120
125
Asn Thr Gly Lys Cys Leu
Thr Ser Glu Asn Tyr Gly Ser Tyr Gly Phe
130
135
140
Gln Asn Cys Leu Arg
Thr Ser Ser Ala Glu Pro Ser Asn Ile Pro Leu
145
150
155
160
Lys His Leu Trp Ile Ile Ala Pro Pro Phe Gly Pro Ser Arg Leu Leu
165
170
175
<210> 2
<211> 531
<212> DNA
<213> Haemphilus
parasuis
<400> 2
atgttaaagc gttttacttt attgatgaca ttaggactat gccagttttc ccttgcagaa 60
acaccaccga tgccacctgc acctaggcca acaccatcaa cttatcctga tgttgttgaa 120
ataaagcccc ctattatctc tttacgcagt ttaaatacgg gggagccagt atctaatcgg 180
agctacgatc ggaatgatcc aagagaggtg cagtggagac ttgtcgatgc tattgttaaa 240
aatcgtcggt tcgtacaatt taaagtagtt gataaagaag agcgttgctt ggttggagat 300
ggtggtactt taccctgtga acaaaaagac actttattta ggttagtccc aaccgacacg 360
ggagcattta ttctgacaga acccaacaca ggaaaatgtt taaccagcga gaattatggc 420
agttatggtt ttcaaaactg cttacggact tcttcagcag aacctagcaa tattccgtta 480
aaacatcttt ggattattgc tccgcctttt ggacctagta ggttattata a 531
Claims (7)
1.一种检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：该试剂盒是将副猪嗜血杆菌的细胞致死性膨胀毒素(Cytolethal distending toxin，CDT) C蛋白作为包被抗原；判断标准为：S/P值=（待测样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）/（阳性样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）<0.200，判为阴性，≥0.200，判为阳性。
2.根据权利要求1所述检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒，其特点在于：包被抗原副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白的氨基酸序列如SEQ
ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒，其特点在于：包被抗原副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白是通过基因工程方法表达得到，具体如下：
将核苷酸序列如SEQ ID
NO.2 所示的副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白核苷酸序列克隆于大肠杆菌表达载体pcold-sumo中，得到pcold-sumo+CDTC质粒。
4.根据表达载体pcold-sumo的操作说明，将pcold-sumo+CDTC质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)PlysS感受态细胞，进行表达、鉴定、纯化，得到副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白。
5.根据权利要求3所述检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒，其特点在于：所述的步骤（2）为：将携带pcold-sumo+CDTC质粒的大肠杆菌BL21(DE3)PlysS接种于含有氨苄的LB液体培养基中，在37℃环境下振荡培养，待菌液的OD600吸光值达到0.6是加入0.5mM的IPTG，在摇床中16℃诱导24h进行表达，收集菌体反复冻融3次后超声破碎300W，工作5s，间隔10s，70次，破碎菌液用HIS标签的纯化柱进行纯化，纯化后通过尿素进行透析复性，获得副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白。
6.根据权利要求1所述检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒，其特点在于：所述试剂盒中副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白的最佳包被浓度为5μg/mL。
7.实现权利要求1-5任一项所述检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA试剂盒，包含待检样品稀释板、阳性对照血清、阴性对照血清、浓缩洗涤液、血清样本稀释液、酶标抗体工作液、显色液和终止液，其特征在于：所用的包被抗原为副猪嗜血杆菌CDT-C蛋白。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20160127 |