CN103288933A - 一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原CdtC - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原的鉴定、蛋白基因的分离、克隆以及它编码的蛋白在疫苗中的应用。本发明从副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)(菌种保藏编号：CVCC3361)中分离得到一个新的具有免疫原性的蛋白CdtC，它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，编码176个氨基酸。CdtC为一种新的具有免疫原性蛋白，其对小鼠感染副猪嗜血杆菌能提供有效的免疫保护力。本发明还包括表达免疫原性蛋白基因CdtC的大肠杆菌重组菌BL21/Hps-CdtC的制备。本发明表达的重组副猪嗜血杆菌CdtC蛋白具有良好的安全性和保护效力，其免疫保护效果达到60％。

Description

一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原CdtC

技术领域

本发明涉及动物传染病亚单位疫苗制备技术领域。具体涉及一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原的鉴定、蛋白基因的分离、克隆以及它编码的蛋白在疫苗中的应用。

背景技术

细胞致死膨胀毒素是细菌蛋白毒素家族最新发现的一员，最早发现于大肠杆菌的培养液上清中，体外作用于中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamsterovary cells，CHO)能够导致靶细胞膨胀和死亡，因此该毒素被命名为“细胞致死膨胀毒素”。目前，CDT是细菌毒素中唯一具有DNA酶(DNase I)活性的毒素，具有遗传毒害作用，导致DNA双链断裂，在哺乳动物细胞中引起不可逆的细胞周期阻滞和凋亡。

现已证实多种革兰氏阴性致病菌，均可产生该毒素。晶体结构研究表明CDT全毒素是由CdtA、CdtB和CdtC构成的三聚体复合物，三个亚基分别由cdtA、cdtB、cdtC基因编码。

研究发现细胞致死膨胀毒素作用于真核细胞，培养72-96h后吉姆萨染色发现能够使细胞发生膨胀；作用细胞72h后发现相较于对照组，实验组细胞数目变化不明显，试验证实该毒素能使细胞循环周期停滞在G2/M期；通过显微注射技术将CDTs全毒素注射到细胞内，发现DNA双链断裂，表明该毒素具有DNA酶活性。成纤维细胞、上皮细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和树突状细胞在CDTs的作用下，不会发生细胞膨胀和循环周期的阻滞，而是直接导致凋亡和裂解成细胞碎片。研究认为CdtB亚基是CDT全毒素的保守亚基，也是功能亚基，具有和DNase I相似的结构和功能，该亚基体外处理质粒DNA，能够导致DNA的线性化，将CdtB显微注射到细胞，发现该亚基不仅能够导致靶细胞的膨胀和细胞循环周期的阻滞，而且能够导致靶细胞DNA双链的断裂，这就说明CdtB的靶目标是DNA。CdtB亚基的DNA酶活性是CDT全毒素发挥细胞毒性作用的关键，CdtA和CdtC没有类似DNase的活性，不能导致靶细胞的膨胀和凋亡，二者的主要作用是结合于细胞膜表面，促进CdtB进入细胞核发挥其细胞毒性作用，但是它们是怎样发挥作用的以及完成使命后它们的去向如何仍不清楚。

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)是一种革兰氏阴性菌，常定居于猪的上呼吸道，是一种条件致病菌，能够导致猪的副猪嗜血杆菌病。

在1910年首次报道该菌，因此该病又称为革拉瑟氏病(disease)。Hps只感染猪，能够影响2周龄到4月龄的猪，发病常见于5～8周龄猪。发病率为10％～15％，严重时死亡率可达50％，给养猪业带来巨大损失，该病的主要特征为纤维素性胸膜炎、腹膜炎、关节炎、心包炎和脑膜炎。

本研究通过克隆、表达编码CdtC的基因，并将纯化后的蛋白免疫小鼠，发现其对小鼠感染副猪嗜血杆菌能提供有效的免疫保护力，可以作为副猪嗜血杆菌亚单位疫苗开发的候选抗原。

发明内容

本发明的目的是提供能够用于制备副猪嗜血杆菌亚单位疫苗的候选抗原的蛋白及其编码基因。

本发明鉴定到具有免疫保护效果的CdtC蛋白，并对小鼠感染副猪嗜血杆菌能提供有效的免疫保护力，可以作为副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗开发的候选抗原。

为了实现本发明目的，本发明首先克隆了副猪嗜血杆菌的CdtC基因，然后将该基因连接于表达载体中重组表达CdtC蛋白，使用猪的康复血清对纯化后的蛋白进行western-blot杂交发现其具有免疫原性，将表达的蛋白纯化后进行小鼠的免疫保护试验，结果表明其具有一定的免疫保护作用。

本发明同时保护一种制备CdtC蛋白的方法，所述方法包括培养含有CdtC蛋白编码序列的重组大肠杆菌，得到CdtC蛋白。所述制备CdtC蛋白的方法具体可为：将所述重组菌37℃培养3h，OD₆₀₀＝0.7时，加入IPTG至终浓度0.8μM，转至37℃继续培养4h。

本发明的CdtC蛋白具有免疫保护活性。

本发明的CdtC蛋白可以应用于副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗的制备。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码根据1所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原的核酸，其序列如SEQ ID NO：2所示。

3.重组载体，其包含根据2所述的核酸。

4.包含根据2所述的核酸或根据3所述的重组载体的细胞。

5.根据1所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原，其用作副猪嗜血杆菌亚单位疫苗。

6.根据1所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原、根据2所述的核酸、根据3所述的重组载体和根据4所述的细胞在制备副猪嗜血杆菌亚单位疫苗中的用途。

7.根据1所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原、根据2所述的核酸、根据3所述的重组载体和根据4所述的细胞在制备用于预防由副猪嗜血杆菌引起的疾病的药物中的用途。

8.根据7所述的用途，其中所述由副猪嗜血杆菌引起的疾病是副猪嗜血杆菌病。

9.疫苗组合物，其包含根据1所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原。

10.一种制备副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原的方法，所述方法包括以下步骤：

构建包含如SEQ ID NO：2所示的核酸序列的重组表达载体；

将所述重组表达载体转化到宿主细胞中；

培养所述经转化的宿主细胞并诱导其表达所述副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原；和

从所述经过诱导的宿主细胞分离和纯化所述副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原。

11.根据10所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

附图说明

图1：CdtC转膜后杂交图。

图2：CdtC免疫后攻毒小鼠存活率图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、CdtC蛋白编码基因的克隆

一、Hps总DNA的提取

将1mL副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)(购自国家兽医微生物菌种保藏中心，菌种编号：CVCC3361)的过夜培养菌液12000rpm离心1分钟，弃上清。在菌体沉淀中加入40μL DB液(TIANamp BacteriaDNA Kit，天根生物有限公司)，160μL溶菌酶和8μL RNaseA。剧烈震荡，混合均匀。37℃温浴30～60分钟，不断颠倒离心管数次。加入200μL DLT液(TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生物有限公司)和25μL蛋白酶K(TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生物有限公司)，立即温和地颠倒混匀。置65℃水浴中至少30分钟，不断颠倒离心管数次。12000rpm离心3～5分钟，用移液器吸取全部上清到一个干净的离心管中。加入200μL无水乙醇，混匀后全部吸入吸附柱，12000rpm，离心30秒。倒掉收集管中的液体，放回吸附柱。加入500μL W1液(TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生物有限公司)，静置1分钟，12000rpm，离心30秒。倒掉收集管中的液体，放回吸附柱。加入500μL W1液，12000rpm，离心30秒。倒掉收集管内的液体，放回吸附柱。12000rpm，离心1分钟。将吸附柱放入一个1.5mL离心管。在吸附膜中央加入100μL T1液(TIANamp Bacteria DNAKit，天根生物有限公司)，65℃水浴5分钟，12000rpm离心1分钟。

二、CdtC基因的制备

根据CdtC基因的核苷酸序列(如序列表的SEQ ID NO：2所示)，设计引物对如下：

正向引物：5’-ACCCATATGCTAAAGCGTTTT-3’

反向引物：5’-GCGGGATCCTTATAATAACCTACT-3’

正向引物的下划线部分为NdeI的酶切位点，反向引物的下划线部分为BamHI酶切位点。

以Hps的总DNA为模板，用设计的引物对进行PCR扩增。

扩增体系：

PCR反应条件：94℃预变性5分钟，然后94℃变性30秒-52℃退火30秒-72℃延伸45秒30个循环，最后72℃延伸7分钟。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒(超薄离心柱型，天根公司生产)纯化。将纯化的PCR产物进行测序，结果表明获得了序列为序列表1的DNA片段，为编码副猪嗜血杆菌CdtC蛋白的基因。

三、重组表达载体的构建

1、将测序正确的PCR产物用NdeI和BamHI双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

2、将质粒pET28a(货号69864-3，Novagen)用BamHI和NdeI双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

3、将步骤1的酶切产物和步骤2的酶切产物进行连接，得到重组质粒。

将重组质粒进行测序。结果表明，在pET28a的BamHI和NdeI酶切位点之间插入了序列为序列表2所示的编码副猪嗜血杆菌CdtC蛋白的基因，将该重组质粒命名为pET28a-CdtC。

四、工程菌的制备

用pET28a-CdtC电击转化大肠杆菌BL21(DE3)(货号CB105，TIANGEN)后涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，得到含有pET28a-CdtC的重组菌，即为工程菌。

用pET28a代替pET28a-CdtC，转化大肠杆菌BL21(DE3)，步骤同上，得到含有pET28a的重组菌，作为对照菌。

实施例2、CdtC蛋白的表达纯化

一、CdtC蛋白的制备和纯化

将实施例1(四)中制备的工程菌培养于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3h；OD₆₀₀＝0.7时，加入IPTG至终浓度0.8μM，转至37℃继续培养4h。

5000rpm、10分钟离心收集菌体，悬浮于PBS中溶液中，于冰浴中超声破碎(300w，10分钟；超声3s，停止5s)，之后15000rpm离心10分钟收集沉淀，将沉淀用30ml溶液A(NaH₂PO₄ 100mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、尿素8mol/L调pH到8.0)溶解，可以短暂超声破碎促溶。加入2mL事先处理好的树脂(Ni-NTA His-Bind Resin，Novagen)，4℃低速振荡30分钟使树脂与目的蛋白充分结合，结合完毕，加入吸附柱中。待液体流尽，加入10mL溶液B(NaH₂PO₄ 100mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、尿素8mol/L，调pH到6.3)洗6次。加入2mL溶液C(NaH₂PO₄ 100mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、尿素8mol/L，调pH到5.9)洗1次。加入10mL溶液D(NaH₂PO₄ 100mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、尿素8mol/L，调pH到4.5)，按每管1mL收集洗脱液。

SDS-PAGE电泳显示纯化的CdtC蛋白的分子量约为25kDa(包含组氨酸标签)，基本符合理论推断。收集含有CdtC蛋白的级分。

将实施例1(四)中制备的对照菌采用相同的步骤进行培养和纯化，得到的溶液作为对照酶液。

二、CdtC蛋白的蛋白印迹法鉴定

对以上一中纯化的重组CdtC蛋白进行蛋白印迹法分析，首先制备12％的聚丙稀酰胺凝胶，将CdtC蛋白上样进行SDS-PAGE；电泳结束后，把凝胶浸泡在电泳液(39mM甘氨酸、48mM Tris碱、0.037％SDS、20％甲醇)中平衡15min；剪裁比凝胶稍大的硝酸纤维素膜，放置于电泳液浸泡至完全湿润；剪裁两张厚滤纸，上层滤纸稍小于凝胶，下层滤纸要稍微大于硝酸纤维素膜，并浸泡在电泳液中至完全湿润；按照滤纸-膜-胶-滤纸的顺序加到石墨电极上，用玻璃棒赶走气泡；接通电源，15v恒压，转印30min。转印结束后取下硝酸纤维素膜；将膜装入小的自封袋中，加入5％脱脂乳4℃封闭过夜；取出膜，用PBST洗5次，每次10min；然后加入5％脱脂乳1∶200稀释的一抗(猪康复血清)，37℃孵育1h；取出膜，用PBST洗5次，每次10min；然后加入5％脱脂乳1∶5000稀释的二抗(HRP标记的兔抗猪二抗)，37℃孵育1h；取出膜，用PBST再洗5次，每次10min；然后用ECL化学发光试剂盒显色，结果表明CdtC蛋白与预期的蛋白条带大小一致，如图1所示。

实施例3、CdtC蛋白免疫保护性的鉴定

1、Hps对昆明小鼠LD₅₀的测定

将Hps(购自国家兽医微生物菌种保藏中心，菌种编号：CVCC3361)接种于TSB液体培养基(含10％马血清，0.01％NAD)37℃200rpm/min培养14～16小时，然后次日涂布TSA固体培养基(含10％马血清，0.01％NAD)37℃培养24～36h。用PBS洗下菌苔，稀释到5×10⁸CFU/mL(OD₆₀₀约为1.0)，然后2倍逐级浓缩，浓缩至所需剂量(如表1中所示)后向小鼠注射。将8～10周龄雌性昆明小鼠(购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心)分为5组，每组10只。每只小鼠腹腔注射100μL的攻毒物，攻毒后连续观察5天，纪录各组死亡情况。按照寇氏公式计算LD₅₀。公式如下：

LD₅₀＝lg^-1{Xm-i〔∑P-(3-Pm-Pn)/4〕}

Xm：最大剂量组剂量的对数值

i：相邻两组剂量(d)对数值之差

∑P：各组动物死亡率之总和

P：各组动物死亡率，用小数表示

Pm：最高剂量组动物死亡率，用小数表示

Pn：最小剂量组动物死亡率，用小数表示

n：每组动物数

攻毒5天后，第5组死亡10只，第1组死亡2只。具体的各组死亡率如下表所示。

表1

通过寇氏公式计算得出LD₅₀＝1.46×10⁹CFU。

2、小鼠的免疫与攻毒

用根据实施例2纯化的CdtC蛋白抗原免疫4～6周龄的昆明小鼠(购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心)，每组10只。对照组不进行免疫。第一次免疫，100μg/只，与福氏完全佐剂1∶1混合，背部多点注射免疫小鼠。间隔两周后，进行第二次免疫，100μg/只，与福氏不完全佐剂1∶1混合，背部多点注射免疫小鼠，10天后，ELISA检测抗体水平，HRP标记的山羊抗鼠(Sigma)为二抗(1∶4000)，二免10天后经腹腔注射Hps(菌种保藏编号：CVCC3361)，攻毒剂量为以上测定的LD₅₀的5倍，观察5天内各组小鼠的死亡情况。如图2所示，CdtC免疫组有60％的存活率。

Claims (11)

1.一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原的核酸，其序列如SEQ ID NO：2所示。

3.重组载体，其包含根据权利要求2所述的核酸。

4.包含根据权利要求2所述的核酸或根据权利要求3所述的重组载体的细胞。

5.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原，其用作副猪嗜血杆菌亚单位疫苗。

6.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原、根据权利要求2所述的核酸、根据权利要求3所述的重组载体和根据权利要求4所述的细胞在制备副猪嗜血杆菌亚单位疫苗中的用途。

7.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原、根据权利要求2所述的核酸、根据权利要求3所述的重组载体和根据权利要求4所述的细胞在制备用于预防由副猪嗜血杆菌引起的疾病的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述由副猪嗜血杆菌引起的疾病是副猪嗜血杆菌病。

9.疫苗组合物，其包含根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原。

10.一种制备副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原的方法，所述方法包括以下步骤：

构建包含如SEQ ID NO：2所示的核酸序列的重组表达载体；

将所述重组表达载体转化到宿主细胞中；

培养所述经转化的宿主细胞并诱导其表达所述副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原；和

从所述经过诱导的宿主细胞分离和纯化所述副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

Images