CN103479996B - 一种副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗组合物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物，所述组合物包含七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-7所示。本发明从副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)（菌种保藏编号：CVCC 3361）中分离得到多个新的具有免疫原性的蛋白，包括HbpA、afuA、oppA、oppA2、D15、Hps06257和nqrA，它们的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8-14所示，分别编码531、346、545、513、417、263和448个氨基酸。这些基因的编码产物为新的具有免疫原性蛋白，其混合物对小鼠感染副猪嗜血杆菌能提供有效的免疫保护力。本发明表达的重组副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白的混合物具有良好的安全性和保护效力，其免疫保护效果达到80%。

Description

一种副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗组合物及应用

技术领域

本发明涉及动物传染病亚单位疫苗制备技术领域。具体涉及一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物及其制备方法和应用，所述组合物包含七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原。

背景技术

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）是一种革兰氏阴性菌，常定居于猪的上呼吸道，是一种条件致病菌，能够导致猪的副猪嗜血杆菌病。在1910年首次报道该菌，因此该病又称为革拉瑟氏病（disease）。Hps只感染猪，能够影响2周龄到4月龄的猪，发病常见于5～8周龄猪。发病率为10%～15%，严重时死亡率可达50%，给养猪业带来巨大损失，该病的主要特征为纤维素性胸膜炎、腹膜炎、关节炎、心包炎和脑膜炎。

蛋白质组学是一个旨在大规模、高通量、高效率地分离和鉴定构成生物体的蛋白质及其功能的新研究领域。因此蛋白质组学技术非常适用于免疫原及疫苗候选成分的筛选等方面的研究。疫苗是生物体抵抗病原微生物的有利武器，而具有保护作用的免疫原往往是理想的疫苗候选靶位。但传统研究方法存在低效、费时及不经济等诸多不利原因，使高效疫苗靶位的发现受到了一定程度限制。在这种情形下，免疫蛋白质组学(Immunoproteomic)随着蛋白质组学的出现也应运而生。免疫蛋白质组学将蛋白质组学技术鉴定蛋白质的高通量性与免疫学技术鉴定免疫原的可靠性有机地结合起来，在病原微生物、肿瘤免疫原和疫苗候选靶位的研究中占据着重要的地位，已经成为该研究领域中最具生命力的技术手段。

免疫蛋白质组学技术是一种有力的工具用于系统的鉴定病原的免疫原性蛋白，研究者们已经应用这项技术成功的从猪链球菌、炭疽芽苞杆菌、福氏志贺菌的亚组份结构中发现了新型抗原，如外膜蛋白。对于G^-病原菌而言，分泌蛋白和外膜蛋白直接参与病原菌在宿主体内的定植、粘附、侵入过程，因此在细菌的感染过程中，分泌和外膜蛋白直接与宿主的免疫系统相互作用，发挥重要的功能。所以从G^-菌的这些亚细胞组份中筛选重要的疫苗候选抗原是可行的。

本研究通过克隆、表达七种编码具有免疫蛋白的基因，并将纯化后的蛋白混合后免疫小鼠，发现其对小鼠感染副猪嗜血杆菌能提供有效的免疫保护力，可以作为副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗开发的候选抗原。

发明内容

本发明的目的是提供能够用于制备副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗的候选抗原的蛋白及其编码基因。

本研究通过双向电泳和蛋白印迹法技术对副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，Hps)分泌蛋白质组进行分析，筛选出抗原性好、保护力强的抗原蛋白，以期为发展血清学诊断标记及新型亚单位疫苗的研发奠定坚实的基础。

本发明鉴定到具有免疫保护效果的七种蛋白，其混合物对小鼠感染副猪嗜血杆菌能提供有效的免疫保护力，可以作为副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗开发的候选抗原。

为了实现本发明目的，本发明首先分离副猪嗜血杆菌的胞外分泌蛋白，然后通过双向电泳方法分离分泌蛋白质组，并将其转移至硝酸纤维素膜上，使用猪的康复血清进行western-blot杂交寻找具有免疫原性的蛋白，然后通过质谱鉴定技术对具有免疫原性的蛋白进行质谱鉴定，再对其编码基因进行克隆表达，将表达的蛋白纯化后，再进行免疫原性分析，同时将七种蛋白混合后进行小鼠的免疫保护试验，结果表明其具有一定的免疫保护作用。

本发明同时保护一种制备七种蛋白的方法，所述方法包括培养含有蛋白编码序列的重组大肠杆菌，得到重组蛋白。所述制备重组蛋白的方法具体可为：将所述重组菌37℃培养3h，OD₆₀₀＝0.7时，加入IPTG至终浓度0.8μM，转至37℃继续培养4h。

本发明的重组蛋白具有免疫保护活性。

本发明的重组蛋白混合物可以应用于副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗的制备。

更具体地，本发明提供以下各项：

附图说明

图1：左图为分泌蛋白的双向电泳分离图谱；右图为转膜后杂交图。

图2：七种蛋白转膜后杂交图。

图3-1：七种蛋白不同浓度混合免疫攻毒后小鼠存活率图。

图3-2：七种蛋白单独及100μg混合免疫攻毒后小鼠存活率图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、蛋白免疫原性的发现

一、分泌蛋白样品的制备

从-70℃冰箱取出Hps菌株，室温融化，然后划线接种于TSA(Becton,Dickinson and Company)固体培养基(含10%的马血清，0.01%的NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸))，37℃培养36h，然后挑取单菌落接种于TSB(Becton,Dickinson and Company)液体培养基(不含马血清，含有0.02%的NAD)，37℃培养24h，然后以1%的菌液体积转接于500mL TSB液体培养基(不含马血清，含有0.02%的NAD)，37℃培养约16h小时，使菌液OD达到1.0。向细菌培养物加入蛋白酶抑制剂，4℃ 5000g离心1h。取上清，用0.22μm的滤膜把残留的Hps滤去。向滤液中加入1/6体积预冷的100%三氯乙酸(TCA)，4℃静止30分钟用于沉淀滤液中的蛋白，之后4℃ 12000g离心30分钟，收集沉淀，弃上清，然后用预冷的丙酮将沉淀洗涤三次，充分将TCA溶于丙酮中洗掉。最后得到的沉淀就是副猪嗜血杆菌的分泌蛋白，室温放置10分钟，使丙酮挥发完全，溶于适量裂解液(7M尿素，2M硫脲，4%Chaps)中。取出一小管进行蛋白浓度测定。

二、分泌蛋白样品的第一向等电聚焦(IEF)

取以上制备的分泌蛋白600μg用裂解液稀释至终体积250μL，用pH梯度为pH3～10的IPG胶条(Bio-Rad)进行等电聚焦，设置聚焦参数为：温度20℃；最大电流0.05mA/胶条，聚焦程序为：30V，12h；200V，1h；500V，1h；1000V，2h；7000V，3h；7000V至50000Vh。

三、分泌蛋白样品的第二向SDS-PAGE电泳

用去离子水小心冲洗聚焦好的胶条上的覆盖油，然后进行平衡。第一次平衡：将胶条置于平衡缓冲液Ⅰ(含6M尿素，75mMTris-HCl pH8.8，87%甘油，2% SDS，0.2%溴酚蓝，0.1g DTT/10mL)中，水平摇床上室温孵育10分钟；用去离子水冲洗胶条4～5次。第二次平衡：将胶条置于平衡缓冲液Ⅱ(含6M尿素，75mMTris-HCl pH8.8，87%甘油，2% SDS，0.2%溴酚蓝，0.25g IAA/10mL)中，水平摇床上孵育15分钟。用配好的1×SDS凝胶缓冲液润洗平衡好的胶条。将覆盖在丙稀酰胺凝胶上的水饱和正丁醇倒掉，并用去离子水小心冲洗凝胶表面。将平衡好的胶条小心放入凝胶的上层，立即加入融化了的0.5%的低熔点琼脂糖固定IPG胶条，避免在胶条和凝胶之间产生气泡。在电泳槽里加入电泳缓冲液，将凝胶玻璃板放入，加入上层缓冲液，然后盖上盖，设置温度12.5℃，电流10mA/胶开始电泳。电泳1h后，电流改为20mA/胶，直到溴酚蓝条带跑到凝胶最下端停止电泳。小心取出凝胶，进行染色。

四、分泌蛋白样品SDS-PAGE胶染色

1.固定：将电泳后的凝胶放入固定液(40%乙醇，10%乙酸，50%去离子水)中，固定过夜。

2.敏化：将固定液倒掉，加入10%冰乙酸，水平摇床上轻摇30分钟。

3.染色：将凝胶放入R-250染色液中，90℃加热30分钟.

4.脱色：将染色液倒掉，加入10%冰乙酸，置于水平摇床上脱色，直到蛋白点清晰可见为止。

五、分泌蛋白样品的蛋白印迹法分析

将分泌蛋白样品的第二向SDS-PAGE胶按照常规的蛋白印迹法采用半干转方式进行转印。转印80分钟，按照0.8mA/cm²设定电流。转印结束后，PVDF膜(Pall Corparation)用丽春红染色，用针头标记若干个标记性的点，拍照保存。4℃封闭过夜，封闭液为5%的脱脂乳。PBST洗3次，每次10分钟。一抗为Hps猪康复血清(选取4-6周龄，ELISA抗体检测为阴性的健康仔猪，以5×10⁷CFU/mL Hps（CVCC3361）攻毒，饲养30天后，抽取存活仔猪的血液样品制备康复血清，实验室内分装、冻存)(1:200)，37℃孵育1h。PBST洗3次，每次10分钟。二抗为辣根过氧化酶HRP标记的兔抗猪二抗(Sigma)(1:5000)，37℃孵育1h。PBST洗3次，每次10分钟，最后化学发光显色试剂盒(天根生物有限公司)进行显色。根据事先的丽春红染色图片和针头标记的特征蛋白点，在对应的考马斯亮蓝染色的凝胶上找出对应的蛋白点。如图1，共找到9个发生免疫反应的蛋白。

六、质谱分析

将找出的蛋白点用剪过的200μL枪头戳取下来，然后放入干净的离心管，做好标记，送往北京蛋白质组研究中心进行质谱分析。经鉴定3号点为Heme-binding protein A(HbpA)，质量分数为394，分子量为59394Da。8号点为Iron(Fe³⁺)ABC superfamily ATP binding cassette transporter,binding protein（AfuA），质量分数为667，分子量为38595Da。5号点为Oligopeptide permease ABC transporter membrane protein（OppA），质量分数为574，分子量为60911Da。7号点为Oligopeptide permease ABCtransporter membrane protein（OppA2），质量分数为572，分子量为57851Da。6号点为Na-translocating NADH-quinone reductase subunit A(nqrA)，质量分数为175，分子量为48690Da。4号点为D15膜蛋白（D15），质量分数为687，分子量为46873Da。9号点为HPS06257，质量分数为257，分子量为27981Da。

实施例2、七种蛋白的表达

一、Hps总DNA的提取

将1mL Hps（CVCC 3361）的过夜培养菌液12000rpm离心1分钟，弃上清。在菌体沉淀中加入40μL DB液(TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生物有限公司)，160μL溶菌酶和8μL RNaseA。剧烈震荡，混合均匀。37℃温浴30～60分钟，不断颠倒离心管数次。加入200μL DLT液(TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生物有限公司)和25μL蛋白酶K(TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生物有限公司)，立即温和地颠倒混匀。置65℃水浴中至少30分钟，不断颠倒离心管数次。12000rpm离心3～5分钟，用移液器吸取全部上清到一个干净的离心管中。加入200μL无水乙醇，混匀后全部吸入吸附柱，12000rpm，离心30秒。倒掉收集管中的液体，放回吸附柱。加入500μL W1液(TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生物有限公司)，静置1分钟，12000rpm，离心30秒。倒掉收集管中的液体，放回吸附柱。加入500μL W1液，12000rpm，离心30秒。倒掉收集管内的液体，放回吸附柱。12000rpm，离心1分钟。将吸附柱放入一个1.5mL离心管。在吸附膜中央加入100μL T1液(TIANamp Bacteria DNAKit，天根生物有限公司)，65℃水浴5分钟，12000rpm离心1分钟。

二、七种蛋白编码基因的制备

根据7种蛋白编码基因的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:8-14所示)，设计引物对如下：

正反向引物的下划线部分为相应的酶切位点。

以Hps的总DNA为模板，用设计的引物对进行PCR扩增。

扩增体系：

PCR反应条件：

hbpA：94℃ 45秒，52℃ 45秒，72℃ 90秒，72℃ 7分钟，30个循环；

afuA：94℃ 45秒，52℃ 45秒，72℃ 60秒，72℃ 7分钟，30个循环；

oppA：94℃ 45秒，52℃ 45秒，72℃ 90秒，72℃ 7分钟，30个循环；

oppA2：94℃ 45秒，48℃ 45秒，72℃ 90秒，72℃ 7分钟，30个循环；

nqrA：94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 90秒，72℃ 7分钟，30个循环；

hps06257：94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 60秒，72℃ 7分钟，30个循环；

D15:94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 90秒，72℃ 7分钟，30个循环；

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒(超薄离心柱型，天根公司生产)纯化。将纯化的PCR产物进行测序，结果表明获得了序列为如序列表2所示的DNA片段，其为编码副猪嗜血杆菌HbpA、afuA、oppA、oppA2、D15、Hps06257、nqrA蛋白的基因。

三、重组表达载体的构建

1、将测序正确的PCR产物用NdeI和BamHI双酶切afuA、oppA、oppA2、nqrA，用NdeI和EcoRI双酶切hbpA和D15，用NdeI和XhoI双酶切Hps06257，琼脂糖电泳回收酶切产物。

2、将质粒pET28a(货号69864-3，Novagen)用NdeI和BamHI，NdeI和EcoRI，NdeI和XhoI分别双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

3、将步骤1的酶切产物和步骤2的酶切产物进行连接，得到重组质粒。

将重组质粒进行测序。结果表明，在pET28a的BamHI/EcoRI/XhoI和NdeI酶切位点之间插入了序列为序列表2所示的编码副猪嗜血杆菌七种蛋白的基因，将该重组质粒命名为pET28a-afuA、pET28a-hbpA、pET28a-oppA、pET28a-oppA2、pET28a-nqrA、pET28a-D15、pET28a-hps06257。

四、工程菌的制备

用pET28a-afuA、pET28a-hbpA、pET28a-oppA、pET28a-oppA2、pET28a-nqrA、pET28a-D15、pET28a-hps06257电击转化大肠杆菌BL21(DE3)(货号CB105，TIANGEN)后涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，得到含有pET28a-afuA、pET28a-hbpA、pET28a-oppA、pET28a-oppA2、pET28a-nqrA、pET28a-D15、pET28a-hps06257的重组菌，即为工程菌。

用pET28a代替pET28a-afuA、pET28a-hbpA、pET28a-oppA、pET28a-oppA2、pET28a-nqrA、pET28a-D15、pET28a-hps06257A，转化大肠杆菌BL21(DE3)，步骤同上，得到含有pET28a的重组菌，作为对照菌。

五、七种蛋白的制备和纯化

将以上四中制备的工程菌培养于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3h；OD₆₀₀＝0.7时，加入IPTG至终浓度0.8μM，转至37℃继续培养4h。

5000rpm、10分钟离心收集菌体，悬浮于PBS溶液中，于冰浴中超声破碎(300w，10分钟；超声3s，停止5s)，之后15000rpm离心10分钟收集沉淀，将沉淀用30ml溶液A(NaH₂PO₄100mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、尿素8mol/L，调pH到8.0)溶解，可以短暂超声破碎促溶。加入2mL事先处理好的树脂(Ni-NTA His-Bind Resin,Novagen)，4℃低速振荡30分钟使树脂与目的蛋白充分结合，结合完毕，加入吸附柱中。待液体流尽，加入10mL溶液B(NaH₂PO₄ 100mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、尿素8mol/L，调pH到6.3)洗6次。加入2mL溶液C(NaH₂PO₄ 100mmol/L、Tris-HCl10mmol/L、尿素8mol/L，调pH到5.9)洗1次。加入10mL溶液D(NaH₂PO₄ 100mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、尿素8mol/L，调pH到4.5)，按每管1mL收集洗脱液。

将以上四中制备的对照菌采用相同的步骤进行培养和纯化，得到的溶液作为对照酶液。

六、七种蛋白的蛋白印迹法鉴定

对以上五中纯化的重组7种蛋白进行蛋白印迹法分析，首先制备12%的聚丙稀酰胺凝胶，将蛋白上样进行SDS-PAGE；电泳结束后，把凝胶浸泡在电泳液(39mM甘氨酸、48mM Tris碱、0.037% SDS、20%甲醇)中平衡15min；剪裁比凝胶稍大的硝酸纤维素膜，放置于电泳液浸泡至完全湿润；剪裁两张厚滤纸，上层滤纸稍小于凝胶，下层滤纸要稍微大于硝酸纤维素膜，并浸泡在电泳液中至完全湿润；按照滤纸-膜-胶-滤纸的顺序加到石墨电极上，用玻璃棒赶走气泡；接通电源，15v恒压，转印30min。转印结束后取下硝酸纤维素膜；将膜装入小的自封袋中，加入5%脱脂乳4℃封闭过夜；取出膜，用PBST洗5次，每次10min；然后加入5%脱脂乳1:200稀释的一抗(猪康复血清)，37℃孵育1h；取出膜，用PBST洗5次，每次10min；然后加入5%脱脂乳1:5000稀释的二抗(HRP标记的兔抗猪二抗)，37℃孵育1h；取出膜，用PBST再洗5次，每次10min；然后用ECL化学发光试剂盒显色，结果表明七种蛋白与预期的蛋白条带大小一致，如图2所示。

实施例3、七种蛋白混合物免疫保护性的鉴定

1、Hps对昆明小鼠LD₅₀的测定

将副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)(购自国家兽医微生物菌种保藏中心，菌种编号：CVCC 3361)菌株接种于TSB液体培养基(含10%马血清，0.01%NAD)37℃ 200rpm/min培养14～16小时，然后次日涂布TSA固体培养基(含10%马血清，0.01%NAD)37℃培养24～36h。用PBS洗下菌苔，稀释到5×10⁸CFU/mL(OD₆₀₀约为1.0)，然后2倍逐级浓缩，浓缩至所需剂量(如表1中所示)后向小鼠注射。将8～10周龄雌性昆明小鼠(购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心)分为5组，每组10只。每只小鼠腹腔注射100μL的攻毒物，攻毒后连续观察5天，纪录各组死亡情况。按照寇氏公式计算LD₅₀。公式如下：

LD₅₀=lg^-1｛Xm-i〔ΣP-(3-Pm-Pn)/4〕｝

Xm：最大剂量组剂量的对数值

i：相邻两组剂量(d)对数值之差

ΣP：各组动物死亡率之总和

P：各组动物死亡率，用小数表示

Pm：最高剂量组动物死亡率,用小数表示

Pn：最小剂量组动物死亡率,用小数表示

n：每组动物数

攻毒5天后，第5组死亡10只，第1组死亡2只。具体的各组死亡率如下表所示。

表1

通过寇氏公式计算得出LD₅₀=1.46×10⁹CFU。

2、小鼠的免疫与攻毒

用根据实施例2纯化的七种蛋白抗原(HbpA、afuA、oppA、oppA2、D15、Hps06257和nqrA)的混合物免疫4～6周龄的昆明小鼠(购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心)，每组10只。对照组不进行免疫。将七种蛋白等比例(重量比)混合后，制备成3种不同浓度的疫苗，与福氏完全佐剂1:1(体积比)混合，使每种疫苗中含总蛋白量分别为50μg/0.1ml、100μg/0.1ml和150μg/0.1ml。每种疫苗分别经背部多点注射免疫小鼠，0.1ml/只。间隔两周后，同样剂量进行第二次免疫，背部多点注射免疫小鼠，10天后，ELISA检测抗体水平，HRP标记的山羊抗鼠（Sigma）为二抗(1：4000)。二免10天后经腹腔注射Hps（菌种保藏编号：CVCC3361），攻毒剂量为以上测定的LD50的5倍，观察5天内各组小鼠的死亡情况。如图3-1所示，100μg与150μg混合组免疫保护率一致，攻毒后三天内保护率最高，五天后仍有80%的存活率。从制造成本考虑选取100μg混合进行下一步试验。

比较用七种蛋白的混合物（七种蛋白等重量比混合，以100μg蛋白混合物/只的剂量免疫）和用单独的每种蛋白（以100μg每种蛋白/只的剂量免疫）进行免疫的保护效果，如图3-2所示。结果表明，在剂量浓度相同的情况下，将七种蛋白混合后作为疫苗免疫能够达到令人意想不到的更好的效果：攻毒后三天的保护率达到90%，高于每种蛋白单独免疫，五天后混合物组免疫保护率到达80%，其它蛋白单独免疫组保护率均低于100μg混合物免疫组。

Claims (7)

1.一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物，所述组合物包含七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原，所述七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-7所示，并且在所述组合物中所述七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原的重量比为1:1:1:1:1:1:1。

2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物，其中编码所述七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原的核酸序列分别如SEQ IDNO:8-14所示。

3.根据权利要求1或2所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物，其用作针对副猪嗜血杆菌的疫苗。

4.根据权利要求1或2所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物在制备针对副猪嗜血杆菌的疫苗中的用途。

5.根据权利要求1或2所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物在制备用于预防由副猪嗜血杆菌引起的疾病的药物中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述由副猪嗜血杆菌引起的疾病是副猪嗜血杆菌病。

7.一种制备副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

分别构建、表达和纯化氨基酸序列如SEQ ID NO:1-7所示的七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原；以及

将经过纯化的所述七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原混合，其中所述七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原混合的比例按重量计为1:1:1:1:1:1:1。