CN110240657B - 一种具有免疫保护性的副猪嗜血杆菌融合蛋白AfuA-OppA2 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有免疫保护性的副猪嗜血杆菌融合蛋白AfuA‑OppA2以及以其作为有效成分的疫苗。经实验表明，融合蛋白AfuA‑OppA2免疫组的保护率为80％，纯化蛋白AfuA和OppA2混合免疫组的保护率为70％。通过融合蛋白的形式，不仅有利于减少生产时的工艺复杂度和降低成本，并且免疫效果更好，可以单独作为疫苗或与其他蛋白一起作为联合疫苗。

Description

一种具有免疫保护性的副猪嗜血杆菌融合蛋白AfuA-OppA2

技术领域

本发明属于兽医疫苗领域，具体涉及具有免疫保护性的副猪嗜血杆菌融合蛋白，及含有其的疫苗。

背景技术

中国一直是世界上生猪存栏量最大的国家，因此保证猪的安全生产关系到国计民生，猪的疫苗也占到了兽医疫苗的60-70％的份额。猪病种类也比较多，其中副猪嗜血杆菌病(也称为格拉泽氏病)是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)引起的以猪的脑膜炎、多发性浆膜炎、心包炎和关节炎为特征的细菌性传染病。该菌由1910年德国科学家Glasser首次在病猪的浆液性分泌物中分离到副猪嗜血杆菌并加以描述，所以该病又被称为格拉泽氏病(Glasser’s disease)。副猪嗜血杆菌病对养猪业危害严重且呈世界性的普遍分布。副猪嗜血杆菌血清型众多，血清型调查表明国内外流行的血清型主要是5型、4型和13型等毒力较强的血清型(Trott DJ,V Rapp,Analysis of Haemophilus parasuis bymultilocus enzyme electrophoresis.Veterinary Microbiology,1997:56,125)。目前，在集约化猪场里该病呈明显的上升趋势，主要引起哺乳仔猪、断奶仔猪死亡，猪生长发育不良，饲料利用率低，而且副猪嗜血杆菌与其他病原的混合感染现象十分普遍，副猪嗜血杆菌从临床发病猪中的分离率高达20％，这也给猪病的诊断与防治带来极大的困难(Kim J,HKChung,T Jung,et al.,Postweaning multisystemic wasting syndrome of pigs inKorea:prevalence,microscopic lesions and coexisting microorganisms.Journal ofVeterinary Medical Science,2002:64,57)。

副猪嗜血杆菌有高度的宿主特异性，只感染猪，且各阶段的猪均易感。从二周龄到四月龄的猪均易感。繁殖母猪一般不表现出临床症状。发病率低但死亡率高，严重时可达50％(蔡旭旺,刘正飞,陈焕春,等,副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定.华中农业大学学报,2005:24,55-58.)。副猪嗜血杆菌主要通过空气、猪只间的接触和污染的排泄物进行传播。主要传染源是带菌猪和患病猪。副猪嗜血杆菌可以存在于健康猪的上呼吸道中，环境变化或猪发生应激后会使该病发生。

副猪嗜血杆菌的毒力因子主要包括ABC家族Fe+转运蛋白(AfuA)、细胞致死膨胀毒素(cytolethal distending toxin，CDTs)和寡肽透过酶(OppA,OppA2)。其中，afuA基因编码的铁离子ABC转运底物结合蛋白(Iron ABC superfamily ATP binding cassettetransporter binding protein)，主要参与跨膜转运Fe³⁺，对转铁蛋白和乳铁蛋白的利用有重要作用，在细菌感染机体的过程中有重要作用(Wei X,S Cao,L Zhang,et al.,Comparative proteome analysis of the extracellular proteins of twoHaemophilus parasuis strains Nagasaki and SW114.Biochemical&BiophysicalResearch Communications,2014:446,997-1001.)。Charland等的研究表明，在猪的血清中有转铁结合蛋白受体存在(Charland N,CG D'Silva,RA Dumont,et al.,Contact-dependent acquisition of transferrin-bound iron by two strains of Haemophilusparasuis.Canadian Journal of Microbiology,1995:41,70.)。研究发现有毒力的5型参考菌株的afuA基因的转录水平高于无毒力的3型的参考菌株。

细胞致死膨胀毒素是多种革兰氏阴性菌产生的蛋白毒素，属于热不稳定的外毒素，能导致真核细胞的膨胀和死亡。其全毒素由三种亚基组成，即CdtA、CdtB、CdtC。CDT全毒素属于AB2型毒素，具有催化性的是CdtB；CdtA和CdtC负责与细胞膜结合，将CdtB递入细胞(Lara-Tejero M,JE Galán,Cytolethal distending toxin:limited damage as astrategy to modulate cellular functions.Trends in Microbiology,2002:10,147)。研究表明，单独的CdtB具有DNase活性，能进入细胞，诱导细胞核内DNA双链的断裂，CDTA、CDTC单独或一起能增强CDTB的DNase I活性，且CDT全毒素对基因的毒性最强，并且能诱导PK-15细胞发生p53依赖的凋亡(牛惠,副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素细胞毒性机制研究.中国农业科学院硕士论文,2015.)。

寡肽透过酶OppA和OppA2属于ABC结合盒转运蛋白家族的一员，ABC结合盒转运蛋白超家族参与机体内蛋白、多肽及各种离子的跨膜运输。研究发现，ABC转运蛋白与细菌的毒力密切相关，参与致病菌对外界营养和金属离子的摄取及对宿主细胞的吸附作用。该家族蛋白具有良好的免疫原性，可作为重组亚单位疫苗的候选抗原蛋白(P L,B M,dW L,etal.,Three different putative phosphate transport receptors are encoded by theMycobacteium tuberculosis genome and are present at the surface ofMycobacterium bovis BCG.Journal of Bacteriology,1997:179,2900-2906.)。

此外，在八十年代初期，科学家研究细菌表面展示技术最初动机是想应用基因工程的原理及操作技术构建减毒活疫苗。其思路一般是将已知的抗原表位或抗原肽段展示于细菌表面制成重组的灭活苗或减毒活疫苗。随着研究的深入，在过去的三十年里，许多活菌载体被证明是生物治疗领域的有效工具，其中一些已在临床试验中得到评价。活细菌疫苗的研究取得了令人鼓舞的进展。新的细菌载体、异源抗原的表达策略和免疫途径显著提高了基于活菌载体平台的疫苗的可行性。因此，基于细菌表面展示的基因工程疫苗的开发也是研究表面展示系统最活跃的方向。目前，细菌表面展示技术甚至已经可以借助乳酸菌的平台来开发可口服的活疫苗(Sun H,Z Lin,L Zhao,et al.,Bacillus subtilis sporewith surface display of paramyosin from Clonorchis sinensis potentializes apromising oral vaccine candidate.Parasites&Vectors,2018:11,156)。新一代的细菌表面展示技术更是通过同时在菌体表面同时表达粘附素等具有特定功能的小分子来增加黏膜靶向信号，实现了活细菌在特定部位的靶向免疫。尽管活细菌是一个很有前景的平台，可以针对人类和动物常见的各种细菌性疾病提供异源抗原，但还是应该谨慎选择合适的宿主菌和表达载体，以避免可能出现的安全风险。

发明内容

本发明考虑到各个抗原蛋白单独制备工艺繁琐，发明人对副猪嗜血杆菌的各种毒力因子蛋白进行融合，以寻找既能减少工艺复杂度又能提高免疫效果的融合蛋白形式，在研究过程中发现，特定的副猪嗜血杆菌的毒力因子蛋白组合能够获得显著提高的免疫原性，现对这几种特定组合进行申请专利保护，本发明具体涉及的是将AfuA和OppA2蛋白融合在一起形成融合蛋白，而通过融合蛋白的形式，不仅有利于减少生产时的工艺复杂度和降低成本，而且更为重要的是融合蛋白的免疫效果更好。该融合蛋白可以单独作为疫苗或与其他蛋白一起作为联合疫苗。

因此，本发明提供一种具有免疫保护性的副猪嗜血杆菌融合蛋白，其特征在于：其是AfuA和OppA2蛋白的融合蛋白。

另一方面，本发明还提供编码由AfuA和OppA2构成的融合蛋白的基因。进一步地，提供含有该基因的表达载体，优选为递呈表达载体。

再一方面，本发明还提供含有上述的融合蛋白作为有效成分的疫苗。疫苗中可以包括任何合适的佐剂，并且可以制备成任何适合的剂型，优选是的适合于肌肉注射的剂型。

其中一个实施方式中，所述疫苗是将培养表达所述融合蛋白的重组菌以获得菌液，再与佐剂混合后乳化得到疫苗，其中优选地所述表达为递呈形式的表达。进一步优选地，是将所述菌液与佐剂ISA201VG按等质量比的比例混合后进行乳化，更优选的是乳化后疫苗中AfuA-OppA2的含量为0.2～0.4mg/mL，优选为0.3mg/mL。在另一个实施方式中，也可以将菌液中的融合蛋白AfuA+OppA2进行提纯以作为疫苗的有效成分，使用时根据需要调整其中的浓度。

通过融合蛋白的形式，不仅有利于减少生产时的工艺复杂度和降低成本，并且免疫效果更好，经实验证明，在相同浓度下，融合蛋白AfuA-OppA2免疫组的保护率为80％，而纯化蛋白AfuA和纯化蛋白OppA2混合免疫组的保护率为70％。因此，本发明具有很明显的有益的技术效果，具有显著的进步。

本发明还提供制备AfuA-OppA2融合蛋白的方法，其通过基因重组的方法获得，更具体的是将afuA、oppA2基因和linker序列混合作为模板，进行重叠延伸PCR，扩增获得完整的afuA+linker+oppA2基因；再通过重组菌表达获得所述融合蛋白。融合蛋白中的两种成分能否分别形成正确的空间结构、更好的发挥生物学活性，与连接融合蛋白中两种成分的linker序列密切相关。重组生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的linker不能影响目的蛋白各自的功能。因此,Linker序列的设计和选择对融合基因的构建至关重要。如果Linker的长度过长，则使融合蛋白对蛋白酶比较敏感，导致活性融合蛋白在生产过程中的产量下降；应用较短的Linker，可以克服重组蛋白酶分解的问题,但可使两个融合分子相距太近导致蛋白功能的丧失。为了更好的表达融合蛋白，本发明对其中的linker进行了更深入的分析，发现GGGGS(4个甘氨酸，一个丝氨酸)会更好，该连接肽较长且柔软,在复性时能够降低融合蛋白的两组份间的空间位阻,从而更有利于融合蛋白各个结构域的正确折叠。因而本发明中优选的linker是为GGGGS基因的2-4次重复，优选3次重复，两端连接相应基因的10-20bp，优选为15bp。最优选地，本发明采用的linker序列如下：5’-ATCAAATTATCGAATggtggcggtgggtctggcggtggtgggtcaggtggcggtgggtcgAAATTAGTTGCAGGT-3’(SEQ ID NO:4)。

5’端15bp为afuA基因C末端序列，3’端15bp为oppA2基因N末端序列，中间为linker序列，为GGGGS编码序列的3次重复。

进一步地，本发明提供对所述融合蛋白是通过递呈表达方法，更优选所述递呈表达是采用大肠杆菌。进而所述疫苗是通过培养能够递呈表达所述融合蛋白的重组菌获得菌液，再与佐剂混合后乳化得到疫苗。优选地，是将所述菌液与佐剂ISA201VG按等质量比的比例混合后进行乳化，更优选的是乳化后疫苗中AfuA-OppA2的含量为0.2～0.4mg/mL，优选为0.3mg/mL。

通过递呈表达能够更好的发挥融合蛋白的免疫性质，相比于纯化蛋白AfuA和纯化蛋白OppA2混合免疫组的保护率有明显的提高，因此构成本发明的优选方案。而通过融合蛋白的形式，不仅有利于减少生产时的工艺复杂度和降低成本，并且免疫效果具有协同作用而更好。而分别单独重组表达获得两个抗原蛋白，则生产中工艺却复杂得多，成本也高得多。

说明书附图

图1融合蛋白AfuA-OppA2表达鉴定

图2小鼠免疫攻毒保护实验

具体实施方式

下面通过具体实施式及实施例对本发明作进一步阐述，更有利于理解本发明，但并不构成对本发明范围的限制。

实施例1、重组质粒pMD-28a-INP-afuA-oppA2-His的构建

一、副猪嗜血杆菌(Hps)基因组DNA的提取

将1mL Hps(CVCC 3361)的过夜培养菌液12000rpm离心1分钟，弃上清。在菌体沉淀中加入40μL DB液(TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生物有限公司)，160μL溶菌酶和8μLRNaseA。剧烈震荡，混合均匀。37℃温浴30～60分钟，不断颠倒离心管数次。加入200μL DLT液(TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生物有限公司)和25μL蛋白酶K(TIANamp BacteriaDNA Kit，天根生物有限公司)，立即温和地颠倒混匀。置65℃水浴中至少30分钟，不断颠倒离心管数次。12000rpm离心3～5分钟，用移液器吸取全部上清到一个干净的离心管中。加入200μL无水乙醇，混匀后全部吸入吸附柱，12000rpm，离心30秒。倒掉收集管中的液体，放回吸附柱。加入500μL W1液(TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生物有限公司)，静置1分钟，12000rpm，离心30秒。倒掉收集管中的液体，放回吸附柱。加入500μL W1液，12000rpm，离心30秒。倒掉收集管内的液体，放回吸附柱。12000rpm，离心1分钟。将吸附柱放入一个1.5mL离心管。在吸附膜中央加入100μL T1液(TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生物有限公司)，65℃水浴5分钟，12000rpm离心1分钟。

二、afuA基因的制备

根据afuA基因的核苷酸序列(如序列表的SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示)，设计引物对如下：

正向引物：5’-CAGACCCAAATGAAAAAATTGCA-3’(SEQ ID NO:2)

反向引物：5’-ATTCGATAATTTGATATTAAAG-3’(SEQ ID NO:3)。

上游引物N端12bp为INP末端序列，后面11bp序列为afuA基因N端序列，下游引物为afuA C末端序列。以Hps的基因组DNA为模板，用设计的引物对进行PCR扩增。

扩增体系：

PCR反应条件：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环；最后72℃延伸10分钟。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒(超薄离心柱型，天根公司生产)纯化。将纯化的PCR产物进行测序，结果表明获得了序列为如序列表中SEQ ID NO:1所示的DNA片段。

三、Linker序列的合成

委托通用生物公司合成linker序列，用于连接afuA和oppA2基因。linker序列如下：

5’-ATCAAATTATCGAATggtggcggtgggtctggcggtggtgggtcaggtggcggtgggtcgAAATTAGTTGCAGGT-3’(SEQ ID NO:4)。

5’端15bp为afuA基因C末端序列，3’端15bp为oppA2基因N末端序列，中间为linker序列，为GGGGS(4个甘氨酸，一个丝氨酸)基因的3次重复。

四、oppA2基因的制备

根据oppA2基因的核苷酸序列(如序列表的SEQ ID NO:5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示)，设计引物对如下：

正向引物：5’-AAATTAGTTGCAGGTGTTGGTGCTGG-3’(SEQ ID NO:6)

反向引物：5’-GTGCTCGAGTGATTTACGGCTTACAC-3’(SEQ ID NO:7)

上游引物为oppA2N端自身序列，下游引物前12个bp为载体上包含6个his和终止密码子的部分序列，后面14bp为oppA2C末端基因。以Hps的基因组DNA为模板，用设计的引物对进行PCR扩增。

扩增体系：

PCR反应条件：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，30个循环；最后72℃延伸10分钟。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒(超薄离心柱型，天根公司生产)纯化。将纯化的PCR产物进行测序，结果表明获得了序列为如序列表中SEQ ID NO:5所示的DNA片段。

五、重叠延伸(SOE)PCR

将afuA、oppA2基因PCR产物以及合成的linker序列混合作为模板，用aufA-U和oppA2-L为引物进行重叠延伸PCR，扩增完整的afuA+linker+oppA2基因。

PCR反应条件：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环；最后72℃延伸10分钟。六、扩增载体序列

该质粒在pMD-28a-INP-Cap-His基础上进行构建，因为要从载体上去除cap序列，需要将载体反向PCR。故以拼装有afuA和oppA2基因的pMD-28a-INP-afuA-oppA2-His质粒中oppA2基因的末端15个bp为上游引物的起点，加上载体自身10bp序列一起组成上游引物。同理，将拼好的载体末端序列10bp加上afuA基因N端15bp一起构成下游引物。按照以上方法，拼装得到“oppA2接头(C端)+载体序列+afuA接头(N端)”序列，以此设计引物。

载体-U：5’-GGTGTAAGCCGTAAATCACTCGAGC-3’(SEQ ID NO:8)

载体-L：5’-AACCGTATAGTAATTGCAATTTTTT-3’(SEQ ID NO:9)

PCR反应条件：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环；最后72℃延伸10分钟。七、重组质粒pMD-28a-INP-aufA-oppA2-His的构建

将afuA+linker+oppA2与载体序列用CloneExpress II(One Step Cloning Kit，Vanyme)进行连接。按说明书进行操作。用PCR对转化子进行鉴定，将阳性克隆调取单菌落增菌后提质粒，送测序。结果表明获得的序列与预期相符，表明重组质粒构建成功。

实施例2、副猪嗜血杆菌融合蛋白AfuA-OppA2的递呈表达

一、递呈表达AfuA-OppA2重组表达菌株的构建

将重组质粒pMD-28a-INP-afuA-oppA2-His转入E.coli DH5α感受态细胞中，再将其涂布于LB(含Amp 100μg/mL)平板上进行抗性筛选。次日挑取单克隆接种到LB(含Amp 100μg/mL)液体培养基中37℃震荡培养，12h后提取质粒送至吉林库美生物公司进行测序。将测序验证正确的重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，进行抗性筛选，挑选单克隆进行PCR鉴定，阳性克隆命名为BL21(afuA-oppA2)。

二、融合蛋白AfuA-OppA2的递呈表达

取BL21(afuA-oppA2)单克隆，增菌培养至10mL LB(含Amp终浓度为100μg/mL)液体培养基中，37℃200r/min摇至OD600≈0.3时加入终浓度为1mM IPTG的诱导剂在37℃诱导4h，6000r/min离心10min收集菌体。将收集的菌体用适量PBS悬起，添加loading-buffer后上样进行SDS-PAGE，随后转至PVDF膜上进行Western-blot，添加空载体的BL21(DE3)作为阴性对照。用AfuA和OppA2小鼠多克隆抗体及商品化的鼠抗His抗体为一抗、山羊抗鼠IgG(含Dylight 680标记)为二抗进行Western-blot检测蛋白的表达。结果见图1。其中，anti-AfuA指抗AfuA蛋白的抗体，anti-OppA2是抗oppA 2蛋白的抗体，anti-his是抗his标签的抗体。融合蛋白可以与上述3个抗体发生反应，证明融合蛋白构建成功，且免疫原性没有受到影响和破坏。前面是空载体对照，不与任一抗体反应。

实施例3、副猪嗜血杆菌融合蛋白AfuA-OppA2的免疫保护性鉴定

一、疫苗的制备

挑取BL21(afuA-oppA2)单克隆接种于LB(含Amp 100μg/mL)液体培养基中，在37℃，180r/min震荡培养，再以1:100的比例转接至500mL相应培养基中，37℃恒温摇床内180r/min震荡。

在无菌条件下收菌并用PBS洗3遍后加适量PBS重悬，加入工作浓度为1.5‰的甲醛使菌体灭活，48h后涂板检查是否灭活完全。

取重悬后的菌液进行SDS-PAGE后转膜进行Western-blot，以商品化鼠源His抗体为一抗，山羊抗鼠IgG(Dylight 680标记)为二抗，以已知浓度的带His标签的蛋白为标准品进行Western-blot。将扫膜后图像用灰度分析软件ImageJ对重悬菌液中AfuA-OppA2蛋白进行定量。

将菌液与ISA201VG佐剂按等质量比的比例混合后进行乳化，使乳化后疫苗中AfuA-OppA2的含量为0.3mg/mL。

二、小鼠免疫攻毒试验

取4周龄雌性KM小鼠200只，随机分为三组，每组10只。包括递呈表达融合蛋白AfuA-OppA2免疫组，纯化蛋白AfuA和OppA2混合免疫组(含AfuA和OppA2各0.3mg/mL)和对照组(PBS+ISA201VG)。每只小鼠背部皮下多点注射，0.3ml/只。在第一次免疫14d后进行第二次免疫，免疫剂量和途径与第一次免疫时相同。在第二次免疫14d后，用新鲜培养的副猪嗜血杆菌血清13型ZD12株在隔离器内对小鼠进行腹腔注射攻毒，攻毒剂量为2×10⁹cfu/只。观察并统计攻毒后一周内小鼠的存活情况。

结果如图2所示，融合蛋白AfuA-OppA2免疫组的保护率为80％，纯化蛋白AfuA+OppA2免疫组的保护率为70％，对照组全部死亡。

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心),哈尔滨维科生物技术有限公司

<120>一种具有免疫保护性的副猪嗜血杆菌融合蛋白AfuA-OppA2

<160>11

<170> PatentIn Version 3.1

<210>1

<211> 1035

<212>DNA

<213> afuA基因

<400> 1

aaaaaattgc aattaaaaaa atgcttttca agcctttttc tcctttcacc attagtcttt 60

gcagcttcta atgctcaggc tgaaggaaag ctgaccgttt attgtggcgt gcaaaacaag 120

gtgtgtgaag atctgacgaa gcgtttttca caaaaatata atgtggaaac tcagtttatt 180

cacggtggaa cagggacaat tttaggtaag ctgaaagcgg aaaaagataa tccgcaagcg 240

gatatttggt atggcggcac tattgagcca catttccaag cagggcagat ggggctatta 300

gaagcctatc gttcaccttt gcaagcggag gttttacctc aatttaaagc attgcaagag 360

agcgaagcag gtaaatatac ctcgattgcg tatttgatgg tgcttggttt tggtattaac 420

accgaaaaat taaagcagtt agggattgat gctccgaaaa aatgggcaga tttgcttgat 480

cctcgcttaa aaggcgaagt gcaattagct gatcctcgca cttcaggaac aatgtacacg 540

acgatgatta cgcttattca gttaatgggc gaggaaaaag cctttgagta cttgaaaaaa 600

ttagatggca acatttctca atatgtgaaa agtaccttag tgacctctaa cctttctcgt 660

ggagagagtg ctgtgacagt tggctttgct cacggctatg cttcagaaaa agagaaaggt 720

gcaccggttg attatgtgtt acctaaagat ggggtaggct atgctttagg ggctgcaagt 780

attattaaag gtgcgagaaa ccttgataat gcgaaattat ttatggattg ggttctctct 840

aaagaggttc aagaaattcc ttggcgtgac cacggacttt atcaaacacc aaccaatgtg 900

aaagcagaag ttgctccaca atcacctaaa ttggacggcg tgaaattggt tgatgtagat 960

tatgctcgtt ttgggtcaag cgaggaaggg aagcgtttgg tagataaatg gctctttaat 1020

atcaaattat cgaat 1035

<210>2

<211> 23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cagac ccaaa tgaaa aaatt gca 23

<210>3

<211> 22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

attcg ataat ttgat attaa ag 22

<210>4

<211>75

<212>DNA

<213> 人工序列

<400>4

atcaaattat cgaatggtgg cggtgggtct ggcggtggtg ggtcaggtgg cggtgggtcg 60

aaattagttg caggt 75

<210>5

<211>1536

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

aaattagttg caggtgttgg tgctggttta gcattctcag gttcaatcgg tacttttgct 60

tctcaggctt atgctgcacc agcaaaaggt tcaactatcg aagcaggtat tgcttatccg 120

atttcaacgg gttttgaccc aatgagttca actggtgcat cttcaatggc ggctaatatc 180

cacatttttg aaggtttagt tgatttacac ccagcaactc gccagccata tctagcactt 240

gcagcgaaag aaccagaaaa agttgacgat gtaacttatc gcatcacttt acgtgacggt 300

gcggtattcc ataacggttc agcagtaacc agtgctgatg ttgtgttttc atttgagcgt 360

gtattagatc caaataccaa atcactcttt gcacaattca tcccattcat taaatcagtc 420

actgcagtgg atcaaaaaac agttgaattt aaattgaaat atccatttgc attattcaaa 480

gaacgtttaa ccattatcaa aatcgtacca aaagcattaa ttgaagccca aggtcaatca 540

gtctttgatg caaatcctgt tggtactggt ccatataaat ttgtttcagc agtaaaagat 600

gaccgtatcg tatttgaagc aaaccctgct tacacaggtc catatcctgc aactgttgaa 660

aaaatgacat ggttcttact ctctgatgac gcagcacgtg ttgcagcaca agagtcaggt 720

cgtgtacaag cgattgaaaa cgtaccttac ttagatgcgg atcgcttaaa acgtaaagca 780

gctgtagaat cagtgcaatc attcggctta attttcttaa tgtttaactg tgaaaaagca 840

ccgtttaaca acaagaaagt acgtcaagca ttacaatatg caattgatac acaaaaatta 900

gttgatgtgg tgttcttagg caacgcaaaa cctgcgacat cttatgttca agactctcac 960

ccagactatg tgaaagcctc aacagtctat gatttcgatc cgaaaaaagc ggctgcattg 1020

ttgaaagaag cgggtgtaga taaacttgag tttacaacac gttcaaccgc acataaatgg 1080

gtagtggact ctgttcaaat gatccttgaa gactggaaca agatccctgg tgtaaaagtg 1140

acaaacatcg cttcacaatc accatacaat gacggtgttg atgcaggtaa ctttgaagta 1200

ttaatcgcac caggtgaccc atcagtattc ggtaacgact tagacttatt attaagctgg 1260

tggtaccgtg gtgatgtatg gccgaaaaaa cgtttccgct ggtcaaatac acctgaatat 1320

gcggaagttc aaaaacttct tgacgctgcg gtggctgcga aaactccggc agaagcacgt 1380

gaaatttggg gtaaagcgat taacatcatt gctgaagaag cagcacttta tccaattatt 1440

caccgtaaac ttccaacagc ttggagtaac aaagcattag atggctttaa accattatca 1500

accacaggta tgtcattcat tggtgtaagc cgtaaa 1536

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

aaatt agttg caggt gttgg tgctg g 26

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 7

gtgct cgagt gattt acggc ttaca c 26

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ggtgt aagcc gtaaa tcact cgagc 25

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

aaccg tatag taatt gcaat ttttt 25

<210>10

<211>345

<212>PRT

<213>afuA蛋白

<400>10

KKLQLKKWFS SLFLLSPLVF AASNAQAEGK LTVYCGVQNK VCEDLTKRFS QKYNVETQFI 60

HGGTGTILGK LKAEKDNPQA DIWYGGTIEP HFQAGQMGLL EAYRSPLQAE VLPQFKALQE 120

SEAGKYTSIA YLMVLGFGIN TEKLKQLGID APKKWADLLD PRLKGEVQLA DPRTSGTMYT 180

TMITLIQLMG EEKAFEYLKK LDGNISQYVK STLVTSNLSR GESAVTVGFA HGYASEKEKG 240

APVDYVLPKD GVGYALGAAS IIKGARNLDN AKLFMDWVLS KEVQEIPWRD HGLYQTPTNV 300

KAEVAPQSPK IDGVKLVDVD YARFGSSEEG KRLVDKWLFN IKLSN 345

<210>11

<211>512

<212>PRT

<213>OppA2蛋白

<400>11

KLVAGVGAGL AFSGSIGTFA SQAYAAPAKG STIETGIAYP ISTGFDPMSS TGASSMAANI 60

HIFEGLVDLH PATRQPYLAL AAKEPEKVDD VTYRITLRDG AVFHNGSAVT SADVVFSFER 120

VLDPNTKSLF AQFIPFIKSV TAVDQKTVEF KLKYPFALFK ERLTIIKIVP KALIEAQGQS 180

VFDANPAGTG PYKFVSAVKD DRIVFEANPA YTGPYPATVE KMTWFLLFDD AARVAAQESG 240

RVQAIENVPY LDADRLKRKA AVESVQSFGL IFLMFNCEKA PFNNKKVRQA LQYAIDTQKL 300

VDVVFLGNAK PATSYVQDSH PDYVKASTVY DFDPKKAAAL LKEAGVDKLE FTTRSTAHKW 360

VVDSVQMILE DWNKIPGVKV TNIASQSPYN DGVDAGNFEV LIAPGDPSVF GNDLDLLLSW 420

WYRGDVWPKK RFRWSNTPEY AEVQKLLDAA VAAKTPAEAR EIWGKAINII AEEAALYPII 480

HRKLPTAWSN KALDGFKPLS TTGMSFIGVS RK 512

Claims (10)

1.一种具有免疫保护性的副猪嗜血杆菌融合蛋白，其特征在于：其是AfuA和OppA2蛋白通过linker序列连接融合而得到，所述linker的序列为GGGGS，AfuA蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：10所示，OppA2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：11所示。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，其是通过基因重组方法获得的。

3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，其是通过重组菌递呈表达获得。

4.编码如权利要求1至3任一项所述的融合蛋白的基因。

5.含有如权利要求4所述的基因的表达载体，其为递呈表达载体。

6.含有如权利要求1至3任一项所述的融合蛋白作为有效成分的疫苗。

7.如权利要求6所述的疫苗，其特征在于，含有佐剂，并制备成任何适合的剂型。

8.如权利要求6所述的疫苗，其特征在于，是将表达所述融合蛋白的重组菌进行培养以获得菌液，再与佐剂混合后乳化得到疫苗。

9.如权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述菌液与佐剂ISA201VG按等质量比的比例混合后进行乳化，乳化后疫苗中AfuA-OppA2的含量为0.2～0.4mg/mL。

10.制备如权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于：通过基因重组的方法获得，具体的是将afuA、oppA2基因和linker序列混合作为模板，进行重叠延伸PCR，扩增获得完整的afuA+linker+oppA2基因；再通过重组菌表达获得所述融合蛋白。

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