JPS58146596A - 組換えｄｎａ、それで形質転換させた微生物およびそれらの用途 - Google Patents
組換えｄｎａ、それで形質転換させた微生物およびそれらの用途Info
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- JPS58146596A JPS58146596A JP3005982A JP3005982A JPS58146596A JP S58146596 A JPS58146596 A JP S58146596A JP 3005982 A JP3005982 A JP 3005982A JP 3005982 A JP3005982 A JP 3005982A JP S58146596 A JPS58146596 A JP S58146596A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な組換えＤＮＡならびにそれで形質転換
させた微生物に関する１、さらに詳しくは、本発明は、
ＣＦＡ構造遺伝子を含む組換えＤＮＡ、ならびに当該Ｄ
ＮＡ、ＬＴＡ’構造遺伝子を含むＤＮ ＡおよびＬＴＢ
構造遺伝子で形質転換させた微生物に関するものである
。
させた微生物に関する１、さらに詳しくは、本発明は、
ＣＦＡ構造遺伝子を含む組換えＤＮＡ、ならびに当該Ｄ
ＮＡ、ＬＴＡ’構造遺伝子を含むＤＮ ＡおよびＬＴＢ
構造遺伝子で形質転換させた微生物に関するものである
。
細菌性下痢症のうちでも北米から中南米への旅行者の多
くが苦しむ旅行者下痢症は重篤な病状を伴うものであシ
、またブタ、ウシなどの幼若動物などにおける細菌性下
痢症は、死を招いたり、生存し得て屯肥育が惑いために
、畜産上の大きな問題になっている。これらの細菌性下
痢症の主な原因は、毒素原性大腸菌が菌体外に放出する
外毒素であることが判明している。また、この外毒素産
生がプフスミドに支配されていることが確かめられてい
る。このプフスミドを持つ毒素原性大腸菌は、６０℃、
３０分間の加熱で毒性を失う蛋白質の易熱性腸管毒素（
ＬＴ、分子量約８０．０００）と、加熱しても毒性が保
たれる耐熱性腸管毒素（ＳＴ、分子量２．０００〜５．
０００）と、細胞膜が腸管粘膜に粘着するのに必要な腸
管付層性蛋白である定着因子抗原（ＣＦＡ）を産生ずる
。ＬＴは腸管粘膜上皮細胞のガングリオシドＧＭ１にＢ
亜粒子（ＬＴＢ）で結合し、続いてＡ亜粒子（ＬＴＡ）
が細胞質膜のリピド層を押し分けて侵入し、サイクリッ
クＡＭＰ（ｏＡＭＰ）レベルの上昇をもたらし、結果的
に細胞質模の透過性を変化せしめ、多食の水と重炭酸イ
オンを細胞外に放出させて下痢を起す。一方、ＳＴは細
胞内サイクリックＧＭＰ（ａＧＭＰ）レベμの上昇をも
たらして下痢を起す（文献１，２，３．４）。これらの
病原性を発現する遺伝子はすべてプラスミド上に存在し
ている。
くが苦しむ旅行者下痢症は重篤な病状を伴うものであシ
、またブタ、ウシなどの幼若動物などにおける細菌性下
痢症は、死を招いたり、生存し得て屯肥育が惑いために
、畜産上の大きな問題になっている。これらの細菌性下
痢症の主な原因は、毒素原性大腸菌が菌体外に放出する
外毒素であることが判明している。また、この外毒素産
生がプフスミドに支配されていることが確かめられてい
る。このプフスミドを持つ毒素原性大腸菌は、６０℃、
３０分間の加熱で毒性を失う蛋白質の易熱性腸管毒素（
ＬＴ、分子量約８０．０００）と、加熱しても毒性が保
たれる耐熱性腸管毒素（ＳＴ、分子量２．０００〜５．
０００）と、細胞膜が腸管粘膜に粘着するのに必要な腸
管付層性蛋白である定着因子抗原（ＣＦＡ）を産生ずる
。ＬＴは腸管粘膜上皮細胞のガングリオシドＧＭ１にＢ
亜粒子（ＬＴＢ）で結合し、続いてＡ亜粒子（ＬＴＡ）
が細胞質膜のリピド層を押し分けて侵入し、サイクリッ
クＡＭＰ（ｏＡＭＰ）レベルの上昇をもたらし、結果的
に細胞質模の透過性を変化せしめ、多食の水と重炭酸イ
オンを細胞外に放出させて下痢を起す。一方、ＳＴは細
胞内サイクリックＧＭＰ（ａＧＭＰ）レベμの上昇をも
たらして下痢を起す（文献１，２，３．４）。これらの
病原性を発現する遺伝子はすべてプラスミド上に存在し
ている。
ＬＴ、ＳＴの構造遺伝子を有する腸管毒素（ＥＮＴ）プ
ラスミドはブタの集団下痢症から得た毒素原性大腸菌で
立証されたのが最初である（文献５）。その後ＤＮＡ解
析がなされ、４０〜６０メガダＡ／）ン前後の分子量を
もつ環状ＤＮＡ（ｏｏ。
ラスミドはブタの集団下痢症から得た毒素原性大腸菌で
立証されたのが最初である（文献５）。その後ＤＮＡ解
析がなされ、４０〜６０メガダＡ／）ン前後の分子量を
もつ環状ＤＮＡ（ｏｏ。
Ｄ ？７ Ａ ）であることが明らかにされ、プラスミ
ド上の毒素産生遺伝子も同定されている。ブタ由来の毒
素原性大腸菌のＳＴ遺伝子はトブンスボゾンで、ＥＮＴ
プラスミドから他の細胞質因子、ファージ、菌染色体な
どの別のレプリコンに自刃で転位すること本知られてい
る（文献６）。
ド上の毒素産生遺伝子も同定されている。ブタ由来の毒
素原性大腸菌のＳＴ遺伝子はトブンスボゾンで、ＥＮＴ
プラスミドから他の細胞質因子、ファージ、菌染色体な
どの別のレプリコンに自刃で転位すること本知られてい
る（文献６）。
本発明者らは１ラスミドと病原性発現の関係がある下痢
症患者から分離された大腸菌Ｈ１０４０７（０７８：［
１１）の１フスミドを解析し、２つのＥＮＴ （ＬＴと
８Ｔ）を産生ずる１フスミドを見いだした（文献７）。
症患者から分離された大腸菌Ｈ１０４０７（０７８：［
１１）の１フスミドを解析し、２つのＥＮＴ （ＬＴと
８Ｔ）を産生ずる１フスミドを見いだした（文献７）。
またＬＴ 、 ＳＴ両遺伝子のクローニングを行ない遺
伝子構造の解析をし、ＳＴ活性を欠いたＩ、ＴＰとＬＴ
Ｂの組換えＤＮＡを創製した（文献８，９）。
伝子構造の解析をし、ＳＴ活性を欠いたＩ、ＴＰとＬＴ
Ｂの組換えＤＮＡを創製した（文献８，９）。
一方、畜産農家は下痢発症の野生菌株を出産前に購ブタ
または牛に経口的に投与することＫよって幼若動物の下
痢症に有効であることを経験的に知っている。しかし野
生菌株では時として病原性があシ取扱いに注意を要する
のみならず、真中に排泄され環境を汚染すること、効果
が安定しないことなどの問題がある。
または牛に経口的に投与することＫよって幼若動物の下
痢症に有効であることを経験的に知っている。しかし野
生菌株では時として病原性があシ取扱いに注意を要する
のみならず、真中に排泄され環境を汚染すること、効果
が安定しないことなどの問題がある。
毒素原性大腸菌に遺伝子操作を行ってＣＦＡおよび菌体
外ポリペ”ブタイドを産生ずる組換えＤＮＡを創製し、
これで形質転換させることにより、抗体産生能を有しし
かも毒性の除去された微生物を創製できれば、安全で有
用性の高い生菌ワクチンとして期待される。
外ポリペ”ブタイドを産生ずる組換えＤＮＡを創製し、
これで形質転換させることにより、抗体産生能を有しし
かも毒性の除去された微生物を創製できれば、安全で有
用性の高い生菌ワクチンとして期待される。
本発明者らはかかる技術的背景の下に鋭意研究した結果
、ＣＦＡ構造遺伝子と８Ｔ構造遺伝子が共存するプラス
ミドからＣＦＡ構造遺伝子を分離することによシ、ＣＦ
Ａ構造遺伝子を含みしかもＳＴ構造遺伝子を欠く組換え
ＤＮＡの創製に成功し、この組換えＤＮＡで形質転換さ
せた微生物を培養して細菌症下痢症防禦用の生菌ワクチ
ンを生産する途を開いた。
、ＣＦＡ構造遺伝子と８Ｔ構造遺伝子が共存するプラス
ミドからＣＦＡ構造遺伝子を分離することによシ、ＣＦ
Ａ構造遺伝子を含みしかもＳＴ構造遺伝子を欠く組換え
ＤＮＡの創製に成功し、この組換えＤＮＡで形質転換さ
せた微生物を培養して細菌症下痢症防禦用の生菌ワクチ
ンを生産する途を開いた。
すなわち、本発明は、■ＣＦＡ構造遺伝子を含む組換え
ＤＮＡ 、■当該ＤＮＡ 、 ＬＴＰ構造遺伝子を含む
ＤＮＡおよびＬＴＢ構造遺伝子で形質転換させた微生物
、ならびに■当該微生物の毒素原性細菌感染防禦剤とし
ての用途を提供する本のである。
ＤＮＡ 、■当該ＤＮＡ 、 ＬＴＰ構造遺伝子を含む
ＤＮＡおよびＬＴＢ構造遺伝子で形質転換させた微生物
、ならびに■当該微生物の毒素原性細菌感染防禦剤とし
ての用途を提供する本のである。
毒素原性大腸菌の病原性発現に関与する遺伝子はプラス
ミドに運ばれており、ＣＦＡとＳＴを産生する遺伝子を
持つプラスミドと、ＬＴとＳＴを産生ずる遺伝子を持つ
プラスミドがあり、これらはいずれも非伝達性プラスミ
ドである。本発明の本質的特徴は、これらの１フスミＦ
から毒性を有ししかも抗体産生能のほとんどない８Ｔを
産生する遺伝子を除去したＤＮＡを創製し、さらに抗体
産生能を持ちしかもＬＴＡの毒性が除去されたポリペプ
チドであるＬＴ／を産生ずる遺伝子を含むＤｆｆＡ 、
ＬＴＢ産生遺伝子を含むＤＮＡｔ−調製し、これらを形
質転換で導入した微生物を創製することにある。
ミドに運ばれており、ＣＦＡとＳＴを産生する遺伝子を
持つプラスミドと、ＬＴとＳＴを産生ずる遺伝子を持つ
プラスミドがあり、これらはいずれも非伝達性プラスミ
ドである。本発明の本質的特徴は、これらの１フスミＦ
から毒性を有ししかも抗体産生能のほとんどない８Ｔを
産生する遺伝子を除去したＤＮＡを創製し、さらに抗体
産生能を持ちしかもＬＴＡの毒性が除去されたポリペプ
チドであるＬＴ／を産生ずる遺伝子を含むＤｆｆＡ 、
ＬＴＢ産生遺伝子を含むＤＮＡｔ−調製し、これらを形
質転換で導入した微生物を創製することにある。
以下に、本発明を、下痢症患者由来庫素原性大腸１１Ｈ
１０４０７（０７８：Ｈ１１，文献７）から調製したプ
ラスミドを利用する例に基づき詳細に説明する。
１０４０７（０７８：Ｈ１１，文献７）から調製したプ
ラスミドを利用する例に基づき詳細に説明する。
［１０４０７は、第１図に示すように４種類の１フスミ
ドを有する。そのうちのｐｃｓ １は分、子者を産生
ずる遺伝子を持つことを見い出したっｐＪＹｌｌは分子
量約＋ａｘｔｆ の非伝達性プラスミドであり、ＳＴと
ＬＴを産生ずる遺伝子を有する（文献？、８．９）。ｐ
ＴＲＡｌは分子量的４３Ｘ１０ の伝達性１ヲスミド
で、自身の伝達性の他、ｐｃｓ １とｐＪＹｌｌを他の
細ＩＮＫ伝達させる機能を有する。残る１つは分子量約
４×１０６の１フスミドで、病原性発現に関係ない機能
不明の１ラスミドである。
ドを有する。そのうちのｐｃｓ １は分、子者を産生
ずる遺伝子を持つことを見い出したっｐＪＹｌｌは分子
量約＋ａｘｔｆ の非伝達性プラスミドであり、ＳＴと
ＬＴを産生ずる遺伝子を有する（文献？、８．９）。ｐ
ＴＲＡｌは分子量的４３Ｘ１０ の伝達性１ヲスミド
で、自身の伝達性の他、ｐｃｓ １とｐＪＹｌｌを他の
細ＩＮＫ伝達させる機能を有する。残る１つは分子量約
４×１０６の１フスミドで、病原性発現に関係ない機能
不明の１ラスミドである。
ｐｃｓ１またはｐ、ＴＹｌｉのみを龜っ大腸菌は以下の
如く調製される。ＲＰ４を大＠ＷＩＴＩ １０４０７に
接合伝達し、ｐｐ４上のアンビシリントランスポゾン（
Ｔｎｌ）をｐＴ１’ｔＡｌに転移させる。ｐＴＲＡ：：
Ｔｎｌ（ｐＪＹ１２）は、ｐＴＲＡｌと同様にｐｃｓｌ
およびｐ’、ｒＹｌｌを他の細胞に伝達させる能力をも
つため、接合によりアンピクリン耐性で、ＣＦＡまたは
ＬＴを産生ずる。
如く調製される。ＲＰ４を大＠ＷＩＴＩ １０４０７に
接合伝達し、ｐｐ４上のアンビシリントランスポゾン（
Ｔｎｌ）をｐＴ１’ｔＡｌに転移させる。ｐＴＲＡ：：
Ｔｎｌ（ｐＪＹ１２）は、ｐＴＲＡｌと同様にｐｃｓｌ
およびｐ’、ｒＹｌｌを他の細胞に伝達させる能力をも
つため、接合によりアンピクリン耐性で、ＣＦＡまたは
ＬＴを産生ずる。
菌株を選択すれば（ｐＪＹ１２．ｐｃｓｉ）を泥は（ｐ
Ｊ Ｙ １２ ｔ ｐ Ｊ Ｙ １１）の２つのプラ
スミドをもつものが得られる。これらの菌株からアンピ
シリン耐性が自然に脱落し゛たものを選べば、ｐｃｓｌ
またはｐ、ＴＹｌｌのみをもつ菌株が得られる（文献１
０）。
Ｊ Ｙ １２ ｔ ｐ Ｊ Ｙ １１）の２つのプラ
スミドをもつものが得られる。これらの菌株からアンピ
シリン耐性が自然に脱落し゛たものを選べば、ｐｃｓｌ
またはｐ、ＴＹｌｌのみをもつ菌株が得られる（文献１
０）。
から構成されている。サプユニッ）Ｂ（Ｉ、ＴＢ）は腸
管粘膜上皮細胞上の受容体への結合能をもつ。
管粘膜上皮細胞上の受容体への結合能をもつ。
サブユニットＡ（ＬＴＡ）はＬＴＢによる結合の後に膜
中のアデニ〜シクフーゼに作用し酵素活性（毒素活性）
を表わす。従ってＬＴＢおよびＬＴＡの誘導体で毒素活
性を欠失しかつ抗原性をもつもの（ＬＴＩＦと命名）は
、共に、ＬＴのトキソイドとなる。ｐＪＹｉｌのＬＴオ
ペロンの構造は第２図Ａに示したとおシである。組換え
ＤＮＡ技術を用いてまず、ｐＪＹｌｌ上にあるとのＬＴ
オペロン領域を長さ５．３ Ｋｂ ＯＰ Ｉ ’ｆエフ
フグメントとして、ｐＢＲ３２２のｐｓｔＴ：部位にク
ローニングし、ｐＪｙＬ２２９９を得る（第２図’Ｂ
）。
中のアデニ〜シクフーゼに作用し酵素活性（毒素活性）
を表わす。従ってＬＴＢおよびＬＴＡの誘導体で毒素活
性を欠失しかつ抗原性をもつもの（ＬＴＩＦと命名）は
、共に、ＬＴのトキソイドとなる。ｐＪＹｉｌのＬＴオ
ペロンの構造は第２図Ａに示したとおシである。組換え
ＤＮＡ技術を用いてまず、ｐＪＹｌｌ上にあるとのＬＴ
オペロン領域を長さ５．３ Ｋｂ ＯＰ Ｉ ’ｆエフ
フグメントとして、ｐＢＲ３２２のｐｓｔＴ：部位にク
ローニングし、ｐＪｙＬ２２９９を得る（第２図’Ｂ
）。
ｐＪＹＬ２２９９ＤＮＡを材料にして、さらに組換えＤ
ＮＡ技術により以下のトキソイド産生フ゛ラスミドを調
製する（文献、８ 、９ ）。
ＮＡ技術により以下のトキソイド産生フ゛ラスミドを調
製する（文献、８ 、９ ）。
−Ｌ Ｔ ＢＪＭｌｒｍ遼Ｌ１ヲスミドの一１Ｌ ＴＢ
Ｃｔｏｘ Ｂ ）はプロモーターを持たないので、ｔａ
ｘ Ｂを発現させるためｔｏｗ ３３を持つフラグメン
トをベクター上のオペロンの転写下流に挿入し、ＬＴＢ
を産生ずるプラスミドを得る。かかるプラスミドの代表
例は、たとえばｐＪＹ２４（テトラサイクリン耐性、Ｌ
ＴＢ産生”）、 ｐＪＹ３５（アンピシリン耐性、ＬＴ
Ｂ産生）、ｐＪＹ３７Ｑ（アンピシリン耐性、ＬＴＢ産
生）とｐＪＹ２６（アンピシリン耐性、ＬＴＢ産生）な
どである（第２図Ｂおよび文献８，９）。
Ｃｔｏｘ Ｂ ）はプロモーターを持たないので、ｔａ
ｘ Ｂを発現させるためｔｏｗ ３３を持つフラグメン
トをベクター上のオペロンの転写下流に挿入し、ＬＴＢ
を産生ずるプラスミドを得る。かかるプラスミドの代表
例は、たとえばｐＪＹ２４（テトラサイクリン耐性、Ｌ
ＴＢ産生”）、 ｐＪＹ３５（アンピシリン耐性、ＬＴ
Ｂ産生）、ｐＪＹ３７Ｑ（アンピシリン耐性、ＬＴＢ産
生）とｐＪＹ２６（アンピシリン耐性、ＬＴＢ産生）な
どである（第２図Ｂおよび文献８，９）。
Ｌ Ｔ’ Ａ産生グ１スーえ−ドーの調製Ｌ’ＴＡ（分
子量２６．８０．、Ｑ 、’ｊＯＸ Ａ ）のＣ末端側
を欠失させるような形でＬＴのフ゛ロモーターｔｔｏｘ
Ａ領域（部分）を゛ベクターに挿入し、毒素活性のな
いＬＴＡ誘導体（分子ｉ ｉ ７．０００． 、 Ｌ
Ｔ※ Ａ）産生プラスミドを得る。ｔＯｘ ＡにはＬＴプロ
ヒーターが存在するので、ベクター上の任意の部位に挿
入可能である。得られた１ヲスミドの代表例は、たとえ
ばｐＪＹ３４ｂ（アンピシリン耐性。
子量２６．８０．、Ｑ 、’ｊＯＸ Ａ ）のＣ末端側
を欠失させるような形でＬＴのフ゛ロモーターｔｔｏｘ
Ａ領域（部分）を゛ベクターに挿入し、毒素活性のな
いＬＴＡ誘導体（分子ｉ ｉ ７．０００． 、 Ｌ
Ｔ※ Ａ）産生プラスミドを得る。ｔＯｘ ＡにはＬＴプロ
ヒーターが存在するので、ベクター上の任意の部位に挿
入可能である。得られた１ヲスミドの代表例は、たとえ
ばｐＪＹ３４ｂ（アンピシリン耐性。
ＬＴＡ＊産生）（第２図Ｂおよび文献９）。
ＣＦＡ遺伝子をもつ１ラスミドの調製
ＤＯ８１はＣＦＡ遺伝子のを１か、ＳＴ遺伝子をもち、
これから産生されたＳＴけｐＪＹｌｌの産生する８Ｔよ
りも強い活性を示した。ｐ ＣＳ−１ｔＰｅｔＩ切断ま
たはＥＱＯＲＩ切断に付し、ＳＴ遺伝子を除去してＣＦ
Ａを産生ずるプラスミＦを得る。
これから産生されたＳＴけｐＪＹｌｌの産生する８Ｔよ
りも強い活性を示した。ｐ ＣＳ−１ｔＰｅｔＩ切断ま
たはＥＱＯＲＩ切断に付し、ＳＴ遺伝子を除去してＣＦ
Ａを産生ずるプラスミＦを得る。
かかるプラスミドの代表例としては、たとえばｐＪＹ４
０（カナマイシン耐性、ＣＦＡ産生）などがある（文献
１０）。
０（カナマイシン耐性、ＣＦＡ産生）などがある（文献
１０）。
ワクチン株の調製
本発明者らはＬＴＢが効率よく細胞外に放出されること
、ＬＴＡ産生１フスミドだけではＬ Ｔ Ａは細胞外に
全く放出されないことそしてＬＴＡの放出に当って、Ｌ
ＴＢが重要な働きをしていることを発見した（文献１１
）。これを発展させて有用性の高い生菌ワクチンを製進
することができる。
、ＬＴＡ産生１フスミドだけではＬ Ｔ Ａは細胞外に
全く放出されないことそしてＬＴＡの放出に当って、Ｌ
ＴＢが重要な働きをしていることを発見した（文献１１
）。これを発展させて有用性の高い生菌ワクチンを製進
することができる。
すなわち、ＣＦＡ産生プラスミド、ＬＴＡ〜牛プ゛ラス
ミドおよびＬＴＢ産生デヲスミドを同一大腸菌に形質転
換操作によ）導入し、腸管粘備絢胞への定膚性因子（Ｃ
ＦＡ）およびトキソイド（■、Ｔ※ ＡおよびＬＴＢ）産生生菌ワクチンを得る。マタ薬剤耐
性以外の選択標識を４つプラスミＦを調製し、形質転換
操作で大腸菌に導入し、非薬剤耐性生菌ワクチンを得る
こともできる。薬剤耐性以外の選択標識としては、たと
えばファージ耐性遺伝子、乳糖分解遺伝子、）す７”）
ファン合成遺伝子などのアミノ酸合成遺伝干などを用い
ることができる。
ミドおよびＬＴＢ産生デヲスミドを同一大腸菌に形質転
換操作によ）導入し、腸管粘備絢胞への定膚性因子（Ｃ
ＦＡ）およびトキソイド（■、Ｔ※ ＡおよびＬＴＢ）産生生菌ワクチンを得る。マタ薬剤耐
性以外の選択標識を４つプラスミＦを調製し、形質転換
操作で大腸菌に導入し、非薬剤耐性生菌ワクチンを得る
こともできる。薬剤耐性以外の選択標識としては、たと
えばファージ耐性遺伝子、乳糖分解遺伝子、）す７”）
ファン合成遺伝子などのアミノ酸合成遺伝干などを用い
ることができる。
上記説明では患者由来大腸菌Ｈ１０４０７株のプラスミ
ドを用いて大腸生菌ワクチンを得る場合を述べたが、こ
の他患者由来毒素原性大腸菌の示すいることも可能であ
る。さらに上記ではＣＦＡ 。
ドを用いて大腸生菌ワクチンを得る場合を述べたが、こ
の他患者由来毒素原性大腸菌の示すいることも可能であ
る。さらに上記ではＣＦＡ 。
Ｔ、ＴＡ、ＬＴＢ産生遺伝子をもつ各々のプラスミドを
作成しているが、３種類の産生遺伝子の２つまたは３つ
を同一１フスミドに含ませることもできる。
作成しているが、３種類の産生遺伝子の２つまたは３つ
を同一１フスミドに含ませることもできる。
また、同様に動物の下痢由来の毒素原性大腸菌のもつ例
えばブタ由来のに８Ｂ抗原遺伝子（文献１３）やウシ由
来のに９９抗原遺伝子（文献１４）を既報に従ってＣＦ
Ａ産生遺伝子をクローニングし、これを上述のＣＦＡ／
Ｉ遺伝子の代りに用いることによシ、これら動物用の大
腸菌生菌ワクチンを製造することができる。
えばブタ由来のに８Ｂ抗原遺伝子（文献１３）やウシ由
来のに９９抗原遺伝子（文献１４）を既報に従ってＣＦ
Ａ産生遺伝子をクローニングし、これを上述のＣＦＡ／
Ｉ遺伝子の代りに用いることによシ、これら動物用の大
腸菌生菌ワクチンを製造することができる。
細胞外放出成分の検出方法を以下に記す。
ＬＴ活性は、チャイニーズ ハムヌター卵巣由来のＣＨ
Ｏ−Ｋｌ細胞の形態変化（文献１５）によシ測定した。
Ｏ−Ｋｌ細胞の形態変化（文献１５）によシ測定した。
８Ｔ活性は、乳のみマウス法（文献１６）により測定し
た。ＣＦＡ（腸管付着性蛋１りの検出は、マ、ンノース
存在下での人赤血球凝集反応によった（文献１）。ＬＴ
サブユニツ）（ＬＴＡまたはＬＴＢ）蛋白の検出には、
ラテックス法を用いた。
た。ＣＦＡ（腸管付着性蛋１りの検出は、マ、ンノース
存在下での人赤血球凝集反応によった（文献１）。ＬＴ
サブユニツ）（ＬＴＡまたはＬＴＢ）蛋白の検出には、
ラテックス法を用いた。
形質転換する微生物としては大腸菌（ＦＡａｈｐ ｒｊ
＋・ｈｉｌｌａｏｌｉ） 、す〜モネフ菌、クレプシエ
フ、エルシニアなとの腸内細菌および緑膿菌などのいず
れを用いてもよい。また、自然界から分離されるコレラ
菌には、コレラ毒素非産生の菌株が見いだされている（
文献１７）ので、これらの毒素非産生コレラ面を本発明
のプラスミドで形質転換させてコレラに対する生菌ワク
チンを製造することもてきる。
＋・ｈｉｌｌａｏｌｉ） 、す〜モネフ菌、クレプシエ
フ、エルシニアなとの腸内細菌および緑膿菌などのいず
れを用いてもよい。また、自然界から分離されるコレラ
菌には、コレラ毒素非産生の菌株が見いだされている（
文献１７）ので、これらの毒素非産生コレラ面を本発明
のプラスミドで形質転換させてコレラに対する生菌ワク
チンを製造することもてきる。
本発明によって形質転換させた微生物は、野性菌株と同
様にして培養することができる（文献１９）。培養によ
り得られる生菌体は、生菌ワクチンとして、野性菌株を
含む生菌ワクチン（文献１９）と同様にして経口的に温
血動物（啄、牛。
様にして培養することができる（文献１９）。培養によ
り得られる生菌体は、生菌ワクチンとして、野性菌株を
含む生菌ワクチン（文献１９）と同様にして経口的に温
血動物（啄、牛。
ｐ、家禽２人間など）とりわけ哺乳動物に投与すること
により、当該動物体内に抗体を産生させ、ｍ素原性細菌
感染から防禦することができる。また、生菌体を除去し
た培養処理物たとえば培養炉液を上記動物に注射するこ
とにより、非経口的にＩＩｉ素原性ｍ菌感染防禦の１的
を達することもできる、 ＤＩ Ｔに、本発明のＣＦＡ 、ＬＴＡならびにＬＴＢ
遺伝Ｊ！−を含む組換えＤＮＡおよび該ＤＮＡで形質転
換した微生物を創製例に基づいてさらに具体けＪＫａＱ
明するが、当該創製例はなんら本発明を制限するもので
はない。
により、当該動物体内に抗体を産生させ、ｍ素原性細菌
感染から防禦することができる。また、生菌体を除去し
た培養処理物たとえば培養炉液を上記動物に注射するこ
とにより、非経口的にＩＩｉ素原性ｍ菌感染防禦の１的
を達することもできる、 ＤＩ Ｔに、本発明のＣＦＡ 、ＬＴＡならびにＬＴＢ
遺伝Ｊ！−を含む組換えＤＮＡおよび該ＤＮＡで形質転
換した微生物を創製例に基づいてさらに具体けＪＫａＱ
明するが、当該創製例はなんら本発明を制限するもので
はない。
創製例
（ｔ） ｃ ＦＡ ／ Ｉ産生組換えプラスミドの調
製Ｅ ｖａｎｅらの方法（文献１）に従いｐｃｓ １（
分子量約６１Ｘ１０ ）を得ろうこのｐｃｓｌＫカナ
マイシントランスボゾン（Ｔｎ５）転移させ１）Ｃ８ｌ
：：Ｔｎ５を得る。ｐｃｓｌ：：Ｔｎ５ＤＮＡをｐ＠ｔ
工で部分消化し、リガーゼで再結合する。この再結合
物の中には１．７ Ｋ ｂの８Ｔ遺伝子（文献１０）を
もつＰｓりｔｌ フラグメント（第３図参照）を失った
プラスミドＤＮＡが含まれるので、該ＤＮＡをカナマイ
シン剛性を標識として形質転換により大腸菌に導入しＣ
ＦＡ の菌株を燐ぶ。これらの菌株からカナマイシン耐
性とＣＦＡ／■産生を示すプラスミド（分子量約３０Ｘ
ｌＯ。
製Ｅ ｖａｎｅらの方法（文献１）に従いｐｃｓ １（
分子量約６１Ｘ１０ ）を得ろうこのｐｃｓｌＫカナ
マイシントランスボゾン（Ｔｎ５）転移させ１）Ｃ８ｌ
：：Ｔｎ５を得る。ｐｃｓｌ：：Ｔｎ５ＤＮＡをｐ＠ｔ
工で部分消化し、リガーゼで再結合する。この再結合
物の中には１．７ Ｋ ｂの８Ｔ遺伝子（文献１０）を
もつＰｓりｔｌ フラグメント（第３図参照）を失った
プラスミドＤＮＡが含まれるので、該ＤＮＡをカナマイ
シン剛性を標識として形質転換により大腸菌に導入しＣ
ＦＡ の菌株を燐ぶ。これらの菌株からカナマイシン耐
性とＣＦＡ／■産生を示すプラスミド（分子量約３０Ｘ
ｌＯ。
ｐＪＹ４０ ）が得られる。
（２）ＬＴＢ産生産生光プラスミドの調製Ｙａｍａｍｏ
ｔｏらの方法（文献８）に従った。７ｐＪＹＬ２２９９
ＤＮＡをＰｅｔ １とＥＯＯ）？ Ｉでター）のＥａｏ
ＲＩ・ＰｓｔＩ部位に挿入した ｐＪＹ２４（テトフサ
イクリン耐性）を得る。
ｔｏらの方法（文献８）に従った。７ｐＪＹＬ２２９９
ＤＮＡをＰｅｔ １とＥＯＯ）？ Ｉでター）のＥａｏ
ＲＩ・ＰｓｔＩ部位に挿入した ｐＪＹ２４（テトフサ
イクリン耐性）を得る。
＜３）ＬＴ／’産生組換えフ”ラスミドの調製Ｙａｙｎ
ａｍｏｔｏらの方法（文献９）に従った。
ａｍｏｔｏらの方法（文献９）に従った。
ｐＪＹＬ２２９９ＤＮＡをＨｌｎｄ ｌで一切断し、Ｌ
ＴプロモーターとＣ末端ＩＱＩＩから０．２５−０．３
ｘｂ１７７（ベクター）の１ｉｎｄ ］１１部に挿入Ｌ
ａｐ、Ｔ Ｙ ３４ ｂ（アンピシリン耐性）を得る。
ＴプロモーターとＣ末端ＩＱＩＩから０．２５−０．３
ｘｂ１７７（ベクター）の１ｉｎｄ ］１１部に挿入Ｌ
ａｐ、Ｔ Ｙ ３４ ｂ（アンピシリン耐性）を得る。
（４）ワクチン株の調製（１）
ｐＪＹ４０ 、ｐＪＹ３４ｂとｐＪＹ２４の３つのプラ
スミドを同一大腸菌に形質転換操作（文献１８）により
導入する。この大腸菌は薬剤耐性をもつ。
スミドを同一大腸菌に形質転換操作（文献１８）により
導入する。この大腸菌は薬剤耐性をもつ。
（５） ワクチン株の調製（２）
ｒＪＹ４０ 、Ｉ）ＪＹ３４？）とｐＪＹ２４からそれ
ぞれＬＴ７”ロモーターとｔａｘ １３領域、ｔｏ！
Ａ部分、ＣＦ’Ａ／Ｉ遺伝子をもつフラグメントを、そ
してファージ耐性遺伝子をもつフラグメントをＲ’ｊ・
・Ｉ（Ｔ４耐性遺伝子をもつ）制限酵素を用い−ｔ Ｎ
４ Ｈし、フラグメントの両末端にある一本鎖ＤＮＡ部
分をＤＮＡポリメラーゼを用いて２本鎖にする。これら
のフラグメントを順次、ｐＢＲ３２２の薬剤耐性遺伝子
部分にある制限部位にＴ４Ｄ Ｎ、 Ａ ！Ｊガーゼ管
用いて結合させる。最終的にファージ耐性を示しかつＬ
Ｔ Ｂ 、 ＬＴ Ａ 、 ＣＦＡ／Ｉを産生ずる組換
え１ラスミドを調製する。このブ′フスミドをファージ
耐性を標識にして、形質転換により大腸菌に導入する。
ぞれＬＴ７”ロモーターとｔａｘ １３領域、ｔｏ！
Ａ部分、ＣＦ’Ａ／Ｉ遺伝子をもつフラグメントを、そ
してファージ耐性遺伝子をもつフラグメントをＲ’ｊ・
・Ｉ（Ｔ４耐性遺伝子をもつ）制限酵素を用い−ｔ Ｎ
４ Ｈし、フラグメントの両末端にある一本鎖ＤＮＡ部
分をＤＮＡポリメラーゼを用いて２本鎖にする。これら
のフラグメントを順次、ｐＢＲ３２２の薬剤耐性遺伝子
部分にある制限部位にＴ４Ｄ Ｎ、 Ａ ！Ｊガーゼ管
用いて結合させる。最終的にファージ耐性を示しかつＬ
Ｔ Ｂ 、 ＬＴ Ａ 、 ＣＦＡ／Ｉを産生ずる組換
え１ラスミドを調製する。このブ′フスミドをファージ
耐性を標識にして、形質転換により大腸菌に導入する。
文献
１、 工ｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、１２： ６５６ ６
６７（１９７５）２、 工ｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎ
、 １９： １０２１−１０３０（１９７８）３、
Ｊ、 ＭｅｄｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ３ ： ３
８７−４０１（１９７０）４、 Ｐｒｏｏ、 １５ｔｈ
Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｎｆ、 ＣｈｏｌｅｒＱＵ！”１−
Ｊａｐａｎ （Ｃｏｏｐ、 Ｍｅｄ、Ｓｃｉ、 Ｐｒｏ
ｇ、、 １４２−１４７ （１９８０） ５、 Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５２
： ３１９３３４（１９６８） ６、 Ｎａｔｕｒｅ ２７７： ４５３−４５６
（１９７９）７、：ｒ、 ＢａｃｔｅｒｉＯｌ、 １
４３ ＋ ６５２−６６０（１９８０）８、 Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、 １４５ ： ８５０−８６
０（１９Ｂ１）９、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４
８ ： ９８３−９８７（１９８１）１０１１丁、
Ｂ−Ｌｃｔｅｒｉｏｌ、投稿中１１、 、Ｔ、 Ｂ
ａｃｔｎｒｉｏｌ、 １５Ｑ ：印刷中（１９８２）１
２、 Ｉｎｆｎｃｔ、 工ｍｍｕｎ、２１ ：６３
Ｂ−６４７（１９７Ｂ）１３、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、 １４５ ：９２０−９２５（１９８１）１
４、 Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、２９ ：１１２
５ １１３３（１９８０）１５、 Ｉｎｆ＋ｑｃｔ、
、 ■ｆｉｌｌ！１ｕ１１．ＩＱ ：３２０−３２
７（１９７４）□＋− １６、；ｒ、ＩｎｆｅｃＪ Ｄｉｅ、１２５：４０７
−４１１ （１９７２）１７、 ＴｎｆｎＯｔ、
工ｍｍｕｎ、３２： ６６１−６６７（１９８１
）１８、 Ｐｒｏａ、Ｎａｔｌ、Ａｏａａ、３ｃｉ、
Ｕ、Ｓ、Ａ、５９ ：ゝ＼
□２１１０−２１１４（１９７２）
６７（１９７５）２、 工ｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎ
、 １９： １０２１−１０３０（１９７８）３、
Ｊ、 ＭｅｄｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ３ ： ３
８７−４０１（１９７０）４、 Ｐｒｏｏ、 １５ｔｈ
Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｎｆ、 ＣｈｏｌｅｒＱＵ！”１−
Ｊａｐａｎ （Ｃｏｏｐ、 Ｍｅｄ、Ｓｃｉ、 Ｐｒｏ
ｇ、、 １４２−１４７ （１９８０） ５、 Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５２
： ３１９３３４（１９６８） ６、 Ｎａｔｕｒｅ ２７７： ４５３−４５６
（１９７９）７、：ｒ、 ＢａｃｔｅｒｉＯｌ、 １
４３ ＋ ６５２−６６０（１９８０）８、 Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、 １４５ ： ８５０−８６
０（１９Ｂ１）９、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４
８ ： ９８３−９８７（１９８１）１０１１丁、
Ｂ−Ｌｃｔｅｒｉｏｌ、投稿中１１、 、Ｔ、 Ｂ
ａｃｔｎｒｉｏｌ、 １５Ｑ ：印刷中（１９８２）１
２、 Ｉｎｆｎｃｔ、 工ｍｍｕｎ、２１ ：６３
Ｂ−６４７（１９７Ｂ）１３、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、 １４５ ：９２０−９２５（１９８１）１
４、 Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、２９ ：１１２
５ １１３３（１９８０）１５、 Ｉｎｆ＋ｑｃｔ、
、 ■ｆｉｌｌ！１ｕ１１．ＩＱ ：３２０−３２
７（１９７４）□＋− １６、；ｒ、ＩｎｆｅｃＪ Ｄｉｅ、１２５：４０７
−４１１ （１９７２）１７、 ＴｎｆｎＯｔ、
工ｍｍｕｎ、３２： ６６１−６６７（１９８１
）１８、 Ｐｒｏａ、Ｎａｔｌ、Ａｏａａ、３ｃｉ、
Ｕ、Ｓ、Ａ、５９ ：ゝ＼
□２１１０−２１１４（１９７２）
Claims (3)
- （１） ＣＦＡ構造遺伝子を含むことを特徴とする組換
えＤＮＡ０ - （２）ＣＦＡ構造遺伝子を含むＤ Ｎ Ａ、 、 Ｌ
Ｔ ｔｉ！構造遺伝子を含むＤＮＡおよびＬＴＢ構造遺
伝子を含むＤＮＡで形質転換させた微生物、。 - （３）ＣＦＡ構造遺伝子を含む工）ＮＡ、ＬＴＩ構造遺
伝子を含むＤＮＡおよびＬＴＢ構造遺伝子を含むＤＮＡ
で形質転換させた微生物の培養物もしくはそれの処理物
を含有する、毒素原性細菌感染防禦剤。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3005982A JPS58146596A (ja) | 1982-02-25 | 1982-02-25 | 組換えｄｎａ、それで形質転換させた微生物およびそれらの用途 |
| EP83101714A EP0087735A3 (en) | 1982-02-25 | 1983-02-23 | Recombinant dna, microorganism transformed therewith and their use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3005982A JPS58146596A (ja) | 1982-02-25 | 1982-02-25 | 組換えｄｎａ、それで形質転換させた微生物およびそれらの用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58146596A true JPS58146596A (ja) | 1983-09-01 |
Family
ID=12293251
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3005982A Pending JPS58146596A (ja) | 1982-02-25 | 1982-02-25 | 組換えｄｎａ、それで形質転換させた微生物およびそれらの用途 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0087735A3 (ja) |
| JP (1) | JPS58146596A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8333131D0 (en) * | 1983-12-12 | 1984-01-18 | Glaxo Group Ltd | Microbiological process |
| IT1217303B (it) * | 1984-02-01 | 1990-03-22 | Enterovax Res Pty Ltd | Ceppi batterici particolarmente utili per la produzione di vaccini per il trattamenmto di malattie intestinali e simili e metodo di ingegneria gentica per la produzione dei detti vaccini |
| CA1340372C (en) * | 1984-07-09 | 1999-02-02 | John D. Clements | Production of e. coli lt-b enterotoxin subunit |
| ATE80179T1 (de) * | 1986-12-23 | 1992-09-15 | Univ Leland Stanford Junior | Modifiziertes pertussistoxin. |
| EP0314224B1 (en) * | 1987-10-26 | 1992-05-27 | Akzo N.V. | Vaccine against e.coli septicaemia in poultry |
| GB0121998D0 (en) * | 2001-09-11 | 2001-10-31 | Acambis Res Ltd | Attenuated bacteria useful in vaccines |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2094314A (en) * | 1981-02-05 | 1982-09-15 | Wellcome Found | Recombinant DNA |
| NZ199866A (en) * | 1981-03-09 | 1984-11-09 | Cetus Corp | Vaccine for prevention of gastroenteric disease:non-pathogenic strain genetically engineered to comprise genes for adhesin and/or toxoids |
-
1982
- 1982-02-25 JP JP3005982A patent/JPS58146596A/ja active Pending
-
1983
- 1983-02-23 EP EP83101714A patent/EP0087735A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0087735A3 (en) | 1983-11-16 |
| EP0087735A2 (en) | 1983-09-07 |
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