JPH03502881A

JPH03502881A - 淋菌ｐｉタンパク質およびワクチンの製造

Info

Publication number: JPH03502881A
Application number: JP1500595A
Authority: JP
Inventors: カルボネッティ，ニコラス，エィチ; スパーリング，ピー，フレデリック
Original assignee: ザ　ユニバーシティ　オブ　ノースカロライナ
Priority date: 1987-11-24
Filing date: 1988-11-23
Publication date: 1991-07-04
Anticipated expiration: 2013-09-24
Also published as: DK175831B1; EP0395706A1; FI102189B; DE3856240T2; US6068992A; EP0869133A1; ATE169958T1; NO902251L; EP0395706A4; CA1340506C; AU2795989A; EP0395706B1; JP2803058B2; AU629807B2; KR970011309B1; DK128490D0; US5736361A; JP3388171B2; NO902251D0; NO302622B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】３６゜ａ）プロティンＩＢの免疫反応性抗原決定基を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有してなりかつ宿主内で複製、転写および翻訳され得るものである組換えベクターを宿主生物に導入し、ｂ）組換えベクターを含有する単細胞生物を培養し、そしてＣ）培養物から該ポリペプチドを単離する、ことからなる、ナイセリア・ゴノロエアエプロテインＩＢの免疫反応性抗原決定基を有するポリペプチドの生産方法。

３７、ベクターがプラスミドである請求の範囲第３６項の方法。

３８、第９図に示すようにプラスミドが配列またはその一部分、突然変異体、あるいは組換え体を有してなる請求の範囲第３７項の方法。

３９、プラスミドがｐＧＥＭ−２から誘導される請求の範囲第３８項の方法。

４０、プラスミドがｐＵＮＣＨ２、特許請求の範囲第３９項の方法。

４１、請求の範囲第３６項の方法により生産されたポリペプチド。

４２、請求の範囲第３８項の方法により生産されたポリペプチド。

４３、請求の範囲第４０項の方法により生産されたポリペプチド。

４４、第９図に示すポリペプチド配列、その相同物、類似物、または活性部分。

４５、ナイセリア・ゴノロエアエのハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質をコードする精製遺伝子配列、またはプロティンＩＡおよびプロティンＩＢの免疫反応性抗原決定基を有するポリペプチドをコードするその一部分、突然変異体、または組換え体。

４６、請求の範囲第４５項の配列を有してなる組換えベクター。

４７、請求の範囲第４５項の配列を含有する宿主生物。

４８、請求の範囲第４６項のベクターを含有する単細胞生物。

４９、プロティンＩＡ及びプロティンＩＢの各々について少な（とも一つの免疫反応性抗原決定基を有してなるポリペプチド配列。

５０、請求の範囲第１５項または請求の範囲第３６項の方法により生産された免疫原的に有効な量のポリペプチドを、医薬上許容されうる担体と組み合わせて含有するナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防または治療のためのワクチン組成物。

５１、請求の範囲第１７項または請求の範囲第３８項の方法により生産された免疫原的に有効な量のポリペプチドを、医薬上許容されうる担体と組み合わせて含有するナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防及び治療のためのワクチン組成物。

５２、請求の範囲第１９項または請求の範囲第４０項の方法により生産された免疫原的に有効な量のポリペプチドを、医薬上許容されつる担体と組み合わせて含有するナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防及び治療のためのワクチン組成物。

５３、請求の範囲第２３項または請求の範囲第４４項の、免疫原的に有効な量のポリペプチドを、医薬上許容されうる担体と組み合わせて含有するナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防及び治療のためのワクチン組放物。

５４．請求の範囲第１５項または請求の範囲第３６項の方法により生産された免疫原的に有効な量のポリペプチドを宿主に投与することからなるナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防または治療法。

５５、請求の範囲第１７項または請求の範囲第３８項の方法により生産された免疫原的に有効な量のポリペプチドを宿主に投与することからなるナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防または治療法。

５６、請求の範囲第１９項または請求の範囲第４０項の方法により生産された免疫原的に有効な量のポリペプチドを宿主に投与することからなるナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防または治療法。

５７、請求の範囲第２３項または請求の範囲第４４項の免疫原的に有効な量のポリペプチドを宿主に投与することからなるナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防または治療法。

５８、ナイセリア・ゴノロエアエのＤＮＡ配列のプロティン■をコードする部分と相補性であってこれとハイブリッド形成できるＤＮＡ配列を含有することを特徴とする、ナイセリア・ゴノロエアエの同定に有用なりＮＡプローブ。

５９、配列：　５’　ＡＣＧＣＣＧＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＣ３°を有する請求の範囲第５８項のＤＮＡプローブ。

を有する請求の範囲第５８項のＤＮＡプローブ。

６１、分析的に検出可能な試薬で標識された請求の範囲第５８、または５９または６０のプローブ。

６２、ナイセリア・ゴノロエアエのＤＮＡ配列のプロティンＩＡをコードする部分と相補性であってこれとハイブリッド形成できるＤＮＡ配列を含有することを特徴とする、ナイセリア・ゴノロエアエの検出に有用なりＮＡプローブ。

６３、配列：　５’　ＧＣＧＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＡＣＣ３’　を有する請求の範囲第６２項のＤＮＡプローブ。

６４、配列＝５°ＣＧＧＴＧＴＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＣ３’　を有する請求の範囲第６２項のＤＮＡプローブ。

６５、配列：　５’　ＴＣＧＡＡＣＣＣＡＡＡＴＣＡＧＣＧ３°を存する請求の範囲第６２項のＤＮＡプローブ。

−６６、配列：　５’　ＡＡＧＴＧＣＧＣＧＴＣＧＧＣＣＧＴ３°を有する請求の範囲第６２項のＤＮＡプローブ。

６７、配列：　５’　ＧＡＣＴＴＧＧＣＧＣＡＡＣＧＡＴＡＡ３°を有する請求の範囲第６２項のＤＮＡプローブ。

６８、配列：５°ＧＣＡＡＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＣＣＣ３°を有する請求の範囲第６２項のＤＮＡプローブ。

６９、・分析的に検出可能な試薬で標識された請求の範囲第６２または６３または６４または６５または６６または６７または６８のプローブ。

７０、ナイセリア・ゴノロエアエのＤＮＡ配列のプロティンＩＢをコードする部分と相補性であってこれとハイブリッド形成できるＤＮＡ配列を含有することを特徴とするナイセリア・ゴノロエアエ検出に有用なりＮＡプローブ。

７１、配列：５°ＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＣＴ３’　を有する請求の範囲第６８項のＤＮＡプローブ。

７２、配列：　５’　ＣＡＡＧＧＴＧＣＣＴＣＣＧＴＣＧＣ３°を有する請求の範囲第６８項のＤＮＡプローブ。

７３、配列：　５’　ＧＣＡＧＣＧＴＡＣＡＡＴＡＣＧＡＣ３°を有する請求の範囲第６８項のＤＮＡプローブ。

７４、配列：　５’　ＡＧＧＣＡＣＴＧＴＴＧＡＴＡＧＴＧＣ３°を有する請求の範囲第６８項のＤＮＡプローブ。

７５、分析的に検出可能な試薬で標識された請求の範囲第７０または７１または７２または７３または７４のプローブ。

７６゜ａ）Ｎ、　ゴノロエアエのＤＮＡゲノムのプロティンＩをコードする部分と相補性であるプローブをＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成を促進する条件下で検体と接触させ、そしてｂ）形成されたハイブリッドすべてを検出し、それによって該検体中のＮ、ゴノロエアエの存在を検出する、ことからなるＮ、ゴノロエアエを含有する疑いのある検体中の該菌を検出する方法。

７７、プローブが請求の範囲第５９項のプローブである請求の範囲第７６項の方法。

７８、プローブが請求の範囲第６０項のプローブである請求の範囲第７６項の方法。

７９、プロティン■がプロティンＩＡである請求の範囲第７６項の方法。

８０、プローブが請求の範囲第６３．６４．６５．６６、６７、または６８項のプローブである請求の範囲第７９項の方法。

８１、プロティンＩがプロティンＩＢである請求の範囲第７６項の方法。

８２、プローブが請求の範囲第７１．７２．７３．　または７４項のプローブである請求の範囲第８１項の方法。

８３、プローブが分析的に検出可能な試薬で標識された請求の範囲第７６または７７または７８または７９または８１項の方法。

８４、プローブが分析的に検出可能な試薬で標識された請求の範囲第８０項の方法。

８５、プローブが分析的に検出可能な試薬で標識された請求の範囲第８２項の方法。

８６、請求の範囲第５８−７２項のいずれかのプローブのうち少なくとも一つを有してなる診断テストキット。

８７、　ＡＴＣＣ５３８０８と同一の特性を有するナイセリア・ゴノロエアエ菌株。

明細書淋菌ＰＩタンパク質およびワクチンの製造米国では毎年数百方何が発生している。この疾患の病原菌は淋菌ナイセリア・ゴノロエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）であり、この細菌はその歴史を通して伝統的な抗生物質治療に対する耐性およびある程度までの正常ヒト血清の抗菌活性に対する耐性の両方を発達させてきた。伝統的手段による感染の防御が不可能であるために、この感染を効果的に阻止しうるワクチンの開発が極めて重要となっている。本発明は、特定のナイセリア・ゴノロエアエ外層膜タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供し、またこの特定ＤＮＡ配列のクローン化産物は前記ワクチンの適当な主成分を提供する。また、本発明は淋菌感染を検出するための診断用プローブとして有用な種−特異的オリゴヌクレオチド配列をも提供する。

２、発明の背景を椎動物における任意の特定の感染因子に対する防御免疫応答の発生は、初めに宿主免疫系に適当な刺激が与えられるか否かの如何による。感染性生物自体は一般に、またはその細胞膜組成の性質によるか、またはそれが宿主体内に放出する代謝産物により、多数の刺激性化合物（すなわち、抗原）を提供する。これらの物質（通常、タンパク質、リポ多糖類、糖タンパクのような比較的大きい分子）は免疫系によって異物として認識され、そして侵入生物を排除または無力にしようとして宿主から１種またはそれ以上の異なる種類の反応をひき出す。この抗原は細胞性免疫を与える感作リンパ球（Ｔ細胞）の生産を惹起しうる。あるいはまた、抗原は遊離抗体の合成および血液または他の体液中への遊離抗体の放出を刺激することができる（体液性免疫）。身体の防御免疫応答の発生はこれらの系の一方または両方の刺激閾値に達するか否かの如何によっている。

感染に対する一時的免疫は、多くの場合同種または異種の別の個体から前辺て産生された抗体を与えることによって付与されつる。これは受動免疫として知られている。このような免疫の例としては、母親の抗体の胎盤移入および母乳を通しての抗体の移入により胎児や新生児に与えられる防御がある。その他の例としては、はしか、水ぼうそう、肝炎、天然痘および破傷風にさらされた際のその作用を阻止もしくは軽減するためにしばしば用いられるプールされた成人γ−グロブリンがある。しかしながら、これら獲得抗体は抗原との相互作用により徐々に利用されるか、または生体により異化作用を受け、その結果終局的には防御が失われる。

より永続的な形態の防御は能動免疫により与えられる。ワクチン接種では免疫系に対する一次刺激として無害のまたは毒性のない形の抗原（例えば、死滅したまたは遺伝学的に変えられた細菌、もしくは細胞壁から単離した糖タンパク）を使用することにより能動防御免疫が賦与される。これは最高に達しその後減少する抗体産生においてやや遅い応答を引き起こす。しかしながら、身体は抗原の存在を警戒しており、その次に、恐らくは生きた毒性の強い生物にさらされると、より一層速やかで豊富な抗体産生を伴う二次応答が観察される。この二次応答は一般に微生物が全面的な感染を引き起こすに足るほどに定着するのを阻止するに十分であろう。

ワクチンはいろいろな形をとることができ、そのうちのあるものは所望の防御効果を賦与するのに他のものよりも有効である。歴史的にみると、多くのワクチンは対象の疾患を起こす微生物を死滅または不活性化し、その死滅細胞を能動免疫原として用いることにより製造されてきた。この種のワクチンは腸チフス、コレラおよびポリオ（ソークワクチン）に対して使用されている。この種のワクチンがかかえる問題は、微生物を殺すのに必要な処理（例えば、ホルムアルデヒド）が往々にして微生物の有用な抗原を変性または破壊し、従って不完全な弱い免疫しか得られない場合があるということである。

ワクチンの別の形は弱毒化微生物を使用するものである。弱毒化微生物はまだ生きていて投与後体内で増殖できるが、無発病性となすために何らかの方法で改変されているものであるか、あるいは他の生物には発病力があるがヒトには無毒の株である。弱毒化生物を使用することの利点は、弱毒化が通常その抗原性に影響を及ぼさず、従って免疫系により効果的な刺激を与えることである。はしか、風疹およびポリオ（セービンワクチン）の弱毒化ワクチンが広く用いられている。

弱毒化は代表的には微生物の増殖条件を変えるか、または、最近では微生物の毒性を遺伝子的に修飾することにより達成される。大体において、弱毒化ワクチンは死滅ワクチンよりも効果的であるが、生存微生物が毒性状態に戻って病気の症状を引き起こす可能性があるという危険が存在する。

微生物全体使用ワクチンに関連した諸問題のために、近年ではワクチン組成物中における活性物質として個々の感染防御抗原を使用することがより一般的になってきている。感染防御性応答を刺激する生物の特定抗原の分離および同定は必ずしも単純ではないが、ひとたび同定されると、この方法は欠点が付随することのない、微生物全体使用ワクチンに代わるべき有効な代替物を提供するものである。

この目的に使用しうる代表的な抗原の種類の例をあげれば、精製された細胞またはカプシド成分、例えばバクテリアトキシン（トキソイドを生成させるには解毒されねばならない）、細菌またはウィルスのトキシンサブユニット、細胞壁多糖類、もしくはカプシド糖タンパクである。これらの成分は免疫性を賦与するのにはしばしば非常に効果的であるが、実際の精製の点で困難が生ずる。対象の抗原を無関係の細胞物質（これらの存在は往々にして所望免疫生成反応と同時に不利な免疫学的または代謝上の応答を引き起こしつる）から多かれ少なかれ完全に単離することが決定的に重要である。必要とされる精製方法はしばしば複雑で、退屈で、しかも費用が莫大にかかり、その結果を必ずしも完全に予想できるわけではない。この問題は、ある場合には、微生物抗原上のエピトープに相当する小型ペプチド配列の合成によって回避できる。いくつかの状況においては、アミノ酸配列が天然のエピトープ配列に一致するが、そのコンホメーションが適切な免疫応答を誘起させるに足るほど親抗原のそれに類似していないかもしれないという欠点がこの技術には存在する。

これらの種類の前記ワクチンに付随する欠点の多（は組換えＤＮＡ技術の使用により回避できる。重要な微生物抗原の全部または一部をコードする遺伝子をクローニングすることができれば、実質的に夾雑するタンパク性または遺伝子物質を含まない比較的大量の必要な免疫原性物質のより経済的で便利な供給源が得られる。簡単に説明すると、精製抗原を得るためのこの方法は、抗原をコードする特定ＤＮＡ配列をＤＮＡベクターに挿入して、宿主細胞内で複製しうる組換えＤＮＡ分子を生成させることを包含する。現在、組換えＤＮＡ分子を作製しうる方法は数多く存在する。より優れた既知技術の１つは、ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒによって米国特許第４２３７２２４号に開示されたものである（この特許の教示内容は参照としてここにとり込まれるものとする）。この方法では制限酵素および連結反応を用いて組換えプラスミドを作製し、次に得られたプラスミドを単細胞宿主細胞に挿入し、これにより形質転換された宿主細胞が外来ＤＮＡの複製を開始する。バクテリオファージベクターを利用する別法は米国特許第４３０４８６３号に開示されている（これも参照としてここにとり込まれる）。クローニング法はすぐに利用できるワクチン製造のための経済的で、都合のよい供給源を提供する可能性が最も大きい。しかしながら、免疫原性をもつことが知られている抗原の適当な遺伝子を初めに単離し、その塩基配列を決定し、適切な複製、転写および翻訳が可能なようにプラスミドに挿入し、その後適合性の宿主細胞に挿入せねばならない点で困難がないわけではない。

もしも遺伝子の転写、ＲＮＡの翻訳、またはポリペプチドの翻訳後プロセッシングおよび区画化のいずれか１つが正しく行われないならば、所望の遺伝子産物の発現が失敗する可能性は非常に大きい。クローン化挿入物が転写されるためには、宿主ＲＮＡポリメラーゼが認識できるプロモーターの存在が必要である。適正な翻訳にはＲＮＡがリポソーム結合部位を育することが必要である。タンパク質の翻訳後修飾にはしばしばタンパク質を細胞膜を通ってその外へ導く機能をするシグナル配列の切断が包含される。また、タンパク質の立体配置やアミノ酸配列が宿主の細胞内のプロテアーゼの作用から保護されない場合には、生産された外来タンパク質の宿主微生物による分解が起こりうる。

従って、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ワクチンを最終的に製造する理想的な方法であるとは考えられるが、これらの技術が以前に淋病のワクチン製造に応用されたこナイセリア・ゴノロエアエのいくつかの抗原は広く研究され分類されている。例えば、淋菌のピリ（線毛）は分子量が約２００００のタンパクサブユニットから主に成っており、抗原性を有することが判明している（Ｂｕｃｈａｎａｎ等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　５２：２８９６−２９０９．１９７３）。

この物質の合成物はワクチンとてし製剤化された（Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ等、Ｐｒｏｇ、Ａｌｌｅｒｇｙ　３３：３１４−３３１．１９８３）。また、ナイセリア・ゴノロエアエのリボ多糖類も抗原性があり、β−１，４−結合ガラクトース− グルコース残基が主要な抗原決定基である。しかしなから、近年この分野における研究の最大の関心は恐らく、タンパク質複合体である外層膜タンパク（このタンパク質の免疫原性における役割はまだ十分に理解されていない）に集中している。外層膜タンパク質の組成は株によってやや変化することが知られており、これに基づいて少なくとも１６種類の異なる血清型が同定されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ等、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１４３ニア４１−７５８．１９７６）。淋菌の膜部分を用いた数多くのワクチン組成物が以前に、例えば米国特許第４２０３９７１号、同第４２８８５５７号および同第４６８１７６１号に記載されている。しかしながら、これらの組成物の大部分はタンパク質と他の物質との混合物を含有しており、細菌細胞から活性成分を単離および分離するにはかなり手の込んだ精製操作を必要とする。従って、これらのワクチンは希望する免疫特異性を有しない可能性があり、しかも商業的量のワクチンを製造するためには大変な量の微生物原料が必要である。

２．２．１．淋菌プロティン■ プロティン■またはＰＩとして知られる特定の外層膜タンパク質もワクチン組成物主成分として使用可能な候補者として提案される。ＰＩはボーリン（ｐｏｒｉｎ）として機能するナイセリア・ゴノロエアエの主要な外層膜タンパク質であり（Ｄｏｕｇｌａｓ等、ＦＥＭＳ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ　１２：３０５−３０９．　１９８１）　、このタンパク質は細胞においで低分子量物質を疎水性脂質外層膜を横切って通過させるように作用すると考えられている。ＰＩが関心を集める多くの特徴が存在する：第一に、それがナイセリアの血清型特異性に少なくとも幾分かは関与しており、比較的少数の抗原性プロティンＩ血清型が存在する。また、特定のＰＩ血清型を保存する多数の淋菌が複雑な淋菌感染に関係している。さらに、それは天然の状態で表面に露出していると思われ、また、オブソニンの生産を刺激すると思われる（Ｓａｒａｆ　ｉａｎ等、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　１４８．１０２５−１０３２．１９８３）。オブソニンは感染性微生物の表面に結合して食細胞による微生物の飲み込みを促進する抗体である。その免疫原性はワクチン接種マウスにおいてすでに立証されている（Ｊｉｓ−ｋｏｏｔ等、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５４：３３３−３３８．１９８６）。

主要な２種類のＰＩ分子であるＰＩＡおよびＰＩＢ（Ｂａｒｒｅｒａ等、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　４４：５６５−５６８．１９８４）がペプチドマツピングおよびタンパク質加水分解に対する感受性に基づいて淋菌において証明されている（Ｂｌａｋｅ等、Ｉｎｆｅｃｔ、ｒｍｍｕｎ、　３３：２１２−２２２．１９８１）。この分類は血清群パターン（Ｓａｎｄｓ　ｔ　ｒｕｍ等、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　３５：２２９−２３９、　１９８２　；Ｓａｎｄｓｔｒｕｍ等、ｒｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　３８：４６２−４７０゜１９８２）および病因と関連のあることが分かった。タンパク質ＩＡを発現する淋菌は全身感染に関係しており、一方タンパク質ＩＢを発現するものは局所感染と関係している（Ｂｕｃｈａｎａｎ等、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　３２：９８５−９９４゜１９８１　；　　Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ等、ｒｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　２０：２６７−２７３゜１９７８）。

可能性のあるワクチン候補としてのＰＩの開発に払われたあらゆる注意にもかかわらず、まだＰＩに基づく有効なワクチンはつくられていない。さらに、その生産を制御する遺伝子配列もまだ何ら解明されておらず、このタンパク質の構造についてはほとんど知られていない。本発明は完全なＰＩ遺伝子配列、ＰＩＡ構造遺伝子、およびクローン化遺伝子産物について初めて説明するものである。さらに、新規なＰＩＢ遺伝子配列と、これらの配列から誘導された特異なＰＩＡ−ＰＩＢキメラについても説明する。後者のキメラはエピトープマツピングの際に有用であり、ワクチン開発の基礎となるものである。

２．３８診断用プローブこの疾患に関して広範囲にゆきわたったもう一つの面は早期検出および診断の重要性である。淋病の診断に利用できる標準的な細菌学的試験法はもちろんあるが、かかる試験法は培養下のバクテリアの増殖を当てにしており、時間がかかり、しかも一般にあまり特異的でない。ナイセリア・ゴノロエアエは種々の血清型を有することが知られており、このことは前節で説明したように、この疾患の非常に明確なパターンを示すものでありうる。この疾患の適切な治療を行うためには、診断が迅速であるばかりでなく、できるだけ正確であることが決定的に重要である。

ＤＮＡ−およびＲＮＡ−プローブ技術の発達により、診断における多くのかかる問題に対する解答が与えられた。プローブは代表的には対象となる特定遺伝子の全部または一部と相補性であるＤＮＡまたはＲＮＡの放射性標識された一本鎖であり、従って、相補性核酸の一本鎖にさらされると、それにハイブリダイズするであろう。プローブはサザンブロッティングとして知られる技法で用いられ、その場合対象遺伝子を含有する疑いのある検体からのＤＮＡ断片をアガロースゲルで分離し、変性させて一本鎖を生成させ、次にニトロセルロースフィルターに移行させる。ここでそれらを予め選択された標識されたプローブとインキュベートすると、そのものは相補鎖にハイブリダイズして、その標識により目的遺伝子の存在が確認されよう。この種のプローブはまた、宿主細胞中の全ゲノムのＤＮＡ断片をクローニングすることにより確立されたゲノムライブラリーから、対象遺伝子を含有する特定クローンを同定する際にも有利に使用できる。

ナイセリア・コリロエアエに関連して開発された便利で、高度に正確なプローブ系はこれまで存在していない。しかしながら、本発明によりＮ、ゴノロエアエの数種類のオリゴヌクレオチドプローブが最初に提供され、それらのうちのあるものは一般にＮ、ゴノロエアエのプロティンＩにハイブリダイズするが、他のバクテリアにはハイブリダイズせず、そして他のものはＰＩＡ抗原のみを発現するＮ、ゴノロエアエ血清型に特異的である。こうして、淋菌感染を検出するための信頼できる診断方法が提供されるばかりでなく、個人が感染している可能性のある特定のカテゴリーの確認方法も提供される。

３、発明の要約ナイセリア・ゴノロエアエのプロティンＩＡおよびプロティンＩＢの完全なヌクレオチド配列、並びにそれらの予測されるアミノ酸配列が開示される。また、単細胞宿主生物中でＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子をクローニングして発現させるための、並びにＰＩＡ−ＰＩＢキメラタラダク質産物をクローニングして発現させるための方法および組成物も開示される。さらに、新規な宿主生物を培養して遺伝子産物を生産させる方法も開示される。用いられた組換えＤＮＡ法の生産物は、淋病を予防するためのワクチン組成物において免疫原として全体または抗原部分を使用するのに適している。

ＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子は新規なオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションにより細菌ゲノムから単離された。一旦特定のＤＮＡセグメントがつきとめられたらそのヌクレオチド配列を決定しそしてアミノ酸配列が予測された。次にそれぞれの遺伝子を、その遺伝子の複製単位として作用するプラスミドクローニングベクターに挿入した。次にこの組換えプラスミドを用いて適合性宿主細胞を形質転換し、それにより遺伝子産物が発現される。また、発現された産物の単離方法およびワクチン組成物への各産物の製剤化法もここに開示される。特に、ハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を包含するワクチン組成物が提唱される。さらに、ＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子のヌクレオチド配列の決定に基づいて、本発明は淋菌感染の検出および診断に有用なオリゴヌクレオチドプローブの配列をも提供するものである。これに関して、本発明はまた、ここに記載のオリゴヌクレオチドプローブの１種またはそれ以上を含有する診断試験キットをも提供する。

４、図面の説明第１図：　Ｒ１０株のＰＩの残基１−１２のアミノ酸配列、縮重塩基を含むコード化ｍＲＮＡ、および合成されたオリゴヌクレオチド。縮重が存在する場合は、塩基配列の決定がなされた他の淋菌遺伝子からのコドン利用データに基づいて塩基配列を選択した。

第２図二Ｐ■遺伝子部分を含むＦＡ１９ゲノムＤＮＡの５ａｕ３Ａ　ＩおよびＴａｑ［断片。この断片をベクタープラスミドｐＯＥＭ−２にクローン化して、ここに示す名称の組換えプラスミドを得た。ゲノム上のＰＩコード領域の相対的な位置は断片の上の空白ボックスで示しく斜線ボックスはＮ末端シグナル配列に相当する）、オリゴヌクレオチドプローブの相対的位置を断片の下に示す。

第３図：　ＦＡ１９のＰＩ遺伝子のＤＮＡ配列。予測されるアミノ酸配列をＤＮＡ配列の上に示し、そしてリポソーム結合部位（ＲＢＳ）、およびｐＵＮｃ　７の作製に用いられるＴａｑｒおよび５ａｕ３Ａ１部位、およびＨａｅＩ［部位（ −３５および−１０）が示される。各行の最後の塩基の番号を右側に示す。

第４図：Ｎ、ゴノロエアエの主要な外層膜タンパク質、ＰＩ、ＰＩＩおよびＰＩ［Ｉ、並びに大腸菌ボーリンＯｍｐＦおよびＯｍｐＣのバイトロバシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）パターン；ｓｐ−シグナルペプチド；ａ、ａ、−アミノ酸残基。

第５図二ｐＵＮＣ７の作製工程図。ＰＩ遺伝子プロモーターの−３５および一１０領域間の好都合なＨａｅＩ［Ｉ部位により一３５領域および上流配列を除去でき、次にＰＩ遺伝子をファージエフプロモーターの制御下にベクタープラスミドｐＧＥＭ−２に挿入した。太い線はｐＧＥＭ−２ＤＮＡを、そして細い線はＦＡ１９　ＤＮＡを表す。Ｐ　Ｉ’　−ＰＩ遺伝子部分（点線はこの遺伝子の欠失セグメントの方向を示す）；Ｐ７□−ファージエフプロモーター；ＭＣ８−多重クローニング部位；制限酵素部位：Ｓ　−３ａｕ３ＡＩ　、　Ｈ−ＨａｅＩＩＩ、Ｂ　−ＢａｍＨＩ、（Ｈ）−ＨａｅＩ［／ＨｉｎｃＩＩ接合点（部位は存在せず）、Ｔ−Ｔａｑｌ。

第６図：　ＢＬ２１　（ＤＥ３　’）におけるｐＵＮＣＴ上のＰＩ遺伝子の発現。Ａ：全細胞溶解物の１５％ゲル上におけるＮａＤｏｄＳＯ４−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、クーマシーブルーで染色。マーカータンパク質の寸法を左側に示す。ＰＩが示されており、そして中央の矢印はレーン４では明らかに失われているタンパク質を示す。

Ｂ：６種類のＰＩＡＭＡｂを用いて検索したＡにおけるゲルのウェスターンプロットのオートラジオグラフ。

レーンｌ：ＦＡ１９；レーン２：ＩＰＴＧなしで１６時間増殖させたＢＬ２１　（ＤＥ３）　ｐＵＮｃ７　；レーン３：ＩＰＴＧを用いて３時間増殖させりＢＬ２１　（ＤＥ３）　ｐＵＮＣ７；　［／−ン４：ＩＰＴＧを用いて１６時間増殖させたＢＬ２１　（ＤＥ３）１）ＵＮＣ７；レーン５　：　ＩＰＴＧなしで１６時間増殖させたＢＬ２１　（ＤＢ３　）　ｐＧＥＭ　−２；レーン６　：　ＩＰＴＧを用いて１６時間増殖させたＢＬ２１　（ＤＢ３　）ｐＧＥＭ−２゜第７図：　ＦＡ１９のＰＩ構造遺伝子に隣接したｍＴｎ３−ＣＡＴ（’ゲ）の挿入。太い線はベクター１））ＩＳＳ６　ＤＮＡを表す。ｍＴｎ　３−　ＣＡＴは長さが１．６６ｋｂであり、尺度に応じて描かれていない。ＦＡ１９　ＣＡＴ　Ｄ　１のゲノム上のＰＩ遺伝子の位置は線上の空白ボックスで示され、斜線ボックスはシグナル配列を示す。ＰＩ’：クローン化構築物中に存在するＰＩ遺伝子部分。

制限酵素部位二Ｎ−ＮｏｔＩ　；　Ｂ　−ＢａｍＨＩ　　；　Ｓ　−３ａｕ３ＡＩ。

第８図：ＰＩ遺伝子の配列決定のためにクローン化したＭＳＩＩ　ＤＮＡの断片。ＰＩ遺伝子の位置は線上の空白ボックスで示され、斜線ボックスはシグナル配列を示す。オリゴヌクレオチドＮＣＩおよびＮＣ１２の配列の位置が示しである。大きい方の断片はベクタープラスミドｐＧＥＭ−３にクローン化され、小さい方の断片はλｇｔｌｌ中にクローン化して、表示した名称の構築物となした。制限酵素部位：　Ｈｆ−Ｈｌｎｆｌ　；　Ｋ−Ｋｐｎｒ　；　Ｓ　−３ａｕ３ＡＩ　；　Ｈｅ−ＨｌｎｃＩ［。

第９図、ＭＳｌｌのＰＩＢ遺伝子のＤＮＡ配列。予測されるアミノ酸配列はＤＮＡ配列の上に示してあり、シグナルペプチドも示される。推定プロモーター配列（−３５および−１０）およびリポソーム結合部位（ＲＢＳ）も示され、関連する制限酵素部位も同様に示される。各行の最後の塩基の番号を右側に示す。ＲＩＯのＰＩＢ配列（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ等、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８４：８１３５ −８１３９゜１９８７）との相違を示すために、塩基（制限酵素部位を構成するものを除く）には下線が引いてあり、アミノ酸は丸で囲っである。

第１０図：ＦＡ１９ＰＩＡおよびＭＳＩＩＰＩＢのアミノ酸配列の比較、並びにハイブリッドＰＩ遺伝子の構造。

ＰＩＡ遺伝子配列は白の棒で、モしてＰＩＢは黒の棒で示す。ＰＩ遺伝子類の上と下はアミノ酸配列の比較であり、垂直線は１個の相違に相当し、黒のブロックは連続して広がった相違に相当する。アミノ酸残基の数は上の目盛で示され、そして塩基対の数は下の目盛で示される。ハイブリッドを分析するのに使用されたオリゴヌクレオチドはこれらの遺伝子の間に示してあり、点線は他の遺伝子上の等しい位置を示す。ハイブリッド遺伝子構造（クラス１−９）を下に示し、交差が起こったオリゴヌクレオチド配列間の領域を傾斜域で表す。種々のハイブリッドクラスのＰＩ血清型を第１表に示す。

第１１図：全細胞溶解物の１５％ゲル上での５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシーブルー染色を用いて検出した、ＢＬ２１　（ＤＢ３）中におけるＩ）ＵＮＣＨ２５上のＰＩＢ遺伝子の発現。ＰＩタンパク質バンドが示しである。レーンｌ：Ｍｓ１１；レーンＩＩＰＴＧなしで増殖させたＢＬ２１　（ＤＢ３）　ｐＵＮＣＨ２５；レーン３−５　：　ＩＰＴＧを用いて増殖させたＢＬ２１　（ＤＢ　３　）ｐＵＮｃＨ２５゜ＩＰＴＧ（５０μｇ／ｍｌ’）は下記細胞密度すなわちレーン３：５Ｘ１０”細胞／ｍｅ：レーン４：１０’細胞／ｍｊ；レーン５：２Ｘ１０”細胞／艷で増殖培地に加えた。ＰＩの発現は生長周期の早期に培養物が誘導された場合に最大である。

５、発明の説明本発明は、淋病感染予防用のワクチン組成物の製造に有用なＮ、ゴノロエアエＰＩＡＳＰＩＢ、およびキメラＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質の使用に関する。これらのタンパク質は組換えＤＮＡ技術または化学的合成法により製造できる。以前には適当なＮ、ゴノロエアエ株からの化学的単離法を使用することが可能であったが、この方法はワクチン接種後に阻止（抗防御）抗体を惹起するある種の他の淋菌タンパク質による汚染を生じうる。ＰＩタンパク質は抗体の生成を刺激することが知られているので、Ｎ、ゴノロエアエによる感染から被接種者を効果的に防御する免疫原として、そのタンパク質全体またはその免疫原部分を使用することができる。

ここに記載の組換えプラスミドにより、安定で宿主細胞による分解に対し抵抗性を有する大量のＰＩタンパク質を宿主細胞中に産生させることができ、その結果ワクチン組成物に適する物質の豊富な供給原が得られる。このワクチン製剤は他の抗防御性淋菌タンパク質による汚染がない。本発明を説明するために、本発明にいくつかの工程に分けて以下に論する、すなわち：１）ＰＩＡ遺伝子または遺伝子断片の同定および単離；２）適合性宿主細胞の形質転換に用いられる適当なりローニングベクターへの遺伝子または遺伝子断片の挿入；３）その遺伝子を複製させ発現させる形質転換宿主細胞の同定および増殖；および４）遺伝子生産物の同定および精製。

本発明によれば、ＰＩタンパク質は第３図または第一　　９図のクローン化配列、もしくはそのハイブリッドを適切なりローニング／発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞を形質転換し、次に遺伝子産物を同定および精製することにより生産されるつる。あるいはまた、第３図または第９図の推定アミノ酸配列部分、またはそのハイブリッドは当分針でよく知られた化学的合成技術を用いて合成することもできる。また、ＰＩＡおよびＰＩＢ配列に基づくオリゴヌクレオチドもここに開示され、これらのオリゴヌクレオチドはサザンプロット、ドツトプロット、スロットプロットなどのハイブリダイゼーションの技術によるＮ、ゴノロエアエ感染の確認および診断に有用である。

５．１．ＰＩＡ遺伝子の同定、単離、および配列決定ＰＩＡタンパク質のヌクレオチドコード配列は第３図に示される。すでに述べたように、ＰＩＡタンパク質はすべてのＮ、ゴノロエアエによって生産されるわけではない；任意の所定の株はＰＩＡまたはＰＩＢのいずれかを生産するが両方は生産しないであろう。ＰＩＡの存在は淋菌血清群■、血清型１−３、と関係があり、従って血清型１−３と関連のある淋菌株はどれもＰＩＡＤＮＡ源として使用できる。既知のＮ、ゴノロエアエ株の中で、ＰＩＡにより特徴づけられる株はＦＡ１９、ＦＡ１３０　、　Ｗ−Ｕｅ、　Ｂ　−２、Ｇ−７，５０２９、Ｒ−１１ＳＥ−５、Ｄ−４、■−１５である（Ｋｎａｐｐ等、Ｊ、　ｒｎｆ。

Ｄｉｓ、　１５０：４４−４８．１９８４）。本発明の実施において、第３図に示す配列は種々の方法で得ることができる。例えば、ひとたび適当なＰＩＡ含有含有室められたら、その生物のＤＮＡを単離し、ＤＮＡ断片を生成させ、そしてＰＩＡ遺伝子配列を含有する断片を同定することが必要である。あるいはまた、その遺伝子または遺伝子セグメントは合成することができよう。

Ｎ、ゴノロエアよりＮＡは多（の異なる方法で断片化しうる；最も好ましい方法はＤＮＡを特定の配列で切断する制限酵素での処理である。その他の方法にはマグネシウムの存在下でのＤＮａｓｅによるＤＮＡの処理、または音波処理のような物理的破壊が含まれる。制限酵素を用いる場合、ＤＮＡを処理するのに１種類の酵素または酵素類の組合せを用いることができる。唯一の必要条件は、核酸の消化がＰＩＡの抗原部位をコードする領域を破壊しないということである。断片化後、線状ＤＮＡの個々の断片を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）　、アガロースゲル、またはカラムクロマトグラフィーのような多数の既知技法の任意のものを用いて、大きさに基づいて分離する。分離した断片によりプラスミド作製および形質転換のための遺伝子物質が提供される。

対象となる遺伝子配列を含有するＤＮＡ断片の同定は多くの方法により達成できる。例えば、モノクローナル抗体のような免疫試薬が使用されつる。ＰＩＡに対するモノクローナル抗体は数多く誘導されており（Ｔａｍ等、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎｏ、　３６：１０４２−１０５３．１９８２）、そしてこれらは種々のＤＮＡ断片により形質転換されたそれぞれの宿主細胞から生産された産物を検査するのに使用されうる、すなわちＰＩＡモノクローナル抗体と反応する産物により、ＰＩ遺伝子を含有する断片で形質転換された細胞が同定される。また、ＤＮＡ断片の塩基配列決定によりそれぞれのアミノ酸配列を予測でき、次に既知の任意の部分アミノ酸配列と比較して、相当するＤＮＡ配列を含有する断片を同定することができる。もう１つの一般的技法はサザンブロツテイングである（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ、　７８：５０３．１９７５）。この方法では、制限断片をゲル上の適所で変性し、そしてプロッティングにより固形基質代表的にはニトロセルロースフィルターに移す。次に、フィルターをこのタンパク質の既知のまたは仮定した部分ＤＮＡ配列を含有する放射性標識オリゴヌクレオチドにさらす。選択されたオリゴヌクレオチドと相補性であるプロットされたＤＮＡがそれにハイブリダイズしてそれによりＰ以下に詳述する実施例において、ＰＩＡをコードする遺伝子は２種の新規なオリゴヌクレオチドとの／’％イブリダイゼーションにより同定および単離された。Ｐおよび既知ＤＮＡ配列を有する種々の他の淋菌タンパク質に伴うコドン使用規則に基づいて、有用なオリゴヌクレオチドを推定する試みがなされた。特に、次のようなＮＣＩおよびＮＣ２と呼ばれる２つの配列が作製された：ＮＣＩ：５°　ＡＣＧＣＣＧＧＣＴＴＴ　ＧＡＴ　ＧＧＣ３゜サザンブロットハイプリダイゼーションで用いられる場合、上記のオリゴマーは淋菌ゲノムから得られたＤＮＡ制限断片をスクリーニングするのに使用された；両方のプローブともＰＩＡ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を同定することに成功した。同定された遺伝子がＰＩＡ遺伝子であることの証明は、遺伝子産物の分子量と天然タンパク質の分子量との比較、およびＰＩＡ特異的モノクローナル抗体のその免疫反応性により行われた。しかしながら、この有用性のほかに、これらのオリゴヌクレオチドはそれぞれ淋菌のＰＩＡおよび２１８株の両方とハイブリダイズしうろことも確認された。従って、これらの正常な化合物は悩める個体のＮ。

ゴノロエアエ感染の検出および同定に、サザンブロットハイプリダイゼーションにおいて診断用プローブとして使用することもできる。

ＰＡ遺伝子を含有する断片の同定に続いてＳａｎｇｅｒ（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７４：５４６３−５４６７、１９７７）の方法に従って関連部分の塩基配列が決定される。Ｓａｎｇｅｒの方法はＤＮＡ鋳型からの相補性ＤＮＡ鎖の酵素による合成を利用するものである。相補鎖の合成はデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）の取込みにより停止される。４つの別々の反応（それぞれｄｄＡＴＰ、　ｄｄＣＴＰＳｄｄＧＴＰ、またはｄｄＴＴＰを含有）が行われ、その結果４組のＤＮＡ断片が形成され、所定の組の各断片はその末端に特定のジデオキシヌクレオチドをもつであろう。次にＤＮＡ断片をポリアクリルアミドゲル上で分離し、各断片の末端ヌクレオチドの同一性の知識よりその塩基配列を決定しそして最短断片から最長断片までを読み取る。

鋳型として用いられる一本ｊＪＩ　Ｄ　Ｎ　Ａは、二本Ｓｆｉ　Ｄ　ＮＡをエキソヌクレアーゼで化学的に処理すると得られる。しかしながら、Ｍｅｓｓ　ｉｎｇ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

９：３０９．１９８１）がクローニングベクターとして開発したＭ１３ｍｐクローニングベクターを使用することがより効果的である。ＭＩ３は一本（＋）鎖ＤＮＡを含育する大腸菌の雑菌特異的線維状バクテリオファージである。

この（＋）鎖は相補性（−）鎖合成用の鋳型として使用される。二本鎖型のＤＮＡが複製型すなわちＲＦ型であり、細胞あたり約２００コピーに増殖する。この二本鎖型を細胞から分離してクローニングベクターとして使用できる。いったん増殖が止まると、２本の鎖のうち一方のみが産生され続け、そして−重鎖がファージ粒子に組み込まれる。Ｍ１３の利点は、粒子がクローン化した鎖の一方に相同な一本鎖ＤＮＡを有しており、それ故にＳａｎｇｅｒ法における鋳型として使用できる点にある。３５０塩基までの塩基配列を単一クローンから決定でき、これよりも長い断片の塩基配列決定は重複すたＰＩＡ遺伝子のヌクレオチド配列が得られた。第３図には推定アミノ酸配列も示しである。

ＰＩＡ遺伝子の塩基配列決定（重複する断片の塩基配列を別々に決定することにより達成された）によりさらに２つの他のオリゴヌクレオチドプローブの同定および作製ができた。両プローブは次の配列を存する１７ヌクレオチドオリゴマーである：ＮＣ８：　　５’　ＧＣＧＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＡＣＣ３’およびＮＣＩＩ：５°ＣＧＧＴＧＴＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＣ３’これらのプローブは両方ともＰＩＡ遺伝子のみに特異的であって、ＰＩＢ　ＤＮＡ配列にはハイブリダイズしない。従って、これらのプローブは共に感染にＰＩ人生物によるか、ＰＩＢ生物によるのかを判断する診断試験において有用である。先に述べたように、これらのタンパク質の各々は全身的かまたは局所的の淋菌感染の特定パターンを示し、従って感染患者の治療プログラムを計画する上で非常に重要でありうる。

単離した遺伝子または化学的に合成したＤＮＡ配列は形質転換宿主細胞の増殖、形質転換細胞からの組換えＤＮＡの単離、および単離した組換えＤＮＡからの挿入遺伝子の回収により、さらに遺伝子コピーを生成されるのに使用されうる。

５．２．ＰＩＢ遺伝子の同定、単離および配列決定ＰＩＢタンパク質のヌクレオチド配列を第９図に示す。この配列はＮ、ゴノロエアエＭＳＩＩ株から単離された。ＰＩＢの存在は血清群４−９と関係しており、これらの血清群と関連した株はどれもＰＩＢ　ＤＮＡの供給源として使用できる。既知の淋菌室中で、ＰＩＢの存在により特徴づけられる株はＭＳＩＩＳＦＡ６１４０ＳＦ６２およびＲＩＯである。ＰＩＢタンパク質の調製、同定、および配列決定の技術は前記５．１節で説明したＰＩＡタンパク質に適用した手法と実質的に同じである。ＰＩＢ遺伝子の詳細な同定は、ＮＣＩおよびＮＣ１２プローブ（５’　−ＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＴＣ−３’　）の使用、並びにハイブリッドＰＩタンパク質のＰＩＢ部分にあるＫｐｎ　Ｉ制限部位の同定（Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ等、Ｉｎｆｅｃｔ、ｒｍｍｕｎ、　５２：５２９−５３３゜１９８６）により助けられた。ＰＩＡと同様にこの遺伝子のクローニングはクローニングベクターに重複配列を別々にクローニングすることにより達成された。

５．３０組換えＤＮＡ技術によるＰＩＡＳＰＩＢまたはＰＩＡ／ＰＩＢハイブリッドの生成ＰＩＡのヌクレオチドコード配列を第３図に示す。

ＰＩＢのヌクレオチドコード配列を第９図に示す。本発明の実施において、ヌクレオチド配列またはその機能上の同等物がＰＩＡまたはＰｒＢ生成物の発現を指示する組換え分子中に組み込まれる。また、第３図および第９図から誘導されたハイブリッド配列を作製してハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を生産させることもできる。

ヌクレオチドコード配列の縮重ゆえに、第３図または第９図に示したと実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も、ＰＩＡまたはＰＩＢをクローニングおよび発現させるために本発明の実施においてそれぞれ使用することができる。第３図または第９図のヌクレオチド配列のかかる変更には種々のヌクレオチド残基の欠失、付加または置換が包含され、同一のまたは機能的に等価の遺伝子生成物をコードする配列が生成される。その遺伝子産物はアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含存できる。置換は関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて行われうる。例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が包含され、正に荷電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが包含される。同様の親水位を有する非荷電極性ヘッド基または非極性ヘッド基をもつアミノ酸には次のものが包含される、すなわちロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン：フェニルアラニン、チロシン。

５．３．１．ＰＩ遺伝子クローニング／発現ベクター第３図に示すＰＩＡ遺伝子配列、第９図に示すＰＩＢ遺伝子配列、およびハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢ配列、もしくはこれらの機能的同等物は適当なりローニング発現ベクターに挿入できる。

終局的に挿入遺伝子の転写および翻訳を達成するためには、その遺伝子は選ばれた宿主細胞と適合するプロモーターの制御下に置かねばならない。プロモーターとはＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始するＤＮＡの領域である。選ばれるプロモーターは宿主細胞生物から単離されたいずれのものでもよい。例えば、宿主系として通常用いられる大腸菌は菌それ自体と、またはそのバクテリオファージと、もしくはそのプラスミドと関連した、　ｌａｃまたはｒｅｃＡプロモーターのような多数のプロモーターを有する。またラムダファージＰ、およびＰ、プロモーターのような、合成的にまたは組換えにより作られたプロモーターを使用して、それに隣接するＤＮＡセグメントの高レベル生産を誘導することもできる。

遺伝子を効率よく転写および翻訳させるには、開始シグナルも必要である。例えば大腸菌のｍＲＮＡでは、リポソーム結合物には翻訳開始コドン（ＡＵＧまたはＧＩＧ）および１６ｓリポソームＲＮＡの３°末端の塩基と相補性符表千３−５０２８８１　（１１）であるもう１つの配列が包含される。後者の配列（シャインーダルガルノまたはＳ−Ｄ配列）のいくつかは大腸菌や他の適当な種類の宿主細胞において確認されている。宿主細胞系と適合しうる任意の５Ｄ−ＡＴＧ配列が使用できる。これらには大腸菌ファージラムダのＣｒＯ遺伝子またはＮ遺伝子、あるいは大腸菌のトリプトファンＥＳＤ、Ｃ，ＢまたはＡ遺伝子が含まれるが、それらに限定されるわけてはない。

インビトロでＤＮＡ断片をクローニングベクターに挿入する方法は数多く存在する。ＤＮＡリガーゼは二重ＤＮＡ鎖中の隣接ヌクレオチド間の一重鎖ニツクを閉じる酵素である；従って、この酵素はある種の制限酵素により生成された付着末端同士を共有結合で連結させるのに使用することができる。また、ＤＮＡリガーゼを使用して平滑末端間のホスホジエステル結合の形成を触媒することもできる。最後に、酵素ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを用いて断片の末端で３°ホモポリマー−重鎖尾部を形成させることができる。すなわち第一の分子の３′末端にオリゴ（ｄＡ）配列を、そして第二の分子の３′末端にオリゴ（ｄＴ）配列を付加することにより、２種類の分子がアニーリングして環状ダイマーを形成させることができる。これらの方法のどれを使っても、遺伝子セグメントプロモーターおよび他の制御エレメントをベクターの特定部位に連結することが可能である。こうして、ＰＩタンパク質をコードする遺伝子がベクタープロモーターおよび制御エレメントに対して特別の関係で所定のベクターに連結され、その結果前記配列はベクターＡＴＧ配列に関して正しい読み枠で挿入される。使用されるベクターは形質転換細胞を同定しうるよう代表的にはアンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性のようなマーカー機能を有していよう。使用するベクターは既知の発現ベクターまたはそれらの誘導体のいずれであってもよい。最も頻繁に用いられるベクターハプラスミトヘクター（例、　ｐＢＲ３２２、ｐＡｃ１０５、ｐＶＡ５、ｐＡｃＹｃ　１７７、ｐＫ）１４７　、ｐＡｃＹｃ１８４、ｐＵＢｌｌｏ、ｐｍＢ９、ｐＢＲ３２５、Ｃｏｌ　Ｅｌ、ｐｓｃｌｏｌ、　ｐＢＲ３１３、Ｉ）ＭＬ２１、Ｒ３Ｆ２１２４、ｐｃＲｌまたはＲＰ４）　；バクテリオファージベクター（例、ラムダｇｔ１１、ラムダｇｔ−ＷＥＳ− ラムダＢ、　Ｃｈａｒｏｎ　２８、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、−ｙムダｇｔ−１−−ｙＬダＢＣ、ラムダ−ｇｔ−１−ラムダＢ、Ｍ１３ｍｐ７、Ｍ１３ｍｐ８、Ｍ　１３ｍｐ　９　）　　；　ＳＶ４０およびアデノウィルスベクター、並びに酵母ベクターで先に述べたように、ＰＩＡおよびＰＩＢをコードする遺伝子セグメントは本来は上記の新規なオリゴヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションにより同定された。選択された断片がＰＩＡをコードする構造遺伝子であるという同一性は、天然ＰＩＡとの分子量比較により、およびコロニーラジオイムノアッセイで試験された６種類すべてのＰＩＡモノクローナル抗体との反応性により証明された。ＰＩＢ生成物の同一性もＰｒＢ特異的モノクローナル抗体との反応により証明された。クローン化ＰＩＡまたはＰＩＢ遺伝子を発現する大腸菌宿主細胞は、適切なモノクローナル抗体と反応するＰＩタンパク質を豊富に産生ずる。ＰＩＡタンパク質の精製操作はＴｅｅｒｌｉｎｋ等（Ｔｈｅ　ＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＮｅｉｓｓｅｒｉａ、　　Ｇ、５ｃｈｏｏｌｌｉｋ　　編、２５９−２６４．　１９８５．　　ＡＳＭ）に詳細に記載されている。

５．５．ＰＩＡ／Ｂハイブリッドの作製本発明に関連して、多数のハイブリッドＰＩＡ／Ｂ遺伝子配列およびタンパク質が作られた。ハイブリッド遺伝子は５ｅｉｆｅｒｔ等（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　Ｐｒ１ｎｃｉ−ｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｖｏｌ、８．　ｐ、１２３−１３４．５ｅｔｔｉｎ等編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８６　；　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８３ニア３５−７３９．１９８６）に従って改良されたシャトル突然変異誘発法を用いて、ＰＩＡ産生株にＰＩ遺伝子に隣接して選択マーカーを挿入することにより作製された。この場合、選択マーカーは選択可能なりロラムフェニコール耐性（Ｃｍ’　）を付与するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であった。次にＣＡＴ　ＤＮＡを含有するＰＩＡ株をＰＩＢ含有受容株を形質転換するためにＤＮＡ供与株として使用した。相互交雑（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　ｃｒｏｓｓ）も行われた。推定上のハイブリッドはＣｍ’で選択し、イムノブロッティングでＰＩについて調べて同定した。次の形質転換体すべてが観察された：（１）供与株ＤＮＡが存在した、または（２）受容株ＤＮＡが保持されていた、または（３）そのＤＮＡがどちらの親のＤＮＡとも相違していた。真のハイブリッドＰＩＡ／Ｂ株は程良く高い頻度で両方の種類の交雑において発生し、多くの異なる血清型が同定可能であった。これらのハイブリッド遺伝子およびタンパク質を入手できることにより、既知モノクローナル抗体のエピトープの位置を解明することができ、また防御抗体の生産を誘導することが知られているエピトープ（従って、有用なワクチンの開発において最も重要なエピトープである）を含有するＰＩＡ／Ｂハイブリッドタンパク質の同定、そして最終的にはその合成による構築が可能となった。これらのハイブリッドの作製および同定の細部については以下の７節で述べることもう一つの態様においては、第３図および第９図に示した遺伝子配列によりコードされるタンパク質並びにそれぞれの一部を含有するキメラタンパク質を当分野でよく知られた技法を使って化学的に容易に合成できる（Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ、　　Ｉ　：３６１．１９８６）。最終実施においては、タンパク質配列内部の防御エピトープが同定されると、その分子の単離された活性領域のペプチド合成によりワクチン製造用の基本物質の単純で比較的安価な製造方法が提供される。ペプチド合成の使用はまた、ハイブリッドＰ　Ｉ　Ａ／Ｐ　Ｉ　Ｂタンパク質の、または、好ましくはＰＩＡとＰＩＢタンパク質の両方の防御エピトープを含有する合成ペプチドの便利な構築手段を提供するものである。従って、本発明は開示した配列による、遺伝子組換えにより製造されたタンパク質および合成的に製造されたタンパク質の両方を包含するものである。また、完全なタンパク質の断片、好ましくは親タンパク質分子の抗原性を保持する断片、そして最も好ましくは防御抗体の生産を惹起するエピトープを含有する断片も本発明に包含される。さらに、配列内の１個またはそれ以上のアミノ酸残基を化学的に同等のアミノ酸で置き換えることによって、完全なタンパク質およびペプチド断片配列内で置換を行うことが可能であることも認識されよう；例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸のような負に荷電した残基は相互交換でき、リジンやアルギニンのような正に荷電した残基も同様に交換できる。疎水性残基にはトリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびアラニンが包含される。既知配列からのある種の欠失または既知配列への付加を行い、しかもまだ所望の抗原活性を保持させることも可能である。これらの２種のタンパク質の配列に関する本情報が与えられたことにより、分子を適当に改変しかつ活性が保持されているかどうか判定することは当分野の技術の範囲内である。従って本発明はさらに、クローン化したものであろうと合成的に製造したものであろうと、親分子の抗原性が実質的に保持されている請求したタンパク質の相同物、類似物、および断片を包含するものである。

５．７．ワクチンの製剤精製された形態の遺伝子産物または合成によるＰＩＡペプチドは淋菌感染予防用のワクチン組成物を調製するのに有用である。完全なＰＩＡタンパク質またはその任意の活性断片がこの種の組成物中で免疫源物質として使用できる。遺伝子生成物が融合タンパク質の一部分として発現された場合には、そのタンパク質を全体として使用できるしあるいは宿主細胞タンパク質を切断して非融合ＰＩＡタンパク質を生成させることもできる。

組換えＤＮＡ技術により作られたＰＩＡタンパク質は標準的なタンパク質分離法を用いて宿主細胞から分離できる。次に精製タンパクを通常使用される任意の医薬上許容しうる担体例えば水、生理食塩水、エタノール、ポリオール（例、グリセロール、プロピレングリコール）、または植物油、並びに当分野で知られた任意のワクチンアジュバントと組み合わせる。ＰＩＡ産物はまたワクチン製剤に使用するためにリポソーム内に取り込ませることもできる。ここで用いる“医薬上許容しうる担体″とはあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などを包含する。医薬上活性な物質に対するかかる作用剤の使用は当分野で知られている。慣用媒体が活性成分と不適合でない限り、治療組成物中におけるその使用が意図される。補助的な活性成分も混入できる。

本発明の特に有用な実施態様は、活性免疫原としてハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を用いたワクチンである。ＰＩＡ、！：ＰＩＢの両方のエピトープを発現する。実験的に誘導された淋菌は文献（Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ。

Ｉｎｆ、　Ｉｍｍｕｎ、　５２：５２９−５３３）に報告されているが、キメラタンパク質の構造は同定されず、そのタンパク質をワクチンに使用する可能性については全く触れられていない。かかるワクチンにより両方の種類の淋菌感染（すなわち、プロティンＩＡ含有株に関連した全身感染およびプロティンＩＡまたはプロティンＩＢ含有株に関連した局所感染）に対して個体を免疫できるという利点が得られる。本発明に関連して述べた特定プローブの入手可能性が示されたことにより、かかる適当なハイブリッドタンパク質は当分野技術者に知られた技法を使って容易に得ることができる。

原則的には、キメラ遺伝子は個々のタンパクの遺伝子を初めに単離することにより作製できる。本発明のＰＩＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いたＰＩＡ遺伝子の単離方法はすでに上で説明した。同様の操作がＰＩＢ遺伝子の単離および同定に使用できる。

ＰＩＢタンパク質のみを産生ずる菌株例えばＭＳＩＩ、ＲＩＯ１ＦＡ６１４０、Ｆ６２などが多数同定されている。上記の非ＰＩＡ特異的ＤＮＡ配列は、ＰＩＢ特異的菌株由来のＰ■配列を含有する制限断片をＰＩＢ菌株の遺伝子ライブラリーから単離するのに好都合に使用できる。正しい産物が発現されたことの証明は、推定ＰＩＢ断片による宿主微生物の形質転換および発現、そして任意の既知ＰＩＢ特異的モノクローナル抗体（ＲｏＣ，Ｎｏｗｉｎｓｋｉ。

Ｋｎａｐｐ、　Ｊ、　Ｓ、　、　Ｔａｍ、　Ｍ、　Ｒ，、ａｎｄ　Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　。

１５０：４４−４８．１９８４）との反応による発現産物の同定から得られる。

ひとたび個々の遺伝子断片が単離されたら、それらは当業上知られた任意の方法を用いて容易にクローン化され、組み立てられる。次にＰＩＡ配列部分を、キメラタンパク質が転写および翻訳可能な形態（例えば、翻訳終止配列により中断されてない形態）でコードされるように、ＰＩＢ配列部分に連結させる。

次に、全キメラ配列を選択マーカーおよび制御エレメントを含有するベクターに連結させることができる。

次にこのベクターを用いて、回収可能な量の遺伝子生成物を発現しうる宿主微生物を形質転換する。もちろん別法として出発点でＰＩＡ遺伝子をすでに含有するベクター（例えば、大腸菌ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２６３に含有されるプラスミド）を使用してもよい。ＰＩＢ配列を上記のようにして単離し、その全部または一部をプラスミド中のＰＩＡ遺伝子に隣接してまたはＰＩＡ遺伝子の内部に連結させて目的とするキメラ遺伝子の転写および翻訳を行わせることもできる。しかしながら好ましくはＰＩＡ／Ｐ■Ｂハイブリッドは５．６節で説明したようにして作製し、ハイブリッド遺伝子をそこから単離して形質転換用のベクターを作製する。このようにして作製したベクターを使って再度宿主微生物を形質転換する。このようにして、遺伝子生成物の発現によりキメラタンパク質の供給源が提供され、このキメラタンパク質ＰＩＡまたはＰ■Ｂタンパク単独と同じ方法でワクチン製剤中に容易に配合できる。

また別の実施態様においては、ワクチン製剤に有用なハイブリッドタンパク質は今や配列が明らかとなったタンパク質の防御エピトープを単離および同定することにより合成的によって製造することもできる。先に述べたように、組換えキメラタンパク質が容易に入手しうろことにより、問題のエピトープをより容易に同定でき、それにより最終的には免疫を賦与するのに必要なハイブリッドタンパク質のその部分のみを含有する“簡素化された“ハイブリッドを合成方法により構築することができる。

６、実施例１：ＰＩＡ遺伝子の同定、単離および発現本発明の方法にしたがって、淋菌ＤＮＡの断片を得、個々の断片を別々にクローニングし、次いで外来の誘導可能プロモーターとともに遺伝子を再構築することにより、ＰＩＡ遺伝子配列を決定した。前述のように、オリゴヌクレオチドＮＣＩとのハイブリッド形成により、ＰＩＡ遺伝子配列の部分を有する２個の推定断片を同定した。次に関連する制限フラグメントをそれぞれｐＧＥＭ−２プラスミドベクターに結合し、適当な宿主に形質転換した。オリゴＮＣＩとハイブリッド形成した形質転換体を単離した。これらのクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で消化し、再びＮＣ１をプローブとして探査した。ＮＣＩとノ＼イブリッド形成した個々の断片を、次いで別々にｐＧＥＭ−２プラスミドに再連結して、２つの別個のプラスミド、ｐＵＮｃ　３およびｐＬＩＮｃｌｌを得た。

７５０ｂｐ断片のＤＮＡ配列の同一性は、それに由来するより小さな制限断片をＭ１３　ｍｐＲＦ　ＤＮＡにサブクローニングし、次いでサンガー法（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７４．５４６３−５４６７、１９７７）にしたがって配列決定することにより決定された。この配列から、新規オリゴヌクレオチドを合成した。ＮＣ８と命名したこの新規オリゴヌクレオチドを、すでにクローニングされた９００ｂｐ断片に隣接する８５０ｂｐ断片を同定するために使用し、この断片をｐＧＥＭ−２にクローニングしてｐＵＮｃ１５を生成させ、サンガー法（上記）により配列決定した。プラスミド調製、配列決定、ハイブリッド形成および形質転換に関する操作法の詳細を以下に述べる。

６．１．プラスミドの調製に用いられる一般的操作法以下の小節には、ＤＮＡ単離、酵素反応、断片の単離および結合反応に用いられる一般的操作法が記載さこの実験に用いられる制限酵素は、特に指示しない限りＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｉｎｃ、　、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手される。Ｎ、ゴノロエアエ培養物は、ケロッグの添加物（Ｋｅｌｌｏｇｇ’ｓ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）　ＩおよびＩＩ　（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉａｌ、　　８５：１２７４−１２７９．１９６３）を含有するＧＣ基礎培地（ＤＩＦＣＯ）中で５％ＣＯ２雰囲気下で増殖させる。

の方法にしたがって、消化に必要なりＮＡを単離した。

この菌株はプロティンＩＡを生産することが知られている。

下記の条件下で全ての消化を行った。約２０μｌのＤＮＡ試料を、２−１Ｏ倍過剰の制限酵素中で３７℃で１−３時間インキュベートした。この条件の例外は、Ｔａｑｌに関して温度６５°ｑＳＳｍａｒに関して３０°Ｃである。

６．１．２．制限酵素緩衝液ＡｃｃＩ、　ＭｓｐｌおよびＲｓａＩ消化に用いた緩衝液は、５０ｍＭトリス− ＨＣｌおよび１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚからなり、ｐＨ８である。

ＡｖａＩ、　ＨｉｎｄＩ［ＩおよびＴａｑ　Ｉ消化に用いた緩衝液は、５０ｍＭ）リス−ＭＣＩ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ　ＮａＣ１からなり、ｐＨ８である。

ＢａｍＨＩ　５ＥｃｏＲＩおよび５ａｉｌ消化に用いた緩衝液は、５０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、　ｌ０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚおよび１００ｍＭ　ＮａＣ１からなり、ｐＨ８である。

ＨｉｎｃＩＩ、５ａｕ３Ａ　ＩおよびＳｍａ　Ｉ消化に用いた緩衝液は、２０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、５　ｍＭ　ＭｇＣ１ｔおよび５０ｍＭ　ＫＣＩからなり、ｐＨ７，４である。

０、５Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）を最終濃度１０ｍＭとなるように添加して反応を停止させる。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

ＮＹ、　１９８２）において、Ｉ）ＢＲ３２２のＰＩＡを他のベクタープラスミド上にクローニングする初期の試みは、否定的な結果の繰り返しであった。したがって、ＰＩＡ遺伝子またはそのタンパク質を含有する断片を、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成によって同定することを試みることにした。

Ｎ、ゴノロエアエ菌株ＲＩＯのＰＩＢの公知のＮ−末端アミノ酸配列（Ｂｌａｋｅら、Ｉｎｆｅｃｔ、、　　Ｉｍｍｕｎ、　３６：２７７−２８５．１９８２）に基づいて、２つのプローブを設計した。２つの他の淋菌タンパク質であるビリンＭｅｙｅｒら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　　８１：６１１０−６１１４、１９８４）およびＰＩＩの遺伝子配列から得られた限られた量のコドン使用データとともに、この情報をＮＣ１およびＮＣ２と命名された第２図に示す１対のオリゴヌクレオチドを構築した。ＮＣＩはただ一つの配列であり、ＮＣ２は正しい配列を同定する確率を高めることを意図したヌクレオチドの混合集団である。コロニーハイブリッド形成アッセイにおいて、これら両方のオリゴヌクレオチドはＦＡ１９とハイブリッド形成したが、ｐＢＲ３２２またはｐＧＥＭ−２のいずれか一方を含有するＨＢＩＯＩとはハイブリッド形成しなかった。

制限エンドヌクレアーゼ消化されたＤＮＡをアガロロースフィルターへ移した。

ＮＣＩおよびＮＣ２オリゴプローブをＭａｎｉａｔｉＳらの方法（上記）にしたがってポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ−Ｐ２′ＡＴＰ　（ＩＣＮＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｉｒｖｉｎｅ、　Ｃａ１ｉｆ、）で標識した。下記の緩衝液中で末端標識を行った。トリス−ＨＣＩ（ｐ）１７．６）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５ｍＭＤＴＴ（ジチオトレイトール）、０．１ｍＭスペルミジンおよび０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ニトロセルロースフィルター上のＤＮＡに対する標識オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成は、４　Ｘ　５ＳＰＥ（０，１８Ｍ　ＮａＣ１゜１０ｍＭ　ＮａＨｚＰＯ４［ｐＨ７，４］、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）、２　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液（１ｘ＝０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、　０．０２％ポリビニルピロリジン）　、２０ｍＭビロリン酸ナトリウム、０．２％ドデシル硫酸ナトリウムおよび５０μｇ／ｍｌサケ精液ＤＮＡ中で、ハイブリッド形成反応液１ｍＡ’当り１０”ｃｐｍの標識オリゴヌクレオチドを用イテー晩行った。フィルターを１　ｘ　５ＳＣ（０，１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、５ｍＭビロリン酸ナトリウムおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウム中で洗浄した。ハイブリッド形成および洗浄の温度は、ＮＣＩおよびＮＣ２についてそれぞれ４６°Ｃおよび４０℃であった。

フィルターを５ＸＳＳＣ中で洗浄し、乾燥し、Ｋｏｄａｋ　Ｘ線フィルムに暴露した。１個のフラグメントに対するハイブリッド形成が個々の場合に起こった。

関連する断片はＥｃｏＲＩ−１０ｋｂ　、　５ａｉｌ−５，５ｋｂ　、５ａｕ３ＡＩ−９００ｂｐおよびＴａｑ　ｌ−７５０ｂｐであった。ＮＣＩおよびＮＣ２の両者について同一の結果が観察された。

６　、１．４．断片のクローニングｐＢＲ３２２にクローニングされたＥｃｏＲＩまたは５ａｌｌ消化ＤＮＡを含有するＨＢＩＯＩのコロニーライブラリーを、コロニーハイブリッド形成法によってオリゴヌクレオチドＮＣＩをプローブとして探査すると、陽性のコロニーは観察されなかった。このことはＰＩが大腸菌に対して致死的であることを示唆する先の観察を支持した。

ＦＡ１９　ＤＮＡのより小さな断片、すなわちオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成した５ａｕ３Ａ　ＩおよびＴａｑｒ消化物は、全ＰＩ遺伝子を含有していないと推定され、クローニングのための候補として選択された。

各断片について、本格的に同じ操作にしたがった。

５ａｕ３ＡＩ断片については、全ＦＡ１９　ＤＮＡを５ａｕ３Ａ　Ｉで完全に消化した。プラスミドｐＧＥＭ　−２（Ｐｒｏｍｅｇａ　ＢｉｏｔｅｃＭａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓ、より入手）ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、５ａｕ３ＡＩ断片に結合した。ＤＮＡ断片の結合はＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、　Ｍａｓｓ、）を用い４°Ｃで１６時間、次のバッファー中で行った。５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００．１ｍＭ　ＡＴＰｌ　１ｍＭ　　ＤＴＴ。

菌ＨＢＩＯＩを形質転換した。これについて概説すると、細菌細胞を５０ｍＭ　ＣａＣ１，および１０ｍＭ　）リス−ＭＣＩ、ｐＨ８、の氷冷滅菌溶液に懸濁し、次いで結合緩衝液中でプラスミドＤＮＡと混合する。

約２０００個の形質転換が回収された。細菌コロニーを、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓの方法（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８２：３９６１−３９６５、１９７５）にしたがってハイブリッド形成により調製されたニトロセルロースフィルター上に移し、オリゴＮＣＩとのハイブリッド形成を観察した。１個のコロニーが実際にこのオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成した。プラスミドＤＮＡを増幅し、集め、５ａｕ３Ａｌで消化し、すでに述べたサザンハイブリッド形成法によってオリゴＮＣＩをプローブとして探査した。９ｏｏｂｐの１個の断片がこのオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成し、これは先のサザンハイブリッド形成によって同定されたＦＡ１９の５ａｕ３Ａ　Ｉゲノム断片と同じ大きさであった。この断片を切り取り、アガロースゲルから電気的に溶出しくｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅ）、ＢａｍＨｌ消化ｐＧＥＭ−２プラスミドに再び結合させて、組換えプラスミドｐＵＮｃ　３を作成した（第２図）。

オリゴＮＣＩとハイブリッド形成したＦＡ１９の７５０ｂｌ）のて、組換えプラスミドＩ）ＵＮＣＩＩを得た（第２図）。

６　、１．５．サブクローニングおよび断片の配列決定配列決定に先立って、７５０ｂｐのＴａｑｌ断片を酵素ＲｓａｌおよびＭｓｐｌを用いて消化して、３００ｂｐ以下のより小さな制限断片とした。次いで断片の末端を修復し、Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら（Ｇｅｎｅ　２６：１０１−１０６．１９８３）により記載されたようにして、Ｍ１３　ｍｐ１８　ＲＦ　ＤＮＡのＳｎ＋ａ１部位に結合した。次いで、このクローニングベクターによっての鋳型として用いられる。

Ｓａｎｇｅｒ　（上記）およびそれに含まれる参考文献（ＢＲＬ。

Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍｃ！、　）に記載の方法にしたがって、ジデオキシヌクレオチドを調製することができる。各ＤＮＡ試料につき４個のウェル、すなわちジデオキシヌクレオチドｄｄＡＳｄｄＴＳｄｄＣおよびｄｄＧのそれぞれについて１個のウェルを用意する。各ウェルに、鋳型ＤＮＡ２μ！、ならびにブライマー混合物（ＢＲＬ由来の１１μｉの（２２ｎｇ）　Ｍ１３１７塩基ブライマー、１１１．ｔｌ！のＴＭ（１００ｍＭ　トリス＋５０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、ｐＨ８，５）および６６μｍ！のＨ２Ｏ（１０クローンにつき）からなる）２μ ｌを添加する。

これらを回転させ、プラスチックラップでおおい、５６℃で５０−６０分間インキュベートする。

インキュベートした後、２μｌの適当なＮＴＰ混合液を各ウェルに添加する。各混合−液は１０−５００μＭのｄｄＮＴＰおよび各６．２５μＭの通常のｄＮＴＰを含有する。ＮＴＰ混合液の添加後、２μｌのフレノウ混合液を各ウェルに添加した。このフレノウ混合液は、１１μｌのフレノウ（ＩＵ／μｌに希釈）、１１μｌの０．１Ｍジチオスレイトール、４．４μｍの３５Ｓ　−ｄＡＴＰおよび６１．６μｍのＨｔｏからなる。

この混合物を回転させ、プラスチックラップでおおい、３０°Ｃで１５分間再度インキュベートする。各ウェルに２μｌの追跡用混合液（４種の全てのｄＮＴＰｏ、　２５ｍＭ）を加え、回転させ、３０°Ｃで１５分間再度インキュベートする。

次いで２μｌのホルムアミド色素を各ウェルに加えた後、おおいをせずに８０° Ｃで１５分間インキュベートする。

この時点で、これらの混合物をゲルにすぐ負荷でき、あるいはラップして一８０ °Ｃで保存することができる。

この操作法で使用したゲルは下記の組成を有する。

展開ゲル（８０％）４０％アクリルアミド　　　　　　　　　　　１６ｍ１尿素　　　　　　　４０ｇ１０ＸＴＢＥ　”　　　　　　　　８ｍｌＨ２０２４ｍ１１０％ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）　　　　　　　ｌｙｄＴＥＭＥＤ（テトラメチルエチレンジアミン）　　２０μｌネトリスはう酸電気泳動緩衝液；８９ｍＭ）リス＋８９ｍＭはう酸ゲルを６０ワツトの定出力で３−４時間操作し、次いで１０％酢酸および１０％メタノール中で１５分間固定したのち、これらを紙の上で乾燥し、Ｋｏｄａｋ　Ｘ線フィルムに暴露する。

胆「断片について決定された配列に基づいて、新規オリゴヌクレオチドであるＮＣ８を作成した。５’　ＧＣＧＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＡＣＣ３“の配列を存するこの新規オリゴヌクレオチドは、前もってクローニングされた９００ｂｐの断片に隣接する８５０ｂｐの５ａｕ３Ａ　Ｉ断片を同定するためにサザンハイブリッド形成に用いられ、この８５０ｂｐはｐＧＥＭ　−２にクローニングされてプラスミドｐＵＮｃ１５　（第２図）を生成し、前記の手法で配列決定された。ＰＩ遺伝予め全配列を第３図に示す。この配列の唯一の大きな読みとり枠は塩基８４と１０６２の間に存在しており、これは３２６個アミノ酸タンパク質に相当する。種々のＰＩタンパク質の刊行されたＮ−末端アミノ酸配列（Ｂｌａｋｅ。

上記）から、成熟タンパク質の最初の残基はおそらく塩基１４１のアスパラギン酸であった。このことは３０７アミノ酸の成熟タンパク質および１９アミノ酸のシグナルペプチドを与える。このタンパク質の推定の大きさは３３、７８６ダルトンであり、これはＦＡ１９におけるＰＩの見かけの分子量３５．０００に近い。このシグナルペプチドは、このような配列に関連した共通の特性を存すると思われ（Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８４：９９− １０５．１９８５）、−続きの疎水性アミノ酸、豊富なアラニン残基およびＡｌａ−Ｘ−Ａｌａ切断部位を有するえまた推定−３５および−１Ｏプロモーター配列、およびシグナル配列の最初の残基のすぐ上流にＳｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏリポゾーム結合部位も存在していた。上記プロモーター配列は配列および分離に関して大腸菌におけるこれらの配列に関するコンセンサスに近い（Ｈａｒｌ、ｅｙら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１５：２３４３−２３６１．１９８７）。予想されるＮ−末端アミノ酸配列は、推定ＰＩＡタンパク質のアミノ酸配列決定により決定されたものに合致し、（Ｂｌａｋｅ、　Ｔｈｅ　ＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＷａｓｈ、　）、ＲＩＯのＰＩＢタンパク質のそれときわめて類似していた。予想されるタンパク質のヒトロバジ−プロフィールは、外層膜ボーリンタンパク質のそれに典型的であり、大腸菌ＯｍｐＦおよびＯｍｐＣの主要ボーリンと比較して優れており（第４図）、実質的に疎水性伸長部をまったく持たない長い親水性領域によって特色付けられた。他の配列決定された淋菌外層膜タンパク質のヒトロバジ−プロフィールとの相関はほとんど存在完全なＰＩ遺伝子クローンを、ｐＵＮｃ　３およびｐＵＮｃ１５の５ａｕ３Ａ　Ｉ断片の遺伝子の２つの部分を結合させることによって回収する試みは、繰り返し失敗に終わり、淋菌ＰＩは大腸菌にとって致死的であるという結論に至った。したがって、ＰＩ遺伝子プロモーターの一部分を除去し、ＰＩ遺伝子がｐＧＥＭＴ２上でファージエフプロモーターの下流に位置するように、組換えプラスミドを構築した。大腸菌細胞は普通はＴ７プロモーターから下流の遺伝子を転写するＴ７ボリメラーゼを含有しないため、このプラスミドは安定に保持される。

このようにして構築されたプラスミドがｐＵＮｃ　７であり、第５図に示したスキームにしたがって調製された。

ＰＩ遺伝子プロモーターの−３５と一１０領域の間の従来のＨａ、ｅ　ＩＩＩ部位により、−３５領域およびその上流配列が容易に除去をできた。次に遺伝子の残りの部分をＴ７プロモーターの制御下でｐＧＥＭ−２に挿入した。ｐＬＩＮｃ　７で形質転換されたＨＢＩＯＩは、コロニーラジオイムノアッセイで検出可能なＰＩを発現しなかった。次に、フ１９８６）の制御下にある溶原菌である。大腸菌ＢＬ２１　（ＤＥ３）を、プラスミドｐＵＮＣ７で形質転換した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ　ＰＴＧ）を含まない培地で生育させると、プラスミドｐＵＮｃ　７を存するＢＬ２１　（ＤＥ　３　’）は検出可能なＰＩを生産しなかったが、培地中にＴ７ボリメラーゼ生産を誘導するＩＰＴＧが存在すると、ＰＩ遺伝子生産物はコロニープロットラジオイムノアッセイでＰＩＡモノクローナル抗体によって検出された。

発現されたタンパク質は、生産物が細胞を溶解することな（コロニーラジオイムノアッセイで検出されつることから、大腸菌クローンの内層膜を通って有効に運び出されると思われる。このタンパク質は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（第６図Ａ）およびウェスタンブロッティング（第６図Ｂ）によって検出されたＦＡ１９と比較して、同等の見かけの分子量を存し、ＩＰＴＧ存在下で一晩生育させる間にクローンによって産生される最も大量のタンパク質であるとも思わ゛れる。このタンパク質生産は特にこの大腸菌株に致死的であり、安定な細胞を回収することはできない。しかしＩ　ＰＴＧ含有培地での生育によって発現が誘導されないならば、ＰＩ遺伝子を包含するプラスミドｐＵＮｃ　７を有する菌株中に安定に保持することができる。プラスミドｐＵＮｃ　７を有する菌株ＢＬ２１　（ＤＥ３）の生物学的に純粋な培養物は、１９８７年１１月１３日に、ｔｈｅ　Ｎｏｒｔｈｅｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　（ＮＲＲＬ）に受託番号ＮＲＲＬ　＃Ｂ−１９２６３のちとに寄託された。

てＰＩＡおよびＰＩＢタンパク質が対立遺伝子であることを示そうとする試みの結果として、ＰＴＢ遺伝子およびＰＴＡ／Ｂハイブリッドの両者が同定および単離された。順次行われる手順はＰＩＡ含有菌株への選択可能なマーカーの挿入、それに続＜ＰＩＢ生産菌株の形質転換を包含する。これらの操作法の輪郭を以下に詳細に述べる。

７．１．ＰＴ遺伝子への選択可能なマーカーの挿入ＦＡ１９（ＰＩＡ生産菌株）のＰＩ遺伝子の最初の４５コドンおよび上流配列を含む、上記ｐＵＮｃ３の９００ｂｐの５ａｕ３Ａ　Ｉ断片を、ＢａｍＨｒ消化ｐＨ８Ｓ６に結合してプラスミドｐＮＣ３２を作成した（第７図）。次にこのプラスミドをシャトル突然変異誘発に付した。シャトル突然変異誘発は５ａｉｆｅｒｔら（上記）の方法の変法を用いて行った。

標的のＤＮＡをｐＨ３Ｓ　６にサブクローニングし、大腸菌株ＲＤＰ１４６（ｐＴＣＡ）に形質転換により導入し、続いて接合によりｐＯＸ３８：：ｍＴｎ３ｃｍ−３（大腸菌Ｗ３１１ｐｏｌＡ由来）を導入した。トランス接合体を３０°Ｃで一夜生育させて転位を起こさせ、続いて数時間３７°Ｃで生育させた。トランス接合体の「ブール」　（約１０００コロニー）を再懸濁し、大腸菌Ｎ５２１１４５ｍとの接合に際してドナーとして使用した。その場合、標的のプラスミドへ転位する際に中間体として生じたプラスミド同時組込み体が分解する（Ｓｅｉｆｅｒｔら、上記）。こうして挿入されたトランス接合体は、プラスミドｐＴＣＡ上でトランスに与えられるトランスボザーゼ機能がもはや存在しないため安定である。この場合に用いられたミニトランスボゾンは、Ｔｎ３のｂｌａ遺伝子がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子により置き換えられたｍＴｎ３Ｃｍ−３である。

ｐＮＣ３２の９　ｏｏｂｐの５ａｕ３Ａ　Ｉ断片内のｍＴｎ３Ｃｍ−３挿入部位をマツピングした後、種々の部位にｍＴｎ３Ｃｍ−３を有する５種のこのような構築物を、全挿入物を線状断片として放出させＮｏｔｌで消化して、ＦＡ１９を形質転換するのに使用した。消化されたプラスミドであるｐＮＣ３３２（第７図）だけが、約ｌＸｌ０−”の頻度でＦＡ１９をＣｍ’に形質転換した。ｐＮＣ３３２におけるｍＴｎ３Ｃｍ−３の挿入部位はＰＩＡ遺伝子プロモーター配列の約３００ｂｐ上流であったが、他の４つのプラスミドの挿入部位はすべて、ＰＩ遺伝子内ではないがより近接していた。形質転換体ＦＡ１．９　ＣＡＴ　ＤＩ　（第７図）のゲノム中のｍＴｎ３Ｃｍ−３の位置をサザンハイブリッド形成によって確認した。

％　であることを示している。ＰＩ構造遺伝子に隣接するＦＡｌ、９　ＣＡＴ　Ｄ　１のＣＡＴ？−カーがｎｍｐ遺伝子座と同じリンケージパターンを示したかどうかを調べるＳｐｃ″Ｃｍ’）の間で相互乗り換えを行った。ＦＡｌ３０　ＤＮＡをＦＡｌ９　ＣＡＴ　Ｄ　１の形質転換に用いた場合に、Ｓｔｒ・またはＳｐｃ’のいずれか一方を選択すると、同時形質転換頻互乗り換えにおいて、Ｃｍ ’を選択すると、同時形質転−夕はＣＡＴ遺伝子がｎｍｐ遺伝子座と同じ様式で且した。二のことはｎｍｐ遺伝子座がＰＩの構造遺伝子であることの強力な証拠を与える。

もう一つの乗り換えに際しては、ＰＩＢ菌株ＭＳＩＩを形質転換するためにＦＡｌ９　ＣＡＴ　ＤＩ　ＤＮＡを用い、Ｃｍ’を選択した。４５個の形質転換体のうち、２４個は供与株のＰＩＡを獲得し、１３個は受容株ＰＩＢを保持し、そ、して８個は新規ハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を発現した。これはコロニーイムノブロッティングにより検出された。近接して結合したＣＡＴ遺伝子を選択するときの供与株ＰＩＡによる受容株ＰＩＢの置換は、これらの遺伝子の対立遺伝子としての性質を確証するものであり、そしてハイブリッドタンパク質が高頻度に出現することは、２つの対立遺伝子間の配列相同性により遺伝子内組換えが起こることを示唆した。

これらのＰＩハイブリッド菌株の詳細な分析はＭＳＩＩのＰＸＢ配列に関する知識の如何に左右されるので、この配列をクローニングして配列決定した。

完全無欠な淋菌ＰＩ遺伝子を大腸菌にクローニングすることはできないと思われるため、−緒になって完全な遺伝子配列を含有するものであるＰＩＡについて上記したクローニング断片の方法を、ＭＳＩＩ　Ｐ　Ｉ遺伝子に採用した。予めハイブリッドＰＩを有するとしＮＡ断片を、クローニングして配列決定し、そして配ＩＢ遺伝子配列から誘導されたオリゴヌクレオチドＮＣｌ２（第８図）、およびこのタンパク質のＮ−末端に対応する遺伝子配列から誘導されたＭＣＩ（第１図）を、した。ベクタープラスミドｐＧＥＭ７３にクローニングされたＫｐｎ　Ｉ／Ｈｉｎｃ　Ｉｆ−消化ＭＳＩＩＤＮＡを含有するＨＢＩＯＩゴロニーを、これらのオリゴヌクレオチドをプローブとして探査し、ＮＣ１２とハイブリッド形成するコロニーをｐＵＮＣＨ２２（第８図）と命名した。しかし繰り返し試みても、ＭＣＩとハイブリッド形成するコロニーは検出されなかった。ＭＣＩはサザンハイブリッド形成でＭＳＩＩゲノムＤＮＡの７５０ｂｐの独ｎｌ／）ｌｉｎｃＩＩ断片とハイブリッド形成したため、問題点は大きさにあるのではなく、コピー数の多いベクターにおいては、ＨＢＩＯＩに対して致命的であるこの断片のＰｌ遺伝子部分の発現の問題である可能性が高いと思われた。この理由から、プローブとしてオリゴヌクレオチドＮＣＩを用いて、ＭＳＩＩＰ　Ｉ遺伝子の残りの部分をλｇｔｌｌにおける５４０ｂｐのＨｉｎｆｌ断片として単離した。このクローンをλｇＬ１１．　ＮＣＩ　　（第化し、サブクローニングし、配列決定した。この配列を第９図に示す。この配列から３５０アミノ酸のタンパク質が予想され、そのうち最初の１９は推定シグナルペプチドである、ＦＡｌ９およびＭＳＩＩのＰＩ遺伝子の比較は、８０％のヌクレオチド配列相同性を示す。Ｐ　Ｉ　Ａ　（ＦＡｌ９）およびＰ　Ｉ　Ｂ　　（ＭＳＩＩ）の予想アミノ酸配列の比較を第１０図に示す。これは長い相同領域が散在する数多くの官憲に相違する領域を示す。淋菌細胞全体に対して生じるＰＩ−特異的モツクローナル抗体はＰＩＡとＰＩＰＩＡの場合と同じ方法を用いて完全なＰＩＢ遺伝子の発現を達成した（６，２節）。ＰＩＢ遺伝子プロモＨｉｎｃＩＩおよびＢａｍＨＩで消化されたベクターｐＧＥＭ−２内にｐυＮＣＨ２２の７５０ｂｐのＫｐｎ　ｌ−３ａｕ３Ａ　Ｉ断片と一緒に連結させた。この結果、それ自身のプロモーターを持たないがプラスミドベクター上のＴ７プロモーターのすぐ下流に完全なＰＩＢコード配列を生じた。この構築物（ｐＵＮＣＨ２５）をＢＬ２１　（ＤＢ３）　ｉ、導入し、ｒＰＴＧ？Ｆ在下ニ生育させると、ＦＩＢの発現を検出することができた（第１１図）。

プラスミドｐＵＮｃ）１２５を有する生物学的に純粋な大腸菌株ＢＬ２１　（ＤＢ　３　）培養物は、ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｃｉｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄに受託番号６７７７５のもとに寄託されている。

？、３．　　Ｐ　Ｉ　Ａ／Ｂハイブリッド菌株の構築および分析さらに、ＭＳＩＩをＦＡ１９　ＣＡＴ　ＤＩ　Ｄ　Ｎ　Ａで形質転換しることにより、ＰＩＡ／Ｂハイブリッドを構築した。

相互乗り換えにおいて、ＦＩＢを保持しているＭＳＩＩのＣＩ！ｌ′形質転換体由来のＤＮＡをＦＡ１９の形質転換に使用し、Ｃｍ’で選択し前記のようにＰＩを検出した。抗生物質耐性を表現型として発現させるために、細胞をＧＣ基礎ブロス中で、あるいは抗生物質を含有する軟寒天上層を添加した。ＧＣ基礎寒天培地中で５時間インキュベートした。受容株としてＦＡ１９を用い、Ｃｍ’で選択するときは１μｇ／−の抗生物質を使用したが、ＭＳＩＩを受容株であるときは１０μｇ／−を用いた。Ｃａｎｎｏｎらの方法の変法を用いてモノクローナル抗体の結合について細菌株をアッセイした。ＧＣ基礎ブロス中の高濃度細胞懸濁液を濾過マニホルドを用いてニトロセルロースに移し、クロロホルム蒸気中で溶解させた。このフィルターを５％粉乳を含有するＴ　Ｂ　Ｓ　　（ｌｏｍＭ）リス −ＨＣｌ５ｐＨ７，５，１５０ｍＭ　ＮａＣ１ｔ）に浸漬し、適当な抗体を含有するＴＢＳ中でインキュベートシ、つぎにＴＢＳ中で洗浄した。二次抗体と接合した抗マウスＩｇＧ−アルカリフォスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）中でインキュベートし、さらに洗浄した後、フィルターをニトロブルーテトラリルホスフェート（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａＬｏｒｔｅｓ）を用いて製造業者の指示にしたがって展開した。使５Ｇ９．５０１（１０）、　１０３（２６）および５Ｍｌ０Ｉ（２７）　（これらは全てＰＩＡ特異的である）、ならびにＩＦ５．３Ｃ８，２Ｄ４および２Ｈ１（１０）　（これらはＦＩＢ特異的である）であった。

５Ｍｌ０Ｉ以外の全ての抗体はＭ、Ｔａｍ（ＧｅｎｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）の厚意により腹水中で供給され、１：２０００ないしｌ　：　１００００大学）の厚意により提供された。

受容株としてＦＡ１９を用いた３００個の形質転換体のうち、３個がハイブリッドＰＩを有した。１３個のハイブリッド菌株のうち、５個の異なるハイブリッドＰＩ血清型が同定された（第工表）。次にハイブリッドＰＩ遺伝子のどの部分がＰＩ配列であるか、そしてどれがＦＩＢ配列であるかを評価するために、多数のＰＩＡ−及びＰＩＢ−特異的オリゴヌクレオチド（第■表および第１Ｏ図）を用いるコロニーハイブリッド形成によりハイブリッド菌株を分析し、この方法により９個の異なるクラスが検出された（第１Ｏ図）構造を既知のハイブリッドＰＩの血清型の分析により、これらのモノクローナル抗体についてのエピトープのおよその位置を決定することができた。

（本頁以下余白）第工表ハイフリッ）’Ｐｌ菌株のＰＩ−特異的モノクローナル抗体との反応性（血清型）（本頁以下余白）第■表ＰＩハイブリッドの分析に使用したオリゴヌクレオチドＮＣ９ＴＣＧＡＡＣＣＣＡＡＡＴＣＡＧＣＧ　　　　Ａ　　　　３４−４ＯＮＣＩＩ　　ＣＧＧＴＧＴＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＣＡ　　　　２９９−３０５ＮＣ１２ＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＣＴ　　　　Ｂ　　　　１８２−１８７ＮＣ１３ＣＡＡＧＧＴＧＣＣＴＣＣＧＴＣＧＣＢ　　　　６ｌ−６６ＮＣ１４ＡＡＧＴＧＣＧＣＧＴＣＧＧＣＣＧＴ　　　　Ａ　　　　８７−９２ＮＣ１５ＧＡＣＴＴＧＧＣＧＣＡＡＣＧＡＴＡ　　　　Ａ　　　　２１３−２１９ＮＣ１６ＧＣＡＧＣＧＴＡＣＡＡＴＡＣＧＣＡＣＢ　　　　１４４−１５ＯＮＣ１８ＧＣＡＡＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＣＣＣ＾　　　１１６−１２１ＮＣ１９ＡＧＧＣＡＣＴＧＴＴＧＡＴＡＧＴＧＣＢ　　　　２７３−２７９零位置は、オリゴヌクレオチド配列によって全体または一部としてコードされたアミノ酸残基の番号　（ここで、＃１は成熟タンパク質の最初の残基である）クラス１ハイブリツドと反応するＰＩＡ特異的モノクローナル抗体４Ｇ５．２Ｆ１２および５Ｍｌ０Ｉのエピトープ（′１、タンパク質のＮ −末端の近く、最初の６０残基以内番こ存在するはずである。）１イブリ・ソドクラス１，５および６の比較は、５Ｍｌ０Ｉに対するエピト−プが少なくとも部分的には残基３４と６０の間の領域に存在すること力（示唆される。Ｎ−末端６０残基はＰＩＡおよびＦＩＢ間で有意な相違を含み（第３図、第９図、第１０図）、これはこれらの抗体の特異性の説明となりうる。ハイブリッドクラス６−９と反応する６Ｄ９　（Ｐ　Ｉ　Ａ特異的）のエピトープは、残基１８７から２５０までのタンパク質領域に存在し、この領域もまたＰＩＡおよびＰＩＢの間で有意に異なる領域を含む。４Ａ１２．５Ｇ９．５Ｄ１およびＩＤ３（すべてＰＩＡ特異的）のエピトープは、クラス９のハイブリッドタンパク質においてのみ検出され、したがっておそらくタンパク質のＮ−末端およびＣ−末端部分の両方を含む複合エピトープである。このことは、タンパク質が比較的に変性されるウェスタンプロットではＰＩとよく反応しないという観察によって支持される。

ＭＳＩＩのＰＩＢと反応する４個の抗体のうち、ハイブリッドクラス７および８と反応する７Ｆ５のエピトープはＮ−末端６０残基内に位置するが、３Ｃ８，２Ｄ４および２Ｈ１のエピトープは分岐配列を含有するタンパク質の中央部、残基１５０から２７０までの間に存在すると思われ、この部分は長く伸びたクラス９ハイブリツドタンパク質が３０８とのみ反応することから、３Ｃ８のエピトープは２Ｄ４および２Ｈ１のエピトープのわずかに上流に位置する。しかし、２Ｄ４および２Ｈ１がウェスタンプロットではＰＩＢと反応しないことから、これらのエピトープは比較的複雑でありうる。ハイブリッドＰＩＡ／Ｂ遺伝子を含有してハイブリッドＰＩＡ／Ｂタンパク質を発現する形質転換微生物ＦＡ６２４８の生物学的に純粋な培養物は、ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤに受託番号５３８０８のちとに寄託されてリポータ −遺伝子をＰＩ構造遺伝子の近くに挿入した本研究は、ＰＩＡおよびＰＩＢ構造遺伝子が同じ遺伝子座の対立遺伝子であることを実証するものであり、の１個のＰＩ遺伝子の存在は、天然に存在する菌株がＰＩＡまたはＰＩＢタンパク質のいずれか一方を有し両方を持つことは決してなく、そしてＰＩ血清型が安定に保持されるとの観察に符号する。ＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子と推定アミノ酸配列の比較は高度の相同性を示したが、有意に配列の異なる領域が確認された。

ＰＩハイブリッドは天然には生じないが、本発明者らが構築したＰＩハイブリッドはインビトロで安定に生存した。しかし、ＦＩＢ　　Ｎ−末端とのハイブリッドＰ■の形成頻度が比較的低く、ＰＩ遺伝子内で多重乗り換えの起こる頻度が驚異的に高いことは、ある種のクラスのハイブリッドＰＩをインビトロ生育した淋菌が好むのかも知れない。

ＰＩハイブリッドの構築および分析によって、本発明者らはタンパク質のいくつかの表面露出部分のおよ−その位置を決定することができ、二次および四次構造の可能性に対する知見が与えられた。ＰＩＡおよびＰＩＢの両方のＮ−末端領域は、各タンパク質の中央部にある少なくとも１つの別の領域とともに表面に露出しているとと思われる。多くのＰＩＡ特異的モノクローナル抗体のエピトープはＮ−末端およびＣ−末端部分の両方がハイブリッドＰＩ内に存在するときにのみ同定されたことから、外層膜内でのＰＩＡの折り畳み状態はＮ−末端およびＣ− 末端部分が表面上で密接に関連しているような状態かもしれない。外層膜内でのＰＡのコンフォーメーションに関するこのようなモデルは、非処理の淋菌内でのＰＩのタンパク質加水分解的切断に基づく先行モデルのいくつかの態様と一致す（７）Ｎ−末端およびＦＩＢの中央部分のみが表面に露出している（Ｂｌａｋｅら、上記；　Ｔｅｅｒｌｉｎｋ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。

±：６３−７６、１９８７）との既報の示唆とは異なる。

８、微生物の寄託列挙したプラスミドを有する下記の大腸菌株は、ｔｈｅ　Ａｇｒｉｃｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）。

Ｐｅｏｒｉａ、　ＩＬまたはＬｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤに寄託され、表記の受託番号が付与されている。

大腸菌株　　　プラスミド　　　　受託番号ＢＬ２１（ＤＥ３）　　　　ｐＵＮＣ７ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２６３ＢＬ２１（ＤＥ３）　　　　ｐＵＮｃＨ２５ＡＴＣＣ６７７７５Ｎ、ゴノロエアエＦＡ６２４８　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ５３８０８本発明は寄託された菌株により範囲を限定されるものではない。なぜならば各菌株は本発明の一態様の一つの説明として意図されるからであり、機能的に同等な全ての細胞系は本発明の範囲を包含される。実際、ここに示されかつ記載されたことに加えて本発明を種々変更することは、前記記載から当業者に明らかになるであろう。このような変更は添付の請求の範囲内に包含されるものとする。

また、ヌクレオチドについて与えられた全ての塩基対の大きさは概数であり、説明の目的で用いられることは当然のことである。

特表千３−５０２８８１　（２０） −」凹占し＝ロ　　　　ロ　　　　　ｅ　　　　　　ｏ　　　ｅ　　　　ロ　　　ロ　　　ロ　　　ロ　　　ロ　　　Ｃ＝　　８　　ぬ　　岡　　Ｓ　　譜　　＝　　二　　 −冨　　臣ＦＩＧ、４中５ｏｏｂ口Ｒニー　　　　〜　　　ｖ１ｃ１１Ｃ〜ｑＰ１．０００円　　ゞ　　ｔｒ　　　　Ｐ ″　　鴫　　φ　　き　　兄ＮＨ２Ｃ００ＨＯｔｏｏ　　　　　　　　　　　　　２００　　　　　　　　　　　　３００国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ナイセリア・ゴノロエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のプロテインＩＡをコードする精製遺伝子配列、またはプロテインＩＡの免疫反応性抗原決定基を有するポリペプチドをコードするその一部分、突然変異体、または組換え体。
２．第３図に示す請求の範囲第１項の配列。
３．請求の範囲第１項の配列を有してなる組換えベクター。
４．請求の範囲第２項の配列を有してなる組換えベクター。
５．プラスミドである請求の範囲第１項または請求の範囲第２項の組換えベクター。
６．プラスミドｐＧＥＭ−２から誘導される請求の範囲第１項または請求の範囲第２項の組換えベクター。
７．プラスミドがｐＵＮＣ−３である請求の範囲第６項の紺換えベクター。
８．プラスミドがｐＵＮＣ−７である請求の範囲第６項の組換えベクター。
９．プラスミドがｐＵＮＣ−１５である請求の範囲第６項の組換えベクター。
１０．請求の範囲第１項または請求の範囲第２項の配列を含有する宿主生物。
１１．請求の範囲第３項のベクターを含有する単細胞生物。
１２．請求の範囲第４項のベクターを含有する単細胞生物。
１３．請求の範囲第９項のベクターを含有する単細胞生物。
１４．ＮＲＲＬ番号Ｂ−１８２６３と同一の特性を有する請求の範囲第１３項の単細胞生物。
１５．ａ）プロテインＩＡの免疫反応性抗原決定基を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有してなりかつ宿主内で複製、転写および翻訳され得るものである組換えベクターを宿主生物に導入し、ｂ）その組換えベクターを含有する単細胞生物を培養し、そしてｃ）その培養物から該ポリペプチドを単離する、ことからなる、ナイセリア・ゴノロエアエプロテインＩＡの免疫反応性抗原決定基を有するポリペプチドの生産方法。
１６．ベクターがプラスミドである請求の範囲第１５項の方法。
１７．第１図に示すようにプラスミドが配列またはその一部分、突然変異体、あるいは組換え体を有してなる請求の範囲第１６項の方法。
１８．プラスミドがｐＧＥＭ−２から誘導される請求の範囲第１７項の方法。
１９．プラスミドがｐＵＮＣ−７である請求の範囲第１８項の方法。
２０．請求の範囲第１５項の方法により生産されたポリペプチド。
２１．請求の範囲第１７項の方法により生産されたポリペプチド。
２２．請求の範囲第１９項の方法により生産されたポリペプチド。
２３．第９図に示すポリペプチド配列、その相同物、類似物、または活性部分。
２４．ナイセリア・ゴノロエアエブロテインＩＢをコードする精製遺伝子配列、またはプロテインＩＢの免疫反応性抗原決定基を有するポリペプチドをコードするその一部分、突然変異体、または組換え体。
２５．第９図に示す請求の範囲第２４項の配列。
２６．請求の範囲第２４項の配列を有してなる組換えベクター。
２７．請求の範囲第２５項の配列を有してなる組換えベクター。
２８．プラスミドである請求の範囲第２４項または請求の範囲第２５項の組換えベクター。
２９．プラスミドｐＧＥＭ−２から誘導される請求の範囲第２４項または請求の範囲第２５項の組換えベクター。
３０．プラスミドがｐＵＮＣＨ２５である請求の範囲第２９項の組換えベクター。
３１．請求の範囲第２４項または請求の範囲第２５項の配列を含有する宿主生物。
３２．請求の範囲第２６項のベクターを含有する単細胞生物。
３３．請求の範囲第２７項のベクターを含有する単細胞生物。
３４．請求の範囲第３０項のベクターを含有する単細胞生物。
３５．ＡＴＣＣ６７７７５と同一の特性を有する請求の範囲第３４項の単細胞生物。
３６．ａ）プロテインＩＢの免疫反応性抗原決定基を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有してなりかつ宿主内で複製、転写および翻訳され得るものである組換えベクターを宿主生物に導入し、ｂ）組換えベクターを含有する単細胞生物を培養し、そしてｃ）培養物から該ポリペプチドを単離する、ことからなる、ナイセリア・ゴノロエアエプロテインＩＢの免疫反応性抗原決定基を有するポリペプチドの生産方法。
３７．ベクターがプラスミドである請求の範囲第３６項の方法。
３８．第９図に示すようにプラスミドが配列またはその一部分、突然変異体、あるいは組換え体を有してなる請求の範囲第３７項の方法。
３９．プラスミドがｐＧＥＭ−２から誘導される請求の範囲第３８項の方法。
４０．プラスミドがｐＵＮＣＨ２５である請求の範囲第３９項の方法。
４１．請求の範囲第３６項の方法により生産されたポリペプチド。
４２．請求の範囲第３８項の方法により生産されたポリペプチド。
４３．請求の範囲第４０項の方法により生産されたポリペプチド。
４４．第９図に示すポリペプチド配列、その相同物、類似物、または活性部分。
４５．ナイセリア・ゴノロエアエのハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質をコードする精製遺伝子配列、またはプロテインＩＡおよびプロテインＩＢの免疫反応性抗原決定基を有するポリペプチドをコードするその一部分、突然変異体、または組換え体。
４６．請求の範囲第４５項の配列を有してなる組換えベクター。
４７．請求の範囲第４５項の配列を含有する宿主生物。
４８．請求の範囲第４６項のベクターを含有する単細胞生物。
４９．プロテインＩＡ及びプロテインＩＢの各々について少なくとも一つの免疫反応性抗原決定基を有してなるポリペプチド配列。
５０．請求の範囲第１５項または請求の範囲第３６項の方法により生産された免疫原的に有効な黄のポリペプチドを、医薬上許容されうる担体と組み合わせて含有するナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防または治療のためのワクチン組成物。
５１．請求の範囲第１７項または請求の範囲第３８項の方法により生産された免疫原的に有効な量のポリペプチドを、医薬上許容されうる担体と組み合わせて含有するナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防及び治療のためのワクチン組成物。
５２．請求の範囲第１９項または請求の範囲第４０項の方法により生産された免疫原的に有効な量のポリペプチドを、医薬上許容されうる担体と組み合わせて含有するナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防及び治療のためのワクチン組成物。
５３．請求の範囲第２３項または請求の範囲第４４項の、免疫原的に有効な量のポリペプチドを、医薬上許容されうる担体と組み合わせて含有するナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防及び治療のためのワクチン組成物。
５４．請求の範囲第１５項または請求の範囲第３６項の方法により生産された免疫原的に有効な量のポリペプチドを宿主に投与することからなるナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防または治療法。
５５．請求の範囲第１７項または請求の範囲第３８項の方法により生産された免疫原的に有効な量のポリペプチドを宿主に投与することからなるナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防または治療法。
５６．請求の範囲第１９項または請求の範囲第４０項の方法により生産された免疫原的に有効な量のポリペプチドを宿主に投与することからなるナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防または治療法。
５７．請求の範囲第２３項または請求の範囲第４４項の免疫原的に有効な量のポリペプチドを宿主に投与することからなるナイセリア・ゴノロエアエ感染の予防または治療法。
５８．ナイセリア・ゴノロエアエのＤＮＡ配列のプロティンＩをコードする部分と相補性であってこれとハイブリッド形成できるＤＮＡ配列を含有することを特徴とする、ナイセリア・ゴノロエアエの同定に有用なＤＮＡプローブ。
５９．配列：【配列があります】を有する請求の範囲第５８項のＤＮＡプローブ。
６０．配列：【配列があります】を有する請求の範囲第５８項のＤＮＡプローブ。
６１．分析的に検出可能な試薬で標識された請求の範囲第５８、または５９または６０のプローブ。
６２．ナイセリア・ゴノロエアエのＤＮＡ配列のプロテインＩＡをコードする部分と相補性であってこれとハイブリッド形成できるＤＮＡ配列を含有することを特徴とする、ナイセリア・ゴノロエアエの検出に有用なＤＮＡプローブ。
６３．配列：【配列があります】を有する請求の範囲第６２項のＤＮＡプローブ。
６４．配列：【配列があります】を有する請求の範囲第６２項のＤＮＡプローブ。
６５．配列：【配列があります】を有する請求の範囲第６２項のＤＮＡプローブ。
６６．配列：【配列があります】を有する請求の範囲第６２項のＤＮＡプローブ。
６７．配列：【配列があります】を有する請求の範囲第６２項のＤＮＡプローブ。
６８．配列：【配列があります】を有する請求の範囲第６２項のＤＮＡプローブ。
６９．分析的に検出可能な試薬で標識された請求の範囲第６２または６３または６４または６５または６６または６７または６８のプローブ。
７０．ナイセリア・ゴノロエアエのＤＮＡ配列のプロテインＩＢをコードする部分と相補性であってこれとハイブリッド形成できるＤＮＡ配列を含有することを特徴とするナイセリア・ゴノロエアエ検出に有用なＤＮＡプローブ。
７１．配列：【配列があります】を有する請求の範囲第６８項のＤＮＡプローブ。
７２．配列：【配列があります】を有する請求の範囲第６８項のＤＮＡプローブ。
７３．配列：【配列があります】を有する請求の範囲第６８項のＤＮＡプローブ。
７４．配列：【配列があります】を有する請求の範囲第６８項のＤＮＡプローブ。
７５．分析的に検出可能な試薬で標識された請求の範囲第７０または７１または７２または７３または７４のプローブ。
７６．ａ）Ｎ．ゴノロエアエのＤＮＡゲノムのプロテインＩをコードする部分と相補性であるプローブをＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成を促進する条件下で検体と接触させ、そしてｂ）形成されたハイブリッドすべてを検出し、それによって該検体中のＮ．ゴノロエアエの存在を検出する、ことからなるＮ．ゴノロエアエを含有する疑いのある検体中の該菌を検出する方法。
７７．プローブが請求の範囲第５９項のプローブである請求の範囲第７６項の方法。
７８．プローブが請求の範囲第６０項のプローブである請求の範囲第７６項の方法。
７９．プロテインＩがプロテインＩＡである請求の範囲第７６項の方法。
８０．プローブが請求の範囲第６３，６４，６５，６６，６７，または６８項のプローブである請求の範囲第７９項の方法。
８１．プロテインＩがプロテインＩＢである請求の範囲第７６項の方法。
８２．プローブが請求の範囲第７１，７２，７３，または７４項のプローブである請求の範囲第８１項の方法。
８３．プローブが分析的に検出可能な試薬で標識された請求の範囲第７６または７７または７８または７９または８１項の方法。
８４．プローブが分析的に検出可能な試薬で標識された請求の範囲第８０項の方法。
８５．プローブが分析的に検出可能な試薬で標識された請求の範囲第８２項の方法。
８６．請求の範囲第５８−７２項のいずれかのプローブのうち少なくとも一つを有してなる診断テストキット。
８７．ＡＴＣＣ５３８０８と同一の特性を有するナイセリア・ゴノロエアエ菌株。