FI102189B - Menetelmä tippuribakteerin PIA-proteiinin tuottamiseksi ja eristämisek si - Google Patents
Menetelmä tippuribakteerin PIA-proteiinin tuottamiseksi ja eristämisek si Download PDFInfo
- Publication number
- FI102189B FI102189B FI902569A FI902569A FI102189B FI 102189 B FI102189 B FI 102189B FI 902569 A FI902569 A FI 902569A FI 902569 A FI902569 A FI 902569A FI 102189 B FI102189 B FI 102189B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- protein
- pia
- vector
- gene
- sequence
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 title claims abstract description 24
- 101710167887 Major outer membrane protein P.IA Proteins 0.000 title claims description 118
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 title claims description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title description 6
- 101710167885 Major outer membrane protein P.IB Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 50
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 39
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 30
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 claims abstract description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 180
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 91
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 51
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 3
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims 2
- 241001212279 Neisseriales Species 0.000 claims 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 88
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 72
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 71
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 239000000047 product Substances 0.000 description 33
- 101150082998 pi gene Proteins 0.000 description 28
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 19
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 18
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 17
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 14
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 12
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 11
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 10
- 101710190786 PI protein Proteins 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 4
- 102000017033 Porins Human genes 0.000 description 4
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 4
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 4
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108700028353 OmpC Proteins 0.000 description 2
- 108700006385 OmpF Proteins 0.000 description 2
- 108700022034 Opsonin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 108010005173 SERPIN-B5 Proteins 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KCVIRDLVBXYYKD-UHFFFAOYSA-O 1-nitrotetrazol-2-ium Chemical compound [O-][N+](=O)[NH+]1C=NN=N1 KCVIRDLVBXYYKD-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108010000916 Fimbriae Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101150044008 PI1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030333 Serpin B5 Human genes 0.000 description 1
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 244000274883 Urtica dioica Species 0.000 description 1
- 235000009108 Urtica dioica Nutrition 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 1
- ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- -1 coatings Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N ddTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 1
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
102189
Menetelmä tippuribakteerin PIA-proteiinin tuottamiseksi ja eristämiseksi 5 Tippuri on tällä hetkellä laajimmalle levinnyt sukupuolitauti, jota esiintyy kaikkialla maailmassa, ja pelkästään Yhdysvalloissa tavataan vuosittain useita miljoonia tapauksia. Taudin aiheuttaja on gonokokki Neisseria gonor-rhoeae, bakteeri, joka on koko historiansa aikana kehittä-10 nyt vastustuskyvyn sekä perinteistä antibioottihoitoa että jossain määrin normaalia ihmisen seerumin bakteereja tappavaa aktiivisuutta vastaan. Nykyinen keinojen puute infektion kontrolloimiseksi perinteisin menetelmin on tehnyt infektion tehokkaasti estävän rokotteen kehittämisen erittäin 15 tärkeäksi. Tämä keksintö tarjoaa käytettäväksi DNA-jakson, joka koodaa spesifistä IL. gonorrhoeapn ulkokalvon proteiinia; tämän nimenomaisen jakson kloonattu tuote tuo käytettäväksi sopivan lähtökohdan tällaista rokotetta varten.
Tämä keksintö tarjoaa myös lajispesifisiä oligonukleotidi-20 jaksoja, jotka ovat käyttökelpoisia diagnostisia koettimia tippuritartunnan havaitsemiseksi.
Mitä tahansa tiettyä infektion aiheuttajaa vastaan . .·. suunnatun suojaavan immuunivasteen muodostuminen selkäran- 25 karsilla riippuu ensi vaiheessa siitä, että isännän m.m.m immuunijärjestelmä saa asianmukaisen kiihokkeen. Useina * · · I.I kiihokkeen antavina yhdisteinä tai antigeeneinä toimivat • · · ** ’ itse infektoivan eliön omaan solukalvokoostumukseen • · i luonteenomaisesti kuuluvat aineet sinänsä tai tästä orga- 30 nismista isännän ruumiiseen vapautuvat metaboliatuotteet.
φ·] . Nämä immunologisen järjestelmän vieraiksi tunnistamat I..* aineet, jotka ovat tavallisesti suurempia molekyylejä, • · ***** kuten proteiinit, lipopolysakkaridit tai glykoproteiinit, saavat isännän reagoimaan yhdellä tai useammalla tavalla 35 hyökkäävän organismin poistamiseksi tai sen saattamiseen toimintakyvyttömäksi. Antigeeni voi aiheuttaa sen, että muodostuu herkistyneitä, soluvälitteisen immuniteetin tuottavia lymfosyyttejä. Vaihtoehtoisesti antigeeni voi 102189 2 stimuloida vapaan vasta-aineen vapautumisen vereen ja muihin ruumiinnesteisiin (humoraalinen immuniteetti). Kehon suojaavan immuniteetin kehittyminen riippuu toisen tai molempien näiden systeemien stimulaatiokynnyksen saa-5 vuttamisesta.
Väliaikainen immuniteetti infektiota vastaan voidaan useissa tapauksissa saada antamalla yksilölle toisen saman lajin yksilön ennakolta muodostamia vasta-aineita.
10 Tämä tunnetaan passiivisena immuniteettina. Yksi esimerkki tästä immuniteetista on sikiön ja vastasyntyneen saama suoja äidin vasta-aineiden siirtymisestä istukan kautta sekä vasta-aineiden siirtymisestä maidon välityksellä. Toinen esimerkki on yhdistetty aikuisten gamma-15 globuliini, jota käytetään usein estämään tai muokkaamaan altistumista tuhkarokolle, vesirokolle, hepatiitille, isorokolle ja jäykkäkouristukselle. Nämä saadut vasta-aineet kuluvat vähitellen vuorovaikutukseen antigeenin kanssa tai ne pilkkoutuvat kehossa ja tästä syystä suoja 20 lopulta häviää.
Säilyvämpi suoja saadaan aktiivisella immunisoinnilla. Rokotuksesta syntyy aktiivinen suojaava immuniteetti käyttämällä immuunijärjestelmän ensivaiheisena kiihokkee-25 na vaaratonta tai ei-virulenttia antigeenin muotoa (esim. tapettua tai geneettisesti muunnettua bakteeria tai soluseinästä eristettyä glykoproteiinia). Tämä synnyttää vasta-aineiden tuotossa melko hitaan vasteen, joka nousee huippuunsa ja häipyy pois. Keho on kuitenkin saa-30 nut hälytyksen antigeenin olemassaolosta, ja kun altistuminen tapahtuu uudelleen, mahdollisesti elävällä ja viru-*···' lentilla organismilla, esiintyy sekundäärinen vaste, jol- '·’ ’ loin vasta-ainetta tuotetaan paljon nopeammin ja runsaam- ·*·.. min. Tämä sekundäärinen vaste riittää tyypillisesti es- 35 tämään mikro-organismin asettumisen kehoon siten, että se voisi aiheuttaa täysimittaisen infektion.
Rokote voi esiintyä useassa eri muodossa, joista jotkin ovat toisia tehokkaampia antamaan haluttua suojaavaa vai- 102189 3 kutusta. Aiemmin monia rokotteita on valmistettu tappamalla tai inaktivoimalla kiinnostuksen kohteena olevaa tautia aiheuttava mikro-organismi ja käyttämällä tapettuja soluja aktiivisena immunogeenisenä aineena. Tämän-5 tyyppisiä rokotteita on käytetty lavantautia, koleraa ja poliota vastaan (Salk -rokote). Tämäntyyppisen rokotteen ongelma on, että mikro-organismin tappamiseen tarvittu käsittely, kuten formaldehydi, voi usein muuntaa tai tuhota mikrobin käyttökelpoisia antigeenejä ja näinollen 10 saatu immuniteetti voi olla huono tai epätäydellinen.
Rokotteen vaihtoehtoinen muoto on heikennettyjä mikro-organismeja käyttävä rokotemuoto. Heikennetty mikro-organismi on sellainen, joka on vielä elävä ja annostelun 15 jälkeen lisääntymiskykyinen kehossa, mutta joka on muunnettu jollain tavalla ei-virulentiksi tai vaihtoehtoisesti tämä on kanta, joka on virulentti toisille eliöille, mutta ei ole virulentti ihmiselle. Heikennetyn organismin käytöstä saadaan se etu, että heikentäminen ei taval-20 lisesti muuta antigeenisyyttä, jolloin tämä tuottaa tehokkaan kiihokkeen immuunijärjestelmälle. Heikennetyt rokotteet tuhkarokkoa, vihurirokkoa ja poliota vastaan ovat päässeet laajaan käyttöön. Heikentäminen suoritetaan tavallisesti muuttamalla mikro-organismin kasvatus-25 olosuhteita tai, viimeaikaisemmin, muuntamalla geneetti-sesti organismin virulenssia. Vaikka elävät organismit ovat yleensä tehokkaampia kuin tapetut rokotteet, on kui- • · · tenkin olemassa se vaara, että niiden virulenssi palautuu, josta on seurauksena taudinoireiden ilmaantuminen.
30
Kokonaisista organismeista valmistettuihin rokotteisiin • · .'···' liittyvien ongelmien johdosta on yksittäisten suojaavien • « « ·.· ' antigeenien käyttö rokotekoostumusten aktiivisina aineina « · yleistynyt viime vuosina. Vaikkakaan ei ole aina yksin- .···. 35 kertaista eristää ja tunnistaa joitakin tiettyjä suojaa- van vasteen herättäviä organismin antigeenejä, tämä menetelmä tarjoaa tehokkaan ja haitattoman vaihtoehdon kokonaisista organismeista valmistetuille rokotteille sitten, kun nämä antigeenit on tunnistettu.
102189 4
Esimerkkejä antigeenityypeistä, jotka ovat tyypillisesti käyttökelpoisia tähän tarkoitukseen, ovat puhdistetut solun tai kapsidin komponentit, kuten bakteeritoksiinit, 5 (joiden toksisuus on hävitettävä, jotta saadaan toksoi-di), bakteerin tai viruksen toksiinialayksiköt, solunsei-nän polysakkaridit tai kapsidin glykoproteiinit. Nämä komponentit ovat usein hyvin tehokkaita immuniteetin tuottamiseen, mutta vaikeuksia syntyy varsinaisessa puh-10 distamisessa. Kriittistä on se, että kiinnostuksen kohteena oleva antigeeni eristetään enemmän tai vähemmän täydellisesti muista ylimääräisistä solumateriaaleista, joiden läsnäolo voi usein aiheuttaa haitallisen immunologisen tai aineenvaihduntaa koskevan vasteen samanaikai-15 sesti halutun immuniteetin tuottavan reaktion kanssa. Tarvittavat puhdistusmenetelmät ovat usein monimutkaisia, vaivalloisia ja kustannuksiltaan niin korkeita, ettei niiden käyttöönotto tule kyseeseen ja tulokset eivät aina ole täysin ennustettavia. Tämä ongelma voidaan joissakin 20 tapauksissa välttää valmistamalla synteettisesti pieniä peptidijaksoja, jotka vastaavat mikrobiantigeenilla olevia epitooppeja. Joissakin olosuhteissa tämän menetelmän varjopuoliin kuuluu se, että vaikka aminohappojärjestys vastaa luonnollista epitoopin aminohappojärjestystä, kon-25 formaatio ei mahdollisesti ole parentaaliseen antigeeniin verrattuna riittävässä määrin samanlainen asianmukaisen immuunivasteen herättämiseksi.
• · »
Monet edellisiin rokotetyyppeihin liittyvät haitat voi-30 daan välttää yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen. Mahdollisuus kloonata kokonaista tärkeää mikrobiantigeenia tai « · *···1 tämän osaa koodaavat geenit tarjoaa suhteellisen talou- • # « dellisen ja helppokäyttöisen tarvittavan immunogeenimate- • · riaalin lähteen, joka on olennaisen puhdas kontaminoivas-35 ta proteiini- tai geneettisestä materiaalista. Lyhyesti kuvattuna tähän menetelmään puhdistettujen antigeenien tuottamiseksi kuuluu tätä antigeeniä koodaavan spesifisen DNA-jakson liittäminen DNA-vektoriin sellaisen yhdistel-mä-DNA-molekyylin muodostamiseksi, jota isäntäsolu voi 5 102189 monistaa. Nykyisin on runsaasti menetelmiä, joilla yhdistelmä -DNA-molekyylejä voidaan valmistaa. Yksi hyvin tunnetuista menetelmistä on Cohenin ja Boyerin US-patentissa 4 237 224 kuvaama menetelmä, johon sisältyvä oppi 5 liitetään tähän hakemukseen viittauksella. Tässä menetelmässä yhdistelmäplasmidit tuotetaan restriktioentsyy-mejä ja ligaasireaktiolla suoritettua yhdistämistä käyttäen; saadut plasmidit viedään sitten yksisoluiseen isän-täsoluun, joka näin transformoituu ja aloittaa vieraan 10 DNA:n monistamisen. Toinen, bakteriofaagivektoreita käyttävä menetelmä on kuvattu US-patentissa 4 304 863, joka myös liitetään tähän hakemukseen viittauksella. Kloonausmenetelmä tarjoaa suurimmat mahdollisuudet tuoda vaivattomasti saataville helppokäyttöiset ja taloudelliset 15 materiaalilähteet rokotteiden valmistamiseksi; sitä ei kuitenkaan voi soveltaa vaikeuksitta, sillä asianmukainen tunnettua immunogeenistä antigeeniä vastaava geeni täytyy ensin eristää ja sekvensoida, liittää plasmidiin asianmukaisen lisääntymisen, transkription ja translaation var-20 mistamiseksi ja liittää sitten yhteensopivaan isäntäso-luun.
Epäonnistumisen mahdollisuus halutun geenituotteen ilmen-• tämisessä on erityisen suuri, jos yksikin geenin trans- • : 25 kriptiosta, RNA:n translaatiosta tai translaation jälkei- sestä prosessoinnista ja polypeptidin sijoittumisesta soluun koostuva vaihe ei tapahdu oikein. Jotta kloonattu • · · liitosjakso toimisi transkriptiossa, vaaditaan sellaista • · φ promoottoria, jonka isännän RNA-polymeraasi voi tunnis- . . 30 taa. Varsinainen translaatio vaatii sen, että RNA:ssa on • · · *;/,* ribosomin sitoutumiskohta. Translaation jälkeiseen pro- • * f *·[ ' teiinien muokkaukseen liittyy usein proteiinit solukalvon :V: läpi ohjaavan signaalijakson pilkkominen. Isäntämikro- ;***: organismin tuottaman vieraan proteiinin hajottamista voi
t f I
*, 35 myös tapahtua, jos aminohappojakson konfiguraatio ei suo- jaa niitä isännän solunsisäisten proteaasien vaikutuksel-ta. Vaikka näiden menetelmien voitaisiin kuvitella olevan ihanteellinen keino saada vihdoinkin konstruoiduksi 102189 6
Neisseria -rokote, niitä ei ole aiemmin sovellettu tip-purirokotteen valmistamiseksi.
Jotkin Neisseria aonorrhoeaen antigeenit ovat tarkoin 5 tutkittuja ja luokiteltuja. Gonokokkien pilusten on havaittu olevan antigeenisiä (Buchanan et ai., (1973) J. elin., Invest. 52, 2896 - 2909) ja ne koostuvat pääasiassa molekyylipainoltaan noin 20 000 suuruisista proteiini-alayksiköistä. Tämän materiaalin synteettinen muoto on 10 formuloitu rokotevalmisteeksi (Schoolnik et ai ., (1983)
Prog. Allergy 33, 314 - 331). iL qonorrhoeaen lipopoly-sakkaridi on myös antigeeninen, ja sen β-l,4-sidoksella kytkeytyneet galaktoosi-glukoosiryhmät ovat pääasiallisin determinantti. Tämän alan tutkimuksen suurin keskittymi-15 nen on kuitenkin viime vuosina luultavasti kohdistunut ulkokalvon proteiineihin, proteiinikompleksiin, jonka osuutta immunogeenisyydessä ei vielä täysin ymmärretä. Ulkokalvon proteiinien koostumuksen tiedetään vaihtelevan jossain määrin kannasta toiseen ja tämän perusteella on 20 tunnistettu ainakin 16 erilaista serotyyppiä (Johnston et ai., (1976) J. Expt. Med. 143, 741 - 758). Aiemmin on kuvattu joitakin rokotekoostumuksia, joissa on käytetty gonokokkien kalvon osia, esimerkiksi US-patentissa n:o 4 203 971, US-patentissa n:o 4 228 557 ja US-patentissa n:o 25 4 681 761. Useimmat näistä koostumuksista sisältävät kuitenkin proteiinin ja muun materiaalin seoksen ja ne .···. kaikki vaativat melko työläitä puhdistusmenetelmiä aktii- t » » visten komponenttien eristämiseksi ja erottamiseksi bakteerisolusta. Näiltä rokotteilta saattaa siten puuttua 30 haluttu immunologinen spesifisyys ja niihin tarvitaan suuri määrä mikrobiperäistä lähtömateriaalia, jotta tuo- • · '···* tetta voitaisiin tuottaa kaupallisia määriä.
» * • * t • « • * :\(i Mahdolliseksi rokotekoostumuksen perustana olevaksi eh- ,"· 35 dokkaaksi on myös ehdotettu spesifistä ulkokalvon prote- • iinia, joka tunnetaan proteiinina I eli PI:nä. PI on N.
qonorrhoeaen runsaimmin esiintyvä ulkokalvon proteiini, '· joka toimii poriinina (Douglas et ai ., (1981) FEMS Mic robiology Letters 12, 305 - 309), proteiinina, jonka us- 102189 7 kotaan toimivan solussa pienimolekyylipainoisten aineiden kanavoimisessa hydrofobisen lipidiulkokalvon läpi. Lukuisat piirteet tekevät PI:stä mielenkiintoisen huomion kohteen: ensiksikin se on ainakin osittain vastuussa 5 Neisseria -suvun serotyyppispesifisyydestä ja proteiini I:n antigeenisten serotyyppien määrä on melko pieni. Tietyn nimenomaisen PI-serotyypin omaavat gonokokit on myös liitetty vaikeisiin gonokokki-infektioihin. Se näyttää lisäksi olevan natiivissa tilassaan pinnalla 10 esiintyvä ja näyttää stimuloivan opsoniinien tuottoa (Sa-rafian et ai., (1983) J. Infect. Dis. 148, 1025 - 1032). Opsoniinit ovat vasta-aineita, jotka sitoutuvat infektoi-vien organismien pintaan edistämään organismin joutumista fagosyyttien sisään. Sen immunogeeninen potentiaali on 15 jo osoitettu rokotetuissa hiirissä (Jiskoot et ai., (1986) Infect. Immun. 54, 333 - 338).
Gonokokeissa on osoitettu esiintyvän kahta eri pääasiallista PI-molekyylityyppiä, PIA ja PIB (Barrera et ai..
20 (1984) Infect. Immun. 44, 565 - 568) peptidikartoituksen ja proteolyysiherkkyyden perusteella (Blake et ai., (1981) Infect. Immun. 33, 212 - 222). Tämän jaottelun on havaittu korreloivan serologisista ryhmistä saatavien esikuvien (Sandstrum et ai., (1982) Infect. Immun. 38, 25 462 - 470) ja patogeneesin mukaan. Proteiinia IA ilmen tävät gonokokit liittyvät systeemisiin infektioihin, kun :'··. taas proteiinin IB omaavat gonokokit liittyvät paikalli- • · · .*:·. seen infektioon (Buchanan et ai ., (1981) Infect. Immun.
32, 985 - 994; Hildebrandt et ai., (1978) Infect. Immun.
30 20, 267 - 273).
Huolimatta siitä huomiosta, jota Pl:n kehittämiseen yh- • · '···' tenä mahdollisena rokote-ehdokkaana on kohdistettu, ei • · · *.* * vielä ole tuotettu Piihin perustuvaa tehokasta rokotetta.
35 Ei myöskään ole selvitetty sen tuottoa ohjaavaa geenisekvenssiä ja proteiinin rakenteesta tiedetään vähän. Tämä keksintö tarjoaa käyttöön ensimmäisen kuvauksen kokonaisesta PI-geenin sekvenssistä, PIA-rakennegeenistä sekä ·. kloonatun geenin tuotteesta. Kuvataan myös uuden PIB- 102189 8 geenin sekvenssi sekä näistä jaksoista johdetut yhtäjaksoiset PIA-PIB-kimeerat. Nämä kimeerat ovat käyttökel poisia peptidikartoituksessa sekä tarjoavat myöskin perustan rokotteen kehittämiselle.
5
Toinen tähän tautiin liittyvä suurimerkityksinen näkökohta on sen varhaisen havaitsemisen ja diagnoosin tärkeys. Tippurin diagnoosiin on tietenkin käytössä normaaleja bakteriologisia testejä, mutta nämä testit riippuvat bak-10 teerien kasvusta viljelmässä, joka voi viedä aikaa ja joka yleensä on melko epäspesifistä. Neisseria qonorr-hoeaella tiedetään olevan eri serotyyppejä, jotka voivat viitata hyvin selviin taudinkuviin, kuten edellisessä kohdassa todettiin. Taudin asianmukaisen hoidon toteut-15 tamista varten on ratkaisevaa, että diagnoosi ei ainoastaan ole nopea, vaan myös mahdollisimman tarkka.
RNA- ja DNA-koetinmeneteImien kehittyminen on tarjonnut ratkaisun useisiin näihin diagnostisiin ongelmiin. Koe-20 tin on tyypillisesti radioaktiivisella leimalla varustettu yksi DNA- tai RNA-nauha, joka on komplementäärinen tiettyä nimenomaista geeniä tai tämän osaa vastaan ja sen vuoksi hybridisoituu tähän, kun se tuodaan yksinauhaisen komplementäärisen nukleiinihapponauhan yhteyteen. Koet-25 timia käytetään Southern -blottauksena tunnetussa mene- ,· telmässä, jossa näytteestä saadut, epäiltyä mielenkiinnon .···. kohteena olevaa geeniä sisältävät DNA-fragment it erote- .···. taan agaroosigeelissä, denaturoidaan yksittäisten nauho- • · · jen muodostamiseksi ja siirretään sitten nitroselluloosa-30 suodattimille. Ne inkuboidaan tässä leimattujen, enna kolta valittujen koettimien kanssa, jotka hybridisoituvat komplementääriseen nauhaan ja tunnistavat näin leimansa perusteella halutun geenin läsnäolon. Nämä koettimet ·.· ovat myös käyttökelpoisia käytettynä tunnistamaan kiin- :·. 35 nostuksen kohteena olevaa geeniä sisältävä klooni genomi- ,···. kirjastosta, joka on valmistettu kloonaamalla kokonaises- ·’· ta genomista peräisin olevat fragmentit isäntäsolussa.
• · 9 102189 Tähän mennessä ei ole ollut Neiaseria gonnrrhnaaan yhteyteen kehitettyä helppokäyttöistä ja tarkkuudeltaan korkealaatuista koetinjärjestelmää. Tämä keksintö kuitenkin tarjoaa ensimmäisenä käyttöön nyt Neisseria gonorrhoeas -bakteerille 5 kehitetyt useat oligonukleotidikoettimet, joista tietyt hyb-ridisoituvat yleisesti IL. gonorrhoeaen proteiini I:hin, mutta eivät muihin bakteereihin, ja joista toiset ovat spesifisiä IL gonorrhoeaen serotyypeille, jotka ilmentävät yksinomaan PIA-antigeeniä. Siten tämä keksintö tarjoaa käyttöön 10 luotettavan diagnostisen menetelmän gonokokki-infektion havaitsemiseksi, sekä keinon sen tietyn nimenomaisen serotyyp-piluokan tunnistamiseksi, jolla henkilö on infektoitunut.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .
15 On kuvattu Neisaaria gonorrhoeaen proteiinien IA ja IB täydellinen nukleotidijärjestys sekä niiden ennustettu amino-: ' : happojärjestys. Kuvataan myös menetelmät ja koostumukset PIA- ja PIB-geenien kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi yksisoluisessa isäntäorganismissa sekä kimeeristen PIA-PIB-pro-: 20 teiinituotteiden kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi. Kuvataan myös menetelmät uuden isäntäorganismin viljelemiseksi geeni-tuotteiden tuottoa varten. Käytettyjen yhdistelmä-DNA-mene-telmien tuotteet soveltuvat käytettäväksi kokonaisina tai antigeenisiltä osiltaan immunogeeneiksi tippurin ehkäisyyn *·*·* 25 tarkoitettuihin rokotekoostumuksiin.
• · · • Φ · . .·. PIA- ja PIB-geenit eristettiin bakteerigenomista hyb- • · « .···. ridisoimalla DNA-fragmentit uusilla oligonukleotidi- • « *** koettimilla. Kun geenit oli paikallistettu spesifiseen • · *.*·: DNA-jaksoon, tämän nukleotidijärjestys määritettiin ja tätä • · · :...ϊ 30 vastaava aminohappojärjestys ennustettiin. Kukin geeni liitettiin sitten kloonausplasmidivektoriin, joka toimii geenin monistamisyksikkönä. Yhdistelmäplasmidia käytettiin sitten transformoimaan tämän kanssa yhteensopiva isäntäsolu, joka ilmentää geenituotetta. Tässä patentti-35 hakemusjulkaisussa kuvataan myös menetelmät, joiden avul la ilmentyneet tuotteet eristetään ja kukin näistä formuloidaan rokotekoostulituksiksi. Erityisesti esitetään ro- 102189 10 kotekoostumuksiksi PIA/PIB-hybridiproteiinin käsittäviä koostumuksia. PIA- ja PIB-geenien nukleotidijärjestyksen määritykseen perustuen tämä keksintö tarjoaa myös käyttöön oligonukleotidikoettimien jaksoja, jotka ovat käyt-5 tökelpoisia gonokokki-infektion havaitsemiseen ja diagnosointiin. Tässä suhteessa tämä keksinnön piirin kuuluviksi on tarkoitettu myös diagnostiset testipakkaukset, jotka käsittävät yhtä tai useampaa tässä kuvattua oligo-nukleotidikoetinta.
10
Kuva 1 Kannan RIO PI:n ryhmien 1-12 aminohappojärjestys, näitä koodaava lähetti-RNA-jakso, johon sisältyy vaihtoehtoiset emäkset ja syntetisoidut oligonukleotidit. Siellä, missä vaihtoehtoisia emäksiä esiintyi, valittiin 15 jaksot, jotka perustuivat muiden sekvenssoitujen gonokok-kigeenien koodisanojen käytöstä saatuihin tuloksiin.
Kuva 2 FA 19 genomin DNA:n Sau3A I- ja Taa I -fragmentit, joihin sisältyy osia PI-geenistä. Fragmentit kloo-20 nättiin vektoriplasmidiin pGEM-2, josta saatiin tässä esitettyjen tunnusten mukaiset rekombinanttiplasmidit. PI:a koodaavan alueen suhteellinen asema genomissa on esitetty tämän yläpuolella olevalla avoimella suorakai-teella (varjostettu suorakaide vastaa N-terminaalista 25 signaalijaksoa) ja oligonukleotidikoettimien suhteellinen asema on esitetty fragmenttien alapuolella.
« ( • · · • · • · • · ·
Kuva 3 FA19:n PI-geenin DNA-jakso. Ennustettu amino- • « « happojärjestys on esitetty DNA:n yläpuolella, (-35 ja -30 10) ja ribosomin sitoutumiskohta (RBS) on myös esitetty, samoin kuin Taa I- ja Sau3A I -kohdat ja pUNC7:n konstruktioon käytettyHae III -kohta. Kunkin rivin viimeisen • « ’···’ emäksen numero on esitetty oikealla.
• M
• « « « · · I'· 35 Kuva 4 N^. aonorrhoeaen runsaimpina esiintyvien ulkokal- von proteiinien PI, PII ja PUI ja JE*. colin poriinien • · OmpF ja OmpC hydropaattisuus; sp - signaalipeptidi; a.a. - aminohapporyhraät • · 102189 11
Kuva 5 pUNC7:n konstruktiokaavio. Käyttökelpoinen Hae III -katkaisukohta, joka sijoittui PI-geenin promoottorin -35 ja -10 -alueiden väliin teki mahdolliseksi poistaa -35 -alueen ja sitä edeltävän jakson, jonka jälkeen PI-5 geeni konstruoitiin uudelleen vektoriplasmidissa pGEM-2 olevan T7-faagin promoottorin ohjaamaksi. Paksu viiva edustaa pGEM-2 DNA:a ja ohut viiva FA19 DNA:a. PI-geenin PI'-osa (katkoviiva osoittaa geenin puuttuvan segmentin suuntaa); PT7 - faagin T7 promoottori; MCS - kloonausten 10 keskityskohta (multiple cloning site); restriktioentsyy-mien kohdat: S - Sau3A I, H - Hae III, B - BamH I, (H) -Hae III/Hinc II -liitoskohta (ei kohtaa) T - Taa I.
Kuva 6 pUNC7:ssä olevan PI-geenin ilmentyminen 15 BL21(DE3) :ssa. A. NaDodS04-polyakryyliamidigeelielekt- roforeesi kokonaisten solujen hajotusvalmisteista 15-%:sessa geelissä, joka on värjätty Coomassiesinellä. Markkeriproteiinien koot on esitetty vasemmalla. PI on merkitty ja keskellä oleva nuoli osoittaa proteiinia, 20 joka nähtävästi puuttuu kanavasta 4. B. Autoradiogrammi A:ssa esitetyn geelin Western -blottauksesta, jossa koettimena oli käytetty kuutta PIA:han suunnattua monoklonaa-lista vasta-ainetta. Kanavat ovat: 1. FA19; 2.
BL21 (DE3) pUNC7, jota oli kasvatettu 16 tuntia ilman 25 IPTG:a; 3. BL21(DE3)pUNC7, jota oli kasvatettu 3 tuntia : .i IPTG:n kanssa; 4. BL21(DE3)pUNC7, jota oli kasvatettu 16 tuntia IPTG:n kanssa; 5. BL21(DE3)pGEM-2, jota oli kas-
IM
vatettu 16 tuntia ilman IPTG:a; 6. BL21(DE3)pGEM-2, jota oli kasvatettu 16 tuntia IPTG:n kanssa.
30
CAT
Kuva 7 mTn3-CAT:n (V) liittäminen FA19:n PI-rakenne- ··» « i * · **; geenin viereen. Paksu viiva edustaa pHSS6:n DNA: a.
• · t , mTn3-CAT on pituudeltaan 1,66 ke. eikä sitä ole piirretty «« : oikeassa mittakaavassa. PI-geenin paikka FA19 CAT Dl:n 35 genomissa on osoitettu viivan yläpuolella olevalla pal-. kiila ja varjostettu suorakaide merkitsee signaalijaksoa.
» • t ' 102189 12 PI7: PI-geenin osa, joka esiintyy kloonatuissa konstruk tioissa. N - Not I; B - BamH I; S - Sau3A I.
Kuva 8 MS11 DNA-fragmentit, jotka on kloonattu PI-gee-5 nin sekvenssointia varten. PI-geenin paikka on osoitettu viivan yläpuolella olevalla palkilla ja varjostettu suorakaide merkitsee signaalijaksoa. 01igonukleotidijakso jen NC1 ja NC12 paikat on esitetty. Suurempi fragmentti kloonattiin pGEM-3 -vektoriplasmidiin ja pienempi frag-10 mentti Xgtll -plasmidiin osoitetuilla merkinnöillä varustettujen konstruktioiden muodostamiseksi. Restriktioent-syymikohdat: Hf - Hinf I; K - Κρη I; S - Sau3A I; He -Hinc II.
15 Kuva 9 MSll:n PIB-geenin DNA-jakso. Ennustettu aminohappojärjestys on esitetty DNA:n emäsjärjestyksen yläpuolella ja sen signaalipeptidi merkitty. Otaksutut pro-moottorijaksot (-35 ja -10) ja ribosomin sitoutumiskohta (RBS) kuten myös asianmukaiset restriktioentsyymikohdat 20 on merkitty. Kunkin rivin viimeisen emäksen numero on esitetty oikealla. RIO:n PIB:n jakson (Gotschlich et ai., (1984) PNAS USA 84, 8135 - 8139) suhteen esiintyvien erojen merkitsemiseksi on emäkset (muut kuin ne emäkset, joita restriktioentsyymikohdat käsittävät) allevii-25 vattu ja aminohapot ympyröity.
Kuva 10 FA19:n PIA:n ja MSll:n PIB:n aminohappojaksojen vertailu ja PI-hybridigeenien rakenne. PIA:n geenijakso on merkitty avoimella palkilla ja PIB:n jakso varjoste-30 tulla palkilla. PI-geenien ylä- ja alapuolella ovat aminohappojaksojen vertailut, pystyviiva vastaa yhtä eroa-vuutta ja varjostettu alue vierekkäisiä eroavuuksien alu-·.· että. Aminohapporyhmien numero on osoitettu yläpuolisel la mitta-asteikolla ja emäsparinumerot alapuolisella mit-35 ta-asteikolla. Hybridien analysointiin käytetyt oligo-nukleotidit on esitetty geenien välissä ja vastaava kohta toisessa geenissä on merkitty katkoviivalla. Hybridi-geenirakenteet (luokat 1-9) on esitetty alla ja ne oli-gonukleotidien väliset alueet, joissa crossing over ta- 102189 13 pahtui, on kuvattu kallistuksilla. Eri hybridiluokkien serologiset reaktiivisuusryhxnät on esitetty taulukossa 1.
Kuva 11 pUNCH25:ssa olevan PIB-geenin ilmentäminen 5 BL21(DE3):ssa havaittuna kokonaisten solujen hajotusval-misteiden SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla 15-%:sessa geelissä, joka on värjätty Coomassiesinellä. PI-proteiinivyöhyke on merkitty. Kanavat ovat: 1. MS11; 2. BL21(DE3) pUNCH25 kasvatettuna ilman IPTG:a; 3 - 5.
10 BL21(DE3) pUNCH25 kasvatettuna IPTG:n kanssa. IPTG (50 Mg/ml) lisättiin kasvavaan viljelmään seuraavissa soluti-heyksissä: 3. 5 x 108 solua/ml, 4. 109 solua/ml; 5. 2 x
A
10 solua/ml. PI:n ilmentyminen on suurin, kun viljelmä indusoidaan kasvusyklin aiemmassa vaiheessa.
15 Tämä keksintö liittyy sellaisten N*, cronorrhoeaen PIA-, PIB- ja kimeeristen PIA/PIB-proteiinien käyttöön, jotka ovat käyttökelpoisia gonorreainfektion ehkäisemiseen tarkoitetun rokotekoostumusten valmistamiseksi. Näitä pro-20 teiineja voidaan tuottaa yhdistelmä-DNA-tekniikalla tai kemiallisilla synteesimenetelmillä. Vaikka aiemmin on ollut mahdollista käyttää kemiallisia eristysmenetelmiä sopivasta N_j_ aonorrhoeae -kannasta, voi näiden tuloksena olla kontaminoituminen tietyillä muilla gonokokkiproteii-25 neilla, jotka aikaansaavat ehkäiseviä (suojausta vastaan vaikuttavia) vasta-aineita rokotuksen jälkeen. Koska PI-proteiinien tiedetään kiihdyttävän vasta-aineiden tuot- • · · toa, on mahdollista käyttää kokonaisia proteiineja tai näiden mitä tahansa immunogeenistä osaa immunogeeneinä, 30 jotka suojaavat tehokkaasti rokotuksen saaneita ao- norrhoeae -infektiota vastaan.
• · · « · • · • · « • 9 · *.· : Tässä kuvatuilla yhdistelmäplasmideilla kyetään isäntä- soluissa tuottamaan suuria määriä PI-proteiineja, jotka .··. 35 ovat pysyviä ja vastustuskykyisiä isäntäsolussa tapahtu vaa hajoamista kohtaan ja jotka tarjoavat siten käyttöön rokotekoostumuksiin sopivan runsaan materiaalilähteen. Tässä valmisteessa ei esiinny suojausta ehkäisevistä go- 102189 14 nokokkiproteiineista johtuvaa kontaminaatiota. Yksinomaan kuvaamistarkoituksissa tätä keksintöä tarkastellaan seuraavassa useina yksittäisinä vaiheina, jotka käsittävät: 1) PIA-geenin tai geenifragmentin tunnistamisen ja 5 eristämisen, 2) geenin tai geenifragmentin liittämisen sopivaan kloonauskantajaan, jota käytetään yhteensopivan isäntäsolun transformointiin; 3) geeniä monistavien ja ilmentävien transformoituneiden isäntäsolujen tunnistaminen ja kasvatus; ja 4) geenituotteen tunnistaminen ja 10 puhdistaminen. Tämän keksinnön mukaan PI-proteiineja voidaan tuottaa liittämällä kloonattu, kuvan 3 tai kuvan 9 mukainen jakso tai näiden hybridien jakso sopivaan kloonaus/ilmentämisvektoriin, transformoimalla sopivat isäntäsolut ja tunnistamalla ja puhdistamalla geenituote.
15 Vaihtoehtoisesti voidaan syntetisoida sinänsä hyvin tunnettuja kemiallisia synteesimenetelmiä käyttäen osia päätellystä aminohappojaksosta, joka on kuvan 3 tai kuvan 9 mukainen tai hybridien mukainen. Tässä patenttihakemus-julkaisussa on myös kuvattu PIA:n ja PIB:n jaksoihin pe-20 rustuvia oligonukleotideja, jotka oligonukleotidit ovat käyttökelpoisia Nj. gonorrhoeae -infektion tunnistamisessa ja diagnosoinnissa hybridisointimenetelmillä, kuten Southern -blotit, täpläblotit, urablotit jne.
25 PIA-proteiinia vastaava koodaava nukleotidijakso on esitetty kuvassa 3. Kuten jo todettiin, kaikki N_i. aonorr-hoeae -bakteerit eivät tuota PIA-proteiinia; mikä tahansa • « · tietty kanta tuottaa joko PIA:ta tai PIB:tä mutta ei molempia. PIA:n esiintyminen korreloi gonokokin serologi-30 sen ryhmän I, serotyypin 1-3 suhteen, ja siten mitä tahansa serotyyppeihin 1-3 assosioitunutta kantaa voi-daan käyttää PIA-DNA:n lähteenä. Niiden tunnettujen JL.
• # · : gonorrhoeae -kantojen joukossa, joille PIA on luonteen- • · :·. omaisena piirteenä, ovat FA19, FA130, W-Ue, B-2, G-7 35 5029, R-ll, E-5, D-4 ja V-15 (Knapp et ai., (1984) J.
Infect. Dis. 150, 44 - 48). Tätä keksintöä sovellettaessa voidaan kuvan 3 mukainen jakso saada useilla eri ta-·.*: voilla. Esimerkiksi kun sopiva PIA:ta sisältävä kanta on määritetty, on tarpeen eristää organismin DNA, muodostaa 102189 15 DNA-fragmentit ja tunnistaa ne fragmentit, jotka sisältävät PIA-geenin jakson. Vaihtoehtoisesti geeni tai geenin segmentit voidaan syntetisoida.
5 N_s_ aonorrhoeaen DNA voidaan pilkkoa osiinsa useilla eri tavoilla; edullisin menetelmä on sen käsittely restrik-tioentsyymeillä, joista jokainen pilkkoo DNA:n spesifisen jakson kohdalta. Muihin menetelmiin kuuluvat DNA:n käsittely DNaasilla magnesiumin läsnäollessa tai fysikaali-10 sella hajotusmenetelmällä, kuten ultraäänikäsittelyllä.
Kun käytetään restriktioentsyymejä, voidaan DNA:n käsittelemiseen käyttää yhtä entsyymiä tai entsyymien yhdistelmää. Ainoa vaatimus on se, että nukleiinihapon pilkkominen ei hävitä PIA:n antigeenistä kohtaa tai antigee-15 nisiä kohtia koodaavaa aluetta. Fragmenttien muodostamisen jälkeen yksittäiset lineaariset DNA-fragmentit erotetaan sitten kokonsa perusteella millä tahansa tunnetuista menetelmistä, kuten polyakryyliamidigeelielektroforeesil-la (PAGE), agaroosigeeleillä tai pylväskromatografiällä.
20 Eristetyistä fragmenteista saadaan plasmidien valmistukseen ja transformaatioon käytettävä geneettinen materiaa li.
Kiinnostuksen kohteena olevan geenijakson sisältävien 25 DNA-fragmenttien tunnistaminen voidaan suorittaa monella tavalla. Voidaan esimerkiksi käyttää immunologisia rea-gensseja, kuten monoklonaalisia vasta-aineita. PIA:a »ti vastaan on muodostettu joukko monoklonaalisia vasta-aineita (Tam et ai., (1982) Infect. Immuno. 36, 1042 - 30 1053) ja näitä voidaan käyttää kunkin eri DNA-fragmentil- la transformoidun isäntäsolun tuottamien tuotteiden tes- • · · :...: taukseen; tuote, joka reagoi monoklonaalisen PIA-vasta— •' · ·.· * aineen kanssa tunnistaa solun, joka on transformoitu PI- geenin sisältävällä fragmentilla. Toisena vaihtoehtona 35 on DNA-fragmenttien sekvenssointi, jonka avulla voidaan ennustaa kutakin fragmenttia vastaava aminohappojärj βει tys, jota sitten voidaan verrata mihin tahansa tunnettui- I hin osittaisiin aminohappojaksoihin vastaavan DNA-jakson sisältävän fragmentin tunnistamiseksi. Toinen suosittu 102189 16 menetelmä on Southern -blottaus (Southern, (1975) J. Mol. Biol. 78, 503). Tässä menetelmässä denaturoidaan rest-riktiofragmentit omilla paikoillaan geelissä ja siirretään imeyttämällä kiinteälle alustalle, tyypillisesti 5 nitroselluloosasuodattimelle. Suodatinta käsitellään radioisotoopilla leimatuilla oligonukleotideilla, jotka sisältävät proteiinia vastaavan tunnetun tai otaksutun osittaisen DNA-jakson. Imeytetty DNA, joka on komplemen-täärinen valitun nukleotidin suhteen, hybridisoituu tämän 10 kanssa tunnistaen näin PI-geenin sisältävän DNA-fragmen- tin koon.
Yksityiskohtaisissa esimerkeissä PIA-geeni tunnistettiin ja eristettiin hybridisoimalla se kahta uutta oligonukle-15 otidia käyttäen. Perustuen tunnettuun PIB:n N-terminaa- lisen pään aminohappojen pienen osan aminohappojärjestykseen (Blake et ai., (1982) Infect. Immun. 36, 277 - 285; Blake, (1985) teoksessa The Pathogenic Neisseria, G. Schoolnik (toim.), ASM, sivut 251 - 258) ja useissa muis-20 sa DNA-jaksoiltaan tunnetuissa gonokokkiproteiineissa esiintyvästä koodisanojen käytöstä johdettuihin käyttö-·, sääntöihin, yritettiin päätellä käyttökelpoiset oligo- nukleotidit. Nimenomaisesti konstruoitiin kaksi jaksoa, j : : joille annettiin merkinnät NC1 ja NC2, seuraavasti: 25 * 1 . NC1: 5' AC GCC GGC TTT GAT GGC 3' « ·· • * · • « » NC2: 5' GAT GTT ACC CTG TAT GG 3'
CC C
30 A
G
• · · « · * ♦ i t· • * ·.·* * Southern -blottaushybridisoinnissa käytettynä näitä oli- • · gomeerejä käytettiin gonokokkien genomista saatujen DNA-35 restriktiofragmenttien seulontaan; molemmilla koettimilla onnistuttiin tunnistamaan PIA-geenin sisältävät DNA-frag-mentit. Tunnistetun geenin varmennus PIA-geeniksi suori-·. : tettiin geenituotteen ja natiivin proteiinin molekyyli- painoja keskenään vertaamalla ja sen immunologisen reak- 102189 17 tiivisuuden perusteella PIA:lie spesifisten monoklonaa-listen vasta-aineiden kanssa. Tämän käyttötavan lisäksi määritettiin myös se, että kummatkin näistä oligonukle-otideista kykenevät hybridisoitumaan sekä PIA- että PIB-5 gonokokkikantoihin. Siten näitä tavallisia yhdisteitä voidaan käyttää myös diagnostisina koettimina Southern -blottaushybridisoinnissa JL*. qonorrhoeae -infektion havaitsemiseen ja tunnistamiseen tautiin sairastuneissa.
10 PI-geenin sisältävien fragmenttien tunnistusta seuraa asiaankuuluvan osan sekvenssointi Sangerin menetelmällä (PNAS USA 74, 5463 - 5467, 1977). Sangerin menetelmässä käytetään DNA-templaatilta tapahtuvaa DNA-vastinnauhan entsymaattista synteesiä. Vastinnauhan synteesi lopete-15 taan liittämällä tähän dideoksinukleotidi (ddNTP). Suo ritetaan neljä peräkkäistä reaktiota, joista kussakin on ddATP, ddCTP, ddGTP ja ddTTP, jolloin syntyy neljä DNA-fragmenttien joukkoa ja kukin tietyssä joukossa oleva fragmentti päättyy spesifiseen dideoksinukleotidiin.
20 DNA-fragmentit erotetaan sitten polyakryyliamidigeelissä; jakso määritetään kunkin fragmentin viimeisen nukleotidin identiteetin perusteella lyhyimmästä pisimpään lukien.
Templaatteina käytettäviä yksinauhaisia DNA-molekyylejä 25 voidaan saada kaksinauhaisten DNA-molekyylien kemialli silla käsittelyillä eksonukleaaseilla. On kuitenkin pal-jon tehokkaampaa käyttää M13mp -kloonausvektoreita, jotka • · · ;‘J’; on kloonausvektoriksi kehittänyt Messing (Messing et ai..
(1981) Nucleic Acids Res. 9, 309). M13 on koirasspesifi- 30 nen nauhamainen colin bakteriofaagi, joka sisältää yksinauhaista (+) DNA:a. Tätä (+)-nauhaa käytetään temp-... laattina (-) -vastinnauhan synteesiin. Kaksinauhainen *··;’ DNA-muoto on lisääntymisvaiheen muoto (RF), joka monistuu • · « *·' ' noin 200 kopioksi solua kohti. Tämä kaksinauhainen muoto 35 voidaan eristää soluista ja käyttää kloonausvektorina.
Kun monistuminen pysähtyy, jatkuu vain toisen nauhan tuotto ja yksinauhainen nauha sulkeutuu faagipartikkelien . ** sisään. Tässä on M13:n etu, nimittäin se, että partikke leissa on yksinauhainen DNA-nauha, joka on homologinen 102189 18 toisen kloonatun nauhan suhteen ja sen vuoksi se voi olla käyttökelpoinen templaatti Sangerin menetelmässä. Yhdestä kloonista voidaan sekvenssoida 350 emäkseen asti ja pidempien fragmenttien sekvenssointi voidaan suorittaa 5 limittäisten fragmenttien avulla.
Tämän menetelmän käyttäen on saatu selvitetyksi PIA-gee-nin sekvenssi, joka esitetään kuvassa 3. Kuvassa 3 esitetään myös ennustettu aminohappojärjestys.
10 PIA-geenin sekvenssoinnilla, joka suoritettiin limittäisten fragmenttien erillisillä sekvenssoinneilla, saatiin aikaan se, että voitiin tunnistaa ja valmistaa kaksi muuta oligonukleotidikoetinta. Molemmat ovat 17 nukleotidia 15 käsittäviä oligonukleotideja, joiden jaksot ovat seuraa-vat: NC8: 5' GCGTTAAAACCGCTACC 3' ja 20 NC11: 5' CGGTGTCGGTCTGCGCC 3'
Kummatkin nämä koettimet ovat spesifisiä ainoastaan PIA-geenille, eivätkä ne hybridisoidu PIB-DNA-jaksoihin. Siten nämä molemmat koettimet ovat käyttökelpoisia PIA-25 organismi- ja PIB-organismi-infektioiden erottamisessa. Kuten edellä todettiin, kummatkin näistä proteiineista indikoivat tiettyä, joko systeemistä tai paikallistunut- • · · ta, gonorreainfektion muotoa, ja ne voivat sen vuoksi olla erittäin tärkeitä tautiin sairastuneen hoito-ohjel-30 man suunnittelussa.
... Eristettyä geeniä tai kemiallisesti syntetisoitua DNA- • · jaksoa voidaan käyttää muodostamaan geenistä uusia kopi- t · · '· ’ oita kasvattamalla transformoituja isäntäsoluorganismeja, 35 eristämällä yhdistelmä-DNA transformoiduista soluista ja ottamalla liitetty geeni talteen eristetystä yhdistelmä-DNA:sta.
19 102189 PIB-proteiinia vastaava nukleotidijärjestys on kuvattu kuvassa 9. Esitetty jakso eristettiin IL. qonorrhoeae:n MS11 -kannasta. PIB:n esiintyminen korreloi serologisten ryhmien 4-9 kanssa ja mitä tahansa näihin serologisiin 5 ryhmiin liittynyttä kantaa voidaan käyttää PIB-DNA:n lähteenä. Niihin tunnettuihin gonorreakantoihin, joiden luonteenomaisena piirteenä on PIB:n esiintyminen, ovat MS11, FA6140, F62 ja RIO. Menetelmät PIB-proteiinin proteiinivalmisteiden tekemiseksi, tunnistamiseksi ja sek-10 venssoimiseksi ovat olennaisesti identtisiä PIA-proteii-nin yhteydessä käytettyjen menetelmien suhteen. PIB-gee-nin spesifisessä tunnistuksessa oli avuksi koettimien NC1 ja NC12 (5'-GATACGGCGAAGGCATC-3') käyttö ja hybridi-PI-proteiinin PIB-osassa olevan Kon I -restriktiokohdan tun-15 nistaminen (Danielsson et ai., (1986) Infect. Immun. 52, 529 - 533). Geenin kloonaus suoritettiin PIA-geenin tavoin kloonaamalla erikseen limittäisiä fragmentteja kloo-nausvektorissa.
20 PIA:ta koodaava nukleotidijakso on esitetty kuvassa 3.
PIB:tä koodaava nukleotidijakso on esitetty kuvassa 9.
Sovellettaessa tämän keksinnön mukaista menetelmää voidaan kumpikin nukleotidijakso tai näitä toiminnallisesti vastaavat jaksot erikseen koostaa yhdistelmämolekyyleik-25 si, joka ohjaa vastaavan PIA- tai PIB-geenin tuotteen ilmentymistä. Sekä kuvasta 3 että kuvasta 9 peräisin olevia hybridijaksoja voidaan myös konstruoida hybridi-PIA/B proteiinien tuottamiseksi.
Koska nukleotidien koodaavissa jaksoissa esiintyy 30 näille ominaista vaihtoehtoisuutta, voidaan käyttää olennaisesti samoja, kuvissa 3 ja 9 esitettyjä aminohappojak- ... soja koodaavia muita DNA-jaksoja sovellettaessa tätä kek- • · *·*;* sintöä PIA:n ja PIB:n kloonaukseen ja ilmentämiseen.
« « « *·* t* Tällaisiin kuvien 3 tai 9 mukaisten nukleotidi jaksojen 35 muutoksiin kuuluvat eri nukleotidien deleetiot, lisäykset tai korvaukset, joista on seurauksena jakso, joka koodaa ..V samaa tai toiminnallisesti vastaavaa geenituotetta. Gee- \ nituote voi sisältää aminohapporyhmien deleetioita, li säyksiä tai korvauksia. Korvauksia voidaan tehdä asian- 102189 20 omaisten ryhmien polaarisuuden, varauksen, liukoisuuden, hydrofobisuuden, hydrofiilisyyden ja/tai amfipaattisen luonteen samanlaisuuden perusteella. Esimerkiksi negatiivisesti varautuneisiin aminohappoihin kuuluvat aspara-5 giinihappo ja glutamiinihappo; positiivisesti varautuneisiin aminohappoihin kuuluvat lysiini ja arginiini; aminohappoihin, joilla on varaukseton polaarinen sivuketju tai ei-polaarinen sivuketju ja joilla on sama hydrofiilisyys-arvo, kuuluvat seuraavat: leusiini, isoleusiini, väliini; 10 glysiini, alaniini; asparagiini, glutamiini; seriini, treoniini; fenyylialaniini ja tyrosiini.
PIA-geenin kuvassa 3 esitetty jakso tai PIB-geenin kuvassa 9 esitetty jakso sekä hybridi A/B jaksot tai näitä 15 toiminnallisesti vastaavat jaksot voidaan liittää sopi vaan kloonaus/ilmentämisvektoriin.
Jotta liitetyn geenin transkriptio ja translaatio tapahtuisi, täytyy geeni sijoittaa valitun isäntäsolun kanssa 20 yhteensopivan promoottorin ohjaamaksi. Promoottori on DNA-alue, johon RNA-polymeraasi liittyy ja aloittaa transkription. Valittu promoottori voi olla mikä tahansa isäntäsoluorganismista eristetty promoottori. Esimerkiksi Ej. colissa, yleisesti käytetyssä isäntäsysteemissä, 25 on useita promoottoreita, kuten siihen liittyvät lac- tai recA -promoottorit ja sen bakteriofaagien tai plasmidien promoottorit. Voidaan myös käyttää synteettisesti tai • · · /:·. yhdistelmätekniikkaa käyttäen tuotettuja promoottoreja, kuten X-fagin PL~ ja PR-promoottorit, ohjaamaan niiden 30 viereisten DNA-segmenttien geenituotteen tuottoa suurella tehokkuudella.
• · « • » *;··* Tarvitaan myös aloitussignaali, jotta saavutettaisiin • « · '·' ' geenin tehokas transkriptio ja translaatio. Esimerkiksi 35 E_j_ colin lähetti-RNA:ssa ribosomin sitoutumiskohta sisältää translaation aloituskoodisanan (AUG tai GUG) ja toisen jakson, joka on komplementäärinen 16S-ribosomaalisen RNA:n 3'-päässä olevien emästen suhteen. Useita näitä 102189 21 viimemainittuja jaksoja (Shine-Dalgarno -jaksot) on tunnistettu colissa ja muissa sopivissa isäntäsolutyy-peissä. Mitä tahansa isäntäsolun kanssa yhteensopivaa S-D-ATG-jaksoa voidaan käyttää. Näihin kuuluvat, mainit-5 tuihin kuitenkaan rajoittumatta, lambda -kolifaagin ero -geeni tai N -geeni, tai Ej. colin tryptofaani E-, D-, C-, B- tai A-geenit.
On olemassa useita menetelmiä DNA-fragmenttien in vitro 10 liittämiseksi kloonausvektoreihin. DNA-ligaasi on entsyymi, joka yhdistää kaksinauhaisessa DNAtssa olevien kahden vierekkäisen nukleotidin välisiä yksinauhaisia katkoksia; tätä entsyymiä voidaan siten käyttää liittämään kovalenttisesti yhteen tiettyjen restriktioentsyymi-15 en tuottamia, toisiinsa pitkittäin liittyneitä kohesiivi-sia päitä. Vaihtoehtoisesti voidaan DNA-ligaasia käyttää katalysoimaan fosfodiesterisidoksien muodostumista tasaiset päät omaavien fragmenttien välille. Lopuksi voidaan terminaalideoksiribonukleotidyylitransferääsi -entsyymiä 20 käyttää homopolymeeristen 3'-yksinauhaisten päätteiden muodostamiseksi; lisäämällä yhden populaation 3'-päähän oligo-(dA) -jaksoja ja toisen populaation 3'-päähän oli-go-(dT) -ryhmiä, voivat molemmat molekyylityyypit liittyä pitkittäin yhteen dimeerisiksi renkaiksi. Mitä tahansa j 25 näitä menetelmiä voidaan käyttää geenisegmentin promoot torin tai muiden säätely-yksikköjen liittämiseen vekto-rissa oleviin spesifisiin kohtiin. Sen mukaan PI-prote- ··· iineja koodaava geeni liitetään valittuun vektoriin spe- sifisessä suhteessa vektorin promoottoriin ja muihin sää- 30 tely-yksiköihin siten, että jakso on oikeassa lukuvai- heistuksessa vektorin ATG-jakson suhteen. Käytettävässä ... vektorissa on tyypillisesti markkeritoiminto, kuten am- • ♦ '···* pisilliiniresistenssi tai tetrasykliiniresistenssi, jotta • · * transformoituneet solut voidaan tunnistaa. Käytettävä • ‘ 35 menetelmä voi olla mikä tahansa tunnetuista ilmentämis- vektoreista, useimmin käytettyjä ovat plasmidivektorit,
.· kuten pBR 322, pA 105, pVA 5, pACYC 177, PKH 47, pACYC
184, pUB 110, pmB9, pBR325, Col El, pSCIOI, pBR313, pML21, RSF2124, pCRl tai RP4; bakteriofaagivektorit, ku- 102189 22 ten lambda gtll lambda gt-WES-lambdaB, Charon 28, Charon 4A, lambda gt-l-lambda BC, lambda-gt-1-lambda B, M13mp7, M13mp8, M13mp9; SV40 ja adenovirusvektorit ja hiivavekto-rit.
5
Kuten jo todettiin, tunnistettiin PIA:ta ja PIB:tä koo-daavat geenisegmentit alunperin hybridisoimalla kuvatuilla uusilla oligonukleotidijaksoilla. Valitun fragmentin identtisyys PIA:ta koodaavana rakennegeeninä varmistet-10 tiin sekä vertaamalla molekyylipainoa natiiviseen PIA:hän että tuotteen reagoinnilla kaikkien kuuden testatun mono-klonaalisen PIA-vasta-aineen kanssa pesäkkeiden radioim-munomäärityksellä. PIB:n tuotteen identtisyys varmistettiin sen reagoinnilla PIB-spesifisten monoklonaalisten 15 vasta-aineiden kanssa. Kloonattua PIA- tai PIB-geeniä ilmentävät E*, coli -isäntäsolut tuottavat runsaasti PI-proteiinia, joka reagoi asianmukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa. PIA-proteiinin puhdistusmenetelmät on kuvattu yksityiskohtaisesti artikkelissa Teerlink 20 et ai., 1985 (teoksessa The Pathogenic Neisseria, G. Schoolnik (toim.) ASM 259 - 264).) Tämän keksinnön yhteydessä on myös muodostettu joukko PIA/B geenien hybridijaksoja ja -proteiineja. Hybridi-25 geenit konstruoitiin käyttämällä sukkulamutageneesimene- telmää, jota oli muunneltu artikkelin Seifert et ai..
*···' (1986) (Genetic Engineering, Principles and Methods osa ' 8, 123 - 134, Settin et ai., toim. Plenum Press) mukai sesti valikoitavan markkerin liittämiseksi PI-geenin vie-30 reen PIA:ta tuottavassa kannassa. Tässä tapauksessa valikoitava geeni oli kloramfenikoliasetyylitransferaasi (CAT) -geeni, joka tuo mukanaan valikoitavan kloramfeni- « · · koliresistenssin (Cmr) . CAT-DNA:n sisältävää PIA-kantaa • · t käytettiin sitten DNA:n luovuttajana PIB:n sisältävän 35 vastaanottajakannan transformointiin. Suoritettiin myös resiprookkinen risteytys. Hybridiehdokkaat tunnistettiin valikoimalla Cmr:n suhteen ja testaamalla PI:n esiintyminen immunoblottauksella. Tutkittiin kaikki transforman- 102189 23 tit, joissa 1) esiintyi luovuttajan DNA:a tai (2) vastaanottajan DNA oli säilynyt tai (3) joissa DNA oli pa-rentaalimuodoista selvästi eroava. Todellisten PIA/B hybridikantojen muodostumista tapahtui molemmissa ristey-5 tystyypeissä kohtuullisen korkealla frekvenssillä ja eri serologiset reaktiivisuusryhmät oli tunnistettavissa. Näiden hybridigeenien ja -proteiinien tuleminen saataville on mahdollistanut tunnettuja monoklonaalisia vasta-aineita vastaavien epitooppien paikantamisen ja antaa 10 mahdollisuuden tunnistaa ja konstruoida lopulta synteettisesti sellaisia epitooppeja sisältäviä PIA/B-hybridi-proteiineja, jotka saavat aikaan suojaavien vasta-aineiden muodostumisen ja joilla siksi on suurinta mielenkiintoa käyttökelpoisen rokotteen kehittämisessä. Yksityis-15 kohtainen kuvaus näiden hybridien konstruktiosta ja tunnistamisesta on esitetty myöhempänä.
Vaihtoehtoisessa sovellutusmuodossa voidaan kuvissa 3 ja 9 esitettyjen geenijaksojen koodaamat proteiinit sekä 20 näiden molempien osia sisältävät kimeeriset proteiinit syntetisoida vaivattomasti kemiallisesti sinänsä hyvin tunnetuilla menetelmillä (J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 361, 1986). Kun proteiinijaksosta on löydetty suojaa antava epitooppi, peptidisynteesi molekyylin erillisistä 25 aktiivisista alueista tarjoaa yksinkertaisen ja suhteellisen halvan menetelmän rokotevalmisteen perusmateriaalin ·...· tuottamiseksi sovellettaessa tätä keksintöä lopullisesti v · käytäntöön. Peptidisynteesin käyttö tarjoaa myös sopivan keinon PIA/B hybridiproteiinin tai edullisesti sekä PIA-30 että PIB-proteiinien suojaavat epitoopit käsittävän synteettisen peptidin konstruoimiseksi. Tämä keksintö siis käsittää sekä yhdistelmätekniikalla että synteettisesti • · · tuotetut proteiinit, jotka ovat kuvattujen jaksojen mu- • · · [ · kaiset. Tämä keksintö käsittää myös kokonaisen proteii- 35 nin fragmentit, erityisesti fragmentit, joissa alkuperäisen, lähtömuotona olevan proteiinin antigeenisyys on säi- lynyt ja erityisimmin sellaisia epitooppeja sisältävät fragmentit, jotka saavat aikaan suojaavien vasta-aineiden tuoton. On myös selvää, että on mahdollista tehdä kor- 102189 24 vauksia koko proteiiniin ja peptidifragmenttien jaksoihin korvaamalla yksi tai useampi jakson aminohapoista tätä aminohappoa kemiallisesti vastaavalla aminohapolla; esimerkiksi negatiivisen varauksen omaavat ryhmät, kuten 5 asparagiinihappo ja glutamiinihappo voidaan vaihtaa keskenään, kuten myös positiivisen varauksen omaavat ryhmät, kuten lysiini tai arginiini. Hydrofobisiin ryhmiin kuuluvat tryptofaani, fenyylialaniini, leusiini, isoleusii-ni, väliini ja alaniini. Tunnetusta jaksosta on myös 10 mahdollista tehdä tiettyjä deleetioita ja tai siihen voidaan tehdä tiettyjä lisäyksiä siten, että haluttu antigeeninen aktiivisuus vielä säilyy. Tässä esitetyn näitä kahta proteiinia koskevan informaation perusteella voidaan alan ammattitaidolla tehdä molekyyliin asianmukai-15 siä muutoksia ja määrittää aktiivisuuden säilyminen. Tämä keksintö tarkoittaa siksi myös patenttivaatimuksien suojapiiriin kuuluvien proteiinien sellaisia homologeja, analogeja ja fragmentteja, jotka voivat olla joko kloonattuja tai synteettisesti tuotettuja ja jotka oleelli-20 sesti säilyttävät lähtömuotoa edustavan molekyylin anti-geenisyyden.
PIA: n puhdistetussa muodossa oleva geenituote tai synteettinen peptidi on käyttökelpoinen gonorreabakteeri-25 infektion ehkäisyyn tarkoitetun rokotekoostumuksen val- mistamiseen. Tässä koostumuksessa voidaan immunogeenise- '···' nä aineena käyttää joko kokonaista PIA-proteiinia tai • · · V * mitä tahansa tämän aktiivista osaa. Jos geenituotetta on ilmennetty osana fuusioproteiinia, proteiinia voidaan 30 käyttää kokonaisena tai isäntäsolun proteiini voidaan pilkkoa, jotta saadaan fuusioitumaton PIA-proteiini.
• · · 4 4 • · • · · .*j·. Yhdistelmä-DNA-tekniikoilla valmistettu PIA-proteiini _· · voidaan eristää isäntäsoluista tavallisilla proteiinien : 35 eristysmenetelmillä. Puhdistettu proteiini yhdistetään sitten mihin tahansa yleisesti käytetyistä, farmaseuttisesti hyväksyttävistä kantaja-aineista, kuten veteen, fysiologiseen keittosuolaliuokseen, etanoliin, polyolei-hin, kuten glyseroliin tai propyleeniglykoliin tai kas- 102189 25 viöljyihin sekä mihin tahansa sinänsä tunnettuun rokoteapu-aineeseen. PIA-tuote voidaan myös sulkea liposomeihin roko-tevalmisteessa käytettäväksi. Tässä käytetyn ilmaisun "farmaseuttisesti hyväksyttävät kantaja-aineet" käsitetään kat-5 tavan mitkä tahansa liuottimet, dispersioaineet, pinnoitus-aineet, bakteerien- ja sientenvastäiset aineet, isotoniset ja absorptiota viivästävät aineet ja muut näiden kaltaiset aineet. Näiden aineiden käyttö farmaseuttisesti aktiivisina aineina on sinänsä tunnettua. Sitä tapausta lukuunottamat -10 ta, että tavanomaisesti käytetty väliaine on yhteensopimaton aktiivisen ainesosan kanssa, on aikomuksena käyttää tätä väliainetta terapeuttisessa koostumuksessa. Muita täydentäviä aktiivisia aineita voidaan myös liittää mukaan.
15 Edullista olisi saada aikaan rokote, jossa aktiivinen im-munogeeni on PIA/B-hybridiproteiini. Kirjallisuudessa on raportoitu kokeellisesti valmistettuja gonokokkeja, jotka ilmentävät sekä PIA- että PIB-epitooppeja (Danielsson aL ai., (1986) Infect. Immun. 52, 529 - 533), mutta kimeerisen 20 proteiinin rakennetta ei tunnistettu eikä tässä esitetty : ehdotusta proteiinin mahdollisesta käytöstä rokotteessa.
; j Tällaisesta rokotteesta koituisi se hyöty, että että sillä voitaisiin immunisoida henkilö molemman tyyppistä gonorrea-: infektiota vastaan, ts. systeemisiä infektioita vastaan, 25 jotka liittyvät IA-proteiinia sisältäviin kantoihin ja pai- kallisia infektioita vastaan, jotka liittyvät IA- tai IB- • ♦ · proteiinia sisältäviin kantoihin. Tämän keksinnön yhteydes- • · · sä kuvattujen spesifisten koettimien saatavuuden pe- ·.·.· rusteella voidaan tällaisen sopivan hybridiproteiinin tai- • · · ' : 30 teenotto suorittaa vaivattomasti alan ammattimiesten tunte- • · · : millä menetelmillä.
• · · » 1 · t • · • ·
Periaatteessa kimeerinen geeni voidaan konstruoida eristämällä ensin yksittäisiä proteiineja vastaavat geenit.
35 Menetelmä PIA-geenin eristämiseksi tämän keksinnön mukaisia PIA-spesifisiä oligonukleotidikoettimia käyttäen on jo kuvattu edellä. Samoja menetelmiä seuraten voidaan 102189 26 PIB-geeni eristää ja tunnistaa. On tunnistettu joukko kantoja, jotka tuottavat vain PIB-proteiinia, esim. MS11, RIO, FA6140, F62 ja monet muut. Kuvattuja DNA-jaksoja, joissa ei ole spesifisyyttä PIA:ta kohtaan, soveltuvat 5 PI-jakson sisältävien restriktiofragmenttien eristämiseen PIB-spesifisestä kannasta, PIB-kantojen geenikirjastosta. Vahvistus sille, että oikea tuote ilmentyy, voidaan saada transformaatiolla ja ilmentämällä ehdokkaana olevaa PIB-fragmenttia isäntämikro-organismissa ja tunnistamalla 10 ilmentynyt tuote antamalla sen reagoida minkä tahansa tunnetun PIB-spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa (R.C. Nowinski, Knapp, J.S., Tam, M.R. ja Sandström, (1984) J. Infect. Dis. 150, 44 - 48) . Sitten, kun kukin yksittäinen geenifragmentti on eristetty, ne voi-15 daan vaivattomasti kloonata ja koostaa millä tahansa sinänsä tunnetulla menetelmällä. PIA-jakson osat liitetään sitten ligaasilla PIB-jakson osiin siten, että ki-meerinen proteiini koodautuu muodossa, joka voi osallistua transkriptioon ja translaatioon, esim. muodossa, jos-20 sa ei esiinny translaation päätejaksojen aikaansaamia keskeytyksiä. Koko kimeerinen jakso voidaan sitten liittää ligaasilla vektoriin, joka sisältää valikoitavan markkerin ja ohjausyksiköt. Vektoria voidaan sitten käyttää transformoimaan geenituotteen ilmentämiseen ky-25 kenevän isäntämikro-organismin, joka kykenee ilmentämään geenituotetta sellaisia määriä, että nämä voidaan saada ·...· talteen. Toisena vaihtoehtona voi tietysti olla se, että
Ml v : lähtökohtana käytetään yksinkertaisesti valmiiksi PIA- geenin sisältävää vektoria, kuten plasmidia, joka sisäl- 30 tyy Ei. coli -kantaan NRRL B-18263; PIB-jakso eristetään edellä kuvatulla tavalla ja koko jakso tai sen osa liite- .···. tään ligaasilla PIA-geenin viereen tai tämän sisään halu- .·** tun kimeerisen geenin transkription ja translaation sai- • · * livalla tavalla. PIA/B-hybridien konstruktio voidaan : '·· 35 kuitenkin suorittaa edullisesti aiemmin kuvatulla taval la, näistä eristetään hybridigeeni ja tätä käytetään vek-·.·. torin valmistamiseen transformaatiota varten. Näin kons- # ; truoitua vektoria käytetään uudelleen transformoimaan isäntämikro-organismi. Geenituotteen ilmentämisestä saa- 102189 27 daan käyttöön sellaisen kimeerisen proteiinin lähde, joka voidaan yhdistää kätevästi rokoteformulaatioon samalla tavalla kuin PIA- tai PIB-proteiinit yksinään.
5 Vaihtoehtoisessa sovellutusmuodossa valmistetaan kuiten kin rokoteformulaatiossa käyttökelpoinen hybridiproteiini synteettisesti eristämällä ja tunnistamalla ennakolta tunnetussa proteiinijaksossa olevat suojaa antavat epi-toopit. Kuten edellä todettiin, on kimeeristen yhdistel-10 mäproteiinien vaivaton saatavuus tehnyt mahdolliseksi tunnistaa mielenkiintoiset epitoopit kätevämmin ja siten tämä sallii sen, että synteettisillä menetelmillä voidaan lopulta konstruoida "virtaviivainen" hybridi, joka sisältää vain immuniteetin muodostumiseen tarvittavat hybridi-15 proteiinin osat.
Esimerkki 1 PIA-geenin tunnistus, eristys ja ilmentäminen 20 Tämän keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti määritettiin PIA-geenijakso hankkimalla saataville gonokokki-DNA-fragmentit, kloonaamalla yksittäiset fragmentit erikseen 25 ja rekonstruoimalla sitten geeni vieraan indusoituvan promoottorin kanssa. Kaksi otaksuttavasti osia PIA-gee-nijaksosta sisältävää fragmenttia tunnistettiin hybridi- • · · i.: : soimalla NCI-oligonukleotidillä aiemmin kuvatulla taval la. Asianmukaiset restriktiofragmentit liitettiin sitten 30 kukin ligaasilla pGEM-2 -plasmidivektoriin ja transfor moitiin sopivaan isäntään. Eristettiin transformantit, .···. jotka hybridisoituivat oligo-NCI:een. Näistä klooneista • · tehtiin plasmidi-DNA-valmisteet, pilkottiin ne asianmu- • · · . kaisilla restriktioentsymeillä ja tutkittiin uudelleen 35 NCI-koettimilla. Yksittäiset NCI:een hybridisoituvat fragmentit liitettiin sitten erikseen pGEM-2 -plasmidei-hin, josta oli tuloksensa kaksi erillistä plasmidia pUNC3 ja pUNCll.
102189 28
Kooltaan 750 ep.:a olevan DNA-jakson identiteetti määritettiin tästä saatujen pienempien restriktiofragmenttien jatkokloonauksella M13 mpl8RF:n DNA:hän ja sekvenssoimal-la sitten Sangerin menetelmän (PNAS USA 74, 5463 - 5467, 5 1977) mukaan. Tästä jaksosta syntetisoitiin uusi oligo- nukleotidi. Tätä uutta oligonukleotidiä, jolle annettiin merkintä NC8, käytettiin tunnistamaan jo aiemmin kloonatun 900 ep.:n vieressä oleva 850 ep.:n fragmentti, ja tämä fragmentti kloonattiin pGEM-2:een, josta saatiin 10 pUNCl5 ja fragmentti sekvenssoitiin Sangerin menetelmällä (ks. yllä). Seuraavassa kuvataan yksityiskohdittain plasmidipreparaatin valmistukseen, sekvenssointiin, hyb-ridisointiin ja transformaatioon liittyvät menetelmät.
15 Seuraavissa alakohdissa kuvataan yleinen DNA:n eristykseen, entsyymireaktioihin, fragmenttien eristykseen ja ligaasireaktioihin käytetty menetelmä.
Näissä kokeissa käytetyt restriktioentsyymit hankittiin 20 yhtiöstä New England Biolabs Inc., Beverly, Massachusetts, ellei toisin ole mainittu. Ν^_ aonorrhoeae -viljelmät kasvatettiin GC -peruskasvatusliuoksessa (DIFCO), joka sisälsi Kellogin suplementit I ja II (J. Bacteriol.
85, 1274 - 1279, 1983), 5-%:sessa C02 -atmosfäärissä.
25 Pilkkomisreaktioihin tarvittava DNA eristettiin julkaisussa Maness et ai., (1973) J. Infect. Dis. 128, 321 - 330 kuvatusta gonokokkikannasta FA19 julkaisussa Stern et ai., (1984) Cell 37, 447 - 456 kuvatun menetelmän mukaan.
Tämän kannan tiedetään tuottavan IA-proteiinia.
30
Kaikki pilkkomisreaktiot suoritettiin seuraavissa olosuh- .···. teissä. Noin 20 μ1:η suuruinen DNA-näyte inkuboitiin 37 • « °C:ssa 1-3 tunnin ajan restriktioentsyymin 2-10 -ker- • · · täisen ylimäärän läsnäollessa. Poikkeuksina näihin olo-35 suhteisiin ovat Tag I:lle käytetty 65 °C:n ja Sma I:lle käytetty 30 °C:n lämpötila.
102189 29
Pilkkomisreaktioihin entsyymeillä Acc I, Msp I ja Rsa I käytettyjen puskuriliuosten koostumukset olivat: 50 mM Tris-HCl ja 10 mM MgCl2, pH säädetty 8,0:aan 5
Pilkkomisreaktioihin entsyymeillä Ava I, Hae III, Hind III ja Tag I käytettyjen puskuriliuosten koostumukset olivat: 10 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, ja 50 mM NaCl, pH säädetty 8,0:aan
Pilkkomisreaktioihin entsyymeillä BamH I, EcoR I ja Sal I käytettyjen puskuriliuosten koostumukset olivat: 15 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, ja 100 mM NaCl, pH säädetty 8,0:aan
Pilkkomisreaktioihin entsyymeillä Hinc II, Sau3A I ja Sma 20 I käytettyjen puskuriliuosten koostumukset olivat: 20 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, ja 50 mM KCl, pH säädetty , 7,4:ään.
25 Reaktiot pysäytettiin lisäämällä 0,5 M EDTA:a (pH 7,5) lopulliseen pitoisuuteen, joka oli 10 mM.
• · *·· *.· * Aluksi tehdyt yritykset PIA:n kloonaamiseksi pBR322:ssa tai muissa JjL. coli HB101 -kannan vektoriplasmideissa (Ma-30 niatis et ai., (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) antoivat toistu- :'**· vasti negatiivisen tuloksen. Siksi päätettiin yrittää • · · ;‘.\ tunnistaa PIA-geenin tai tämän osan sisältäviä fragment teja oligonukleotidikoettimilla hybridisoimalla. Suunni-‘ 35 teltiin kaksi koetinta, jotka perustuivat tunnettuun N.
gonorrhoeae -kannan RIO (Blake et ai., (1982) Infect. Immun. 36, 277 - 285) PIB:n N-terminaalisen pään aminohappojärjestykseen. Tätä informaatiota käytettiin yhdes- 30 λ n ""· 1 ηη lUz ίο>- sä kahden muun gonokokkiproteiinin, piliinin (Meyer et ai., (1984) PNAS USA 81, 6110 - 6114) ja PII:n geenijak-sosta saadun pienen koodisanojen käyttämistä koskevan tulosmateriaalin kanssa kahden oligonukleotidin konstru-5 oimiseksi, joille annettiin merkinnät NC1 ja NC2 ja jotka on esitetty kuvassa 2. NC1 on kertaalleen esiintyvä jakso ja NC2 on sekapopulaatio nukleotideistä, joiden tarkoituksena on oikean jakson tunnistustodennäköisyyden lisääminen. Pesäkehybridisointimäärityksissä nämä molem-10 mat oligonukleotidit hybridisoituivat FA19:aan, mutta eivät hybridisoituneet joko pBR322:n tai pGEM-2:n sisältävään HB 101 -kantaan.
Restriktioendonukleaasilla pilkottu DNA analysoitiin aga-15 roosigeeleissä ja siirrettiin geeleistä nitroselluloosa-suodattimelle Southernin blottausmenetelmällä (Southern, (1978) J. Mol. Biol. 98, 503 - 517). Oligonukleotidi- koettimet NC1 ja NC2 leimattiin γ-32Ρ-ΑΤΡ:11a (ICN Radio-chemicals, Irvine, Calif.) polynukleotidikinaasia käyttä-20 en teoksessa Maniatis et ai. esitetyn menetelmän mukaan. Päiden leimaus suoritettiin puskurissa, jonka koostumus oli Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT (ditiotrei-toli), 0,1 mM spermidiini ja 0,1 mM EDTA. Leimattujen oligonukleotidien hybridisointi DNA:hän nitroselluloosa-25 suodattimilla suoritettiin yön yli liuoksessa, jossa oli 4 x SSPE-liuosta (koostumukseltaan 0,18 M NaCl, 10 mM .···. NaH2P04 [pH 7,4], 1 mM EDTA), 2 x Denhardt'n liuosta (1 x koostumus = 0,02 % naudan seerumin albumiinia, 0,02 % • « ·
Ficoll, 0,02 % polyvinyylipyrrolidoni), 20 mM natriumpy-30 rofosfaattia, 0,2 % natriumdodekyylisulfaattia ja 50 /ag/ml lohen maidin DNA:a käyttäen 106 iskua/minuutti leimattua oligonukleotidikoetinta yhtä hybridisointiliuoksen • · *···’ millilitraa kohti. Suodattimet pestiin liuoksessa, jonka («· koostumus oli 1 x SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M natriumsit-35 raatti), 5 mM natriumpyrofosfaatti ja 0,1 % natriumdode- kyylisulfaatti. Hybridisoinnin ja pesun lämpötilat NCI:lie ja NC2:lie olivat 46 °C ja 40 °C tässä järjestyksessä. Suodattimet pestiin 5 x SSC:ssa, kuivattiin ja 102189 31 valotettiin Kodakin röntgenfilmille. Kaikissa tapauksissa hybridisoituminen tapahtui yhteen ainoaan fragmenttiin ja asianomaiset fragmentit olivat: EcoR I - 10 ke.; Sal I - 5,5 ke.; Sau3A I - 900 ep. ja Taa I - 750 ep. Identti-5 set tulokset saatiin sekä NCI:llä että NC2:lla.
Kun NCl-oligonukleotidiä käytettiin koettimena pesäkehyb-ridisoinnissa tutkittaessa pBR322 -kantaan kloonattua,
EcoR I:llä tai Sai I:lla pilkottua DNA:ta sisältäviä HB 10 101 -kannan pesäkekirjastoja, ei havaittu yhtään positii vista pesäkettä. Tämä tulos tuki sitä aiempaa havaintoa, joka viittasi siihen, että PI saattaa olla letaali E. colia kohtaan. Pienempien FA19 -DNA-fragmenttien, ts. oligonukleotideihin hybridisoituvien Sau3A I- ja Tag I -15 pilkkoutumistuotteiden, ei otaksuttu sisältävän kokonaista PI-geeniä ja ne valittiin siksi ehdokkaiksi kloonaukseen.
Molempien fragmenttien suhteen noudatettiin olennaisesti 20 samoja menetelmiä. Sau3A I -fragmentin tapauksessa pilkottiin FA19:n kokonais-DNA täydellisesti Sau3A I:llä. Plasmidin pGEM-2 (hankittu yhtiöstä Promega Biotec, Madison, Wis.) DNA pilkottiin BamH I:llä ja liitettiin ligaasilla Sau3A I -fragmentteihin. DNA-fragmenttien 25 ligaasikäsittely suoritettiin T4-DNA-ligaasilla (New England Biolabs, Beverley, Mass.) 4 °C:ssa 16 tunnin ajan 1./ puskurissa, jonka koostumus oli: 50 mM Tris-HCl (pH 7,6),
10 mM MgCl», 5 paino-% polyetyleeniglykoli 8000, 1 mM
• « · * *** * ATP, 1 mM DDT. Yhdistelmäplasmidit transformoitiin E_s_ 30 coli HB 101 -kantaan julkaisussa Mandel ja Higa, (1974) J. Mol. Biol. 53, 154 esitetyn kalsiumkloridimenetelmän mukaan; lyhyesti esitettynä, bakteerisolut suspendoidaan • · ·
jääkylmään steriiliin liuokseen, jonka koostumus on 50 mM
• 9 · : : : CaCl2 ja 10 mM Tris-Cl, pH 8, ja sekoitetaan sitten plas- :·. 35 midi-DNA:han ligaatiopuskurissa.
V. Noin 2000 transformanttia saatiin talteen; bakteeripesäk- : '.· keet siirrettiin nitroselluloosasuodattimille, jotka vai- 102189 32 niistettiin hybridisointiin julkaisussa Grunstein ja Hog-ness, (1975) PNAS USA 82, 3961 - 3965 esitetyn menetelmän mukaan ja havaittiin hybridisoituminen oligo-NCl:een. Oligonukleotidin kanssa hybridisoitui varsinaisesti yksi 5 pesäke. Plasmidi-DNA monistettiin, otettiin talteen, pilkottiin Sau3A I:llä ja tutkittiin oligo-NCl -koetti-mella kuvatulla Southern -hybridisointimenetelmällä. Oligonukleotidiin hybridisoitui yksi 900 ep.:n suuruinen fragmentti, jonka koko oli sama kuin aiemmin Southern -10 hybridisoinnilla tunnistetun FA19:n genomin Sau3A I -fragmentti. Tämä fragmentti irrotettiin ja uutettiin sähkövirralla agaroosigeelistä ja liitettiin uudelleen BamH I:llä pilkottuun pGEM-2 -plasmidiin yhdistelmäplas-midin pUNC3 muodostamiseksi (kuva 2).
15
Olennaisesti samaa menetelmää sovellettiin FA19:n 750 ep.:n Taa I -fragmenttiin, joka hybridisoitui oligo-NCl:n kanssa. Taa I -fragmentti liitettiin kuitenkin ligaasil-la pGEM-2:n Acc I -katkaisukohtaan, josta oli tuloksena 20 yhdistelmäplasmidi pUNCll (kuva 2).
Ennen sekvenssointia pilkottiin 750 ep.:n Taa I-fragment- ti edelleen 300 ep.:a pienemmiksi restriktiofragmenteiksi
Rsa I- ja Msp I -entsyymeillä. Tämän jälkeen korjattiin : 25 fragmenttien päät ja ne liitettiin ligaasilla M13 mpl8 RF-DNA:hän julkaisussa Norrander et ai., (1983) Gene 26, ....p 101 - 106 esitetyn kuvauksen mukaisesti. Tämän kloonaus- !’! vektorin tuottamaa yksinauhaista DNA:a käytetään sitten • · sekvenssoitavana templaattina julkaisussa Sanger et ai., 30 (1977) PNAS USA 74, 5463 - 5467 (ks. yllä) kuvatun mene telmän mukaan.
• · ·
Dideoksinukleotidit voidaan valmistaa julkaisussa Sanger : et ai. esitetyn kuvauksen ja siihen sisältyvien viittei- 35 den mukaisesti (BRL, Gaithersburg, Md.). Neljä erillistä kuoppaa varataan kutakin DNA-näytettä varten, yksi kullekin dideoksinukleotidille ddA, ddT, ddC ja ddG. Kuhunkin kuoppaan lisätään 2 μΐ templaatti-DNA:a ja 2 μΐ aluke-. seosta, joka koostumus on: 11 μΐ (22 ng) M13:n 17 emäksen 102189 33 aluketta yhtiöstä BRL, 11 /il TM (100 mM Tris + 50 mM MgCl2/ pH 8,5) ja 66 μΐ H20 (10 kloonia kohti). Nämä sentrifugoidaan, peitetään muovikelmulla ja inkuboidaan 56 °C:ssa 50 - 60 minuutin ajan.
5
Inkuboinnin jälkeen kuhunkin kuoppaan lisätään asiaankuuluva NTP-seos: kukin seos sisältää 10 - 500 /zM:sta ddNTPrtä ja 6,25 μΜ:η pitoisuuden kutakin tavallista dNTP:tä. NTP-seoksen lisäyksen jälkeen lisättiin 2 μΐ 10 Klenow -seosta, Klenow -seos käsitti: 11 μΐ Klenow -entsyymiä (laimennettuna pitoisuuteen 1 U/ml); 11 μΐ 0,1 M ditiotreitolia 4,4 μΐ 35S-dATP:tä ja 61,6 μΐ H20:ta. Seos sentrifugoidaan, peitetään muovikelmulla ja inkuboidaan 30 °C:ssa 15 minuutin ajan. Kuhunkin kuoppaan lisätään 2 15 μΐ karkotusseosta (0,2 mM kaikkia neljää dNTP:tä), sentrifugoidaan, ja inkuboidaan uudelleen 30 °C:ssa 15 minuutin ajan. Tämän jälkeen lisätään 2 μΐ formamidiväriä kuhunkin kuoppaan ja niitä inkuboidaan sitten avonaisina 80 °C:ssa 15 minuutin ajan.
20 Tässä vaiheessa seokset ovat valmiita geeleihin vietäviksi tai ne voidaan kääriä kelmuun ja varastoida -80 °C:ssa. Tässä menetelmässä käytetttyjen geelien koostumus on seuraava: .·' : 25
Erotuksen pidennysgeeli (80%) 40 % akryyliamidia 16 ml • · *·’ * Ureaa 40 g 10 x TBE* 8 ml 30 H20 24 ml 10 % APS (ammoniunpersulfaattia) 1 ml TEMED (tetrametyylietyleenidiamiinia) 20 μΐ • · • * · • · · * Tris-boraatti -elektroforeesipuskuriliuos; 89 mM Tris, 35 + 89 mM boorihappo .· Geelit ajettiin 60 W:n jatkuvalla teholla 3-4 tunnin ajan ja kiinnitettiin sitten 10-%:sessa etikkahapossa ja 102189 34 10-%:sessa metanolissa 15 minuutin ajan; sitten ne kuivattiin paperilla ja niillä valotettiin Kodak -röntgen-filmi.
5 Tag I -fragmentin jakson määritykseen perustuen muodostettiin uusi oligonukleotidi, NC8. Tätä uutta oligonuk-leotidiä, jonka nukleotidijärjestys on 5' GCGTTAAAACCGC-TACC 3', käytettiin tunnistamaan aiemmin kloonatun 900 ep. :n fragmentin viereinen 850 ep.:n Sau3A I -fragmentti 10 ja tämä 850 ep.:n fragmentti kloonattiin pGEM-2:een, josta saatiin plasmidi pUNC15 (kuva 2) , ja sekvenssoitiin äsken kuvatulla tavalla. PI-geenin koko jakso on esitetty kuvassa 3. Ainoa tässä jaksossa oleva suuri ja avoin lukuvaiheistusjakso on emäksien 84 ja 1062 välissä vasta-15 ten 326 aminohapon kokoista proteiinia. Useiden PI-pro-teiinien julkaistujen N-terminaalisten aminohappojaksojen (Blake, ks. yllä) perusteella oli kypsän proteiinin ensimmäinen ryhmä emäksen 141 kohdalla oleva asparagiini-happo, josta kypsän proteiinin kooksi saadaan 307 amino-20 happoa ja signaalipeptidiksi 19 aminohappoa. Proteiinin ennustettu koko on 33786 daltonia, joka on lähellä FA19:ssä olevan PI:n näennäistä molekyylipainoa, joka on 34000. Signaalipeptidillä näyttää olevan näihin jaksoihin liittyviä yhteisiä ominaispiirteitä (Von Heijne, 25 (1985) J. Mol. Biol. 184, 99 - 105) joihin kuuluu hydro fobisten aminohappojen alue, alaniiniryhmien runsas ··* esiintyminen ja Ala-X-Ala -katkaisukohta. Esiintyi myös • · · : otaksutut -35 ja -10 promoottorijaksot, joiden nukleoti- dijärjestys ja keskinäinen etäisyys muistutti läheisesti 30 näiden jaksojen E^. colissa esiintyvää konsensus -jaksoa (Hartley et ai., (1987) Nucl. Acid Res. 15, 2343 - 2361), .***. ja signaali jakson ensimmäistä ryhmää välittömästi edeltä- • · « vä ribosomin Shine-Dalgarno -sitoutumiskohta. Ennustettu • · ·· N-terminaalinen aminohappojärjestys on yhteensopiva vas- 35 taavan otaksutulle PIA-proteiinille määritetyn aminohappojärjestyksen (Blake, (1985) teoksessa The Pathogenic Neisseria, G. Schoolnik (toim.), Amer. Soc. Microbiol., Wash.) kanssa ja oli hyvin samanlainen, kuin RIO -kannan PIB-proteiinin vastaava aminohappojärjestys. Ennustetun 102189 35 proteiinin hydropaattisuusprofiili oli tyypillisen ulko-kalvon poriiniproteiinin vastaava profiili ja se oli verrattaessa Ej. colin runsaimmin esiintyvien poriinien OmpF ja OmpC kaltainen, joille luonteenomaisena piirteenä on 5 pitkien hydrofiilisten alueiden esiintyminen, joissa ei ole oleellisesti hydrofobisia alueita. Muiden sekvens-soitujen gonokokkien ulkokalvoproteiinien hydropaattisuusprof iilien suhteen esiintyi vähän korrelaatiota.
10 Yrityksissä kokonaisen PI-geenin kloonin talteensaamisek-si liittämällä yhteen kaksi pUNC3:n ja pUNC15:n Sau3A I -fragmenteissa olevaa geenin osaa epäonnistuttiin toistuvasti, josta tultiin siihen johtopäätökseen, että gonokokkien PI on letaali E^_ colissa. Tämän vuoksi konstru-15 oitiin yhdistelmäplasmidi niin, että osa PI-geenin promoottoria poistettiin ja PI-geeni sijoitettiin pGEM-2:n T7-faagin promoottorin jälkeen. Koska E*, coli -soluissa ei tavallisesti ole T7-polymeraasia, joka vastaa T7-pro-moottorien jälkeisten geenien transkriptiosta, plasmidi 20 säilyy jatkuvasti.
Näin konstruoitu plasmidi on pUNC7, ja se valmistettiin kuvassa 5 esitetyn kaavion mukaan. Käyttökelpoinen Hae III -kohta PI-geenin promoottorin -35 ja -10 alueiden 25 välissä ja teki mahdolliseksi -35 -alueen ja tätä edeltävän alueen poiston. Jäljelle jäävä geenin osa liitettiin sitten pGEM-2:een T7-promoottorin ohjaamaksi. pUNC7:llä • · · *·* * transformoitu HB101 ei ilmentänyt pesäkeradioimmunomääri- tyksessä havaittavia PI-määriä. Plasmidi pUNC7 transfor- 30 moitiin sitten Ej_ coli -kantaan BL21 (DE3), lysogeeniin, jossa T7-faagin polymeraasi esiintyy, mutta tämä on lac :***; UV5 -promoottorin (Studier et ai·/ (1986) J. Mol. Biol.
··« 189, 113 - 130) ohjaama. Kun plasmidin pUNC7 sisältävää ..· 1 BL21 (DE3) -kantaa kasvatettiin kasvatusliuoksessa, jossa 35 ei ollut isopropyyli-j3-D-tiogalaktosidia (IPTG), tämä ei tuottanut havaittavaa PI:tä, mutta kun kasvatusliuoksesa oli läsnä T7-polymeraasituotannon indusoivaa IPTG:tä, ; . : havaittiin PI-geenin tuote monoklonaalisillä PIA-vasta- aineilla pesäkeblottausradioimmunomäärityksessä.
102189 36
Ilmennetyn proteiinin kuljetus EL. colin solukalvon läpi tapahtuu ilmeisesti tehokkaasti, koska tuote oli havaittavissa pesäkeradioimmunomäärityksessä soluja hajottamat-5 ta. Verrattaessa tätä proteiinia FA19:n PI-proteiiniin SDS-PAGE:ssa (kuva 6A) ja Western- blottauksessa (kuva 6B) havaitut näennäiset molekyylipainot olivat samansuuruiset ja tämä on ilmeisesti runsaimmin esiintyvä proteiini, jota tämä klooni tuottaa IPTGrn läsnäollessa suori-10 tetun yön yli kestäneen kasvatuksen jälkeen. Proteiinin tuotto oli letaali tälle nimenomaiselle E. coli -kannalle, eikä saatu talteen yhtään pysyvää solua. PI-geenin sisältävä plasmidi pUNC7 voi säilyä pysyvästi tässä kannassa, mikäli ilmentymistä ei indusoida kasvatuksella 15 IPTG:a sisältävässä kasvatusliuoksessa. Plasmidin pUNC7 sisältävän BL21 (DE3) -kannan biologisesti puhdas viljelmä talletettiin 13.11.1987 talletuslaitokseen Northern Regional Research Laboratory (NRRL) talletusnumerolle NRRL B-18263.
20
Esimerkki 2 PIB-geenin tunnistaminen, eristäminen, sek-venssointi ja ilmentäminen ja PIA/B-hybridien konstruktio ja ilmentäminen :::: 25
Sekä PIB-geenin että PIA/B-hybridien tunnistaminen ja '···' eristäminen olivat tulosta yrityksestä osoittaa se, että *.* * nmo -lokus on PI:n rakennegeeni ja että PIA ja PIB ovat alleeleja. Peräkkäisiin vaiheisiin liittyi yleensä vali-30 koitavan markkerin liittäminen PIA:ta sisältävään kan taan, jonka jälkeen transformoitiin PIBrtä tuottava kan-·*’*: ta. Nämä menetelmät esitetään yksityiskohdissaan seuraa- .V. vassa kohdassa.
• · « ♦ 35 Kooltaan 900 ep.:n suuruinen pUNC3:n Sau3A I-fragmentti, joka sisältää FA19:n (PIA:ta tuottavan kannan) PIA-geenin ensimmäiset 45 koodisanaa ja rakennegeeniä edeltävät jaksot, liitettiin ligaasilla BamH I -pilkottuun pHSS6:een plasmidin pNCS2 muodostamiseksi (kuva 7) . Tälle plasmi- 102189 37 dille suoritettiin sukkulamutageneesi. Sukkulamutagenee-si suoritettiin käyttäen Seifertin et ai. (ks yllä) menetelmän muunnosta. Kohde-DNA jatkokloonattiin pHSS6:een ja vietiin Ej_ coli -kantaan RDP146 (pTCA) transformaa-5 tiolla, jonka jälkeen tähän tuotiin konjugaatiolla pOX38::mTn3Cm-3 (IL. colista W3110polA). Transkonjugantit kasvatettiin yön yli 30 °C:ssa, jotta transpositio voisi tapahtua, jonka jälkeen kasvatettiin useita tunteja 37 °C:ssa. Yhdistetyt (noin 1000 pesäkettä) transkonjugan-10 tit suspendoitiin uudelleen ja käytettiin luovuttajana E. coli NS2114Sm -kannan kanssa suoritetussa konjugaatiossa, jossa kohdeplasmidiin transpositiotapahtumien välivaiheina muodostuneet plasmidien rinnakkaisliittymät purkautuvat (Seifert et ai., ks. yllä). Näin liitetty transposo-15 ni on pysyvä, koska pTCA -plasmidin trans-asemasta tuottamaa transposonitoimintoa ei enää esiinny. Tässä tapauksessa käytetty mini-transposoni oli mTnCm-3, jossa Tn3:n bla -geeni oli korvattu kloramfenikoliasetyyli-transferaasigeenillä.
20
Kun mTnCm-3:n liityntäkohdat pNSC2:n 900 ep.:n Sau3A I -fragmentissa oli kartoitettu, pilkottiin viisi tällaista, eri kohdissaan mTnCm-3:a sisältävää konstruktiota Not I:llä, joka vapauttaa koko liittymän lineaarisena frag-25 menttina, ja näitä käytettiin transformoimaan FA19 -kanta. Vain yksi pilkottu plasmidi, pNCS32 (kuva 7) trans-formoi FA19:n Cmr:ksi frekvenssillä, joka oli noin 1 x 107. mTnCm-3: n liityntäkohta pNCS32:ssa oli noin 300 ep.:a PIA-geenin promoottorijaksoja edeltävässä kohdassa, 30 kun taas muissa neljässä plasmidissa olleet liityntäkohdat olivat PI-geeniä lähempänä mutta ei tämän sisällä. mTnCm-3:n sijainti FA19:n CAT Dl -transformantin genomis- ;;; sa (kuva 7) varmennettiin Southern -hybridisoinnilla.
♦ · · 35 Aiemmat tutkimukset (Cannon et ai., (1980) J. Bacteriol. 143, 847 - 851; (1981) Infect. Immun.) 32, 547 - 552) ovat osoittaneet, että nmp -lokus, joka vaikuttaa PI:n molekyylipainoon ja antigeenisyyteen, sijaitsee gonokok- 38 102189 kien genomissa lähellä antibioottiresistenssixnarkkereita str ja spc järjestyksen ollessa str-spc-nmp ja rinnak-kaistransformaatiofrekvenssien ollessa 5 % str;n ja nmp:n välillä ja noin 23 % spc:n ja nmp;n välillä. Sen määrit-5 tämiseksi, esiintyykö FA19 CAT Dl -kannassa olevalla PI- rakennegeenin viereisellä CAT-markkerilla samat kytkentä-ominaisuudet kuin nmp -lokuksella, suoritettiin resi-prookkiset risteytykset kantojen FA130 (Strr Spcr Cm“; Sarubbi et ai., (1974) J. Bacteriol. 120, 1824 - 1292) ja 10 FA19 CAT Dl (Stre Spc* Cmr) välillä. Kun FA130 DNA:a käy tettiin transformoimaan FA19 CAT Dl valikoiden joko Strr:n tai Spcr:n suhteen, olivat rinnakkaistransformaa-tiofrekvenssit 26 % (99/383) spc:n ja CAT:n suhteen ja 7,5 % (40/537) str:n ja CAT:n suhteen. Resiprookkisessa 15 risteytyksessä Cmr:n suhteen olivat rinnakkaistransfor- maatiofrekvenssit 10 % (11/111) spc:n ja CAT:n suhteen ja 1 % (1/111) str:n ja CAT:n suhteen. Crossing-over -luokkien analyysi vahvisti sen, että geenien järjestys oli str...spc...CAT. Nämä koetulokset osoittivat, että CAT-20 geeni oli kytkeytynyt str- ja spc-markkere ih in samalla tavalla kuin nmp-lokus. joka antaa vahvan todisteen siitä, että nmp-lokus on PI:n rakennegeeni.
Toisessa risteytyksessä käytettiin FA19 CAT Dl: n DNA: a 25 transformoimaan PIB-kantaa MS11, valikoiden Cmr:n suh teen. 45:n transforraantin joukosta 24 sai luovuttajan PIA:n, 13:ssa säilyi vastaanottajan PIB ja 8 ilmensi uu- • · ♦
.* siä pesäkeimmunoblottausmäärityksessä havaittavia PIA/B
hybridiproteiineja. Vastaanottajan PIB:n korvautuminen 30 luovuttajan PIA:11a valikoitaessa läheistä kytkentää osoittavan CAT-geenin suhteen vahvisti näiden geenien .···. alleelisen luonteen ja hybridiproteiinien usein tapahtuva • · esiintyminen viittasi siihen, että näiden kahden alleelin välinen sekvenssihomologia salli intrageenisen rekombi-35 naation tapahtumisen. Näiden hybridi-PI-kantojen yksi tyiskohtainen analyysi riippuu siitä, että tunnetaan PIB: n nukleotidijärjestys MSll -kannassa, jonka vuoksi tämä geeni kloonattiin ja sekvenssoitiin.
· 102189 39
Koska kokonaisia gonokokkien PI-geenejä ei ilmeisesti voi kloonata £j. colissa. käytettiin MSllrn PI-geenin suhteen ΡΙΆ:η tapauksessa käytettyä strategiaa, kokonaisen geenin 5 osista muodostuvien fragmenttien kloonausta. Aiemmin hybridi-PI:a sisältäväksi luonnehditun FA6149 -kannan (Danielson et ai., (1986) Infect. Immun. 52, 529 - 533) PI-geenistä saatu DNA-fragmentti kloonattiin ja sekvens-soitiin ja sen havaittiin sisältävän Kpn I -kohdan jakson 10 PIB-osassa, noin 300 ep.:a geenin alkukohdasta. Oligo- nukleotideja NC12 (kuva 8) , joka on johdettu Kpn I -kohdan jälkeisestä PIB-jaksosta, ja NC1 (kuva 1) , joka on johdettu proteiinin N-terminaalista päätettä vastaavasta jaksosta, käytettiin koettimina Southern-hybridisoinnissa 15 varmistamaan Κρη I -kohdan esiintyminen MSll:n PI-geenis-sä. Vektoriplasmidiin pGEM-3 kloonattua, Kpn I/Hinc III -pilkottua MSll-DNA:a sisältäviä HB101 -kannan pesäkkeitä käsiteltiin näillä oligonukleotidikoettimilla ja havaittiin NC12:n kanssa hybridisoituvia pesäkkeitä, ja 20 näihin havaittiin sisältyvän NC12:n kanssa hybridisoitu-va 1,8 ke.:n Kpn I-Hinc lii -fragmentin sisältävä plas-midi. Tälle plasmidille annettiin merkintä pUNCH22 (kuva 8). Toistetuista yrityksistä huolimatta ei havaittu lainkaan NCl-koettimen kanssa hybridisoituvia pesäkkeitä.
25 Koska NC1 hybridisoitui Southern-hybridisoinnissa MSll:n genomisen DNA:n 750 ep.:n Kpn I/Hinc II -fragmentin kans-sa, ongelmana ei nähtävästi ollut koko vaan todennäköi- • · ♦ semmin tämän fragmentin PI-geenin osan ilmeneminen, joka korkean kopioluvun omaavassa vektorissa oli letaalinen 30 HB101:ssa. Tästä syystä jäljellä oleva MSll:n PI-geenin osa eristettiin 540 ep.:n suuruisena Hinf I -fragmenttina Xgtll:ssa käyttäen koettimena NC1 -oligonukleotidia.
• · *···' Tälle kloonille annettiin merkintä Xgtll.NCl (kuva 8) .
• « · *·' : Xgtll.NCl:n 540 ep.:n Hinf I -fragmentti ja pUNCH2:n 750 35 ep.:n Kpn I-Sau3A I-fragmentti pilkottiin edelleen, jat-kokloonattiin ja sekvenssoitiin. Sekvenssi on esitetty kuvassa 9 ja sen perusteella on ennustettavissa 350 aminohapon suuruinen proteiini, jonka 19 ensimmäistä aminohappoa ovat otaksuttu signaalipeptidi. FA19:n ja MSll:n 102189 40 PI-geenijaksojen vertaus paljastaa, että nukleotidijaksoilla on 80 %:n homologia. PIA:n (FA19) ja PIB:n (MS11) ennustettujen aminohappojaksojen vertailu on esitetty kuvassa 10 ja tästä on havaittavissa joukko merkittävää 5 vaihtelua osoittavia jaksoja, jotka sijoittuvat pitkien homologisten alueiden väliin. Jotkin vaihtelua osoittavat jaksot vastaavat ilmeisesti proteiinin pinnassa olevia antigeenisiä osia, koska kokonaisia gonokokkisoluja vastaan muodostetut PI-spesifiset monoklonaaliset vasta-10 aineet eivät koskaan osoita ristireaktiota PIA:n ja PIB:n välillä (Knapp et ai., (1984) J. Infect. Dis. 150, 44 - 48) .
Täydellisen PIB-geenin ilmentäminen suoritettiin käyttäen 15 samaa strategiaa kuin PIA:n ollessa kyseessä.
Xgtll.NCl -insertio-DNA:n PIB -geenin promoottorin -35-ja -10 -alueiden välisestä Nci I -kohdasta geenin alueella olevaan Κρη I -kohtaan ulottuva fragmentti liitettiin ligaasilla pUNCH22:n Knn I-Sau3A I -fragmentin kanssa 20 Hinc II:11a ja BamH I:llä pilkottuun vektoriin pGEM-2. Tämän tuloksena saatiin täydellinen plasmidivektorissa oleva PIB:tä koodaava jakso, jossa ei ollut sen omaa promoottoria ja joka oli välittömästi T7-promoottorin jälkeen. Kun tämä konstruktio (pUNCH25) vietiin BL21 25 (DE3) -kantaan ja kasvatettiin IPTG:n läsnäollessa, oli PIB:n ilmentyminen havaittavissa (kuva 11).
• · ♦ · ·*♦
Plasmidin pUNCH25 sisältävän BL21 (DE3) -kannan biologisesti puhdas viljelmä on talletettu talletuslaitokseen 30 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland talletusnumerolle 67775.
• · ·
Uusia PIA/B hybridejä konstruoitiin transformoimalla : (Biswas et ai., (1977) J. Bacteriol. 129, 983 - 992) MS11 35 -kanta FA19:n CAT Dl -DNA:11a, valikoiden Cmr:n suhteen ja tutkimalla PI:n esiintymisen suhteen immunoblottauk-sella. Resiprookkisessa risteytyksessä käytettiin PIB:n säilyttäneestä MSll:n Cmr -transformantista saatua DNA: a 102189 41 transformoimaan FA19, valikoiden Cmr:n suhteen ja tutkien PI:n esiintyminen kuten edellä. Solut inkuboitiin 5 tunnin ajan antibioottiresistenssin fenotyyppistä ilmentymistä varten joko perus-GC-kasvatusliemessä ennen mal-5 jausta tai perus-GC-agarilla ennen antibioottia sisältävän pehmytagarkerroksen lisäystä. Silloin, kun FA19:a käytettiin vastaanottajana ja valikoitiin Cmr:n suhteen, antibioottia lisättiin 1 jug/ml, kun taas MSll:n ollessa vastaanottajana käytettiin pitoisuutena 10 μg/ml. Bak-10 teerikantojen kyky sitoa monoklonaalisia vasta-aineita määritettiin käyttäen muunnelmaa menetelmästä, jonka ovat kuvanneet Cannon et ai. Perus-GC-liuokseen tehty väke- vöity solususpensio siirrettiin nitroselluloosalle moni-kanavasuodatinlaitetta käyttäen ja hajoitettiin klorofor-15 mihöyryssä. Suodatin upotettiin TBS-liuokseen (10 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl), joka sisälsi 5 % kuivamaitoa, inkuboitiin asianmukaisen vasta-aineen sisältävässä TBS-liuoksessa ja pestiin sitten TBS-liuoksessa. Kun suodatinta oli inkuboitu alkaalisella fosfataasilla konjugoi-20 dun hiiren IgG-vasta-aineen sekundäärisen vasta-aineen (Sigma) kanssa ja pesty edelleen, kehitettiin se käyttäen nitrotetratsoliumsineä ja 5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-fosfaattia (Bethesda Research Laboratories) valmistajan ohjeiden mukaan. Käytetyt monoklonaaliset vasta-aineet i.l 25 olivat 4A12, 4G5, 2F12, 6D9, 5G9, 5D1 (10), 1D3 (26) ja SM101 (27), jotka kaikki ovat PIA-spesifisiä, ja 1F5, 3C8, 2D4 ja 2H1 (10), jotka ovat PlB-spesifisiä. Kaikki • · · vasta-aineet SM101:tä lukuunottamatta oli saatu ascites - * « · nesteessä M. Tamilta (Genetic Systems) ja niitä käytet-30 tiin laimennuksissa 1:2000 - 1: 10000. SM101 saatiin J.
Heckelsiltä (University of Southampton).
• · · • * ’;·** Niiden 300 trans formant in joukossa, jotka saatiin käytet- • « * ’ täessä FA19:a vastaanottajana, oli kolmella hybridi-PI.
·.. 35 Näiden 13 hybridikannan joukosta tunnistettiin 5 eri se rologista reaktiivisuusryhmää (taulukko I). Hybridikan-nat analysoitiin sitten pesäkehybridisoinnilla käyttäen joukkoa PIA- ja PIB-spesifisiä oligonukleotidejä (tauluk- 102189 42 ko II ja kuva 10), jotta voitaisiin määrittää se, mitkä osat hybridi-PI-geeneistä olivat PIA-jaksoja ja mitkä osat PIB-jaksoja, ja tällä menetelmällä havaittiin 9 eri luokkaa (kuva 10). Tunnetun rakenteen omaavien hybridi-5 PI-geenien serologisia reaktiivisuusryhmiä analysoimalla voitiin määrittää näitä monoklonaalisia vasta-aineita vastaavien epitooppien likimääräinen sijainti.
> I
t i t • t » · • · · 411
* « · f « I
• II
» · « · » · 4 ♦ I • · 4 | I 4
Taulukko I
43 102189
Hybridi-PI-kantojen serologiset reaktiivisuusryhmät PI-5 spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa monoklonaalinen Hybridiluokat (kuva 10) vasta-aine 1-4 5 6 7-8 9 FA19 MS11 10 4G5 + + + - + + 2F12 + + + - + + SM101 + - - - + + 6D9 - - + + + + 15 4A12 + + 5G9 + + 5D1 ----+ + - 1D3 ----+ + - 1F5 + - + 20 3C8 + + - - + - + 2D4 + + - - - - + 2H1 + + - + • · 1 • · • 1 » • · · • · · · · 5 44 102189
Taulukko II
PI-hybridien analysointiin käytetyt oligonukleotidit oligo- jakso PI- paikka nukleotidi (5' -> 3') spesifisyys (ryhmä n:o)1 10 NC8 GCGTTAAAACCGCTACC A 27-32 NC9 TCGAACCCAAATCAGGC A 37-40 NC11 CGGTGTCGGTCTGCGCC A 299-305 NC12 GATACGGCGAAGGCACT B 182-187 NC13 CAAGGTGCCTCCGTCGC B 61-66 15 NC14 AAGTGCGCGTCGGCCGT A 87-92 NC15 GACTTGGCGCAACGATA A 213-219 NC16 GCAGCGTACAATACGCAC B 144 - 150 NC18 GCAACATTGCCCAACCC A 116 - 121 NC19 AGGCACTGTTGATAGTGC B 273-279 20 -------------------------------------------------------- *Paikka viittaa aminohapporyhmien numeroihin (missä n:o l on kypsän proteiinin ensimmäinen ryhmä) jotka ovat kokonaan tai osittain oligonukleotidijakson koodaamia.
• · « • ·
« I
• · · • · · I · · • ♦ · · • · · l(· 102189 45
Hybridiluokan 1 kanssa reagoivia PIA-spesifisiä monoklo-naalisia vasta-aineita 4G5, 2F12 ja SM101 vastaavien epi-tooppien täytyy sijaita lähellä proteiinin N-terminaalis-ta päätä 60:n ensimmäisen ryhmän alueella. Hybridiluok-5 kien 1, 5 ja 6 vertailu viittaa siihen, että SMIOlsn epi-tooppi on ainakin osittain ryhmien 34 ja 60 välisellä alueella. 60 N-terminaalista ryhmää sisältää huomattavaa vaihtelua PIA:n ja PIB:n välillä (kuvat 3, 9 ja 10), joka voisi selittää näiden vasta-aineiden spesifisyyden.
10 6D9:ää vastaava (PIA-spesifinen) epitooppi, joka reagoi hybridiluokkien 6-9 kanssa, sijaitsee proteiinissa ryhmien 187 - 250 välisellä alueella, joka myös sisältää PIA:n ja PIB:n välistä merkittävää vaihtelua sisältäviä alueita. Epitooppeja, jotka vastaavat vasta-aineita 15 4A12, 5G9, 5D1 ja 1D3 (kaikki PIA-spesifisiä) havaittiin vain luokan 9 hybridiproteiinissa, jotka ovat siten otaksuttavasti monimutkaisia epitooppeja, jotka liittyvät proteiinin N-terminaalisiin ja C-terminaalisiin osiin. Tätä tukee se havainto, että nämä vasta-aineet eivät rea-20 goi hyvin PI:n kanssa Western -blottauksessa, jossa proteiini on suhteellisen denaturoitunut.
MSll:n PIB:n kanssa reagoivien neljän vasta-aineen joukossa oleva, hybridiluokkien 7 ja 8 kanssa reagoivaa vas-:*: 25 ta-ainetta 1F5 vastaava epitooppi sijaitsee N-terminaa- listen 60 ryhmän alueella, kun taas vasta-aineita 3C8, .···. 2D4 ja 2H1 vastaavat epitoopit sijaitsevat nähtävästi • · • · proteiinin ryhmien 150 ja 270 välisessä keskiosassa, joka • · · sisältää pitkän vaihtelevan jakson. Vasta-ainetta 3C8 30 vastaava epitooppi sijaitsee hieman jäljempänä kuin 2D4:ää ja 2Hl:tä vastaavat epitoopit, koska luokan 9 hyb-ridiproteiini reagoi vain 3C8:n kanssa. Nämä epitoopit • · voivat olla kuitenkin suhteellisen monimutkaisia, koska ·«· 2D4 ja 2H1 eivät reagoi PIB:n kanssa WEstern-blottaukses-35 sa. Hybridi-PIA/B-geenin sisältävän ja tätä ilmentävän transformoidun mikro-organismin FA6248 biologisesti puhdas viljelmä on talletettu talletuslaitokseen American Type Culture Collection, Rockville, Maryland talletusnu-merolle 53808.
102189 46 Tämä tutkimus, jossa raportoiva geeni liitettiin PI:n rakennegeenin lähelle, osoittaa, että rakennegeenit PIA ja PIB ovat aiemmin nmp:ksi tunnistetun lokuksen (Cannon 5 et ai., (1980) J. Bacteriol. 143, 847 - 851) alleeleja.
Vain yhden PI-geenin esiintyminen gonokokkien genomissa on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että luonnossa esiintyvät kannat omaavat joko PIA-proteiinin tai PIB-proteiinin, mutta eivät koskaan molempia, ja niiden PI-10 serotyyppi säilyy pysyvästi. PIA- ja PIB-geenin ja pääteltyjen aminohappojärjestysten vertailu paljasti korkeanasteisen homologian esiintymisen mutta tunnistettiin alueita, joissa esiintyi merkittävää vaihtelua. Vaikka PI-hybridejä ei esiinny luonnossa, konstruoidut PI-hybri-15 dit olivat pysyvästi elinkykyisiä in vitro. Suhteellisen harvoin tapahtuva sellaisen PI-hybridin muodostuminen, jonka terminaalinen pääteosa on PIBrstä, ja hämmästyttävän usein PI-geenissä esiintyvät moninkertaiset crossing-over -tapahtumat viittaavat siihen, että in vitro -olo-20 suhteissa kasvavat gonokokit suosivat tiettyjä hybridi-PI-luokkia.
PI-hybridien konstruktion ja analyysin avulla päästiin määrittämään proteiinien joidenkin pinnassa esiintyvien 25 osien likimääräinen sijainti ja saatiin jonkinlainen käsitys niiden mahdollisista sekundäärisistä ja tertiää-risistä rakenteista. Sekä PIA:n että PIB:n N-terminaali- * » II! set alueet ovat ilmeisesti pinnalla ainakin yhden muun • · « ’ kummankin proteiinin keskiosassa olevan alueen kanssa.
30 PIA-ketjun laskostuminen ulkokalvossa voi olla sellainen, että N-terminaaliset ja C-terminaaliset osat assosioituvat läheisesti pinnalla, koska epitooppeja, jotka vasta- • · · sivat joukkoa PIA-spesifisiä monoklonaalisia vasta-ainei-:V ta, tunnistettiin vain silloin, kun molemmat nämä osat 35 esiintyivät PI-hybridissä. Nämä Piin konformaatiota ul- ... kokalvossa koskevat mallit ovat yhtäpitäviä joidenkin aikaisempien mallien kanssa, jotka perustuvat PI:n prote-; olyyttiseen pilkkoutumiseen ehjissä gonokokeissa (Blake . ‘ ; et ai., (1981) Infect. Immun. 33, 212 - 222; Judd et ai., 102189 47 (1986) Infect. Immun. 54, 408 - 414), mutta eroavat aiemmista ehdotuksista, että vain PIA:n N-terminaalinen osa ja PIB:n keskiosa esiintyvät pinnassa Blake et ai., ks. yllä, Teerlink, (1987) J. Exp. Med. 166, 63 - 76).
5
Seuraavat, luetellut plasmidit sisältävät coli -kannat on talletettu talletuslaitoksiin Agricultural Research Culture collection (NRRL), Peoria, IL tai American Type Culture Collection, Rockville, MD, ja niille on annettu 10 mainitut talletusnumerot.
E. coli -kanta Plasmidi Talletusnumero BL21 (D3) pUNC7 NRRL B-18263 BL21 (D3) PUNCH25 ATCC 67775 15 N_s_ aonorrhoeae FA 6248 ATCC 53808
Kantojen talletuksen tarkoituksena ei ole rajoittaa tämän keksinnön suojapiiriä, sillä kukin niistä on tarkoitettu tämän keksinnön yhden puolen kuvaamiseksi, ja mitkä ta-20 hansa solulinjat, jotka ovat toiminnallisesti samanarvoisia, kuuluvat tämän keksinnön suojapiiriin. Edelläolevan kuvauksen perusteella on alan ammattimiehille selvää, että tässä esitettyjen ja kuvattujen muunnelmien lisäksi on useita muita erilaisia muunnoksia. Näiden muunnelmien 25 on tarkoitus kuulua esitettyjen patenttivaatimusten suojapiiriin.
• · • ·
On myös selvää, että kaikki nukleotideille ilmoitetut emäsparikoot ovat likimääräisiä, ja niitä on käytetty 30 kuvaamistarkoituksissa.
Claims (27)
102189
1. Oleellisesti puhdistettu nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa kuvion 3 mukaista Neisseria 5 gonorrhoeaen IA-proteiinin täysmittaista aminohapposekvenssiä.
2. Yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen nukleiinihappomolekyylin, 10 jossa vektori sisältyy stabiilisti isäntäsoluun ja proteiinin ilmentymistä kontrolloi säädeltävä promoottori.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se on plasmidi. 15
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se on johdettu plasmidista pGEM-2.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdistelmävektori, tun-20 nettu siitä, että plasmidi on pUNC-7, jolla on kuvassa 5 esitetty restriktiokartta. 102189 kainen DNA-sekvenssi, jota kontrolloi säädeltävä promoottori ja joka sisältyy stabiilisti isäntäsoluun; ja b) sen jälkeen isäntäsolun viljelemisen indusorin läsnäollessa siten, että täysmittainen PIA-proteiini ilmentyy 5 selektiivisesti; ja c) täysmittaisen PIA-proteiinin eristämisen viljelmästä.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori on jonkin patenttivaatimuksen 2-5 mu- 10 kainen vektori.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori on plasmidi, joka käsittää kuvassa 1 esitetyn jakson tai tämän osan tai sen mutatoituneen tai 15 rekombinaation tuloksena saadun muodon.
12. Polypeptidikoostumus, tunnettu siitä, että se on tuotettu jonkin patenttivaatimuksen 9-11 mukaisella menetelmällä ja joka koostumus sisältää Neisseria aonorrhoeaen 20 täysmittaisen kuvan 3 mukaisen PIA-proteiinin ja on oleellisesti vapaa muista Neisseria gonorrhoeaen proteiineista.
13. Oleellisesti puhdistettu nukleiinihappomolekyyli, tun- . ! nettu siitä, että se koodaa Neisseria cronorrhoeaen proteii- ; 25 nin IA ja IB kimeeristä, kuvissa 3 ja 9 vastaavasti esitet- tyä aminohapposekvenssiä, jossa kimeerinen aminohapposek- ...* venssi kykenee sitoutumaan vasta-aineen kanssa, joka vasta- • · · .· · aine on suunnattu proteiinia IA vastaan, ja vasta-aineen kanssa, joka on suunnattu proteiinia IB vastaan. Y: 30 • ·
14. Yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se käsittää .* . patenttivaatimuksen 13 mukaisen nukleiinihappomolekyylin, * · · jossa vektori sisältyy stabiilisti isäntäsoluun ja proteiinin ilmentymistä kontrolloi säädeltävä promoottori. 35
15. Isäntäorganismi, tunnettu siitä, että se sisältää pa tenttivaatimuksen 13 mukaisen nukleiinihappomolekyylin. 102189
16. Yksisoluinen organismi, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 14 mukaisen vektorin.
17. Kimeerinen hybridiproteiini, tunnettu siitä, että se 5 käsittää ainakin osan Neisseria gnnnrrhnpapn IA ja IB proteiineista, kuten on esitetty kuvissa 3 ja 9 vastaavasti, ja omaa aminohapposekvenssin, joka kykenee sitoutumaan vasta-aineen kanssa, joka vasta-aine on suunnattu proteiinia IA vastaan, ja vasta-aineen kanssa, joka vasta-aine on 10 suunnattu proteiinia IB vastaan.
1. En väsentligen renad nukleinsyramolekyl, kännetecknad 15 av att den kodar en fullständig aminosyrasekvens av IA-pro- tein av Nei sseria gonorrhoea enligt figur 3.
2. En rekombinant vektor, kännetecknad av att den inne-fattar en nukleinsyramolekyl enligt patentkrav l, i vilken 20 vektorn ingär stabilt i värdcellen och proteinets expone-: ring kontrolleras av en reglerbar promotor. : 3. En rekombinant vektor enligt patentkrav 2, känneteck- nad av att den är en plasmid. 25 ,4. En rekombinant vektor enligt patentkrav 3, kanneteck-• · « t*.!t nad av att den är härledd frän pGEM-2. • · · m ·.·. 5. En rekombinant vektor enligt patentkrav 4, känneteck- • Il ϊ.,.ί 30 nad av att plasmiden är pUNC-7, som har en restriktionskar- .·. j ta enligt figur 5. • ·« • i • · · • · • · "* 6. En värdorganism, kännetecknad av att den innehäller en vektor enligt nägot av patentkraven 2-5.
7. En encellsorganism, kännetecknad av att den innehäller en vektor enligt nägot av patentkraven 2-5. 35 102189
8. En encellsorganism enligt patentkrav 7, kännetecknad av att den har drag som är kannet e cknande för stainmen NRRL nr B-18263.
9. Ett förfarande för att producera en fullständig PIA- protein av Neisseria gonorrhoea, kännetecknat av att det innefattar: a) odling av en värdcell utan inducerare, varvid värd-cellen innehäller en replikerbar rekombinant vektor, som 10 innehäller en DNA-sekvens som kodar fullständigt PIA-pro-tein enligt figur 3, varvid DNA-sekvensen kontrolleras av en reglerbar promotor och ingär stabilt i en värdcell; och b) därefter odling av värdcellen i närvaro av inducera-ren sä att ett fullständigt PIA-protein exponeras selek- 15 tivt; och c) isolering av det fullständiga PIA-proteinet ur odlin-gen.
10. Ett förfarande enligt patentkrav 9, kännetecknat av 20 att vektorn är en vektor enligt nägot av patentkraven 2-5.
11. Ett förfarande enligt patentkrav 10, kännetecknat av : att vektorn är en plasmid, som innefattar en sekvens enligt : : : figur 1 eller en del av derma eller dess mutationsform el- 25 ler form som erhällits som resultat av rekombination. • « t • · ·
12. En polypeptidsammansättning, kännetecknad av att den • · 1 producerats med ett förfarande enligt nägot av patentkraven 9-11, och att den innehäller ett fullständigt PIA-protein • · · 30 av Neisseria gonorrhoea enligt figur 3 och är väsentligen .·. ; fri frän övriga proteiner av Ne-i sseria gonorrhoea. • · 9 • · · • ·
13. En väsentligen renad nukleinsyramolekyl, kännetecknad av att den kodar en kimerisk aminosyrasekvens av protein IA 35 och IB av Neisseria gonorrhoea enligt figur 3 respektive 9, i vilken den kimeriska aminosyrasekvensen förmar bindas med en antikropp som är riktad mot protein IA, och med en anti-kropp som är riktad mot protein IB. 102189
14. En rekoitibinant vektor, kannetecknad av att den inne-fattar en nukleinsyramolekyl enligt patentkrav 13, i vilken vektorn ingär stabilt i värdcellen och proteinets expone-ring kontrolleras av en reglerbar promotor. 5
15. En värdorganism, kännetecknad av att den innehäller en nukleinsyramolekyl enligt patentkrav 13.
16. En encellsorganism, kännetecknad av att den innehäl-10 ler en vektor enligt patentkrav 14.
17. Ett kimeriskt hybridprotein, kännetecknad av att det innehäller ätminstone en del av IA och IB protein av Neisseria gonorrhoea, säsom visats i figur 3 respektive 9, och 15 har en aminosyrasekvens som förmar bindas med en antikropp som är riktad mot protein IA och med en antikropp som är riktad mot protein IB. • at • · · • · • · · • · · • · · • · ( • · 1 2 a · • · ··« • · • a · • a 1 • · • · · • · 2 ·
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI945110A FI101936B (fi) | 1987-11-24 | 1994-10-31 | Tippuribakteerien rokotteiden valmistusmenetelmä |
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12472787A | 1987-11-24 | 1987-11-24 | |
| US12472787 | 1987-11-24 | ||
| US24275888A | 1988-09-09 | 1988-09-09 | |
| US24275888 | 1988-09-09 | ||
| US8804225 | 1988-11-23 | ||
| PCT/US1988/004225 WO1989004873A1 (en) | 1987-11-24 | 1988-11-23 | Production of gonorrheal pi proteins and vaccines |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI902569A0 FI902569A0 (fi) | 1990-05-23 |
| FI102189B true FI102189B (fi) | 1998-10-30 |
| FI102189B1 FI102189B1 (fi) | 1998-10-30 |
Family
ID=26822891
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI902569A FI102189B1 (fi) | 1987-11-24 | 1990-05-23 | Menetelmä tippuribakteerin PIA-proteiinin tuottamiseksi ja eristämiseksi |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5736361A (fi) |
| EP (2) | EP0869133A1 (fi) |
| JP (2) | JP2803058B2 (fi) |
| KR (1) | KR970011309B1 (fi) |
| AT (1) | ATE169958T1 (fi) |
| AU (1) | AU629807B2 (fi) |
| CA (1) | CA1340506C (fi) |
| DE (1) | DE3856240T2 (fi) |
| DK (1) | DK175831B1 (fi) |
| FI (1) | FI102189B1 (fi) |
| NO (1) | NO302622B1 (fi) |
| WO (1) | WO1989004873A1 (fi) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1340506C (en) * | 1987-11-24 | 1999-04-20 | Nicholas H. Carbonetti | Production of gonorrheal pi proteins and vaccines |
| US7118757B1 (en) * | 1988-12-19 | 2006-10-10 | Wyeth Holdings Corporation | Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine |
| DE69227898T2 (de) * | 1991-03-14 | 1999-05-12 | Imclone Systems, Inc., New York, N.Y. | Rekombinante hybride porinepitope |
| CA2167938A1 (en) * | 1993-07-30 | 1995-02-09 | Christopher Elkins | Production of gonorrheal pi proteins and vaccines in e. coli and salmonella |
| US7252828B2 (en) | 1998-07-15 | 2007-08-07 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Polysaccharide vaccine for staphylococcal infections |
| HUP0201220A3 (en) | 1999-05-13 | 2004-07-28 | Wyeth Holdings Corp Madison | Adjuvant combination formulations |
| EP2110137A1 (en) * | 1999-09-30 | 2009-10-21 | ISIS Innovation Limited | Vaccine against neisseria infection |
| DK1947187T5 (da) * | 2000-02-28 | 2011-10-24 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Hybrid ekspression af neisserial-proteiner |
| KR100863368B1 (ko) * | 2000-11-10 | 2008-10-13 | 와이어쓰 홀딩스 코포레이션 | 조합 보조 제제 |
| AU2003290867A1 (en) | 2002-11-12 | 2004-06-03 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and products for treating staphylococcal infections |
| EP1565478B1 (en) | 2002-11-12 | 2017-08-02 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Polysaccharide vaccine for staphylococcal infections |
| US7786255B2 (en) | 2004-04-21 | 2010-08-31 | The Bringham and Women's Hospital, Inc. | Poly-N-acetyl glucosamine (PNAG/dPNAG)-binding peptides and methods of use thereof |
| US7037698B2 (en) | 2004-05-19 | 2006-05-02 | Amano Enzyme Inc. | Pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase |
| KR101573648B1 (ko) | 2008-07-21 | 2015-12-01 | 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. | 합성 베타-1,6 글루코사민 올리고당에 관한 방법 및 조성물 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
| US4203971A (en) * | 1978-03-23 | 1980-05-20 | Government Of The United States | Neisseria gonorrhoeae vaccine |
| DE2814039C3 (de) * | 1978-03-31 | 1981-02-19 | Gesellschaft Fuer Biotechnologische Forschung Mbh (Gbf), 3300 Braunschweig | Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Bakterien |
| US4351761A (en) * | 1978-05-15 | 1982-09-28 | Research Corporation | Purified antigen to test for Neisseria gonorrhoeae antibodies |
| US4220638A (en) * | 1978-10-12 | 1980-09-02 | Merck & Co., Inc. | Antigenic complex from N. Gonorrhoeae |
| US4288557A (en) * | 1978-10-12 | 1981-09-08 | Merck & Co., Inc. | Antigenic complex from N. gonorrhoeae |
| US4239749A (en) * | 1979-09-27 | 1980-12-16 | United States Of America | Neisseria gonorrhoeae vaccine |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| WO1983003354A1 (en) * | 1982-03-30 | 1983-10-13 | Us Army | Neisseria gonorrhoeae vaccine |
| EP0178863A1 (en) * | 1984-10-15 | 1986-04-23 | Schering Corporation | Novel expression systems utilizing bacteriophage T7 promoters and gene sequences |
| US4681761A (en) * | 1985-10-24 | 1987-07-21 | State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University | Major iron-regulated protein of Neisseria gonorrhoeae and its use as vaccine |
| US4786592A (en) * | 1986-06-18 | 1988-11-22 | Scripps Clinic And Research Foundation | Neisseria gonorrhoeae lectin useful as a vaccine and diagnostic marker and means for producing this lectin |
| CA1340506C (en) * | 1987-11-24 | 1999-04-20 | Nicholas H. Carbonetti | Production of gonorrheal pi proteins and vaccines |
-
1988
- 1988-11-22 CA CA000583787A patent/CA1340506C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-23 WO PCT/US1988/004225 patent/WO1989004873A1/en active IP Right Grant
- 1988-11-23 AU AU27959/89A patent/AU629807B2/en not_active Expired
- 1988-11-23 KR KR1019890701369A patent/KR970011309B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-11-23 EP EP98101882A patent/EP0869133A1/en not_active Withdrawn
- 1988-11-23 EP EP89900540A patent/EP0395706B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-23 AT AT89900540T patent/ATE169958T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-11-23 DE DE3856240T patent/DE3856240T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-23 JP JP1500595A patent/JP2803058B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-05-22 NO NO902251A patent/NO302622B1/no unknown
- 1990-05-23 DK DK199001284A patent/DK175831B1/da not_active IP Right Cessation
- 1990-05-23 FI FI902569A patent/FI102189B1/fi not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-12-01 US US07/983,995 patent/US5736361A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-11-06 US US08/965,085 patent/US6068992A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-01-22 JP JP04415498A patent/JP3388171B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK175831B1 (da) | 2005-03-14 |
| EP0395706A1 (en) | 1990-11-07 |
| DE3856240T2 (de) | 1999-05-06 |
| US6068992A (en) | 2000-05-30 |
| EP0869133A1 (en) | 1998-10-07 |
| ATE169958T1 (de) | 1998-09-15 |
| NO902251L (no) | 1990-07-18 |
| JPH03502881A (ja) | 1991-07-04 |
| EP0395706A4 (en) | 1991-11-13 |
| CA1340506C (en) | 1999-04-20 |
| AU2795989A (en) | 1989-06-14 |
| EP0395706B1 (en) | 1998-08-19 |
| JP2803058B2 (ja) | 1998-09-24 |
| AU629807B2 (en) | 1992-10-15 |
| KR970011309B1 (ko) | 1997-07-09 |
| DK128490D0 (da) | 1990-05-23 |
| US5736361A (en) | 1998-04-07 |
| JP3388171B2 (ja) | 2003-03-17 |
| NO902251D0 (no) | 1990-05-22 |
| NO302622B1 (no) | 1998-03-30 |
| WO1989004873A1 (en) | 1989-06-01 |
| DE3856240D1 (de) | 1998-09-24 |
| FI102189B1 (fi) | 1998-10-30 |
| KR890701750A (ko) | 1989-12-21 |
| JPH10234388A (ja) | 1998-09-08 |
| DK128490A (da) | 1990-07-06 |
| FI902569A0 (fi) | 1990-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Whiteside et al. | Role of human natural killer cells in health and disease | |
| FI102189B (fi) | Menetelmä tippuribakteerin PIA-proteiinin tuottamiseksi ja eristämisek si | |
| Hale et al. | Identification and antigenic characterization of virulence-associated, plasmid-coded proteins of Shigella spp. and enteroinvasive Escherichia coli | |
| KR100188323B1 (ko) | 비타입성 헤모필루스 인플렌자에 대한 백신 | |
| JP2685442B2 (ja) | ボルデテラ・パータツシス染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩフラグメント | |
| AU4934396A (en) | Proteinase k resistant surface protein of neisseria meningitidis | |
| JPH08510120A (ja) | ヘリコバクター感染に対する免疫性組成物、該組成物に用いられるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸配列 | |
| JP2004529854A (ja) | 増殖性回腸炎のための改善されたワクチン及びその作製と使用の方法 | |
| AU615429B2 (en) | Vaccines and diagnostic assays for haemophilus influenzae | |
| US6444799B1 (en) | P. gingivalis polynucleotides and uses thereof | |
| US20030026809A1 (en) | Neisserial vaccine compositions and methods | |
| JP2001501808A (ja) | 歯周炎の診断および治療用のポルフィロモナス・ジンジバリス抗原 | |
| Dallas et al. | Identification and purification of a recombinant Treponema pallidum basic membrane protein antigen expressed in Escherichia coli | |
| KR0170752B1 (ko) | 혈호균속 인플루엔자용 백신과 진단검사법 | |
| EP0409895B1 (en) | A pasteurella vaccine | |
| US5026636A (en) | Methods and compositions for production of mycoplasmal adhesins | |
| Benz et al. | Diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli strains—processing of AIDA-I | |
| US6348332B1 (en) | DNA molecule encoding gonorrhoeal hybrid PIA/PIB protein | |
| Fortineau et al. | Lack of antibody response to invasin in humans with yersiniosis. | |
| WO1992016223A1 (en) | Production of gonorrheal pi proteins and vaccines | |
| WO1994006911A2 (en) | Mycoplasma pulmonis antigens and methods and compositions for use in cloning and vaccination | |
| JPH04501661A (ja) | マラリア抗原 | |
| AU762316B2 (en) | Proteinase K resistant surface protein of neisseria meningitidis | |
| Wake et al. | Virulence Factors of Yersinia pestis | |
| EP0815234A1 (en) | Proteinase k resistant surface protein of neisseria meningitidis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: THE UNIVERSITY OF NORTH CAROLINA |
|
| MA | Patent expired |