JP3388171B2 - 淋菌ｐｉタンパク質およびワクチンの製造 - Google Patents
淋菌ｐｉタンパク質およびワクチンの製造Info
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】１．序論
現在、淋疾は世界で最も広がった性病の１つであり、米
国では毎年数百万例が発生している。この疾患の病原菌
は淋菌ナイセリア・ゴノロエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）であり、この細菌はその歴史
を通して伝統的な抗生物質治療に対する耐性およびある
程度までの正常ヒト血清の抗菌活性に対する耐性の両方
を発達させてきた。伝統的手段による感染の防御が不可
能であるために、この感染を効果的に阻止しうるワクチ
ンの開発が極めて重要となっている。本発明は、特定の
ナイセリア・ゴノロエアエ外層膜タンパク質をコードす
るＤＮＡ配列を提供し、またこの特定ＤＮＡ配列のクロ
ーン化産物は前記ワクチンの適当な主成分を提供する。
また、本発明は淋菌感染を検出するための診断用プロー
ブとして有用な種−特異的オリゴヌクレオチド配列をも
提供する。
国では毎年数百万例が発生している。この疾患の病原菌
は淋菌ナイセリア・ゴノロエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）であり、この細菌はその歴史
を通して伝統的な抗生物質治療に対する耐性およびある
程度までの正常ヒト血清の抗菌活性に対する耐性の両方
を発達させてきた。伝統的手段による感染の防御が不可
能であるために、この感染を効果的に阻止しうるワクチ
ンの開発が極めて重要となっている。本発明は、特定の
ナイセリア・ゴノロエアエ外層膜タンパク質をコードす
るＤＮＡ配列を提供し、またこの特定ＤＮＡ配列のクロ
ーン化産物は前記ワクチンの適当な主成分を提供する。
また、本発明は淋菌感染を検出するための診断用プロー
ブとして有用な種−特異的オリゴヌクレオチド配列をも
提供する。
【従来の技術】２．発明の背景
脊椎動物における任意の特定の感染因子に対する防御免
疫応答の発生は、初めに宿主免疫系に適当な刺激が与え
られるか否かの如何による。感染性生物自体は一般に、
またはその細胞膜組成の性質によるか、またはそれが宿
主体内に放出する代謝産物により、多数の刺激性化合物
（すなわち、抗原）を提供する。これらの物質（通常、
タンパク質、リポ多糖類、糖タンパクのような比較的大
きい分子）は免疫系によって異物として認識され、そし
て侵入生物を排除または無力にしようとして宿主から１
種またはそれ以上の異なる種類の反応をひき出す。この
抗原は細胞性免疫を与える感作リンパ球（Ｔ細胞）の生
産を惹起しうる。あるいはまた、抗原は遊離抗体の合成
および血液または他の体液中への遊離抗体の放出を刺激
することができる（体液性免疫）。身体の防御免疫応答
の発生はこれらの系の一方または両方の刺激閾値に達す
るか否かの如何によっている。感染に対する一時的免疫
は、多くの場合同種または異種の別の個体から前以て産
生された抗体を与えることによって付与されうる。これ
は受動免疫として知られている。このような免疫の例と
しては、母親の抗体の胎盤移入および母乳を通しての抗
体の移入により胎児や新生児に与えられる防御がある。
その他の例としては、はしか、水ぼうそう、肝炎、天然
痘および破傷風にさらされた際のその作用を阻止もしく
は軽減するためにしばしば用いられるプールされた成人
γ−グロブリンがある。しかしながら、これら獲得抗体
は抗原との相互作用により徐々に利用されるか、または
生体により異化作用を受け、その結果終局的には防御が
失われる。より永続的な形態の防御は能動免疫により与
えられる。ワクチン接種では免疫系に対する一次刺激と
して無害のまたは毒性のない形の抗原（例えば、死滅し
たまたは遺伝学的に変えられた細菌、もしくは細胞壁か
ら単離した糖タンパク）を使用することにより能動防御
免疫が賦与される。これは最高に達しその後減少する抗
体産生においてやや遅い応答を引き起こす。しかしなが
ら、身体は抗原の存在を警戒しており、その次に、恐ら
くは生きた毒性の強い生物にさらされると、より一層速
やかで豊富な抗体産生を伴う二次応答が観察される。こ
の二次応答は一般に微生物が全面的な感染を引き起こす
に足るほどに定着するのを阻止するに十分であろう。ワ
クチンはいろいろな形をとることができ、そのうちのあ
るものは所望の防御効果を賦与するのに他のものよりも
有効てある。歴史的にみると、多くのワクチンは対象の
疾患を起こす微生物を死滅または不活性化し、その死滅
細胞を能動免疫原として用いることにより製造されてき
た。この種のワクチンは腸チフス、コレラおよびポリオ
（ソークワクチン）に対して使用されている。この種の
ワクチンがかかえる問題は、微生物を殺すのに必要な処
理（例えば、ホルムアルデヒド）が往々にして微生物の
有用な抗原を変性または破壊し、従って不完全な弱い免
疫しか得られない場合があるということである。ワクチ
ンの別の形は弱毒化微生物を使用するものである。弱毒
化微生物はまだ生きていて投与後体内で増殖できるが、
無発病性となすために何らかの方法で改変されているも
のであるか、あるいは他の生物には発病力があるがヒト
には無毒の株である。弱毒化生物を使用することの利点
は、弱毒化が通常その抗原性に影響を及ぼさず、従って
免疫系により効果的な刺激を与えることである。はし
か、風疹およびポリオ（セービンワクチン）の弱毒化ワ
クチンが広く用いられている。弱毒化は代表的には微生
物の増殖条件を変えるか、または、最近では微生物の毒
性を遺伝子的に修飾することにより達成される。大体に
おいて、弱毒化ワクチンは死滅ワクチンよりも効果的で
あるが、生存微生物が毒性状態に戻って病気の症状を引
き起こす可能性があるという危険が存在する。微生物全
体使用ワクチンに関連した諸問題のために、近年ではワ
クチン組成物中における活性物質として個々の感染防御
抗原を使用することがより一般的になってきている。感
染防御性応答を刺激する生物の特定抗原の分離および同
定は必ずしも単純ではないが、ひとたび同定されると、
この方法は欠点が付随することのない、微生物全体使用
ワクチンに代わるべき有効な代替物を提供するものであ
る。この目的に使用しうる代表的な抗原の種類の例をあ
げれば、精製された細胞またはカプシド成分、例えばバ
クテリアトキシン（トキソイドを生成させるには解毒さ
れねばならない）、細菌またはウイルスのトキシンサブ
ユニット、細胞壁多糖類、もしくはカプシド糖タンパク
である。これらの成分は免疫性を賦与するのにはしばし
ば非常に効果的であるが、実際の精製の点で困難が生ず
る。対象の抗原を無関係の細胞物質（これらの存在は往
々にして所望免疫生成反応と同時に不利な免疫学的また
は代謝上の応答を引き起こしうる）から多かれ少なかれ
完全に単離することが決定的に重要である。必要とされ
る精製方法はしばしば複雑で、退屈で、しかも費用が莫
大にかかり、その結果を必ずしも完全に予想できるわけ
ではない。この問題は、ある場合には、微生物抗原上の
エピトープに相当する小型ペプチド配列の合成によって
回避できる。いくつかの状況においては、アミノ酸配列
が天然のエピトープ配列に一致するが、そのコンホメー
ションが適切な免疫応答を誘起させるに足るほど親抗原
のそれに類似していないかもしれないという欠点がこの
技術には存在する。これらの種類の前記ワクチンに付随
する欠点の多くは組換えＤＮＡ技術の使用により回避で
きる。重要な微生物抗原の全部または一部をコードする
遺伝子をクローニングすることができれば、実質的に夾
雑するタンパク性または遺伝子物質を含まない比較的大
量の必要な免疫原性物質のより経済的で便利な供給源が
得られる。簡単に説明すると、精製抗原を得るためのこ
の方法は、抗原をコードする特定ＤＮＡ配列をＤＮＡベ
クターに挿入して、宿主細胞内で複製しうる組換えＤＮ
Ａ分子を生成させることを包含する。現在、組換えＤＮ
Ａ分子を作製しうる方法は数多く存在する。より優れた
既知技術の１つは、ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒによっ
て米国特許第４２３７２２４号に開示されたものである
（この特許の教示内容は参照としてここにとり込まれる
ものとする）。この方法では制限酵素および連結反応を
用いて組換えプラスミドを作製し、次に得られたプラス
ミドを単細胞宿主細胞に挿入し、これにより形質転換さ
れた宿主細胞が外来ＤＮＡの複製を開始する。バクテリ
オファージベクターを利用する別法は米国特許第４３０
４８６３号に開示されている（これも参照としてここに
とり込まれる）。クローニング法はすぐに利用できるワ
クチン製造のための経済的で、都合のよい供給源を提供
する可能性が最も大きい。しかしながら、免疫原性をも
つことが知られている抗原の適当な遺伝子を初めに単離
し、その塩基配列を決定し、適切な複製、転写および翻
訳が可能なようにプラスミドに挿入し、その後適合性の
宿主細胞に挿入せねばならない点で困難がないわけでは
ない。もしも遺伝子の転写、ＲＮＡの翻訳、またはポリ
ペプチドの翻訳後プロセッシングおよび区画化のいずれ
か１つが正しく行われないならば、所望の遺伝子産物の
発現が失敗する可能性は非常に大きい。クローン化挿入
物が転写されるためには、宿主ＲＮＡポリメラーゼが認
識できるプロモーターの存在が必要である。適正な翻訳
にはＲＮＡがリボソーム結合部位を有することが必要で
ある。タンパク質の翻訳後修飾にはしばしばタンパク質
を細胞膜を通ってその外へ導く機能をするシグナル配列
の切断が包含される。また、タンパク質の立体配置やア
ミノ酸配列が宿主の細胞内のプロテアーゼの作用から保
護されない場合には、生産された外来タンパク質の宿主
微生物による分解が起こりうる。従って、ナイセリア
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ワクチンを最終的に製造する理
想的な方法であるとは考えられるが、これらの技術が以
前に淋疾のワクチン製造に応用されたことはない。 ２．２．淋菌抗原 ナイセリア・ゴノロエアエのいくつかの抗原は広く研究
され分類されている。例えば、淋菌のピリ（線毛）は分
子量が約２００００のタンパクサブユニットから主に成
っており、抗原性を有することが判明している（Ｂｕｃ
ｈａｎａｎ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５２：２
８９６−２９０９，１９７３）。この物質の合成物はワ
クチンとてし製剤化された（Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ等、Ｐ
ｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ ３３：３１４−３３１，１９
８３）。また、ナイセリア・ゴノロエアエのリポ多糖類
も抗原性があり、β−１，４−結合ガラクトース−グル
コース残基が主要な抗原決定基である。しかしながら、
近年この分野における研究の最大の関心は恐らく、タン
パク質複合体である外層膜タンパク（このタンパク質の
免疫原性における役割はまだ十分に理解されていない）
に集中している。外層膜タンパク質の組成は株によって
やや変化することが知られており、これに基づいて少な
くとも１６種類の異なる血清型が同定されている（Ｊｏ
ｈｎｓｔｏｎ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３：７４１
−７５８，１９７６）。淋菌の膜部分を用いた数多くの
ワクチン組成物が以前に、例えば米国特許第４２０３９
７１号、同第４２８８５５７号および同第４６８１７６
１号に記載されている。しかしながら、これらの組成物
の大部分はタンパク質と他の物質との混合物を含有して
おり、細菌細胞から活性成分を単離および分離するには
かなり手の込んだ精製操作を必要とする。従って、これ
らのワクチンは希望する免疫特異性を有しない可能性が
あり、しかも商業的量のワクチンを製造するためには大
変な量の微生物原料が必要である。 ２．２．１．淋菌プロテインＩ プロテインＩまたはＰＩとして知られる特定の外層膜タ
ンパク質もワクチン組成物主成分として使用可能な候補
者として提案される。ＰＩはポーリン（ｐｏｒｉｎ）と
して機能するナイセリア・ゴノロエアエの主要な外層膜
タンパク質であり（Ｄｏｕｇｌａｓ等、ＦＥＭＳ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ１２：３０５−
３０９，１９８１）、このタンパク質は細胞において低
分子量物質を疎水性脂質外層膜を横切って通過させるよ
うに作用すると考えられている。ＰＩが関心を集める多
くの特徴が存在する：第一に、それがナイセリアの血清
型特異性に少なくとも幾分かは関与しており、比較的少
数の抗原性プロテインＩ血清型が存在する。また、特定
のＰＩ血清型を保有する多数の淋菌が複雑な淋菌感染に
関係している。さらに、それは天然の状態で表面に露出
していると思われ、また、オプソニンの生産を刺激する
と思われる（Ｓａｒａｆｉａｎ等、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｄｉｓ．１４８．１０２５−１０３２，１９８３）。オ
プソニンは感染性微生物の表面に結合して食細胞による
微生物の飲み込みを促進する抗体である。その免疫原性
はワクチン接種マウスにおいてすでに立証されている
（Ｊｉｓ−ｋｏｏｔ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５
４：３３３−３３８，１９８６）。主要な２種類のＰＩ
分子であるＰＩＡおよびＰＩＢ（Ｂａｒｒｅｒａ等、Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４４：５６５−５６８，１９
８４）がペプチドマッピングおよびタンパク質加水分解
に対する感受性に基づいて淋菌において証明されている
（Ｂｌａｋｅ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３３：２
１２−２２２，１９８１）。この分類は血清群パターン
（Ｓａｎｄｓｔｒｕｍ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
３５：２２９−２３９，１９８２；Ｓａｎｄｓｔｒｕｍ
等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３８：４６２−４７
０，１９８２）および病因と関連のあることが分かっ
た。タンパク質ＩＡを発現する淋菌は全身感染に関係し
ており、一方タンパク質ＩＢを発現するものは局所感染
と関係している（Ｂｕｃｈａｎａｎ等、Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｉｍｍｕｎ．３２：９８５−９９４，１９８１；Ｈｉｌ
ｄｅｂｒａｎｄｔ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２
０：２６７−２７３，１９７８）。可能性のあるワクチ
ン候補としてのＰＩの開発に払われたあらゆる注意にも
かかわらず、まだＰＩに基づく有効なワクチンはつくら
れていない。さらに、その生産を制御する遺伝子配列も
まだ何ら解明されておらず、このタンパク質の構造につ
いてはほとんど知られていない。本発明は完全なＰＩ遺
伝子配列、ＰＩＡ構造遺伝子、およびクローン化遺伝子
産物について初めて説明するものである。さらに、新規
なＰＩＢ遺伝子配列と、これらの配列から誘導された特
異なＰＩＡ−ＰＩＢキメラについても説明する。後者の
キメラはエピトープマッピングの際に有用であり、ワク
チン開発の基礎となるものである。 ２．３．診断用プローブ この疾患に関して広範囲にゆきわたったもう一つの面は
早期検出および診断の重要性である。淋疾の診断に利用
できる標準的な細菌学的試験法はもちろんあるが、かか
る試験法は培養下のバクテリアの増殖を当てにしてお
り、時間がかかり、しかも一般にあまり特異的でない。
ナイセリア・ゴノロエアエは種々の血清型を有すること
が知られており、このことは前節で説明したように、こ
の疾患の非常に明確なパターンを示すものでありうる。
この疾患の適切な治療を行うためには、診断が迅速であ
るばかりでなく、できるだけ正確であることが決定的に
重要である。ＤＮＡ−およびＲＮＡ−プローブ技術の発
達により、診断における多くのかかる問題に対する解答
が与えられた。ブローブは代表的には対象となる特定遣
伝子の全部または一部と相補性であるＤＮＡまたはＲＮ
Ａの放射性標識された一本鎖であり、従って、相補性核
酸の一本鎖にさらされると、それにハイブリダイズする
であろう。ブローブはサザンブロッティングとして知ら
れる技法で用いられ、その場合対象遺伝子を含有する疑
いのある検体からのＤＮＡ断片をアガロースゲルで分離
し、変性させて一本鎖を生成させ、次にニトロ−セルロ
ースフィルターに移行させる。ここでそれらを予め選択
された標識されたプローブとインキュベートすると、そ
のものは相補鎖にハイブリダイズして、その標識により
目的遺伝子の存在が確認されよう。この種のプローブは
また、宿主細胞中の全ゲノムのＤＮＡ断片をクローニン
グすることにより確立されたゲノムライブラリーから、
対象遺伝子を含有する特定クローンを同定する際にも有
利に使用できる。ナイセリア・ゴノロエアエに関連して
開発された便利で、高度に正確なプローブ系はこれまで
存在していない。
疫応答の発生は、初めに宿主免疫系に適当な刺激が与え
られるか否かの如何による。感染性生物自体は一般に、
またはその細胞膜組成の性質によるか、またはそれが宿
主体内に放出する代謝産物により、多数の刺激性化合物
（すなわち、抗原）を提供する。これらの物質（通常、
タンパク質、リポ多糖類、糖タンパクのような比較的大
きい分子）は免疫系によって異物として認識され、そし
て侵入生物を排除または無力にしようとして宿主から１
種またはそれ以上の異なる種類の反応をひき出す。この
抗原は細胞性免疫を与える感作リンパ球（Ｔ細胞）の生
産を惹起しうる。あるいはまた、抗原は遊離抗体の合成
および血液または他の体液中への遊離抗体の放出を刺激
することができる（体液性免疫）。身体の防御免疫応答
の発生はこれらの系の一方または両方の刺激閾値に達す
るか否かの如何によっている。感染に対する一時的免疫
は、多くの場合同種または異種の別の個体から前以て産
生された抗体を与えることによって付与されうる。これ
は受動免疫として知られている。このような免疫の例と
しては、母親の抗体の胎盤移入および母乳を通しての抗
体の移入により胎児や新生児に与えられる防御がある。
その他の例としては、はしか、水ぼうそう、肝炎、天然
痘および破傷風にさらされた際のその作用を阻止もしく
は軽減するためにしばしば用いられるプールされた成人
γ−グロブリンがある。しかしながら、これら獲得抗体
は抗原との相互作用により徐々に利用されるか、または
生体により異化作用を受け、その結果終局的には防御が
失われる。より永続的な形態の防御は能動免疫により与
えられる。ワクチン接種では免疫系に対する一次刺激と
して無害のまたは毒性のない形の抗原（例えば、死滅し
たまたは遺伝学的に変えられた細菌、もしくは細胞壁か
ら単離した糖タンパク）を使用することにより能動防御
免疫が賦与される。これは最高に達しその後減少する抗
体産生においてやや遅い応答を引き起こす。しかしなが
ら、身体は抗原の存在を警戒しており、その次に、恐ら
くは生きた毒性の強い生物にさらされると、より一層速
やかで豊富な抗体産生を伴う二次応答が観察される。こ
の二次応答は一般に微生物が全面的な感染を引き起こす
に足るほどに定着するのを阻止するに十分であろう。ワ
クチンはいろいろな形をとることができ、そのうちのあ
るものは所望の防御効果を賦与するのに他のものよりも
有効てある。歴史的にみると、多くのワクチンは対象の
疾患を起こす微生物を死滅または不活性化し、その死滅
細胞を能動免疫原として用いることにより製造されてき
た。この種のワクチンは腸チフス、コレラおよびポリオ
（ソークワクチン）に対して使用されている。この種の
ワクチンがかかえる問題は、微生物を殺すのに必要な処
理（例えば、ホルムアルデヒド）が往々にして微生物の
有用な抗原を変性または破壊し、従って不完全な弱い免
疫しか得られない場合があるということである。ワクチ
ンの別の形は弱毒化微生物を使用するものである。弱毒
化微生物はまだ生きていて投与後体内で増殖できるが、
無発病性となすために何らかの方法で改変されているも
のであるか、あるいは他の生物には発病力があるがヒト
には無毒の株である。弱毒化生物を使用することの利点
は、弱毒化が通常その抗原性に影響を及ぼさず、従って
免疫系により効果的な刺激を与えることである。はし
か、風疹およびポリオ（セービンワクチン）の弱毒化ワ
クチンが広く用いられている。弱毒化は代表的には微生
物の増殖条件を変えるか、または、最近では微生物の毒
性を遺伝子的に修飾することにより達成される。大体に
おいて、弱毒化ワクチンは死滅ワクチンよりも効果的で
あるが、生存微生物が毒性状態に戻って病気の症状を引
き起こす可能性があるという危険が存在する。微生物全
体使用ワクチンに関連した諸問題のために、近年ではワ
クチン組成物中における活性物質として個々の感染防御
抗原を使用することがより一般的になってきている。感
染防御性応答を刺激する生物の特定抗原の分離および同
定は必ずしも単純ではないが、ひとたび同定されると、
この方法は欠点が付随することのない、微生物全体使用
ワクチンに代わるべき有効な代替物を提供するものであ
る。この目的に使用しうる代表的な抗原の種類の例をあ
げれば、精製された細胞またはカプシド成分、例えばバ
クテリアトキシン（トキソイドを生成させるには解毒さ
れねばならない）、細菌またはウイルスのトキシンサブ
ユニット、細胞壁多糖類、もしくはカプシド糖タンパク
である。これらの成分は免疫性を賦与するのにはしばし
ば非常に効果的であるが、実際の精製の点で困難が生ず
る。対象の抗原を無関係の細胞物質（これらの存在は往
々にして所望免疫生成反応と同時に不利な免疫学的また
は代謝上の応答を引き起こしうる）から多かれ少なかれ
完全に単離することが決定的に重要である。必要とされ
る精製方法はしばしば複雑で、退屈で、しかも費用が莫
大にかかり、その結果を必ずしも完全に予想できるわけ
ではない。この問題は、ある場合には、微生物抗原上の
エピトープに相当する小型ペプチド配列の合成によって
回避できる。いくつかの状況においては、アミノ酸配列
が天然のエピトープ配列に一致するが、そのコンホメー
ションが適切な免疫応答を誘起させるに足るほど親抗原
のそれに類似していないかもしれないという欠点がこの
技術には存在する。これらの種類の前記ワクチンに付随
する欠点の多くは組換えＤＮＡ技術の使用により回避で
きる。重要な微生物抗原の全部または一部をコードする
遺伝子をクローニングすることができれば、実質的に夾
雑するタンパク性または遺伝子物質を含まない比較的大
量の必要な免疫原性物質のより経済的で便利な供給源が
得られる。簡単に説明すると、精製抗原を得るためのこ
の方法は、抗原をコードする特定ＤＮＡ配列をＤＮＡベ
クターに挿入して、宿主細胞内で複製しうる組換えＤＮ
Ａ分子を生成させることを包含する。現在、組換えＤＮ
Ａ分子を作製しうる方法は数多く存在する。より優れた
既知技術の１つは、ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒによっ
て米国特許第４２３７２２４号に開示されたものである
（この特許の教示内容は参照としてここにとり込まれる
ものとする）。この方法では制限酵素および連結反応を
用いて組換えプラスミドを作製し、次に得られたプラス
ミドを単細胞宿主細胞に挿入し、これにより形質転換さ
れた宿主細胞が外来ＤＮＡの複製を開始する。バクテリ
オファージベクターを利用する別法は米国特許第４３０
４８６３号に開示されている（これも参照としてここに
とり込まれる）。クローニング法はすぐに利用できるワ
クチン製造のための経済的で、都合のよい供給源を提供
する可能性が最も大きい。しかしながら、免疫原性をも
つことが知られている抗原の適当な遺伝子を初めに単離
し、その塩基配列を決定し、適切な複製、転写および翻
訳が可能なようにプラスミドに挿入し、その後適合性の
宿主細胞に挿入せねばならない点で困難がないわけでは
ない。もしも遺伝子の転写、ＲＮＡの翻訳、またはポリ
ペプチドの翻訳後プロセッシングおよび区画化のいずれ
か１つが正しく行われないならば、所望の遺伝子産物の
発現が失敗する可能性は非常に大きい。クローン化挿入
物が転写されるためには、宿主ＲＮＡポリメラーゼが認
識できるプロモーターの存在が必要である。適正な翻訳
にはＲＮＡがリボソーム結合部位を有することが必要で
ある。タンパク質の翻訳後修飾にはしばしばタンパク質
を細胞膜を通ってその外へ導く機能をするシグナル配列
の切断が包含される。また、タンパク質の立体配置やア
ミノ酸配列が宿主の細胞内のプロテアーゼの作用から保
護されない場合には、生産された外来タンパク質の宿主
微生物による分解が起こりうる。従って、ナイセリア
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ワクチンを最終的に製造する理
想的な方法であるとは考えられるが、これらの技術が以
前に淋疾のワクチン製造に応用されたことはない。 ２．２．淋菌抗原 ナイセリア・ゴノロエアエのいくつかの抗原は広く研究
され分類されている。例えば、淋菌のピリ（線毛）は分
子量が約２００００のタンパクサブユニットから主に成
っており、抗原性を有することが判明している（Ｂｕｃ
ｈａｎａｎ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５２：２
８９６−２９０９，１９７３）。この物質の合成物はワ
クチンとてし製剤化された（Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ等、Ｐ
ｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ ３３：３１４−３３１，１９
８３）。また、ナイセリア・ゴノロエアエのリポ多糖類
も抗原性があり、β−１，４−結合ガラクトース−グル
コース残基が主要な抗原決定基である。しかしながら、
近年この分野における研究の最大の関心は恐らく、タン
パク質複合体である外層膜タンパク（このタンパク質の
免疫原性における役割はまだ十分に理解されていない）
に集中している。外層膜タンパク質の組成は株によって
やや変化することが知られており、これに基づいて少な
くとも１６種類の異なる血清型が同定されている（Ｊｏ
ｈｎｓｔｏｎ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３：７４１
−７５８，１９７６）。淋菌の膜部分を用いた数多くの
ワクチン組成物が以前に、例えば米国特許第４２０３９
７１号、同第４２８８５５７号および同第４６８１７６
１号に記載されている。しかしながら、これらの組成物
の大部分はタンパク質と他の物質との混合物を含有して
おり、細菌細胞から活性成分を単離および分離するには
かなり手の込んだ精製操作を必要とする。従って、これ
らのワクチンは希望する免疫特異性を有しない可能性が
あり、しかも商業的量のワクチンを製造するためには大
変な量の微生物原料が必要である。 ２．２．１．淋菌プロテインＩ プロテインＩまたはＰＩとして知られる特定の外層膜タ
ンパク質もワクチン組成物主成分として使用可能な候補
者として提案される。ＰＩはポーリン（ｐｏｒｉｎ）と
して機能するナイセリア・ゴノロエアエの主要な外層膜
タンパク質であり（Ｄｏｕｇｌａｓ等、ＦＥＭＳ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ１２：３０５−
３０９，１９８１）、このタンパク質は細胞において低
分子量物質を疎水性脂質外層膜を横切って通過させるよ
うに作用すると考えられている。ＰＩが関心を集める多
くの特徴が存在する：第一に、それがナイセリアの血清
型特異性に少なくとも幾分かは関与しており、比較的少
数の抗原性プロテインＩ血清型が存在する。また、特定
のＰＩ血清型を保有する多数の淋菌が複雑な淋菌感染に
関係している。さらに、それは天然の状態で表面に露出
していると思われ、また、オプソニンの生産を刺激する
と思われる（Ｓａｒａｆｉａｎ等、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｄｉｓ．１４８．１０２５−１０３２，１９８３）。オ
プソニンは感染性微生物の表面に結合して食細胞による
微生物の飲み込みを促進する抗体である。その免疫原性
はワクチン接種マウスにおいてすでに立証されている
（Ｊｉｓ−ｋｏｏｔ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５
４：３３３−３３８，１９８６）。主要な２種類のＰＩ
分子であるＰＩＡおよびＰＩＢ（Ｂａｒｒｅｒａ等、Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４４：５６５−５６８，１９
８４）がペプチドマッピングおよびタンパク質加水分解
に対する感受性に基づいて淋菌において証明されている
（Ｂｌａｋｅ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３３：２
１２−２２２，１９８１）。この分類は血清群パターン
（Ｓａｎｄｓｔｒｕｍ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
３５：２２９−２３９，１９８２；Ｓａｎｄｓｔｒｕｍ
等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３８：４６２−４７
０，１９８２）および病因と関連のあることが分かっ
た。タンパク質ＩＡを発現する淋菌は全身感染に関係し
ており、一方タンパク質ＩＢを発現するものは局所感染
と関係している（Ｂｕｃｈａｎａｎ等、Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｉｍｍｕｎ．３２：９８５−９９４，１９８１；Ｈｉｌ
ｄｅｂｒａｎｄｔ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２
０：２６７−２７３，１９７８）。可能性のあるワクチ
ン候補としてのＰＩの開発に払われたあらゆる注意にも
かかわらず、まだＰＩに基づく有効なワクチンはつくら
れていない。さらに、その生産を制御する遺伝子配列も
まだ何ら解明されておらず、このタンパク質の構造につ
いてはほとんど知られていない。本発明は完全なＰＩ遺
伝子配列、ＰＩＡ構造遺伝子、およびクローン化遺伝子
産物について初めて説明するものである。さらに、新規
なＰＩＢ遺伝子配列と、これらの配列から誘導された特
異なＰＩＡ−ＰＩＢキメラについても説明する。後者の
キメラはエピトープマッピングの際に有用であり、ワク
チン開発の基礎となるものである。 ２．３．診断用プローブ この疾患に関して広範囲にゆきわたったもう一つの面は
早期検出および診断の重要性である。淋疾の診断に利用
できる標準的な細菌学的試験法はもちろんあるが、かか
る試験法は培養下のバクテリアの増殖を当てにしてお
り、時間がかかり、しかも一般にあまり特異的でない。
ナイセリア・ゴノロエアエは種々の血清型を有すること
が知られており、このことは前節で説明したように、こ
の疾患の非常に明確なパターンを示すものでありうる。
この疾患の適切な治療を行うためには、診断が迅速であ
るばかりでなく、できるだけ正確であることが決定的に
重要である。ＤＮＡ−およびＲＮＡ−プローブ技術の発
達により、診断における多くのかかる問題に対する解答
が与えられた。ブローブは代表的には対象となる特定遣
伝子の全部または一部と相補性であるＤＮＡまたはＲＮ
Ａの放射性標識された一本鎖であり、従って、相補性核
酸の一本鎖にさらされると、それにハイブリダイズする
であろう。ブローブはサザンブロッティングとして知ら
れる技法で用いられ、その場合対象遺伝子を含有する疑
いのある検体からのＤＮＡ断片をアガロースゲルで分離
し、変性させて一本鎖を生成させ、次にニトロ−セルロ
ースフィルターに移行させる。ここでそれらを予め選択
された標識されたプローブとインキュベートすると、そ
のものは相補鎖にハイブリダイズして、その標識により
目的遺伝子の存在が確認されよう。この種のプローブは
また、宿主細胞中の全ゲノムのＤＮＡ断片をクローニン
グすることにより確立されたゲノムライブラリーから、
対象遺伝子を含有する特定クローンを同定する際にも有
利に使用できる。ナイセリア・ゴノロエアエに関連して
開発された便利で、高度に正確なプローブ系はこれまで
存在していない。
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｎ．ゴノロ
エアエの数種類のオリゴヌクレオチドプローブを提供す
ることを目的とする。それらのうちのあるものは一般に
Ｎ．ゴノロエアエのプロテインＩにハイブリダイズする
が、他のバクテリアにはハイブリダイズせず、そして他
のものはＰＩＡ抗原のみを発現するＮ．ゴノロエアエ血
清型に特異的である。こうして、淋菌感染を検出するた
めの信頼できる診断方法が提供されるばかりでなく、個
人が感染している可能性のある特定のカテゴリーの確認
方法も提供される。それらの方法を提供することも本発
明の目的である。
エアエの数種類のオリゴヌクレオチドプローブを提供す
ることを目的とする。それらのうちのあるものは一般に
Ｎ．ゴノロエアエのプロテインＩにハイブリダイズする
が、他のバクテリアにはハイブリダイズせず、そして他
のものはＰＩＡ抗原のみを発現するＮ．ゴノロエアエ血
清型に特異的である。こうして、淋菌感染を検出するた
めの信頼できる診断方法が提供されるばかりでなく、個
人が感染している可能性のある特定のカテゴリーの確認
方法も提供される。それらの方法を提供することも本発
明の目的である。
【課題を解決するための手段】３．発明の要約
ナイセリア・ゴノロエアエのプロテインＩＡおよびプロ
テインＩＢの完全なヌクレオチド配列、並びにそれらの
予測されるアミノ酸配列が開示される。また、単細胞宿
主生物中でＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子をクローニングし
て発現させるための、並びにＰＩＡ−ＰＩＢキメラタン
パク質産物をクローニングして発現させるための方法お
よび組成物も開示される。さらに、新規な宿主生物を培
養して遺伝子産物を生産させる方法も開示される。用い
られた組換えＤＮＡ法の生産物は、淋疾を予防するため
のワクチン組成物において免疫原として全体または抗原
部分を使用するのに適している。ＰＩＡおよびＰＩＢ遺
伝子は新規なオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ断片
とのハイブリダイゼーションにより細菌ゲノムから単離
された。一旦特定のＤＮＡセグメントがつきとめられた
らそのヌクレオチド配列を決定しそしてアミノ酸配列が
予測された。次にそれぞれの遺伝子を、その遺伝子の複
製単位として作用するプラスミドクローニングベクター
に挿入した。次にこの組換えプラスミドを用いて適合性
宿主細胞を形質転換し、それにより遺伝子産物が発現さ
れる。また、発現された産物の単離方法およびワクチン
組成物への各産物の製剤化法もここに開示される。特
に、ハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を包含する
ワクチン組成物が提唱される。さらに、ＰＩＡおよびＰ
ＩＢ遺伝子のヌクレオチド配列の決定に基づいて、本発
明は淋菌感染の検出および診断に有用なオリゴヌクレオ
チドプローブの配列をも提供するものである。これに関
して、本発明はまた、ここに記載のオリゴヌクレオチド
プローブの１種またはそれ以上を含有する診断試験キッ
トをも提供する。 ４．図面の説明 第１図：Ｒ１０株のＰＩの残基１−１２のアミノ酸配
列、縮重塩基を含むコード化ｍＲＮＡ、および合成され
たオリゴヌクレオチド。縮重が存在する場合は、塩基配
列の決定がなされた他の淋菌遺伝子からのコドン利用デ
ータに基づいて塩基配列を選択した。 第２図：ＰＩ遺伝子部分を含むＦＡ１９ゲノムＤＮＡの
Ｓａｕ３ＡＩおよびＴａｑＩ断片。この断片をベクター
プラスミドｐＧＥＭ−２にクローン化して、ここに示す
名称の組換えプラスミドを得た。ゲノム上のＰＩコード
領域の相対的な位置は断片の上の空白ボックスで示し
（斜線ボックスはＮ末端シグナル配列に相当する）、オ
リゴヌクレオチドプローブの相対的位置を断片の下に示
す。 第３図：ＦＡ１９のＰＩ遺伝子のＤＮＡ配列。予測され
るアミノ酸配列をＤＮＡ配列の上に示し、そしてリボソ
ーム結合部位（ＲＢＳ）、およびｐＵＮＣ７の作製に用
いられるＴａｑＩおよびＳａｕ３ＡＩ部位、およびＨａ
ｅＩＩＩ部位（−３５および−１０）が示される。各行
の最後の塩基の番号を右側に示す。 第４図：Ｎ．ゴノロエアエの主要な外層膜タンパク質、
ＰＩ、ＰＩＩおよびＰＩＩＩ、並びに大腸菌ポーリンＯ
ｍｐＦおよびＯｍｐＣのハイドロパシー（ｈｙｄｒｏｐ
ａｔｈｙ）パターン；ｓｐ−シグナルペプチド；ａ．
ａ．−アミノ酸残基。 第５図：ｐＵＮＣ７の作製工程図。ＰＩ遺伝子プロモー
ターの−３５および−１０領域間の好都合なＨａｅＩＩ
Ｉ部位により−３５領域および上流配列を除去でき、次
にＰＩ遺伝子をファージＴ７プロモーターの制御下にベ
クタープラスミドｐＧＥＭ−２に挿入した。太い線はｐ
ＧＥＭ−２ＤＮＡを、そして細い線はＦＡ１９ＤＮＡを
表す。ＰＩ’−ＰＩ遺伝子部分（点線はこの遺伝子の欠
失セグメントの方向を示す）；ＰＴ７−ファージＴ７プ
ロモーター；ＭＣＳ−多重クローニング部位；制限酵素
部位：Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ、Ｈ−ＨａｅＩＩＩ、Ｂ−Ｂａ
ｍＨＩ、（Ｈ）−ＨａｅＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩ接合点
（部位は存在せず）、Ｔ−ＴａｑＩ。 第６図：ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるｐＵＮＣ７上のＰ
Ｉ遺伝子の発現。Ａ：全細胞溶解物の１５％ゲル上にお
けるＮａＤｏｄＳＯ4−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、クーマシーブルーで染色。マーカータンパク質の寸
法を左側に示す。ＰＩが示されており、そして中央の矢
印はレーン４では明らかに失われているタンパク質を示
す。Ｂ：６種類のＰＩＡ ＭＡｂを用いて検索したＡに
おけるゲルのウエスターンブロットのオートラジオグラ
フ。レーン１：ＦＡ１９；レーン２：ＩＰＴＧなしで１
６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；レー
ン３：ＩＰＴＧを用いて３時間増殖させたＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）ｐＵＮＣ７；レーン４：ＩＰＴＧを用いて１６時
間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；レーン
５：ＩＰＴＧなしで１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ
３）ｐＧＥＭ−２；レーン６：ＩＰＴＧを用いて１６時
間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧＥＭ−２。 第７図：ＦＡ１９のＰＩ構造遺伝子に隣接したｍＴｎ３
− 表す。ｍＴｎ３−ＣＡＴは長さが１．６６ｋｂであり、
尺度に応じて描かれていない。ＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１の
ゲノム上のＰＩ遺伝子の位置は線上の空白ボックスで示
され、斜線ボックスはシグナル配列を示す。ＰＩ’：ク
ローン化構築物中に存在するＰＩ遺伝子部分。制限酵素
部位：Ｎ−ＮｏｔＩ；Ｂ−ＢａｍＨＩ；Ｓ−Ｓａｕ３Ａ
Ｉ。 第８図：ＰＩ遺伝子の配列決定のためにクローン化した
ＭＳ１１ ＤＮＡの断片。ＰＩ遺伝子の位置は線上の空
白ボックスで示され、斜線ボックスはシグナル配列を示
す。オリゴヌクレオチドＮＣ１およびＮＣ１２の配列の
位置が示してある。大きい方の断片はベクタープラスミ
ドｐＧＥＭ−３にクローン化され、小さい方の断片はλ
ｇｔ１１中にクローン化して、表示した名称の構築物と
なした。制限酵素部位：Ｈｆ−ＨｉｎｆＩ；Ｋ−Ｋｐｎ
Ｉ；Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ；Ｈｃ−ＨｉｎｃＩＩ。 第９図；ＭＳ１１のＰＩＢ遺伝子のＤＮＡ配列。予測さ
れるアミノ酸配列はＤＮＡ配列の上に示してあり、シグ
ナルペプチドも示される。推定ブロモーター配列（−３
５および−１０）およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）
も示され、関連する制限酵素部位も同様に示される。各
行の最後の塩基の番号を右側に示す。Ｒ１０のＰＩＢ配
列（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ等、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８４：
８１３５−８１３９，１９８７）との相違を示すため
に、塩基（制限酵素部位を構成するものを除く）には下
線が引いてあり、アミノ酸は丸で囲ってある。 第１０図：ＦＡ１９ ＰＩＡおよびＭＳ１１ ＰＩＢのア
ミノ酸配列の比較、並びにハイブリッドＰＩ遺伝子の構
造。ＰＩＡ遺伝子配列は白の捧で、そしてＰＩＢは黒の
棒で示す。ＰＩ遺伝子類の上と下はアミノ酸配列の比較
であり、垂直線は１個の相違に相当し、黒のブロックは
連続して広がった相違に相当する。アミノ酸残基の数は
上の目盛で示され、そして塩基対の数は下の目盛で示さ
れる。ハイブリッドを分析するのに使用されたオリゴヌ
クレオチドはこれらの遺伝子の間に示してあり、点線は
他の遺伝子上の等しい位置を示す。ハイブリッド遺伝子
構造（クラス１−９）を下に示し、交差が起こったオリ
ゴヌクレオチド配列間の領域を傾斜域で表す。種々のハ
イブリッドクラスのＰＩ血清型を第１表に示す。 第１１図：全細胞溶解物の１５％ゲル上でのＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシーブルー
染色を用いて検出した、ＢＬ２１（ＤＥ３）中における
ｐＵＮＣＨ２５上のＰＩＢ遺伝子の発現。ＰＩタンパク
質バンドが示してある。レーン１：ＭＳ１１；レーン
２：ＩＰＴＧなしで増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵ
ＮＣＨ２５；レーン３−５：ＩＰＴＧを用いて増殖させ
たＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣＨ２５。ＩＰＴＧ（５０
μｇ／ｍｌ）は下記細胞密度すなわちレーン３：５×１
０8細胞／ｍｌ；レーン４：１０9細胞／ｍｌ；レーン
５：２×１０9細胞／ｍｌで増殖培地に加えた。ＰＩの
発現は生長周期の早期に培養物が誘導された場合に最大
である。 ５．発明の説明 本発明は、淋疾感染予防用のワクチン組成物の製造に有
用なＮ．ゴノロエアエＰＩＡ、ＰＩＢ、およびキメラＰ
ＩＡ／ＰＩＢタンパク質の使用に関する。これらのタン
パク質は組換えＤＮＡ技術または化学的合成法により製
造できる。以前には適当なＮ．ゴノロエアエ株からの化
学的単離法を使用することが可能であったが、この方法
はワクチン接種後に阻止（抗防御）抗体を惹起するある
種の他の淋菌タンパク質による汚染を生じうる。ＰＩタ
ンパク質は抗体の生成を刺激することが知られているの
で、Ｎ．ゴノロエアエによる感染から被接種者を効果的
に防御する免疫原として、そのタンパク質全体またはそ
の免疫原部分を使用することができる。ここに記載の組
換えプラスミドにより、安定で宿主細胞による分解に対
し抵抗性を有する大量のＰＩタンパク質を宿主細胞中に
産生させることができ、その結果ワクチン組成物に適す
る物質の豊富な供給原が得られる。このワクチン製剤は
他の抗防御性淋菌タンパク質による汚染がない。本発明
を説明するために、本発明にいくつかの工程に分けて以
下に論ずる、すなわち：１）ＰＩＡ遺伝子または遺伝子
断片の同定および単離；２）適合性宿主細胞の形質転換
に用いられる適当なクローニングベクターへの遺伝子ま
たは遺伝子断片の挿入；３）その遺伝子を複製させ発現
させる形質転換宿主細胞の同定および増殖；および４）
遺伝子生産物の同定および精製。本発明によれば、ＰＩ
タンパク質は第３図または第９図のクローン化配列、も
しくはそのハイブリッドを適切なクローニング／発現ベ
クターに挿入し、適当な宿主細胞を形質転換し、次に遺
伝子産物を同定および精製することにより生産されるう
る。あるいはまた、第３図または第９図の推定アミノ酸
配列部分、またはそのハイブリッドは当分野でよく知ら
れた化学的合成技術を用いて合成することもできる。ま
た、ＰＩＡおよびＰＩＢ配列に基づくオリゴヌクレオチ
ドもここに開示され、これらのオリゴヌクレオチドはサ
ザンブロット、ドットブロット、スロットブロットなど
のハイブリダイゼーションの技術によるＮ．ゴノロエア
エ感染の確認および診断に有用である。 ５．１．ＰＩＡ遺伝子の同定、単離、および配列決定 ＰＩＡタンパク質のヌクレオチドコード配列は第３図に
示される。すでに述べたように、ＰＩＡタンパク質はす
べてのＮ．ゴノロエアエによって生産されるわけではな
い；任意の所定の株はＰＩＡまたはＰＩＢのいずれかを
生産するが両方は生産しないであろう。ＰＩＡの存在は
淋菌血清群Ｉ、血清型Ｉ−３、と関係があり、従って血
清型１−３と関連のある淋菌株はどれもＰＩＡ ＤＮＡ
源として使用できる。既知のＮ．ゴノロエアエ株の中
で、ＰＩＡにより特徴づけられる株はＦＡ１９、ＦＡ１
３０、Ｗ−Ｕｅ、Ｂ−２、Ｇ−７、５０２９、Ｒ−１
１、Ｅ−５、Ｄ−４、Ｖ−１５である（Ｋｎａｐｐ等、
Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１５０：４４−４８，１９８
４）。本発明の実施において、第３図に示す配列は種々
の方法で得ることができる。例えば、ひとたび適当なＰ
ＩＡ含有株が定められたら、その生物のＤＮＡを単離
し、ＤＮＡ断片を生成させ、そしてＰＩＡ遺伝子配列を
含有する断片を同定することが必要である。あるいはま
た、その遺伝子または遺伝子セグメントは合成すること
ができよう。Ｎ．ゴノロエアエＤＮＡは多くの異なる方
法で断片化しうる；最も好ましい方法はＤＮＡを特定の
配列で切断する制限酵素での処理である。その他の方法
にはマグネシウムの存在下でのＤＮａｓｅによるＤＮＡ
の処理、または音波処理のような物理的破壊が含まれ
る。制限酵素を用いる場合、ＤＮＡを処理するのに１種
類の酵素または酵素類の組合せを用いることができる。
唯一の必要条件は、核酸の消化がＰＩＡの抗原部位をコ
ードする領域を破壊しないということである。断片化
後、線状ＤＮＡの個々の断片を、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＰＡＧＥ）、アガロースゲル、またはカラ
ムクロマトグラフィーのような多数の既知技法の任意の
ものを用いて、大きさに基づいて分離する。分離した断
片によりプラスミド作製および形質転換のための遺伝子
物質が提供される。対象となる遺伝子配列を含有するＤ
ＮＡ断片の同定は多くの方法により達成できる。例え
ば、モノクローナル抗体のような免疫試薬が使用されう
る。ＰＩＡに対するモノクローナル抗体は数多く誘導さ
れており（Ｔａｍ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏ．３
６：１０４２−１０５３，１９８２）、そしてこれらは
種々のＤＮＡ断片により形質転換されたそれぞれの宿主
細胞から生産された産物を検査するのに使用されうる、
すなわちＰＩＡモノクローナル抗体と反応する産物によ
り、ＰＩ遺伝子を含有する断片で形質転換された細胞が
同定される。また、ＤＮＡ断片の塩基配列決定によりそ
れぞれのアミノ酸配列を予測でき、次に既知の任意の部
分アミノ酸配列と比較して、相当するＤＮＡ配列を含有
する断片を同定することができる。もう１つの一般的技
法はサザンブロッティングである（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７８：５０３，１９７５）。この
方法では、制限断片をゲル上の適所で変性し、そしてブ
ロッティングにより固形基質代表的にはニトロセルロー
スフィルターに移す。次に、フィルターをこのタンパク
質の既知のまたは仮定した部分ＤＮＡ配列を含有する放
射性標識オリゴヌクレオチドにさらす。選択されたオリ
ゴヌクレオチドと相補性であるブロットされたＤＮＡが
それにハイブリダイズしてそれによりＰＩ遺伝子を含有
するＤＮＡ断片の大きさが確認されよう。以下に詳述す
る実施例において、ＰＩＡをコードする遺伝子は２種の
新規なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション
により同定および単離された。ＰＩＢのＮ末端アミノ酸
部分の既知配列（Ｂｌａｋｅ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ．３６：２７７−２８５，１９８２；Ｂｌａｋｅ，
Ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ，
Ｇ．Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ編、２５１−２５８，１９８
５，ＡＳＭ）、および既知ＤＮＡ配列を有する種々の他
の淋菌タンパク質に伴うコドン使用規則に基づいて、有
用なオリゴヌクレオチドを推定する試みがなされた。特
に、次のようなＮＣ１およびＮＣ２と呼ばれる２つの配
列が作製された： サザンブロットハイブリダイゼーションで用いられる場
合、上記のオリゴマーは淋菌ゲノムから得られたＤＮＡ
制限断片をスクリーニングするのに使用された；両方の
プローブともＰＩＡ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を同定
することに成功した。同定された遺伝子がＰＩＡ遺伝子
であることの証明は、遺伝子産物の分子量と天然タンパ
ク質の分子量との比較、およびＰＩＡ特異的モノクロー
ナル抗体のその免疫反応性により行われた。しかしなが
ら、この有用性のほかに、これらのオリゴヌクレオチド
はそれぞれ淋菌のＰＩＡおよびＰＩＢ株の両方とハイブ
リダイズしうることも確認された。従って、これらの正
常な化合物は悩める個体のＮ．ゴノロエアエ感染の検出
および同定に、サザンブロットハイブリダイゼーション
において診断用プローブとして使用することもできる。
ＰＡ遺伝子を含有する断片の同定に続いて Ｓａｎｇｅ
ｒ（ＰＮＡＳ ＵＳＡ７４：５４６３−５４６７，１９
７７）の方法に従って関連部分の塩基配列が決定され
る。Ｓａｎｇｅｒの方法はＤＮＡ鋳型からの相補性ＤＮ
Ａ鎖の酵素による合成を利用するものである。相補鎖の
合成はデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）の取込みに
より停止される。４つの別々の反応（それぞれｄｄＡＴ
Ｐ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、またはｄｄＴＴＰを含
有）が行われ、その結果４組のＤＮＡ断片が形成され、
所定の組の各断片はその末端に特定のジデオキシヌクレ
オチドをもつであろう。次にＤＮＡ断片をポリアクリル
アミドゲル上で分離し、各断片の末端ヌクレオチドの同
一性の知識よりその塩基配列を決定しそして最短断片か
ら最長断片までを読み取る。鋳型として用いられる一本
鎖ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼで化学
的に処理すると得られる。しかしながら、Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：３０
９，１９８１）がクローニングベクターとして開発した
Ｍ１３ｍｐクローニングベクターを使用することがより
効果的である。Ｍ１３は一本（＋）鎖ＤＮＡを含有する
大腸菌の雄菌特異的線維状バクテリオファージである。
この（＋）鎖は相補性（−）鎖合成用の鋳型として使用
される。二本鎖型のＤＮＡが複製型すなわちＲＦ型であ
り、細胞あたり約２００コピーに増殖する。この二本鎖
型を細胞から分離してクローニングベクターとして使用
できる。いったん増殖が止まると、２本の鎖のうち一方
のみが産生され続け、そして一本鎖がファージ粒子に組
み込まれる。Ｍ１３の利点は、粒子がクローン化した鎖
の一方に相同な一本鎖ＤＮＡを有しており、それ故にＳ
ａｎｇｅｒ法における鋳型として使用できる点にある。
３５０塩基までの塩基配列を単一クローンから決定で
き、これよりも長い断片の塩基配列決定は重複する断片
の塩基配列を解析することにより達成できる。前記技法
を使用するすることにより、第３図に示したＰＩＡ遺伝
子のヌクレオチド配列が得られた。第３図には推定アミ
ノ酸配列も示してある。ＰＩＡ遺伝子の塩基配列決定
（重複する断片の塩基配列を別々に決定することにより
達成された）によりさらに２つの他のオリゴヌクレオチ
ドプローブの同定および作製ができた。両プローブは次
の配列を有する１７ヌクレオチドオリゴマーである： ＮＣ８：５’ＧＣＧＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＡＣＣ３’ および ＮＣ１１：５’ＣＧＧＴＧＴＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＣ３’ これらのプローブは両方ともＰＩＡ遺伝子のみに特異的
であって、ＰＩＢ ＤＮＡ配列にはハイブリダイズしな
い。従って、これらのプローブは共に感染にＰＩＡ生物
によるか、ＰＩＢ生物によるのかを判断する診断試験に
おいて有用である。先に述べたように、これらのタンパ
ク質の各々は全身的かまたは局所的の淋菌感染の特定パ
ターンを示し、従って感染患者の治療プログラムを計画
する上で非常に重要でありうる。単離した遺伝子または
化学的に合成したＤＮＡ配列は形質転換宿主細胞の増
殖、形質転換細胞からの組換えＤＮＡの単離、および単
離した組換えＤＮＡからの挿入遺伝子の回収により、さ
らに遺伝子コピーを生成されるのに使用されうる。 ５．２．ＰＩＢ遺伝子の同定、単離および配列決定 ＰＩＢタンパク質のヌクレオチド配列を第９図に示す。
この配列はＮ．ゴノロエアエＭＳ１１株から単離され
た。ＰＩＢの存在は血清群４−９と関係しており、これ
らの血清群と関連した株はどれもＰＩＢ ＤＮＡの供給
源として使用できる。既知の淋菌株中で、ＰＩＢの存在
により特徴づけられる株はＭＳ１１、ＦＡ６１４０、Ｆ
６２およびＲ１０である。ＰＩＢタンパク質の調製、同
定、および配列決定の技術は前記５．１節で説明したＰ
ＩＡタンパク質に適用した手法と実質的に同じである。
ＰＩＢ遺伝子の詳細な同定は、ＮＣ１およびＮＣ１２プ
ローブ（５’−ＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＴＣ−
３’）の使用、並びにハイブリッドＰＩタンパク質のＰ
ＩＢ部分にあるＫｐｎＩ制限部位の同定（Ｄａｎｉｅｌ
ｓｓｏｎ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５２９
−５３３，１９８６）により助けられた。ＰＩＡと同様
にこの遺伝子のクローニングはクローニングベクターに
重複配列を別々にクローニングすることにより達成され
た。 ５．３．組換えＤＮＡ技術によるＰＩＡ、ＰＩＢまたは
ＰＩＡ／ＰＩＢハイブリッドの生成 ＰＩＡのヌクレオチドコード配列を第３図に示す。ＰＩ
Ｂのヌクレオチドコード配列を第９図に示す。本発明の
実施において、ヌクレオチド配列またはその機能上の同
等物がＰＩＡまたはＰＩＢ生成物の発現を指示する組換
え分子中に組み込まれる。また、第３図および第９図か
ら誘導されたハイブリッド配列を作製してハイブリッド
ＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を生産させることもできる。
ヌクレオチドコード配列の縮重ゆえに、第３図または第
９図に示したと実質的に同じアミノ酸配列をコードする
他のＤＮＡ配列も、ＰＩＡまたはＰＩＢをクローニング
および発現させるために本発明の実施においてそれぞれ
使用することができる。第３図または第９図のヌクレオ
チド配列のかかる変更には種々のヌクレオチド残基の欠
失、付加または置換が包含され、同一のまたは機能的に
等価の遺伝子生成物をコードする配列が生成される。そ
の遺伝子産物はアミノ酸残基の欠失、付加または置換を
含有できる。置換は関与する残基の極性、電荷、溶解
度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に
基づいて行われうる。例えば、負に荷電したアミノ酸に
はアスパラギン酸およびグルタミン酸が包含され、正に
荷電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが包含さ
れる。同様の親水値を有する非荷電極性ヘッド基または
非極性ヘッド基をもつアミノ酸には次のものが包含され
る、すなわちロイシン、イソロイシン、バリン；グリシ
ン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、ト
レオニン；フェニルアラニン、チロシン。 ５．３．１．ＰＩ遺伝子クローニング／発現ベクターの
作製 第３図に示すＰＩＡ遺伝子配列、第９図に示すＰＩＢ遺
伝子配列、およびハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢ配列、も
しくはこれらの機能的同等物は適当なクローニング発現
ベクターに挿入できる。終局的に挿入遺伝子の転写およ
び翻訳を達成するためには、その遺伝子は選ばれた宿主
細胞と適合するプロモーターの制御下に置かねばならな
い。プロモーターとはＲＮＡポリメラーゼが結合して転
写を開始するＤＮＡの領域である。選ばれるプロモータ
ーは宿主細胞生物から単離されたいずれのものでもよ
い。例えば、宿主系として通常用いられる大腸菌は菌そ
れ自体と、またはそのバクテリオファージと、もしくは
そのプラスミドと関連した、ｌａｃまたはｒｅｃＡプロ
モーターのような多数のプロモーターを有する。またラ
ムダファージＰＬおよびＰＲプロモーターのような、合
成的にまたは組換えにより作られたプロモーターを使用
して、それに隣接するＤＮＡセグメントの高レベル生産
を誘導することもできる。遺伝子を効率よく転写および
翻訳させるには、開始シグナルも必要である。例えば大
腸菌のｍＲＮＡでは、リボソーム結合物には翻訳開始コ
ドン（ＡＵＧまたはＧＵＧ）および１６ＳリボソームＲ
ＮＡの３’末端の塩基と相補性であるもう１つの配列が
包含される。後者の配列（シャイン−ダルガルノまたは
Ｓ−Ｄ配列）のいくつかは大腸菌や他の適当な種類の宿
主細胞において確認されている。宿主細胞系と適合しう
る任意のＳＤ−ＡＴＧ配列が使用できる。これらには大
腸菌ファージラムダのｃｒｏ遺伝子またはＮ遺伝子、あ
るいは大腸菌のトリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ、ＢまたはＡ
遺伝子が含まれるが、それらに限定されるわけではな
い。インビトロでＤＮＡ断片をクローニングベクターに
挿入する方法は数多く存在する。ＤＮＡリガーゼは二重
ＤＮＡ鎖中の隣接ヌクレオチド間の一本鎖ニックを閉じ
る酵素である；従って、この酵素はある種の制限酵素に
より生成された付着末端同士を共有結合で連結させるの
に使用することができる。また、ＤＮＡリガーゼを使用
して平滑末端間のホスホジエステル結合の形成を触媒す
ることもできる。最後に、酵素ターミナルデオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼを用いて断片の末端で
３’ホモポリマー一本鎖尾部を形成させることができ
る。すなわち第一の分子の３’末端にオリゴ（ｄＡ）配
列を、そして第二の分子の３’末端にオリゴ（ｄＴ）配
列を付加することにより、２種類の分子がアニーリング
して環状ダイマーを形成させることができる。これらの
方法のどれを使っても、遺伝子セグメントプロモーター
および他の制御エレメントをベクターの特定部位に連結
することが可能である。こうして、ＰＩタンパク質をコ
ードする遺伝子がベクタープロモーターおよび制御エレ
メントに対して特別の関係で所定のベクターに連結さ
れ、その結果前記配列はベクターＡＴＧ配列に関して正
しい読み枠で挿入される。使用されるベクターは形質転
換細胞を同定しうるよう代表的にはアンピシリン耐性ま
たはテトラサイクリン耐性のようなマーカー機能を有し
ていよう。使用するベクターは既知の発現ベクターまた
はそれらの誘導体のいずれであってもよい。最も頻繁に
用いられるベクターはプラスミドベクター（例．ｐＢＲ
３２２、ｐＡＣ１０５、ｐＶＡ５、ｐＡＣＹＣ１７７、
ｐＫＨ４７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＢ１１０、ｐｍＢ
９、ｐＢＲ３２５、Ｃｏｌ Ｅｌ、ｐＳＣ１０１、ｐＢ
Ｒ３１３、ｐＭＬ２１、ＲＳＦ２１２４、ｐＣＲ１また
はＲＰ４）；バクテリオファージベクター（例．ラムダ
ｇｔ１１、ラムダｇｔ−ＷＥＳ−ラムダＢ、Ｃｈａｒｏ
ｎ２８、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、ラムダｇｔ−１−ラムダＢ
Ｃ、ラムダ−ｇｔ−１−ラムダＢ、Ｍ１３ｍｐ７、Ｍ１
３ｍｐ８、Ｍ１３ｍｐ９）；ＳＶ４０およびアデノウイ
ルスベクター、並びに酵母ベクターである。 ５．４．ＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子生成物の同定および
精製 先に述べたように、ＰＩＡおよびＰＩＢをコードする遺
伝子セグメントは本来は上記の新規なオリゴヌクレオチ
ド配列とのハイブリダイゼーションにより同定された。
選択された断片がＰＩＡをコードする構造遺伝子である
という同一性は、天然ＰＩＡとの分子量比較により、お
よびコロニーラジオイムノアッセイで試験された６種類
すべてのＰＩＡモノクローナル抗体との反応性により証
明された。ＰＩＢ生成物の同一性もＰＩＢ特異的モノク
ローナル抗体との反応により証明された。クローン化Ｐ
ＩＡまたはＰＩＢ遺伝子を発現する大腸菌宿主細胞は、
適切なモノクローナル抗体と反応するＰＩタンパク質を
豊富に産生する。ＰＩＡタンパク質の精製操作はＴｅｅ
ｒｌｉｎｋ等（Ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｎｅｉｓ
ｓｅｒｉａ，Ｇ．Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ編、２５９−２６
４，１９８５，ＡＳＭ）に詳細に記載されている。 ５．５．ＰＩＡ／Ｂハイブリッドの作製 本発明に関連して、多数のハイブリッドＰＩＡ／Ｂ遺伝
子配列およびタンパク質が作られた。ハイブリッド遺伝
子はＳｅｉｆｅｒｔ等（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ，Ｖｏｌ．８，ｐ．１２３−１３４，Ｓｅｔｔｉｎ
等編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８６；ＰＮＡＳ
ＵＳＡ ８３：７３５−７３９，１９８６）に従って改
良されたシャトル突然変異誘発法を用いて、ＰＩＡ産生
株にＰＩ遺伝子に隣接して選択マーカーを挿入すること
により作製された。この場合、選択マーカーは選択可能
なクロラムフェニコール耐性（Ｃｍr）を付与するクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）遺伝子であった。次にＣＡＴ ＤＮＡを含有するＰ
ＩＡ株をＰＩＢ含有受容株を形質転換するためにＤＮＡ
供与株として使用した。相互交雑（ｒｅｃｉｐｒｏｃａ
ｌ ｃｒｏｓｓ）も行われた。推定上のハイブリッドは
Ｃｍrで選択し、イムノブロッティングでＰＩについて
調べて同定した。次の形質転換体すべてが観察された：
（１）供与株ＤＮＡが存在した、または（２）受容株Ｄ
ＮＡが保持されていた、または（３）そのＤＮＡがどち
らの親のＤＮＡとも相違していた。真のハイブリッドＰ
ＩＡ／Ｂ株は程良く高い頻度で両方の種類の交雑におい
て発生し、多くの異なる血清型が同定可能であった。こ
れらのハイブリッド遺伝子およびタンパク質を入手でき
ることにより、既知モノクローナル抗体のエピトープの
位置を解明することができ、また防御抗体の生産を誘導
することが知られているエピトープ（従って、有用なワ
クチンの開発において最も重要なエピトープである）を
含有するＰＩＡ／Ｂハイブリッドタンパク質の同定、そ
して最終的にはその合成による構築が可能となった。こ
れらのハイブリッドの作製および同定の細部については
以下の７節で述べることにする。 ５．６．合成法によるＰＩＡ、ＰＩＢおよびハイブリッ
ドタンパク質の製造 もう一つの態様においては、第３図および第９図に示し
た遺伝子配列によりコードされるタンパク質並びにそれ
ぞれの一部を含有するキメラタンパク質を当分野でよく
知られた技法を使って化学的に容易に合成できる（Ｊ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ：３
６１，１９８６）。最終実施においては、タンパク質配
列内部の防御エピトープが同定されると、その分子の単
離された活性領域のペプチド合成によりワクチン製造用
の基本物質の単純で比較的安価な製造方法が提供され
る。ペプチド合成の使用はまた、ハイブリッドＰＩＡ／
ＰＩＢタンパク質の、または、好ましくはＰＩＡとＰＩ
Ｂタンパク質の両方の防御エピトープを含有する合成ペ
プチドの便利な構築手段を提供するものてある。従っ
て、本発明は開示した配列による、遺伝子組換えにより
製造されたタンパク質および合成的に製造されたタンパ
ク質の両方を包含するものである。また、完全なタンパ
ク質の断片、好ましくは親タンパク質分子の抗原性を保
持する断片、そして最も好ましくは防御抗体の生産を惹
起するエピトープを含有する断片も本発明に包含され
る。さらに、配列内の１個またはそれ以上のアミノ酸残
基を化学的に同等のアミノ酸で置き換えることによっ
て、完全なタンパク質およびペプチド断片配列内で置換
を行うことが可能であることも認識されよう；例えば、
アスパラギン酸およびグルタミン酸のような負に荷電し
た残基は相互交換でき、リジンやアルギニンのような正
に荷電した残基も同様に交換できる。疎水性残基にはト
リプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイ
シン、バリンおよびアラニンが包含される。既知配列か
らのある種の欠失または既知配列への付加を行い、しか
もまだ所望の抗原活性を保持させることも可能である。
これらの２種のタンパク質の配列に関する本情報が与え
られたことにより、分子を適当に改変しかつ活性が保持
されているかどうか判定することは当分野の技術の範囲
内である。従って本発明はさらに、クローン化したもの
であろうと合成的に製造したものであろうと、親分子の
抗原性が実質的に保持されている請求したタンパク質の
相同物、類似物、および断片を包含するものである。 ５．７．ワクチンの製剤 精製された形態の遺伝子産物または合成によるＰＩＡペ
プチドは淋菌感染予防用のワクチン組成物を調製するの
に有用である。完全なＰＩＡタンパク質またはその任意
の活性断片がこの種の組成物中で免疫源物質として使用
できる。遺伝子生成物が融合タンパク質の一部分として
発現された場合には、そのタンパク質を全体として使用
できるしあるいは宿主細胞タンパク質を切断して非融合
ＰＩＡタンパク質を生成させることもできる。組換えＤ
ＮＡ技術により作られたＰＩＡタンパク質は標準的なタ
ンパク質分離法を用いて宿主細胞から分離できる。次に
精製タンパクを通常使用される任意の医薬上許容しうる
担体例えば水、生理食塩水、エタノール、ポリオール
（例．グリセロール、プロピレングリコール）、または
植物油、並びに当分野で知られた任意のワクチンアジュ
バントと組み合わせる。ＰＩＡ産物はまたワクチン製剤
に使用するためにリボソーム内に取り込ませることもで
きる。ここで用いる“医薬上許容しうる担体”とはあら
ゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌
剤、等張剤、吸収遅延剤などを包含する。医薬上活性な
物質に対するかかる作用剤の使用は当分野で知られてい
る。慣用媒体が活性成分と不適合でない限り、治療組成
物中におけるその使用が意図される。補助的な活性成分
も混入できる。本発明の特に有用な実施態様は、活性免
疫原としてハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を用
いたワクチンである。ＰＩＡとＰＩＢの両方のエピトー
プを発現する。実験的に誘導された淋菌は文献（Ｄａｎ
ｉｅｌｓｓｏｎ，Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５２９−
５３３）に報告されているが、キメラタンパク質の構造
は同定されず、そのタンパク質をワクチンに使用する可
能性については全く触れられていない。かかるワクチン
により両方の種類の淋菌感染（すなわち、プロテインＩ
Ａ含有株に関連した全身感染およびプロテインＩＡまた
はプロテインＩＢ含有株に関連した局所感染）に対して
個体を免疫できるという利点が得られる。本発明に関連
して述べた特定プローブの入手可能性が示されたことに
より、かかる適当なハイブリッドタンパク質は当分野技
術者に知られた技法を使って容易に得ることができる。
原則的には、キメラ遺伝子は個々のタンパクの遺伝子を
初めに単離することにより作製できる。本発明のＰＩＡ
特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いたＰＩＡ遺伝
子の単離方法はすでに上で説明した。同様の操作がＰＩ
Ｂ遺伝子の単離および同定に使用できる。ＰＩＢタンパ
ク質のみを産生する菌株例えばＭＳ１１、Ｒ１０、ＦＡ
６１４０、Ｆ６２などが多数同定されている。上記の非
ＰＩＡ特異的ＤＮＡ配列は、ＰＩＢ特異的菌株由来のＰ
Ｉ配列を含有する制限断片をＰＩＢ菌株の遺伝子ライブ
ラリーから単離するのに好都合に使用できる。正しい産
物が発現されたことの証明は、推定ＰＩＢ断片による宿
主微生物の形質転換および発現、そして任意の既知ＰＩ
Ｂ特異的モノクローナル抗体（Ｒ．Ｃ．Ｎｏｗｉｎｓｋ
ｉ，Ｋｎａｐｐ，Ｊ．Ｓ．，Ｔａｍ，Ｍ．Ｒ．，ａｎｄ
Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１
５０：４４−４８，１９８４）との反応による発現産物
の同定から得られる。ひとたび個々の遺伝子断片が単離
されたら、それらは当業上知られた任意の方法を用いて
容易にクローン化され、組み立てられる。次にＰＩＡ配
列部分を、キメラタンパク質が転写および翻訳可能な形
態（例えば、翻訳終止配列により中断されてない形態）
でコードされるように、ＰＩＢ配列部分に連結させる。
次に、全キメラ配列を選択マーカーおよび制御エレメン
トを含有するベクターに連結させることができる。次に
このベクターを用いて、回収可能な量の遺伝子生成物を
発現しうる宿主微生物を形質転換する。もちろん別法と
して出発点でＰＩＡ遺伝子をすでに含有するベクター
（例えば、大腸菌ＮＲＲＬ Ｂ−１８２６３に含有され
るプラスミド）を使用してもよい。ＰＩＢ配列を上記の
ようにして単離し、その全部または一部をプラスミド中
のＰＩＡ遺伝子に隣接してまたはＰＩＡ遺伝子の内部に
連結させて目的とするキメラ遺伝子の転写および翻訳を
行わせることもできる。しかしながら好ましくはＰＩＡ
／ＰＩＢハイブリッドは５．６節で説明したようにして
作製し、ハイブリッド遺伝子をそこから単離して形質転
換用のベクターを作製する。このようにして作製したベ
クターを使って再度宿主微生物を形質転換する。このよ
うにして、遺伝子生成物の発現によりキメラタンパク質
の供給源が提供され、このキメラタンパク質ＰＩＡまた
はＰＩＢタンパク単独と同じ方法でワクチン製剤中に容
易に配合できる。また別の実施態様においては、ワクチ
ン製剤に有用なハイブリッドタンパク質は今や配列が明
らかとなったタンパク質の防御エピトープを単離および
同定することにより合成的によって製造することもでき
る。先に述べたように、組換えキメラタンパク質が容易
に入手しうることにより、問題のエピトープをより容易
に同定でき、それにより最終的には免疫を賦与するのに
必要なハイブリッドタンパク質のその部分のみを含有す
る“簡素化された”ハイブリッドを合成方法により構築
することができる。
テインＩＢの完全なヌクレオチド配列、並びにそれらの
予測されるアミノ酸配列が開示される。また、単細胞宿
主生物中でＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子をクローニングし
て発現させるための、並びにＰＩＡ−ＰＩＢキメラタン
パク質産物をクローニングして発現させるための方法お
よび組成物も開示される。さらに、新規な宿主生物を培
養して遺伝子産物を生産させる方法も開示される。用い
られた組換えＤＮＡ法の生産物は、淋疾を予防するため
のワクチン組成物において免疫原として全体または抗原
部分を使用するのに適している。ＰＩＡおよびＰＩＢ遺
伝子は新規なオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ断片
とのハイブリダイゼーションにより細菌ゲノムから単離
された。一旦特定のＤＮＡセグメントがつきとめられた
らそのヌクレオチド配列を決定しそしてアミノ酸配列が
予測された。次にそれぞれの遺伝子を、その遺伝子の複
製単位として作用するプラスミドクローニングベクター
に挿入した。次にこの組換えプラスミドを用いて適合性
宿主細胞を形質転換し、それにより遺伝子産物が発現さ
れる。また、発現された産物の単離方法およびワクチン
組成物への各産物の製剤化法もここに開示される。特
に、ハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を包含する
ワクチン組成物が提唱される。さらに、ＰＩＡおよびＰ
ＩＢ遺伝子のヌクレオチド配列の決定に基づいて、本発
明は淋菌感染の検出および診断に有用なオリゴヌクレオ
チドプローブの配列をも提供するものである。これに関
して、本発明はまた、ここに記載のオリゴヌクレオチド
プローブの１種またはそれ以上を含有する診断試験キッ
トをも提供する。 ４．図面の説明 第１図：Ｒ１０株のＰＩの残基１−１２のアミノ酸配
列、縮重塩基を含むコード化ｍＲＮＡ、および合成され
たオリゴヌクレオチド。縮重が存在する場合は、塩基配
列の決定がなされた他の淋菌遺伝子からのコドン利用デ
ータに基づいて塩基配列を選択した。 第２図：ＰＩ遺伝子部分を含むＦＡ１９ゲノムＤＮＡの
Ｓａｕ３ＡＩおよびＴａｑＩ断片。この断片をベクター
プラスミドｐＧＥＭ−２にクローン化して、ここに示す
名称の組換えプラスミドを得た。ゲノム上のＰＩコード
領域の相対的な位置は断片の上の空白ボックスで示し
（斜線ボックスはＮ末端シグナル配列に相当する）、オ
リゴヌクレオチドプローブの相対的位置を断片の下に示
す。 第３図：ＦＡ１９のＰＩ遺伝子のＤＮＡ配列。予測され
るアミノ酸配列をＤＮＡ配列の上に示し、そしてリボソ
ーム結合部位（ＲＢＳ）、およびｐＵＮＣ７の作製に用
いられるＴａｑＩおよびＳａｕ３ＡＩ部位、およびＨａ
ｅＩＩＩ部位（−３５および−１０）が示される。各行
の最後の塩基の番号を右側に示す。 第４図：Ｎ．ゴノロエアエの主要な外層膜タンパク質、
ＰＩ、ＰＩＩおよびＰＩＩＩ、並びに大腸菌ポーリンＯ
ｍｐＦおよびＯｍｐＣのハイドロパシー（ｈｙｄｒｏｐ
ａｔｈｙ）パターン；ｓｐ−シグナルペプチド；ａ．
ａ．−アミノ酸残基。 第５図：ｐＵＮＣ７の作製工程図。ＰＩ遺伝子プロモー
ターの−３５および−１０領域間の好都合なＨａｅＩＩ
Ｉ部位により−３５領域および上流配列を除去でき、次
にＰＩ遺伝子をファージＴ７プロモーターの制御下にベ
クタープラスミドｐＧＥＭ−２に挿入した。太い線はｐ
ＧＥＭ−２ＤＮＡを、そして細い線はＦＡ１９ＤＮＡを
表す。ＰＩ’−ＰＩ遺伝子部分（点線はこの遺伝子の欠
失セグメントの方向を示す）；ＰＴ７−ファージＴ７プ
ロモーター；ＭＣＳ−多重クローニング部位；制限酵素
部位：Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ、Ｈ−ＨａｅＩＩＩ、Ｂ−Ｂａ
ｍＨＩ、（Ｈ）−ＨａｅＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩ接合点
（部位は存在せず）、Ｔ−ＴａｑＩ。 第６図：ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるｐＵＮＣ７上のＰ
Ｉ遺伝子の発現。Ａ：全細胞溶解物の１５％ゲル上にお
けるＮａＤｏｄＳＯ4−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、クーマシーブルーで染色。マーカータンパク質の寸
法を左側に示す。ＰＩが示されており、そして中央の矢
印はレーン４では明らかに失われているタンパク質を示
す。Ｂ：６種類のＰＩＡ ＭＡｂを用いて検索したＡに
おけるゲルのウエスターンブロットのオートラジオグラ
フ。レーン１：ＦＡ１９；レーン２：ＩＰＴＧなしで１
６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；レー
ン３：ＩＰＴＧを用いて３時間増殖させたＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）ｐＵＮＣ７；レーン４：ＩＰＴＧを用いて１６時
間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；レーン
５：ＩＰＴＧなしで１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ
３）ｐＧＥＭ−２；レーン６：ＩＰＴＧを用いて１６時
間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧＥＭ−２。 第７図：ＦＡ１９のＰＩ構造遺伝子に隣接したｍＴｎ３
− 表す。ｍＴｎ３−ＣＡＴは長さが１．６６ｋｂであり、
尺度に応じて描かれていない。ＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１の
ゲノム上のＰＩ遺伝子の位置は線上の空白ボックスで示
され、斜線ボックスはシグナル配列を示す。ＰＩ’：ク
ローン化構築物中に存在するＰＩ遺伝子部分。制限酵素
部位：Ｎ−ＮｏｔＩ；Ｂ−ＢａｍＨＩ；Ｓ−Ｓａｕ３Ａ
Ｉ。 第８図：ＰＩ遺伝子の配列決定のためにクローン化した
ＭＳ１１ ＤＮＡの断片。ＰＩ遺伝子の位置は線上の空
白ボックスで示され、斜線ボックスはシグナル配列を示
す。オリゴヌクレオチドＮＣ１およびＮＣ１２の配列の
位置が示してある。大きい方の断片はベクタープラスミ
ドｐＧＥＭ−３にクローン化され、小さい方の断片はλ
ｇｔ１１中にクローン化して、表示した名称の構築物と
なした。制限酵素部位：Ｈｆ−ＨｉｎｆＩ；Ｋ−Ｋｐｎ
Ｉ；Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ；Ｈｃ−ＨｉｎｃＩＩ。 第９図；ＭＳ１１のＰＩＢ遺伝子のＤＮＡ配列。予測さ
れるアミノ酸配列はＤＮＡ配列の上に示してあり、シグ
ナルペプチドも示される。推定ブロモーター配列（−３
５および−１０）およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）
も示され、関連する制限酵素部位も同様に示される。各
行の最後の塩基の番号を右側に示す。Ｒ１０のＰＩＢ配
列（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ等、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８４：
８１３５−８１３９，１９８７）との相違を示すため
に、塩基（制限酵素部位を構成するものを除く）には下
線が引いてあり、アミノ酸は丸で囲ってある。 第１０図：ＦＡ１９ ＰＩＡおよびＭＳ１１ ＰＩＢのア
ミノ酸配列の比較、並びにハイブリッドＰＩ遺伝子の構
造。ＰＩＡ遺伝子配列は白の捧で、そしてＰＩＢは黒の
棒で示す。ＰＩ遺伝子類の上と下はアミノ酸配列の比較
であり、垂直線は１個の相違に相当し、黒のブロックは
連続して広がった相違に相当する。アミノ酸残基の数は
上の目盛で示され、そして塩基対の数は下の目盛で示さ
れる。ハイブリッドを分析するのに使用されたオリゴヌ
クレオチドはこれらの遺伝子の間に示してあり、点線は
他の遺伝子上の等しい位置を示す。ハイブリッド遺伝子
構造（クラス１−９）を下に示し、交差が起こったオリ
ゴヌクレオチド配列間の領域を傾斜域で表す。種々のハ
イブリッドクラスのＰＩ血清型を第１表に示す。 第１１図：全細胞溶解物の１５％ゲル上でのＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシーブルー
染色を用いて検出した、ＢＬ２１（ＤＥ３）中における
ｐＵＮＣＨ２５上のＰＩＢ遺伝子の発現。ＰＩタンパク
質バンドが示してある。レーン１：ＭＳ１１；レーン
２：ＩＰＴＧなしで増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵ
ＮＣＨ２５；レーン３−５：ＩＰＴＧを用いて増殖させ
たＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣＨ２５。ＩＰＴＧ（５０
μｇ／ｍｌ）は下記細胞密度すなわちレーン３：５×１
０8細胞／ｍｌ；レーン４：１０9細胞／ｍｌ；レーン
５：２×１０9細胞／ｍｌで増殖培地に加えた。ＰＩの
発現は生長周期の早期に培養物が誘導された場合に最大
である。 ５．発明の説明 本発明は、淋疾感染予防用のワクチン組成物の製造に有
用なＮ．ゴノロエアエＰＩＡ、ＰＩＢ、およびキメラＰ
ＩＡ／ＰＩＢタンパク質の使用に関する。これらのタン
パク質は組換えＤＮＡ技術または化学的合成法により製
造できる。以前には適当なＮ．ゴノロエアエ株からの化
学的単離法を使用することが可能であったが、この方法
はワクチン接種後に阻止（抗防御）抗体を惹起するある
種の他の淋菌タンパク質による汚染を生じうる。ＰＩタ
ンパク質は抗体の生成を刺激することが知られているの
で、Ｎ．ゴノロエアエによる感染から被接種者を効果的
に防御する免疫原として、そのタンパク質全体またはそ
の免疫原部分を使用することができる。ここに記載の組
換えプラスミドにより、安定で宿主細胞による分解に対
し抵抗性を有する大量のＰＩタンパク質を宿主細胞中に
産生させることができ、その結果ワクチン組成物に適す
る物質の豊富な供給原が得られる。このワクチン製剤は
他の抗防御性淋菌タンパク質による汚染がない。本発明
を説明するために、本発明にいくつかの工程に分けて以
下に論ずる、すなわち：１）ＰＩＡ遺伝子または遺伝子
断片の同定および単離；２）適合性宿主細胞の形質転換
に用いられる適当なクローニングベクターへの遺伝子ま
たは遺伝子断片の挿入；３）その遺伝子を複製させ発現
させる形質転換宿主細胞の同定および増殖；および４）
遺伝子生産物の同定および精製。本発明によれば、ＰＩ
タンパク質は第３図または第９図のクローン化配列、も
しくはそのハイブリッドを適切なクローニング／発現ベ
クターに挿入し、適当な宿主細胞を形質転換し、次に遺
伝子産物を同定および精製することにより生産されるう
る。あるいはまた、第３図または第９図の推定アミノ酸
配列部分、またはそのハイブリッドは当分野でよく知ら
れた化学的合成技術を用いて合成することもできる。ま
た、ＰＩＡおよびＰＩＢ配列に基づくオリゴヌクレオチ
ドもここに開示され、これらのオリゴヌクレオチドはサ
ザンブロット、ドットブロット、スロットブロットなど
のハイブリダイゼーションの技術によるＮ．ゴノロエア
エ感染の確認および診断に有用である。 ５．１．ＰＩＡ遺伝子の同定、単離、および配列決定 ＰＩＡタンパク質のヌクレオチドコード配列は第３図に
示される。すでに述べたように、ＰＩＡタンパク質はす
べてのＮ．ゴノロエアエによって生産されるわけではな
い；任意の所定の株はＰＩＡまたはＰＩＢのいずれかを
生産するが両方は生産しないであろう。ＰＩＡの存在は
淋菌血清群Ｉ、血清型Ｉ−３、と関係があり、従って血
清型１−３と関連のある淋菌株はどれもＰＩＡ ＤＮＡ
源として使用できる。既知のＮ．ゴノロエアエ株の中
で、ＰＩＡにより特徴づけられる株はＦＡ１９、ＦＡ１
３０、Ｗ−Ｕｅ、Ｂ−２、Ｇ−７、５０２９、Ｒ−１
１、Ｅ−５、Ｄ−４、Ｖ−１５である（Ｋｎａｐｐ等、
Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１５０：４４−４８，１９８
４）。本発明の実施において、第３図に示す配列は種々
の方法で得ることができる。例えば、ひとたび適当なＰ
ＩＡ含有株が定められたら、その生物のＤＮＡを単離
し、ＤＮＡ断片を生成させ、そしてＰＩＡ遺伝子配列を
含有する断片を同定することが必要である。あるいはま
た、その遺伝子または遺伝子セグメントは合成すること
ができよう。Ｎ．ゴノロエアエＤＮＡは多くの異なる方
法で断片化しうる；最も好ましい方法はＤＮＡを特定の
配列で切断する制限酵素での処理である。その他の方法
にはマグネシウムの存在下でのＤＮａｓｅによるＤＮＡ
の処理、または音波処理のような物理的破壊が含まれ
る。制限酵素を用いる場合、ＤＮＡを処理するのに１種
類の酵素または酵素類の組合せを用いることができる。
唯一の必要条件は、核酸の消化がＰＩＡの抗原部位をコ
ードする領域を破壊しないということである。断片化
後、線状ＤＮＡの個々の断片を、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＰＡＧＥ）、アガロースゲル、またはカラ
ムクロマトグラフィーのような多数の既知技法の任意の
ものを用いて、大きさに基づいて分離する。分離した断
片によりプラスミド作製および形質転換のための遺伝子
物質が提供される。対象となる遺伝子配列を含有するＤ
ＮＡ断片の同定は多くの方法により達成できる。例え
ば、モノクローナル抗体のような免疫試薬が使用されう
る。ＰＩＡに対するモノクローナル抗体は数多く誘導さ
れており（Ｔａｍ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏ．３
６：１０４２−１０５３，１９８２）、そしてこれらは
種々のＤＮＡ断片により形質転換されたそれぞれの宿主
細胞から生産された産物を検査するのに使用されうる、
すなわちＰＩＡモノクローナル抗体と反応する産物によ
り、ＰＩ遺伝子を含有する断片で形質転換された細胞が
同定される。また、ＤＮＡ断片の塩基配列決定によりそ
れぞれのアミノ酸配列を予測でき、次に既知の任意の部
分アミノ酸配列と比較して、相当するＤＮＡ配列を含有
する断片を同定することができる。もう１つの一般的技
法はサザンブロッティングである（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７８：５０３，１９７５）。この
方法では、制限断片をゲル上の適所で変性し、そしてブ
ロッティングにより固形基質代表的にはニトロセルロー
スフィルターに移す。次に、フィルターをこのタンパク
質の既知のまたは仮定した部分ＤＮＡ配列を含有する放
射性標識オリゴヌクレオチドにさらす。選択されたオリ
ゴヌクレオチドと相補性であるブロットされたＤＮＡが
それにハイブリダイズしてそれによりＰＩ遺伝子を含有
するＤＮＡ断片の大きさが確認されよう。以下に詳述す
る実施例において、ＰＩＡをコードする遺伝子は２種の
新規なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション
により同定および単離された。ＰＩＢのＮ末端アミノ酸
部分の既知配列（Ｂｌａｋｅ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ．３６：２７７−２８５，１９８２；Ｂｌａｋｅ，
Ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ，
Ｇ．Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ編、２５１−２５８，１９８
５，ＡＳＭ）、および既知ＤＮＡ配列を有する種々の他
の淋菌タンパク質に伴うコドン使用規則に基づいて、有
用なオリゴヌクレオチドを推定する試みがなされた。特
に、次のようなＮＣ１およびＮＣ２と呼ばれる２つの配
列が作製された： サザンブロットハイブリダイゼーションで用いられる場
合、上記のオリゴマーは淋菌ゲノムから得られたＤＮＡ
制限断片をスクリーニングするのに使用された；両方の
プローブともＰＩＡ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を同定
することに成功した。同定された遺伝子がＰＩＡ遺伝子
であることの証明は、遺伝子産物の分子量と天然タンパ
ク質の分子量との比較、およびＰＩＡ特異的モノクロー
ナル抗体のその免疫反応性により行われた。しかしなが
ら、この有用性のほかに、これらのオリゴヌクレオチド
はそれぞれ淋菌のＰＩＡおよびＰＩＢ株の両方とハイブ
リダイズしうることも確認された。従って、これらの正
常な化合物は悩める個体のＮ．ゴノロエアエ感染の検出
および同定に、サザンブロットハイブリダイゼーション
において診断用プローブとして使用することもできる。
ＰＡ遺伝子を含有する断片の同定に続いて Ｓａｎｇｅ
ｒ（ＰＮＡＳ ＵＳＡ７４：５４６３−５４６７，１９
７７）の方法に従って関連部分の塩基配列が決定され
る。Ｓａｎｇｅｒの方法はＤＮＡ鋳型からの相補性ＤＮ
Ａ鎖の酵素による合成を利用するものである。相補鎖の
合成はデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）の取込みに
より停止される。４つの別々の反応（それぞれｄｄＡＴ
Ｐ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、またはｄｄＴＴＰを含
有）が行われ、その結果４組のＤＮＡ断片が形成され、
所定の組の各断片はその末端に特定のジデオキシヌクレ
オチドをもつであろう。次にＤＮＡ断片をポリアクリル
アミドゲル上で分離し、各断片の末端ヌクレオチドの同
一性の知識よりその塩基配列を決定しそして最短断片か
ら最長断片までを読み取る。鋳型として用いられる一本
鎖ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼで化学
的に処理すると得られる。しかしながら、Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：３０
９，１９８１）がクローニングベクターとして開発した
Ｍ１３ｍｐクローニングベクターを使用することがより
効果的である。Ｍ１３は一本（＋）鎖ＤＮＡを含有する
大腸菌の雄菌特異的線維状バクテリオファージである。
この（＋）鎖は相補性（−）鎖合成用の鋳型として使用
される。二本鎖型のＤＮＡが複製型すなわちＲＦ型であ
り、細胞あたり約２００コピーに増殖する。この二本鎖
型を細胞から分離してクローニングベクターとして使用
できる。いったん増殖が止まると、２本の鎖のうち一方
のみが産生され続け、そして一本鎖がファージ粒子に組
み込まれる。Ｍ１３の利点は、粒子がクローン化した鎖
の一方に相同な一本鎖ＤＮＡを有しており、それ故にＳ
ａｎｇｅｒ法における鋳型として使用できる点にある。
３５０塩基までの塩基配列を単一クローンから決定で
き、これよりも長い断片の塩基配列決定は重複する断片
の塩基配列を解析することにより達成できる。前記技法
を使用するすることにより、第３図に示したＰＩＡ遺伝
子のヌクレオチド配列が得られた。第３図には推定アミ
ノ酸配列も示してある。ＰＩＡ遺伝子の塩基配列決定
（重複する断片の塩基配列を別々に決定することにより
達成された）によりさらに２つの他のオリゴヌクレオチ
ドプローブの同定および作製ができた。両プローブは次
の配列を有する１７ヌクレオチドオリゴマーである： ＮＣ８：５’ＧＣＧＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＡＣＣ３’ および ＮＣ１１：５’ＣＧＧＴＧＴＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＣ３’ これらのプローブは両方ともＰＩＡ遺伝子のみに特異的
であって、ＰＩＢ ＤＮＡ配列にはハイブリダイズしな
い。従って、これらのプローブは共に感染にＰＩＡ生物
によるか、ＰＩＢ生物によるのかを判断する診断試験に
おいて有用である。先に述べたように、これらのタンパ
ク質の各々は全身的かまたは局所的の淋菌感染の特定パ
ターンを示し、従って感染患者の治療プログラムを計画
する上で非常に重要でありうる。単離した遺伝子または
化学的に合成したＤＮＡ配列は形質転換宿主細胞の増
殖、形質転換細胞からの組換えＤＮＡの単離、および単
離した組換えＤＮＡからの挿入遺伝子の回収により、さ
らに遺伝子コピーを生成されるのに使用されうる。 ５．２．ＰＩＢ遺伝子の同定、単離および配列決定 ＰＩＢタンパク質のヌクレオチド配列を第９図に示す。
この配列はＮ．ゴノロエアエＭＳ１１株から単離され
た。ＰＩＢの存在は血清群４−９と関係しており、これ
らの血清群と関連した株はどれもＰＩＢ ＤＮＡの供給
源として使用できる。既知の淋菌株中で、ＰＩＢの存在
により特徴づけられる株はＭＳ１１、ＦＡ６１４０、Ｆ
６２およびＲ１０である。ＰＩＢタンパク質の調製、同
定、および配列決定の技術は前記５．１節で説明したＰ
ＩＡタンパク質に適用した手法と実質的に同じである。
ＰＩＢ遺伝子の詳細な同定は、ＮＣ１およびＮＣ１２プ
ローブ（５’−ＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＴＣ−
３’）の使用、並びにハイブリッドＰＩタンパク質のＰ
ＩＢ部分にあるＫｐｎＩ制限部位の同定（Ｄａｎｉｅｌ
ｓｓｏｎ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５２９
−５３３，１９８６）により助けられた。ＰＩＡと同様
にこの遺伝子のクローニングはクローニングベクターに
重複配列を別々にクローニングすることにより達成され
た。 ５．３．組換えＤＮＡ技術によるＰＩＡ、ＰＩＢまたは
ＰＩＡ／ＰＩＢハイブリッドの生成 ＰＩＡのヌクレオチドコード配列を第３図に示す。ＰＩ
Ｂのヌクレオチドコード配列を第９図に示す。本発明の
実施において、ヌクレオチド配列またはその機能上の同
等物がＰＩＡまたはＰＩＢ生成物の発現を指示する組換
え分子中に組み込まれる。また、第３図および第９図か
ら誘導されたハイブリッド配列を作製してハイブリッド
ＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を生産させることもできる。
ヌクレオチドコード配列の縮重ゆえに、第３図または第
９図に示したと実質的に同じアミノ酸配列をコードする
他のＤＮＡ配列も、ＰＩＡまたはＰＩＢをクローニング
および発現させるために本発明の実施においてそれぞれ
使用することができる。第３図または第９図のヌクレオ
チド配列のかかる変更には種々のヌクレオチド残基の欠
失、付加または置換が包含され、同一のまたは機能的に
等価の遺伝子生成物をコードする配列が生成される。そ
の遺伝子産物はアミノ酸残基の欠失、付加または置換を
含有できる。置換は関与する残基の極性、電荷、溶解
度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に
基づいて行われうる。例えば、負に荷電したアミノ酸に
はアスパラギン酸およびグルタミン酸が包含され、正に
荷電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが包含さ
れる。同様の親水値を有する非荷電極性ヘッド基または
非極性ヘッド基をもつアミノ酸には次のものが包含され
る、すなわちロイシン、イソロイシン、バリン；グリシ
ン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、ト
レオニン；フェニルアラニン、チロシン。 ５．３．１．ＰＩ遺伝子クローニング／発現ベクターの
作製 第３図に示すＰＩＡ遺伝子配列、第９図に示すＰＩＢ遺
伝子配列、およびハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢ配列、も
しくはこれらの機能的同等物は適当なクローニング発現
ベクターに挿入できる。終局的に挿入遺伝子の転写およ
び翻訳を達成するためには、その遺伝子は選ばれた宿主
細胞と適合するプロモーターの制御下に置かねばならな
い。プロモーターとはＲＮＡポリメラーゼが結合して転
写を開始するＤＮＡの領域である。選ばれるプロモータ
ーは宿主細胞生物から単離されたいずれのものでもよ
い。例えば、宿主系として通常用いられる大腸菌は菌そ
れ自体と、またはそのバクテリオファージと、もしくは
そのプラスミドと関連した、ｌａｃまたはｒｅｃＡプロ
モーターのような多数のプロモーターを有する。またラ
ムダファージＰＬおよびＰＲプロモーターのような、合
成的にまたは組換えにより作られたプロモーターを使用
して、それに隣接するＤＮＡセグメントの高レベル生産
を誘導することもできる。遺伝子を効率よく転写および
翻訳させるには、開始シグナルも必要である。例えば大
腸菌のｍＲＮＡでは、リボソーム結合物には翻訳開始コ
ドン（ＡＵＧまたはＧＵＧ）および１６ＳリボソームＲ
ＮＡの３’末端の塩基と相補性であるもう１つの配列が
包含される。後者の配列（シャイン−ダルガルノまたは
Ｓ−Ｄ配列）のいくつかは大腸菌や他の適当な種類の宿
主細胞において確認されている。宿主細胞系と適合しう
る任意のＳＤ−ＡＴＧ配列が使用できる。これらには大
腸菌ファージラムダのｃｒｏ遺伝子またはＮ遺伝子、あ
るいは大腸菌のトリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ、ＢまたはＡ
遺伝子が含まれるが、それらに限定されるわけではな
い。インビトロでＤＮＡ断片をクローニングベクターに
挿入する方法は数多く存在する。ＤＮＡリガーゼは二重
ＤＮＡ鎖中の隣接ヌクレオチド間の一本鎖ニックを閉じ
る酵素である；従って、この酵素はある種の制限酵素に
より生成された付着末端同士を共有結合で連結させるの
に使用することができる。また、ＤＮＡリガーゼを使用
して平滑末端間のホスホジエステル結合の形成を触媒す
ることもできる。最後に、酵素ターミナルデオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼを用いて断片の末端で
３’ホモポリマー一本鎖尾部を形成させることができ
る。すなわち第一の分子の３’末端にオリゴ（ｄＡ）配
列を、そして第二の分子の３’末端にオリゴ（ｄＴ）配
列を付加することにより、２種類の分子がアニーリング
して環状ダイマーを形成させることができる。これらの
方法のどれを使っても、遺伝子セグメントプロモーター
および他の制御エレメントをベクターの特定部位に連結
することが可能である。こうして、ＰＩタンパク質をコ
ードする遺伝子がベクタープロモーターおよび制御エレ
メントに対して特別の関係で所定のベクターに連結さ
れ、その結果前記配列はベクターＡＴＧ配列に関して正
しい読み枠で挿入される。使用されるベクターは形質転
換細胞を同定しうるよう代表的にはアンピシリン耐性ま
たはテトラサイクリン耐性のようなマーカー機能を有し
ていよう。使用するベクターは既知の発現ベクターまた
はそれらの誘導体のいずれであってもよい。最も頻繁に
用いられるベクターはプラスミドベクター（例．ｐＢＲ
３２２、ｐＡＣ１０５、ｐＶＡ５、ｐＡＣＹＣ１７７、
ｐＫＨ４７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＢ１１０、ｐｍＢ
９、ｐＢＲ３２５、Ｃｏｌ Ｅｌ、ｐＳＣ１０１、ｐＢ
Ｒ３１３、ｐＭＬ２１、ＲＳＦ２１２４、ｐＣＲ１また
はＲＰ４）；バクテリオファージベクター（例．ラムダ
ｇｔ１１、ラムダｇｔ−ＷＥＳ−ラムダＢ、Ｃｈａｒｏ
ｎ２８、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、ラムダｇｔ−１−ラムダＢ
Ｃ、ラムダ−ｇｔ−１−ラムダＢ、Ｍ１３ｍｐ７、Ｍ１
３ｍｐ８、Ｍ１３ｍｐ９）；ＳＶ４０およびアデノウイ
ルスベクター、並びに酵母ベクターである。 ５．４．ＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子生成物の同定および
精製 先に述べたように、ＰＩＡおよびＰＩＢをコードする遺
伝子セグメントは本来は上記の新規なオリゴヌクレオチ
ド配列とのハイブリダイゼーションにより同定された。
選択された断片がＰＩＡをコードする構造遺伝子である
という同一性は、天然ＰＩＡとの分子量比較により、お
よびコロニーラジオイムノアッセイで試験された６種類
すべてのＰＩＡモノクローナル抗体との反応性により証
明された。ＰＩＢ生成物の同一性もＰＩＢ特異的モノク
ローナル抗体との反応により証明された。クローン化Ｐ
ＩＡまたはＰＩＢ遺伝子を発現する大腸菌宿主細胞は、
適切なモノクローナル抗体と反応するＰＩタンパク質を
豊富に産生する。ＰＩＡタンパク質の精製操作はＴｅｅ
ｒｌｉｎｋ等（Ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｎｅｉｓ
ｓｅｒｉａ，Ｇ．Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ編、２５９−２６
４，１９８５，ＡＳＭ）に詳細に記載されている。 ５．５．ＰＩＡ／Ｂハイブリッドの作製 本発明に関連して、多数のハイブリッドＰＩＡ／Ｂ遺伝
子配列およびタンパク質が作られた。ハイブリッド遺伝
子はＳｅｉｆｅｒｔ等（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ，Ｖｏｌ．８，ｐ．１２３−１３４，Ｓｅｔｔｉｎ
等編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８６；ＰＮＡＳ
ＵＳＡ ８３：７３５−７３９，１９８６）に従って改
良されたシャトル突然変異誘発法を用いて、ＰＩＡ産生
株にＰＩ遺伝子に隣接して選択マーカーを挿入すること
により作製された。この場合、選択マーカーは選択可能
なクロラムフェニコール耐性（Ｃｍr）を付与するクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）遺伝子であった。次にＣＡＴ ＤＮＡを含有するＰ
ＩＡ株をＰＩＢ含有受容株を形質転換するためにＤＮＡ
供与株として使用した。相互交雑（ｒｅｃｉｐｒｏｃａ
ｌ ｃｒｏｓｓ）も行われた。推定上のハイブリッドは
Ｃｍrで選択し、イムノブロッティングでＰＩについて
調べて同定した。次の形質転換体すべてが観察された：
（１）供与株ＤＮＡが存在した、または（２）受容株Ｄ
ＮＡが保持されていた、または（３）そのＤＮＡがどち
らの親のＤＮＡとも相違していた。真のハイブリッドＰ
ＩＡ／Ｂ株は程良く高い頻度で両方の種類の交雑におい
て発生し、多くの異なる血清型が同定可能であった。こ
れらのハイブリッド遺伝子およびタンパク質を入手でき
ることにより、既知モノクローナル抗体のエピトープの
位置を解明することができ、また防御抗体の生産を誘導
することが知られているエピトープ（従って、有用なワ
クチンの開発において最も重要なエピトープである）を
含有するＰＩＡ／Ｂハイブリッドタンパク質の同定、そ
して最終的にはその合成による構築が可能となった。こ
れらのハイブリッドの作製および同定の細部については
以下の７節で述べることにする。 ５．６．合成法によるＰＩＡ、ＰＩＢおよびハイブリッ
ドタンパク質の製造 もう一つの態様においては、第３図および第９図に示し
た遺伝子配列によりコードされるタンパク質並びにそれ
ぞれの一部を含有するキメラタンパク質を当分野でよく
知られた技法を使って化学的に容易に合成できる（Ｊ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ：３
６１，１９８６）。最終実施においては、タンパク質配
列内部の防御エピトープが同定されると、その分子の単
離された活性領域のペプチド合成によりワクチン製造用
の基本物質の単純で比較的安価な製造方法が提供され
る。ペプチド合成の使用はまた、ハイブリッドＰＩＡ／
ＰＩＢタンパク質の、または、好ましくはＰＩＡとＰＩ
Ｂタンパク質の両方の防御エピトープを含有する合成ペ
プチドの便利な構築手段を提供するものてある。従っ
て、本発明は開示した配列による、遺伝子組換えにより
製造されたタンパク質および合成的に製造されたタンパ
ク質の両方を包含するものである。また、完全なタンパ
ク質の断片、好ましくは親タンパク質分子の抗原性を保
持する断片、そして最も好ましくは防御抗体の生産を惹
起するエピトープを含有する断片も本発明に包含され
る。さらに、配列内の１個またはそれ以上のアミノ酸残
基を化学的に同等のアミノ酸で置き換えることによっ
て、完全なタンパク質およびペプチド断片配列内で置換
を行うことが可能であることも認識されよう；例えば、
アスパラギン酸およびグルタミン酸のような負に荷電し
た残基は相互交換でき、リジンやアルギニンのような正
に荷電した残基も同様に交換できる。疎水性残基にはト
リプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイ
シン、バリンおよびアラニンが包含される。既知配列か
らのある種の欠失または既知配列への付加を行い、しか
もまだ所望の抗原活性を保持させることも可能である。
これらの２種のタンパク質の配列に関する本情報が与え
られたことにより、分子を適当に改変しかつ活性が保持
されているかどうか判定することは当分野の技術の範囲
内である。従って本発明はさらに、クローン化したもの
であろうと合成的に製造したものであろうと、親分子の
抗原性が実質的に保持されている請求したタンパク質の
相同物、類似物、および断片を包含するものである。 ５．７．ワクチンの製剤 精製された形態の遺伝子産物または合成によるＰＩＡペ
プチドは淋菌感染予防用のワクチン組成物を調製するの
に有用である。完全なＰＩＡタンパク質またはその任意
の活性断片がこの種の組成物中で免疫源物質として使用
できる。遺伝子生成物が融合タンパク質の一部分として
発現された場合には、そのタンパク質を全体として使用
できるしあるいは宿主細胞タンパク質を切断して非融合
ＰＩＡタンパク質を生成させることもできる。組換えＤ
ＮＡ技術により作られたＰＩＡタンパク質は標準的なタ
ンパク質分離法を用いて宿主細胞から分離できる。次に
精製タンパクを通常使用される任意の医薬上許容しうる
担体例えば水、生理食塩水、エタノール、ポリオール
（例．グリセロール、プロピレングリコール）、または
植物油、並びに当分野で知られた任意のワクチンアジュ
バントと組み合わせる。ＰＩＡ産物はまたワクチン製剤
に使用するためにリボソーム内に取り込ませることもで
きる。ここで用いる“医薬上許容しうる担体”とはあら
ゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌
剤、等張剤、吸収遅延剤などを包含する。医薬上活性な
物質に対するかかる作用剤の使用は当分野で知られてい
る。慣用媒体が活性成分と不適合でない限り、治療組成
物中におけるその使用が意図される。補助的な活性成分
も混入できる。本発明の特に有用な実施態様は、活性免
疫原としてハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を用
いたワクチンである。ＰＩＡとＰＩＢの両方のエピトー
プを発現する。実験的に誘導された淋菌は文献（Ｄａｎ
ｉｅｌｓｓｏｎ，Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５２９−
５３３）に報告されているが、キメラタンパク質の構造
は同定されず、そのタンパク質をワクチンに使用する可
能性については全く触れられていない。かかるワクチン
により両方の種類の淋菌感染（すなわち、プロテインＩ
Ａ含有株に関連した全身感染およびプロテインＩＡまた
はプロテインＩＢ含有株に関連した局所感染）に対して
個体を免疫できるという利点が得られる。本発明に関連
して述べた特定プローブの入手可能性が示されたことに
より、かかる適当なハイブリッドタンパク質は当分野技
術者に知られた技法を使って容易に得ることができる。
原則的には、キメラ遺伝子は個々のタンパクの遺伝子を
初めに単離することにより作製できる。本発明のＰＩＡ
特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いたＰＩＡ遺伝
子の単離方法はすでに上で説明した。同様の操作がＰＩ
Ｂ遺伝子の単離および同定に使用できる。ＰＩＢタンパ
ク質のみを産生する菌株例えばＭＳ１１、Ｒ１０、ＦＡ
６１４０、Ｆ６２などが多数同定されている。上記の非
ＰＩＡ特異的ＤＮＡ配列は、ＰＩＢ特異的菌株由来のＰ
Ｉ配列を含有する制限断片をＰＩＢ菌株の遺伝子ライブ
ラリーから単離するのに好都合に使用できる。正しい産
物が発現されたことの証明は、推定ＰＩＢ断片による宿
主微生物の形質転換および発現、そして任意の既知ＰＩ
Ｂ特異的モノクローナル抗体（Ｒ．Ｃ．Ｎｏｗｉｎｓｋ
ｉ，Ｋｎａｐｐ，Ｊ．Ｓ．，Ｔａｍ，Ｍ．Ｒ．，ａｎｄ
Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１
５０：４４−４８，１９８４）との反応による発現産物
の同定から得られる。ひとたび個々の遺伝子断片が単離
されたら、それらは当業上知られた任意の方法を用いて
容易にクローン化され、組み立てられる。次にＰＩＡ配
列部分を、キメラタンパク質が転写および翻訳可能な形
態（例えば、翻訳終止配列により中断されてない形態）
でコードされるように、ＰＩＢ配列部分に連結させる。
次に、全キメラ配列を選択マーカーおよび制御エレメン
トを含有するベクターに連結させることができる。次に
このベクターを用いて、回収可能な量の遺伝子生成物を
発現しうる宿主微生物を形質転換する。もちろん別法と
して出発点でＰＩＡ遺伝子をすでに含有するベクター
（例えば、大腸菌ＮＲＲＬ Ｂ−１８２６３に含有され
るプラスミド）を使用してもよい。ＰＩＢ配列を上記の
ようにして単離し、その全部または一部をプラスミド中
のＰＩＡ遺伝子に隣接してまたはＰＩＡ遺伝子の内部に
連結させて目的とするキメラ遺伝子の転写および翻訳を
行わせることもできる。しかしながら好ましくはＰＩＡ
／ＰＩＢハイブリッドは５．６節で説明したようにして
作製し、ハイブリッド遺伝子をそこから単離して形質転
換用のベクターを作製する。このようにして作製したベ
クターを使って再度宿主微生物を形質転換する。このよ
うにして、遺伝子生成物の発現によりキメラタンパク質
の供給源が提供され、このキメラタンパク質ＰＩＡまた
はＰＩＢタンパク単独と同じ方法でワクチン製剤中に容
易に配合できる。また別の実施態様においては、ワクチ
ン製剤に有用なハイブリッドタンパク質は今や配列が明
らかとなったタンパク質の防御エピトープを単離および
同定することにより合成的によって製造することもでき
る。先に述べたように、組換えキメラタンパク質が容易
に入手しうることにより、問題のエピトープをより容易
に同定でき、それにより最終的には免疫を賦与するのに
必要なハイブリッドタンパク質のその部分のみを含有す
る“簡素化された”ハイブリッドを合成方法により構築
することができる。
【実施例】６．実施例１：ＰＩＡ遺伝子の同定、単離お
よび発現 本発明の方法にしたがって、淋菌ＤＮＡの断片を得、個
々の断片を別々にクローニングし、次いで外来の誘導可
能プロモーターとともに遺伝子を再構築することによ
り、ＰＩＡ遺伝子配列を決定した。前述のように、オリ
ゴヌクレオチドＮＣ１とのハイブリッド形成により、Ｐ
ＩＡ遺伝子配列の部分を有する２個の推定断片を同定し
た。次に関連する制限フラグメントをそれぞれｐＧＥＭ
−２プラスミドベクターに結合し、適当な宿主に形質転
換した。オリゴＮＣ１とハイブリッド形成した形質転換
体を単離した。これらのクローンからプラスミドＤＮＡ
を調製し、適当な制限酵素で消化し、再びＮＣ１をプロ
ーブとして探査した。ＮＣ１とハイブリッド形成した個
々の断片を、次いで別々にｐＧＥＭ−２プラスミドに再
連結して、２つの別個のプラスミド、ｐＵＮＣ３および
ｐＵＮＣ１１を得た。７５０ｂｐ断片のＤＮＡ配列の同
一性は、それに由来するより小さな制限断片をＭ１３ｍ
ｐＲＦ ＤＮＡにサブクローニングし、次いでサンガー
法（ＰＮＡＳＵＳＡ ７４，５４６３−５４６７，１９
７７）にしたがって配列決定することにより決定され
た。この配列から、新規オリゴヌクレオチドを合成し
た。ＮＣ８と命名したこの新規オリゴヌクレオチドを、
すでにクローニングされた９００ｂｐ断片に隣接する８
５０ｂｐ断片を同定するために使用し、この断片をｐＧ
ＥＭ−２にクローニングしてｐＵＮＣ１５を生成させ、
サンガー法（上記）により配列決定した。プラスミド調
製、配列決定、ハイブリッド形成および形質転換に関す
る操作法の詳細、を以下に述べる。 ６．１．プラスミドの調製に用いられる一般的操作法 以下の小節には、ＤＮＡ単離、酵素反応、断片の単離お
よび結合反応に用いられる一般的操作法が記載される。 ６．１．１．制限酵素に関する条件 この実験に用いられる制限酵素は、特に指示しない限り
Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手さ
れる。Ｎ．ゴノロエアエ培養物は、ケロッグの添加物
（Ｋｅｌｌｏｇｇ’ｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）Ｉおよ
びＩＩ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．８５：１２７４−１
２７９，１９６３）を含有するＧＣ基礎培地（ＤＩＦＣ
Ｏ）中で５％ＣＯ2雰囲気下で増殖させる。Ｍａｎｅｓ
ｓら（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２８：３２１−３
３０）に記載された淋菌株ＦＡ１９から、Ｓｔｅｒｎら
（Ｃｅｌｌ ３７：４４７−４５６，１９８４）の方法
にしたがって、消化に必要なＤＮＡを単離した。この菌
株はプロティンＩＡを生産することが知られている。下
記の条件下で全ての消化を行った。約２０μｌのＤＮＡ
試料を、２−１０倍過剰の制限酵素中で３７℃で１−３
時間インキュベートした。この条件の例外は、ＴａｑＩ
に関して温度６５℃、ＳｍａＩに関して３０℃である。 ６．１．２．制限酵素緩衝液 ＡｃｃＩ、ＭｓｐＩおよびＲｓａＩ消化に用いた緩衝液
は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌおよび１０ｍＭＭｇＣｌ2
からなり、ｐＨ８である。ＡｖａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＴａｑＩ消化に用いた緩衝液は、５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ2および５０ｍＭ ＮａＣｌか
らなり、ｐＨ８である。ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよび
ＳａｌＩ消化に用いた緩衝液は、５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2および１００ｍＭ ＮａＣｌか
らなり、ｐＨ８である。ＨｉｎｃＩＩ、Ｓａｕ３ＡＩお
よびＳｍａＩ消化に用いた緩衝液は、２０ｍＭトリス−
ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2および５０ｍＭ ＫＣｌから
なり、ｐＨ７．４である。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ
７．５）を最終濃度１０ｍＭとなるように添加して反応
を停止させる。 ６．１．３．関連する制限断片の同定 大腸菌株ＨＢ１０１（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８２）において、ｐＢ
Ｒ３２２のＰＩＡを他のベクタープラスミド上にクロー
ニングする初期の試みは、否定的な結果の繰り返しであ
った。したがって、ＰＩＡ遺伝子またはそのタンパク質
を含有する断片を、オリゴヌクレオチドプローブとのハ
イブリッド形成によって同定することを試みることにし
た。Ｎ．ゴノロエアエ菌株Ｒ１０のＰＩＢの公知のＮ−
末端アミノ酸配列（Ｂｌａｋｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．，Ｉ
ｍｍｕｎ．３６：２７７−２８５，１９８２）に基づい
て、２つのプローブを設計した。２つの他の淋菌タンパ
ク質であるピリンＭｅｙｅｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８
１：６１１０−６１１４，１９８４）およびＰＩＩの遺
伝子配列から得られた限られた量のコドン使用データと
ともに、この情報をＮＣ１およびＮＣ２と命名された第
２図に示す１対のオリゴヌクレオチドを構築した。ＮＣ
１はただ一つの配列であり、ＮＣ２は正しい配列を同定
する確率を高めることを意図したヌクレオチドの混合集
団である。コロニーハイブリッド形成アッセイにおい
て、これら両方のオリゴヌクレオチドはＦＡ１９とハイ
ブリッド形成したが、ｐＢＲ３２２またはｐＧＥＭ−２
のいずれか一方を含有するＨＢ１０１とはハイブリッド
形成しなかった。制限エンドヌクレアーゼ消化されたＤ
ＮＡをアガロースゲルで操作し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎのブ
ロット法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１
７，１９７８）によりゲルからニトロセルロースフィル
ターへ移した。ＮＣ１およびＮＣ２オリゴプローブをＭ
ａｎｉａｔｉｓらの方法（上記）にしたがってポリヌク
レオチドキナーゼを用いてγ−Ｐ３２ＡＴＰ（ＩＣＮＲ
ａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉ
ｆ．）で標識した。下記の緩衝液中で末端標識を行っ
た。トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、０．１ｍ
Ｍスペルミジンおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ。ニトロセ
ルロースフィルター上のＤＮＡに対する標識オリゴヌク
レオチドのハイブリッド形成は、４×ＳＳＰＥ（０．１
８Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4［ｐＨ７．
４］、１ｍＭ ＥＤＴＡ）、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶
液（１×＝０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％
Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリジン）、２
０ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．２％ドデシル硫酸ナ
トリウムおよび５０μｇ／ｍｌサケ精液ＤＮＡ中で、ハ
イブリッド形成反応液１ｍｌ当り１０6ｃｐｍの標識オ
リゴヌクレオチドを用いて一晩行った。フィルターを１
×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン
酸ナトリウム）、５ｍＭピロリン酸ナトリウムおよび
０．１％ドデシル硫酸ナトリウム中で洗浄した。ハイブ
リッド形成および洗浄の温度は、ＮＣ１およびＮＣ２に
ついてそれぞれ４６℃および４０℃であった。フィルタ
ーを５×ＳＳＣ中で洗浄し、乾燥し、Ｋｏｄａｋ Ｘ線
フィルムに暴露した。１個のフラグメントに対するハイ
ブリッド形成が個々の場合に起こった。関連する断片は
ＥｃｏＲＩ−１０ｋｂ、ＳａｌＩ−５．５ｋｂ、Ｓａｕ
３ＡＩ−９００ｂｐおよびＴａｑＩ−７５０ｂｐであっ
た。ＮＣ１およびＮＣ２の両者について同一の結果が観
察された。 ６．１．４．断片のクローニング ｐＢＲ３２２にクローニングされたＥｃｏＲＩまたはＳ
ａｌＩ消化ＤＮＡを含有するＨＢ１０１のコロニーライ
ブラリーを、コロニーハイブリッド形成法によってオリ
ゴヌクレオチドＮＣ１をプローブとして探査すると、陽
性のコロニーは観察されなかった。このことはＰＩが大
腸菌に対して致死的てあることを示唆する先の観察を支
持した。ＦＡ１９ＤＮＡのより小さな断片、すなわちオ
リゴヌクレオチドとハイブリッド形成したＳａｕ３ＡＩ
およびＴａｑＩ消化物は、全ＰＩ遺伝子を含有していな
いと推定され、クローニングのための候補として選択さ
れた。各断片について、本格的に同じ操作にしたがっ
た。Ｓａｕ３ＡＩ断片については、全ＦＡ１９ ＤＮＡ
をＳａｕ３ＡＩで完全に消化した。プラスミドｐＧＥＭ
−２（Ｐｒｏｍｅｇａ ＢｉｏｔｅｃＭａｄｉｓｏｎ，
Ｗｉｓ．より入手）ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、Ｓａ
ｕ３ＡＩ断片に結合した。ＤＮＡ断片の結合はＴ４リガ
ーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖ
ｅｒｌｅｙ，Ｍａｓｓ．）を用い４℃で１６時間、次の
バッファー中で行った。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５％（ｗ／ｖ）ポリエ
チレングリコール８０００、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ Ｄ
ＴＴ。ＭａｎｄｅｌおよびＨｉｇａの塩化カルシウム法
（Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．５３：１５４，１９７０）に
より、この組換えプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を形質
転換した。これについて概説すると、細菌細胞を５０ｍ
Ｍ ＣａＣｌ2および１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、
の氷冷滅菌溶液に懸濁し、次いで結合緩衝液中でプラス
ミドＤＮＡと混合する。約２０００個の形質転換が回収
された。細菌コロニーを、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨ
ｏｇｎｅｓｓの方法（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８２：３９６１
−３９６５，１９７５）にしたがってハイブリッド形成
により調製されたニトロセルロースフィルター上に移
し、オリゴＮＣｌとのハイブリッド形成を観察した。１
個のコロニーが実際にこのオリゴヌクレオチドとハイブ
リッド形成した。プラスミドＤＮＡを増幅し、集め、Ｓ
ａｕ３ＡＩで消化し、すでに述べたサザンハイブリッド
形成法によってオリゴＮＣｌをプローブとして探査し
た。９００ｂｐの１個の断片がこのオリゴヌクレオチド
とハイブリッド形成し、これは先のサザンハイブリッド
形成によって同定されたＦＡ１９のＳａｕ３ＡＩゲノム
断片と同じ大きさであった。この断片を切り取り、アガ
ロースゲルから電気的に溶出し（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕ
ｔｅ）、ＢａｍＨｌ消化ｐＧＥＭ−２プラスミドに再び
結合させて、組換えプラスミドｐＵＮＣ３を作成した
（第２図）。オリゴＮＣ１とハイブリッド形成したＦＡ
１９の７５０ｂｐのＴａｑＩ断片を用いて実質的に前記
と同じ操作を行った。しかし、ＴａｑＩ断片はｐＧＥＭ
−２のＡｃｃＩ消化部位に結合して、組換えプラスミド
ＰＵＮＣ１１を得た（第２図）。 ６．１．５．サブクローニングおよび断片の配列決定 配列決定に先立って、７５０ｂｐのＴａｑＩ断片を酵素
ＲｓａＩおよびＭｓｐＩを用いて消化して、３００ｂｐ
以下のより小さな制限断片とした。次いで断片の末端を
修復し、Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ら（Ｇｅｎｅ ２６：１０
１−１０６，１９８３）により記載されたようにして、
Ｍ１３ ｍｐ１８ ＲＦ ＤＮＡのＳｍａＩ部位に結合し
た。次いで、このクローニングベクターによって作成さ
れた１本鎖ＤＮＡは、Ｓａｎｇｅｒらの方法（ＰＮＡＳ
ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７，１９７７）によっ
て配列決定するための鋳型として用いられる。Ｓａｎｇ
ｅｒ（上記）およびそれに含まれる参考文献（ＢＲＬ，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）に記載の方法にし
たがって、ジデオキシヌクレオチドを調製することがで
きる。各ＤＮＡ試料につき４個のウェル、すなわちジデ
オキシヌクレオチドｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣおよびｄｄ
Ｇのそれぞれについて１個のウェルを用意する。各ウェ
ルに、鋳型ＤＮＡ２μｌ、ならびにプライマー混合物
（ＢＲＬ由来の１１μｌの（２２ｎｇ）Ｍ１３ １７塩
基プライマー、１１μｌのＴＭ（１００ｍＭトリス＋５
０ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ８．５）および６６μｌのＨ2
Ｏ（１０クローンにつき）からなる）２μｌを添加す
る。これらを回転させ、プラスチックラップでおおい、
５６℃で５０−６０分間インキュベートする。インキュ
ベートした後、２μｌの適当なＮＴＰ混合液を各ウェル
に添加する。各混合液は１０−５００μＭのｄｄＮＴＰ
および各６．２５μＭの通常のｄＮＴＰを含有する。Ｎ
ＴＰ混合液の添加後、２μｌのクレノウ混合液を各ウェ
ルに添加した。このクレノウ混合液は、１１μｌのクレ
ノウ（１Ｕ／μｌに希釈）、１１μｌの０．１Ｍジチオ
スレイトール、４．４μｌの３５Ｓ−ｄＡＴＰおよび６
１．６μｌのＨ2Ｏからなる。この混合物を回転させ、
プラスチックラップでおおい、３０℃で１５分間再度イ
ンキュベートする。各ウェルに２μｌの追跡用混合液
（４種の全てのｄＮＴＰ０．２５ｍＭ）を加え、回転さ
せ、３０℃で１５分間再度インキュベートする。次いで
２μｌのホルムアミド色素を各ウェルに加えた後、おお
いをせずに８０℃で１５分間インキュベートする。この
時点で、これらの混合物をゲルにすぐ負荷でき、あるい
はラップして−８０℃で保存することができる。この操
作法て使用したゲルは下記の組成を有する。 ゲルを６０ワットの定出力で３−４時間操作し、次いで
１０％酢酸および１０％メタノール中で１５分間固定し
たのち、これらを紙の上で乾燥し、ＫｏｄａｋＸ線フィ
ルムに暴露する。ＴａｑＩ断片について決定された配列
に基づいて、新規オリゴヌクレオチドであるＮＣ８を作
成した。５’ＧＣＧＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＡＣＣ３’
の配列を有するこの新規オリゴヌクレオチドは、前もっ
てクローニングされた９００ｂｐの断片に隣接する８５
０ｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片を同定するためにサザンハイ
ブリッド形成に用いられ、この８５０ｂｐはｐＧＥＭ−
２にクローニングされてプラスミドｐＵＮＣ１５（第２
図）を生成し、前記の手法で配列決定された。ＰＩ遺伝
子の全配列を第３図に示す。この配列の唯一の大きな読
みとり枠は塩基８４と１０６２の間に存在しており、こ
れは３２６個アミノ酸タンパク質に相当する。種々のＰ
Ｉタンパク質の刊行されたＮ−末端アミノ酸配列（Ｂｌ
ａｋｅ，上記）から、成熟タンパク質の最初の残基はお
そらく塩基１４１のアスパラギン酸であった。このこと
は３０７アミノ酸の成熟タンパク質および１９アミノ酸
のシグナルペプチドを与える。このタンパク質の推定の
大きさは３３，７８６ダルトンであり、これはＦＡ１９
におけるＰＩの見かけの分子量３５，０００に近い。こ
のシグナルペプチドは、このような配列に関連した共通
の特性を有すると思われ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４：９９−１０５，１９８
５）、一続きの疎水性アミノ酸、豊富なアラニン残基お
よびＡｌａ−Ｘ−Ａｌａ切断部位を有する。また推定−
３５および−１０プロモーター配列、およびシグナル配
列の最初の残基のすぐ上流にＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒ
ｎｏリボゾーム結合部位も存在していた。上記プロモー
ター配列は配列および分離に関して大腸菌におけるこれ
らの配列に関するコンセンサスに近い（Ｈａｒｌｅｙ
ら、Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄ Ｒｅｓ，１５：２３４３−２
３６１，１９８７）。予想されるＮ−末端アミノ酸配列
は、推定ＰＩＡタンパク質のアミノ酸配列決定により決
定されたものに合致し、（Ｂｌａｋｅ，Ｔｈｅ Ｐａｔ
ｈｏｇｅｎｉｃ Ｎｅｉｓｅｅｒｉａ，Ｇ．Ｋ．Ｓｃｈ
ｏｏｌｎｉｋ編、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，Ｗａｓｈ．）、Ｒ１０のＰＩＢタンパク質のそれ
ときわめて類似していた。予想されるタンパク質のヒド
ロパシープロフィールは、外層膜ポーリンタンパク質の
それに典型的であり、大腸菌０ｍｐＦおよび０ｍｐＣの
主要ポーリンと比較して優れており（第４図）、実質的
に疎水性伸長部をまったく持たない長い親水性領域によ
って特色付けられた。他の配列決定された淋菌外層膜タ
ンパク質のヒドロパシープロフィールとの相関はほとん
ど存在しなかった。 ６．２．遺伝子発現 完全なＰＩ遺伝子クローンを、ｐＵＮＣ３およびｐＵＮ
Ｃ１５のＳａｕ３ＡＩ断片の遺伝子の２つの部分を結合
させることによって回収する試みは、繰り返し失敗に終
わり、淋菌ＰＩは大腸菌にとって致死的であるという結
論に至った。したがって、ＰＩ遺伝子プロモーターの一
部分を除去し、ＰＩ遺伝子がｐＧＥＭ−２上でファージ
Ｔ７プロモーターの下流に位置するように、組換えプラ
スミドを構築した。大腸菌細胞は普通はＴ７プロモータ
ーから下流の遺伝子を転写するＴ７ポリメラーゼを含有
しないため、このプラスミドは安定に保持される。この
ようにして構築されたプラスミドがｐＵＮＣ７であり、
第５図に示したスキームにしたがって調製された。ＰＩ
遺伝子プロモーターの−３５と−１０領域の間の従来の
ＨａｅＩＩＩ部位により、−３５領域およびその上流配
列が容易に除去をできた。次に遺伝子の残りの部分をＴ
７プロモーターの制御下でｐＧＥＭ−２に挿入した。ｐ
ＵＮＣ７で形質転換されたＨＢ１０１は、コロニーラジ
オイムノアッセイで検出可能なＰＩを発現しなかった。
次に、ファージＴ７ポリメラーゼ遺伝子を有するがＬａ
ｃ ＵＶ５プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏ
ｌ，Ｂｉ ｏｌ．１８９：１１３−１３０，１９８６）の
制御下にある溶原菌である。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）
を、プラスミドｐＵＮＣ７で形質転換した。イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含
まない培地で生育させると、プラスミドｐＵＮＣ７を有
するＢＬ２１（ＤＥ３）は検出可能なＰＩを生産しなか
ったが、培地中にＴ７ポリメラーゼ生産を誘導するＩＰ
ＴＧが存在すると、ＰＩ遺伝子生産物はコロニーブロッ
トラジオイムノアッセイでＰＩＡモノクローナル抗体に
よって検出された。発現されたタンパク質は、生産物が
細胞を溶解することなくコロニーラジオイムノアッセイ
で検出されうることから、大腸菌クローンの内層膜を通
って有効に運び出されると思われる。このタンパク質
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（第６図Ａ）およびウェスタンブ
ロッティング（第６図Ｂ）によって検出されたＦＡ１９
と比較して、同等の見かけの分子量を有し、ＩＰＴＧ存
在下で一晩生育させる間にクローンによって産生される
最も大量のタンパク質であるとも思われる。このタンパ
ク質生産は特にこの大腸菌株に致死的であり、安定な細
胞を回収することはできない。しかしＩＰＴＧ含有培地
での生育によって発現が誘導されないならば、ＰＩ遺伝
子を包含するプラスミドｐＵＮＣ７を有する菌株中に安
定に保持することがてきる。プラスミドｐＵＮＣ７を有
する菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）の生物学的に純粋な培養物
は、１９８７年１１月１３日に、ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈｅ
ｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ−ｒ
ａｔｏｒｙ（ＮＲＲＬ）に受託番号ＮＲＲＬ ♯Ｂ−１
９２６３のもとに寄託された。 ７．実施例２：ＰＩＢ遺伝子の同定、単離、配列決定お
よび発現ならびにＰＩＡ／Ｂハイブリッドの構築および
発現 ｎｍｐ 遺伝子座がＰＩ構造遺伝子であること、そしてＰ
ＩＡおよびＰＩＢタンパク質が対立遺伝子であることを
示そうとする試みの結果として、ＰＩＢ遺伝子およびＰ
ＩＡ／Ｂハイブリッドの両者が同定および単離された。
順次行われる手順はＰＩＡ含有菌株への選択可能なマー
カーの挿入、それに続くＰＩＢ生産菌株の形質転換を包
含する。これらの操作法の輪郭を以下に詳細に述べる。 ７．１．ＰＩ遺伝子への選択可能なマーカーの挿入 ＦＡ１９（ＰＩＡ生産菌株）のＰＩ遺伝子の最初の４５
コドンおよび上流配列を含む、上記ｐＵＮＣ３の９００
ｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片を、ＢａｍＨＩ消化ｐＨＳＳ６
に結合してプラスミドｐＮＣＳ２を作成した（第７
図）。次にこのプラスミドをシャトル突然変異誘発に付
した。シャトル突然変異誘発はＳａｉｆｅｒｔら（上
記）の方法の変法を用いて行った。標的のＤＮＡをｐＨ
ＳＳ６にサブクローニングし、大腸菌株ＲＤＰ１４６
（ｐＴＣＡ）に形質転換により導入し、続いて接合によ
りｐＯＸ３８：：ｍＴｎ３Ｃｍ−３（大腸菌Ｗ３１１
ｐｏｌＡ由来）を導入した。トランス接合体を３０℃で
一夜生育させて転位を起こさせ、続いて数時間３７℃で
生育させた。トランス接合体の「プール」（約１０００
コロニー）を再懸濁し、大腸菌ＮＳ２１１４Ｓｍとの接
合に際してドナーとして使用した。その場合、標的のプ
ラスミドへ転位する際に中間体として生じたプラスミド
同時組込み体が分解する（Ｓｅｉｆｅｒｔら、上記）。
こうして挿入されたトランスポゾンは、プラスミドｐＴ
ＣＡ上でトランスに与えられるトランスポザーゼ機能が
もはや存在しないため安定である。この場合に用いられ
たミニトランスポゾンは、Ｔｎ３のｂｌａ遺伝子がクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）遺伝子により置き換えられたｍＴｎ３Ｃｍ−３であ
る。ｐＮＣＳ２の９００ｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片内のｍ
Ｔｎ３Ｃｍ−３挿入部位をマッピングした後、種々の部
位にｍＴｎ３Ｃｍ−３を有する５種のこのような構築物
を、全挿入物を線状断片として放出させＮｏｔＩで消化
して、ＦＡ１９を形質転換するのに使用した。消化され
たプラスミドであるｐＮＣＳ３２（第７図）だけが、約
１×１０-7の頻度でＦＡ１９をＣｍrに形質転換した。
ｐＮＣＳ３２におけるｍＴｎ３Ｃｍ−３の挿入部位はＰ
ＩＡ遺伝子プロモーター配列の約３００ｂｐ上流であっ
たが、他の４つのプラスミドの挿入部位はすべて、ＰＩ
遺伝子内ではないがより近接していた。形質転換体ＦＡ
１９ ＣＡＴ Ｄ１（第７図）のゲノム中のｍＴｎ３Ｃｍ
−３の位置をサザンハイブリッド形成によって確認し
た。先行する研究（Ｃａｎｎｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ，１４３：８４７−８５１，１９８０；Ｉｎｆｅ
ｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：５４７−５５２，１９８１）
はＰＩの分子量および抗原性に影響を与えるｎｍｐ遺伝
子座が淋菌ゲノム上で抗生物質耐性マーカーｓｔｒおよ
びｓｐｃと、ｓｔｒ−ｓｐｃと、ｎｍｐの順で近接して
結合しており、同時形質転換頻度はｓｔｒおよびｎｍｐ
について５％、ｓｐｃおよびｎｍｐについては約２３％
であることを示している。ＰＩ構造遺伝子に隣接するＦ
Ａ１９ ＣＡＴ Ｄ１のＣＡＴマーカーがｎｍｐ遺伝子座
と同じリンケージパターンを示したかどうかを調べるた
めに、菌株ＦＡ１３０（ＳｔｒrＳｐｃrＣｍs）Ｓａｒ
ｕｂｂｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２０：１２８
４−１２９２，１９７４）とＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１（Ｓ
ｔｒsＳｐｃsＣｍr）の間で相互乗り換えを行った。Ｆ
Ａ１３０ ＤＮＡをＦＡ１９ ＣＡＴＤ１の形質転換に用
いた場合に、ＳｔｒｒまたはＳｐｃｒのいずれか一方を
選択すると、同時形質転換頻度はｓｐｃおよびＣＡＴに
ついて２６％（９９／３８３）、ｓｔｒおよびＣＡＴに
ついて７．５％（４０／５３７）てあった。相互乗り換
えにおいて、Ｃｍrを選択すると、同時形質転換頻度は
ｓｐｃおよびＣＡＴについて１０％（１１／１１１）、
ｓｔｒおよびＣＡＴについて１％（１／１１１）であっ
た。乗り換え程度の分析により、遺伝子の順序がｓｔｒ
…ｓｐｃ…ＣＡＴであることが確認された。これらのデ
ータはＣＡＴ遺伝子がｎｍｐ遺伝子座と同じ様式でｓｔ
ｒおよびｓｐｃマーカーと結合していることを実証し
た。このことはｎｍｐ遺伝子座がＰＩの構造遺伝子であ
ることの強力な証拠を与える。もう一つの乗り換えに際
しては、ＰＩＢ菌株ＭＳ１１を形質転換するためにＦＡ
１９ ＣＡＴ Ｄ１ ＤＮＡを用い、Ｃｍrを選択した。４
５個の形質転換体のうち、２４個は供与株のＰＩＡを獲
得し、１３個は受容株ＰＩＢを保持し、そして８個は新
規ハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を発現した。
これはコロニーイムノブロッティングにより検出され
た。近接して結合したＣＡＴ遺伝子を選択するときの供
与株ＰＩＡによる受容株ＰＩＢの置換は、これらの遺伝
子の対立遺伝子としての性質を確証するものであり、そ
してハイブリッドタンパク質が高頻度に出現すること
は、２つの対立遺伝子間の配列相同性により遺伝子内組
換えが起こることを示唆した。これらのＰＩハイブリッ
ド菌株の詳細な分析はＭＳ１１のＰＩＢ配列に関する知
識の如何に左右されるので、この配列をクローニングし
て配列決定した。 ７．２．ＰＩＢ遺伝子のクローニング、配列決定及び発
現 完全無欠な淋菌ＰＩ遺伝子を大腸菌にクローニングする
ことはできないと思われるため、一緒になって完全な遺
伝子配列を含有するものであるＰＩＡについて上記した
クローニング断片の方法を、ＭＳ１１ ＰＩ遺伝子に採
用した。予めハイブリッドＰＩを有するとして特性決定
された菌株ＦＡ６１４９（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎら、Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５２９−５３３，１９８
６）のＰＩ遺伝子内からのＤＮＡ断片を、クローニング
して配列決定し、そして配列のＰＩＢ部分、遺伝子の開
始点から約３００ｂｐ、にＫｐｎＩ部位が存在すること
が判明した。ＫｐｎＩ部位下流のＰＩＢ遺伝子配列から
誘導されたオリゴヌクレオチドＮＣ１２（第８図）、お
よびこのタンパク質のＮ−末端に対応する遺伝子配列か
ら誘導されたＮＣ１（第１図）を、サザンハイブリッド
形成でのプローブとして用い、ＭＳ１１ ＰＩ遺伝子に
ＫｐｎＩ部位が存在することを確認した。ベクタープラ
スミドｐＧＥＭ−３にクローニングされたＫｐｎＩ／Ｈ
ｉｎｃＩＩ−消化ＭＳ１１ ＤＮＡを含有するＨＢ１０
１コロニーを、これらのオリゴヌクレオチドをプローブ
として探査し、ＮＣ１２とハイブリッド形成するコロニ
ーを検出し、そしてこれらのコロニーがＮＣ１２とハイ
ブリッド形成した１．８ｋｂのＫｐｎＩ／ＨｉｎｃＩＩ
断片を有するプラスミドを含有することを見いだした。
このプラスミドをｐＵＮＣＨ２２（第８図）と命名し
た。しかし繰り返し試みても、ＮＣ１とハイブリッド形
成するコロニーは検出されなかった。ＮＣ１はサザンハ
イブリッド形成でＭＳ１１ゲノムＤＮＡの７５０ｂｐの
ＫｐｎＩ／ＨｉｎｃＩＩ断片とハイブリッド形成したた
め、問題点は大きさにあるのではなく、コピー数の多い
ベクターにおいては、ＨＢ１０１に対して致命的である
この断片のＰＩ遺伝子部分の発現の問題である可能性が
高いと思われた。この理由から、プローブとしてオリゴ
ヌクレオチドＮＣ１を用いて、ＭＳ１１ＰＩ遺伝子の残
りの部分をλｇι１１における５４０ｂｐのＨｉｎｆＩ
断片として単離した。このクローンをλｇｔ１１．ＮＣ
１（第８図）と命名した。λｇｔ１１．ＮＣ１の５４０
ｂｐのＨｉｎｆＩ断片およびｐＵＮＣＨ２２のＫｐｎＩ
−Ｓａｕ３ＡＩフラグメントをさらに消化し、サブクロ
ーニングし、配列決定した。この配列を第９図に示す。
この配列から３５０アミノ酸のタンパク質が予想され、
そのうち最初の１９は推定シグナルペプチドである、Ｆ
Ａ１９およびＭＳ１１のＰＩ遺伝子の比較は、８０％の
ヌクレオチド配列相同性を示す。ＰＩＡ（ＦＡ１９）お
よびＰＩＢ（ＭＳ１１）の予想アミノ酸配列の比較を第
１０図に示す。これは長い相同領域が散在する数多くの
有意に相違する領域を示す。淋菌細胞全体に対して生じ
るＰＩ−特異的モノクローナル抗体はＰＩＡとＰＩＢと
の間で全く交差反応性ではないので（Ｋｎａｐｐら、
Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５０：４４−４８，１９
８４）、相違領域の一部はおそらくタンパク質の表面に
露出した抗原性の部分に相当する。ＰＩＡの場合と同じ
方法を用いて完全なＰＩＢ遺伝子の発現を達成した
（６．２節）。ＰＩＢ遺伝子プロモーターの−３５およ
び−１０領域間のＮｃｉＩ部位から遺伝子内のＫｐｎＩ
部位までのλｇｔ１１．ＮＣ１挿入ＤＮＡの断片を、Ｈ
ｉｎｃＩＩおよびＢａｍＨＩで消化されたベクターｐＧ
ＥＭ−２内にｐＵＮＣＨ２２の７５０ｂｐのＫｐｎＩ−
Ｓａｕ３ＡＩ断片と一緒に連結させた。この結果、それ
自身のプロモーターを持たないがプラスミドベクター上
のＴ７プロモーターのすぐ下流に完全なＰＩＢコード配
列を生じた。この構築物（ｐＵＮＣＨ２５）をＢＬ２１
（ＤＥ３）に導入し、ＩＰＴＧ存在下に生育させると、
ＰＩＢの発現を検出することができた（第１１図）。プ
ラスミドｐＵＮＣＨ２５を有する生物学的に純粋な大腸
菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）培養物は、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに受託番号
６７７７５のもとに寄託されている。 ７．３．ＰＩＡ／Ｂハイブリッド菌株の構築および分析 さらに、ＭＳ１１をＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１ ＤＮＡで形
質転換し（Ｂｉｓｗａｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１２９：９８３−９９２，１９７７）、Ｃｍrを選択
し、イムノブロッティングによりＰＩを検出することに
より、ＰＩＡ／Ｂハイブリッドを構築した。相互乗り換
えにおいて、ＰＩＢを保持しているＭＳ１１のＣｍr形
質転換体由来のＤＮＡをＦＡ１９の形質転換に使用し、
Ｃｍrで選択し前記のようにＰＩを検出した。抗生物質
耐性を表現型として発現させるために、細胞をＧＣ基礎
ブロス中で、あるいは抗生物質を含有する軟寒天上層を
添加した。ＧＣ基礎寒天培地中で５時間インキュベート
した。受容株としてＦＡ１９を用い、Ｃｍrで選択する
ときは１μｇ／ｍｌの抗生物質を使用したが、ＭＳ１１
を受容株であるときは１０μｇ／ｍｌを用いた。Ｃａｎ
ｎｏｎらの方法の変法を用いてモノクローナル抗体の結
合について細菌株をアッセイした。ＧＣ基礎ブロス中の
高濃度細胞懸濁液を濾過マニホルドを用いてニトロセル
ロースに移し、クロロホルム蒸気中で溶解させた。この
フィルターを５％粉乳を含有するＴＢＳ（１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に浸
漬し、適当な抗体を含有するＴＢＳ中でインキュベート
し、つぎにＴＢＳ中で洗浄した。二次抗体と接合した抗
マウスＩｇＧ−アルカリフォスファターゼ（Ｓｉｇｍ
ａ）中でインキュベートし、さらに洗浄した後、フィル
ターをニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルホスフェート（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
を用いて製造業者の指示にしたがって展開した。使用し
たモノクローナル抗体は、４Ａ１２，４Ｇ５，２Ｆ１
２，６Ｄ９，５Ｇ９，５Ｄ１（１０），１Ｄ３（２６）
およびＳＭ１０１（２７）（これらは全てＰＩＡ特異的
である）、ならびに１Ｆ５，３Ｃ８，２Ｄ４および２Ｈ
１（１０）（これらはＰＩＢ特異的である）であった。
ＳＭ１０１以外の全ての抗体はＭ．Ｔａｍ（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）の厚意により腹水中で供給され、
１：２０００ないし１：１００００の希釈で用いられ
た。ＳＭ１０１はＪ．Ｈｅｃｋｅｌｓ（Ｓｏｕｔｈａｍ
ｐｔｏｎ大学）の厚意により提供された。受容株として
ＦＡ１９を用いた３００個の形質転換体のうち、３個が
ハイブリッドＰＩを有した。１３個のハイブリッド菌株
のうち、５個の異なるハイブリッドＰＩ血清型が同定さ
れた（第Ｉ表）。次にハイブリッドＰＩ遺伝子のどの部
分がＰＩ配列であるか、そしてどれがＰＩＢ配列である
かを評価するために、多数のＰＩＡ−及びＰＩＢ−特異
的オリゴヌクレオチド（第ＩＩ表および第１０図）を用
いるコロニーハイブリッド形成によりハイブリッド菌株
を分析し、この方法により９個の異なるクラスが検出さ
れた（第１０図）構造を既知のハイブリッドＰＩの血清
型の分析により、これらのモノクローナル抗体について
のエピトープのおよその位置を決定することができた。 クラス１ハイブリッドと反応するＰＩＡ特異的モノクロ
ーナル抗体４Ｇ５、２Ｆ１２およびＳＭ１０１のエピト
ープは、タンパク質のＮ−末端の近く、最初の６０残基
以内に存在するはずである。ハイブリッドクラス１、５
および６の比較は、ＳＭ１０１に対するエピトープが少
なくとも部分的には残基３４と６０の間の領域に存在す
ることが示唆される。Ｎ−末端６０残基はＰＩＡおよび
ＰＩＢ間で有意な相違を含み（第３図、第９図、第１０
図）、これはこれらの抗体の特異性の説明となりうる。
ハイブリッドクラス６−９と反応する６Ｄ９（ＰＩＡ特
異的）のエピトープは、残基１８７から２５０までのタ
ンパク質領域に存在し、この領域もまたＰＩＡおよびＰ
ＩＢの間で有意に異なる領域を含む。４Ａ１２，５Ｇ
９，５Ｄ１および１Ｄ３（すべてＰＩＡ特異的）のエピ
トープは、クラス９のハイブリッドタンパク質において
のみ検出され、したがっておそらくタンパク質のＮ−末
端およびＣ−末端部分の両方を含む複合エピトープであ
る。このことは、タンパク質が比較的に変性されるウェ
スタンブロットではＰＩとよく反応しないという観察に
よって支持される。ＭＳ１１のＰＩＢと反応する４個の
抗体のうち、ハイブリッドクラス７および８と反応する
７Ｆ５のエピトープはＮ−末端６０残基内に位置する
が、３Ｃ８，２Ｄ４および２Ｈ１のエピトープは分岐配
列を含有するタンパク質の中央部、残基１５０から２７
０までの間に存在すると思われ、この部分は長く伸びた
クラス９ハイブリッドタンパク質が３Ｄ８とのみ反応す
ることから、３Ｃ８のエピトープは２Ｄ４および２Ｈ１
のエピトープのわずかに上流に位置する。しかし、２Ｄ
４および２Ｈ１がウエスタンブロットではＰＩＢと反応
しないことから、これらのエピトープは比較的複雑であ
りうる。ハイブリッドＰＩＡ／Ｂ遺伝子を含有してハイ
ブリッドＰＩＡ／Ｂタンパク質を発現する形質転換微生
物ＦＡ６２４８の生物学的に純粋な培養物は、ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに受託番号５
３８０８のもとに寄託されている。 ７．４．考察 リポーター遺伝子をＰＩ構造遺伝子の近くに挿入した本
研究は、ＰＩＡおよびＰＩＢ構造遺伝子が同じ遺伝子座
の対立遺伝子であることを実証するものであり、この遺
伝子座はすでにｎｍｐとして同定された（Ｃａｎｎｏｎ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４３：８４７−８５
１，１９８０）。淋菌ゲノム上の１個のＰＩ遺伝子の存
在は、天然に存在する菌株がＰＩＡまたはＰＩＢタンパ
ク質のいずれか一方を有し両方を持つことは決してな
く、そしてＰＩ血清型が安定に保持されるとの観察に符
号する。ＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子と推定アミノ酸配列
の比較は高度の相同性を示したが、有意に配列の異なる
領域が確認された。ＰＩハイブリッドは天然には生じな
いが、本発明者らが構築したＰＩハイブリッドはインビ
トロで安定に生存した。しかし、ＰＩＢＮ−末端とのハ
イブリッドＰＩの形成頻度が比較的低く、ＰＩ遺伝子内
で多重乗り換えの起こる頻度が驚異的に高いことは、あ
る種のクラスのハイブリッドＰＩをインビトロ生育した
淋菌が好むのかも知れない。ＰＩハィブリッドの構築お
よび分析によって、本発明者らはタンパク質のいくつか
の表面露出部分のおよその位置を決定することができ、
二次および四次構造の可能性に対する知見が与えられ
た。ＰＩＡおよびＰＩＢの両方のＮ−末端領域は、各タ
ンパク質の中央部にある少なくとも１つの別の領域とと
もに表面に露出しているとと思われる。多くのＰＩＡ特
異的モノクローナル抗体のエピトープはＮ−末端および
Ｃ−末端部分の両方がハイブリッドＰＩ内に存在すると
きにのみ同定されたことから、外層膜内でのＰＩＡの折
り畳み状態はＮ−末端およびＣ−末端部分が表面上で密
接に関連しているような状態かもしれない。外層膜内で
のＰＡのコンフォーメーションに関するこのようなモデ
ルは、非処理の淋菌内でのＰＩのタンパク質加水分解的
切断に基づく先行モデルのいくつかの態様と一致するが
（Ｂｌａｋｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３３：２
１２−２２２，１９８１；Ｊｕｄｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｉｍｍｕｎ．５４：４０８−４１４，１９８６）、ＰＩ
ＡのＮ−末端およびＰＩＢの中央部分のみが表面に露出
している（Ｂｌａｋｅら、上記；Ｔｅｅｒｌｉｎｋ，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：６３−７６，１９８７）
との既報の示唆とは異なる。 ８．微生物の寄託 列挙したプラスミドを有する下記の大腸菌株は、ｔｈｅ
Ａｇｒｉｃｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ），Ｐｅｏｒ
ｉａ，ＩＬまたはｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ，ＭＤに寄託され、表記の受託番号が付与されてい
る。 本発明は寄託された菌株により範囲を限定されるもので
はない。なぜならば各菌株は本発明の一態様の一つの説
明として意図されるからであり、機能的に同等な全ての
細胞系は本発明の範囲を包含される。実際、ここに示さ
れかつ記載されたことに加えて本発明を種々変更するこ
とは、前記記載から当業者に明らかになるであろう。こ
のような変更は添付の請求の範囲内に包含されるものと
する。また、ヌクレオチドについて与えられた全ての塩
基対の大きさは概数であり、説明の目的で用いられるこ
とは当然のことである。
よび発現 本発明の方法にしたがって、淋菌ＤＮＡの断片を得、個
々の断片を別々にクローニングし、次いで外来の誘導可
能プロモーターとともに遺伝子を再構築することによ
り、ＰＩＡ遺伝子配列を決定した。前述のように、オリ
ゴヌクレオチドＮＣ１とのハイブリッド形成により、Ｐ
ＩＡ遺伝子配列の部分を有する２個の推定断片を同定し
た。次に関連する制限フラグメントをそれぞれｐＧＥＭ
−２プラスミドベクターに結合し、適当な宿主に形質転
換した。オリゴＮＣ１とハイブリッド形成した形質転換
体を単離した。これらのクローンからプラスミドＤＮＡ
を調製し、適当な制限酵素で消化し、再びＮＣ１をプロ
ーブとして探査した。ＮＣ１とハイブリッド形成した個
々の断片を、次いで別々にｐＧＥＭ−２プラスミドに再
連結して、２つの別個のプラスミド、ｐＵＮＣ３および
ｐＵＮＣ１１を得た。７５０ｂｐ断片のＤＮＡ配列の同
一性は、それに由来するより小さな制限断片をＭ１３ｍ
ｐＲＦ ＤＮＡにサブクローニングし、次いでサンガー
法（ＰＮＡＳＵＳＡ ７４，５４６３−５４６７，１９
７７）にしたがって配列決定することにより決定され
た。この配列から、新規オリゴヌクレオチドを合成し
た。ＮＣ８と命名したこの新規オリゴヌクレオチドを、
すでにクローニングされた９００ｂｐ断片に隣接する８
５０ｂｐ断片を同定するために使用し、この断片をｐＧ
ＥＭ−２にクローニングしてｐＵＮＣ１５を生成させ、
サンガー法（上記）により配列決定した。プラスミド調
製、配列決定、ハイブリッド形成および形質転換に関す
る操作法の詳細、を以下に述べる。 ６．１．プラスミドの調製に用いられる一般的操作法 以下の小節には、ＤＮＡ単離、酵素反応、断片の単離お
よび結合反応に用いられる一般的操作法が記載される。 ６．１．１．制限酵素に関する条件 この実験に用いられる制限酵素は、特に指示しない限り
Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手さ
れる。Ｎ．ゴノロエアエ培養物は、ケロッグの添加物
（Ｋｅｌｌｏｇｇ’ｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）Ｉおよ
びＩＩ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．８５：１２７４−１
２７９，１９６３）を含有するＧＣ基礎培地（ＤＩＦＣ
Ｏ）中で５％ＣＯ2雰囲気下で増殖させる。Ｍａｎｅｓ
ｓら（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２８：３２１−３
３０）に記載された淋菌株ＦＡ１９から、Ｓｔｅｒｎら
（Ｃｅｌｌ ３７：４４７−４５６，１９８４）の方法
にしたがって、消化に必要なＤＮＡを単離した。この菌
株はプロティンＩＡを生産することが知られている。下
記の条件下で全ての消化を行った。約２０μｌのＤＮＡ
試料を、２−１０倍過剰の制限酵素中で３７℃で１−３
時間インキュベートした。この条件の例外は、ＴａｑＩ
に関して温度６５℃、ＳｍａＩに関して３０℃である。 ６．１．２．制限酵素緩衝液 ＡｃｃＩ、ＭｓｐＩおよびＲｓａＩ消化に用いた緩衝液
は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌおよび１０ｍＭＭｇＣｌ2
からなり、ｐＨ８である。ＡｖａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＴａｑＩ消化に用いた緩衝液は、５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ2および５０ｍＭ ＮａＣｌか
らなり、ｐＨ８である。ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよび
ＳａｌＩ消化に用いた緩衝液は、５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2および１００ｍＭ ＮａＣｌか
らなり、ｐＨ８である。ＨｉｎｃＩＩ、Ｓａｕ３ＡＩお
よびＳｍａＩ消化に用いた緩衝液は、２０ｍＭトリス−
ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2および５０ｍＭ ＫＣｌから
なり、ｐＨ７．４である。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ
７．５）を最終濃度１０ｍＭとなるように添加して反応
を停止させる。 ６．１．３．関連する制限断片の同定 大腸菌株ＨＢ１０１（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８２）において、ｐＢ
Ｒ３２２のＰＩＡを他のベクタープラスミド上にクロー
ニングする初期の試みは、否定的な結果の繰り返しであ
った。したがって、ＰＩＡ遺伝子またはそのタンパク質
を含有する断片を、オリゴヌクレオチドプローブとのハ
イブリッド形成によって同定することを試みることにし
た。Ｎ．ゴノロエアエ菌株Ｒ１０のＰＩＢの公知のＮ−
末端アミノ酸配列（Ｂｌａｋｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．，Ｉ
ｍｍｕｎ．３６：２７７−２８５，１９８２）に基づい
て、２つのプローブを設計した。２つの他の淋菌タンパ
ク質であるピリンＭｅｙｅｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８
１：６１１０−６１１４，１９８４）およびＰＩＩの遺
伝子配列から得られた限られた量のコドン使用データと
ともに、この情報をＮＣ１およびＮＣ２と命名された第
２図に示す１対のオリゴヌクレオチドを構築した。ＮＣ
１はただ一つの配列であり、ＮＣ２は正しい配列を同定
する確率を高めることを意図したヌクレオチドの混合集
団である。コロニーハイブリッド形成アッセイにおい
て、これら両方のオリゴヌクレオチドはＦＡ１９とハイ
ブリッド形成したが、ｐＢＲ３２２またはｐＧＥＭ−２
のいずれか一方を含有するＨＢ１０１とはハイブリッド
形成しなかった。制限エンドヌクレアーゼ消化されたＤ
ＮＡをアガロースゲルで操作し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎのブ
ロット法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１
７，１９７８）によりゲルからニトロセルロースフィル
ターへ移した。ＮＣ１およびＮＣ２オリゴプローブをＭ
ａｎｉａｔｉｓらの方法（上記）にしたがってポリヌク
レオチドキナーゼを用いてγ−Ｐ３２ＡＴＰ（ＩＣＮＲ
ａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉ
ｆ．）で標識した。下記の緩衝液中で末端標識を行っ
た。トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、０．１ｍ
Ｍスペルミジンおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ。ニトロセ
ルロースフィルター上のＤＮＡに対する標識オリゴヌク
レオチドのハイブリッド形成は、４×ＳＳＰＥ（０．１
８Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4［ｐＨ７．
４］、１ｍＭ ＥＤＴＡ）、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶
液（１×＝０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％
Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリジン）、２
０ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．２％ドデシル硫酸ナ
トリウムおよび５０μｇ／ｍｌサケ精液ＤＮＡ中で、ハ
イブリッド形成反応液１ｍｌ当り１０6ｃｐｍの標識オ
リゴヌクレオチドを用いて一晩行った。フィルターを１
×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン
酸ナトリウム）、５ｍＭピロリン酸ナトリウムおよび
０．１％ドデシル硫酸ナトリウム中で洗浄した。ハイブ
リッド形成および洗浄の温度は、ＮＣ１およびＮＣ２に
ついてそれぞれ４６℃および４０℃であった。フィルタ
ーを５×ＳＳＣ中で洗浄し、乾燥し、Ｋｏｄａｋ Ｘ線
フィルムに暴露した。１個のフラグメントに対するハイ
ブリッド形成が個々の場合に起こった。関連する断片は
ＥｃｏＲＩ−１０ｋｂ、ＳａｌＩ−５．５ｋｂ、Ｓａｕ
３ＡＩ−９００ｂｐおよびＴａｑＩ−７５０ｂｐであっ
た。ＮＣ１およびＮＣ２の両者について同一の結果が観
察された。 ６．１．４．断片のクローニング ｐＢＲ３２２にクローニングされたＥｃｏＲＩまたはＳ
ａｌＩ消化ＤＮＡを含有するＨＢ１０１のコロニーライ
ブラリーを、コロニーハイブリッド形成法によってオリ
ゴヌクレオチドＮＣ１をプローブとして探査すると、陽
性のコロニーは観察されなかった。このことはＰＩが大
腸菌に対して致死的てあることを示唆する先の観察を支
持した。ＦＡ１９ＤＮＡのより小さな断片、すなわちオ
リゴヌクレオチドとハイブリッド形成したＳａｕ３ＡＩ
およびＴａｑＩ消化物は、全ＰＩ遺伝子を含有していな
いと推定され、クローニングのための候補として選択さ
れた。各断片について、本格的に同じ操作にしたがっ
た。Ｓａｕ３ＡＩ断片については、全ＦＡ１９ ＤＮＡ
をＳａｕ３ＡＩで完全に消化した。プラスミドｐＧＥＭ
−２（Ｐｒｏｍｅｇａ ＢｉｏｔｅｃＭａｄｉｓｏｎ，
Ｗｉｓ．より入手）ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、Ｓａ
ｕ３ＡＩ断片に結合した。ＤＮＡ断片の結合はＴ４リガ
ーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖ
ｅｒｌｅｙ，Ｍａｓｓ．）を用い４℃で１６時間、次の
バッファー中で行った。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５％（ｗ／ｖ）ポリエ
チレングリコール８０００、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ Ｄ
ＴＴ。ＭａｎｄｅｌおよびＨｉｇａの塩化カルシウム法
（Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．５３：１５４，１９７０）に
より、この組換えプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を形質
転換した。これについて概説すると、細菌細胞を５０ｍ
Ｍ ＣａＣｌ2および１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、
の氷冷滅菌溶液に懸濁し、次いで結合緩衝液中でプラス
ミドＤＮＡと混合する。約２０００個の形質転換が回収
された。細菌コロニーを、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨ
ｏｇｎｅｓｓの方法（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８２：３９６１
−３９６５，１９７５）にしたがってハイブリッド形成
により調製されたニトロセルロースフィルター上に移
し、オリゴＮＣｌとのハイブリッド形成を観察した。１
個のコロニーが実際にこのオリゴヌクレオチドとハイブ
リッド形成した。プラスミドＤＮＡを増幅し、集め、Ｓ
ａｕ３ＡＩで消化し、すでに述べたサザンハイブリッド
形成法によってオリゴＮＣｌをプローブとして探査し
た。９００ｂｐの１個の断片がこのオリゴヌクレオチド
とハイブリッド形成し、これは先のサザンハイブリッド
形成によって同定されたＦＡ１９のＳａｕ３ＡＩゲノム
断片と同じ大きさであった。この断片を切り取り、アガ
ロースゲルから電気的に溶出し（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕ
ｔｅ）、ＢａｍＨｌ消化ｐＧＥＭ−２プラスミドに再び
結合させて、組換えプラスミドｐＵＮＣ３を作成した
（第２図）。オリゴＮＣ１とハイブリッド形成したＦＡ
１９の７５０ｂｐのＴａｑＩ断片を用いて実質的に前記
と同じ操作を行った。しかし、ＴａｑＩ断片はｐＧＥＭ
−２のＡｃｃＩ消化部位に結合して、組換えプラスミド
ＰＵＮＣ１１を得た（第２図）。 ６．１．５．サブクローニングおよび断片の配列決定 配列決定に先立って、７５０ｂｐのＴａｑＩ断片を酵素
ＲｓａＩおよびＭｓｐＩを用いて消化して、３００ｂｐ
以下のより小さな制限断片とした。次いで断片の末端を
修復し、Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ら（Ｇｅｎｅ ２６：１０
１−１０６，１９８３）により記載されたようにして、
Ｍ１３ ｍｐ１８ ＲＦ ＤＮＡのＳｍａＩ部位に結合し
た。次いで、このクローニングベクターによって作成さ
れた１本鎖ＤＮＡは、Ｓａｎｇｅｒらの方法（ＰＮＡＳ
ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７，１９７７）によっ
て配列決定するための鋳型として用いられる。Ｓａｎｇ
ｅｒ（上記）およびそれに含まれる参考文献（ＢＲＬ，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）に記載の方法にし
たがって、ジデオキシヌクレオチドを調製することがで
きる。各ＤＮＡ試料につき４個のウェル、すなわちジデ
オキシヌクレオチドｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣおよびｄｄ
Ｇのそれぞれについて１個のウェルを用意する。各ウェ
ルに、鋳型ＤＮＡ２μｌ、ならびにプライマー混合物
（ＢＲＬ由来の１１μｌの（２２ｎｇ）Ｍ１３ １７塩
基プライマー、１１μｌのＴＭ（１００ｍＭトリス＋５
０ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ８．５）および６６μｌのＨ2
Ｏ（１０クローンにつき）からなる）２μｌを添加す
る。これらを回転させ、プラスチックラップでおおい、
５６℃で５０−６０分間インキュベートする。インキュ
ベートした後、２μｌの適当なＮＴＰ混合液を各ウェル
に添加する。各混合液は１０−５００μＭのｄｄＮＴＰ
および各６．２５μＭの通常のｄＮＴＰを含有する。Ｎ
ＴＰ混合液の添加後、２μｌのクレノウ混合液を各ウェ
ルに添加した。このクレノウ混合液は、１１μｌのクレ
ノウ（１Ｕ／μｌに希釈）、１１μｌの０．１Ｍジチオ
スレイトール、４．４μｌの３５Ｓ−ｄＡＴＰおよび６
１．６μｌのＨ2Ｏからなる。この混合物を回転させ、
プラスチックラップでおおい、３０℃で１５分間再度イ
ンキュベートする。各ウェルに２μｌの追跡用混合液
（４種の全てのｄＮＴＰ０．２５ｍＭ）を加え、回転さ
せ、３０℃で１５分間再度インキュベートする。次いで
２μｌのホルムアミド色素を各ウェルに加えた後、おお
いをせずに８０℃で１５分間インキュベートする。この
時点で、これらの混合物をゲルにすぐ負荷でき、あるい
はラップして−８０℃で保存することができる。この操
作法て使用したゲルは下記の組成を有する。 ゲルを６０ワットの定出力で３−４時間操作し、次いで
１０％酢酸および１０％メタノール中で１５分間固定し
たのち、これらを紙の上で乾燥し、ＫｏｄａｋＸ線フィ
ルムに暴露する。ＴａｑＩ断片について決定された配列
に基づいて、新規オリゴヌクレオチドであるＮＣ８を作
成した。５’ＧＣＧＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＡＣＣ３’
の配列を有するこの新規オリゴヌクレオチドは、前もっ
てクローニングされた９００ｂｐの断片に隣接する８５
０ｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片を同定するためにサザンハイ
ブリッド形成に用いられ、この８５０ｂｐはｐＧＥＭ−
２にクローニングされてプラスミドｐＵＮＣ１５（第２
図）を生成し、前記の手法で配列決定された。ＰＩ遺伝
子の全配列を第３図に示す。この配列の唯一の大きな読
みとり枠は塩基８４と１０６２の間に存在しており、こ
れは３２６個アミノ酸タンパク質に相当する。種々のＰ
Ｉタンパク質の刊行されたＮ−末端アミノ酸配列（Ｂｌ
ａｋｅ，上記）から、成熟タンパク質の最初の残基はお
そらく塩基１４１のアスパラギン酸であった。このこと
は３０７アミノ酸の成熟タンパク質および１９アミノ酸
のシグナルペプチドを与える。このタンパク質の推定の
大きさは３３，７８６ダルトンであり、これはＦＡ１９
におけるＰＩの見かけの分子量３５，０００に近い。こ
のシグナルペプチドは、このような配列に関連した共通
の特性を有すると思われ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４：９９−１０５，１９８
５）、一続きの疎水性アミノ酸、豊富なアラニン残基お
よびＡｌａ−Ｘ−Ａｌａ切断部位を有する。また推定−
３５および−１０プロモーター配列、およびシグナル配
列の最初の残基のすぐ上流にＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒ
ｎｏリボゾーム結合部位も存在していた。上記プロモー
ター配列は配列および分離に関して大腸菌におけるこれ
らの配列に関するコンセンサスに近い（Ｈａｒｌｅｙ
ら、Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄ Ｒｅｓ，１５：２３４３−２
３６１，１９８７）。予想されるＮ−末端アミノ酸配列
は、推定ＰＩＡタンパク質のアミノ酸配列決定により決
定されたものに合致し、（Ｂｌａｋｅ，Ｔｈｅ Ｐａｔ
ｈｏｇｅｎｉｃ Ｎｅｉｓｅｅｒｉａ，Ｇ．Ｋ．Ｓｃｈ
ｏｏｌｎｉｋ編、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，Ｗａｓｈ．）、Ｒ１０のＰＩＢタンパク質のそれ
ときわめて類似していた。予想されるタンパク質のヒド
ロパシープロフィールは、外層膜ポーリンタンパク質の
それに典型的であり、大腸菌０ｍｐＦおよび０ｍｐＣの
主要ポーリンと比較して優れており（第４図）、実質的
に疎水性伸長部をまったく持たない長い親水性領域によ
って特色付けられた。他の配列決定された淋菌外層膜タ
ンパク質のヒドロパシープロフィールとの相関はほとん
ど存在しなかった。 ６．２．遺伝子発現 完全なＰＩ遺伝子クローンを、ｐＵＮＣ３およびｐＵＮ
Ｃ１５のＳａｕ３ＡＩ断片の遺伝子の２つの部分を結合
させることによって回収する試みは、繰り返し失敗に終
わり、淋菌ＰＩは大腸菌にとって致死的であるという結
論に至った。したがって、ＰＩ遺伝子プロモーターの一
部分を除去し、ＰＩ遺伝子がｐＧＥＭ−２上でファージ
Ｔ７プロモーターの下流に位置するように、組換えプラ
スミドを構築した。大腸菌細胞は普通はＴ７プロモータ
ーから下流の遺伝子を転写するＴ７ポリメラーゼを含有
しないため、このプラスミドは安定に保持される。この
ようにして構築されたプラスミドがｐＵＮＣ７であり、
第５図に示したスキームにしたがって調製された。ＰＩ
遺伝子プロモーターの−３５と−１０領域の間の従来の
ＨａｅＩＩＩ部位により、−３５領域およびその上流配
列が容易に除去をできた。次に遺伝子の残りの部分をＴ
７プロモーターの制御下でｐＧＥＭ−２に挿入した。ｐ
ＵＮＣ７で形質転換されたＨＢ１０１は、コロニーラジ
オイムノアッセイで検出可能なＰＩを発現しなかった。
次に、ファージＴ７ポリメラーゼ遺伝子を有するがＬａ
ｃ ＵＶ５プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏ
ｌ，Ｂｉ ｏｌ．１８９：１１３−１３０，１９８６）の
制御下にある溶原菌である。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）
を、プラスミドｐＵＮＣ７で形質転換した。イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含
まない培地で生育させると、プラスミドｐＵＮＣ７を有
するＢＬ２１（ＤＥ３）は検出可能なＰＩを生産しなか
ったが、培地中にＴ７ポリメラーゼ生産を誘導するＩＰ
ＴＧが存在すると、ＰＩ遺伝子生産物はコロニーブロッ
トラジオイムノアッセイでＰＩＡモノクローナル抗体に
よって検出された。発現されたタンパク質は、生産物が
細胞を溶解することなくコロニーラジオイムノアッセイ
で検出されうることから、大腸菌クローンの内層膜を通
って有効に運び出されると思われる。このタンパク質
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（第６図Ａ）およびウェスタンブ
ロッティング（第６図Ｂ）によって検出されたＦＡ１９
と比較して、同等の見かけの分子量を有し、ＩＰＴＧ存
在下で一晩生育させる間にクローンによって産生される
最も大量のタンパク質であるとも思われる。このタンパ
ク質生産は特にこの大腸菌株に致死的であり、安定な細
胞を回収することはできない。しかしＩＰＴＧ含有培地
での生育によって発現が誘導されないならば、ＰＩ遺伝
子を包含するプラスミドｐＵＮＣ７を有する菌株中に安
定に保持することがてきる。プラスミドｐＵＮＣ７を有
する菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）の生物学的に純粋な培養物
は、１９８７年１１月１３日に、ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈｅ
ｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ−ｒ
ａｔｏｒｙ（ＮＲＲＬ）に受託番号ＮＲＲＬ ♯Ｂ−１
９２６３のもとに寄託された。 ７．実施例２：ＰＩＢ遺伝子の同定、単離、配列決定お
よび発現ならびにＰＩＡ／Ｂハイブリッドの構築および
発現 ｎｍｐ 遺伝子座がＰＩ構造遺伝子であること、そしてＰ
ＩＡおよびＰＩＢタンパク質が対立遺伝子であることを
示そうとする試みの結果として、ＰＩＢ遺伝子およびＰ
ＩＡ／Ｂハイブリッドの両者が同定および単離された。
順次行われる手順はＰＩＡ含有菌株への選択可能なマー
カーの挿入、それに続くＰＩＢ生産菌株の形質転換を包
含する。これらの操作法の輪郭を以下に詳細に述べる。 ７．１．ＰＩ遺伝子への選択可能なマーカーの挿入 ＦＡ１９（ＰＩＡ生産菌株）のＰＩ遺伝子の最初の４５
コドンおよび上流配列を含む、上記ｐＵＮＣ３の９００
ｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片を、ＢａｍＨＩ消化ｐＨＳＳ６
に結合してプラスミドｐＮＣＳ２を作成した（第７
図）。次にこのプラスミドをシャトル突然変異誘発に付
した。シャトル突然変異誘発はＳａｉｆｅｒｔら（上
記）の方法の変法を用いて行った。標的のＤＮＡをｐＨ
ＳＳ６にサブクローニングし、大腸菌株ＲＤＰ１４６
（ｐＴＣＡ）に形質転換により導入し、続いて接合によ
りｐＯＸ３８：：ｍＴｎ３Ｃｍ−３（大腸菌Ｗ３１１
ｐｏｌＡ由来）を導入した。トランス接合体を３０℃で
一夜生育させて転位を起こさせ、続いて数時間３７℃で
生育させた。トランス接合体の「プール」（約１０００
コロニー）を再懸濁し、大腸菌ＮＳ２１１４Ｓｍとの接
合に際してドナーとして使用した。その場合、標的のプ
ラスミドへ転位する際に中間体として生じたプラスミド
同時組込み体が分解する（Ｓｅｉｆｅｒｔら、上記）。
こうして挿入されたトランスポゾンは、プラスミドｐＴ
ＣＡ上でトランスに与えられるトランスポザーゼ機能が
もはや存在しないため安定である。この場合に用いられ
たミニトランスポゾンは、Ｔｎ３のｂｌａ遺伝子がクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）遺伝子により置き換えられたｍＴｎ３Ｃｍ−３であ
る。ｐＮＣＳ２の９００ｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片内のｍ
Ｔｎ３Ｃｍ−３挿入部位をマッピングした後、種々の部
位にｍＴｎ３Ｃｍ−３を有する５種のこのような構築物
を、全挿入物を線状断片として放出させＮｏｔＩで消化
して、ＦＡ１９を形質転換するのに使用した。消化され
たプラスミドであるｐＮＣＳ３２（第７図）だけが、約
１×１０-7の頻度でＦＡ１９をＣｍrに形質転換した。
ｐＮＣＳ３２におけるｍＴｎ３Ｃｍ−３の挿入部位はＰ
ＩＡ遺伝子プロモーター配列の約３００ｂｐ上流であっ
たが、他の４つのプラスミドの挿入部位はすべて、ＰＩ
遺伝子内ではないがより近接していた。形質転換体ＦＡ
１９ ＣＡＴ Ｄ１（第７図）のゲノム中のｍＴｎ３Ｃｍ
−３の位置をサザンハイブリッド形成によって確認し
た。先行する研究（Ｃａｎｎｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ，１４３：８４７−８５１，１９８０；Ｉｎｆｅ
ｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：５４７−５５２，１９８１）
はＰＩの分子量および抗原性に影響を与えるｎｍｐ遺伝
子座が淋菌ゲノム上で抗生物質耐性マーカーｓｔｒおよ
びｓｐｃと、ｓｔｒ−ｓｐｃと、ｎｍｐの順で近接して
結合しており、同時形質転換頻度はｓｔｒおよびｎｍｐ
について５％、ｓｐｃおよびｎｍｐについては約２３％
であることを示している。ＰＩ構造遺伝子に隣接するＦ
Ａ１９ ＣＡＴ Ｄ１のＣＡＴマーカーがｎｍｐ遺伝子座
と同じリンケージパターンを示したかどうかを調べるた
めに、菌株ＦＡ１３０（ＳｔｒrＳｐｃrＣｍs）Ｓａｒ
ｕｂｂｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２０：１２８
４−１２９２，１９７４）とＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１（Ｓ
ｔｒsＳｐｃsＣｍr）の間で相互乗り換えを行った。Ｆ
Ａ１３０ ＤＮＡをＦＡ１９ ＣＡＴＤ１の形質転換に用
いた場合に、ＳｔｒｒまたはＳｐｃｒのいずれか一方を
選択すると、同時形質転換頻度はｓｐｃおよびＣＡＴに
ついて２６％（９９／３８３）、ｓｔｒおよびＣＡＴに
ついて７．５％（４０／５３７）てあった。相互乗り換
えにおいて、Ｃｍrを選択すると、同時形質転換頻度は
ｓｐｃおよびＣＡＴについて１０％（１１／１１１）、
ｓｔｒおよびＣＡＴについて１％（１／１１１）であっ
た。乗り換え程度の分析により、遺伝子の順序がｓｔｒ
…ｓｐｃ…ＣＡＴであることが確認された。これらのデ
ータはＣＡＴ遺伝子がｎｍｐ遺伝子座と同じ様式でｓｔ
ｒおよびｓｐｃマーカーと結合していることを実証し
た。このことはｎｍｐ遺伝子座がＰＩの構造遺伝子であ
ることの強力な証拠を与える。もう一つの乗り換えに際
しては、ＰＩＢ菌株ＭＳ１１を形質転換するためにＦＡ
１９ ＣＡＴ Ｄ１ ＤＮＡを用い、Ｃｍrを選択した。４
５個の形質転換体のうち、２４個は供与株のＰＩＡを獲
得し、１３個は受容株ＰＩＢを保持し、そして８個は新
規ハイブリッドＰＩＡ／ＰＩＢタンパク質を発現した。
これはコロニーイムノブロッティングにより検出され
た。近接して結合したＣＡＴ遺伝子を選択するときの供
与株ＰＩＡによる受容株ＰＩＢの置換は、これらの遺伝
子の対立遺伝子としての性質を確証するものであり、そ
してハイブリッドタンパク質が高頻度に出現すること
は、２つの対立遺伝子間の配列相同性により遺伝子内組
換えが起こることを示唆した。これらのＰＩハイブリッ
ド菌株の詳細な分析はＭＳ１１のＰＩＢ配列に関する知
識の如何に左右されるので、この配列をクローニングし
て配列決定した。 ７．２．ＰＩＢ遺伝子のクローニング、配列決定及び発
現 完全無欠な淋菌ＰＩ遺伝子を大腸菌にクローニングする
ことはできないと思われるため、一緒になって完全な遺
伝子配列を含有するものであるＰＩＡについて上記した
クローニング断片の方法を、ＭＳ１１ ＰＩ遺伝子に採
用した。予めハイブリッドＰＩを有するとして特性決定
された菌株ＦＡ６１４９（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎら、Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５２９−５３３，１９８
６）のＰＩ遺伝子内からのＤＮＡ断片を、クローニング
して配列決定し、そして配列のＰＩＢ部分、遺伝子の開
始点から約３００ｂｐ、にＫｐｎＩ部位が存在すること
が判明した。ＫｐｎＩ部位下流のＰＩＢ遺伝子配列から
誘導されたオリゴヌクレオチドＮＣ１２（第８図）、お
よびこのタンパク質のＮ−末端に対応する遺伝子配列か
ら誘導されたＮＣ１（第１図）を、サザンハイブリッド
形成でのプローブとして用い、ＭＳ１１ ＰＩ遺伝子に
ＫｐｎＩ部位が存在することを確認した。ベクタープラ
スミドｐＧＥＭ−３にクローニングされたＫｐｎＩ／Ｈ
ｉｎｃＩＩ−消化ＭＳ１１ ＤＮＡを含有するＨＢ１０
１コロニーを、これらのオリゴヌクレオチドをプローブ
として探査し、ＮＣ１２とハイブリッド形成するコロニ
ーを検出し、そしてこれらのコロニーがＮＣ１２とハイ
ブリッド形成した１．８ｋｂのＫｐｎＩ／ＨｉｎｃＩＩ
断片を有するプラスミドを含有することを見いだした。
このプラスミドをｐＵＮＣＨ２２（第８図）と命名し
た。しかし繰り返し試みても、ＮＣ１とハイブリッド形
成するコロニーは検出されなかった。ＮＣ１はサザンハ
イブリッド形成でＭＳ１１ゲノムＤＮＡの７５０ｂｐの
ＫｐｎＩ／ＨｉｎｃＩＩ断片とハイブリッド形成したた
め、問題点は大きさにあるのではなく、コピー数の多い
ベクターにおいては、ＨＢ１０１に対して致命的である
この断片のＰＩ遺伝子部分の発現の問題である可能性が
高いと思われた。この理由から、プローブとしてオリゴ
ヌクレオチドＮＣ１を用いて、ＭＳ１１ＰＩ遺伝子の残
りの部分をλｇι１１における５４０ｂｐのＨｉｎｆＩ
断片として単離した。このクローンをλｇｔ１１．ＮＣ
１（第８図）と命名した。λｇｔ１１．ＮＣ１の５４０
ｂｐのＨｉｎｆＩ断片およびｐＵＮＣＨ２２のＫｐｎＩ
−Ｓａｕ３ＡＩフラグメントをさらに消化し、サブクロ
ーニングし、配列決定した。この配列を第９図に示す。
この配列から３５０アミノ酸のタンパク質が予想され、
そのうち最初の１９は推定シグナルペプチドである、Ｆ
Ａ１９およびＭＳ１１のＰＩ遺伝子の比較は、８０％の
ヌクレオチド配列相同性を示す。ＰＩＡ（ＦＡ１９）お
よびＰＩＢ（ＭＳ１１）の予想アミノ酸配列の比較を第
１０図に示す。これは長い相同領域が散在する数多くの
有意に相違する領域を示す。淋菌細胞全体に対して生じ
るＰＩ−特異的モノクローナル抗体はＰＩＡとＰＩＢと
の間で全く交差反応性ではないので（Ｋｎａｐｐら、
Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５０：４４−４８，１９
８４）、相違領域の一部はおそらくタンパク質の表面に
露出した抗原性の部分に相当する。ＰＩＡの場合と同じ
方法を用いて完全なＰＩＢ遺伝子の発現を達成した
（６．２節）。ＰＩＢ遺伝子プロモーターの−３５およ
び−１０領域間のＮｃｉＩ部位から遺伝子内のＫｐｎＩ
部位までのλｇｔ１１．ＮＣ１挿入ＤＮＡの断片を、Ｈ
ｉｎｃＩＩおよびＢａｍＨＩで消化されたベクターｐＧ
ＥＭ−２内にｐＵＮＣＨ２２の７５０ｂｐのＫｐｎＩ−
Ｓａｕ３ＡＩ断片と一緒に連結させた。この結果、それ
自身のプロモーターを持たないがプラスミドベクター上
のＴ７プロモーターのすぐ下流に完全なＰＩＢコード配
列を生じた。この構築物（ｐＵＮＣＨ２５）をＢＬ２１
（ＤＥ３）に導入し、ＩＰＴＧ存在下に生育させると、
ＰＩＢの発現を検出することができた（第１１図）。プ
ラスミドｐＵＮＣＨ２５を有する生物学的に純粋な大腸
菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）培養物は、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに受託番号
６７７７５のもとに寄託されている。 ７．３．ＰＩＡ／Ｂハイブリッド菌株の構築および分析 さらに、ＭＳ１１をＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１ ＤＮＡで形
質転換し（Ｂｉｓｗａｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１２９：９８３−９９２，１９７７）、Ｃｍrを選択
し、イムノブロッティングによりＰＩを検出することに
より、ＰＩＡ／Ｂハイブリッドを構築した。相互乗り換
えにおいて、ＰＩＢを保持しているＭＳ１１のＣｍr形
質転換体由来のＤＮＡをＦＡ１９の形質転換に使用し、
Ｃｍrで選択し前記のようにＰＩを検出した。抗生物質
耐性を表現型として発現させるために、細胞をＧＣ基礎
ブロス中で、あるいは抗生物質を含有する軟寒天上層を
添加した。ＧＣ基礎寒天培地中で５時間インキュベート
した。受容株としてＦＡ１９を用い、Ｃｍrで選択する
ときは１μｇ／ｍｌの抗生物質を使用したが、ＭＳ１１
を受容株であるときは１０μｇ／ｍｌを用いた。Ｃａｎ
ｎｏｎらの方法の変法を用いてモノクローナル抗体の結
合について細菌株をアッセイした。ＧＣ基礎ブロス中の
高濃度細胞懸濁液を濾過マニホルドを用いてニトロセル
ロースに移し、クロロホルム蒸気中で溶解させた。この
フィルターを５％粉乳を含有するＴＢＳ（１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に浸
漬し、適当な抗体を含有するＴＢＳ中でインキュベート
し、つぎにＴＢＳ中で洗浄した。二次抗体と接合した抗
マウスＩｇＧ−アルカリフォスファターゼ（Ｓｉｇｍ
ａ）中でインキュベートし、さらに洗浄した後、フィル
ターをニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルホスフェート（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
を用いて製造業者の指示にしたがって展開した。使用し
たモノクローナル抗体は、４Ａ１２，４Ｇ５，２Ｆ１
２，６Ｄ９，５Ｇ９，５Ｄ１（１０），１Ｄ３（２６）
およびＳＭ１０１（２７）（これらは全てＰＩＡ特異的
である）、ならびに１Ｆ５，３Ｃ８，２Ｄ４および２Ｈ
１（１０）（これらはＰＩＢ特異的である）であった。
ＳＭ１０１以外の全ての抗体はＭ．Ｔａｍ（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）の厚意により腹水中で供給され、
１：２０００ないし１：１００００の希釈で用いられ
た。ＳＭ１０１はＪ．Ｈｅｃｋｅｌｓ（Ｓｏｕｔｈａｍ
ｐｔｏｎ大学）の厚意により提供された。受容株として
ＦＡ１９を用いた３００個の形質転換体のうち、３個が
ハイブリッドＰＩを有した。１３個のハイブリッド菌株
のうち、５個の異なるハイブリッドＰＩ血清型が同定さ
れた（第Ｉ表）。次にハイブリッドＰＩ遺伝子のどの部
分がＰＩ配列であるか、そしてどれがＰＩＢ配列である
かを評価するために、多数のＰＩＡ−及びＰＩＢ−特異
的オリゴヌクレオチド（第ＩＩ表および第１０図）を用
いるコロニーハイブリッド形成によりハイブリッド菌株
を分析し、この方法により９個の異なるクラスが検出さ
れた（第１０図）構造を既知のハイブリッドＰＩの血清
型の分析により、これらのモノクローナル抗体について
のエピトープのおよその位置を決定することができた。 クラス１ハイブリッドと反応するＰＩＡ特異的モノクロ
ーナル抗体４Ｇ５、２Ｆ１２およびＳＭ１０１のエピト
ープは、タンパク質のＮ−末端の近く、最初の６０残基
以内に存在するはずである。ハイブリッドクラス１、５
および６の比較は、ＳＭ１０１に対するエピトープが少
なくとも部分的には残基３４と６０の間の領域に存在す
ることが示唆される。Ｎ−末端６０残基はＰＩＡおよび
ＰＩＢ間で有意な相違を含み（第３図、第９図、第１０
図）、これはこれらの抗体の特異性の説明となりうる。
ハイブリッドクラス６−９と反応する６Ｄ９（ＰＩＡ特
異的）のエピトープは、残基１８７から２５０までのタ
ンパク質領域に存在し、この領域もまたＰＩＡおよびＰ
ＩＢの間で有意に異なる領域を含む。４Ａ１２，５Ｇ
９，５Ｄ１および１Ｄ３（すべてＰＩＡ特異的）のエピ
トープは、クラス９のハイブリッドタンパク質において
のみ検出され、したがっておそらくタンパク質のＮ−末
端およびＣ−末端部分の両方を含む複合エピトープであ
る。このことは、タンパク質が比較的に変性されるウェ
スタンブロットではＰＩとよく反応しないという観察に
よって支持される。ＭＳ１１のＰＩＢと反応する４個の
抗体のうち、ハイブリッドクラス７および８と反応する
７Ｆ５のエピトープはＮ−末端６０残基内に位置する
が、３Ｃ８，２Ｄ４および２Ｈ１のエピトープは分岐配
列を含有するタンパク質の中央部、残基１５０から２７
０までの間に存在すると思われ、この部分は長く伸びた
クラス９ハイブリッドタンパク質が３Ｄ８とのみ反応す
ることから、３Ｃ８のエピトープは２Ｄ４および２Ｈ１
のエピトープのわずかに上流に位置する。しかし、２Ｄ
４および２Ｈ１がウエスタンブロットではＰＩＢと反応
しないことから、これらのエピトープは比較的複雑であ
りうる。ハイブリッドＰＩＡ／Ｂ遺伝子を含有してハイ
ブリッドＰＩＡ／Ｂタンパク質を発現する形質転換微生
物ＦＡ６２４８の生物学的に純粋な培養物は、ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに受託番号５
３８０８のもとに寄託されている。 ７．４．考察 リポーター遺伝子をＰＩ構造遺伝子の近くに挿入した本
研究は、ＰＩＡおよびＰＩＢ構造遺伝子が同じ遺伝子座
の対立遺伝子であることを実証するものであり、この遺
伝子座はすでにｎｍｐとして同定された（Ｃａｎｎｏｎ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４３：８４７−８５
１，１９８０）。淋菌ゲノム上の１個のＰＩ遺伝子の存
在は、天然に存在する菌株がＰＩＡまたはＰＩＢタンパ
ク質のいずれか一方を有し両方を持つことは決してな
く、そしてＰＩ血清型が安定に保持されるとの観察に符
号する。ＰＩＡおよびＰＩＢ遺伝子と推定アミノ酸配列
の比較は高度の相同性を示したが、有意に配列の異なる
領域が確認された。ＰＩハイブリッドは天然には生じな
いが、本発明者らが構築したＰＩハイブリッドはインビ
トロで安定に生存した。しかし、ＰＩＢＮ−末端とのハ
イブリッドＰＩの形成頻度が比較的低く、ＰＩ遺伝子内
で多重乗り換えの起こる頻度が驚異的に高いことは、あ
る種のクラスのハイブリッドＰＩをインビトロ生育した
淋菌が好むのかも知れない。ＰＩハィブリッドの構築お
よび分析によって、本発明者らはタンパク質のいくつか
の表面露出部分のおよその位置を決定することができ、
二次および四次構造の可能性に対する知見が与えられ
た。ＰＩＡおよびＰＩＢの両方のＮ−末端領域は、各タ
ンパク質の中央部にある少なくとも１つの別の領域とと
もに表面に露出しているとと思われる。多くのＰＩＡ特
異的モノクローナル抗体のエピトープはＮ−末端および
Ｃ−末端部分の両方がハイブリッドＰＩ内に存在すると
きにのみ同定されたことから、外層膜内でのＰＩＡの折
り畳み状態はＮ−末端およびＣ−末端部分が表面上で密
接に関連しているような状態かもしれない。外層膜内で
のＰＡのコンフォーメーションに関するこのようなモデ
ルは、非処理の淋菌内でのＰＩのタンパク質加水分解的
切断に基づく先行モデルのいくつかの態様と一致するが
（Ｂｌａｋｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３３：２
１２−２２２，１９８１；Ｊｕｄｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｉｍｍｕｎ．５４：４０８−４１４，１９８６）、ＰＩ
ＡのＮ−末端およびＰＩＢの中央部分のみが表面に露出
している（Ｂｌａｋｅら、上記；Ｔｅｅｒｌｉｎｋ，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：６３−７６，１９８７）
との既報の示唆とは異なる。 ８．微生物の寄託 列挙したプラスミドを有する下記の大腸菌株は、ｔｈｅ
Ａｇｒｉｃｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ），Ｐｅｏｒ
ｉａ，ＩＬまたはｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ，ＭＤに寄託され、表記の受託番号が付与されてい
る。 本発明は寄託された菌株により範囲を限定されるもので
はない。なぜならば各菌株は本発明の一態様の一つの説
明として意図されるからであり、機能的に同等な全ての
細胞系は本発明の範囲を包含される。実際、ここに示さ
れかつ記載されたことに加えて本発明を種々変更するこ
とは、前記記載から当業者に明らかになるであろう。こ
のような変更は添付の請求の範囲内に包含されるものと
する。また、ヌクレオチドについて与えられた全ての塩
基対の大きさは概数であり、説明の目的で用いられるこ
とは当然のことである。
【配列表】配列番号：1
配列の長さ：17
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列
ACGCCGGCTT TGATGGC 17
配列番号：2
配列の長さ：17
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列の特徴
他の情報：Y=T又はC,
N=T又はC又はA又はG
配列
GAYGTNACCC TGTAYGG 17
配列番号：3
配列の長さ：17
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列
GCGTTAAAAC CGCTACC 17
配列番号：4
配列の長さ：17
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列
TCGAACCCAA ATCAGCG 17
配列番号：5
配列の長さ：17
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列
CGGTGTCGGT CTGCGCC 17
配列番号：6
配列の長さ：17
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列
GATACGGCGA AGGCACT 17
配列番号：7
配列の長さ：17
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列
CAAGGTGCCT CCGTCGC 17
配列番号：8
配列の長さ：17
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列
AAGTGCGCGT CGGCCGT 17
配列番号：9
配列の長さ：17
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列
GACTTGGCGC AACGATA 17
配列番号：10
配列の長さ：18
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列
GCAGCGTACA ATACGCAC 18
配列番号：11
配列の長さ：17
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列
GCAGCGTACA ATACGAC 17
配列番号：12
配列の長さ：17
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列
GCAACATTGC CCAACCC 17
配列番号：13
配列の長さ：18
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列
AGGCACTGTT GATAGTGC 18
配列番号：14
配列の長さ：17
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列
GATACGGCGA AGGCATC 17
配列番号：15
配列の長さ：35
配列の型：核酸
配列の種類：ｍRNA
起源
生物名：ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrh
oeae) 株名：R10 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..35 他の情報：Y=U又はC, N=U又はC又はA又はG, H=U又はC又はA, R=A又はG 配列 GAY GUN ACN YUN UAY GGN GCN AUH AAR GCN GGN GU 35 Asp Val Thr Leu Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Gly Val 1 5 10 配列番号：16 配列の長さ：1040 配列の型：核酸 配列の種類：DNA 起源 生物名：ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrh
oeae) 株名：FA19 配列の特徴： 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1025 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：81..134 特徴を表す記号：RBS 存在位置：69..73 配列 CCCTCGGCGG TAAATGCAAA GCTAAGCGGC TTGGAAAACC CGGCCTGCTT AAATTTCTTA 60 ACCAAAAAAG GAATACAGCA ATG AAA AAA TCC CTG ATT GCC CTG ACT GCA GCC 113 Met Lys Lys Ser Leu Ile Ala Leu Thr Ala Ala -15 -10 CTT CCT GTT GCA GCA ATG GCT GAC GTT ACC CTG TAC GGC ACC ATC AAA 161 Leu Pro Val Ala Ala Met Ala Asp Val Thr Leu Tyr Gly Thr Ile Lys -5 -1 1 5 GCC GGC GTA GAA ACT TCC CGC TCC GTA GCT CAC GGA GCT CAG GCG GAT 209 Ala Gly Val Glu Thr Ser Arg Ser Val Ala His Gly Ala Gln Ala Asp 10 15 20 25 CGC GTT AAA ACC GCT ACC GAA ATC GCT GAT TTG GGT TCG AAA ATC GGC 257 Arg Val Lys Thr Ala Thr Glu Ile Ala Asp Leu Gly Ser Lys Ile Gly 30 35 40 TTT AAA GGC CAA GAA GAC CTC GGC GGC CTG AAA GCC ATT TGG CAG TTG 305 Phe Lys Gly Gln Glu Asp Leu Gly Gly Leu Lys Ala Ile Trp Gln Leu 45 50 55 GAA CAA AAA GCC TAC GTC AGC GGT ACT GAC ACA GGC TGG GGC AAC CGC 353 Glu Gln Lys Ala Tyr Val Ser Gly Thr Asp Thr Gly Trp Gly Asn Arg 60 65 70 CAA TCC TTC ATC GGT AAA GGC GGC TTC GGT AAA GTG CGC GTC GGC CGT 401 Gln Ser Phe Ile Gly Lys Gly Gly Phe Gly Lys Val Arg Val Gly Arg 75 80 85 TTG AAC AGC GTC CTG AAA GAC ACC GGC GGC TTC AAT CCT TGG GAG GGT 449 Leu Asn Ser Val Leu Lys Asp Thr Gly Gly Phe Asn Pro Trp Glu Gly 90 95 100 105 AAA ACC TAT TTG GGT TTA AGC AAC ATT GCC CAA CCC GAA GAA CGC CAC 497 Lys Ser Tyr Leu Gly Leu Ser Asn Ile Ala Gln Pro Glu Glu Arg His 110 115 120 GTT TCC GTA CGC TAC GAT TCT CCC GAA TTT GCC GGC TTC AGG GCA CAA 545 Val Ser Val Arg Tyr Asp Ser Pro Glu Phe Ala Gly Phe Arg Ala Gln 125 130 135 TAC GTG CCT AAC GAC AAT TCG GGC AAA AAT CAC AGC GAA TCT TAC CAT 593 Tyr Val Pro Asn Asp Asn Ser Gly Lys Asn His Ser Glu Ser Tyr His 140 145 150 GCA GGC TTC AAC TAC AAA AAC AGC GGC TTC TTC GTG TAT GCC GGC TTC 641 Ala Gly Phe Asn Tyr Lys Asn Ser Gly Phe Phe Val Tyr Ala Gly Phe 155 160 165 TAT AAA AGA CAT AGT TAC ACG ACT GAG AAA CAC CAG GTT CAC CGT TTG 689 Tyr Lys Arg His Ser Tyr Thr Thr Glu Lys His Gln Val His Arg Leu 170 175 180 185 GTC GGC GGT TAC GAC CAT GAT GCC CTG GCT TCC GTA GCC GTA CAG CAA 737 Val Gly Gly Tyr Asp His Asp Ala Leu Ala Ser Val Ala Val Gln Gln 190 195 200 CAA GAC GCG AAA TTG ACT TGG CGC AAC GAT AAT TCG CAC AAC TCT CAA 785 Gln Asp Ala Lys Leu Thr Trp Arg Asn Asp Asn Ser His Asn Ser Gln 205 210 215 ACC GAA GTT GCC GCT ACC GCA TAC CGC TTC GGC AAC GTA ACG CCC CGC 833 Thr Glu Val Ala Ala Thr Ala Tyr Arg Phe Gly Asn Val Thr Pro Arg 220 225 230 GTT TCT TAC GCC CAC GGC TTC AAA GGT TCG GTT TAT GAT GCA GAT AAC 881 Val Ser Tyr Ala His Gly Phe Lys Gly Ser Val Tyr Asp Ala Asp Asn 235 240 245 GAC AAT ACT GAC CAA GTG GTT GTC GGT GCG GAA TAC GAC TTC TCC AAA 929 Asp Asn Thr Asp Gln Val Val Val Gly Ala Glu Tyr Asp Phe Ser Lys 250 255 260 265 CGC ACT TCT GCC TTG GTT TCT GCC GGT TGG TTG CAA AGA GGC AAA GGC 977 Arg Thr Ser Ala Leu Val Ser Ala Gly Trp Leu Gln Arg Gly Lys Gly 270 275 280 GAA AAA TTC GTA GCG ACT GTC GGC GGT GTC GGT CTG CGC CAC AAA TTC 1025 Glu Lys Phe Val Ala Thr Val Gly Gly Val Gly Leu Arg His Lys Phe 285 290 295 TAATCTGCAA AGATC 1040 配列番号：17 配列の長さ：1222 配列の型：核酸 配列の種類：DNA 起源 生物名：ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrh
oeae) 株名：MS11 配列の特徴： 特徴を表す記号：CDS 存在位置：158..1207 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：158..214 特徴を表す記号：RBS 存在位置：146..150 配列 GATTCCACAC AAAAACAGGC AGAAGTTTGT TTTTTCAGAC AGGAACATCT ATAGTTTCAG 60 ACATGTAACC GCCGAGCCCC TCGGCGGTAA ATGCAAAGCT AAGCGGCTTG GAAAGCCCGG 120 CCTGCTTAAA TTTCTTAACC AAAAAAGGAA TACAGCA ATG AAA AAA TCC CTG ATT 175 Met Lys Lys Ser Leu Ile -15 GCC CTG ACT TTG GCA GCC CTT CCT GTT GCG GCA ACG GCC GAT GTC ACC 223 Ala Leu Thr Leu Ala Ala Leu Pro Val Ala Ala Thr Ala Asp Val Thr -10 -5 -1 1 CTG TAC GGT GCC ATC AAA GCC GGC GTA CAA ACT TAC CGT TCT GTA GAA 271 Leu Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Gly Val Gln Thr Tyr Arg Ser Val Glu 5 10 15 CAT ACA GAC GGC AAG GTA AGT AAA GTG GAA ACC GGC AGC GAA ATC GCC 319 His Thr Asp Gly Lys Val Ser Lys Val Glu Thr Gly Ser Glu Ile Ala 20 25 30 35 GAC TTC GGT TCA AAA ATC GGC TTC AAA GGC CAA GAA GAC CTC GGC AAC 367 Asp Phe Gly Ser Lys Ile Gly Phe Lys Gly Gln Glu Asp Leu Gly Asn 40 45 50 GGT CTG AAG GCC GTT TGG CAG TTG GAA CAA GGT GCC TCC GTC GCC GGC 415 Gly Leu Lys Ala Val Trp Gln Leu Glu Gln Gly Ala Ser Val Ala Gly 55 60 65 ACT AAC ACC GGC TGG GGC AAC AAA CAA TCC TTC GTC GGC TTG AAG GGC 463 Thr Asn Thr Gly Trp Gly Asn Lys Gln Ser Phe Val Gly Leu Lys Gly 70 75 80 GGC TTC GGT ACC ATC CGC GCC GGT AGC CTG AAC AGC CCC CTG AAA AAC 511 Gly Phe Gly Thr Ile Arg Ala Gly Ser Leu Asn Ser Pro Leu Lys Asn 85 90 95 ACC GAC GAC AAC GTC AAT GCT TGG GAA TCC GGC AAA TTT ACC GGC AAT 559 Thr Asp Asp Asn Val Asn Ala Trp Glu Ser Gly Lys Phe Thr Gly Asn 100 105 110 115 GTG CTG GAA ATC AGC GGA ATG GCC AAA CGG GAA CAC CGC TAC CTG TCC 607 Val Leu Glu Ile Ser Gly Met Ala Lys Arg Glu His Arg Tyr Leu Ser 120 125 130 GTA CGC TAC GAT TCT CCC GAA TTT GCC GGC TTC AGC GGC AGC GTA CAA 655 Val Arg Tyr Asp Ser Pro Glu Phe Ala Gly Phe Ser Gly Ser Val Gln 135 140 145 TAC GCA CCT AAA GAC AAT TCA GGC TCA AAC GGC GAA TCT TAC CAC GTT 703 Tyr Ala Pro Lys Asp Asn Ser Gly Ser Asn Gly Glu Ser Tyr His Val 150 155 160 GGC TTG AAC TAC CAA AAC AGC GGC TTC TTC GCA CAA TAC GCC GGC TTG 751 Gly Leu Asn Tyr Gln Asn Ser Gly Phe Phe Ala Gln Tyr Ala Gly Leu 165 170 175 TTC CAA AGA TAC GGC GAA GGC ACT AAA AAA ATC GAA TAC GAA CAT CAA 799 Phe Gln Arg Tyr Gly Glu Gly Thr Lys Lys Ile Glu Tyr Glu His Gln 180 185 190 195 GTT TAT AGT ATC CCC AGC CTG TTT GTT GAA AAA CTG CAA GTT CAC CGT 847 Val Tyr Ser Ile Pro Ser Leu Phe Val Glu Lys Leu Gln Val His Arg 200 205 210 TTG GTA GGC GGT TAC GAC AAT AAT GCC CTG TAC GTC TCC GTA GCC GCA 895 Leu Val Gly Gly Tyr Asp Asn Asn Ala Leu Tyr Val Ser Val Ala Ala 215 220 225 CAA CAA CAA GAT GCC AAA TTG TAT CAA AAT CAA TTA GTG CGT GAT AAT 943 Gln Gln Gln Asp Ala Lys Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Val Arg Asp Asn 230 235 240 TCG CAC AAC TCT CAA ACC GAA GTT GCC GCT ACC GTG GCA TAC CGT TTC 991 Ser His Asn Ser Gln Thr Glu Val Ala Ala Thr Val Ala Tyr Arg Phe 245 250 255 GGC AAC GTA ACG CCC CGC GTT TCT TAC GCC CAC GGC TTC AAA GGC ACT 1039 Gly Asn Val Thr Pro Arg Val Ser Tyr Ala His Gly Phe Lys Gly Thr 260 265 270 275 GTT GAT AGT GCA GAC CAC GAC AAT ACT TAT GAC CAA GTG GTT GTC GGC 1087 Val Asp Ser Ala Asp His Asp Asn Thr Tyr Asp Gln Val Val Val Gly 280 285 290 GCG GAA TAC GAC TTC TCC AAA CGC ACT TCT GCC TTG GTT TCT GCC GGC 1135 Ala Glu Tyr Asp Phe Ser Lys Arg Thr Ser Ala Leu Val Ser Ala Gly 295 300 305 TGG TTG CAA GAA GGC AAA GGC GCA GAC AAA ATC GTA TCG ACT GCC AGC 1183 Trp Leu Gln Glu Gly Lys Gly Ala Asp Lys Ile Val Ser Thr Ala Ser 310 315 320 GCC GTC GTT CTG CGC CAC AAA TTC TAATCTGCAA AGATC 1222 Ala Val Val Leu Arg His Lys Phe 325 330
oeae) 株名：R10 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..35 他の情報：Y=U又はC, N=U又はC又はA又はG, H=U又はC又はA, R=A又はG 配列 GAY GUN ACN YUN UAY GGN GCN AUH AAR GCN GGN GU 35 Asp Val Thr Leu Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Gly Val 1 5 10 配列番号：16 配列の長さ：1040 配列の型：核酸 配列の種類：DNA 起源 生物名：ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrh
oeae) 株名：FA19 配列の特徴： 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1025 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：81..134 特徴を表す記号：RBS 存在位置：69..73 配列 CCCTCGGCGG TAAATGCAAA GCTAAGCGGC TTGGAAAACC CGGCCTGCTT AAATTTCTTA 60 ACCAAAAAAG GAATACAGCA ATG AAA AAA TCC CTG ATT GCC CTG ACT GCA GCC 113 Met Lys Lys Ser Leu Ile Ala Leu Thr Ala Ala -15 -10 CTT CCT GTT GCA GCA ATG GCT GAC GTT ACC CTG TAC GGC ACC ATC AAA 161 Leu Pro Val Ala Ala Met Ala Asp Val Thr Leu Tyr Gly Thr Ile Lys -5 -1 1 5 GCC GGC GTA GAA ACT TCC CGC TCC GTA GCT CAC GGA GCT CAG GCG GAT 209 Ala Gly Val Glu Thr Ser Arg Ser Val Ala His Gly Ala Gln Ala Asp 10 15 20 25 CGC GTT AAA ACC GCT ACC GAA ATC GCT GAT TTG GGT TCG AAA ATC GGC 257 Arg Val Lys Thr Ala Thr Glu Ile Ala Asp Leu Gly Ser Lys Ile Gly 30 35 40 TTT AAA GGC CAA GAA GAC CTC GGC GGC CTG AAA GCC ATT TGG CAG TTG 305 Phe Lys Gly Gln Glu Asp Leu Gly Gly Leu Lys Ala Ile Trp Gln Leu 45 50 55 GAA CAA AAA GCC TAC GTC AGC GGT ACT GAC ACA GGC TGG GGC AAC CGC 353 Glu Gln Lys Ala Tyr Val Ser Gly Thr Asp Thr Gly Trp Gly Asn Arg 60 65 70 CAA TCC TTC ATC GGT AAA GGC GGC TTC GGT AAA GTG CGC GTC GGC CGT 401 Gln Ser Phe Ile Gly Lys Gly Gly Phe Gly Lys Val Arg Val Gly Arg 75 80 85 TTG AAC AGC GTC CTG AAA GAC ACC GGC GGC TTC AAT CCT TGG GAG GGT 449 Leu Asn Ser Val Leu Lys Asp Thr Gly Gly Phe Asn Pro Trp Glu Gly 90 95 100 105 AAA ACC TAT TTG GGT TTA AGC AAC ATT GCC CAA CCC GAA GAA CGC CAC 497 Lys Ser Tyr Leu Gly Leu Ser Asn Ile Ala Gln Pro Glu Glu Arg His 110 115 120 GTT TCC GTA CGC TAC GAT TCT CCC GAA TTT GCC GGC TTC AGG GCA CAA 545 Val Ser Val Arg Tyr Asp Ser Pro Glu Phe Ala Gly Phe Arg Ala Gln 125 130 135 TAC GTG CCT AAC GAC AAT TCG GGC AAA AAT CAC AGC GAA TCT TAC CAT 593 Tyr Val Pro Asn Asp Asn Ser Gly Lys Asn His Ser Glu Ser Tyr His 140 145 150 GCA GGC TTC AAC TAC AAA AAC AGC GGC TTC TTC GTG TAT GCC GGC TTC 641 Ala Gly Phe Asn Tyr Lys Asn Ser Gly Phe Phe Val Tyr Ala Gly Phe 155 160 165 TAT AAA AGA CAT AGT TAC ACG ACT GAG AAA CAC CAG GTT CAC CGT TTG 689 Tyr Lys Arg His Ser Tyr Thr Thr Glu Lys His Gln Val His Arg Leu 170 175 180 185 GTC GGC GGT TAC GAC CAT GAT GCC CTG GCT TCC GTA GCC GTA CAG CAA 737 Val Gly Gly Tyr Asp His Asp Ala Leu Ala Ser Val Ala Val Gln Gln 190 195 200 CAA GAC GCG AAA TTG ACT TGG CGC AAC GAT AAT TCG CAC AAC TCT CAA 785 Gln Asp Ala Lys Leu Thr Trp Arg Asn Asp Asn Ser His Asn Ser Gln 205 210 215 ACC GAA GTT GCC GCT ACC GCA TAC CGC TTC GGC AAC GTA ACG CCC CGC 833 Thr Glu Val Ala Ala Thr Ala Tyr Arg Phe Gly Asn Val Thr Pro Arg 220 225 230 GTT TCT TAC GCC CAC GGC TTC AAA GGT TCG GTT TAT GAT GCA GAT AAC 881 Val Ser Tyr Ala His Gly Phe Lys Gly Ser Val Tyr Asp Ala Asp Asn 235 240 245 GAC AAT ACT GAC CAA GTG GTT GTC GGT GCG GAA TAC GAC TTC TCC AAA 929 Asp Asn Thr Asp Gln Val Val Val Gly Ala Glu Tyr Asp Phe Ser Lys 250 255 260 265 CGC ACT TCT GCC TTG GTT TCT GCC GGT TGG TTG CAA AGA GGC AAA GGC 977 Arg Thr Ser Ala Leu Val Ser Ala Gly Trp Leu Gln Arg Gly Lys Gly 270 275 280 GAA AAA TTC GTA GCG ACT GTC GGC GGT GTC GGT CTG CGC CAC AAA TTC 1025 Glu Lys Phe Val Ala Thr Val Gly Gly Val Gly Leu Arg His Lys Phe 285 290 295 TAATCTGCAA AGATC 1040 配列番号：17 配列の長さ：1222 配列の型：核酸 配列の種類：DNA 起源 生物名：ナイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrh
oeae) 株名：MS11 配列の特徴： 特徴を表す記号：CDS 存在位置：158..1207 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：158..214 特徴を表す記号：RBS 存在位置：146..150 配列 GATTCCACAC AAAAACAGGC AGAAGTTTGT TTTTTCAGAC AGGAACATCT ATAGTTTCAG 60 ACATGTAACC GCCGAGCCCC TCGGCGGTAA ATGCAAAGCT AAGCGGCTTG GAAAGCCCGG 120 CCTGCTTAAA TTTCTTAACC AAAAAAGGAA TACAGCA ATG AAA AAA TCC CTG ATT 175 Met Lys Lys Ser Leu Ile -15 GCC CTG ACT TTG GCA GCC CTT CCT GTT GCG GCA ACG GCC GAT GTC ACC 223 Ala Leu Thr Leu Ala Ala Leu Pro Val Ala Ala Thr Ala Asp Val Thr -10 -5 -1 1 CTG TAC GGT GCC ATC AAA GCC GGC GTA CAA ACT TAC CGT TCT GTA GAA 271 Leu Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Gly Val Gln Thr Tyr Arg Ser Val Glu 5 10 15 CAT ACA GAC GGC AAG GTA AGT AAA GTG GAA ACC GGC AGC GAA ATC GCC 319 His Thr Asp Gly Lys Val Ser Lys Val Glu Thr Gly Ser Glu Ile Ala 20 25 30 35 GAC TTC GGT TCA AAA ATC GGC TTC AAA GGC CAA GAA GAC CTC GGC AAC 367 Asp Phe Gly Ser Lys Ile Gly Phe Lys Gly Gln Glu Asp Leu Gly Asn 40 45 50 GGT CTG AAG GCC GTT TGG CAG TTG GAA CAA GGT GCC TCC GTC GCC GGC 415 Gly Leu Lys Ala Val Trp Gln Leu Glu Gln Gly Ala Ser Val Ala Gly 55 60 65 ACT AAC ACC GGC TGG GGC AAC AAA CAA TCC TTC GTC GGC TTG AAG GGC 463 Thr Asn Thr Gly Trp Gly Asn Lys Gln Ser Phe Val Gly Leu Lys Gly 70 75 80 GGC TTC GGT ACC ATC CGC GCC GGT AGC CTG AAC AGC CCC CTG AAA AAC 511 Gly Phe Gly Thr Ile Arg Ala Gly Ser Leu Asn Ser Pro Leu Lys Asn 85 90 95 ACC GAC GAC AAC GTC AAT GCT TGG GAA TCC GGC AAA TTT ACC GGC AAT 559 Thr Asp Asp Asn Val Asn Ala Trp Glu Ser Gly Lys Phe Thr Gly Asn 100 105 110 115 GTG CTG GAA ATC AGC GGA ATG GCC AAA CGG GAA CAC CGC TAC CTG TCC 607 Val Leu Glu Ile Ser Gly Met Ala Lys Arg Glu His Arg Tyr Leu Ser 120 125 130 GTA CGC TAC GAT TCT CCC GAA TTT GCC GGC TTC AGC GGC AGC GTA CAA 655 Val Arg Tyr Asp Ser Pro Glu Phe Ala Gly Phe Ser Gly Ser Val Gln 135 140 145 TAC GCA CCT AAA GAC AAT TCA GGC TCA AAC GGC GAA TCT TAC CAC GTT 703 Tyr Ala Pro Lys Asp Asn Ser Gly Ser Asn Gly Glu Ser Tyr His Val 150 155 160 GGC TTG AAC TAC CAA AAC AGC GGC TTC TTC GCA CAA TAC GCC GGC TTG 751 Gly Leu Asn Tyr Gln Asn Ser Gly Phe Phe Ala Gln Tyr Ala Gly Leu 165 170 175 TTC CAA AGA TAC GGC GAA GGC ACT AAA AAA ATC GAA TAC GAA CAT CAA 799 Phe Gln Arg Tyr Gly Glu Gly Thr Lys Lys Ile Glu Tyr Glu His Gln 180 185 190 195 GTT TAT AGT ATC CCC AGC CTG TTT GTT GAA AAA CTG CAA GTT CAC CGT 847 Val Tyr Ser Ile Pro Ser Leu Phe Val Glu Lys Leu Gln Val His Arg 200 205 210 TTG GTA GGC GGT TAC GAC AAT AAT GCC CTG TAC GTC TCC GTA GCC GCA 895 Leu Val Gly Gly Tyr Asp Asn Asn Ala Leu Tyr Val Ser Val Ala Ala 215 220 225 CAA CAA CAA GAT GCC AAA TTG TAT CAA AAT CAA TTA GTG CGT GAT AAT 943 Gln Gln Gln Asp Ala Lys Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Val Arg Asp Asn 230 235 240 TCG CAC AAC TCT CAA ACC GAA GTT GCC GCT ACC GTG GCA TAC CGT TTC 991 Ser His Asn Ser Gln Thr Glu Val Ala Ala Thr Val Ala Tyr Arg Phe 245 250 255 GGC AAC GTA ACG CCC CGC GTT TCT TAC GCC CAC GGC TTC AAA GGC ACT 1039 Gly Asn Val Thr Pro Arg Val Ser Tyr Ala His Gly Phe Lys Gly Thr 260 265 270 275 GTT GAT AGT GCA GAC CAC GAC AAT ACT TAT GAC CAA GTG GTT GTC GGC 1087 Val Asp Ser Ala Asp His Asp Asn Thr Tyr Asp Gln Val Val Val Gly 280 285 290 GCG GAA TAC GAC TTC TCC AAA CGC ACT TCT GCC TTG GTT TCT GCC GGC 1135 Ala Glu Tyr Asp Phe Ser Lys Arg Thr Ser Ala Leu Val Ser Ala Gly 295 300 305 TGG TTG CAA GAA GGC AAA GGC GCA GAC AAA ATC GTA TCG ACT GCC AGC 1183 Trp Leu Gln Glu Gly Lys Gly Ala Asp Lys Ile Val Ser Thr Ala Ser 310 315 320 GCC GTC GTT CTG CGC CAC AAA TTC TAATCTGCAA AGATC 1222 Ala Val Val Leu Arg His Lys Phe 325 330
【図１】第１図：Ｒ１０株のＰＩの残基１−１２のアミ
ノ酸配列、縮重塩基を含むコード化ｍＲＮＡ、および合
成されたオリゴヌクレオチド。縮重が存在する場合は、
塩基配列の決定がなされた他の淋菌遺伝子からのコドン
利用データに基づいて塩基配列を選択した。
ノ酸配列、縮重塩基を含むコード化ｍＲＮＡ、および合
成されたオリゴヌクレオチド。縮重が存在する場合は、
塩基配列の決定がなされた他の淋菌遺伝子からのコドン
利用データに基づいて塩基配列を選択した。
【図２】第２図：ＰＩ遺伝子部分を含むＦＡ１９ゲノム
ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩおよびＴａｑＩ断片。この断片を
ベクタープラスミドｐＧＥＭ−２にクローン化して、こ
こに示す名称の組換えプラスミドを得た。ゲノム上のＰ
Ｉコード領域の相対的な位置は断片の上の空白ボックス
で示し（斜線ボックスはＮ末端シグナル配列に相当す
る）、オリゴヌクレオチドプローブの相対的位置を断片
の下に示す。
ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩおよびＴａｑＩ断片。この断片を
ベクタープラスミドｐＧＥＭ−２にクローン化して、こ
こに示す名称の組換えプラスミドを得た。ゲノム上のＰ
Ｉコード領域の相対的な位置は断片の上の空白ボックス
で示し（斜線ボックスはＮ末端シグナル配列に相当す
る）、オリゴヌクレオチドプローブの相対的位置を断片
の下に示す。
【図３】第３図：ＦＡ１９のＰＩ遺伝子のＤＮＡ配列。
予測されるアミノ酸配列をＤＮＡ配列の上に示し、そし
てリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、およびｐＵＮＣ７の
作製に用いられるＴａｑＩおよびＳａｕ３ＡＩ部位、お
よびＨａｅＩＩＩ部位（−３５および−１０）が示され
る。各行の最後の塩基の番号を右側に示す。
予測されるアミノ酸配列をＤＮＡ配列の上に示し、そし
てリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、およびｐＵＮＣ７の
作製に用いられるＴａｑＩおよびＳａｕ３ＡＩ部位、お
よびＨａｅＩＩＩ部位（−３５および−１０）が示され
る。各行の最後の塩基の番号を右側に示す。
【図４】第４図：Ｎ．ゴノロエアエの主要な外層膜タン
パク質、ＰＩ、ＰＩＩおよびＰＩＩＩ、並びに大腸菌ポ
ーリンＯｍｐＦおよびＯｍｐＣのハイドロパシー（ｈｙ
ｄｒｏｐａｔｈｙ）パターン；ｓｐ−シグナルペプチ
ド；ａ．ａ．−アミノ酸残基。
パク質、ＰＩ、ＰＩＩおよびＰＩＩＩ、並びに大腸菌ポ
ーリンＯｍｐＦおよびＯｍｐＣのハイドロパシー（ｈｙ
ｄｒｏｐａｔｈｙ）パターン；ｓｐ−シグナルペプチ
ド；ａ．ａ．−アミノ酸残基。
【図５】第５図：ｐＵＮＣ７の作製工程図。ＰＩ遺伝子
プロモーターの−３５および−１０領域間の好都合なＨ
ａｅＩＩＩ部位により−３５領域および上流配列を除去
でき、次にＰＩ遺伝子をファージＴ７プロモーターの制
御下にベクタープラスミドｐＧＥＭ−２に挿入した。太
い線はｐＧＥＭ−２ ＤＮＡを、そして細い線はＦＡ１
９ ＤＮＡを表す。ＰＩ’−ＰＩ遺伝子部分（点線はこ
の遺伝子の欠失セグメントの方向を示す）；Ｐｒ７，−
ファージＴ７プロモーター；ＭＣＳ−多重クローニング
部位；制限酵素部位：Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ、Ｈ−ＨａｅＩ
ＩＩ、Ｂ−ＢａｍＨＩ、（Ｈ）−ＨａｅＩＩＩ／Ｈｉｎ
ｃＩＩ接合点（部位は存在せず）、Ｔ−ＴａｑＩ。
プロモーターの−３５および−１０領域間の好都合なＨ
ａｅＩＩＩ部位により−３５領域および上流配列を除去
でき、次にＰＩ遺伝子をファージＴ７プロモーターの制
御下にベクタープラスミドｐＧＥＭ−２に挿入した。太
い線はｐＧＥＭ−２ ＤＮＡを、そして細い線はＦＡ１
９ ＤＮＡを表す。ＰＩ’−ＰＩ遺伝子部分（点線はこ
の遺伝子の欠失セグメントの方向を示す）；Ｐｒ７，−
ファージＴ７プロモーター；ＭＣＳ−多重クローニング
部位；制限酵素部位：Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ、Ｈ−ＨａｅＩ
ＩＩ、Ｂ−ＢａｍＨＩ、（Ｈ）−ＨａｅＩＩＩ／Ｈｉｎ
ｃＩＩ接合点（部位は存在せず）、Ｔ−ＴａｑＩ。
【図６】第６図：ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるｐＵＮＣ
７上のＰＩ遺伝子の発現。Ａ：全細胞溶解物の１５％ゲ
ル上におけるＮａＤｏｄＳＯ４−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動、クーマシーブルーで染色。マーカータンパ
ク質の寸法を左側に示す。ＰＩが示されており、そして
中央の矢印はレーン４では明らかに失われているタンパ
ク質を示す。Ｂ：６種類のＰＩＡ ＭＡｂを用いて検索
したＡにおけるゲルのウエスターンブロットのオートラ
ジオグラフ。レーン１：ＦＡ１９；レーン２：ＩＰＴＧ
なしで１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ
７；レーン３：ＩＰＴＧを用いて３時間増殖させたＢＬ
２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；レーン４：ＩＰＴＧを用い
て１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；
レーン５：ＩＰＴＧなしで１６時間増殖させたＢＬ２１
（ＤＥ３）ｐＧＥＭ−２；レーン６：ＩＰＴＧを用いて
１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧＥＭ−２。
７上のＰＩ遺伝子の発現。Ａ：全細胞溶解物の１５％ゲ
ル上におけるＮａＤｏｄＳＯ４−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動、クーマシーブルーで染色。マーカータンパ
ク質の寸法を左側に示す。ＰＩが示されており、そして
中央の矢印はレーン４では明らかに失われているタンパ
ク質を示す。Ｂ：６種類のＰＩＡ ＭＡｂを用いて検索
したＡにおけるゲルのウエスターンブロットのオートラ
ジオグラフ。レーン１：ＦＡ１９；レーン２：ＩＰＴＧ
なしで１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ
７；レーン３：ＩＰＴＧを用いて３時間増殖させたＢＬ
２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；レーン４：ＩＰＴＧを用い
て１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣ７；
レーン５：ＩＰＴＧなしで１６時間増殖させたＢＬ２１
（ＤＥ３）ｐＧＥＭ−２；レーン６：ＩＰＴＧを用いて
１６時間増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧＥＭ−２。
【図７】第７図：ＦＡ１９のＰＩ構造遺伝子に隣接した
ｍＴｎ３− 表す。ｍＴｎ３−ＣＡＴは長さが１．６６ｋｂてあり、
尺度に応じて描かれていない。ＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１
のゲノム上のＰＩ遺伝子の位置は線上の空白ボックスで
示され、斜線ボックスはシグナル配列を示す。ＰＩ’：
クローン化構築物中に存在するＰＩ遺伝子部分。制限酵
素部位：Ｎ−ＮｏｔＩ；Ｂ−ＢａｍＨＩ；Ｓ−Ｓａｕ３
ＡＩ。
ｍＴｎ３− 表す。ｍＴｎ３−ＣＡＴは長さが１．６６ｋｂてあり、
尺度に応じて描かれていない。ＦＡ１９ ＣＡＴ Ｄ１
のゲノム上のＰＩ遺伝子の位置は線上の空白ボックスで
示され、斜線ボックスはシグナル配列を示す。ＰＩ’：
クローン化構築物中に存在するＰＩ遺伝子部分。制限酵
素部位：Ｎ−ＮｏｔＩ；Ｂ−ＢａｍＨＩ；Ｓ−Ｓａｕ３
ＡＩ。
【図８】第８図：ＰＩ遺伝子の配列決定のためにクロー
ン化したＭＳ１１ ＤＮＡの断片。ＰＩ遺伝子の位置は
線上の空白ボックスで示され、斜線ボックスはシグナル
配列を示す。オリゴヌクレオチドＮＣ１およびＮＣ１２
の配列の位置が示してある。大きい方の断片はベクター
プラスミドｐＧＥＭ−３にクローン化され、小さい方の
断片はλｇｔ１１中にクローン化して、表示した名称の
構築物となした。制限酵素部位：Ｈｆ−ＨｉｎｆＩ；Ｋ
−ＫｐｎＩ；Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ；Ｈｃ−ＨｉｎｃＩＩ。
ン化したＭＳ１１ ＤＮＡの断片。ＰＩ遺伝子の位置は
線上の空白ボックスで示され、斜線ボックスはシグナル
配列を示す。オリゴヌクレオチドＮＣ１およびＮＣ１２
の配列の位置が示してある。大きい方の断片はベクター
プラスミドｐＧＥＭ−３にクローン化され、小さい方の
断片はλｇｔ１１中にクローン化して、表示した名称の
構築物となした。制限酵素部位：Ｈｆ−ＨｉｎｆＩ；Ｋ
−ＫｐｎＩ；Ｓ−Ｓａｕ３ＡＩ；Ｈｃ−ＨｉｎｃＩＩ。
【図９】第９図；ＭＳ１１のＰＩＢ遺伝子のＤＮＡ配
列。予測されるアミノ酸配列はＤＮＡ配列の上に示して
あり、シグナルペプチドも示される。推定プロモーター
配列（−３５および−１０）およびリボソーム結合部位
（ＲＢＳ）も示され、関連する制限酵素部位も同様に示
される。各行の最後の塩基の番号を右側に示す。Ｒ１０
のＰＩＢ配列（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ等、ＰＮＡＳ Ｕ
ＳＡ ８４：８１３５−８１３９，１９８７）との相違
を示すために、塩基（制限酵素部位を構成するものを除
く）には下線が引いてあり、アミノ酸は丸で囲ってあ
る。
列。予測されるアミノ酸配列はＤＮＡ配列の上に示して
あり、シグナルペプチドも示される。推定プロモーター
配列（−３５および−１０）およびリボソーム結合部位
（ＲＢＳ）も示され、関連する制限酵素部位も同様に示
される。各行の最後の塩基の番号を右側に示す。Ｒ１０
のＰＩＢ配列（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ等、ＰＮＡＳ Ｕ
ＳＡ ８４：８１３５−８１３９，１９８７）との相違
を示すために、塩基（制限酵素部位を構成するものを除
く）には下線が引いてあり、アミノ酸は丸で囲ってあ
る。
【図１０】第１０図：ＦＡ１９ ＰＩＡおよびＭＳ１１
ＰＩＢのアミノ酸配列の比較、並びにハイブリッドＰ
Ｉ遺伝子の構造。ＰＩＡ遺伝子配列は白の棒で、そして
ＰＩＢは黒の棒で示す。ＰＩ遺伝子類の上と下はアミノ
酸配列の比較であり、垂直線は１個の相違に相当し、黒
のブロックは連続して広がった相違に相当する。アミノ
酸残基の数は上の目盛で示され、そして塩基対の数は下
の目盛で示される。ハイブリッドを分析するのに使用さ
れたオリゴヌクレオチドはこれらの遺伝子の間に示して
あり、点線は他の遺伝子上の等しい位置を示す。ハイブ
リッド遺伝子構造（クラス１−９）を下に示し、交差が
起こったオリゴヌクレオチド配列間の領域を傾斜域で表
す。種々のハイブリッドクラスのＰＩ血清型を第１表に
示す。
ＰＩＢのアミノ酸配列の比較、並びにハイブリッドＰ
Ｉ遺伝子の構造。ＰＩＡ遺伝子配列は白の棒で、そして
ＰＩＢは黒の棒で示す。ＰＩ遺伝子類の上と下はアミノ
酸配列の比較であり、垂直線は１個の相違に相当し、黒
のブロックは連続して広がった相違に相当する。アミノ
酸残基の数は上の目盛で示され、そして塩基対の数は下
の目盛で示される。ハイブリッドを分析するのに使用さ
れたオリゴヌクレオチドはこれらの遺伝子の間に示して
あり、点線は他の遺伝子上の等しい位置を示す。ハイブ
リッド遺伝子構造（クラス１−９）を下に示し、交差が
起こったオリゴヌクレオチド配列間の領域を傾斜域で表
す。種々のハイブリッドクラスのＰＩ血清型を第１表に
示す。
【図１１】第１１図：全細胞溶解物の１５％ゲル上での
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマ
シーブルー染色を用いて検出した、ＢＬ２１（ＤＥ３）
中におけるｐＵＮＣＨ２５上のＰＩＢ遺伝子の発現。Ｐ
Ｉタンパク質バンドが示してある。レーン１：ＭＳ１
１；レーン２：ＩＰＴＧなしで増殖させたＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）ｐＵＮＣＨ２５；レーン３−５：ＩＰＴＧを用い
て増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣＨ２５。ＩＰ
ＴＧ（５０μｇ／ｍｌ）は下記細胞密度すなわちレーン
３：５×１０８細胞／ｍｌ；レーン４：１０９細胞／ｍ
ｌ；レーン５：２×１０９細胞／ｍｌで増殖培地に加え
た。ＰＩの発現は生長周期の早期に培養物が誘導された
場合に最大である。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマ
シーブルー染色を用いて検出した、ＢＬ２１（ＤＥ３）
中におけるｐＵＮＣＨ２５上のＰＩＢ遺伝子の発現。Ｐ
Ｉタンパク質バンドが示してある。レーン１：ＭＳ１
１；レーン２：ＩＰＴＧなしで増殖させたＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）ｐＵＮＣＨ２５；レーン３−５：ＩＰＴＧを用い
て増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＮＣＨ２５。ＩＰ
ＴＧ（５０μｇ／ｍｌ）は下記細胞密度すなわちレーン
３：５×１０８細胞／ｍｌ；レーン４：１０９細胞／ｍ
ｌ；レーン５：２×１０９細胞／ｍｌで増殖培地に加え
た。ＰＩの発現は生長周期の早期に培養物が誘導された
場合に最大である。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
//(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01
Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｒ 1:01）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，1987年，84，8135−8139
Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，1982
年，36（１），277−283
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，1984年，81，6110−6114
Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，1984
年，150，44−48
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
Claims (32)
- 【請求項１】ナイセリア・ゴノロエアエＭＳ１１株のプ
ロテインＩＢの全長のアミノ酸配列をコードする実質的
に精製された核酸分子であって、該アミノ酸配列が配列
番号１７に示される核酸分子。 - 【請求項２】ナイセリア・ゴノロエアエＭＳ１１株のプ
ロテインＩＢのアミノ酸配列をコードする実質的に精製
された核酸分子であって、該アミノ酸配列が配列番号１
７に示される核酸分子。 - 【請求項３】配列番号１７に示される核酸配列を有す
る、ナイセリア・ゴノロエアエＭＳ１１株のプロテイン
ＩＢの実質的に精製されたｃＤＮＡ。 - 【請求項４】ナイセリア・ゴノロエアエＭＳ１１株のプ
ロテインＩＢの少なくとも一部のアミノ酸配列をコード
する請求の範囲１、２又は３項の核酸分子を含む組換え
ベクターであって、該ベクターは宿主細胞中で安定に保
持され、かつ、タンパク質発現は誘導可能なプロモータ
ーによって制御されているベクター。 - 【請求項５】プラスミドである請求の範囲第４項の組換
えベクター。 - 【請求項６】プラスミドがｐＧＥＭ−２から誘導される
請求の範囲第４項の組換えベクター。 - 【請求項７】プラスミドがｐＵＮＣＨ２５である請求の
範囲第６項の組換えベクター。 - 【請求項８】請求の範囲第４項のベクターを含む形質転
換体。 - 【請求項９】請求の範囲第４項のベクターを含有する単
細胞生物。 - 【請求項１０】請求の範囲第５項のベクターを含有する
単細胞生物。 - 【請求項１１】請求の範囲第７項のベクターを含有する
単細胞生物。 - 【請求項１２】大腸菌ＡＴＣＣ番号６７７７５と同一で
ある請求の範囲第１１項の単細胞生物。 - 【請求項１３】配列番号１７に示されるアミノ酸配列を
有する、ナイセリア・ゴノロエアエＭＳ１１株の全長の
ＰＩＢタンパク質の生産方法であって、（ａ）全長のＰ
ＩＢタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する複製可
能な組換えベクターを含む宿主細胞を、インデューサー
の非存在下で培養し、配列は誘導可能なプロモーターに
よって制御され、宿主細胞内で安定に保持されるもので
あり、（ｂ）それに続いて、全長のＰＩＢタンパク質が
選択的に発現されるようにインデューサーの存在下で宿
主細胞を培養する、ことを含む方法。 - 【請求項１４】ベクターがプラスミドである請求の範囲
第１３項の方法。 - 【請求項１５】プラスミドが、配列番号１７に示すヌク
レオチド配列、又は免疫反応性及び／又は抗原性を有す
るポリペプチド若しくはタンパク質をコードするそれら
の一部分、突然変異体若しくは組換え体を含むものであ
る請求の範囲第１４項の方法。 - 【請求項１６】プラスミドがｐＧＥＭ−２から誘導され
る請求の範囲第１５項の方法。 - 【請求項１７】プラスミドがｐＵＮＣＨ２５である請求
の範囲第１６項の方法。 - 【請求項１８】ナイセリア・ゴノロエアエＭＳ１１株の
実質的に精製されたＰＩＢポリペプチドであって、配列
番号１７に示されるアミノ酸配列を有し、実質的に他の
ナイセリア・ゴノロエアエタンパク質を含まないＰＩＢ
ポリペプチド。 - 【請求項１９】請求の範囲１３、１４、１５、１６又は
１７項の方法によって生産されたポリペプチド組成物で
あって、実質的に他のナイセリア・ゴノロエアエタンパ
ク質を含まないポリペプチド。 - 【請求項２０】請求の範囲第１３項の方法によって生産
された、実質的に精製されたポリペプチドであって、配
列番号１７に示された核酸配列又はその相補配列と選択
的にハイブリダイズする核酸配列によりコードされた、
ポリペプチド。 - 【請求項２１】請求の範囲第１５項の方法により生産さ
れたポリペプチド。 - 【請求項２２】請求の範囲第１６項の方法により生産さ
れたポリペプチド。 - 【請求項２３】請求の範囲第１７項の方法により生産さ
れたポリペプチド。 - 【請求項２４】配列番号１７に示されるナイセリア・ゴ
ノロエアエのＤＮＡ配列の一部分（但し１５核酸長以上
の長さを有するものとする）と相補的であるＤＮＡ配列
を含有することを特徴とする、ナイセリア・ゴノロエア
エの同定に有用なＤＮＡプローブ。 - 【請求項２５】配列番号１に示された核酸配列を有する
請求の範囲第２４項のＤＮＡプローブ。 - 【請求項２６】配列番号２に示された核酸配列を有する
請求の範囲第２４項のＤＮＡプローブ。 - 【請求項２７】分析的に検出可能な試薬で標識された請
求の範囲第２４、２５又は２６項のプローブ。 - 【請求項２８】ナイセリア・ゴノロエアエを含有する疑
いのある検体中からナイセリア・ゴノロエアエを検出す
る方法であって、（ａ）配列番号１７に示されるナイセ
リア・ゴノロエアエのＤＮＡ配列の一部分（但し１５核
酸長以上の長さを有するものとする）と相補的であるＤ
ＮＡ配列を含有するプローブを、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブ
リッド形成を促進する条件下で該検体と接触させ、そし
て、（ｂ）形成されたハイブリッドすべてを検出し、そ
れによって該検体中のナイセリア・ゴノロエアエの存在
を検出する、ことを含む方法。 - 【請求項２９】プローブが請求の範囲第２５項のプロー
ブである請求の範囲第２８項の方法。 - 【請求項３０】プローブが請求の範囲第２６項のプロー
ブである請求の範囲第２８項の方法。 - 【請求項３１】プローブが分析的に検出可能な試薬で標
識された請求の範囲第２８、２９又は３０項の方法。 - 【請求項３２】請求の範囲第２４〜２７項のいずれか１
項のプローブのうち少なくとも一つを含む診断テストキ
ット。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12472787A | 1987-11-24 | 1987-11-24 | |
| US124727 | 1987-11-24 | ||
| US24275888A | 1988-09-09 | 1988-09-09 | |
| US242758 | 1988-09-09 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1500595A Division JP2803058B2 (ja) | 1987-11-24 | 1988-11-23 | 淋菌ｐｉタンパク質およびワクチンの製造 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10234388A JPH10234388A (ja) | 1998-09-08 |
| JP3388171B2 true JP3388171B2 (ja) | 2003-03-17 |
Family
ID=26822891
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1500595A Expired - Lifetime JP2803058B2 (ja) | 1987-11-24 | 1988-11-23 | 淋菌ｐｉタンパク質およびワクチンの製造 |
| JP04415498A Expired - Lifetime JP3388171B2 (ja) | 1987-11-24 | 1998-01-22 | 淋菌ｐｉタンパク質およびワクチンの製造 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1500595A Expired - Lifetime JP2803058B2 (ja) | 1987-11-24 | 1988-11-23 | 淋菌ｐｉタンパク質およびワクチンの製造 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5736361A (ja) |
| EP (2) | EP0395706B1 (ja) |
| JP (2) | JP2803058B2 (ja) |
| KR (1) | KR970011309B1 (ja) |
| AT (1) | ATE169958T1 (ja) |
| AU (1) | AU629807B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340506C (ja) |
| DE (1) | DE3856240T2 (ja) |
| DK (1) | DK175831B1 (ja) |
| FI (1) | FI102189B (ja) |
| NO (1) | NO302622B1 (ja) |
| WO (1) | WO1989004873A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| CA1340506C (en) * | 1987-11-24 | 1999-04-20 | Nicholas H. Carbonetti | Production of gonorrheal pi proteins and vaccines |
| US7118757B1 (en) * | 1988-12-19 | 2006-10-10 | Wyeth Holdings Corporation | Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine |
| EP0575553B1 (en) * | 1991-03-14 | 1998-12-16 | Imclone Systems, Inc. | Recombinant hybrid porin epitopes |
| AU7408494A (en) * | 1993-07-30 | 1995-02-28 | University Of North Carolina At Chapel Hill, The | Production of gonorrheal pi proteins and vaccines in e. coli and salmonella |
| US7252828B2 (en) | 1998-07-15 | 2007-08-07 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Polysaccharide vaccine for staphylococcal infections |
| IL146382A0 (en) * | 1999-05-13 | 2002-07-25 | American Cyanamid Co | Adjuvant combination formulations |
| EP2364726A3 (en) * | 1999-09-30 | 2011-11-09 | Isis Innovation Limited | Vaccine against neisseria infection |
| ES2391153T3 (es) * | 2000-02-28 | 2012-11-22 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Expresión heteróloga de proteínas de Neisseria |
| PL366031A1 (en) * | 2000-11-10 | 2005-01-24 | Wyeth Holdings Corporation | Adjuvant combination formulations |
| EP1583517B1 (en) | 2002-11-12 | 2019-06-12 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and products for treating staphylococcal infections |
| WO2004043405A2 (en) | 2002-11-12 | 2004-05-27 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Polysaccharide vaccine for staphylococcal infections |
| ES2738112T3 (es) | 2004-04-21 | 2020-01-20 | Brigham & Womens Hospital Inc | Péptidos de fijación a la poli-N-acetil glucosamina (PNAG/dPNAG) y procedimientos para el uso de los mismos |
| US7037698B2 (en) | 2004-05-19 | 2006-05-02 | Amano Enzyme Inc. | Pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase |
| WO2010011284A2 (en) | 2008-07-21 | 2010-01-28 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and compositions relating to synthetic beta-1,6 glucosamine oligosaccharides |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
| US4203971A (en) * | 1978-03-23 | 1980-05-20 | Government Of The United States | Neisseria gonorrhoeae vaccine |
| DE2814039C3 (de) * | 1978-03-31 | 1981-02-19 | Gesellschaft Fuer Biotechnologische Forschung Mbh (Gbf), 3300 Braunschweig | Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Bakterien |
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| US4220638A (en) * | 1978-10-12 | 1980-09-02 | Merck & Co., Inc. | Antigenic complex from N. Gonorrhoeae |
| US4288557A (en) * | 1978-10-12 | 1981-09-08 | Merck & Co., Inc. | Antigenic complex from N. gonorrhoeae |
| US4239749A (en) * | 1979-09-27 | 1980-12-16 | United States Of America | Neisseria gonorrhoeae vaccine |
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