ES2391153T3 - Expresión heteróloga de proteínas de Neisseria - Google Patents

Abstract

Un método para la expresión heteróloga de una proteína inmunogénica que comprende a) al menos 90 aminoácidos consecutivos de la secuencia b) una secuencia de longitud completa con al menos un 70% de identidad con la secuencia y en donde el péptido líder de la proteína está eliminado

Description

Expresión heteróloga de proteínas de Neisseria.

5 CAMPO TECNICO

Esta invención corresponde al campo de la expresión de proteínas. En particular se refiere a la expresión heteróloga de proteínas de Neisseria (por ejemplo N.gonorrhoeae o, preferiblemente, N. meningitidis).

TECNICA ANTERIOR

Las solicitudes de patente internacional WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/57280 y WO 00/22430 describen proteínas de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae. Típicamente estas proteínas se describen

15 como expresadas en E. coli (esto es, expresión heteróloga) como fusiones GST N-terminales o fusiones His-tag Cterminales, aunque también se describen otros sistemas de expresión, incluida la expresión en Neisseria nativa. El documento FRA- 2720408 describe la producción heteróloga de una proteína de N. meningitidis en la que se ha suprimido al menos un dominio.

20 Es un objetivo de la presente invención proporcionar enfoques alternativos y mejorados para la expresión heteróloga de estas proteínas. Estos enfoques afectarán típicamente al nivel de expresión, la facilidad de purificación, la localización celular de expresión y/o las propiedades inmunológicas de la proteína expresada.

DESCRIPCION DE LA INVENCION Nomenclatura en la presente

[04] Las secuencias de las proteínas 2166 divulgadas en la WO99/24578, WO99/36544 y la WO99/57280 están referidas en la presente por los siguientes números de SEQ#:

Solicitud

Secuencias de proteína SEQ# en la presente

WO99/24578

Even SEQ IDs 2-892 SEQ#s 1-446

WO99/36544

Even SEQ IDs 2-90 SEQ#s 447-491

WO99/57280

Even SEQ IDs 2-3020 Even SEQ IDs 3040-3114 SEQ IDs 3115-3241 SEQ#s 492-2001 SEQ#s 2002-2039 SEQ#s 2040-2166

Además de esta numeración de SEQ#, también se usan las convenciones de denominación usadas en la WO99/24578, la WO99/36544 y la WO99/57280 (por ejemplo, "ORFs4", "ORF40", "ORF40-1", etc. como se usan en la WO99/24578 y la WO99/36544: "m919", "g919" y "a919" etc. como se usan en la WO99/57280).

35 Las proteínas 2160 NMB0001 a NMB2160 de Tettelin y otros [Science (2000) 287:1809-1815] son referidas en la presente como SEQ#s 2167-4326 [ver también la WO00/66791].

El término "proteína de la invención" como se usa en la presente se refiere a una proteína inmunogénica que comprende: 40 a) al menos 90 aminoácidos consecutivos de la secuencia

b) una secuencia de longitud completa con al menos un 70% de identidad con la secuencia

y en donde el péptido líder de la proteína se borra

El grado de "identidad de secuencia" al que se hace referencia en (b) es preferiblemente mayor del 50% (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más). Esto incluye mutantes y variantes alélicas [ver por ejemplo la WO0/66741]. La identidad es preferiblemente determinada por el algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman como se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando una búsqueda de huecos por afinidad con parámetros gap open penalty=12 y Gap extension penalty=1. Típicamente, un 50% de identidad o más entre dos proteínas se considera que es una indicación de equivalencia funcional.

El "fragmento" referido en (a) debería comprender la menos n aminoácidos consecutivos de una de las SEQ#s 1-4326 y, dependiendo de la secuencia particular, n es 90 o más (por ejemplo 90, 100 o más). Preferiblemente el fragmento comprende un epítopo de una de las SEQ#s 1-4326. Los fragmentos preferidos don aquellos divulgados en la WO00/71574 y l aWO01/04316.

Las proteínas preferidas de la invención se encuentran en el serogrupo B de la N. meningitidis.

Las proteínas preferidas para el uso de acuerdo a la invención son aquellas de la cepa 2996 o la cepa 394/98 (Una cepa de Nueva Zelanda) de la N. meningitidis del serogrupo B. A menos que se indique lo contrario, las proteínas mencionadas en la presente son de la cepa 2996 de la N. meningitidis. Se apreciará, sin embargo, que la invención no está limitada en general por la cepa. Las referencias a una proteína particular (por ejemplo "287, "919") pueden ser tomadas para incluir esa proteína desde cualquier cepa.

Deleción del péptido líder

En un enfoque a la expresión heteróloga, se elimina el péptido líder nativo de una proteína de la invención. Además, se prefiere que no se use ninguna pareja de fusión.

Por lo tanto la invención proporciona un método para la expresión heteróloga de una proteína de la invención, en el que (a) el péptido líder de la proteína se borra y, opcionalmente, (b) no se usa pareja de fusión.

La invención proporciona un método para la expresión heteróloga de una proteína inmunogénica que comprende:

a) al menos 90 aminoácidos consecutivos de la secuencia

b) una secuencia de longitud completa con al menos un 70% de identidad con la secuencia

y en donde el péptido líder de la proteína se elimina.

El método implicará típicamente los pasos de: obtener ácido nucleíco que codifica una proteína de la invención; manipular el mencionado ácido nucleíco para retirar los nucleótidos que codifican el péptido líder de la proteína. EL ácido nucleíco resultante puede ser insertado en un vector de expresión, o puede ser ya parte de un vector de expresión. El primer aminoácido de la proteína expresada será el de la proteína nativa madura.

este método puede aumentar los niveles de expresión. Para la proteína 919, por ejemplo, los niveles de expresión en la E. coli son mucho más altos cuando el péptido líder se elimina. La expresión aumentada puede deberse a una localización alterada en ausencia del péptido líder.

El método se usa para la expresión de la 287.

Expresión basada en el dominio

En un cuarto enfoque de la expresión heteróloga, la proteína se expresa como dominios. Esto puede ser usado en asociación con sistemas de fusión (por ejemplo GST o fusiones His-tag).

Por lo tanto la invención proporciona un método para la expresión heteróloga de una proteína de la invención, en el que (a) al menos un dominio en la proteína se borra y, opcionalmente (b) no se usa pareja de fusión.

El procedimiento típicamente implica las etapas de: obtener ácido nucleíco que codifica una proteína de la invención; manipular el mencionado ácido nucleíco para eliminar al menos un dominio del interior de la proteína. El ácido nucleíco resultante se puede insertar en un vector de expresión o puede ser ya parte de un vector de expresión. Cuando no se usan partícipes de fusión, el primer aminoácido de la proteína expresada será el de un dominio de la proteína.

Típicamente, una proteína se divide en dominio nocionales alineándola con secuencias conocidas de bases de datos y determinando luego regiones determinantes de la proteína que presentan diferentes configuraciones de alineamiento entre sí.

El método es preferiblemente usado para la expresión de la proteína 287. Esta proteína puede ser teóricamente dividida en tres dominios, referidos como A B y C (ver Figura 5). EL dominio B se alinea fuertemente con las proteasas de la IgA, el dominio C se alinea fuertemente con las proteínas que enlazan la transferrina, y el dominio A no muestra alineamiento fuerte con las secuencias de la base de datos. Un alineamiento de formas polimórficas de la 287 se divulga en la WO00/66741.

Una vez que una proteína se ha dividido en dominios, éstos se pueden (a) expresar individualmente, (b) suprimir de la proteína, por ejemplo proteína ABCD - ABD, ACD, BCD, etc., o (c) reordenar por ejemplo, proteína ABC - ACB, CAB, etc. Estas tres estrategias se pueden combinar con parejas de fusión, si se desea.

LA ORF46 también ha sido teóricamente dividida en dos dominios - un primer dominio (aminoácidos 1-433) que está bien conservado entre las especies y los serogrupos, y un segundo dominio (aminoácidos 433-608) que no está bien conservado. El segundo dominio preferiblemente se elimina. Un alineamiento de formas polimórficas de la ORF46 se divulga en la WO00/66741.

La proteína 564 también ha sido dividida en dominios (Figura 8), como la proteína 961 (Figura 12) y la proteína 502 (aminoácidos 28-167 de la proteína MC58).

Proteínas Híbridas

En un quinto enfoque de la expresión heteróloga, dos o más (por ejemplo 3, 4, 5, 6 o más) proteínas de la invención se expresan como una sola proteína híbrida. Se prefiere que no se use una pareja de fusión no de la Neisseria (por ejemplo GST o poly-His)

Esto ofrece dos ventajas. Primera, una proteína que pueda ser inestable o expresarse deficientemente en sí puede ser ayudada añadiendo un partícipe de fusión que eluda el problema. Segunda, la producción industrial se simplifica; sólo es necesario emplear una expresión y purificación para producir dos proteínas útiles separadamente.

Por lo tanto la invención proporciona un método para la expresión heteróloga simultanea de dos o más proteínas de la invención, en el que las mencionadas dos o más proteínas de la invención se fusionan (es decir, son traducidas como una única cadena polipeptídica.

Típicamente, el procedimiento implicará las etapas de: obtener un primer ácido nucleíco que codifica una primera proteína de la invención; obtener un segundo ácido nucleíco que codifica una segunda proteína de la invención; ligar los ácidos nucleícos primero y segundo. El ácido nucleíco resultante se puede expresar en un vector de expresión, o puede ser ya parte de un vector de expresión.

Preferiblemente, las proteínas constitutivas de una proteína híbrida de acuerdo con la invención serán de la misma cepa.

Las proteínas fusionadas en el híbrido se pueden unir directamente o se pueden unir a través de un péptido conector, por ejemplo, a través de un conector de poliglicina (esto es, Gn en el que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) o a través de una secuencia peptídica corta que facilita la clonación. Evidentemente se prefiere no unir una proteína �G al término C de un conector de poliglicina.

Las proteínas fusionadas pueden carecer de péptidos líder nativos o pueden incluir la secuencia de péptido líder de la pareja de fusión N-terminal.

El método es muy adecuado para la expresión de proteínas orf1, orf4, orf24, orf40, Orf46/46.1, orf83, 233, 287, 292L, 564, 687, 741, 907, 919, 953, 961 y 983.

Se prefieren los 42 híbridos indicados por "X· en la siguiente tabla de forma NH2-A-B-COOH:

LA B-

ORF46.1 287 741 919 953 961 983

ORF46.1

X X X X X X

287

X X X X X X

741

X X X X X X

919

X X X X X X

953

X X X X X X

961

X X X X X X

983

X X X X X X

Las proteínas preferidas a ser expresadas como híbridos son por lo tanto la ORF46.1, la 287, la 741, la 919, la 953, la 961 y la 983. Estas pueden ser usadas en su forma de longitud completa esencialmente, o se pueden usar las formas de deleciones de poli-glicina (�G) (por ejemplo. �G-287, �GTbp2, �G741, �G983 etc.), o se pueden usar formas truncadas (por ejemplo �1-287, �2-287 etc.) o se pueden usar versiones de domino eliminado (por ejemplo 287B, 287C, 287BC, ORF461-433, ORF46433-608, ORF46, 961c etc.).

Particularmente preferidas son: (a) una proteína híbrida que comprende la 919 y la 287; (b)una proteína híbrida que comprende la 953 y la 287; (c) una proteína híbrida que comprende la 287 y la ORF46.1; (d) una proteína híbrida que comprende la ORF1 y la ORF46.1; (e) una proteína híbrida que comprende la 919 y la ORF 46.1; (f) una proteína híbrida que comprende la ORF46.1 y la 919; (g) una proteína híbrida que comprende la ORF46.1, la 287 y la 919; (h) una proteína híbrida que comprende la 919 y la 519; y (i) una proteína híbrida que comprende la ORF97 y la 225. Realizaciones adicionales de muestran en la Figura 14.

Donde se usa la 287, es preferible en el extremo C-terminal de un híbrido; si se va a usar en el término N, se prefiere usar un forma �G de la 287 (por ejemplo ,como el término N de un híbrido como ORF46.1, 919, 953 ó 961).

Cuando se usa 287, preferiblemente es de la cepa 2996 o de la cepa 394/98.

Preferiblemente, 961 está en el término N. Preferiblemente, en tales híbridos se usan las formas de dominio de 961.

Los alineamientos de formas polimórficas de ORF46, 287, 919 y 953 se describen en el documento WO00/66741.Se puede usar de acuerdo con la presente invención cualquiera de estos polimorfos.

Vectores alternativos

El pSM214 puede también ser usada con: �G287, �2-287, �3-287, �4-287. ORf46.1, 961L, 961, 961(MC58), 96 1 c, 96 1c-L, 9199, 953 y �G287-Orf46.1.

Otro vector adecuado es el pET-24b (Novagen, usa resistencia de kanamicina), de nuevo sin usar parejas de fusión, el pET-24b se prefiere para el uso con: �G287K, L2-287K, L3-287K, L4-287K, Orf46.1-K, Orf46A-K, 961-K (MC58), 961a-K, 961b-K, 961c-K, 961c-L-K, 961d-K, LG287-919-K, LG287-Orf46.1-K y LG287-961-K.

Forma Multimérica

Una proteína de la invención puede ser expresada o purificada de tal forma que adopte una forma multimérica particular.

Las proteínas 287 y 919 pueden ser purificadas en formas diméricas.

Lipidación

Una proteína de la invención puede ser expresada como una proteína lipidada.

De esta manera la invención proporciona un método para la expresión heteróloga de una proteína de la invención, en la que la proteína se expresa como una proteína lipidada.

Esto es particularmente útil para la expresión de la 287, formas polimórficas de la 287 se divulgan en la WO00/66741.

Deleción de la Poli-glicina

Como se describe en la presente, laos tramos de poli-glicina en secuencias del tipo salvaje se pueden mutar. Esto mejora la expresión de proteína.

El tramos de poli-glicina tiene la secuencia (Gly)n, donde n�4 (por ejemplo 5, ,6 ,7, 8, 9 o más). Este tramos es mutado para interrumpir o retirar la (Gly)n. Esto puede ser por deleción (por ejemplo CGGGGS-CGGGS, CGGS, CGS o CS), por sustitución (por ejemplo CGGGGS-CGXGGS, CGXXGS, CGXGXS etc.), y/o por inserción (por ejemplo CGGGGS-CGGXGGS, CGXGGGS, etc.).

Este enfoque no está restringido a proteínas de Neisseria - puede ser usado para cualquier proteína (particularmente proteínas bacterianas) para mejorar la expresión heteróloga. Para las proteínas de Neisseria, sin embargo, es particularmente adecuado para expresar ls 287, 741, 983 y Tbp2. Un alineamiento de formas polimórficas de la 287 se divulga en la WO00/66741.

Se describe en la presente un método para la expresión heteróloga de una proteína, en la que (a) se muta un tramo de poli-glicina dentro de la proteína.

El método implicará típicamente los pasos de: obtener ácido nucleíco que codifica una proteína de la invención; y manipular el mencionado ácido nucleíco para mutar los nucleótidos que codifican un tramo de poliglicina dentro de la secuencia de la proteína. El ácido nucleíco resultante puede ser insertado en un vector de expresión, o puede ser ya parte de un vector de expresión.

A la inversa, el enfoque opuesto (es decir, introducción de tramos de poli-glicina) puede ser usado para suprimir o disminuir la expresión de una proteína heteróloga dada.

Huésped heterólogo

Mientras que la expresión de las proteínas de la invención puede tener lugar en el huésped nativo (es decir, el organismo en el que la proteína se expresa en la naturaleza), la presente invención utiliza un huésped heterólogo El huésped heterólogo puede ser procariótico o eucariótico. Preferiblemente es E. coli, pero entre otros huéspedes adecuados están incluidos Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (por ejemplo, Tuberculosis), levadura, etc.

Vectores, etc

Además de los procedimientos descritos antes, la invención proporciona (a) ácido nucleíco y vectores útiles en estos procedimientos, (b) células huésped que contienen los mencionados vectores, (c) proteínas expresadas o expresables por los procedimientos, (d) composiciones que comprenden estas proteínas, que pueden ser adecuadas como vacunas, por ejemplo, o como reactivos diagnósticos, (e) estas composiciones para uso como medicamentos (por ejemplo, vacunas), (f) el uso de estas composiciones en la fabricación de (1) un medicamento para tratar o prevenir una infección debida a bacterias Neisseria, (2) un reactivo diagnóstico para detectar la presencia de bacterias Neisseria o de anticuerpos generados contra bacterias Neisseria, y/o (3) un reactivo que puede generar anticuerpos contra bacterias Neisseria y (g) un procedimiento para tratar un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de estas composiciones.

Secuencias

La invención proporciona también una proteína o un ácido nucleíco que tiene cualquiera de las secuencias que se presentan en los ejemplos siguientes. También proporciona proteínas y ácido nucleíco que tienen identidad de secuencia con las anteriores. Como se ha descrito antes, el grado de identidad de la secuencia es mayor que 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más).

Además, la invención proporciona ácido nucleíco que puede hibridizar con el ácido nucleico descrito en los ejemplos, preferiblemente en condiciones de “alta rigurosidad” (por ejemplo, 65ºC en una solución 01xSSC, 05% de SDS.

La invención también usa ácido nucleíco que codifica proteínas usadas en la invención.

Debe apreciarse también que la invención proporciona ácido nucleíco que comprende secuencias complementarias de las descritas antes (por ejemplo, de antisentido o a fines de sonda). El ácido nucleíco de acuerdo con la invención se puede preparar, obviamente, de varias maneras (por ejemplo, por síntesis química, a partir de bibliotecas genómicas o de cDNA, a partir del propio organismo, etc.) y puede tomar varias formas (por ejemplo, de cadena simple, cadena doble, vectores, sondas, etc.).

Además, el término “ácido nucleíco” incluye DNA y RNA y también sus análogos, tales como los que contienen espinazos modificados, y también ácidos nucleícos peptídicos (PNA) etc.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Las Figura 1 y 2 muestran constructos usados para expresar proteínas que usan péptidos líder heterólogos. La Figura 3 muestra datos de expresión par ala ORF1, y la Figura 4 muestra datos similares para la proteína

961. La Figura 5 muestra dominios de la proteína 287, y las Figuras 6 y 7muestran deleciones dentro del dominio

A. La Figura 8 muestra dominios de la proteína 564. La Figura 9 muestra el gen indicador conducido por el péptido líder 9191, y la Figura 10 muestra los

resultados obtenidos usando mutantes del péptido líder. La Figura 11 muestra mutantes de inserción de la proteína 730 (A: 730-C1; B730-C2). La Figura 12 muestra dominios de la proteína 961. La Figura 13 muestra el SDS-PAGE de proteínas �G. Los puntos muestran el producto recombinante

principal. La Figura 14 muestra 26 proteínas híbridas de acuerdo con la invención.

Ejemplos y Ejemplos de Referencia

Ejemplo de Referencia 1 - 919 y su péptido líder

La proteína 919 de la N. meningitidis (serogrupo B, cepa 2996) tiene la secuencia siguiente:

El péptido líder está subrayado. Las secuencias de la 919 de otras cepas se pueden encontrar en las Figuras 7 y 18 de la WO00/66741. El ejemplo 2 de la WO99/57280 divulga la expresión de la proteína 9191 como una fusión His en el E. coli.

La proteína es un inmunógeno expuesto a la superficie bueno. Se usaron tres estrategias de expresión alternativas para la 919: 1) 919 sin su péptido lider (y sin la siteina N-terminal madura) y sin pareja de fusión ("91sin etiquetar"):

EL péptido líder y la cisteína fueron omitidos diseñando el cebador de amplificación 5' final hacia abajo desde la secuencia líder predicha. 2) 9191 con su propio péptido líder pero sin pareja de fusión ("919); y 3) 919 con el péptido líder (MKTFFKTLSAAALALILAA) de la ORF4 ("919LOrf4").

Para hacer este constructo, la secuencia entera que codifica el péptido líder de la ORF4 fue incluida en el cebador 5' como una cola (cebador 919Lorf4 For). Un sitio de restricción Nhel fue generado por un cambio de nucleótido doble en la secuencia que codifica el líder de la ORF4 (sin cambios de aminoácido), para permitir que genes diferentes sean fusionados con la secuencia del péptido líder de la ORF4. Un codón de terminación fue incluido en todas las secuencias del cebador 3' finales.

Las tres formas de la proteína fueron expresadas y pudieron ser purificadas.

Los productos de la expresión "919L" y "919LOrf4" fueron lipidados, como de muestra por la incorporación de la etiqueta de palmitato [3H]. La 919sin etiquetar no incorporaba la etiqueta 3H y fue ubicada intracelularmente.

La 919LOrf4 pudo ser purificada más fácilmente que la 919L. Fue purificada y usada para inmunizar ratones. El suero resultante dio excelentes resultados en las pruebas FACS y ELISA, y también en el ensayo bactericida. Se mostró que la lipoproteína estaba ubicada en la membrana exterior.

La 919sin etiquetar dio excelentes títulos ELISA y alta actividad bactericida del suero. El FACS Confirmó su localización de superficie celular.

Ejemplo de Referencia 2 - 9191 y temperatura de expresión

El crecimiento de la E. coli que expresaba la proteína 919LOrf4 a 37º C resultó en la lisis de la bacteria. Para superar este problema, la bacteria recombinante fue cultivada a 30º C. La lisis fue evitada sin evitar la expresión.

Ejemplo de Referencia 3 -mutación de la 907, 919 y la 922

Se formuló la hipótesis de que las proteínas 917, 919 y 922 son hidrolasas de mureína, y más particularmente transglicosilasas líticas. Las hidrolasas de mureína están ubicadas en la membrana exterior y participan en la degradación del peptidoglicano.

Las proteínas purificadas 919sin etiquetar, 919Lorf4, 919-His (es decir con una etiqueta His del término C) y 992-His fueron por lo tanto probadas para la actividad de hidrolasa de mureína [Ursinus y Holtje (1994) J. Bact. 176:338-343]. se usaron dos ensayos diferentes, uno determinando la degradación del sáculo de mureína en los muropéptidos solubles y el otro midiendo el desglose de las cadenas de glicano poli(MurNAc-ClcNAc)n>30.

El primer ensayo usa sáculos de mureína radioetiquetados con ácido meso-2,6-diamino-3,4,5-[3H]pimélico como sustrato. El enzima (3-10μg totales) fue incubado durante 45 minutos a 37º C en un volumen total de 100 μl que comprendía 10 mM de Tris-maleato (pH 5,5), 10 mM de MgCl2, un 0,2% v/v de Triton X-100 y sáculo de mureína etiquetado [3H]A2pm (alrededor de 10000 cpm). La mezcla del ensayo fue colocada en hielo durante 15 minutos con 100 μl de un 1% w/v de N-acetil-N,N,N-trimetilamonio durante 15 minutos y el material precipitado peletizado por centrifugación a 100000 g durante 150 minutos. La radioactividad en el sobrenadante fue medida por conteo por centelleo líquido. Se usó transglicosilasa Slt70 lítica soluble al E.coli como un control positivo para el ensayo; el control negativo comprendió la solución del ensayo anterior sin el enzima.

Todas las proteínas excepto la 919-His dieron resultados positivos en el priemr ensayo.

El segundo ensayo monitoriza la hidrólisis de las cadenas de poli(MurNAc-ClcNAc)glicano. Las cadenas purificadas, etiquetadas poli(Mur-NAc-GlcNAc)n>30 con N-acetil-D-A-[3H]glucosamina fueron incubadas con 3 μg de 919L en 10 mM de Tris-maleato (pH 5,5), 10 mM de MgCl2 y un 0,2% v/v de Triton X-100 durante 30 minutos a 37º

C. La reacción se paró por ebullición durante 5 minutos y el pH de la muestra ajustado a alrededor de 3,5 por adición e 10 μl de un 20% v/v de ácido fosfórico. El sustrato y el producto fueron separados por HPLC de fase inversa en una columna Nucleosil 300 C18 como se describe por Harz y otros [Anal. Biochem. (1990) 190:120-128]. El Mlt A de la transglicosilasa lítica del E. coli fue usada como un control positivo en el ensayo. El control negativo fue realizado en la ausencia de enzimas.

Por este ensayo, se demostró la capacidad de la 919LOrf4 para hidrolizar cadenas de glicano aisladas cuando las subunidades anhidrodisacáridas fueron separadas del oligosacárido por HPLC.

La proteína 919 Lorf4 fue elegida para los análisis cinéticos. La actividad de la 919Lorf4 fue potenciada 3,7 veces por la adición de un 0,2% v/v de Triton X-100 en el regulador del ensayo. La presencia del Triton X-100 no tuvo efecto en la actividad de la 919sin etiquetar. El efecto del pH en la actividad del enzima fue determinada en regulador Tris-Maleato sobre un intervalo de 5,0 a 8,0. Se determinó que el pH óptimo para la reacción era de 5,5. Sobre el intervalo de temperatura de 18º C a 42º C, se observó la actividad máxima a 37º C. El efecto de varios iones en la actividad de la hidrolasa de mureina fue determinado realizando la reacción en presencia de una variedad de iones a una concentración final de 10mM. La actividad máxima se encontró con el Mg2+, que estimuló la actividad 2,1 veces. El Mn2+ y el Ca2+ también estimularon la actividad enzimática a una extensión similar mientras que la adición de Ni2+ y EDTA no tuvo un efecto significativo. Por el contrario, tanto el Fe2+ como el Zn2+ inhibieron significativamente la actividad enzimática. Las estructuras de los productos de la reacción resultantes de la digestión del sáculo de mureina de E. coli sin etiquetar fueron analizados por HPLC de fase inversa como se describe por Glauner [Anal. Biochem. (1998) 172:451-464]. Los sáculos de mureina digeridos con la Cellosyl muramidasa fueron usados para calibrar y estandarizar la columna ODS Hypersil. Los productos de la reacción principales fueron péptidos tetra y tri 1,6 anhidrodisacaridos, demostrando la formación del enlace intermolecular del de ácido 1,6 anhidromuramínico.

Estos resultados demuestran experimentalmente que la 919 es una hidrolasa de mureina y en particular un miembro de la familia transglicosilasa lítica de los enzimas. Además la capacidad de la 922-His de hidrolizar sáculos de mureina sugiere que esta proteína es también una transglicosilasa lítica.

Esta actividad puede ayudar a explicar los efectos tóxicos de la 919 cuando se expresa en el E. coli.

Para eliminar la actividad enzimática, se uso la mutagénesis racional,. Las 907, 919 y 922 muestran homología bastante baja a tres transglicosilasas líticas de mureina lipidadas enlazadas a la membrana del E. coli.

919 (441aa) es un 27,3% idéntica sobre la superposición 440aa a la MLTA de la E.coli (P46885);

922 (369aa) es un 38,7% idéntica sobre la superposición 310aa a la MLTB de la E. coli (P41052); y

907-2 (207aa) es un 26,8% idéntica sobre la superposición 149aa a la MLTC de la E.coli (P52066).

La 907-2 también comparte homología con la MLTD de la E.coli (P23931) y la Slt70 (P03810), una transglicosilasa lítica soluble que está localizada en el espacio periplásmico. No se puede detectar una homología de secuencia significativa entre las 919, 922 y 907-2, y lo mism oes cierto entre las proteína MLTA, MLTB y MLTC correspondientes.

Las estructuras de cristal están disponibles para la Slt70 [1QTEA; 1QTEB; Thunissen y otros (1995) B¡iochemistry 34: 12729-12737] y para la Slt35 [1LTM; 1QUS; 1QUT; van Asselt y otros (199) Streucture Fold DEs 7:1167-80] que es una forma soluble de la MLTB 40kDa.

El residuo catalítico (un ácido glutámico) ha sido identificado para la Slt70 y la MLTB.

En el caso de la Slt70, los estudios de mutagénesis han demostrado que incluso una sustitución conservadora de la Glu505 catalítica con una glutamina (Gln) causa la pérdida completa de la actividad enzimática.

A pesar de que la Slt35 no tiene similitud de secuencia obvia con la Slt70, sus dominios catalíticos muestran una similitud sorprendente. El residuo catalítico correspondiente en la MLTB es el Glu162.

Otro residuo que se cree que juega un papel importante en el plegado correcto de la hendidura enzimática es una corriente hacia abajo de glicina (Gly) bien conservada del ácido glutámico. Recientemente, Terrak y otros [Mol. Microbiol. (1999) 34:350-64] han sugerido la presencia de otro residuo importante que es un aminoácido aromático localizado alrededor de 70-75 residuos corriente abajo del ácido glutámico catalítico.

El alineamiento de secuencias de la Slt70 con la 907-2 y de la MLTB con la 922 fueron realizados para identificar los residuos catalíticos correspondientes en antígenos MenB.

Los dos alineamientos en la región del dominio catalítico son presentados a continuación:

De estos alineamientos, resulta que el glutamato catalítico correspondiente en la 907-2 es el Glu117, mientras en la 922 es el Glu164. Ambos antígenos también comparten glicinas corriente abajo que podrían tener un papel estructural en el plegado de la hendidura enzimática (en negrita), y l a922 ha conservado residuo aromático alrededor de la 70aa corriente abajo (en negrita).

En el caso de la proteína 919, no está disponible ninguna estructura 3D para su MLTA homólogo de E. coli, y no se conoce nada sobre un posible residuo catalítico. Sin embargo, se predicen tres aminoácidos en la 919 como residuos catalíticos por alineamiento con la MLTA:

Estos tres posibles residuos catalíticos se muestran por el símbolo T:

1) Glu255 (Asp en la MLTA), seguido por tres glicinas conservadas (Gly263, Gly265 y Gly272) y tres residuos aromáticos conservados localizados aproximadamente 75-77 residuos corriente abajo. Estos residuos corriente abajo se muestran por D.

2) Glu 323 (conservada en la MLTA), seguido por 2 glicinas conservadas (GLy347 y Gly355) y dos residuos aromáticos conservados localizados 84-85 residuos corriente abajo (Tyr406 o Phe407). Estos residuos corriente abajo se muestran por O.

3) ASp362 (en lugar del Glu esperado), seguido por una glicina (Gly 369) y un residuo aromático conservado (Trp428). Estos residuos corriente abajo se muestran por o.

Los alineamientos de formas polimórficas de la 919 se divulgan en la WO00/66741.

En base a la predicción de los residuos catalíticos, se han generado tres mutantes de la 919 y un mutante de la 907, conteniendo cada uno una única sustitución de aminoácido. Los ácidos glutámicos en la posición 255 y 323 y los ácidos aspárticos en la posición 362 de la proteína 919 y el ácido glutámico en la posición 117 de la proteína 907, fueron reemplazados con residuos de glicina usando SDM basada en PCR. Para hacer esto, se diseñaron cebadores internos que contenían un cambio de codón para el Glu oAsp o Gly:

Cebadores

Secuencias Cambio de codón

919-E255 for 919-E255 rev

GAA - Ggt

919-E323 for 919-E323 rev

GAA - Ggt

919-D362 for 919-D362 rev

GAC - Ggt

907-E117 for 907-E117 rev

GAA - Ggt

Los nucleótidos subrayados codifican para la glicina; los nucleótidos mutados están en minúscula.

Para generar los mutantes 919-E255, 919-E323 y 919-E362, se realizó PCR usando 20 ng del ADN de la 919 LORrf4 de pET como plantilla, y los siguientes pares de cebadores:

1) Orf4L for / 919-E255 rev 2) 919-E255 for / 919L rev 3) Orf4L for / 919-E323 rev 4) 919-E323 for /919L rev 5) Orf4L for / 919-D362 rev

6) 919-D362 for / 919L rev

La segunda ronda de PCR fue realizada usando el producto del PCR 1-2, 3-4 ó 5-6 como plantilla, y como cebadores directos e inversos los "Orf4L for" y "919L rev" respectivamente.

Para el mutante 907-E117, el PCR ha sido realizado usando 200 ng de ADN cromosómico de la cepa 2996 como plantilla y los siguientes pares de cebadores:

7) 907L for / 907-E117 rev

8) 907-E for / 907L rev

La segunda ronda de PCR fue realizada usando los productos de los PCR 7 y 8 como plantillas y los oligos "907L for" y "907L rev" como cebadores.

Los fragmentos de PCR que contenían cada mutación fueron procesados después del procedimiento estándar, digeridos con enzimas de restricción Ndel y Xhol y clonados en el vector pET-21b+. La presencia de cada mutación fue confirmada por análisis de secuencia.

La mutación de Glu117 a Gly en la 907 se lleva a cabo de manera similar, como es una mutación de residuos Glu164, Ser213 y Asn348 en la 922.

El mutante E255G de la 919 muestra un 50% de reducción en la actividad; el mutante E323G muestra un 70% de reducción en la actividad; el mutante E362G no muestra reducción en la actividad.

Ejemplo de Referencia 4 - forma multimérica

[102] Las 287-GST, 919sin etiquetar y 953-His fueron sometidas a filtración en gel para el análisis de la estructura cuaternaria o propósitos preparativos. Se estimó el peso molecular de las proteínas nativas usando columnas de filtración en gel Superdex 75 o FPLC Superpose 12 (H/R 10/30) (Pharmacia). Los reguladores usados para la cromatografía para las 287, 919 y 953 fueron 50mM de Tris HCl (pH 8,0), 20 mM de Bicina (pH 8,5) y 50 mM de Bicina (pH 8, 0), respectivamente.

Adicionalmente cada regulador contenía 150-200 mM de NaCl y un 10% v/v de glicerol. Las proteínas fueron dializadas contra el regulador apropiado y aplicadas en un volumen de 200 μl. La filtración en gel fue realizada con un caudal de 0,5-2,0 ml/min y el eluido monitorizado a 280 nm. Las fracciones fueron recogidas y analizadas por SDS-PAGE. Se usaron azul dextrano 200 y los estándares de peso molecular de la ribonucleasa A, quimotripsina A ovalbumina, albumina (Pharamcia) para calibrar la columna. El peso molecular de la muestra fue estimado de una curva de calibración de Kav contra log Mr de los estándares. Antes de la filtración en gel, la 287-GST fue digerida con trombina para hender la fracción GST.

[104] Los pesos moleculares estimados para las 287,919 y 953-His fueron 73 kDa, 47kDa y 43 kDA respectivamente. Estos resultados sugieren que la 919 es monomérica mientras que tanto la 287 como la 953 son principalmente diméricas en sus naturaleza. En el caso de la 953-His, se observaron dos picos durante la filtración en gel. El pico mayor (80%) representó una conformación dimérica de la 953 mientras el pico menor (20%) tuvo el tamaño esperado de un monómero. Se descubrió que la forma monomérica de la 953 tiene mayor actividad bactericida que la dímera.

Ejemplo de Referencia 5 - Vectores 5-psM214 y pET-24b

La proteína 953 con su péptido líder nativo y sin partícipes de fusión se expresó a partir del vector pET y también de pSM214 [Velati Bellini y otros, (1991), J. Biotechnol. 18, 177-192].

La secuencia de 953 se clonó como gen de longitud total en pSM214 usando la cepa MM294-1 de E. coli como huésped. Para hacerlo, se amplificó por reacción en cadena de polimerasa (PCR) la secuencia entera de DNA del gen de 953 /de ATG al codón STOP) usando los cebadores siguientes:

que contienen los sitios de restricción EcoRI y HindIII, respectivamente. El fragmento amplificado se digirió con ECORI y HindIII y se ligó con el vector pSM214 digerido con las mismas dos enzimas. El plásmido ligado se transformó en células MM294-1 de E. coli (por incubación en hielo durante 65 min a 37ºC) y las células bacterianas se cultivaron en agar LB que contenía 20 !g/ml de cloranfenicol.

Se hicieron crecer colonias recombinantes durante la noche, a 37ºC en 4 ml de caldo LB que contenía 20 !g/ml de cloranfenicol; se centrifugaron las células microbianas y se extrajo DNA del plásmido y se analizó por restricción con EcoRI y HindIII. Para analizar la capacidad de las colonias recombinantes de expresar la proteína, se inocularon con caldo de LB que contenía 20 !g/ml de cloranfenicol y se dejaron crecer durante 16 horas a 37ºC. Se centrifugaron las células bacterianas y ase pusieron en suspensión PBS. La expresión de la proteína se analizó por SDS-PAGE y tinción con azul Coomassie.

Los niveles de expresión fueron inesperadamente altos desde el plásmido pSM214.

Los oligonucleótidos usados para clonar secuencias en vectores pSM214 fueron los siguientes:

LG287 (pSM-214)

Fwd CCGGAATTCTTATG-TCGCCCGATGTTAAATCGGCGGA EcoRI

Rev

GCCCAAGCTT-TCAATCCTGCTCTTTTTTGCCG HindIII

L2 287 (pSM-214)

Fwd CCGGAATTCTTATG-AGCCAAGATATGGCGGCAGT EcoRI

Rev

GCCCAAGCTT-TCAATCCTGCTCT’ITI’1TGCCG HindIII

L3 287 (pSM-214)

Fwd CCGGAATTCTTATG-TCCGCCGAATCCGCAAATCA EcoRI

Rev

GCCCAAGCTT-TCAATCCTGCTCTTTTTTGCCG HindIII

L4287 (pSM-214)

Fwd CCGGAATTCTTATG-GGAAGGGTTGATTTGGCTAATG EcoRI

Rev

GCCCAAGCTT-TCAATCCTGCTCTTTTTTGCCG HindIII

Orf46.1 (pSM-214)

Fwd CCGGAATTCTTATG-TCAGATTTGGCAAACGATTCTT EcoRI

Rev

GCCCAAGCTT-TTACGTATCATATTTCACGTGCTTC HindIII

LG287-0p<46.1 (nLM-214)

Fwd CCGGAATTCTTATG-TCGCCCGATGTTAAATCGGCGGA EcoRI

Rev

GCCCAAGCTT-TTACGTATCATATTTCACGTGCTTC HindIII

919 (pSM-214)

Fwd CCGGAATTCTTATG-CAAAGCAAGAGCATCCAAACCT EcoRI

Rev

GCCCAAGCTT-TTACGGGCGGTATTCGGGCT HindIII

961L (pSM-214)

Fwd CCGGAATTCATATG-AAACACTTTCCATCC . EcoRI

Rev

GCCCAAGCTT-TTACCACTCGTAATTGAC HindIII

961 (pSM-214)

Fwd CCGGAATTCATATG-GCCACAAGCGACGAC EcoRI

Rev

GCCCAAGCTT-TTACCACTCGTAATTGAC HindIII

961c L pSM-214

Fwd CCGGAATTCTTATG-AAACACTTTCCATCC EcoRI

Rev

GCCCAAGCTT-TCAACCCACGTTGTAAGGTTG HindIII

961c pSM-214

Fwd CCGGAATTCTTATG-GCCACAAACGACGACG EcoRI

Rev

GCCCAAGCTT-TCAACCCACGTTGTAAGGTTG HindIII

953 (pSM-214)

Fwd CCGGAATTCTTATG-GCCACCTACAAAGTGGACGA EcoRI

Rev

GCCCAAGCTT-TTATTGTTTGGCTGCCTCGATT HindIII

Estas secuencias se manipularon, clonaron y expresaron como se ha descrito para 953L.

Para el vector pET-24, se clonaron las secuencias y las proteínas se expresaron en pET-24 como se describe más adelante para pET21. pET2 tiene la misma secuencia que pET-21, pero con la casete de resistencia a la kanamicina en vez de la casete de ampicilina.

Los oligonucleótidos usados para clonar secuencias en el vector pET24b fueron las siguientes:

LG 287 K

Fwd CGCGGATCCGCTAGC-CCCGATGTTAAATCGGC § NheI

Rev

CCCGCTCGAG-TCAATCCTGCTCTITITTGCC * XhoI

L2 287 K

Fwd CGCGGATCCGCTAGC-CAAGATATGGCGGCAGT § Nhel

L3 287 K

Fwd CGCGGATCCGCTAGC-GCCGAATCCGCAAATCA § NheI

L4 287 K

Fwd CGCGCTAGC-GGAAGGGTTGATTTGGCTAATGG § NheI

Orf46.1 K

Fwd GGGAATTCCATATG-GGCATTTCCCGCAAAATATC NdeI

Rev

CCCGCTCGAG-TTACGTATCATATITCACGTGC XhoI

Orf46A K

Fwd GGGAATTCCATATG-GGCATTTCCCGCAAAATATC NdeI

Rev

CCCGCTCGAG-TTATTCTATGCCTTGTGCGGCAT Xhol

961 K (MC58)

Fwd CGCGGATCCCATATG-GCCACAAGCGACGACGA Ndel

Rev

CCCGCTCGAG-TTACCACTCGTAATTGAC XhoI

961a K

Fwd CGCGGATCCCATATG-GCCACAAACGACG NdeI

Rev

CCCGCTCGAG-TCATTTAGCAATATTATCTTTGTTC Xhol

961b K

Fwd CGCGGATCCCATATG-AAAGCAAACAGTGCCGAC Ndel

Rev

CCCGCTCGAG-TTACCACTCGTAATTGAC XhoI

961c K

Fwd CGCGGATCCCATATG-GCCACAAACGACG NdeI

Rev

CCCGCTCGAG-TTAACCCACGTTGTAAGGT Xhol

961cL K

Fwd CGCGGATCCCATATG-ATGAAACACTTTCCATCC Ndel

Rev

CCCGCTCGAG-TTAACCCACGTTGTAAGGT Xhol

961d K

Fwd CGCGGATCCCATATG-GCCACAAACGACG Ndel

Rev

CCCGCTCGAG-TCAGTCTGACACTGTTTTATCC XhoI

.G 287-919 K

Fwd CGCGGATCCGCTAGC-CCCGATGTTAAATCGGC NheI

Rev

CCCGCTCGAG-TTACGGGCGGTATTCGG XhoI

.G 287-Orf46.1 K

Fwd CGCGGATCCGCTAGC-CCCGATGTTAAATCGGC NheI

Rev

CCCGCTCGAG-TTACGTATCATATTTCACGTGC Xhol

.G 287-961 K

Fwd CGCGGATCCGCTAGC-CCCGATGTTAAATCGGC NheI

Rev

CCCGCTCGAG-TTACCACTCGTAATTGAC XhoI

* Este cebador se usó como cebador Inverso para todas las formas de la 287. Los cebadores directos usados en combinación con el cebador inverso LG278 K.

Ejemplo 6 -ORF1 y su péptido líder

[113] La ORF1 de la n. meningitidis (serogrupo B, cepa MC58) se prevé que sea una membrana exterior o proteína secretada. Tiene la siguiente secuencia:

El péptido líder está subrayado Una forma polimórfica e la ORF 1 se divulga en la WO99/55873. Se han usado tres estrategias de expresión para la ORF 1:

1) ORF1 usando una etiqueta His, siguiendo la WO99/24578 (ORF1-His; 2) ORF1 con su propio péptido líder pero sin ninguna pareja de fusión ("ORF1L"); y 3) ORF1 con el péptido líder (MKKTAIAIAVALAGFATVAQA) de la OmpA del E. coli ("Orf1LOmpA"):

Para hacer este constructo, el clon pET911LOmpA (ver más abajo) fue digerida con enzimas de restricción Nhel y Xhol y el fragmento correspondiente al vector que lleva la secuencia líder de la OmpA fue purificada (pETLOmpA). El gen de la ORF1 que codifica para la proteína madura fue amplificado usando los oligonucleótidos ORF1-For y ORF1-Rev (incluyendo los sitios de restricción Nhel y Xhol, respectivamente), digerido con Nhel y Xhol y ligado al fragmento pETOmpA purificado (ver Figura 1). Se introdujo un dipéptido AS adicional en el sitio Nhel.

Se expresaron las tres formas de la proteína. La proteína etiquetada His pudo ser purificada y se confirmo como expuesta a la superficie, y posiblemente secretada (ver Figura 3). La proteína se usó para inmunizar ratones, y el suero resultante dio excelentes resultados en el ensayo bactericida.

La ORF1LOmpA fue purificada como membranas totales, y fue localizada en tanto la membrana interna como la externa. Inesperadamente, el suero producido contra la ORF1LOmpA mostró incluso mejores propiedades anti-bactericidas y ELISA que los producidos contra la proteína etiquetada His.

La ORF1L fue purificada como membranas exteriores, donde se localiza.

Ejemplo de Referencia 7 - proteína 911 y su péptido líder

La proteína 911 de la N. meningitidis (serogrupo B, cepa MC58) tiene la siguiente secuencia:

El péptido líder está subrayado

Se han empelado tres estrategias de expresión para la 911:

1) 911 con su propio péptido líder pero sin ninguna pareja de fusión ("911L"); 2) 911 con el péptido líder de la OmpA del E. coli ("911LOmpA"). Para hacer este constructo, la secuencia entera que codifica el péptido líder de la OmpA fue incluida en el cebador 5' como una cola (cebador 911LOmpA Directo). Un sitio de restricción Nhel fue insertado entre la secuencia que codifica para el péptido líder de la OmpA y el gen de la 911 que codifica la proteína madura prevista (inserción de un aminoácido, una serina), para permitir el uso de este constructo para clonar diferentes genes corriente abajo de la secuencia del péptido líder de la OmpA. 3) 911 con el péptido líder (MKYLLPTAAAGLLLAAQPAMA) de la Erwinia carotovora PelB ("911LpelB").

Para hacer este constructo, el cebador PCR final 5' fue diseñado corriente abajo desde la secuencia líder e incluyó el sitio de restricción Ncol para tener la 911 fusionada directamente con la secuencia líder PelB; el cebador final 3' incluyó el codón STOP. El vector de expresión usado fue el pET22b+ (Novagen), que lleva la secuencia codificante para el péptido líder de la PelB. El sitio Ncol introduce una metionina adicional después de la secuencia de la PelB.

Se expresaron las tres formas de la proteína. Los títulos ELISA fueron más altos usando la 911L, con la 919LOmpA dando también buenos resultados.

Ejemplo de Referencia 8 - ORF46

La proteína ORF46 de la N. meningitidis (serogrupo B, cepa 2996) tiene la siguiente secuencia:

El péptido líder está subrayado.

Las secuencias de la ORF46 de otras cepas se pueden encontrar en la WO00/66741.

Se han usado tres estrategias de expresión par ala ORF46:

1) ORF46 con su propio péptido líder pero sin ninguna pareja de fusión ("ORF46-2L"); 2) ORF46 sin su péptido líder y sin ninguna pareja de fusión ("ORF46-2"), con el péptido líder omitido diseñando el cebador de amplificación final 5' corriente abajo desde la secuencia líder prevista:

Un codón STOP se incluyó en las secuencias del cebador final 3'.

La ORF46-2L se expresa a muy bajo nivel en el E. coli. La retirada de su péptido líder (ORF46-2) no resuelve este problema. La forma ORF46.1L truncada (primeros 433 aminoácidos, que están bien conservados entre los serogrupos y las especies), sin embargo, está bien expresada y da excelentes resultados en la prueba ELISA y en el ensayo bactericida.

La ORF46.1 también ha sido usada como la base de proteínas híbridas. Ha sido fusionada con la 287, la 919 y laORF1. Las proteínas híbridas fueron de forma general insolubles, pero dieron algunos buenos resultados ELISA y bactericidas (contra la cepa homóloga 2996):

Proteína

ELISA Ab Bactericida

Orf1-Orf46.1-His

850 256

919-Orf46.1-His

12900 512

919-287-Orf46-His

n.d. n.d.

Orf46.1-287His

150 8192

Orf46.1-919His

2800 2048

Orf46.1-287-919His

3200 16384

Por comparación, se construyeron híbridos "triples" de las ORF46, 1, 287 (o como una fusión GST, o en la forma �G287) y 919 y se probaron contra varias cepas (incluyendo la cepa 2996 homóloga) frente a una mezcla simple de los tres antígenos. Se usó FCA como adyuvante:

2996

BZ232 MC58 NGH38 F6124 BZ133

Mezcla

8192 256 512 1024 >2048 >2048

ORF46.1-287-919his

16384 256 4096 8192 8192 8192

LG287-919-ORF46.1his

8192 64 4096 8192 8192 16384

LG287-ORF46.1-919his

4096 128 256 8192 512 1024

De nuevo, los híbridos mostraron actividad inmunológica equivalente o superior.

Los híbridos de las dos proteínas (cepa 2996) se compararon con las proteínas individuales contra varias cepas heterólogas:

1000

MC58 F6124 (MenA)

ORF46.1-His

<4 4096 <4

ORF1-His

8 256 128

ORF1-ORF46.1-His

1024 512 1024

De nuevo, los híbridos mostraron actividad inmunológica equivalente o superior.

Ejemplo de Referencia 9 -proteína 961

La proteína 961 entera de N. meningitidis (serogrupo B, cepa MC58) tiene la siguiente secuencia:

El péptido líder está subrayado. Se usaron tres enfoques a la expresión de 961:

(1)

usando una proteína de fusión de GST, según WO 99/57280 (“GST961”)

(2)

961 con su propia secuencia líder pero sin partícipe de fusión (“961L”), y

(3)

961 sin su secuencia líder y sin partícipe de fusión (“961no etiquetada”), con el péptido líder omitido por diseñar el cebador de PCR del extremo 5’ aguas abajo de la secuencia líder prevista.

Se expresaron las tres formas de la proteína. Se pudo purificar la proteína de fusión GST y los anticuerpos contra ella confirmaron que 961 es de superficie expuesta (Figura 4). La proteína se usó para inmunizar ratones y los sueros resultantes dieron excelentes resultados en el ensayo bactericida. También se pudo purificar 961L y dio títulos por ELISA muy altos.

Parece que la proteína 961 es de fase variable. Además, no se encuentra en todas las cepas de N. meningitidis.

La proteína 287 de la N. meningitidis (serogrupo B, cepa 2996) tiene la siguiente secuencia:

El péptido líder se muestra subrayado Las secuencias de la 287 de otras cepas se puede4n encontrar en las Figuras 5 y 15 de la WO00/66741. El Ejemplo 9 de la WO99/57280 divulga la expresión de la 287 como un fusión GST en el E. coli. Se han usado un número de enfoques adicionales para expresar la 287 en la E.coli, incluyendo:

1) 287 como fusión etiquetada His ("287"-His"); 2) 287 con su propio péptido líder pero sin ninguna pareja de fusión ("287L"); 3) 287 con los péptidos líder de la ORF4 y sin ninguna pareja de fusión ("287LOrf4"); y 4) 287 sin su péptido líder y sin ninguna pareja de fusión ("287sin etiquetar").

Todas estas proteínas pudieron ser expresadas y purificadas.

La "287l" u la "287Lorf4" fueron confirmadas como lipoproteínas.

Como se muestra en la Figura 2, la "287LOrf4" fue construida digiriendo la 919Lorf4 con Nhel y Xhol. El péptido líder completo de la ORF4 fue restaurado por la adición de una secuencia de ADN codificando para los aminoácidos desaparecidos, como una cola, en el cebador final 5' (287LOrf4 for), fusionada con la secuencia codificante de la 287. El gen de la 287 que codifica para la proteína madura se amplificó usando los oligonucleótidos 287 LOrf4 For y Rev (incluyendo los sitios Nhel y XHol, respectivamente), digeridos con Nhel y XHol y ligados con el fragmento pETOrf4 purificado.

Ejemplo de Referencia 11 - proteínas no de fusión adicionales con/sin péptidos líder nativos

Un enfoque similar se adoptó para la expresión de la E. coli de proteínas adicionales de la WO99/24578, la WO99/36544 y la WO99/57280.

Las siguientes fueron expresadas sin una pareja de fusión: 008, 105, 117-1, 121-1, 122-1, 128-1, 148, 216, 243, 308, 593, 652, 726, 982, y Orf143-1. Se confirmó a la proteína 1171-a como expuesta a la superficie por FACS y dio altos títulos ELISA.

Las siguientes fueron expresadas con el péptido líder nativo pero sin una pareja de fusión: 111, 149, 206, 225-1, 235, 247-1, 274, 283, 286, 292, 401, 406, 502-1, 503, 519-1, 525-1, 552, 556, 557, 570, 576-1, 580, 583, 664, 759, 907, 913, 920-1, 926, 936-1, 953, 961, 983, 989, Orf4, Orf7-1, Orf9-1, Orf23, Orf25, Orf37, Orf38, Orf40, Orf40.1, Orf40.2, Orf72-1, Orf76-1, Orf85-2, Orf91, Orf97-1, Orf119, Orf143.1. A estas proteínas se les da el sufijo "L".

La proteína 760 etiquetada His fue expresada con y sin su péptido líder. La deleción del péptido señal aumentó enormemente los niveles de expresión. La proteína pudo ser purificada más fácilmente usando urea 2M para la solubilización.

La proteína 264 etiquetada His fue expresada bien usando su propio péptido señal, y la proteína 30kDa dió resultados Western blot positivos.

Todas las proteínas se expresaron con éxito.

Se confirmó la localización de las 593, 121-1, 128-1, 593, 726, y 982 en el citoplasma.

Se confirmó la localización de las 920-1L, 953L, ORF9-1L, ORF85-2L, ORF97-1L, 570L, 580L y 664L en el pleriplasma.

Se confirmó la localización de la ORF40L en la membrana exterior, y de la 008 y la 519-1L en la membrana interior. Se confirmo que las ORF25L, ORF4L, 406L, 576-1L estaban todas localizadas en la membrana.

Se descubrió que la 206 no es una lipoproteína.

La ORF25 y la ORF40 expresadas con sus péptidos líder nativos pero sin parejas de fusión, y la proteína 593 expresada sin su péptido líder nativo y sin una pareja de fusión, dieron lugar a buen suero anti-bactericida. Sorprendentemente, las formas de la ORF25 y la ORF40 expresadas sin parejas de fusión y usando sus propios péptidos líder (es decir "ORF25L" y "ORF40L") dieron mejores resultados en el ensayo bactericida que las proteínas de fusión.

Las proteínas 920L y 953L fueron sometidas a secuenciación N-terminal, dando HRVWVETAH and ATYKVDEYHANARFAF, respectivamente. Esta secuenciación confirma que los péptidos líder previstos fueron hendidos y, cuando se combinan con la localización periplásmica, se confirma que las proteínas están procesadas correctamente y localizadas por el E. coli cuando se expresan desde sus péptidos líder nativos.

La secuencia N-terminal de la proteína 519.1L localizada en la membrana interior fue MEFFIILLA, indicando que la secuencia líder no está hendida. Puede por lo tanto funcionar como una secuencia líder no hendida y un anclaje de la transmembrana de una manera similar a la del péptido líder de la PBP1 de la N. gonorrhoeae [Ropp y Nichola (1997) J. Bact. 179: 2783-2787.]. De hecho la región N-terminal muestra fuerte carácter hidrofóbico y se prevé por el programa Rmpred. ser una trasmembrana.

Ejemplo de Referencia 12- lipoproteínas

La incorporación de palmitato en las lipoproteínas recombinantes se demostró por el método de Kraft y otros [K. Bact. (1998) 180:3441-3447.]. Se cultivaron colonias únicas albergando el plásmido de interés durante la toda la noche a 37º C en 20 ml de LB/Amp (100 μg/ml) de cultivo líquido. El cultivo fue diluido a un OD550 de 0,1 en 5,0 ml de medio fresco medio LB/Amp que contenía 5 μC/ml [3H] palmitato (Amersham). Cuando el OD550 del cultivo llegó a 0,4-0,8 de lipoproteína recombinante fue inducido durante 1 hora con IPTG (concentración final 1,0 mM). Las bacterias fueron recolectadas por centrifugación en un centrífuga de sobremesa a 2700 g durante 15 minutos y lavadas dos veces con 1,0 ml de PBS frio. Las células fueron resuspendidas en 120 μl de 20mM de Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM de EDTA, 1,0% w/v de SDS y lisadas por ebullición durante 10 minutos. Después de la centrifugación a 13000 g durante 10 minutos el sobrenadante fue recogido y las proteínas precipitadas por la adición de 1,2 ml de acetona fría y dejadas durante 1 hora a -20º C. La proteína fue peletizada por centrifugación a 13000 g durante 10 minutos y resuspendida en 20-50 μl (calculado para estandarizar la carga con respecto a la O.D: final del cultivo) de 1,0% w/v de SDS, Una alícuota de de 15 μl se hirvió con 5 μl de un regulador de muestra SDS-PAGE y se analizó por SDS-PAGE. Tras la electroforesis los geles fueron fijados durante 1 hora en un 10% v/v de ácido acético y empapados durante 30 minutos en solución Amplify (Amersham). El gel fue secado al vacío bajo calor y expuesto a Hyperfilm (Kodak) durante toda la noche a -80º C.

La incorporación de la etiqueta [3H] palmitato, confirmando la lipidación se encontró para las siguientes proteínas: Orf4L, Orf25L, 287L, 287LOrf4, 406.L, 576L, 926L, 919L y 919LOrf4.

Ejemplo 13 - dominios en la 287

En base a la homología de diferentes regiones de la 287 con proteínas que pertenecen a diferentes clases funcionales, se dividió en tres "dominios", como se muestra en la Figura 5. El segundo dominio muestra homología con las proteasas de la IgA, y el tercer dominio muestra homología con las proteínas que enlazan con la transferrina.

Cada uno de los tres "dominios" muestra un grado diferente de conservación de secuencia entre las cepas de la N. meningitidis - el dominio C es un 98% idéntico, el dominio A es un 83% idéntico, mientras que el dominio B es sólo un 71% idéntico. Observar que la proteína 287 en la cepa MD 58 es 61 aminoácidos más larga que la de la cepa 2996. Un alineamiento de las dos secuencias se muestra en la Figura 7, y alineamientos para varias cepas se divulgan en la WO00/66741 (ver Figuras 5 y 6 en la misma).

Los tres dominios fueron expresado individualmente como proteínas etiquetadas His C-terminales. Esto se hizo para las cepas MC58 y 2996, usando los siguientes construcots:

287a-MC58 (aa 1-202), 287b-MC58 (aa 203-288), 287c-MC58 (aa 311-488).

287a-2996 (aa 1-139), 287b-2996 (aa 140-225), 287c-2996 (aa 250-427).

Para hacer estos constructos, la secuencia del codón de terminación se omitió en la secuencia del cebador final 3'. Los cebadores 5' incluían el sitio de restricción Nhel, y los cebadores 3' incluían un Xhhol como una cola, para dirigir la clonación de cada fragmento amplificado en el vector de expresión pET21b+ usando sitios de restricción NdeI-XhoI, NheI-XhoI or NdeI-HindIII.

Los seis constructos podrían ser expresados, pero el 287b-MC8 requería desnaturalización y replegado para la solubilización.

La deleción del dominio A se describe más abajo ("�4 287-His").

Los datos inmunológicos (ensayo bactericida del suero) fueron obtenidos también usando los varios dominios de la cepa 2996, contra las cepas MenB homólogas y heterólogas, así como MenA (cepa F6214) y MenC cepa BZ133):

2996

BZ232 MC58 NGH38 394/98 MenA MenC

287-His

32000 16 4096 4096 512 8000 16000

287(B)-His

256 - - - - 16 -

287(C)-His

256 - 32 512 32 2048 >2048

287(B-C)-His

64000 128 4096 64000 1024 64000 32000

Usando los dominios de la cepa MC58, se obtuvieron los siguientes resultados:

MC58

2996 BZ232 NGH38 394/98 MenA MenC

287-His

4096 32000 16 4096 512 8000 16000

287(B)-His

128 128 - - - - 128

287(C)-His -

16 - 1024 - 512 -

287(B-C)-His

16000 64000 128 64000 512 64000 >8000

Ejemplo 14 - deleciones en la 287

Además de expresar dominios individuales, la 287 también fue expresada (como una proteína etiquetada His C-terminal) haciendo deleciones progresivas dentro del primer dominio. Estos

Cuatro mutantes de deleción de la proteína 287 de la cepa 2996 fueron usados (Figura 6):

1) "287-His", que consiste de aminoácidos los 18-427 (es decir péptido líder eliminado);

2) "�1 287-His", que consiste de los aminoácidos 26-427;

3) "�2 287-His", que consiste de los aminoácidos 70-421;

4) "�3 287-His", que consiste de los aminoácidos 107-427; y

5) "�4 287-His", que consiste de los aminoácidos 140-427 (=287-bc).

La proteína "� 4" también se hizo para la cepa MC58 (" �4 287MC58-His"; aa 203-488).

Los constructos se hicieron de la misma manera que los 287a/b/c, como se ha descrito anteriormente.

Los seis constructos pudieron ser expresados y la proteína pudo ser purificada. La expresión de la 287-His fue, sin embargo, bastante pobre.

La expresión fue también alta cuando se omitieron las etiquetas His C-terminales.

Los datos inmunológicos (ensayo bactericida del suero) se obtuvieron también usando los mutantes de deleción, contra las cepas homóloga (2996) y MenB heteróloga, así como las MenA (cepa F6124) y MenC (cepa BZ133):

2996

BZ232 MC58 MGH38 394/98 MenA MenC

287-his

32000 16 4096 4096 512 8000 16000

L1 287-His

16000 128 4096 4096 1024 8000 16000

L2 287-His

16000 128 4096 >2048 512 16000 >8000

L3 287-His

16000 128 4096 >2048 512 16000 >8000

L4 287-His

64000 128 4096 64000 1024 64000 32000

Se vio la misma alta actividad para la deleción �4 usando la secuencia de la cepa MC58.

Además de mostrar características de expresión superiores, por lo tanto, los mutantes son inmunológicamente equivalentes o superiores.

Ejemplo 15 - deleciones de poli-glicina

El constructo " 1 287-His" del ejemplo anterior difiere del 287-His y del "287sin etiquetar" sólo por una deleción N-terminal corta (GGGGGGS). Usando un vector de expresión que reemplaza la serina eliminada con un codón presente en el sitio de clonación Nhe, sin embargo, esto equivale a una deleción sólo de la (Gly)6. Por lo tanto la deleción de esta secuencia (Gly)6 ha mostrado tener un efecto dramático en la expresión de proteínas.

La proteína que carece de los aminoácidos N-terminales hasta GGGGGG se llama " G287". En la cepa MC58, su secuencia (péptido líder subrayado) es:

Las �G287, con o sin etiqueta His ("�G287-His" y "�G287K", respectivamente), se expresan a muy buenos niveles en comparación con la "287-His" o la "287sin etiquetar".

En base a los datos de variabilidad de los genes, se expresaron variantes de la �G287-His en la E. coli de un número de cepas MenB, en concreto de las cepas 2996, MC58, 1000 y BZ232. Los resultados también fueron buenos.

Se formuló la hipótesis de que la deleción de la poli-Gly podría ser una estrategia general para mejorar la expresión. Se identificaron por lo tanto otras lipoproteínas MenB que contienen motivos (Gly)n similares (cerca del término N, corriente abajo de una cisteína), concretamente la Tbp2 (NMB0460), la 741 (NMB 1870) y la 983 (NMB 1969):

Los genes Tbp2 y 741 eran de la cepa MC58; los genes 983 y 287 eran de la cepa 2996. Estos fueron clonados en el vector pET y expresados en E. coli sin la secuencia que codifica para sus péptidos líder o como "formas �G", ambos fusionados a una etiqueta His C-terminal. En cada caso, se vio el mismo efecto - la expresión fue buena en los clones que llevaban la deleción del tramo de poli-glicina, y pobre o ausente si las glicinas estaban presentes en las proteínas expresadas:

ORF Express. Purificación Actividad Bact.

287-His(2996) +/- + + ’287sin etiquetar’ (2996) +/- nd nd LG287-His(2996) + + + LG287K(2996) + + + LG287-His(MC58) + + + LG287-His(1000) + + + LG287-His(BZ232) + + +

Tbp2-His(MC58) +/-nd nd LGTbp2-His(MC58) + +

741-His(MC58) +/- nd nd LG741-His(MC58) + +

983-His (2996) LG983-His (2996) + +

El SDS-PAGE de las proteínas se muestra en la Figura 13.

IG287 e híbridos

Las proteínas �G287 fueron hechas y purificadas para las cepas MC58, 1000 y BZ232. Cada una de estas dio títulos ELISA altos y también títulos bactericidas del suero de >8192. LA �G287K, expresada de la pET-24b, dio excelentes títulos en ELISA y el ensayo bactericida del suero. La �G287-ORF46.1K también puede ser expresada en la pET-24b.

La �G287 fue también fusionada directamente dentro del marco corriente arriba de las 919, 953, 961 (secuencias mostradas a continuación) y la ORF46.1:

ELISA

Bactericida

LG287-953-His

3834 65536

LG287-961-His

108627 65536

La eficacia bactericida (cepa homóloga) de los anticuerpos producidos contra las proteína híbridas se comparó con los anticuerpos producidos contra mezclas simples de los antígenos de los componentes (usando 287-GST) par ala 919 y la ORF46.1:

Mezcla con 287

Híbrida con LG287

919

32000 128000

ORF46.1

128 16000

Se obtuvieron también los datos para la actividad bactericida contra las cepas MenB heterólogas y contra los serotipos A y C:

919

ORF46.1

Cepa

Mezcla Híbrida Mezcla Híbrida

NGH38

1024 32000 - 16384

MC58

512 8192 - 512

BZ232

512 512 - -

MenA (F6124)

512 32000 - 8192

MenC (C11)

>2048 >2048 - -

MenC (BZ133

>4096 64000 - 8192

Las proteínas híbridas con �G287 y el término N son por lo tanto inmunológicamente superiores a las mezclas simples, con la �G287-ORF46.1 siendo particularmente efectiva, incluso contra cepas heterólogas. La �G287-ORF46.1K puede ser expresada en el pTE-24b.

Las mismas proteínas híbridas se hicieron usando la cepa Nueva Zelanda 394/98 en lugar de la 2996:

IG983 e híbridos

Los títulos bactericidas generados en respuesta a la �G983 (fusión His) fueron medidos contra varias cepas, incluyendo la cepa homóloga 2996:

2996

NGH38 BZ133

LG983

512 128 128

La �G983 fue también expresada como un híbrido, con la ORF46.1, la 741, la 961 o la 961c en su término

C:

IG741 e híbridos

Los títulos bactericidas generados en respuesta a la �G741 (fusión His) fueron medidos contra varias cepas incluyendo la cepa homóloga 2996:

2996

MC58 NGH38 F6124 BZ133

LG741

512 131072 >2048 16384 >2048

Como se puede ver, el título anti-bactericida inducido por la �G741 es particularmente alto contra la cepa heteróloga MC58.

La �G741 fue también fusionada directamente dentro del marco corriente arriba de las proteínas 961, 961c, 983 y OR46.1:

Ejemplo 16 - fusiones C-terminales ("híbridos") con 287/1G287

De acuerdo con la invención, los híbridos de dos proteínas A & B pueden ser o NH2-A-B-COOH o NH2-B-A-COOH. El efecto de esta diferencia se investigó usando la proteína 287 o C-terminal (en forma "287-His") o Nterminal (en forma �G287 - secuencias mostradas anteriormente) a 919, 953 y ORF46.1. Se uso un panel de cepas, incluyendo la cepa homóloga 2996. Se usó FCA como adyuvante:

287 & 919

287 & 953 287 & ORF46.1

Cepa

LG287-919 919-287 LG287-953 953-287 LG287-46.1 46.1-287

2996

128000 16000 65536 8192 16384 8192

BZ232

256 128 128 <4 <4 <4

1000

2048 <4 <4 <4 <4 <4

MC58

8192 1024 16384 1024 512 128

NGH38

32000 2048 >2048 4096 16384 4096

394/98

4096 32 256 128 128 16

MenA (F6124)

32000 2048 >2048 32 8192 1024

MenC (BZ133)

64000 >8192 >8192 <16 8192 2048

Se ven generalmente mejores títulos bactericidas con la 287 en el término N (en la forma �G).

Cuando se fusiona con la proteína 961 [NH2-�G28/7-961-COOH - secuencia mostrada anteriormente], la proteína resultante es insoluble y debe ser desnaturalizada y renaturalizada para la purificación. Después de la renaturalización, se descubrió que alrededor del 50% de la proteína premanecia insoluble. Se compararon las proteínas solubles e insolubles, y se obtuvieron títulos bactericidas mucho mejores con la proteína soluble (FCA como adyuvante).

2996

BZ232 MC58 NGH38 F6124 BZ133

Soluble

65536 128 4096 >2048 >2048 4096

Insoluble

8192 <4 <4 16 n.d. n.d.

Los títulos con la forma insoluble fueron, sin embargo, mejorados usando adyuvante de alumbre en su

lugar:

Insoluble

32768 128 4096 >2048 >2048 2048

Ejemplo 17 -fusiones N-terminales ("híbridos") con la 287

La expresión de la proteína 287 como de longitud completa con una etiqueta His C-terminal, o sin su péptido líder pero con una etiqueta His C-terminal, da niveles de expresión relativamente bajos. La mejor expresión se consigue usando una fusión GTS N-terminal.

Como una alternativa a usar el GST como una pareja de fusión N-terminal, la 287 fue colocada en el término C de la proteína 919 ("919-287"), de la proteína 953 ("953-287), y de las proteínas ORG46.1 ("ORF46.1287"). En ambos casos, los péptidos líder fueron eliminados, y los híbridos fueron fusiones dentro del marco directas.

Para generar el híbrido 953-287, los péptidos líder de las dos proteínas fueron omitidos diseñando le cebador directo corriente abajo desde el líder de cada secuencia; la secuencia del codón de terminación fue omitida en el cebador inverso de la953 pero incluido en el cebador inverso de la 287. Para el gen 953 , los cebadores 5' y 3' usados para la amplificación incluyeron un sitio de restricción Ndel y uno BamHL respectivamente, mientras que para la amplificación del gen 287 los cebadores 5' y 3' incluyeron un sitio de restricción BamHL y uno Xhol respectivamente. De esta manera se pudo conseguir una clonación direccional secuencial de los deos genes en el pET21 b+, usando Ndel-BamHl (para clonar el primer gen) y posteriormente BamHl-Xhol (para clonar el segundo gen).

El híbrido 919-287 fue obtenido clonando la secuencia que codifica para la parte madura de la 287 en el sitio Xhol en el final 3' del clon 919-His en el pET21b+. Los cebadores usados para la amplificación del gen 287 fueron diseñados para introducir un sitio de restricción Sall en el final 5' y un sitio Xhol en el 3' - del fragmento PCR. Como los finales cohesivos producidos por los enzimas de restricción Sall y Xhol son compatible, el producto del PCR de la 287 digerido con Sall-Xhol pudo ser insertado en el clon p-ET21b-919 hendido con Xhol.

El híbrido ORF46.1-287 fue obtenido de manera similar.

La eficacia bactericida (cepa homóloga) de los anticuerpos producidos contra las proteínas híbridas se comparo con los anticuerpos producidos contra las mezclas simples de los antígenos de los componentes:

Mezcla con 287

Híbrido con 287

919

32000 16000

953

8192 8192

ORF46.1

128 8192

Se obtuvieron también los datos para la actividad bactericida contra las cepas MenB heterólogas y contra los serotipos A y C para la 919-287 y la 953-287:

919

953 ORF46.1

Cepa

Mezcla Híbrido Mezcla Híbrido Mezcla Híbrido

MC58

512 1024 512 1024 - 1024

NGH38

1024 2048 2048 4096 - 4096

BZ232

512 128 1024 16 - -

MenA (F6124)

512 2048 2048 32 - 1024

MenC (C11)

>2048 n.d. >2048 n.d. - n.d.

MenC (BZ133)

>4096 >8192 >4096 <16 - 2048

Se construyeron también los híbridos de la ORF46.1 y la 919, Se consiguieron mejores resultados (título cuatro veces más alto) con la 919 en el término N.

Se probaron también los híbridos 919-519His, ORF97-225His y 225ORF97His. Estos dieron títulos ELISA y respuestas de anticuerpo antibactericidas moderadas.

Ejemplo de Referencia 18 -el péptido líder de la ORF4

Como se ah mostrado anteriormente, el péptido líder de la ORF4 puede ser fusionado con la secuencia madura de otras proteína (por ejemplo proteínas 287 y 919). Es capaz de lipidación directa en la E. coli.

Ejemplo de Referencia 19 dominios en la 564

La proteína "564" es muy grande (2073aa), y es difícil de clonar y expresar en su forma completa. Para facilitar la expresión, la proteína ha sido dividida en cuatro dominios, como se muestra en la Figura 8 (de acuerdo con la secuencia de la MC58):

Dominio

A B C D

Aminoácidos

79-360 361-731 732-2044 2045-2073

Estos dominios muestran las siguientes homologías:

• El dominio A muestra homología con otras toxinas bacterianas:

b|AAG03431.1|AE004443_9 probable hemaglutinina [Pseudomonas aeruginosa] (38%) gb|AAC31981.1|(139897) HecA [Pectobacterium chrysanthemi] (45%) emb|CAA36409.1|(X52156) hemaglutinina filamentosa [Bordetella pertussis] (31%)

gb|AAC79757.1|(AF057695) proteína sobrenadante grande1 [Haemophilus ducreyi] (26%)

gb|AAA25657.1|(M30186) HpmA precursor [Proteus mirabilis] (29%)

•

El dominio B no muestra homología, y su especificidad con la 564.

•

El dominio C muestra homología con:

gb|AAF84995.1|AE004032 proteína secretada como HA [Xylella fastidiosa] (33%) gb|AAG05850.1|AE004673 proteína hipotética [Pseudomonas aeruginosa] (27%) gb|AAF68414.1AF237928 FHA putativo [Pasteurella multocisida] (23%) gb|AAC79757.1| (AF057695) proteína sobrenadante grande1 [Haemophilus ducreyi] (23%) piriS21010 FHA B precursor [Bordetella pertussis] (20%)

•

El dominio D muestra homología con otras toxinas bacterianas:

gb|AAFB4995.1|AE004032_14 proteína secretada como HA [Xylella fastidiosa] (29%)

Usando la secuencia de la cepa MC58, se obtuvo una buena expresión intracelular de la 564ab en la forma proteínas de fusiones GST (sin purificación) y etiquetada his; esta pareja dominante fue también expresada como una lipoproteína, que mostró expresión moderada en la membrana exterior/fracción sobrenadante.

EL dominio b mostró expresión intracelular moderada cuando se expreso como un producto etiquetado his (sin purificación), y buena expresión como una fusión GST

El dominio c mostró buena expresión intracelular como una fusión GST, pero era insoluble. El domino d mostro expresión intracelular moderada como un producto etiquetado his (sin purificación). La pareja del dominio de la proteína cd mostro expresión intracelular moderada (sin purificación) como una fusión GST.

Se observaron buenos títulos del ensayo bactericida usando el dominio c y la pareja bc.

Ejemplo de Referencia 20 - el péptido líder de la 919

El péptido líder 20mer de la 919 s epalntea en el ejemplo 1 anterior:

MKKYLFRAAL YGIAAAILAA

Como se muestra en el ejemplo 1, la deleción de este líder mejora la expresión heteróloga, como lo hace la sustitución con el péptido líder de la ORF4. La influencia del líder de la 919 en la expresión se investigó fusionando la secuencia codificante para el gen indicador PhpC de la Morganella morganll [Thaller y otros (1994) Microbiology

140: 1341-1350]. El constructo fue clonado en el plásmido pET21-b entre los sitios Ndel y Xhol (Figura 9):

El nivel de expresión del PhoC de este plásmido es >200 veces más bajo que el encontrado en el mismo constructo pero que contiene el péptido señal PhoC nativo. Se obtuvo el mismo resultado incluso después de la sustitución del promotor T7 con el promotor Plac de la E. coli. Esto significa que la influencia de la secuencia líder de la 919 en la expresión no depende del promotor usado.

Para investigar si los resultados observados se debieron a alguna peculiaridad de la secuencia del nucleótido del péptido señal de la 919 (formación de estructura secundaria, sensibilidad a RNAasas, etc.) o a la inestabilidad de la proteína inducida por la presencia de este péptido señal, se generaron un número de mutantes. El enfoque usado fue una sustitución de nucleótidos de la secuencia del péptido señal de la 919 clonando conectores sintéticos que contenían codones degenerados. De esta manera, los mutantes fueron obtenidos con sustituciones de nucleótidos y/o aminoácidos.

Se usaron dos conectores diferentes, diseñados para producir mutaciones en dos regiones diferentes de la secuencia del péptido señal de la 919, en las primeras 19 parejas de base (L1) y entre las bases 20-36 (S1).

Se da a continuación el alineamiento de algunos de los mutantes obtenidos.

Como se muestra en los alineamientos de secuencias, la mayoría de los mutantes analizados contienen deleciones dentro del marco que fueron producidas inesperadamente por las células huésped.

La selección de los mutantes se realizó transformando las células BL21 (DE3) de la E. coli con ADN preparado de una mezcla de los clones mutados L1 y S1. Los transformantes individuales fueron cribados para alta actividad PhoC golpeándolos en placas LB que contenían 100 μg/ml de ampicilina, 50 ug/ml de verde de metilo, 1 mg/ml de PDP (difosfato de fenolftaleína). En este medio las células productoras de PhoC se volvieron verdes (Figura 10).

Se llevó a cabo un análisis cuantitativo del PhoC producido por estos mutantes en medio líquido usando PNPP como un sustrato para la actividad edl PhoC. Las actividades específicas medidas en los extractos celulares y los sobrenadantes de los mutantes cultivados en el medio líquido durante 0, 30, 90, 180 minutos fueron:

EXTRACTOS CELULARES

SOBRENADANTES

0

30 90 180

control

0,00 1,11 102,12 206,46 5,11 27,75 156,51 72,15 156,51 194,25 0,00 1,11 111,00 111,00 4,77 94,35 111,00 33,30 83,25 180,93 0,00 3,33 149,85 94,35 4,00 82,14 72,15 21,09 55,50 149,85 0,00 4,44 172,05 83,25 3,11 36,63 28,86 14,43 26,64 142,08

9phoC

9S1e

9L1a

9L1d

9L1f

9S1b

9S1c

9S1i

phoCwt

0

30 90 180

control

0,00 0,33 0,11 4,88 0,11 0,11 1,44 0,44 0,22 34,41 0,00 0,00 0,22 5,99 0,11 0,22 1,44 0,78 0,44 43,29 0,00 0,00 0,44 5,99 0,11 0,11 1,44 0,56 0,22 87,69 0,00 0,00 0,89 7,22 0,11 0,11 1,67 0,67 0,78 177,60

9phoC

9S1e

9L1a

9L1d

9L1f

9S1b

9S1c

9S1i

phoCwt

Algunos de los mutantes producen altas cantidades de PhoC y en particular, el mutante 9L1a puede secretar PhoC en el medio de cultivo. Esto es digno de mencionar ya que la secuencia del péptido señal de este mutante sólo es de 9 aminoácidos de larga. Este es el péptido señal más corto descrito hasta la fecha:

Ejemplo de Referencia 21 - deleciones C-terminales de proteínas relacionadas con el Maf

Las proteínas relacionadas con el MafB incluyen la 730, la ORF46 y la ORF29. La proteína 730 de la MC58 tiene la siguiente secuencia:

El péptido líder está subrayado.

La 730 muestra características similares a la ORF46 (ver ejemplo 8 anterior)

-

como para la Orf46, la conservación de la secuencia 730 entre la Menb, MenA y el gonococo es alta (>80%) sólo para la parte N-terminal. El término C, de la ~340, es altanamente divergente.

-

se prevé que la estructura secundaria contenga un segmento hidrofóbico que abarca la región central de la molécula (aa. 227-247).

-

la expresión del gen de longitud completa en la E. coli da rendimientos muy bajos de proteína. La expresión de constructos etiquetados o sin etiquetar donde la secuencia del péptido señal se ha omitido tiene un efecto tóxico en las células huésped. En otras palabras, la presencia de la proteína madura de longitud completa en el citoplasma es altamente tóxica para la célula huésped mientras que su translocación al periplasma (mediada por el péptido señal) no tiene efectos detectables en la viabilidad celular. Esta "toxicidad intracelular" de la 730 es particularmente alta ya que los clones para la expresión para la 730 sin líder sólo se puede obtener a muy baja frecuencia usando un antecedente genético recA (cepas de E. coli: HB101 para clonación: HMS 174(DE3) para la expresión).

Para superar esta toxicidad, se usó un enfoque similar para la 730 al descrito en el ejemplo 8 par ala ORF46. Se obtuvieron cuatro formas truncadas C-terminales, cada una de las cuales está bien expresada. Todas fueron obtenidas de expresión intracelular de la 730 sin líder etiquetada His.

La Forma A consiste de la región hidrofílica N-terminal de la proteína madura (aa. 28-226). Esta fue purificada como un producto etiquetado His soluble, teniendo un MW más alto del esperado.

La Forma B se extiende hasta el final de la región cosnervada entre los serogrupos (aa. 28-340). Esta fue purificada como un producto etiquetado His insoluble.

Las formas truncadas C-terminales denominadas C1 y C2 se obtuvieron después de cribar los clones que expresaban altos niveles de clones 730-His en la cepa HMS174(DE3). Brevemente, el plásmido pET21b que contenía la secuencia etiquetada His que codifica para la proteína 730 madura de longitud completa se usó para transformar la cepa recA HMS174(DE3). Los transformantes fueron obtenidos a baja frecuencia que mostró dos fenotipos: colonias grandes y colonias muy pequeñas. Se analizaron varias colonias grandes y pequeñas para la expresión del clon 730-His. Sólo las células de colonias grandes sobre-expresaron una proteína reconocida por los anticuerpos anti-730A. Sin embargo la proteína sobre-expresada en diferentes clones mostro diferencias en masa molecular. La secuenciación de dos de los clones reveló que en ambos casos la integración de una secuencia de E. coli IS había tenido lugar dentro de la secuencia que codifica para la región C terminal de la 730. Los dos eventos de integración han producido la fusión dentro del marco con 1 codón adicional en el caso de la C1, y 12 codones adicionales en el caso de la C2 (Figura 11). Las formas "mutantes" resultantes de la 730 tienen las siguientes secuencias:

El aminoácido adicional producido por la inserción está subrayado.

Los aminoácidos adicionales producidos por la inserción están subrayados.

En conclusión, la expresión intracelular de la forma 730-C1 da un nivel muy alto de proteína y no tiene efecto tóxico en las células huésped, mientras que la presencia del término C nativo es tóxica. Estos datos sugieren que la "toxicidad intracelular" de la 730 está asociada con los aminoácidos 65 C-terminales de la proteína.

Se ha realizado el truncamiento equivalente de la ORF29 a los primeros aminoácidos 231 ó 368, usando la expresión con o sin el péptido líder (aminoácidos 1-26; la deleción da expresión citoplásmica) y con o sin etiqueta His.

Ejemplo de Referencia 22 -dominios en la 961

Como se ha descrito en el ejemplo 9 anterior, la fusión GST de 961 se expresó óptimamente en E. coli. Para mejorar la expresión, la proteína se dividió en dominios. (Figura 12).

Los dominios de 961 se diseñaron sobre la base de YadA (una adhesina producida por Yersinia que se había demostrado que es una adhesina localizada sobre la superficie bacteriana que forma oligómeros que generan proyección de la superficie [Hoiczyk y otros (2000). EMBO J. 19:5989-99]) y son: péptido líder, dominio de cabecera, región de la bobina enrollada (tronco) y dominio de anclaje de membrana.

Estos dominios se expresaron con o sin péptido líder y opcionalmente se fusionaron a His-tag C-terminal o GST N-terminal. Los clones de E. coli que expresaban diferentes dominios de 961 se analizaron por SDS-PAGE y transferencia western para la producción y localización de la proteína expresada, desde cultivo durante la noche (o/n) o después de 3 horas de inducción con IPTG. Los resultados fueron:

Lisado Total (Western Blot)

Periplasma (Western Blot) Sobrenadante (Western Blot) OMV SDS-PAGE

961 (o/n) 961 (IPTG)

-+/ -- --

961-L (o/n) 961-L (IPTG)

+ + -- -- + +

961 c-L (o/n) 961c-L (IPTG)

-+ -+ -+

961L1-L (o/n) 961L1-L (IPTG)

-+ -- -- +

Los resultados revelan que, en E. coli:

•

961-L se expresa altamente y se localiza en la membrana exterior. Por análisis de transferencia western se han detectado dos bandas específicas: una a _45 kDa (el peso molecular previsto) y una a _180 kDa, lo que indica que 961- L puede formar oligómeros. Además, estos agregados se expresan más en el cultivo nocturno (sin inducción por IPTG). Se usaron preparaciones de OMV de este clon para inmunizar ratones y se obtuvo suero. Usando cultivo nocturno (predominantemente en forma oligómera), el suero era bactericida; el cultivo inducido por IPTG (predominantemente monómero) no era bactericida;

•

961� 1-L (con supresión parcial en la región de anclaje) se expresa altamente y se localiza en la membrana exterior, pero no forma oligómeros;

•

el 961c-L (sin la región de anclaje) es produce en forma soluble y se exporta al material sobrenadante.

Los títulos en ELISA y el ensayo bactericida en suero usando fusiones His fueron los siguientes:

ELISA

Bactericida

961a (aa 24-268)

24397 4096

961b (aa 269-405)

7763 64

961c-L

29770 8192

961c(2996)

30774 >65536

961c (MC58)

33437 16384

961d

26069 >65536

Se usaron clones de E. coli que expresan diferentes formas de 961 (961, 961-L, 961 _1L y 961c-L) para investigar si l961 es una adhesina (c.f. YadA). Se hizo un ensayo de adhesión usando (a) las células epiteliales humanas y (b) clones de E. coli después de cultivo nocturno o 3 horas de inducción por IPTG. 961-L crecido durante la noche (961� 1-L) y 961c-L (los clones que expresan proteína sobre la superficie) se adhieren a células epiteliales humanas.

También se usó 961c en proteínas híbridas (véase antes). Como 961 y sus variantes de dominio dirigen la expresión eficiente, son idealmente adecuadas como porción N-terminal de un proteína híbrida

Ejemplo de Referencia 23 - híbridos adicionales

Seguidamente se presentan otras proteínas híbridas de la invención (véase también la Figura 14). Éstas son ventajosas cuando se comparan con proteínas individuales

Se entenderá que la invención se ha descrito sólo a modo de ejemplo y que se pueden hacer modificaciones dentro del ámbito de la invención. Por ejemplo, se contempla el uso de proteínas de otras cepas [por ejemplo, véase el documento WO 00/66741 para las secuencias polimórficas para ORF4, ORF40, ORF46, 225, 235, 287, 519, 726, 919 y 953].

DETALLES EXPERIMENTALES

Purificación de la FPLCproteína

La tabla siguiente resume la purificación de la proteína FPLC que se usó:

Proteína

PI Columna Regulador pH Protocolo

121.1sin etiquetar

6.23 Mono Q Tris 8.0 A

128.1sin etiquetar

5.04 Mono Q Bis-Tris propano 6.5 A

406.1L

7.75 Mono Q Dietanolamina 9.0 B

576.1L

5.63 Mono Q Tris 7.5 B

593 sin etiquetar

8.79 Mono S Hepes 7.4 A

726 sin etiquetar

4.95 Hi-trap S Bis-Tris 6.0 A

919 sin etiquetar

10.5(-líder) Mono S Bicina 8.5 C

919Lorf4

10.4(-líder)) Mono S Tris 8.0 B

920L

6.92(-líder) Mono Q Dietanolamina 8.5 A

953L

7.56(-líder)) Mono S MES 6.6 D

982 sin etiquetar

4.73 Mono Q Bis-Tris propano 6.5 A

919-287

6.58 Hi-trap Q Tris 8.0 A

953-287

4.92 Mono Q Bis-Tris propano 6.2 A

Las soluciones de regulador incluían 20-120 mM de NaCl, 5,0 mg/ml de CHAPS y un 10% v/v de glicerol. El dializado fue centrifugado a 13000 g durante 20 minutos y aplicado a resina de intercambio de iones FPLC mono Q o mono S. El regulador y las resinas de intercambio de iones fueron elegidas de acuerdo al pl de la proteína de interés y las recomendaciones del manual de protocolos FPLC [Pharmacia: FPLC Ion Exchange and Chromatofocussing; Principles and Methods. Pharmacia Publication]. Las proteínas fueron eluidas usando un gradiente de NaCl escalonado. La purificación fue analizada por SDS-PAGE y l aconcentración de proteína determinada por el método Bradford.

La letra en la columna "protocolo" se refiere a lo siguiente:

FPLC-A: Los clones 121.1, 128.1, 593, 726, 982, la proteína periplásmica 920L y las proteínas híbridas 919287, 953-287 fueron purificados de la fracción soluble de la E. coli obtenida después de la disrupción de las células. Las colonias individuales que albergan el plásmido de interés fueron cultivadas toda la noche a 37º C en 20 ml de cultivo líquido LB/Amp (100 μg/ml). Las bacterias fueron diluidas a 1:30 en 1,0 L de medio fresco y cultivadas a o 30º C ó 37º C hasta que el OD550 alcanzó 0,6-08. La expresión de la proteína recombinante fue inducida con IPTG a una concentración final de 1,0 mM. Tras la incubación durante 3 horas, las bacterias fueron recolectadas por centrifugación a 8000 g durante 15 minutos a 4º C. Cuando fue necesario las células fueron almacenadas a -20º C. Todos los procedimientos posteriores fueron realizados en hielo o a 4º C. Para las proteínas citosólicas (121.1, 128.1, 593, 726 y 982) y la proteína periplásmica 920L, las bacterias fueron resuspendidas en 25 ml de PBS que contenía un inhibidor de proteasa completo (Boehringer-Mannheim). Las células fueron lisadas por sonicación usando el Branson Sonifier 450. Las células fragmentadas fueron centrifugadas a 8000 g durante 30 minutos para sedimentar las células no rotas y la inclusión de cuerpos en el sobrenadante tomado a un 35% v/v de saturación por la adición de 3,9 M de (NH4)2SO4. El precipitado fue sedimentado a 8000 g durante 30 minutos. El sobrenadante fue llevado a un 70% v/v de saturación por la adición de 3,9 M de (NH4)2SO4. y el precipitado colectado como anteriormente. Los pellets que contenían la proteína de interés fueron identificados por SDS-PAGE y dializados contra el regulador de intercambio de iones apropiado (ver a continuación) durante 6 horas o toda la noche. La fracción periplásmica de la E. coli que expresaba la 953L fue preparada de acuerdo al protocolo de Evans y otros [Infect. Immun. (1974), 10:1010-1017]. y dializado contra el regulador de intercambio de iones apropiado. El regulador y la resina de intercambio de iones fueron elegidas de acuerdo al pl de la proteína de interés y las recomendaciones del manual de protocolos FPLC (Pharmacia). Las soluciones reguladoras incluían 20 mM de NaCl, y un 10% (v/v) de glicerol. El dializado fue centrifugado a 13000 g durante 20 minutos y aplicado a resina de intercambio de iones FPLC mono Q o mono S. El regulador y la resina de intercambio de iones fueron elegidas de acuerdo al pl de la proteína de interés y las recomendaciones del manual de protocolos FPLC (Pharmacia). Las proteínas fueron eluidas de la resina de intercambio de iones usando gradientes de NaCL escalonados o continuos. La purificación fue analizada por SDS-PAGE y la concentración de proteína determinada por el método Bradford. La hendidura del péptido líder de las proteínas periplásmicas fue demostrada por la secuenciación del término NH2 (ver a continuación.

FPLC-B: Estas proteínas fueron purificadas de la fracción de la membrana de la E. coli. Las colonias individuales que albergan el plásmido de interés fueron cultivadas toda la noche a 37º C en 20 ml de cultivo líquido LB/Amp (100 μg/ml). Las bacterias fueron diluidas a 1:30 en 1,0 L de medio fresco. Los clones 460.1 L y 919LOrf4 fueron cultivados a 30º C y el Orf25L y el 576.1L a 37º C hasta que el OD550 alcanzó 0,6-08. En el caso del 919LOrf4, el cultivado a 30º C era esencial ya que la expresión de la proteína recombinante a 37º C resultó en la lisis de las células. La expresión de la proteína recombinante fue inducida con IPTG a una concentración final de 1.0 mM. Tras la incubación durante 3 horas, las bacterias fueron recolectadas por centrifugación a 8000 g durante 15 minutos a 4º C. Cuando fue necesario las células fueron almacenadas a 20º C. Todos los procedimientos posteriores fueron realizados en hielo o a 4º C. Las bacterias fueron resuspendidas en 25 ml de PBS que contenía un inhibidor de proteasa completo (Boehringer-Mannheim) y lisadas por choque osmótico con 2-3 pasos a través de una Prensa Francesa. Las células no rotas fueron retiradas por centrifugación a 5000 g durante 15 minutos y las membranas precipitadas por centrifugación a 100000 g (Beckam Ti50, 38000 rpm) durante 45 minutos. Se usó un homogeneizador Dounce para resuspender el pellet de la membrana en 7,5 ml de 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 1.0 M de NaCl y inhibidor de la proteasa completo. La suspensión fue mezclada durante 2-4 horas, centrifugada a 100000 g durante 45 minutos y el pellet resuspendido en 7,5 ml de 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 M de NaCL, 5,0 mg/ml de CHAPS, 10% (v/v) de glicerol e inhibidor de la proteasa completo. La solución fue mezclada durante toda la noche, centrifugada a 100000 g durante 45 minutos y el sobrenadante dializado durante 6 horas contra un regulador seleccionado apropiadamente. En el caso de la Orf25.L, se encontró que el pellet obtenido después de la extracción del CHAPS contenía la proteína recombinante. Esta fracción, sin purificación adicional, fue usada para inmunizar ratones.

FPLC-C: Idéntica a la FPLC-A, pero la purificación fue de una fracción soluble obtenida tras permeabilizar la

E. coli con polimixina B, en lugar de después de fragmentación celular.

FPLC-D: Una única colonia que abarcaba el plásmido de interés fue cultivada durante toda la noche a 37º C en 20 ml de cultivo líquido LB/Amp (100 μg/ml). Las bacterias fueron diluidas a 1:30 en 1,0 L de medio fresco y cultivadas a 30º C hasta que el OD550 alcanzó 0,6-08. La expresión de la proteína recombinante fue inducida con IPTG a una concentración final de 1,0 mM. Tras la incubación durante 3 horas, las bacterias fueron recolectadas por centrifugación a 8000 g durante 15 minutos a 4º C. Cuando fue necesario las células fueron almacenadas a -20º C. Todos los procedimientos posteriores fueron realizados en hielo o a 4º C. Las células fueron resuspendidas en 20 mM de Bicina (pH 8,5), 20 mM de NaCL, 10% (v/v) de glicerol, inhibidor de proteasa completo (Boehringer-Mannheim) y fragmentadas usando un sonificador Branson 450. El sonicado fue centrifugado a 8000 g durante 30 minutos para sedimentar las células no rotas y los cuerpos de inclusión. La proteína recombinante fue precipitada de la solución entre un 35% v/v y un 70% v/v de saturación por la adición de 3,9 M (NH4)2SO4. El precipitado fue sedimentado a 8000 g durante 30 minutos, resuspendido en 20 mM de Bicina (pH 8,5), 20 mM de NaCL, 10% (v/v) de glicerol y dializado contra su regulador durante 6 horas o toda la noche. El dializado fue centrifugado a 13000 g durante 20 minutos y aplicado a la resina de FPLC. La proteína fue eluida de la columna usando un gradiente de NaCl escalonado. La purificación fue analizada por SDS-PAGE y la concentración de proteína determinada por el método Bradford.

Estrategia de clonación y diseño de oligonucleótidos

Se amplificaron por PCR genes que codifican antígenos de interés diseñados sobre la base de la secuencia

genómica de B MC58 de N. meningitidis. Se usó siempre DNA genómico de la cepa 2996 como plantilla en

reacciones de PCR a no ser que se especifique lo contrario, y se clonaron los fragmentos amplificados en el vector

de expresión pET21b+ (Novagen) para expresar la proteína como producto C-terminal etiquetado His, o en pET24b+ (Novagen) para expresar la proteína en forma “no etiquetada” (por ejemplo, �G 287K). Cuando se expresó una proteína sin un partícipe de fusión y con su propio péptido líder (si estaba presente), se realizó la amplificación del marco de lectura abierta (codones ATG a STOP). 5 Cuando se expresó una proteína en forma “no etiquetada”, se omitió la secuencia líder diseñando el cebador de amplificación de extremo 5’ aguas abajo de la secuencia líder predicha.

La temperatura de fusión de los cebadores usados en la PCR dependía del número y el tipo de nucleótidos 10 de hibridación en el cebador global, y se determinó usando las fórmulas:

Tm1 = 4 (G + c) + 2 (A + T) excluida la cola

Tm2 = 64,9 + 0,41 (% de GC) - 600/N cebador entero 15

Las temperaturas de fusión de los oligonucleótidos seleccionados usualmente eran de 65-70ºC para los oligonucleótidos enteros y de 50-60ºC para la región de hibridación sola.

20 Los oligonucleótidos se sintetizaron usando un sintetizador Perkin Elmer 394 DNA/RNA eluyendo de las columnas en 2,0 ml de NH4OH y desprotegiendo por incubación durante 5 horas a 56º C. Los oligonucleótidos se precipitaron añadiendo acetato sódico 0,3 M de Na-Acetato y 2 volúmenes de etanol. Se centrifugaron las muestras y los pellets se volvieron a poner en suspensión en agua.

[TABLAS]

Las reacciones NB- AII PCR usan la cepa 2996 a no ser que se especifique lo contrario (por ejemplo, cepa MC58). En todas los constructos que empiezan con un ATG no seguido por un sitio individual NheI, el codón ATG es parte del sitio NdeI usado para clonar. Las construcciones hechas usando NheI como sitio de clonación en el terminal 5’ (por ejemplo, los que contienen 287 en el término N) tienen dos codones adicionales (GCT AGC) fusionados a la secuencia de codificación del antígeno.

Preparación de plantillas de DNA cromosomales

Las cepas de N. meningitidis 2996, MC58, 394.98, 1000 y BZ232 (y otras) se hicieron crecer a fase exponencial en 100 ml de medio GC, se cosecharon por centrifugación y se volvieron a poner en suspensión en 5 ml de regulador (20% p/v de sacarosa, Tris-HCl 50 mM, EDTA 50 mM, pH 8). Después de 10 minutos de incubación sobre hielo, las bacterias se lisaron añadiendo 10 ml de solución de lisis (NaCl 50 mM, 1% de Na-sacarosil, 50 !g/ml de proteinasa K) y la suspensión se incubó a 37ºC durante 2 horas. Se realizaron dos extracciones con fenol (equilibrado a pH 8) y una extracción con CHCl3/alcohol isoamílico, se precipitó DNA añadiendo acetato sódico 0,3 M y dos volúmenes de etanol y se recogió por centrifugación. El pellet es lavó una vez con etanol (70% v/v) y se redisolvió en 4,0 ml de regulador TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). La concentración de DNA se midió por lectura de OD 260.

Amplificación por PCR

El protocolo estándar de PCR fue el siguiente: se usaron como plantillas 200 ng de DNA genómico de cepas 2996, MC58, 1000 o BZ232, o 10 ng de preparación de DNA de plásmido de clones recombinantes en presencia de 40 !M de cada cebador de nucleótido, 400-800 !M de solución de dNTPs, regulador lx de PCR (que incluye MgCl2 1,5 mM), 2,5 unidades de Taq/polimerasa de DNA (usando Perkin-Elmer AmpliTaQ, plantilla larga Boehringer Mannheim ExpandMC).

Después de una incubación preliminar de 3 minutos de la totalidad de la mezcla a 95ºC, cada muestra experimentó una amplificación en dos etapas: los primeros 5 ciclos es realizaron usando la temperatura de hibridación que excluía la cola de la enzima de restricción del cebador (Tm1). A esto siguieron 5 ciclos de de acuerdo con la temperatura de hibridación calculada para oligonucleótidos de longitud entera (Tm2). Los tiempos de alargamiento, realizados a 68ºC o 72ºC, variaban de acuerdo con la longitud de Orf a amplificar. En el caso de Orf1, el tiempo de alargamiento, empezando desde 3 minutos, se aumentó en 15 segundos cada ciclo. Los ciclos se completaron con una etapa de extensión de 10 minutos a 72ºC.

El ADN amplificado se cargó directamente en gel de agarosa al 1%. El fragmento de DNA correspondiente a la banda de tamaño correcto se purificó desde gel usando el kit Qiagen Gel Extraction.

Digestión de fragmentos de PCR y de vectores de clonación

El ADN purificado correspondiente al fragmento ampliado se digirió con enzimas de restricción apropiadas en pET-21b, pET22b+ o pET-24b-. Los fragmentos digeridos se purificaron usando el kit de purificación QIAquick (siguiendo las instrucciones del fabricante) y se eluyó con H2O o Tris 10 mM, pH 8,5. Los vectores de plásmido se digirieron con las enzimas de restricción apropiadas, se cargaron en gel de agarosa al 1,0% y la banda correspondiente al vector digerido se purificó usando el kit Qiagen QIAquack Gel Extraction.

Clonación

Los fragmentos correspondientes a cada gen, previamente digeridos y purificados, se ligaron a pRT21b+, pET22b+ o pEt-24b+. Se usó una relación 3:1 de fragmento/vector con T4 DNA ligasa en el regulador de ligación suministrado por el fabricante.

Se transformó plásmido recombinante en DH5 o HB101 competente de E. coli incubando la solución de reacción de ligasa y bacterias durante 40 minutos sobre hielo, luego a 37ºC durante 3 minutos. Seguidamente se añadieron 800 !l de caldo LB y se incubó a 37ºC durante 20 minutos. Las células se centrifugaron a la velocidad máxima en una microcentrifugadora Eppendorf y se pusieron nuevamente en suspensión en aproximadamente 200 !l de material sobrenadante y se cultivaron sobre agar de ampicilina LB (100 mg/ml).

La exploración de clones recombinantes se realizó haciendo crecer al azar colonias seleccionadas durante la noche a 37ºC en 4,0 ml de caldo LB + 100 !g/ml de ampicilina. Se peletizaron las células y se extrajo el DNA de plásmido usando el kit Qiagen QIAprep Spin Miniprep siguiendo las instrucciones del fabricante. Se digirió aproximadamente 1 !g de cada minipreparado individual con las enzimas de restricción apropiadas y el digerido se cargó en gel de agarosa al 1-1,5% (dependiendo del tamaño esperado del inserto) paralelamente con el marcado del peso molecular (1 kb DNA Ladder, GIBCO). Se seleccionaron clones positivos sobre la base del tamaño del inserto.

Expresión

Después de clonar cada gen en el vector de expresión, se transformaron plásmidos recombinantes en cepas de E. coli adecuadas para expresión de la proteína recombinante. Para transformar BL21-DE3 de E. coli se usó 1 !l de cada construcción como se ha descrito antes. Se inocularon colonias recombinantes individuales en 2 ml de LB+Amp (100 !g/ml), se incubó a 37ºC durante la noche, luego se diluyó 1:30 en 20 ml de LB+Amp (100 !g/ml) en matraces de 100 ml para obtener un OD600 entre 0,1 y 0,2. Los matraces se incubaron a 30ºC o a 37ºC en un agitador giratorio de baño de agua hasta que IO600 indicó un crecimiento exponencial adecuado para inducir la expresión (0,4-0,8 OD). La expresión de proteína se indujo añadiendo IPTG 1,0 mM. Después de 3 horas de incubación a 30ºC o 37ºC, se midió OD600 y se examinó la expresión. Se centrífugo 1,0 ml de cada muestra en una microcentrifugadora, se volvió a poner en suspensión el pellet en PBS y se analizó por SDS-PAGE y tinción con azul Coomassie.

Clonación y expresión por Gateway

Las secuencias marcadas GATE se clonaron y expresaron usando la tecnología de clonación GATEWAY (GIBCOBRL). La clonación por recombinación (RC) está basada en reacciones de recombinación que median la integración y escisión de fago en y de, respectivamente, E. coli. La integración implica recombinación del sitio attP del DNA del fago dentro del sitio attB situado en el genoma bacteriano (reacción de BP) y genera un genoma de fago integrado flanqueado por los sitios attL y attR. La escisión recombina los sitios attL y attR (reacción LR). La reacción de integración requiere dos enzimas [la integrasa de proteína de fago (Int) y el factor de huésped de integración de proteína bacteriana (IHF)] (BP clonasa). La reacción de escisión requiere Int, IHF y una enzima de fago adicional, escisionasa (Xis) (RL clonasa). Al extremo 5’ de los cebadores usados en las reacciones PCR para amplificar ORFs de Neisseria se añadieron derivados artificiales del sitio de recombinación attB bacteriana de 25 bp, denominados B1 y B2. Los productos resultantes se clonaron por BP en el “vector dador” que contenía derivados complementarios del sitio de recombinación (P1 y P2) attP del fago usando BO clonasa. Los “clones de entrada” resultantes contenían ORFs flanqueadas por derivados del sitio attL (L1 y L2) y se subclonaron en los “vectores de destino” de expresión que contienen derivados de los sitios attR compatibles con attL.(R1 y R2) usando LR clonasa. Esto dio por resultado “clones de expresión” en los que las ORFs están flanqueadas por B1 y B2 y fusionadas en el marco a GST o etiquetas His N terminales.

La cepa de E. coli usada para expresión GATEWAY es BL21-SI. Las células de esta cepa se inducen para expresión de la T7 RNA polimerasa por crecimiento en un medio que contiene sal (NaCl 0,3M).

Nótese que este sistema da etiquetas His de término N.

Preparación de proteínas de membrana

Con el fin de obtener proteínas recombinantes expresadas con secuencias líder de localización de membrana, se aislaron fracciones compuestas principalmente por membrana interior, exterior o membrana completa. El procedimiento de preparación de fracciones de membrana, enriquecidas para proteínas recombinantes, se adaptó de Filip y otros (J. Bact. (1973) 115:717-722) y Davies y otros [J. Immunol. Meth. (1990) 143:215-225]. Se hicieron crecer colonias individuales que alojan el plásmido durante la noche a 37ºC en 20 ml de cultivo líquido de LB/Amp (100 !g/ml). Las bacterias se diluyeron 1:30 en 1,0 l de medio de cultivo recientemente preparado y se hicieron crecer a 30ºC o 37ºC hasta que OD550 alcanzó 0,6-0,8. La expresión de bacterias recombinantes se indujo con ITPG a una concentración final de 1,0 mM. Después de una incubación durante 3 horas, las bacterias se cosecharon por centrifugación a 8000 g durante 15 minutos a 4ºC y se volvieron a poner en suspensión en 20 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) e inhibidores de proteasa entera (Boehringer Mannheim). Todos los procedimientos posteriores se realizaron a 4ºC sobre hielo.

Las células se rompieron por sonicación usando un Branson Sonifier 450 y se centrifugaron a 5000 g durante 20 min para sedimentar células no rotas y cuerpos de inclusión. El material sobrenadante, que contenía membranas y residuos celulares, se centrífugo a 50000 g (Beckman Ti50, 29000 rpm) durante 75 min, se lavó con bis-tris-propano 20 mM (pH 6,5), NaCl 1,0 M, 10% de glicerol (v/v) y se sedimentó nuevamente a 50000 g durante 75 min. El pellet se volvió a poner en suspensión en Tris.-HCl 20 mM (pH 7,5), 2% (v/v) de Sarkosyl, inhibidor de proteasa completa (concentración final en EDTA 1,0 mM) y se incubó durante 20 minutos para disolver la membrana interior. Los residuos celulares se peletizaron por centrifugación a 5000 g durante 10 min y el material sobrenadante se centrífugo a 75000 g durante 75 min (Beckman Ti50, 33000 rpm). En el material sobrenadante se encontraron proteínas 008L y 519L, lo que sugirió la localización de la membrana interior. Para estas proteínas se usaron fracciones de membrana interior y de membrana total (lavadas como antes con NaCl) con el fin de inmunizar ratones. Se lavaron con Tris-HCl (pH 7,5) vesículas de membrana exterior obtenidas del pellet de 75000 g y se centrifugaron a 75000 g durante 75 minutos o durante la noche. El OMV se volvió a poner finalmente en suspensión en 500 !l de Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), 10% v/v de glicerol. Se localizaron Orf1L y Orf4L y se enriquecieron en la fracción de membrana exterior que se usó para inmunizar ratones. La concentración de proteína se estimó por la norma Bradford Assay (Bio-Rad), mientras que la concentración de proteína en la fracción de membrana interior se determinó con el ensayo DC de proteínas (Bio-Rad). Se ensayaron por SDS-PAGE varias fracciones del procedimiento de aislamiento.

Purificación de proteínas His-etiquetadas

Se clonaron varias formas de 287 de las cepas 2996 y MC58. Se construyeron con una fusión etiquetada His de término C y se incluyeron en una forma madura (aa 18-427), construcciones con supresiones ( 1, �2, �_3 y

�4) y clones compuestos por dominios B o C. Para cada clon purificado como una fusión His, se tomó una porción de una colonia individual y se hizo crecer durante la noche a 37ºC sobre placa de agar con LB/Amp (100 !g/ml). Se inoculó una colonia aislada de esta placa en 20 ml de medio líquido de LB/Amp (100 !g/ml) y se hizo crecer durante la noche a 37ºC. El cultivo nocturno se diluyó 1:30 en 1,0 l de medio líquido de LB/Amp (100 !g/ml) y se dejó que creciera a la temperatura óptima (30 o 37ºC) hasta que OD550 alcanzó el valor de 0,6-0,8. La expresión de proteína recombinante se indujo añadiendo IPTG (concentración final, 1,0 mM) y el cultivo se incubó durante 3 horas más. Las bacterias se cosecharon por centrifugación a 8000 g durante 15 min a 4ºC. El pellet bacteriano se volvió a poner en suspensión en 7,5 ml de (i) regulador A frío (NaCl 300 mM, regulador de fosfato 50 mM, imidazol 10 mM, pH 8,0) para proteínas solubles, o (ii) regulador B (Tris-HCl 10 mM, regulador de fosfato 100 mM, pH 8,8 y, opcionalmente, urea 8 M) para proteínas insolubles. Las proteínas purificadas en forma soluble incluían 287-His, �1, �2, �3 y �4287-His, �4287MC58-His, 287c-His y 287cMC58-His. La proteína 287bMC58-His era insoluble y se purificó como correspondía. Las células se rompieron por sonicación sobre hielo cuatro veces durante 30 s a 40 W usando un sonicador Branson 450 y se centrifugaron a 13000xg durante 30 min a 4ºC. Para las proteínas insolubles, los pellets se pusieron nuevamente en suspensión en 2,0 ml de regulador C (hidrocloruro de guanidina 6M, regulador de fosfato 100 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5) y se trataron con 10 pasadas de un homogeneizador de mano de mortero (Dounce). El homogeneizado se centrífugo a 13000 g durante 30 min y se retuvo el material sobrenadante. El material sobrenadante tanto de la preparación soluble como de la insoluble se mezcló con 150 !l de resina Ni2+ (equilibrada previamente con regulador A o regulador B, como procediera) y se incubó a temperatura ambiente con una agitación suave durante 30 min. La resina era Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia), preparada de acuerdo con el protocolo del fabricante. La preparación por lotes se centrífugo a 700 g durante 5 min a 4ºC y se desechó el material sobrenadante. La resina se lavó dos veces (a modo de lote) con 10 ml de regulador A o B durante 10 min, se puso en suspensión en 1,0 ml de regulador A o B y se cargó en una columna desechable. Se continuó lavando la resina con (i) regulador A a 4ºC o (ii) regulador B a temperatura ambiente hasta que OD280 de la corriente de paso alcanzó el valor de 0,02-0,01. La resina se lavó más con (i) regulador C frío (NaCl 300 mM, regulador de fosfato 50 mM, imidazol 20 mM, pH 8,0) o (ii) regulador D (tris-HCl 10 mM, regulador de fosfato 100 mM, pH 6,3 y, opcionalmente, urea 8M) hasta que el OD280 de la corriente de paso alcanzó el valor de 0,02-0,01. La proteína de fusión His se eluyó añadiendo 700 !l de (i) regulador de elusión A frío (NaCl 300 mM, regulador de fosfato 50 mM, imidazol 250 mM, pH 8,0) o (ii) regulador de elución B (Tris-HCl 10 mM, regulador de fosfato 100 mM, pH 4,5 y, opcionalmente, urea 8M) y se recogieron las fracciones hasta que OD260 indicó que se había obtenido la totalidad de proteína recombinante. Se analizaron por SDS-PAGE partes alícuotas de 20 !l de cada fracción de elución. Las concentraciones de proteína se estimaron usando el ensayo Bradford.

Renaturalización de proteínas de fusión His desnaturalizadas

La desnaturalización era necesaria para solubilizar 287bMC8, por lo que se empleó una etapa de renaturalización antes de la inmunización. Se añadió glicerol a las fracciones desnaturalizadas obtenidas antes para obtener una concentración final de 10% v/v. Las proteínas se diluyeron a 200 !g/ml usando regulador de diálisis I (glicerol al 10% v/v, arginina 0,5M, regulador de fosfato 50 mM, glutationa reducida 5,0 mM. glutationa oxidada 0,5 mM, urea 2,0 mM, pH 8,8) y se dializó contra el mismo regulador durante 12-14 horas a 4ºC. Se dializó además con regulador II (glicerol al 10% v/v, arginina 0,5 mM, regulador de fosfato 50 mM, glutationa reducida 5,0 mM, glutationa oxidada 0,5 mM, pH 8,8) durante 12-14 horas a 4ºC. La concentración de proteína se estimó usando la fórmula:

Proteína (mg/ml) = (1,55 x OD280) - (0,76 x OD260)

Análisis de la secuencia de aminoácidos

El análisis automatizado de secuencias del término NH2 de proteínas se realizó con un secuenciador Beckman (LF 3000) equipado con analizador en linea de feniltioindantoin-aminoácidos (sistema Gold) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Inmunización

Se inmunizaron ratones Balb/C con antígenos los días 0, 21 y 35 y se analizaron los sueros el día 49.

Análisis ELISA de sueros

Las cepas acapsuladas MenB M7 y las capsuladas se cultivaron sobre placas de agar de chocolate y se incubaron durante la noche a 37ºC con 5% de CO2. Se recogieron de las placas de agar colonias de bacterias usando un trapo de dracón estéril y se inocularon en caldo Mueller-Hinton (Difco) que contenía 0,25% de glucosa. El crecimiento de bacterias se controló cada 30 minutos siguiendo el valor de OD620. Se dejó que crecieran las bacterias hasta que OD alcanzó el valor de 0,4-0,5. Se centrífugo el cultivo a 4000 rpm durante 10 minutos. Se desechó el material sobrenadante y las bacterias se lavaron dos veces con PBS, se pusieron en suspensión en PBS que contenía 0,025% de formaldehído y se incubó durante 1 hora a 37ºC y luego durante la noche a 4ºC con agitación. Se añadieron 100 !l de células de bacterias a cada pocillo de una placa Greiner de 96 pocillos y se incubó a 4ºC durante la noche. Luego se lavaron los pocillos tres veces con regulador de lavado de PBS (Tween-20 al 0,1% en PBS). A cada pocillo se añadieron 200 !l de regulador de saturación (polivinilpirrolidona 10 al 2,7% en agua) y las placas se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Los pocillos se lavaron luego tres veces con regulador de PBT. A cada pocillo se añadieron 200 200 !l de suero de dilución (regulador de dilución: 1% de BSA, 0,1% de Tween-20, 0,1% de NaN3 en PBS) y las placas se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con PBT).Se añadieron a cada pocillo 100 !l de suero antirratón (Dako) de ratón HRP-conjugado diluido 1:2000 en regulador de dilución y las placas se incubaron durante 90 minutos a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con regulador de PBT. Se añadieron a cada pocillo 100 !l de regulador de sustrato para HPR (25 ml de regulador de citrato pH 5, 10 mg de O-fenildiamina y 10 !l de H2O2) y las placas se dejaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadieron 100 !l de H2SO4 al 12% a cada pocillo y se siguió OD400. Los títulos de ELISA se calcularon arbitrariamente como la dilución de suero que daba un valor de OD490 de 0,4 por encima de sueros preinmunes. Se consideró que ELISA era positivo cuando la dilución del suero con un OD490 de 0,4 era mayor que 1:400.

Análisis de sueros - Ensayo de unión de bacterias FACS-Scan

La cepa acapsulada MenB M7 se cultivó sobre placas de agar con chocolate y se incubó durante la noche a 37º C con 5% de CO2. De las placas de agar se recogieron colonias de bacterias usando un trapo estéril de dracon y se inocularon en 4 tubos que contenían 8 ml cada una de caldo Mueller-Hinton (Difco) que contenía 0,25% de glucosa. El crecimiento de bacterias se controló cada 30 minutos siguiendo OD620. Se dejó que las bacterias crecieran hasta que OD alcanzó el valor de 0,35-0,5. El cultivo se centrifugó a 4000 rpm durante 10 min. Se desechó el material sobrenadante y el pellet se puso en suspensión en regulador de bloqueo (1% de BSA en PBS, 0,4% de NaN3) y se centrífugo a 4000 rpm durante 5 minutos. Se volvió a poner en suspensión las células en regulador de bloqueo para alcanzar un valor de OD620 de 0,05. Se añadieron 100 !l de células de bacterias a cada pocillo de una placa Costar de 96 pocillos. A cada pocillo se añadieron 100 !l de suero diluido (1:100, 1:200, 1:400) (en tapón de bloqueo) y las placas se incubaron a 4ºC durante 2 horas. Se centrifugaron las células durante 5 minutos a 4000 rpm, se aspiró el material sobrenadante y las células se lavaron añadiendo 200 !l/pocillo de regulador de bloqueo en cada pocillo. Se añadieron a cada pocillo de antirratón de cabra conjugado F(ab)2 a R-ficoeritrina, diluido 1:100 y las placas se incubaron durante 1 hora a 4ºC. Las células se sedimentaron por centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos y se lavaron añadiendo 200 !l/pocillo de regulador de bloqueo. Se aspiró el material sobrenadante y las células se pusieron nuevamente en suspensión en 200 !l/pocillo de PBS, 0,25% de formaldehído. Se pasaron las muestras a tubos para FACscan y se hicieron las lecturas. Los parámetros experimentales para FACScan (potencia del láser 15 mW) fueron: FL2 conect.; umbral de FSC-H: 92; voltaje de FSC PMT: E 01; SSC PMT: 474; aumentos del amp. 6:1; FL-2-PMT: 586; valores de compensación: 0.

Análisis de sueros - ensayo bactericida

Se hizo crecer durante la noche a 37ºC, la cepa 2996 de N. meningitidis sobre placas de agar con chocolate (a partir de un acopio congelado) con 5% de CO2. Se recogieron colonias y se usaron para inocular 7 ml de caldo Mueller-Hinton que contenía 0,25% de glucosa para alcanzar un OD620 de 0,05-0,08. El cultivo se incubó durante aproximadamente 1,5 horas a 37ºC con sacudidas hasta que OD620 alcanzó el valor de 0,23-0,24. Las bacterias se diluyeron en regulador de fosfato 50 mM, pH 7,2, que contenía MgCl2 10 mM, CaCl2 10 mM y 0,5% (p/v) de BSA (regulador de ensayo) a una dilución de trabajo de 105 CFU/ml. El volumen total de la mezcla de reacción final era de 50 !l con 25 !l de suero de ensayo con dilución serial de dos veces, 12,5 !l bacteriana a la dilución de trabajo, 12,5 !l de complemento de conejo joven (concentración final 25%). Los controles incluían bacterias incubadas con suero complementario, sueros inmunes incubados con bacterias y con complemento inactivados por calentamiento a 55ºC durante 30 minutos. Inmediatamente después de añadir el complemento de conejo joven, se cultivaron 10 !l de los controles sobre placas de agar Mueller-Hinton usando el procedimiento de inclinación (tiempo 0). Las placas de agar de 96 pocillos se incubaron durante 1 hora a 37ºC con rotación. Se cultivaron 7 !l de cada muestra sobre placas de agar Mueller-Hinton como manchas, mientras que se cultivaron 10 !l de los controles sobre placas de agar Mueller-usando el procedimiento de inclinación (tiempo 1. Las placas de agar se incubaron a 37ºC durante 18 horas y se contaron las colonias correspondientes al tiempo 0 y el tiempo 1.

Análisis de sueros - western blots

Proteínas purificadas (500 ng/hilera), vesículas de membrana exterior (5 !g) y extractos de células totales (25 !g) derivados de la cepa 2996 de MenB se cargaron en gel de SDS al 12%-poliacrilamida y se pasaron a una membrana de nitrocelulosa. La transferencia se hizo durante 2 horas a 150 mA y 4ºC usando regulador de transferencia (0,3% de Tris base, 1,44% de glicina, 20% (v/v) de metanol. La membrana se saturó por incubación nocturna a 4ºC en regulador de saturación (10% de leche desnatada, 0,1% de Triton X100 en PBS). La membrana se lavó dos veces con regulador de lavado (3% de leche desnatada, 0,1% de TritónX100 en PBS) y se incubó durante 2 horas a 37ºC con suero de ratón diluido 1:200 en regulador de lavado. La membrana se lavó dos veces y se incubó durante 90 minutos con una dilución 1:2000 de Ig antirratón marcada con peroxidasa de rábano amargo. La membrana se lavó dos veces con 0,1% de Triton X100 en PBS y se reveló con el kit Opti-4CN Substrate (Bio-Rad). La reacción se paró añadiendo agua.

Los OMVs se prepararon como sigue: Se hizo crecer durante la noche la cepa 2996 de N. meningitidis a 37ºC con 5% de CO2 sobre placas 5 GC, se cosechó con un bucle y se volvió a poner en suspensión en 10 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 5,2, EDTA 2 mM. La inactivación por calor se realizó a 56ºC durante 45 min y las bacterias se rompieron por sonicación durante 5 min sobre hielo (50% de ciclo debido, 50% de producción, sonificador Branson con micropunta de 3 mm). Las células no rotas se eliminaron por centrifugación a 5000 g durante 10 min, se recuperó la parte sobrenadante que contenía la fracción de envoltura de la célula entera y se centrífugo más durante la noche a 50000 g a la temperatura de 4ºC. El pellet que contenía las membranas se volvió a poner en suspensión en 2% de sarkosyl, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos para solubilizar las membranas interiores. La suspensión se centrífugo a 10000 para eliminar agregados, se centrífugo luego el material sobrenadante a 50000 g durante 3 horas. El pellet, que contenía las membranas externas, se lavó en PBS y se volvió a poner en suspensión en el mismo regulador. La concentración de proteína se midió por el ensayo de proteínas D.C. Bio-Rad (procedimiento de Lowry modificado) usando BSA como patrón.

Se prepararon como sigue extractos de células completas: se hizo crecer durante la noche la cepa 2996 de

N. meningitidis sobre una placa GC, se cosechó con un bucle y se volvió a poner en suspensión en 1 ml de Tris-HCl 20 mM. La inactivación por calor se realizó a 56ºC durante 30 minutos.

Estudios de dominios de 961

Preparación de fracciones celulares. Se prepararon lisado total, periplasma, material sobrenadante y OMV de clones de E. coli que expresan diferentes dominios de 961 usando bacterias de cultivos nocturnos o después de tres horas de inducción con IPTG. En resumen, el periplasma se obtuvo poniendo en suspensión bacterias en sacarosa al 25% y Tris 50 mM (pH 8) con 100 !g/ml de poliximina. Después de 1 hora a temperatura ambiente, se centrifugaron las bacterias a 13000 rpm durante 15 min y se recogió el material sobrenadante. El material sobrenadante del cultivo se filtró con 0,2 !m y se precipitó con TCA al 50% en baño de hielo durante 2 horas. Después de centrifugación (30 min a 13000 rpm), el pellet se enjuagó dos veces con etanol al 70% y se volvió a poner en suspensión en PBS. La preparación de OMV se realizó como se ha descrito previamente. Cada fracción celular se analizó por SDS-PAGE o transferencia western usando el antisuero policlonal generado contra GST-961.

Ensayo de adhesión. Se mantuvieron células epiteliales Chang (derivadas de Wong-Kibourne, clon 1-5c-4, de conjuntiva humana) en DMEM (Gibco) suplementado con 10% de FCS inactivado por calor, L-glutamina 15 mM y antibióticos.

Para el ensayo de adherencia, se enjuagaron con PBS cultivos sub-confluentes de células epiteliales Chang y se trataron con tripsina-EDTA (Gibco) para liberarlas del soporte de plástico. Las células se pusieron luego en suspensión en PBS a 5 x 105 células/ml.

Se peletizaron bacterias procedentes de cultivos nocturnos o después de inducidas por IPTG y se lavaron dos veces con PBS por centrifugación a 13000 durante 5 minutos. Se incubaron aproximadamente (2-3) x108 (cfu) con 0,5 mg/ml de FITC (Sigma) en 1 ml de regulador que contenía NaHCO3 50 mM y NaCl 100 mM, pH 8, durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Bacterias marcadas por IFTC se lavaron 3 veces y se pusieron en suspensión en PBS a (1-5) x109/ml. Se incubaron 200 !l de esta suspensión ((2-3)x108) con 200 !l (1x105) células epiteliales durante 30 minutos a 37ºC. Las células se centrifugaron luego a 2000 rpm durante 5 minutos para eliminar bacterias no adherentes, se pusieron en suspensión en 200 !l de PBS, se pasaron a tubos de FACScan y se hicieron las lecturas.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para la expresión heteróloga de una proteína inmunogénica que comprende a) al menos 90 aminoácidos consecutivos de la secuencia

   b) una secuencia de longitud completa con al menos un 70% de identidad con la secuencia

   y en donde el péptido líder de la proteína está eliminado.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende una secuencia de longitud completa con al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia enumerada en la reivindicación 1 a).

3. 3.

   El método de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende una secuencia de longitud completa con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia enumerada en la reivindicación 1 a).

4. 4.

   El método de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende una secuencia de longitud completa con al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia enumerada en la reivindicación 1 a).

5. 5.

   El método de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende una secuencia de longitud completa con al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia enumerada en la reivindicación 1 a).

6. 6.

   El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde no se usa pareja de fusión.

7. 7.

   El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la mencionada proteína está expresada en la E. coli.

8. 8.

   EL método de la reivindicación 1 en donde la proteína consiste de la secuencia

9. 9.

   Una proteína inmunogénica que consiste de la secuencia