ES2759484T3 - Meningococo que sobreexpresa NadA y/o NHBA y vesículas de la membrana externa derivadas del mismo - Google Patents

Abstract

Un meningococo que expresa NadA y opcionalmente NHBA, en el que el meningococo es isogénico con una cepa parental, excepto por una modificación genética que hace que el meningococo exprese más NadA y opcionalmente más NHBA que la cepa parental, en el que el meningococo no expresa NadR y en el que la bacteria no expresa un MltA activo.

Description

DESCRIPCIÓN

Meningococo que sobreexpresa NadA y/o NHBA y vesículas de la membrana externa derivadas del mismo

Campo técnico

La presente invención está en el campo de las vacunas meningocócicas basadas en vesículas de membrana.

Técnica antecedente

Actualmente se están investigando varias vacunas contra el serogrupo B de Neisseria meningitidis ("MenB"). Algunos de estos se basan en vesículas de membrana externa (VME), tal como el producto Novartis MENZB™, el producto del Finlay Institute VA-MENGOC-BC™ y el producto MENBVa C ™ del Instituto Noruego de Salud Pública. La referencia 1 desvela la construcción de vesículas a partir de cepas modificadas para expresar seis subtipos diferentes de PorA. Las referencias 2-4 informan sobre estudios preclínicos de una vacuna de VME en la que la fHbp (también conocida como GN1870) se sobreexpresa (y esta sobreexpresión se puede combinar con la eliminación de LpxL1 [5]). La referencia 6 informó recientemente de un estudio clínico de cinco formulaciones de una vacuna de v Me en la que PorA y FrpB están eliminados y Hsf y TbpA se sobreexpresan. La referencia 7 informa de una vacuna de vesículas de membrana externa nativa preparada a partir de bacterias que tienen los genes synX, LpxLI e IgtA inactivados. El documento WO2006/046143 (Referencia 31) describe una bacteria que tiene una mutación inactiva de su gen mltA e informa que la inactivación del homólogo meningocócico mltA proporciona bacterias que liberan espontáneamente vesículas que son ricas en proteínas inmunogénicas de la membrana externa y que pueden provocar respuestas de anticuerpos de protección cruzada con títulos bactericidas más altos que las VME preparadas mediante procesos de producción normales.

Es un objeto de la invención proporcionar VME meningocócicas adicionales y mejoradas, y también proporcionar meningococos adicionales y mejorados para su uso en la producción de vacunas.

Divulgación de la invención

Un primer aspecto de la invención proporciona un meningococo que expresa NadA y opcionalmente NHBA, en el que el meningococo es isogénico con una cepa parental, excepto por una modificación genética que hace que el meningococo exprese más NadA y opcionalmente más NHBA que la cepa parental, en el que el meningococo no expresa NadR y en el que la bacteria no expresa un MltA activo.

Un segundo aspecto de la invención proporciona un procedimiento para preparar una cepa meningocócica adecuada para la preparación de VME, que comprende las etapas de (i) elegir una cepa de partida que exprese NadA y opcionalmente NHBA; y (ii) modificar la cepa de partida para aumentar la cantidad de NadA y opcionalmente NHBA que expresa, en el que el meningococo no expresa NadR y no expresa un MltA activo.

Un tercer aspecto de la invención proporciona vesículas de membrana externa meningocócicas preparadas a partir del meningococo del primer aspecto de la invención o preparadas por el procedimiento del segundo aspecto de la invención.

Un cuarto aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica inmunogénica que comprende vesículas de acuerdo con el tercer aspecto de la invención.

Sobreexpresión

La invención proporciona vesículas de membrana externa meningocócica en las que ciertos antígenos se sobreexpresan. Al menos NadA se sobreexpresa, y NHBA opcionalmente también se sobreexpresa.

Tal como se analiza más adelante, estas vesículas se obtienen de bacterias que sobreexpresan los antígenos relevantes. La bacteria ya puede expresar el o los antígenos, pero incluye una modificación genética que, en comparación con una bacteria sin esa modificación, aumenta la expresión del antígeno. Esta modificación generalmente se introducirá utilizando técnicas recombinantes, tales como mutagénesis dirigida al sitio o recombinación homóloga dirigida, de modo que las vesículas de la invención se obtienen generalmente de bacterias recombinantes. Típicamente, una bacteria incluirá (i) un gen bajo el control de un promotor con el que no se encuentra en la naturaleza y/o (ii) una inactivación de un gen que se encuentra en la bacteria en la naturaleza.

Como resultado de la sobreexpresión, las vesículas de la membrana externa preparadas a partir del meningococo modificado contienen niveles más altos de los antígenos sobreexpresados. El aumento de la expresión en las VME es útil al menos del 10 %, medido en masa del antígeno relevante por unidad de masa de VME, y es más útil al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 75 %, 100 % o más.

Las modificaciones recombinantes adecuadas que pueden usarse para causar la sobreexpresión de un antígeno incluyen, pero sin limitación: (i) reemplazo del promotor; (ii) adición de genes; (iii) reemplazo de genes; o (iv) inactivación del represor.

En el reemplazo del promotor, El promotor que controla la expresión del gen del antígeno en una bacteria se reemplaza por un promotor que proporciona niveles más altos de expresión. Por ejemplo, el gen podría colocarse bajo el control de un promotor de un gen metabólico de mantenimiento. En otras realizaciones, el gen del antígeno se coloca bajo el control de un promotor constitutivo o inducible. De manera similar, el gen puede modificarse para garantizar que su expresión no esté sujeta a variación de fase. Los procedimientos para reducir o eliminar la variabilidad de fase de la expresión génica en meningococos se desvelan en la referencia 8. Estos procedimientos incluyen el reemplazo del promotor, o la eliminación o reemplazo de un motivo de ADN que es responsable de la variabilidad de fase de un gen.

Además de genes, una bacteria que ya expresa el antígeno recibe una segunda copia del gen relevante. Esta segunda copia puede integrarse en el cromosoma bacteriano o puede estar en un elemento episomal como un plásmido. La segunda copia puede tener un promotor más fuerte que la copia existente. El gen puede colocarse bajo el control de un promotor constitutivo o inducible. El efecto de la adición del gen es aumentar la cantidad de antígeno expresado. Cuando se usa un plásmido, idealmente es un plásmido con un alto número de copias, por ejemplo, por encima de 10, o incluso por encima de 100.

En el reemplazo de genes, se produce la adición del gen, pero se acompaña de la deleción de la copia existente del gen. Por ejemplo, este enfoque se utilizó en la referencia 4, en la que el gen fHbp cromosómico endógeno de una bacteria se delecionó y reemplazó por una copia codificada por un plásmido (véase también la referencia 9). La expresión de la copia de reemplazo es mayor que la de la copia anterior, lo que conduce a sobreexpresión.

En la inactivación del represor, se inactiva una proteína que reprime la expresión de un antígeno de interés. Por lo tanto, la represión no se produce y el antígeno de interés puede expresarse a un nivel superior.

Los promotores de genes sobreexpresados pueden incluir ventajosamente un CREN [10].

La cepa modificada que se sobreexpresa es isogénica con su cepa original, excepto por una modificación genética. Como resultado de la modificación, la expresión del antígeno de interés en la cepa modificada es mayor (en las mismas condiciones) que en la cepa original. Una modificación típica será colocar un gen bajo el control de un promotor con el que no se encuentra en la naturaleza y/o eliminar un gen que codifica un represor.

En realizaciones en las que se sobreexpresa NHBA, se pueden utilizar varios enfoques. Por conveniencia, puede usarse el enfoque ya informado en la referencia 11, es decir, la introducción de un gen NHBA bajo el control de un promotor inducible por IPTG. Mediante este enfoque, el nivel de expresión de NHBA puede ser proporcional a la concentración de IPTG añadida a un cultivo. El promotor puede incluir un CREN.

Para sobreexpresar NadA, el meningococo no expresa NadR. Un enfoque útil implica la eliminación del gen que codifica NadR (NMB1843), que es una proteína represora transcripcional [12] que regula por disminución o reprime el gen que codifica NadA en todas las cepas analizadas. La eliminación de NadR da como resultado una expresión constitutiva de alto nivel de NadA. Un enfoque alternativo para lograr la sobreexpresión de NadA es agregar 4-hidroxifenilacético al medio de cultivo. Un enfoque adicional es introducir un gen NadA bajo el control de un promotor inducible por IPTG.

En algunas realizaciones, una bacteria sobreexpresa tanto NHBA como NadA.

Además de sobreexpresar NadA, y opcionalmente NHBA, una bacteria puede sobreexpresar uno o más antígenos adicionales. Por ejemplo, una bacteria puede sobreexpresar uno o más de: (a) NhhA; (b) TbpA; (c) HmbR; (d) TbpB; (e) NspA; (f) Cu, Zn-superóxido dismutasa; (g) Omp85; (h) App; y/o (i) fHbp. La sobreexpresión de NhhA ya se informa en las referencias 6 y 13. La sobreexpresión de TbpA ya se informa en las referencias 6, 13 y 14. La sobreexpresión de HmbR ya se informa en la referencia 15. La sobreexpresión de TbpB ya se informa en la referencia 14. La sobreexpresión de NspA ya se informa en la referencia 16, en combinación con inactivación de porA y cps. La sobreexpresión de Cu, Zn-superóxido dismutasa ya se informa en la referencia 14. La sobreexpresión de fHbp ya se informa en las referencias 2-4 y 9, y por un enfoque diferente (que expresa un FNR mutante constitutivamente activo) en las referencias 17 y 18.

En algunas realizaciones, una bacteria sobreexpresa NHBA, NadA y fHbp. Estos tres antígenos son componentes de la "vacuna universal" desvelada en la referencia 19 o "4CMenB" [20,21]. En una realización, la expresión de NHBA está controlada por un fuerte promotor, NadR es inactivado y la cepa expresa un FNR mutante constitutivamente activo. En otra realización, la expresión de NHBA está controlada por un fuerte promotor, la expresión de fHbp está controlada por un promotor, y fuerte NadR es inactivado. La bacteria es una bacteria que no expresa un MltA activo (GNA33), de modo que libera espontáneamente vesículas que contienen NadA y opcionalmente NHBA y fHbp. En el mejor de los casos, la bacteria no expresa un LPS nativo, por ejemplo, tiene un mutante o inactivación de LpxL1.

Vesículas

Los aspectos segundo y tercero de la invención proporcionan vesículas de membrana externa meningocócica. Estas vesículas de membrana externa incluyen cualquier vesícula proteoliposómica obtenida por rotura o formación de ampollas de una membrana externa meningocócica para formar vesículas a partir de ella que retienen antígenos de la membrana externa. Así, el término incluye, por ejemplo, VME (a veces denominadas "ampollas"), microvesículas (MV [22]) y "VME nativos" ("VMEN" [23]).

Las VM y las NOVM son vesículas de membrana que se producen de forma natural y se forman de forma espontánea durante el crecimiento bacteriano y se liberan en medio de cultivo. Las VM pueden obtenerse cultivando Neisseria en medio de cultivo en caldo, separando células enteras de las VM más pequeñas en el medio de cultivo en caldo (por ejemplo, mediante filtración o mediante centrifugación a baja velocidad para sedimentar solo las células y no las vesículas más pequeñas), y recogiendo a continuación VM del medio agotado en células (por ejemplo, por filtración, por precipitación diferencial o agregación de VM, por centrifugación a alta velocidad para sedimentar las VM). Las cepas para su uso en la producción de VM pueden seleccionarse generalmente basándose en la cantidad de VM producidas en cultivo, por ejemplo, las ref. 24 y 25 describen Neisseria con alta producción de VM.

Las VME se preparan artificialmente a partir de bacterias y se pueden preparar usando tratamiento con detergente (por ejemplo, con desoxicolato) o por medios sin detergente (por ejemplo, véase la referencia 26). Las técnicas para formar v Me incluyen el tratamiento de bacterias con un detergente de sal de ácido biliar (por ejemplo, sales de ácido litocólico, ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursocólico, etc., con el desoxicolato de sodio [27 y 28] siendo preferido para tratar Neisseria) a un pH suficientemente alto para no precipitar el detergente [29]. Otras técnicas pueden realizarse sustancialmente en ausencia de detergente [26] usando técnicas tales como sonicación, homogeneización, microfluidización, cavitación, choque osmótico, trituración, prensa francesa, mezcla, etc. Los procedimientos que usan detergente sin o con bajo contenido pueden retener antígenos útiles, tales como NspA [26]. Por lo tanto, un procedimiento puede usar un tampón de extracción de VME con aproximadamente 0,5 % de desoxicolato o inferior, por ejemplo, aproximadamente 0,2 %, aproximadamente 0,1 %, <0,05 % o cero.

Un procedimiento útil para la preparación de VME se describe en la referencia 30 e implica la ultrafiltración en VME en bruto, en lugar de una centrifugación a alta velocidad. El procedimiento puede implicar una etapa de ultracentrifugación después de que tenga lugar la ultrafiltración.

Otro procedimiento útil para la producción de vesículas de membrana externa es inactivar el gen mltA en un meningococo, como se desvela en la referencia 31. Estas bacterias mutantes liberan espontáneamente vesículas en su medio de cultivo.

Cuando el lipooligosacárido (LOS) está presente en una vesícula, es posible tratar la vesícula para vincular sus componentes LOS y proteínas (conjugación "intravesicular" [43]).

Las vesículas pueden carecer de LOS por completo o pueden carecer de LOS hexa-acilados, por ejemplo, LOS en las vesículas puede tener un número reducido de cadenas de acilo secundarias por molécula de LOS [32]. Por ejemplo, las vesículas pueden provenir de una cepa que tiene una deleción o mutación lpxL1 que da como resultado la producción de un LOS penta-acilado [3,7]. Los LOS en una cepa pueden carecer de un epítopo de lacto-N-neotetraosa, por ejemplo, puede ser una cepa de inactivación de Ist y/o IgtB [6]. Los LOS pueden carecer de al menos un ácido graso primario unido a O de tipo salvaje [33]. LOS que tiene. El LOS puede no tener cadena a. El LOS puede comprender GlcNAc-Hep2fosfoetanolamina-KDO2-Lípido A [34].

Las vesículas pueden incluir uno, más de uno, o (preferentemente) cero serosubtipos de PorA. Se conoce la modificación del meningococo para proporcionar VME multi-PorA, por ejemplo, de las referencias 1 y 35. A la inversa, también se conoce la modificación para eliminar PorA, por ejemplo de la referencia 6.

Las vesículas pueden estar libres de uno de PorA y FrpB. Las vesículas preferidas están libres de PorA.

La invención puede usar con mezclas de vesículas de diferentes cepas. Por ejemplo, la referencia 36 desvela una vacuna que comprende composiciones de vesículas meningocócicas multivalentes, que comprenden una primera vesícula derivada de una cepa meningocócica con un serosubtipo prevalente en un país de uso y una segunda vesícula derivada de una cepa que no necesita prevenir un serosubtipo en un país de uso. La referencia 37 también desvela combinaciones útiles de diferentes vesículas. Una combinación de vesículas de cepas de cada uno de los inmunotipos L2 y L3 se puede usar en algunas realizaciones.

Bacterias

Como se ha mencionado anteriormente, las VME de la invención se preparan a partir de meningococos que sobreexpresan los antígenos relevantes debido a la modificación genética. La invención también proporciona estas bacterias. Las bacterias se pueden usar para preparar VME de la invención.

Además de las modificaciones genéticas que causan la sobreexpresión de los antígenos de interés, las bacterias no expresan un MltA activo. Además, la bacteria puede incluir una o más modificaciones adicionales. Por ejemplo, la bacteria puede tener una inactivación de uno o más de lpxL1, IgtB, porA, frpB, synX, IgtA y/o Ist.

La bacteria puede tener niveles bajos de endotoxina, logrado por la inactivación de enzimas involucradas en la biosíntesis de LPS [38,39].

La bacteria puede ser de cualquier serogrupo, por ejemplo A, B, C, W135, Y. Es preferentemente, el serogrupo B.

La bacteria puede ser de cualquier serotipo (por ejemplo, 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, etc.), cualquier serosubtipo y cualquier inmunotipo (por ejemplo, L1; L2; L3; L3,3,7; L10; etc.). Las vesículas pueden prepararse útilmente a partir de cepas que tengan uno de los siguientes subtipos: P1.2; P1.2,5; P1.4; P1.5; P1.5,2; p 1.5,c; P1.5c,10; P1.7,16; P1.7,16b; P1.7 h,4; P1.9; P1.15; P1.9,15; P1.12,13; P1.13; P1.14; P1.21,16; P1.22,14.

La bacteria puede ser de cualquier linaje adecuado, incluyendo los linajes hiperinvasivos e hipervirulentos, por ejemplo, cualquiera de los siguientes siete linajes hipervirulentos: subgrupo I; subgrupo III; subgrupo IV-1; complejo eT-5; complejo ET-37; grupo A4; linaje 3. Estos linajes se han definido mediante electroforesis de enzimas multilocus (MLEE), pero la tipificación de secuencia multilocus (MLST) también se ha utilizado para clasificar los meningococos [ref. 40], por ejemplo, el complejo ET-37 es el complejo ST-11 de MLST, el complejo ET-5 es ST-32 (ET-5), el linaje 3 es ST-41/44, etc.

La bacteria puede incluir una o más mutaciones de inactivación y/o hiperexpresión desveladas en las referencias 16 y 41-43. Los genes adecuados para la modificación incluyen: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, Pi1C, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA y/o TbpB [41]; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB,

LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, Pi1C, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, Pi1C, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB; y (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, Pi1C, PorB, SiaD, SynA, SynB y/o SynC.

Una bacteria puede tener uno o más, o todos, de las siguientes características: (i) LgtB y/o GalE regulados negativamente o inactivados para truncar el LOS meningocócico; (ii) TbpA regulado positivamente; (iii) NhhA regulado positivamente; (iv) Omp85 regulado positivamente; (v) LbpA regulado positivamente; (vi) NspA regulado positivamente; (vii) PorA inactivado; (viii) FrpB regulado negativamente o inactivado; (ix) Opa regulado negativamente o inactivado; (x) Opc regulado negativamente o inactivado; (xii) complejo del gen cps eliminado. Un LOS truncado puede ser uno que no incluya un epítopo de sialil-lacto-N-neotetraosa, por ejemplo, podría ser un LOS deficiente en galactosa. El LOS puede no tener cadena a.

Producción de cepas

La invención proporciona un procedimiento para preparar una cepa meningocócica adecuada para la preparación de VME, que comprende las etapas de (i) elegir una cepa de partida que exprese NadA y opcionalmente NHBA; y (ii) modificar la cepa de partida para aumentar la cantidad de NadA y opcionalmente NHBa que expresa, en el que el meningococo no expresa NadR y no expresa M1tA. La cantidad incrementada después de la modificación en la etapa (ii) es útil al menos 10 %, mayor que la primera cantidad, medido en masa del antígeno relevante por unidad de masa de bacteria y es más útil al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 75 %, 100 % o más.

Los procesos pueden ser seguidos por una etapa de (iii) cultivar las bacterias modificadas obtenidas en la etapa (ii) para proporcionar un cultivo bacteriano.

La cepa también se puede modificar para aumentar o disminuir la expresión de otros polipéptidos, como se describe en otra parte del presente documento, por ejemplo, para aumentar su expresión de fHbp, tal como mediante la introducción de un gen que codifica un f Nr mutante constitutivamente activo.

La invención también proporciona un procedimiento para preparar una vesícula meningocócica, que comprende una etapa de tratamiento de un cultivo bacteriano obtenido mediante un procedimiento de la invención (como se ha descrito anteriormente) de modo que su membrana externa forme vesículas. Esta etapa de tratamiento puede usar cualquiera de las técnicas tratadas anteriormente.

Las cepas iniciales útiles se encuentran en el serogrupo B del meningococo. Cuatro cepas meningocócicas iniciales útiles para preparar bacterias que sobreexpresan un antígeno de interés son MC58, NZ05/33, H44/76 y GB013. MC58 tiene el serosubtipo PorA 1.7,16; NZ05/33 tiene el serosubtipo 1.7-2,4; H44/76 tiene el serosubtipo 1.7,16; y GB013 tiene el serosubtipo 1.22,9.

Antígenos

NHBA (antígeno de unión a heparina de Neisseria)

NHBA [11] se incluyó en la secuencia del genoma publicada para la cepa MC58 del serogrupo B meningocócico [68] como gen NMB2132 (número de referencia de GenBank GI:7227388; SEQ ID NO: 9 en el presente documento). Desde entonces se han publicado secuencias de NHBA de muchas cepas. Por ejemplo, las formas alélicas de NHBA (denominadas proteína "287") se pueden ver en las figuras 5 y 15 de la referencia 44 y en el ejemplo 13 y la figura 21 de la referencia 45 (SEQ ID 3179 a 3184 en ellas). También se han notificado diversos fragmentos inmunógenos de NHBA.

Los antígenos de NHBA preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO:9; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO:9, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO:9.

Los antígenos de NHBA más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:9. Los antígenos NHBA ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos antimeningocócicos bactericidas después de la administración a un sujeto.

NadA (adhesina A de Neisseria)

El antígeno NadA se incluyó en la secuencia del genoma publicada para la cepa MC58 del serogrupo B meningocócico [68] como gen NMB1994 (número de referencia de GenBank GI:7227256; SEQ ID NO: 10 en el presente documento). Las secuencias de antígeno NadA de muchas cepas se han publicado desde entonces y la actividad de la proteína como una adhesina de Neisseria ha sido bien documentada. También se han notificado diversos fragmentos inmunógenos de NadA.

Los antígenos NadA preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO:10; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ iD NO:10, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO:10.

Los antígenos NadA más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:10. Los antígenos NadA ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos antimeningocócicos bactericidas después de la administración a un sujeto. SEQ ID NO: 6 es uno de tales fragmentos.

HmbR

La secuencia de HmbR de longitud completa se incluyó en la secuencia del genoma publicada para la cepa MC58 del serogrupo B meningocócico [68] como gen NMB1668 (SEQ ID NO:7 en el presente documento). La referencia 46 informa una secuencia de HmbR de una cepa diferente (SEQ ID NO:8 en el presente documento), y la referencia 15 informa una secuencia adicional (SEQ ID n O:19 en el presente documento). Las SEQ ID NO: 7 y 8 difieren en longitud en 1 aminoácido y tienen una identidad del 94,2 %. La SEQ ID NO: 19 es un aminoácido más corta que la SEQ ID NO:7 y tienen un 99 % de identidad (una inserción, siete diferencias) mediante CLUSTALW. La invención puede usar cualquiera de tales polipéptidos HmbR.

La invención puede usar un polipéptido que comprende una secuencia de HmbR de longitud completa, pero a menudo usará un polipéptido que comprende una secuencia de HmbR parcial. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una secuencia DE HmbR usada de acuerdo con la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un i% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:7, en la que el valor de i es 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 o más. En otras realizaciones, una secuencia DE HmbR usada de acuerdo con la invención puede comprender un fragmento de al menos j aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO:7, en la que el valor de j es 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más. En otras realizaciones, una secuencia DE HmbR usada de acuerdo con la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos (i) que tiene al menos i% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:7 Y/O (II) que comprende un fragmento de al menos j aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO:7.

Los fragmentos preferidos de j aminoácidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO:7. Dichos epítopos habitualmente comprenderán aminoácidos que están ubicados en la superficie de HmbR. Los epítopos útiles incluyen aquellos con aminoácidos implicados en la unión de HmbR a la hemoglobina, ya que los anticuerpos que se unen a estos epítopos pueden bloquear la capacidad de una bacteria para unirse a la hemoglobina del huésped. La topología de HmbR, y sus restos funcionales críticos, se investigaron en la referencia 47. Los fragmentos que retienen una secuencia transmembrana son útiles, porque se pueden mostrar en la superficie bacteriana, por ejemplo, en vesículas. Los ejemplos de fragmentos largos de HmbR corresponden a las SEQ ID NO: 21 y 22. Si se usa HmbR soluble, sin embargo, se pueden usar secuencias que omiten la secuencia transmembrana, pero típicamente reteniendo el o los epítopos de la porción extracelular.

Los antígenos HmbR más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:7. Los antígenos HmbR ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos antimeningocócicos bactericidas después de la administración a un sujeto.

fHbp (proteína de unión al factor H)

El antígeno fHbp se ha caracterizado con detalle. También se ha conocido como proteína "741" [SEQ ID 2535 y 2536 en la ref. 45], "NMB1870", "GNA1870" [refs. 48-50], "P2086", "LP2086" u "ORF2086" [51-53]. Es naturalmente una lipoproteína y se expresa en todos los serogrupos meningocócicos. La estructura del dominio inmunodominante C-terminal de fHbp ('fHbpC') se ha determinado mediante RMN [54]. Esta parte de la proteína forma un barril p de ocho cadenas, cuyas hebras están conectadas por bucles de longitudes variables. El barril está precedido por una hélice a corta y una cola flexible N-terminal.

El antígeno fHbp se divide en tres variantes distintas [55] y se ha encontrado que el suero producido contra una familia dada es bactericida dentro de la misma familia, pero no es activo contra las cepas que expresan una de las otras dos familias, es decir, existe una protección cruzada intravariante, pero sin protección cruzada entre familias. La invención puede usar una única variante de fHbp, pero será útil incluir un fHbp de dos o tres de las variantes. Por lo tanto, puede usar una combinación de dos o tres fHbps diferentes, seleccionados de: (a) una primera proteína, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un a% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:1; (b) una segunda proteína, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un % b de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en un fragmento de al menos y aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:2; y/o (c) una tercera proteína, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un c% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en un fragmento de al menos z aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:3.

El valor de a es al menos 85, por ejemplo 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 o más. El valor de b es al menos 85, por ejemplo 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 o más. El valor de c es al menos 85, por ejemplo 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 o más. Los valores de a, b y c no están intrínsecamente relacionados entre sí.

El valor de x es al menos 7, por ejemplo 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). El valor de y es al menos 7, por ejemplo 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). El valor de z es al menos 7, por ejemplo 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Los valores de x, y y z no están intrínsecamente relacionados entre sí.

Cuando la invención usa una sola variante de fHbp, una composición puede incluir un polipéptido que comprende (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un % de identidad de secuencia con la SEC ID NO:1 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:1; o (b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un % b de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en un fragmento de al menos y aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:2; o (c) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un c% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en un fragmento de al menos z aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:3.

Cuando la invención usa un fHbp de dos o tres de las variantes, una composición puede incluir una combinación de dos o tres fHbp diferentes seleccionados entre: (a) un primer polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un a% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:1; (b) un segundo polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un % b de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en un fragmento de al menos y aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:2; y/o (c) un tercer polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un c% de identidad de secuencia con la s Eq ID NO:3 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en un fragmento de al menos z aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:3. La primera, los polipéptidos segundo y tercero tienen diferentes secuencias de aminoácidos.

Cuando la invención usa un fHbp de dos de las variantes, una composición puede incluir ambas: (a) un primer polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un a% de identidad de secuencia con la Se Q ID NO:1 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:1; y (b) un segundo polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un b% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en un fragmento de al menos y aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:2. El primer y el segundo polipéptidos tienen diferentes secuencias de aminoácidos.

Cuando la invención usa un fHbp de dos de las variantes, una composición puede incluir ambas: (a) un primer polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un a% de identidad de secuencia con la Se Q ID NO:1 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:1; (b) un segundo polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un c% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en un fragmento de al menos z aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:3. El primer y el segundo polipéptidos tienen diferentes secuencias de aminoácidos.

Otra fHbp útil que puede usarse según la invención es una de las formas modificadas desveladas, por ejemplo, en la referencia 56, por ejemplo que comprende la SEQ ID NO:20 o 23. Estas formas modificadas pueden provocar respuestas de anticuerpos que son ampliamente bactericidas contra los meningococos.

Las proteínas fHbp en una VME generalmente estarán lipidadas, por ejemplo en una cisteína N-terminal. En otras realizaciones, no serán lipidados.

NspA (proteína A de superficie de Neisseria)

El antígeno NspA se incluyó en la secuencia del genoma publicada para la cepa MC58 del serogrupo B meningocócico [68] como gen NMB0663 (número de referencia de GenBank GI:7225888; SEQ ID NO: 11 en el presente documento). El antígeno se conocía anteriormente de las referencias 57 y 58. Las secuencias de antígeno NspA de muchas cepas se han publicado desde entonces. También se han notificado diversos fragmentos inmunógenos de NspA.

Los antígenos NspA preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO:11; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ iD NO:11, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO:11.

Los antígenos NspA más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:11. Los antígenos NspA ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos antimeningocócicos bactericidas después de la administración a un sujeto.

NhhA (homólogo hia de Neisseria)

El antígeno NhhA se incluyó en la secuencia del genoma publicada para la cepa MC58 del serogrupo B meningocócico [68] como gen NMB0992 (número de referencia de GenBank GI:7226232; SEQ ID NO: 12 en el presente documento). Las secuencias de antígeno NhhA de muchas cepas se han publicado desde, por ejemplo, las referencias 44 y 59, y se han notificado diversos fragmentos inmunógenos de NhhA. También se conoce como Hsf.

Los antígenos NhhA preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO:12; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ iD NO:12, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO:12.

Los antígenos NhhA más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:12. Los antígenos NhhA ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos antimeningocócicos bactericidas después de la administración a un sujeto.

App (proteína de adhesión y penetración)

El antígeno App se incluyó en la secuencia del genoma publicada para la cepa MC58 del serogrupo B meningocócico [68] como gen NMB1985 (número de referencia de GenBank GI:7227246; s Eq ID NO: 13 en el presente documento). Las secuencias de antígeno App de muchas cepas se han publicado desde entonces. También se conoce como "ORF1" y "Hap". También se han notificado diversos fragmentos inmunógenos de App.

Los antígenos App preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO:13; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ iD NO:13, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO:13.

Los antígenos App más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:13. Los antígenos App ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos antimeningocócicos bactericidas después de la administración a un sujeto.

Omp85 (proteína de membrana externa de 85 kDa)

El antígeno Omp85 se incluyó en la secuencia del genoma publicada para la cepa MC58 del serogrupo B meningocócico [68] como gen NMB0182 (número de referencia de GenBank GI:7225401; SEQ ID NO: 14 en el presente documento). Las secuencias de antígeno Omp85 de muchas cepas se han publicado desde entonces. Más información sobre Omp85 se puede encontrar en las referencias 60 y 61. También se han notificado diversos fragmentos inmunógenos de Omp85.

Los antígenos Omp85 preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO:14; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO:14, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO:14.

Los antígenos Omp85 más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:14. Los antígenos Omp85 ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos antimeningocócicos bactericidas después de la administración a un sujeto.

TbpA

El antígeno TbpA se incluyó en la secuencia del genoma publicada para la cepa MC58 del serogrupo B meningocócico [68] como gen NMB0461 (número de referencia de GenBank GI:7225687; s Eq ID NO: 23 en el presente documento). Las secuencias de TbpA de muchas cepas se han publicado desde entonces. También se han notificado diversos fragmentos inmunógenos de TbpA.

Los antígenos TbpA preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO:23; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ iD NO:23, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO:23.

Los antígenos TbpA más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:23. Los antígenos TbpA ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos antimeningocócicos bactericidas después de la administración a un sujeto.

TbpB

El antígeno TbpB se incluyó en la secuencia del genoma publicada para la cepa MC58 del serogrupo B meningocócico [68] como el gen NMB1398 (número de referencia de GenBank GI:7225686; SEQ ID NO: 24 en el presente documento). Las secuencias de TbpB de muchas cepas se han publicado desde entonces. También se han notificado diversos fragmentos inmunógenos de TbpB.

Los antígenos TbpB preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO:24; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ iD NO:24, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO:24.

Los antígenos TbpB más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:24. Los antígenos TbpB ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos antimeningocócicos bactericidas después de la administración a un sujeto.

Cu.Zn-superóxido dismutasa

El antígeno de la Cu, Zn-superóxido dismutasa se incluyó en la secuencia del genoma publicada para la cepa MC58 del serogrupo B meningocócico [68] como gen NMB1398 (número de referencia de GenBank GI:7226637; SEQ ID NO: 25 en el presente documento). Las secuencias de Cu, Zn-superóxido dismutasa de muchas cepas se han publicado desde entonces. También se han informado varios fragmentos inmunogénicos de Cu, Zn-superóxido dismutasa.

Los antígenos de Cu, Zn-superóxido dismutasa preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO:25; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO:25, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO:25.

Los antígenos Cu, Zn-superóxido dismutasa más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:25. Los antígenos de Cu, Zn-superóxido dismutasa ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos antimeningocócicos bactericidas después de la administración a un sujeto.

Composiciones farmacéuticas

Las vesículas de la invención son útiles como ingredientes activos en composiciones farmacéuticas inmunogénicas para la administración a un paciente. Estos incluirán típicamente un vehículo farmacéuticamente aceptable y una discusión exhaustiva de dichos vehículos está disponible en la referencia 62.

Los volúmenes de dosificación eficaces se pueden establecer de forma habitual, pero una dosis humana típica de la composición tiene un volumen de aproximadamente 0,5 ml, por ejemplo para inyección intramuscular. La vacuna basada en VEM RIVM se administró en un volumen de 0,5 ml [63] mediante inyección intramuscular en el muslo o el antebrazo. MeNZB™ se administra en una dosis de 0,5 ml mediante inyección intramuscular en la parte anterolateral del muslo o la región deltoides del brazo. Se pueden usar dosis similares para otras vías de administración, por ejemplo, una vacuna intranasal basada en VME para atomización puede tener un volumen de aproximadamente 100 |jl o aproximadamente 130 j l por pulverización, con cuatro pulverizaciones administradas para dar una dosis total de aproximadamente 0,5 ml.

El pH de una composición de la invención está usualmente entre 6 y 8, y más preferentemente entre 6,5 y 7,5 (por ejemplo, aproximadamente 7). El pH de la vacuna basada en VME de RIVM es 7,4 [64], y, para las composiciones, se prefiere un pH <7,5. La vacuna basada en VME de RIVM mantiene el pH mediante el uso de un tampón Tris/HCl 10 mM, y el pH estable en las composiciones de la invención puede mantenerse mediante el uso de un tampón, por ejemplo, un tampón Tris, un tampón citrato, tampón fosfato o un tampón histidina. De este modo, generalmente, las composiciones de la invención incluyen un tampón.

La composición puede ser estéril y/o apirógena. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los seres humanos.

Las composiciones de la invención para la administración a pacientes son inmunogénicas y, más preferentemente, son composiciones de vacuna. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser o bien profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero normalmente serán profilácticas. Las composiciones inmunogénicas usadas como vacuna comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno o antígenos, así como cualquier otro componente, según sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente eficaz", se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo del estado de salud y físico del individuo que se vaya a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica por parte del médico encargado del tratamiento y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad esté dentro de un intervalo relativamente amplio que pueda determinarse a través de pruebas habituales. El contenido de antígeno de las composiciones de la invención se expresará, generalmente, en términos de la cantidad de proteína por dosis. Una dosis de aproximadamente 0,9 mg de proteína por ml es típica para las vacunas intranasales basadas en VME.

Las composiciones de la invención pueden incluir un adyuvante inmunológico. Por consiguiente, por ejemplo, pueden incluir un adyuvante de sal de aluminio o una emulsión de aceite en agua (por ejemplo, una emulsión de escualeno en agua). Las sales de aluminio adecuadas incluyen hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), (por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de la referencia 65), o mezclas de los mismos. Las sales pueden asumir cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), prefiriéndose la adsorción de antígeno a la sal. La concentración de A1+++ en una composición para la administración a un paciente es, preferentemente, inferior a 5 mg/ml, por ejemplo, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Un intervalo preferente es entre 0,3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de 0,85 mg/dosis. Los adyuvantes de hidróxido de aluminio son particularmente adecuados para su uso con vacunas contra el meningococo.

Los meningococos afectan a varias zonas del cuerpo y, por tanto, las composiciones de la invención se pueden preparar en varias formas líquidas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones. La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo, en forma de un inhalador, usando un aerosol fino. La composición puede prepararse para administración nasal, administración auditiva u ocular, por ejemplo, como pulverizador o gotas. Son típicos los inyectables para administración intramuscular.

Las composiciones de la invención pueden incluir un antimicrobiano, particularmente cuando se envasa en formato de dosis múltiple. Los antimicrobianos, tal como el tiomersal y el 2-fenoxietanol, se encuentran habitualmente en las vacunas, pero se prefiere usar un conservante sin mercurio o ningún conservante.

Las composiciones de la invención pueden comprender detergente, por ejemplo, un Tween (polisorbato), tal como Tween 80. Los detergentes generalmente están presentes en niveles bajos, por ejemplo, <0,01 %.

Las composiciones de la invención pueden incluir detergente residual (por ejemplo, desoxicolato) de la preparación de VME. La cantidad de detergente residual es, preferentemente, inferior a 0,4 |jg (más preferentemente inferior a 0,2 |jg) por cada jg de proteína MenB.

Si una composición de la invención incluye LOS, la cantidad de LOS es, preferentemente, inferior a 0,12 jg (más preferentemente inferior a 0,05 jg ) por cada jg de proteína.

Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro sódico) para dar tonicidad. Una concentración de 10 ± 2 mg/ml de NaCl es típica, por ejemplo, aproximadamente 9 mg/ml.

Uso en tratamiento

La invención también proporciona una composición farmacéutica inmunogénica como se ha descrito anteriormente para su uso en un procedimiento para elevar una respuesta inmune en un mamífero, que comprende administrar una composición de la invención al mamífero. Preferentemente, la respuesta inmunitaria es protectora y, preferentemente, implica la aparición de anticuerpos. El procedimiento puede generar una respuesta de refuerzo en un paciente que ya ha sido sensibilizado contra N. meningitidis.

El mamífero es preferentemente un ser humano. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o un lactante) o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adulto. Una vacuna destinada a niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, la dosificación, la inmunogenicidad, etc.

La invención también proporciona una composición de la invención para su uso como medicamentos. Preferentemente, el medicamento es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero (es decir, es una composición inmunogénica) y es, más preferentemente, una vacuna.

Estos usos y procedimientos son, preferentemente, para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por N. meningitidis, por ejemplo, meningitis bacteriana (o, más específicamente, meningocócica) o septicemia.

Un modo de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica monitorizar la infección por Neisseria tras la administración de la composición de la invención. Un modo de comprobar la eficacia del tratamiento profiláctico implica monitorizar las respuestas inmunitarias contra los antígenos básicos tras la administración de la composición. La inmunogenicidad de las composiciones de la invención se puede determinar administrándolas a sujetos de ensayo (por ejemplo, niños de 12-16 meses de edad o modelos animales [66]) y determinando a continuación parámetros estándar que incluyen anticuerpos bactericidas en suero (SBA) y títulos de ELISA (GMT). Estas respuestas inmunitarias generalmente se determinarán alrededor de 4 semanas después de la administración de la composición, y se compararán con los valores determinados antes de la administración de la composición. Se prefiere un aumento de SBA de al menos 4 veces u 8 veces. Cuando se administra más de una dosis de la composición, se puede hacer más de una determinación posterior a la administración.

En general, las composiciones de la invención pueden inducir respuestas bactericidas de anticuerpos después de su administración a un sujeto. Estas respuestas se miden de forma conveniente en ratones y son un indicador estándar de la eficacia de la vacuna. La actividad bactericida en suero (ABS) mide la muerte de bacterias mediada por el complemento y se puede analizar usando complemento humano o de cachorro de conejo. Las normas de la OMS requieren que una vacuna induzca al menos una elevación multiplicada por 4 de la ABS en más del 90 % de los receptores. MeNZB™ produce un aumento de 4 veces la ABS 4-6 semanas después de la administración de la tercera dosis.

Las composiciones preferidas pueden conferir un título de anticuerpos en un paciente sujeto humano que es superior al criterio para seroprotección para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Los antígenos con un título de anticuerpos asociado por encima del cual se considera que un huésped está seroconvertido contra el antígeno son bien conocidos, y dichos títulos son publicados por organizaciones tales como la OMS. Preferentemente, más del 80 % de una muestra estadísticamente significativa de sujetos está seroconvertida, más preferentemente más del 90 %, aún más preferentemente más del 93 % y de la forma más preferente del 96-100 %.

En general, las composiciones de la invención se administrarán directamente a un paciente. La administración directa puede llevarse a cabo mediante inyección parenteral (por ejemplo por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o en el espacio intersticial de un tejido), o por cualquier otra vía adecuada. La invención puede usarse para generar inmunidad sistémica y/o mucosa. Se prefiere la administración intramuscular en el muslo o la parte superior del brazo. La inyección puede ser a través de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero también se puede usar como alternativa la inyección sin aguja. Una dosis intramuscular habitual es de 0,5 ml.

El tratamiento de dosificación puede ser una pauta en una sola dosis o una pauta en múltiples dosis. Pueden usarse múltiples dosis en una pauta de inmunización primaria y/o en una pauta de inmunización de refuerzo. Una pauta de dosis primaria puede ir seguida por una pauta de dosis de refuerzo. El tiempo adecuado entre las dosis de sensibilización (por ejemplo, entre 4-16 semanas) y entre la sensibilización y el refuerzo, se puede determinar de manera rutinaria. La vacuna RIVM basada en VME se probó utilizando un esquema primario de 3 o 4 dosis, con vacunación a 0. 2 y 8 o 0, 1,2 y 8 meses. MeNZB™ se administra en tres dosis a intervalos de seis semanas.

Las composiciones de la invención pueden usarse para inducir respuestas de anticuerpos bactericidas contra más de un linaje hipervirulento de meningococo. En particular, preferentemente pueden inducir respuestas bactericidas contra dos o tres de los siguientes tres linajes hipervirulentos: (i) grupo A4; (ii) complejo ET5; y (iii) linaje 3. Además, pueden inducir respuestas de anticuerpos bactericidas contra uno o más de los linajes hipervirulentos del subgrupo I, subgrupo III, subgrupo IV-1 o complejo ET-37, y contra otros linajes, por ejemplo, linajes hiperinvasivos. Esto no significa necesariamente que la composición pueda inducir anticuerpos bactericidas contra todas y cada una de las cepas de meningococo dentro de estos linajes hipervirulentos, por ejemplo, más bien, para cualquier grupo dado de cuatro o más cepas de meningococo dentro de un linaje hipervirulento particular, los anticuerpos inducidos por la composición son bactericidas contra al menos el 50 % (por ejemplo, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más) del grupo. Los grupos de cepas preferidos incluirán cepas aisladas en al menos cuatro de los países siguientes: GB, AU, c A, NO, IT, US, NZ, NL, BR y CU. El suero tiene, preferentemente, un título bactericida de al menos 1024 (por ejemplo, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 o mayor, preferentemente al menos 214) por ejemplo, el suero puede matar al menos el 50 % de las bacterias de prueba de una cepa particular cuando se diluye 1/1024.

Las composiciones útiles pueden inducir respuestas bactericidas contra las cepas siguientes de meningococo del serogrupo B: (i) del grupo A4, cepa 961-5945 (B:2b:P1.21,16) y/o cepa G2136 (B:-); (ii) del complejo ET-5, cepa MC58 (B:15:P1.7,16b) y/o cepa 44/76 (B:15:P1.7,16); (iii) del linaje 3, cepa 394/98 (B:4:P1.4) y/o cepa BZ198 (B:NT:-). Las composiciones más preferidas pueden inducir respuestas bactericidas contra las cepas 961-5945, 44/76 y 394/98.

Las cepas 961-5945 y G2136 son las dos cepas de referencia de Neisseria MLST [ids 638 y 1002 en la referencia 67]. La cepa MC58 está ampliamente disponible (por ejemplo, ATCC BAA-335) y fue la cepa secuenciada en la referencia 68. La cepa 44/76 ha sido ampliamente utilizada y caracterizada (por ejemplo, ref.69) y es una de las cepas de referencia de Neisseria MLST [id 237 en la ref. 67; fila 32 de la tabla 2 en la ref. 40]. Originalmente, la cepa 394/98 se aisló en Nueva Zelanda en 1998 y se han publicado varios estudios usando esta cepa (por ejemplo, refs. 70 y 71). La cepa BZ198 es otra cepa de referencia m Ls T (id 409 en la ref. 67; fila 41 de la tabla 2 en la ref. 40).

Componentes antigénicos adicionales

Además de las vesículas de la invención, una composición inmunogénica puede incluir antígenos adicionales.

Una composición puede incluir uno o más sacáridos capsulares de meningococos, por ejemplo, de los serogrupos A, C, W135 y/o Y. Estos sacáridos generalmente se conjugarán con un portador de proteínas. Una composición de la invención puede incluir uno o más conjugados de sacáridos capsulares de 1, 2, 3 o 4 de serogrupos meningocócicos A, C, W135 e Y, por ejemplo, A C, A W135, A Y, C+W135, C+Y, W135 Y, A C W135, A C Y, A W135 Y, A C W135 Y, etc. Componentes que incluyen sacáridos de los cuatro serogrupos A, C, W135 e Y son ideales.

Además de contener antígenos de N. meningitidis, las composiciones pueden incluir antígenos de otros patógenos. Por ejemplo, la composición puede comprender uno o más de los siguientes antígenos adicionales:

- un antígeno de Streptococcus pneumoniae, tal como un sacárido (típicamente conjugado)

- un antígeno del virus de la hepatitis B, tal como el antígeno de superficie HBsAg.

- un antígeno de Bordetella pertussis, tal como la holotoxina pertussis (PT) y la hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3.

- un antígeno de difteria, tal como un toxoide diftérico.

- un antígeno del tétanos, tal como un toxoide tetánico.

- un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae B (Hib), típicamente conjugado.

- antígenos del poliovirus inactivados.

En los casos en los que se incluye un antígeno de difteria en la composición, se prefiere incluir también un antígeno del tétanos y antígenos de la tos ferina. De manera similar, en los casos en los que se incluye un antígeno del tétanos, se prefiere incluir también antígenos de tos ferina. De manera similar, en los casos en los que se incluye un antígeno de tos ferina, se prefiere incluir también antígenos de difteria y tétanos. Por lo tanto, se prefieren las combinaciones de DTP.

Si se incluye un sacárido Hib (típicamente como un conjugado), el resto sacárido puede ser un polisacárido (por ejemplo, fosfato de polirribosilribitol (PRP) de longitud completa purificado de bacterias), pero también es posible fragmentar el sacárido purificado para producir oligosacáridos (por ejemplo, PM de ~ 1 a ~ 5 kDa) por ejemplo por hidrólisis. La concentración de conjugado de Hib en una composición generalmente estará en el intervalo de 0,5 |jg a 50 jg , por ejemplo, de 1-20 jg , de 10-15 jg , de 12-16 jg , etc. La cantidad puede ser de aproximadamente 15 g, o aproximadamente 12,5 jg en algunas realizaciones. Puede ser adecuada una masa de menos de 5 jg [72] por ejemplo, en el intervalo de 1-5 jg , 2-4 jg , o aproximadamente 2,5 jg . Tal como se ha descrito anteriormente, en combinaciones que incluyen sacárido Hib y sacáridos meningocócicos, la dosis del primero puede seleccionarse en función de la dosis del segundo (en particular, con múltiples serogrupos meningocócicos, su masa media). Otras características de los conjugados de Hib son como se ha desvelado anteriormente para los conjugados meningocócicos, incluida la elección de la proteína transportadora (por ejemplo, CRM197 o toxoide tetánico), enlaces, relaciones, etc.

Si se incluye un antígeno de S.pneumoniae, esto puede ser un polipéptido o un sacárido. Los sacáridos capsulares conjugados son particularmente útiles para inmunizar contra neumococos. El sacárido puede ser un polisacárido que tiene el tamaño que surge durante la purificación del sacárido de la bacteria o puede ser un oligosacárido logrado por fragmentación de dicho polisacárido. En el producto heptavalente PREVNAR™, por ejemplo, 6 de los sacáridos se presentan como polisacáridos intactos, mientras que uno (el serotipo 18C) se presenta como un oligosacárido. Una composición puede incluir un sacárido capsular de uno o más de los siguientes serotipos neumocócicos: 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y/o 33F. Una composición puede incluir múltiples serotipos, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o más serotipos. Las combinaciones conjugadas 7-valente, 9-valente, 10-valente, 11-valente y 13-valente ya son conocidas en la técnica, así como una combinación no conjugada 23-valente. Por ejemplo, una combinación 10-valente puede incluir sacáridos de los serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F. Una combinación 11-valente puede incluir además sacárido del serotipo 3. Una combinación 12-valente puede añadir a la mezcla 10-valente: serotipos 6A y 19A; 6A y 22F; 19A y 22F; 6A y 15B; 19A y 15B; r 22F y 15B; Una combinación 13-valente puede añadir a la mezcla 11-valente: serotipos 19A y 22F; 8 y 12F; 8 y 15B; 8 y 19A; 8 y 22F; 12F y 15B; 12F y 19A; 12F y 22F; 15B y 19A; 15B y 22F. etc. Las características adicionales de los conjugados neumocócicos son las desveladas anteriormente para los conjugados meningocócicos., incluida la elección de la proteína transportadora (por ejemplo, CRM197 o toxoide tetánico), enlaces, relaciones, etc. Cuando una composición incluye más de un conjugado, cada conjugado puede usar la misma proteína transportadora o una proteína transportadora diferente. La referencia 73 describe posibles ventajas a la hora de usar proteínas vehículo diferentes en vacunas conjugadas neumocócicas multivalentes.

General

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra cosa, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véanse, por ejemplo, las referencias 74-80, etc.

La expresión "que comprende" abarca "que incluye", así como "que consiste en", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.

El término "aproximadamente", en relación con un valor numérico x, es opcional y significa, por ejemplo, x±10 %.

En los casos en los que la invención se refiera a un "epítopo", este epítopo puede ser un epítopo de linfocitos B y/o un epítopo de linfocitos T, pero generalmente será un epítopo de células B. Dichos epítopos pueden identificarse empíricamente (por ejemplo, usando PEPSCAN [81,82] o procedimientos similares) o pueden predecirse (por ejemplo, usando el índice antigénico de Jameson-Wolf [83], estrategias basadas en matriz [84], MAPITOPE [85], TEPITOPE [86,87], redes neurales [88], OptiMer y EpiMer [89, 90], ADEPT [91], Tsites [92], hidrofilia [93], índice antigénico [94] o los procedimientos desvelados en las referencias 95-99, etc.). Los epítopos son partes de un antígeno que son reconocidos por y se unen a los sitios de unión a antígeno de anticuerpos o receptores de linfocito T y también pueden citarse como "determinantes antigénicos".

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significan que, cuando se alinean, el porcentaje de aminoácidos que son iguales al comparar las dos secuencias. Pueden determinarse este alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia usando programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la ref. 100. Se determina un alineamiento preferido mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de hueco afín con una penalización por apertura de hueco de 12 y una penalización por extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se desvela en la ref. 101.

La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra el enfoque para construir un panel isogénico inactivando nadA y nhba (GNA2132) para crear una cepa de fondo. La Figura 2 muestra la inserción de genes fHbp en la cepa de fondo para hacer un panel de cepas isogénicas que expresan diferentes genes fHbp bajo el control de un promotor Ptac.

La Figura 3 muestra los niveles de expresión de fHbp en las cepas de panel isogénicas descritas en la Figura 2.

La Figura 4 muestra la expresión de NadA (panel superior) y NadR (panel inferior) en ocho cepas de tipo salvaje (Figura 4A) o sus formas de inactivación de NadR (Figura 4B). Los números en la Figura 4A muestran el número de repeticiones de tetranucleótidos TAAA en la cepa. La Figura 4C muestra la expresión de NadA y NadR en 7 cepas, en presencia de ausencia de 4HPA.

La Figura 5 muestra (A) cepa de inicio MC58 (B) MC58Anhba y (C) MC58Anhba transformada con un gen de nhba complementario con un promotor inducible por CREN e IPTG corriente arriba.

La Figura 6 muestra la expresión de NHBA por MC58 y cepas derivadas. Los dos carriles izquierdos muestran expresión en MC58 y MC58Anhba. Los siguientes 8 carriles muestran expresión en cepas complementadas a cuatro concentraciones de IPTG. Los carriles están dispuestos en pares, siento el carril de la derecha una cepa complementada con nhba que tiene un CREN corriente arriba.

La Figura 7 muestra la expresión de NHBA por 95N477 y cepas derivadas. Los dos carriles izquierdos muestran expresión en 95N477 y 95N477Anhba. Los siguientes 5 carriles muestran expresión en cepas complementadas a las concentraciones indicadas de IPTG.

La Figura 8 muestra la expresión de NHBA para cinco cepas en un panel isogénico. De arriba a abajo, el NHBA expresado es de la cepa NZ98/254, UK013, UK355, 2996 y NM117.

Modos para llevar a cabo la invención

NHBA

El gen nhba endógeno se inactiva en varias cepas del serogrupo B para crear cepas MC58Anhba, 95N477Anhba, NGH38Anhba y UK013Anhba. Estas cepas se transforman luego con el vector pCOMPpind-287 que contiene un gen que codifica nhba de la cepa 394/98, con o sin un CREN corriente arriba (elemento regulador de contacto de Neisseria), bajo el control de un promotor inducible por IPTG. Los vectores insertan el gen nhba (± CREN) entre los genes endógenos nmb1428 y nmb1429 por recombinación homóloga.

La Figura 5 muestra la cepa MC58 inicial, la cepa MC58Anhba y la cepa MC58 complementada (+ CREN). La Figura 6 muestra la expresión de NHBA por las diversas cepas de MC58 con una concentración creciente de IPTG. Las cepas complementadas muestran altos niveles de expresión inducible de NHBA, con los niveles más altos vistos con el gen insertado tiene un CREN aguas arriba.

La Figura 7 muestra la expresión en las cepas 95N477. El gen nhba endógeno en esta cepa codifica una proteína 427aa, mientras que el gen complementario insertado tiene 492aa. Los niveles de expresión aumentados de la proteína NHBA más grande son claramente visibles, y esta expresión aumenta con la concentración de IPTG.

Aunque en algunas cepas (por ejemplo, M4407) no fue posible obtener una inactivación de Anhbba usando los protocolos de transformación, para las cepas que podrían transformarse, estos resultados muestran que pueden obtenerse fácilmente cepas que sobreexpresan NHBA.

NadR (NMB1843)

El gen nadA está presente en aproximadamente el 50% de los aislamientos meningocócicos. NadA exhibe expresión dependiente de la fase de crecimiento, con niveles máximos en la fase de crecimiento estacionario de todas las cepas analizadas. La expresión está controlada por una repetición de tetranucleótidos (TAAA) ubicada corriente arriba del promotor nadA. El número de repeticiones se puede modificar durante la replicación a través del mal emparejamiento de la cadena deslizada y, en consecuencia, puede influir en la expresión del gen nadA creando variantes en las que los cambios en el número de repeticiones dan como resultado promotores con actividad baja, media o alta.

Un área del promotor nadA aguas arriba de la repetición TAAA, es responsable de la represión de la expresión de nadA durante la fase logarítmica de crecimiento. Esta área se llama la "región GPR". El fraccionamiento por afinidad de ADN identificó una proteína presente en los extractos crudos de meningococo que se une a la región GPR. Esta proteína es NadR (NMB1843) y es miembro de la familia de represores MarR. NadR se une a tres operadores (sitios de unión) en el promotor nadA y da como resultado la represión de la expresión de NadA. La inactivación de NadR en cepas que expresan niveles altos, medios o bajos de NadA da como resultado una expresión de alto nivel casi comparable en cada cepa. Por lo tanto, NadR es el represor que contribuye a los niveles de expresión diferencial exhibidos por las cepas meningocócicas, o variantes de fase en la misma cepa, con diferentes números de repeticiones en su promotor. NadR se expresa a niveles similares en diferentes cepas pero puede reprimir más o menos eficientemente el promotor nadA dependiendo del número de repeticiones presentes en el promotor variante.

La eliminación de NadR en diversos antecedentes de meningococo produce niveles de expresión de NadA casi comparables en todo el panel. Las cepas se transforman con la construcción de inactivación para el reemplazo alélico de nmb1843 con un casete de cloranfenicol. Los niveles de expresión en ocho cepas diferentes se muestran en la Figura 4.

Un ligando de molécula pequeña de ácido 4-hidroxifenilacético (4HPA) puede inducir la expresión de NadA in vitro debido a la desrrepresión de NadR (Figura 4C). La adición de la molécula a la proteína NadR purificada in vitro puede inhibir la actividad de unión de la proteína para el promotor nadA. 4HPA es un metabolito de la vía catabólica de los aminoácidos aromáticos y se secreta en la saliva y la orina humanas, por lo que la expresión in vivo de NadA puede ser mayor que la observada durante el crecimiento in vitro.

Así, las cepas que sobreexpresan NadA pueden obtenerse fácilmente mediante la inactivación de NadR y/o mediante la adición de un inductor de molécula pequeña al medio de crecimiento.

Panel isogénico - NHBA

NHBA es un antígeno en el producto 4CMenB. Se usó un panel isogénico para estudiar la posible protección cruzada de los anticuerpos bactericidas inducidos por NHBA.

Los genes nhba de seis cepas meningocócicas diferentes se amplificaron para proporcionar la forma madura del polipéptido con una etiqueta de histidina C-terminal. Estos se clonaron en el vector plasmídico pET-21b+ y se expresaron en E. coli. Los péptidos NHBA purificados se usaron luego para inmunizar ratones (dosis de 20 |jg) y obtener antisueros de ratón. Se realizaron ensayos ELISA para confirmar la presencia de anticuerpos en todos los sueros de ratón obtenidos.

Para evaluar la inmunogenicidad y la contribución de la variabilidad de la secuencia de aminoácidos a la cobertura de la vacuna, se diseñó una cepa de partida para que fuera susceptible a la muerte bactericida solo por anticuerpos anti-NHBA (en lugar de los otros antígenos en 4CMenB). La cepa 5/99 de N. meningitidis expresa de forma natural niveles altos de NadA, pero niveles muy bajos de NHBA y fHbp. Sus genes nadA y nhba fueron reemplazados respectivamente por los casetes de resistencia ery y kan (5/99AA). El gen nhba que se complementará se insertó en la región intergénica entre los marcos de lectura abiertos nmb1428 y nmb1429. Por lo tanto, el panel de cepa final era isogénico, excepto el gen nhba elegido y este gen debería ser inducible para la expresión a niveles iguales en todos los miembros del panel.

Mediante FACS se demostró que los miembros del panel mostraban una cantidad comparable de los diferentes polipéptidos NHBA en cada cepa (Figura 8). Se analizaron varios antisueros de ratón generados contra los diferentes polipéptidos de NHBA en Western blot y la detección parecía ser específica de la variante, mostrando un reconocimiento más fuerte para la variante homóloga.

El panel también se usó para probar el efecto bactericida de los antisueros de ratón. Como las cepas eran isogénicas, cualquier diferencia en el efecto bactericida debería surgir solo de los diferentes polipéptidos NHBA expresados. Paralelamente, los sueros se probaron frente a cepas de tipo salvaje que expresan la secuencia de polipéptidos de NHBA relevante, para ver si el fondo genético común del panel isogénico permitió la detección de diferencias que serían ocultadas por la variación natural si se usaran cepas de tipo salvaje. Los resultados fueron los siguientes:

Por lo tanto, el panel parece compensar la variabilidad que no está relacionada con el antígeno NHBA mismo. Por ejemplo, el suero producido contra la secuencia MC58 es mucho más efectivo contra el polipéptido MC58 en el panel isogénico que contra la cepa MC58 de tipo salvaje.

Panel isogénico - fHbp

La secuenciación del gen fHbp en una gran colección de aislados meningocócicos reveló tres variantes con bajos niveles de respuesta bactericida de protección cruzada. Se usó un ensayo bactericida en suero para evaluar las capacidades de protección cruzada de los anticuerpos humanos generados contra diferentes variantes de fHbp, pero la muerte mediada por anticuerpos bactericidas en este ensayo depende de varios factores. Por lo tanto, la cobertura potencial de un solo antígeno puede ser difícil de estimar.

Se utilizó un enfoque genético para superar la variabilidad debido a la susceptibilidad sérica específica de la cepa, limitaciones de fuentes de complemento compatibles y expresión variable de fHbp y otros factores expuestos a la superficie que afectan a la resistencia al suero (por ejemplo, la cápsula). Se diseñó un aislado meningocócico bien caracterizado (5/99) para generar cepas isogénicas que expresaran diez subvariantes fHbp diferentes de un promotor heterólogo constitutivo. Los genes fHbp se insertaron entre los genes endógenos nmb1428 y nmb1429. Este panel se usó después como la cepa de prueba en un ensayo de anticuerpos bactericidas en suero (SBA) para evaluar la capacidad de una única variante de fHbp para provocar una respuesta inmune ampliamente protectora.

Para tener un fondo genético para expresar diferentes subvariantes de fHbp sin la acción interferente de los otros antígenos, los genes nadA y nhba en la cepa inicial 5/99 se inactivaron mediante la inserción de los casetes de resistencia erm y kan, respectivamente (Figura 1). La cepa mutante doble resultante (denominada 5/99AA) se manipuló para expresar diferentes subvariantes de fHbp bajo el control de un promotor Ptac para estandarizar la cantidad de fHbp expresada (Figuras 1 y 2). En total, se clonaron diez secuencias diferentes de codificación de fHbp en el vector pComp-RBS y se transfirieron al fondo genético 5/99AA.

Para evaluar la expresión de fHbp en las cepas recombinantes, los inventores realizaron un análisis FACS utilizando un suero policlonal de ratón contra una única variante de fHbp. El análisis mostró una cantidad comparable de las diferentes subvariantes de fHbp en la superficie de las cepas recombinantes generadas (Figura 3).

Las cepas recombinantes se analizaron para determinar su susceptibilidad a la muerte por anticuerpos bactericidas de ratones en un SBA usando complemento de conejo. Los sueros agrupados de ratones inmunizados con la "vacuna universal" de referencia 19 o con su componente GNA2091-fHbp se analizaron para determinar su capacidad para matar el tipo salvaje 5/99, la cepa intermedia 5/99AA que no expresa antígenos NHBA ni NadA, y las diez cepas recombinantes. La cepa 5/99 se destruyó por sueros criados contra la vacuna universal, pero no por sueros generados contra el antígeno único GNA2091-fHbp. La cepa 5/99AA fue resistente a la muerte por todos los sueros. Todas las cepas complementadas, excepto una, mostraron una susceptibilidad significativa a los sueros derivados de ratones inmunizados con la vacuna universal o con el antígeno GNA2091-fHbp. La única cepa sobreviviente expresó un fHbp en la familia III, confirmando la ausencia de reactividad cruzada entre las familias de fHbp. Las nueve cepas susceptibles confirman que la secuencia específica de fHbp en la vacuna universal puede generar anticuerpos que son ampliamente protectores en toda la familia de fHbp I.

El panel también se analizó utilizando sueros obtenidos de adultos humanos que fueron inmunizados con 4CMenB. Los resultados fueron comparables a los observados con ratones.

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un meningococo que expresa NadA y opcionalmente NHBA, en el que el meningococo es isogénico con una cepa parental, excepto por una modificación genética que hace que el meningococo exprese más NadA y opcionalmente más NHBA que la cepa parental, en el que el meningococo no expresa NadR y en el que la bacteria no expresa un MltA activo.

2. El meningococo de la reivindicación 1, que incluye (i) un gen bajo el control de un promotor que no controla ese gen en la cepa parental y/o (ii) una desactivación de un gen que se encuentra en la cepa parental.

3. El meningococo de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que la expresión de NHBA está controlada por un promotor inducible o constitutivo y en el que el promotor incluye opcionalmente un CREN.

4. El meningococo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la bacteria también expresa más fHbp que la cepa parental.

5. El meningococo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que:

(i) la bacteria tiene una inactivación de LpxL1;

(ii) la bacteria no expresa PorA; y/o

(iii) la bacteria no expresa FrpB.

6. El meningococo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el serogrupo B.

7. El meningococo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en inmunotipo L3.

8. Un procedimiento de preparación de una cepa meningocócica adecuada para la preparación de VME, que comprende las etapas de (i) elegir una cepa de partida que exprese NadA y opcionalmente NHBA; y (ii) modificar la cepa de partida para aumentar la cantidad de NadA y opcionalmente NHBA que expresa, en el que el meningococo no expresa NadR y no expresa un MltA activo.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, que incluye una etapa de (iii) cultivar las bacterias modificadas obtenidas en la etapa (ii) para proporcionar un cultivo bacteriano.

10. Un procedimiento de preparación de una vesícula meningocócica, que comprende una etapa de tratamiento de un cultivo bacteriano obtenido mediante el procedimiento de la reivindicación 9, de modo que su membrana externa forme vesículas.

11. Vesículas de membrana externa preparadas a partir del meningococo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o preparadas por el procedimiento de la reivindicación 10.

12. Una composición farmacéutica inmunogénica que comprende las vesículas de la reivindicación 11.

13. La composición de la reivindicación 12, incluyendo uno o más sacáridos capsulares de meningococos y/o incluyendo un antígeno de Streptococcus pneumoniae.

14. La composición de la reivindicación 12 o la reivindicación 13 para su uso en la elevación de una respuesta inmune en un mamífero, que comprende administrar la composición al mamífero.