JP2001510169A

JP2001510169A - Ｂ型髄膜炎菌性ポーリンおよびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ多糖体を含む免疫原性結合体

Info

Publication number: JP2001510169A
Application number: JP2000502796A
Authority: JP
Inventors: マイランエス．ブレイク，; フランシスミッション，; ピーターシー．ファスコ，; アイバーヘロン，
Original assignee: ノースアメリカンワクチン，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-07-17
Filing date: 1998-07-17
Publication date: 2001-07-31
Also published as: CN1272062A; PL338146A1; BR9811475A; WO1999003501A9; KR20010021953A; US20020131984A1; AU748973B2; EP1003549A1; NO20000202D0; CA2297072A1; NZ502437A; AU8494698A; NO20000202L; WO1999003501A1; US6451317B1; EP1003549A4; US6613336B2

Abstract

(57)【要約】Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型多糖体−髄膜炎菌外膜タンパク結合体、その薬学的組成物、および動物におけるＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する免疫応答を誘導するためのこの使用を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

（発明の背景）（発明の分野）本発明は、動物において免疫応答を誘発するために有用なワクチンの分野にあ
る。特に本発明は、Ｈ．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ多糖体−Ｎ髄膜炎外膜タンパク質
結合体、薬学的組成物、およびその使用に関係する。

【０００１】（背景情報）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、小さな、多型性の、グラ
ム陰性の球桿菌である。単離体は、６つの抗原性の異なる莢膜型（ａ−ｆ）、お
よび非被包性の、型分類できない株に分類される。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａｅは、髄膜炎、中耳炎、副鼻腔炎、喉頭蓋炎、敗血症関節炎、
潜在性の熱性の菌血症、蜂窩織炎、肺炎および蓄膿を引き起こし得る；時折、こ
の生物は、新生児の髄膜炎および敗血症を引き起こす。他のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎ
ｚａｅ感染は、化膿性の心外膜炎、心内膜炎、結膜炎、骨髄炎、腹膜炎、精巣精
巣上体炎、舌炎、口蓋垂炎、および敗血症血栓静脈炎を含む。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａｅＢ型（Ｈｉｂ）結合体ワクチン接種の導入以前の子供における侵襲性
の疾患のほとんどの症例は、Ｂ型により引き起こされた。非被包性の生物は、新
生児における侵襲性の疾患を引き起こし得る。非被包性の株は、中耳炎、副鼻腔
炎および気管支炎を含む上気道感染を引き起こし、そして肺炎を引き起こし得る
。

【０００２】この生物の供給源は、ヒトの上気道である。伝染の態様は、おそらくヒトから
ヒトへ、直接的接触によるか、またはこの生物を含む気道分泌物の液滴の吸引を
通してである。非被包性株による無症候の定着が頻繁にある；生物は６０％〜９
０％の子供の咽喉から回収される。しかし、Ｂ型生物による定着はまれであり、
ワクチン接種前年代の２％〜５％の範囲の子供に見られ、そして広範なＨｉｂ結
合体ワクチン接種により、さらにまれであるようである。伝染性の正確な期間は
未知であるが、この生物が上気道に存在する限りの期間であり得る。

【０００３】有効なワクチンの導入前に、Ｈｉｂは米国および多くの他の国の子供における
細菌性髄膜炎の最も一般的な原因であった。髄膜炎および他の侵襲性の感染は、
３ヶ月齢から３歳の年齢の子供において最も一般的であり、そしてその症例のお
およそ半分は、１２ヶ月より若い乳児において起こった。国における異なる集団
における、侵襲性のＢ型疾患の年齢特異的発生率は変動していた；１２ヶ月より
若い乳児における疾患の比率は、人数において最も多く、最も高い総発生率を有
する傾向にあり、症例の中央値の年齢を低くするという結果になる。髄膜炎およ
びほとんどの他の侵襲性のＨｉｂ疾患と対比して、喉頭蓋炎は１２ヶ月よりも若
い乳児においてまれである；ワクチン接種前年代におけるその発生のピークは、
２〜４歳の年齢であった。喉頭蓋炎はまた、より年齢の高い、ワクチンを接種し
ていない子供および大人に起こり得る。

【０００４】侵襲性の疾患は、男児、アフリカ系のアメリカ人、アラスカエスキモー、アパ
ッチ族およびナヴァホ族のインディアン、児童養護センターに通う者、過密した
条件下で生活する子供達、および母乳育ちでない子供達においてより頻繁であっ
た。免疫化していない子供達、特に４歳未満で、長期間侵襲性のＨｉｂ疾患を有
する子供と密接な接触のあった（例えば、家族内で）子供達には、この生物から
の重篤な感染の増大した危険がある。侵襲性の疾患にかかりやすくする他の因子
には、鎌状赤血球疾患、無脾症、ＨＩＶ感染、特定の免疫不全症候群、および悪
性疾患がある。侵襲性の感染を有すると記録された１歳より若い乳児には、その
後ワクチン接種しなければ、およそ１％の再発の危険性がある。

【０００５】Ｈｉｂ結合体ワクチンが導入された１９８８年以来、侵襲性のＨｉｂ疾患の発
生率は、乳幼児および幼い子供において９５％減少し、そして他の被包型により
引き起こされる侵襲性の感染の発生率は、現在、Ｂ型により引き起こされる発生
率と類似である。この成功の結果として、アメリカ合衆国公衆衛生局は、５歳よ
り若い子供におけるＨｉｂ疾患を、この国から排除するために、標的にした。侵
襲性のＨｉｂ疾患は、現在、この国において主にワクチン接種した子供のうちで
、および幼すぎて主な一連のワクチン接種を完了していない乳幼児の間で発生す
る。

【０００６】４つのＨｉｂ結合体ワクチンが、アメリカ合衆国において認可されている。こ
れらのワクチンは、担体タンパク質と直接に、または介在性のスペーサー分子を
介して共有結合したＨｉｂ莢膜多糖体（すなわち、ポリリボシルリボトール（ｐ
ｏｌｙｒｉｂｏｓｙｌｒｉｂｏｔｏｌ）ホスフェート（ＰＲＰ）またはＰＲＰオ
リゴマー）からなる。保護抗体は、組成物および免疫原性が異なるＰＲＰ結合体
ワクチンに対して指向され、結果として、それらの用途について推奨されるもの
は異なる。例えば、ＰＲＰ−Ｄは、年齢が１２ヶ月以上の子供についてのみ奨め
られるのに対し、他の３つのワクチン、ＨｂＯＣ、ＰＲＰ−Ｔ、およびＰＲＰ−
ＯＭＰは、乳幼児の年齢２ヶ月の時点で開始することが奨められる。

【０００７】アジュバントは、抗原に対する免疫応答を増大する物質であり、それゆえ多く
のワクチンおよびワクチン候補において使用されてきた。アジュバントは多くの
異なる抗原型に対して免疫応答を高めるので、アジュバントの免疫刺激性の効果
は、抗原特異的でない。ヒトのための使用について現在ＦＤＡにより承認されて
いる唯一のアジュバンドは、アルミニウム塩であるが、動物のワクチン接種に、
およびより新しいワクチン候補において使用される多くのアジュバンドは、微生
物起源（６１）であり、例えば、フロイントアジュバンド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍ、ムラミルジペチド（ｄｉｐｅｔｉｄｅ）、破傷風
トキソイドなどである。微生物性の物質の免疫強化能力についての機構は未知で
ある。

【０００８】病原性のナイセリア（ＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ
ｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の主な外膜タンパク質は、アジ
ュバンドの潜在能力（３６、３７、３９、４０、６０）について、およびその免
疫強化能力の原因となる機構について研究されてきた。目的のタンパク質は、淋
菌からのタンパク質ＩＡ（ＰＩＡ）およびタンパク質ＩＢ（ＰＩＢ），ならびに
髄膜炎菌からのクラス１、２または３タンパク質（それぞれＣ１、Ｃ２およびＣ
３）である（４）。これらはすべてポーリンとして機能（４１、４３、６２）し
、互いの間で有意なアミノ酸配列相同性を有し（６、７、２１、５９）、そして
グラム陰性ポーリンスーパーファミリーの一部であると考えられている（２６）
。

【０００９】ナイセリアのポーリンは、マラリアのペプチドと非共有結合的な複合体化した
場合、このペプチドが免疫原として単独で使用されたか、もしくは他のタンパク
質と共有結合的に結合した場合と比較して、これらのペプチドに対する抗体応答
を増強することが示された（３９、４０）。さらに、Ａ型連鎖球菌（３８）、イ
ンフルエンザウィルス血球凝集素（３８）、またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｂ
ｒｕｃｅｉｉ（４０）由来のペプチドは、マウスがペプチド単独で免疫化された
場合と比較して、ナイセリアのポーリンを含有する複合体中に組み込まれた場合
に、マウスにおいてより免疫原性であることが示された。髄膜炎菌性外膜小胞（
ＯＭＶ）、これは主にクラス２タンパク質からなるが、Ｍｅｒｃｋらが開発し、
最近認可されたＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型ワクチン中のＨ．ｉｎｆｌｕｗｎ
ｚａｅ多糖体カプセルへの免疫応答を高めるための担体として使用された（１０
）。さらにＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎは、抗黒色腫ワクチンにおけるアジュバントと
しての精製ナイセリアポーリンの使用を調査してきた。黒色腫細胞は、通常のメ
ラニン細胞と比較して、それらの表面上に非常に高いレベルのヒトガングリオシ
ドＧＭ２またはＧＤ３発現する。ＧＭ２およびＧＤ３に対するこの免疫応答を増
加し、そして多分黒色腫患者における腫瘍免疫を誘導するために、ＧＭ２および
ＧＤ３を、非共有結合的に精製ナイセリアポーリンと結合させ、そして悪性の黒
色腫を有するボランティアを、これらのワクチン構成物で免疫化した。抗ＧＭ２
または抗ＧＤ３抗体応答は、これらのガングリオシドのみで、またはＢＣＧと複
合体化したガングリオシドで免疫化した患者と比較して、ポーリン／ＧＭ２また
はポーリン／ＧＤ３複合体で免疫化した患者において大いに高まった（３６、３
７）。さらに、ポーリン／ＧＭ２で免疫化した患者における腫瘍負荷は、有意に
減少した（個人的に入手した情報、Ｐ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ）。

【００１０】このナイセリアポーリンがアジュバントとして作用する機構は未知である。Ｍ
ｅｒｃｋからのグループ（１０、３５、５６）は、ヘモフィルス多糖体莢膜−髄
膜炎菌のＯＭＶ結合体ワクチンを開発したが、彼らは、クラス２タンパク質によ
る直接的Ｔ細胞刺激のためであり得ると考えた。彼らは、初めに、このクラス２
タンパク質が、直接Ｔリンパ球を刺激し得ることを実証し、それゆえクラス２タ
ンパク質を髄膜炎菌免疫強化タンパク質（ＭｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌＩｍｍ
ｕｎｅＥｎｈａｎｃｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ）（ＭＩＥＰ）と改名した（３５
）。しかし、高濃度（＞５０μｇ）の変性したクラス２タンパク質のみがＴ細胞
を刺激し得るのに対し、天然のタンパク質はこのような効果を有さないことが後
に示された（５６）。さらに、大多数のナイセリアポーリンは、ワクチン候補ま
たはアジュバントとして使用された場合、それらの天然の構造で存在するので、
変性ポーリンによる非特異的Ｔ細胞刺激がそれらの免疫強化能力を説明する可能
性は低い。

【００１１】最近の数年の間、抗原認識、リンパ球刺激、および抗体産生に必要なＴリンパ
球とＢリンパ球との間の相互作用に関する詳細が、解明されてきた。Ｔリンパ球
刺激の現行のモデルにおいて、抗原呈示細胞（ａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔ
ｉｎｇｃｅｌｌ）（ＡＰＣ）とＴリンパ球との間の２セットのシグナルが必要
であることが示されてきた（２４、２５、５１）。この第一のシグナル（シグナ
ル１）は、抗原呈示細胞（例えば、Ｂリンパ球、樹状細胞、マクロファージなど
）上の主要組織適合性（ＭＨＣ）複合体およびＴリンパ球上のＴ細胞レセプター
の相互作用を介して送達される。このＭＨＣ複合体上の溝は通常、プロセシング
された抗原（Ｔ細胞エピトープ）に由来する、オリゴペプチドにより占有される
。この反応の特異性は、シグナル１により与えられる。この第二のまたは同時刺
激性のシグナル（シグナル２）は、Ｂリンパ球とＴリンパ球との間の相互作用の
間、２セットのカウンターレセプターの結合により送達される（図１）。次に、
活性化Ｔリンパ球はサイトカインを放出し、次いでこれは、例えばＢリンパ球を
抗体生産細胞にするエフェクター細胞を刺激する。これらのカウンターレセプタ
ーの相互作用による同時刺激の誘導は、腫瘍免疫（１，３，８，１１，５１，５
５）、耐性の阻止（１９，４５，５４）において、および細胞障害性リンパ球活
性（１）について重要であることが示されている。

【００１２】このＴリンパ球カウンターレセプターは、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４である
。これらは、共に免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである（９）。
ＣＤ２８は、休止状態のＴ細胞、および活性化Ｔ細胞（１、８、２７、３０、３
２、３４、４６）に存在する一方で、ＣＴＬＡ−４は、活性化Ｔ細胞（１７、２
３、３１、３３、５１）上でのみ発現する。活性化Ｔ細胞上のＣＤ２８のレベル
は、ＣＴＬＡ−４より２０倍高いが、そのＢ細胞カウンターレセプターに対する
ＣＤ２８の親和性はずっと低い（３１、３３）。このＢリンパ球カウンターレセ
プターは、Ｂ７（１４、２０、３２、４８、４９）、およびより近年発見された
Ｂ７−２（２、１２、１３、１６、２４）である。Ｂ７およびＢ７−２は、免疫
グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり（１３−１５）、そして活性化
Ｂリンパ球上にのみ存在する（１４）。幾つかの一連の証拠は、そのより新しい
リガンド、Ｂ７−２のＴリンパ球同時刺激との関係を実証する；１）活性化Ｂ細
胞と結合するＣＴＬＡ−４は、抗Ｂ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により部分
的にのみ阻害され（２４）、２）Ｂ７発現において不完全なマウス由来のリンパ
球は、なおＴ細胞を同時刺激し得（１２，１３）、３）Ｂ７−２のみ発現するト
ランスフェクト体は、Ｔ細胞を同時刺激し得（１３、１６）、そして４）Ｂ７−
２に特異的なｍＡｂはＢ細胞（２４）またはＢ７−２トランスフェクト体（１３
）によるＴリンパ球同時刺激を阻害し得る。初めに記述したＢ７抗原の同時刺激
カウンターレセプターとしての有意性は、Ｂ７−２の発現がＢ７の発現より早期
に起こり、活性化Ｂリンパ球の表面上にＢ７よりも多くのＢ７−２が存在するの
で議論の的である（２４）。Ｔリンパ球同時刺激およびこの同時刺激カウンター
レセプターの略図が、図１に示される。

【００１３】様々な研究者により示された、微生物の生成物がＢリンパ球を刺激し得るとい
う予備証拠がある。Ｌｉｕ．らは、リポ多糖（ＬＰＳ）、マイトジェンインフル
エンザウィルス、およびウィルス感染を模倣する抗原（ポリイノシニック−ポリ
シチジル酸）はすべて、Ｂリンパ球を刺激し、これは次にＴリンパ球を同時刺激
することを実証した（２５）。Ｖｏｒｄｅｒｍｅｉｅｒは、精製Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａｔｙｐｈｉポーリン（ＬＰＳを含まない）が、強力なＢ細胞刺激物質で
あるが、Ｔリンパ球に対して最小の効果を有することを実証した（５７、５８）
。さらに、主に髄膜炎菌ポーリンからなる髄膜炎菌外膜の調製物は、Ｂ細胞マイ
トジェンとして作用し、そしてＴリンパ球を刺激しない（４４、５２、５３）。
この証拠は、ナイセリアポーリンおよびおそらく他のグラム陰性ポーリンが、Ｂ
リンパ球を刺激し、Ｂ７−２発現を増加し得ることを示唆する。このＢ７−２の
増加した発現は、Ｔリンパ球同時刺激を仲介し得、これはポーリンが本明細書中
に示すＰＲＰ多糖体のような他の抗原に対する免疫応答を増大する機構であり得
る。

【００１４】（発明の簡単な要旨）本発明は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型（Ｈｉｂ）多糖体−実質的に純粋
な再折り畳みした髄膜炎菌の外膜タンパク質（ｒＰｏｒＢ）結合体に関する。

【００１５】本発明はまた、Ｈｉｂ多糖体−ｒＰｏｒＢ結合体を調製する方法に関し、以下
の工程：（ａ）Ｈｉｂ多糖体を得る工程；（ｂ）アルデヒド基を産生するために上記多糖体を酸化または選択的に加水分解する工程；（ｃ）ｒＰｏｒＢを得る工程；および（ｄ）アルデヒド基を含む多糖体を還元的アミノ化によりｒＰｏｒＢと結合体化する工程、を包含する。

【００１６】本発明はまた、本発明の方法に従って得られた結合体に関する。随意に、本発
明の結合体は、ＤＴａＰ（ジフテリア、破傷風、無細胞の百日咳ワクチン）と組
み合せ得る。

【００１７】本発明はまた、本発明の結合体を含み、随意にＤＴａＰおよび薬学的に受容可
能な担体を含む薬学的組成物、に関する。

【００１８】本発明はまた、動物においてＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する免疫応答を誘
導する方法に関し、この方法は、本発明の結合体をこの動物に上記免疫応答を誘
導するのに有効な量投与する工程を包含する。

【００１９】本発明は、本発明のＨｉｂ−ｒＰｏｒＢ結合体が、破傷風トキソイド、および
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｓａｅから組み換え的に生成した外膜Ｐ２タンパク質が、抗
原タンパク質として使用される場合と比較して、動物における実質的により大き
い免疫応答を誘導するという驚くべき発見に部分的に関する。Ｌｅｄｅｒｌｅ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＡｍｅｒｉｃａｎＣｙ
ａｎａｍｉｄｅＣｏｍｐａｎｙ，ＰｅａｒｌＲｉｖｅｒ，ＮＹより市販され
ているＨｉｂ−ＣＲＭ結合体と比較して、実質的により大きい免疫原性の応答が
また得られた。ＣＲＭ₁₉₇は、ＣｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅＣ７（β１９７）の培養物から単離されたジフテリア毒素の部位変異
体の無毒な改変体である。Ｓｅｉｄ，Ｒ．Ｃ．Ｊｒ．ら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．
Ｊ．６：４８９−４９８（１９８９）．さらに本発明の結合体は、この構成成分間の免疫学的相互作用ならびにエピト
ープの（ｅｐｉｔｏｐｉｃ）抑制が、破傷風トキソイドのような従来の担体タン
パク質を用いて観察されるので、ＤＴａＰをまた含む組成物において特に有用で
ある。本発明の結合体は、組み合せワクチン組成物におけるこの重大な制限を克
服する。

【００２０】（発明の詳細な説明）本発明は、動物において免疫応答を誘導するためのワクチンに関し、このワク
チンは、Ｈｉｂ多糖体と結合した外膜髄膜炎菌Ｂ群ポーリンタンパク質を、薬学
的に受容される希釈剤、担体または賦形剤とともに含有し、ここでこのワクチン
は動物におけるＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する免疫応答を誘発するのに有効
な量で投与され得る。好ましい実施態様において、この動物は、ヒト、ウシ、ブ
タ、ヒツジおよびニワトリからなる群より選択される哺乳動物である。別の好ま
しい実施態様において、この哺乳動物はヒトである。

【００２１】用語「ｒＰｏｒＢ」とは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからの、成熟した再
折り畳みクラス２またはクラス３外膜タンパク質、ならびにＴ７遺伝子Φ１０キ
ャプシドタンパク質のアミノ酸１〜２０または１〜２２を含む、それらの融合物
を意図する。成熟クラス２およびクラス３ｒＰｏｒＢならびにそれらの融合物の
高レベルの発現、再折り畳みおよび精製についての方法は、（４７）および米国
特許第５，４３９，８０８号（それらの開示を本明細書中で参考として援用する
）に記載される。組換えポーリンは、米国特許第５，４３９，８０８号に従って
Ｅ．ｃｏｌｉから、または０８／７９２，３０２に従って酵母から、高レベルで
発現され得る。好ましい実施態様において、クラス３ｒＰｏｒＢは、ｒＰｏｒ
Ｂをコードする遺伝子で形質転換した宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｏｍｐＡから発
現され、実質的に純粋であり、そして米国特許第５，４３９，８０８に従って再
折り畳みした。

【００２２】Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ莢膜多糖体は、当業者らに周知の方法に従って単離
され得る。Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：３６１−３
７６（１９８０）；Ｍａｒｂｕｒｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８：
５２８２（１９８６）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：１
０１１−１０１８（１９８１）；およびＢｅｕｖｅｒｙら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．４０：３９−４５（１９８３）を参照のこと。好ましい実施態様に
おいて、この生物を培養し、この培養上清を微量濾過し、そしてこの濾液を３０
０，０００分子量まで遮るフィルターに通す。次にこの透過物を、例えば１００
，０００分子量まで遮るフィルターを用いて濃縮する。次にこの１００，０００
〜３００，０００分子量材料を、メタ過ヨウ素酸のような中程度の酸化剤で酸化
し、この生成物を３０，０００分子量フィルターで濾過し、次に５，０００分子
量フィルターで濃縮し、結合体に直接使用され得るアルデヒド基を有する多糖体
を得る。好ましい多糖体は、約５，０００〜５０，０００の分子量を有する。よ
り好ましい多糖体は、約１０，０００〜５０，０００の分子量を有するが、他の
分子量の範囲も所望に応じて使用され得る。

【００２３】本発明のワクチンの莢膜多糖体−タンパク質担体結合体が幾つかの異なる方法
で生成され得ることは、当業者により理解される。多糖体をタンパク質担体に連
結する共有結合の型およびこれらを生成する手段は、当業者に周知である。これ
ら２つの部分が結合し得る化学的な方法に関する詳細は、米国特許第５，６２３
，０５７号、同第５，３７１，１９７号、同第５，１９２，５４０号、同第４，
９０２，５０６号および同第４，３５６，１７０号に見い出され得、その内容は
その全体が本明細書中に参考として援用される。概説については、Ｃｏｎｔｒｉ
ｂｕｔｉｏｎｓｔｏＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ、第１０巻、ＣｏｎｊｕｇａｔｅＶａｃｃｉｎｅｓ、Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ
およびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ編，Ｊｒ．、１９８９および（２９）を参照のこと。
１つのこのような方法は、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＧｒａｙ（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１８１：５４２−５４９（１９７７））に記載され
る還元性のアミノ化プロセスである。このプロセスは、還元末端基を有する形態
の多糖体を生成する工程、およびシアノホウ化水素イオンまたは別の還元剤の存
在下で莢膜多糖体およびｒＰｏｒＢを反応させる工程を含む。この還元基は、選
択的な加水分解または特異的な酸化的切断、あるいは両方の組み合わせにより形
成され得る。

【００２４】本発明のワクチンは、投与の経路に依存する有効な量において、Ｈｉｂ−ｒＰ
ｏｒ結合体を含む。皮下のまたは筋肉内の投与の経路が好ましいが、髄膜炎菌Ｂ
群ポーリンタンパク質、融合タンパク質または本発明のワクチンはまた、腹膜内
の、静脈内のまたは鼻腔内の経路により投与され得る。当業者は、任意の特定の
処置プロトコルについて投与される量が過度に実験することなく容易に決定され
得ることを理解する。適切な量は動物１匹あたり５〜５０μｇの範囲内にあり、
より好ましくは動物１匹あたり約１０μｇであると予想される。

【００２５】本発明のワクチンは、経口投与のためのカプセル、液体溶液、懸濁液またはエ
リキシルのような形態、または溶液または懸濁液のような滅菌液体形態で使用さ
れ得る。生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水または結合体ワクチンが適切な可
溶性の特性を有する任意のこのような担体のような、任意の不活性の担体が好ま
しく使用される。このワクチンは、単一用量調製物の形態で、または集団ワクチ
ン接種プログラムのために使用され得る複数用量フラスコ中に存在し得る。ワク
チンの調製および使用の方法についての参照は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓＰｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，Ｏｓｏｌ（編）（１９８０）；およびＮｅｗ
ＴｒｅｎｄｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎＶａｃｃｉｎｅｓ
，Ｖｏｌｌｅｒら（編）、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰａｒｋＰｒｅｓｓ，Ｂａ
ｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９７８）に対してなされる。

【００２６】本発明のワクチンは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ特異的抗体の生成を増強する
アジュバントをさらに含み得る。このようなアジュバントは、フロイント完全ア
ジュバント（ＣＦＡ）、ステアリルチロシン（ＳＴ、米国特許第４，２５８，０
２９を参照のこと）、ＭＤＰとして知られるジペプチド、サポニン、水酸化アル
ミニウムおよびリンパ球サイトカイニンのような様々な油処方物を含むがこれら
に限定されない。

【００２７】フロイントアジュバントは、免疫原性物質と混合したミネラルオイルまたは水
のエマルジョンである。フロイントアジュバントは強力であるが、通常ヒトへは
投与されない。代わりに、このアジュバントのミョウバン（水酸化アルミニウム
）またはＳＴがヒトへの投与のために使用され得る。この結合体ワクチンは、注
射後ゆっくりと放たれる水酸化アルミニウム上に吸収され得る。この結合体ワク
チンはまた、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国特許第４，２３５，８７７号に従ってリ
ポソーム内にカプセル化され得る。

【００２８】別の好ましい実施態様において、本発明の結合体は、動物にワクチン接種する
のに使用される他の免疫原と合わされる。従って、本発明の結合体は、この動物
への投与について、ＤＴａＰまたはＤＴａＰＩＰＶと合わされ得る。ＤＴａＰ
は、ジフテリア、破傷風および無細胞百日咳についての組み合わせワクチンであ
り、これはＡｍｖａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄか
ら入手可能である。好ましい実施態様において、この無細胞百日咳は、Ａｍｖａ
ｘ，Ｉｎｃ．より入手した場合、酸化した形態である。

【００２９】別の好ましい実施態様において、本発明は動物における免疫応答を誘導する方
法に関し、この方法は、免疫応答を誘導するのに有効な量で、本発明のワクチン
を動物に投与する工程を含む。必要に応じて、本発明のワクチンは、この動物に
おける多重免疫応答を生成するために、上記に言及したような他の免疫原の有効
な量とともに同時投与され得る。

【００３０】以下の実施例は、本発明の方法および組成物の例示であるが、これらと限定な
い。当該分野において通常遭遇する状況およびパラメーターの多様性の他の適切
な改変および適用は、当業者に明白であり、本発明の精神および範囲内にある。

【００３１】（実施例）（実施例１ｒＰｏｒＢ発現、単離、再折り畳みおよび精製）細菌株、増殖条件および試薬−ゲノムＤＮＡを、標準的な手順を使用して、Ｂ
群Ｎ．ｍｉｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株４４／７６（血清型１５）から単離し、その
他の場所に記載される（４７）ようにクラス３タンパク質遺伝子の増幅について
、ポリメラーゼ連鎖反応鋳型として使用した。この増幅した生成物を、コンピテ
ントＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αを形質転換するために使用したｐＥＴ１７ｂプラスミ
ド（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローン化し
た。選択したＤＨ５αクローンからのプラスミドＤＮＡを単離し、そしてＥ．ｃ
ｏｌｉＢＬ２１［ＤＥ３］−ΔｏｍｐＡを形質転換するために使用した。この形
質転換体をカルベニシリンにより選択し、そして発現を、ＩＰＴＧを０．４ｍＭ
の最終濃度まで添加することにより誘導した。

【００３２】（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｒＰｏｒＢの過剰発現および再折り畳み精製手順）。
誘導後様々な時期に発現したｒＰｏｒＢタンパク質のレベルを、この細胞抽出物
を、Ｎｏｖｅｘシステム（Ｎｏｖｅｘ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用する
８〜１６％勾配ゲルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥに供すること、続いてクーマシー
ブリリアントブルー染色およびデジタル画像処理システムＩＳ−１０００モデル
（ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃｈＣｏ．，ＳａｎＬｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）を
使用する濃度測定分析によりモニターした。この過剰発現ｒＰｏｒＢを、ＴＥＮ
緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，１００ｍＭＮａＣ
ｌ，ｐＨ８．０）中でＳｔａｎｓｔｅｄ空気駆動細胞破砕機（Ｓｔａｎｓｔｅｄ
ＦｌｕｉｄＰｏｗｅｒＬｔｄ．）を用いて、この細菌細胞を再懸濁および
溶解すること、続いて封入体（ＩＢ）の形態で凝集したｒＰｏｒＢを含むペレッ
トを遠心分離および単離することにより単離した。このペレットをＴＥＮ緩衝液
中０．５％デオキシコール酸で洗浄し、続いてＴＥＮ緩衝液で２回のリンスし、
このタンパク質を、このＩＢを再懸濁および新しく調製した８Ｍ尿素溶液中で５
分間、水浴超音波処理機を使用して超音波処理することにより可溶化した。ｒＰ
ｏｒＢをその天然のコンホメーションへと再折り畳みすることを界面活性剤補助
再折り畳み手順を使用することにより達成した。等量の尿素溶解ＩＢおよび１０
％Ｚ３−１４（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を合わせ、そしてこの最終ポーリン抽出
物を、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤ
ＴＡ、２０ｍＭＣａＣｌ₂、および０．０５％Ｚ３−１４、ｐＨ８．０からなる緩衝液中に平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００（５×１００ｃｍ）カ
ラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．）に適用した。ｒＰｏｒ
Ｂを含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プールし、そして２５ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭＮａＣｌ、１．０ｍＭＥＤＴＡおよび０．０５
％Ｚ３−１４ｐＨ８．０中で平衡化したＨｉｌｏａｄＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＨＰイオン交換（２．６×２０ｃｍ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用し
た。０．２〜１．０ｍＭＮａＣｌの勾配を適用し、そしてｒＰｏｒＢは単一の
ピークとして溶出した。タンパク質濃度を、Ｍａｃｈら（４２）に従ってＰｏｒ
Ｂ芳香族アミノ酸含有量に基づいて、計算された４１，９６０のモル吸光係数を
使用して、ダイオードアレイ検出器（Ｈｅｗｌｅｔｔ−ＰａｃｋａｒｄＣｏｍ
ｐａｎｙ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を装備したＨＰモデル８４５３ＵＶ／Ｖ
ｉｓ迅速スキャン分光光度計を使用して、２８０ｎｍでの吸収を測定することに
より見積もった。

【００３３】（実施例２ＰＲＰ多糖体生成、精製および酸化）Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型の１４Ｌ醗酵を以下のようにＭＡＥＩＩ培地
を使用して実施した。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型Ｅａｇａｎ株を超低温液
体窒素冷凍庫から４ｍＬ種培養バイアル中に入手し、室温で３０分間融解した。
５０ｍＬのＭＭＥＩＩ培地（１０ｍｇ／Ｌヘミン）を有する２５０ｍＬ振盪フラ
スコに、種Ｉ（ＳＩ）を生成するために、１ｍＬの種培養を接種した。このＳＩ
フラスコを、振盪インキュベーター（Ｉｎｎｏｖａ４３３０，ＮｅｗＢｒｕ
ｎｓｗｉｃｋＳｃｉ．）中で、３７℃で１０時間および１５０ＲＰＭでインキ
ュベートした。１２ｍＬのＳＩを使用して、ＳＩＩを生成するために２．８Ｌの
Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコ中の６００ｍＬのＭＭＥＩＩ（１０ｍｇ／Ｌヘミン）
に接種した。このＳＩＩフラスコを、振盪インキュベーター中で３７℃で９時間
および１５０ＲＰＭでインキュベートした。６００ｍＬ（４％（ｖ／ｖ）種菌）
のＳＩＩ培養を使用して、２０ＬＢＩＯＦＬＯＩＶ醗酵層（ＮｅｗＢｒｕ
ｎｓｗｉｃｋＳｃ．）中の１３．４ＬのＭＭＥＩＩ（１０ｇ／Ｌキシロース、
１０ｍｇ／Ｌヘミン）に接種した。この醗酵プロフィールの実施例を図２に示す
。１０時間の醗酵後、ポリスルホンからなる０．１４ｍ²の表面積を有すると規格化されている０．２μｍ孔サイズを有する中空繊維カートリッジ（Ｍｉｌｉｐ
ｏｒｅ）を使用して、微量濾過による収集工程を開始した。この透過物を２０Ｌ
の籠入りガラス瓶へ無菌濾過し、この籠入りガラス瓶をさらに処理されるまで２
〜８℃で静置した。次にこの濾液を３００，０００分子量遮断（ＭＷＣＯ）フィ
ルター（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を通して処理し、この透過物を保存した。次にこの
透過物を１００，０００（ＭＷＣＯ）フィルター（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）に適用し
、２０ｍｇ／ｍｌを超えるまで濃縮した。この保存物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を
、２５℃で２時間、メタ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化した。この酸化ＰＲＰを、
３０，０００ＭＷＣＯフィルター（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を通して限外濾過し、こ
の透過物を保存した。次にこの透過物を５，０００ＭＷＣＯフィルター（Ｍｉｌ
ｉｐｏｒｅ）に適用し、９０ｍｇ／ｍｌを超える最終濃度まで濃縮し、ＤＩ水に
対しダイアフィルトレーションし、そして凍結乾燥した。

【００３４】（実施例３ＰＲＰ−ＰｏｒＢ結合体の調製）結合体化に使用した精製ｒＰｏｒＢを図３に示す。これまでに記載される酸化
ＰＲＰ多糖体をｒＰｏｒＢ溶液（ｐＨ８．５の０．２５ＭＨＥＰＥＳ、０．２
ＭＮａＣｌおよび０．０５％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎ３、１４中１０ｍｇ／ｍｌ
濃度）に添加して、１０ｍｇ／ｍｌ多糖体溶液を作製した。シアノホウ化水素ナ
トリウムを６ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した後、この溶液を１分間混合した
。次にこの溶液を２８〜３０℃で、１６〜２４時間水浴に静置した。この結合体
化反応を、ｐＨ８．５で２Ｍエタノールアミン溶液の添加により停止し、そして
２８〜３０℃でさらに１６〜２４時間インキュベートした。次にこの反応混合物
をあらかじめ平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｒｅｐＧｒａｄｅカラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用し、そして０．０１％チメロサールを含むＰＢ
Ｓで流した。ＵＶ−２８０ｎｍ吸光度によりモニターされるようにこのカラムの
空隙の容積に溶出する画分を収集し、プールし、そしてそれらの分析の前まで４
℃で保存した。２つの化学分析を行って、ＰＲＰ含有量（オルシノール／塩化鉄
（ＩＩＩ）／塩酸アッセイ（５０））およびｒＰｏｒＢ含有量（クーマシータン
パク質アッセイ（５））を評価した。

【００３５】（実施例４ラットにおけるＰＲＰ−ｒＰｏｒＢ結合体の評価）１０の群における雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（４〜６週齢）に
、水酸化アルミニウム（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ，Ｓｕｐｅｒｆｏｓ，Ｄｅｎｍａ
ｒｋ）（基本的な最終アルミニウム濃度の１ｍｇ／ｍｌ）上に吸収しなかったか
、あらかじめ吸収したかのいずれかである、０．０１％チメロサールを含む０．
５ｍｌのＰＢＳ中で１０μｇの結合体化ＰＲＰを、０、２８および４９日目に皮
下注射した。０、２８、３８、４９日目に採血を実施し、５９日目にこの動物は
放血した。

【００３６】（ＥＬＩＳＡによる血清抗体測定）。ＥＬＩＳＡアッセイについて使用したヒ
ト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）結合体を
、以前に記載したとおり還元的なアミノ化により調製した。この酸化ＰＲＰ多糖
体をＨＳＡに添加し、続いて記載される（２８）とおりＮａＢＨ₃ＣＮを用いて還元した。この結合体をゲル濾過クロマトグラフィーにより単離し、そして−７
０℃で凍結乾燥保存した。ＰＲＰ特異的抗体力価を、酵素結合免疫吸着アッセイ
（ＥＬＩＳＡ）により決定した。ポリスチレン９６ウェル平底マイクロタイター
プレート（ＮＵＮＣＰｏｌｙｓｏｒｂ）（Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，
ＩＬ）をＰＢＳ（０．０１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７
．４）中、０．２５μｇ／ウェル（１００μｌ／ウェル）で、３７℃で１時間イ
ンキュベートすることによりＰＲＰ−ＨＳＡ結合体でコートし、次にＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎ（ＰＢＳ中０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄（５回）した
。続くインキュベートは全て、室温で行った。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを、必要な洗
浄全てに使用した。次にこのコートしたプレートをＰＢＳおよび０．１％（ｗ／
ｖ）Ｃａｒｎａｔｉｏｎ脱脂ドライミルクで、ＩｇＭＥＬＩＳＡについて０．
１５ｍｌ／ウェルで１時間ブロックし、続いて洗浄した。このプレート中１００
μｌ／ウェルで、２連で血清を２倍に希釈し、そして１時間インキュベートし、
続いて、洗浄した。抗体結合体（ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ラット（Ｋｉ
ｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））
を１００μｌ／ウェルで添加し、そして３０分間インキュベートし、続いて洗浄
した。１：１の色素および基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＴＭ
Ｂおよび過酸化物）を０．０５ｍｌ／ウェルで添加し、その１０分間インキュベ
ートした。次にこのペルオキシダーゼ反応を、０．０５ｍｌ／ウェルで１ＭＨ ₃ ＰＯ₄を用いて停止し、そしてこのプレートを、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉ
ｃｅｓＥｍａｘマイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃ
ｅｓ，ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，ＣＡ）上で、４５０ｎｍの波長で、参考波長とし
て６５０ｎｍを使用して読んだ。バックグラウンド吸光度を、幾つかの血清の無
い対照ウェルで決定し、そして各プレートについて平均した。各血清希釈につい
て、この平均バックグラウンド吸光度を差し引き、次いで二連の血清吸光度値を
平均した。改変したＳｃａｔｃｈａｒｄプロットを、続くデータ分析に使用した
が、ここでこの吸光度（ｙ軸）を吸光時間、希釈の逆数（ｘ軸）に対してプロッ
トした（１８、２２）。平衡および抗体過剰にしておく条件下で、各血清希釈系
列について直線を得た；この直線を、抗体力価の決定についてのｘ軸に対して推
定した。以前に決定した抗体力価を有するポジティブコントロール血清を、全て
の血清を標準化することについての参考を提供するために各プレートで使用した
が、これはプレート間のおよび日毎の変動を最小化した。このアッセイの結果を
、このＰｏｒＢ−ＰＲＰ結合体（ミョウバンを有するまたは有さない）を破傷風
トキソイドであるＣＲＭから構築した結合体と比較して、図４および５Ａ−５Ｈ
に示す。

【００３７】（実施例５Ｈｉｂ−ｒＰｏｒＢ，Ｈｉｂ−ＴＴおよび２つの市販のＨｉｂ
ワクチンの比較）Ｈｉｂ−ｒＰｏｒＢ結合体（Ｈｉｂ−ｒＰｏｒＢ−１およびＨｉｂ−ｒＰｏｒ
Ｂ−２）、Ｈｉｂ−ＴＴ（破傷風トキソイド）結合体および２つの市販のワクチ
ンである、ＬｅｄｅｒｌｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎｏ
ｆＡｍｅｒｉｃａｎＣｙａｎａｍｉｄｅＣｏｍｐａｎｙ，ＰｅａｒｌＲ
ｉｖｅｒ，ＮＹ，からのＨｂＯＣ（ＣＲＭ担体）およびＣｏｎｎａｕｇｈｔＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｗｉｆｔｗａｔｅｒ，ＰＡからのＰＲＰ
−Ｔ（破傷風トキソイド担体）を比較した。

【００３８】ラット（４〜６週齢）を、１、２８および４９日目に１０μｇの結合体化ＰＲ
Ｐ用量で免疫化した。予備免疫試料に加えて、血清試料を、２８、３８、４９お
よび５９日目に採取した。結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。ＥＬＩＳＡＩｇＧ
力価は抗多糖体抗体を参照する。

【００３９】図６Ａのデータのグラフ表示は、このＨｉｂ−ｒＰｏｒＢ結合体が、他の結合
体ワクチンのものよりも少なくとも２桁大きい反応を生成したことを示す。図６
Ｂは対応する表のデータを示す。「応答者」を上記予備免疫の４倍以上大きなＩ
ｇＧＥＬＩＳＡ力価を示すことと定義し、ここで全ての予備免疫値は＜５０で
あり、そして計算のために２５に調整した。Ｈｉｂ−ＴＴ、Ｈｉｂ−ｒＰｏｒＢ
−１およびＨｉｂ−ｒＰｏｒＢ−２を比較する類似の実験を、５．０μｇおよび
０．５μｇの抱合投薬量を使用してマウスにおいて実施した。このデータを図７
に示す。

【００４０】最後に、Ｈｉｂ−ｒＰｏｒＢ（図８のＡ〜Ｈ）の８つの異なる調製物を、Ｈｉ
ｂ−ＴＴおよびＨｉｂ−ＣＲＭ結合体と比較した。Ｈｉｂ−ｒＰｏｒＢ調製物は
、ラットにおける抗多糖体ＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡアッセイにより示されるよう
に、このＨｉｂ−ＴＴまたはＨｉｂ−ＣＲＭ結合体よりも、一貫して２桁大きい
刺激であった。このデータを図８に示す。

【００４１】今や本発明を完全に記載したが、本発明が、本発明またはこの任意の実施態様
の範囲に影響を及ぼすこと無く、条件、処方物および他のパラメーターの広くか
つ等価な範囲内で行われ得ることは、当業者らに理解される。本明細書中に引用
した全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が本明細書中に参考として
完全に援用される。

【００４２】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｔリンパ球同時刺激を表す図を示す。

【図２】Ｂ１ＨＢ１０３０醗酵プロフィールを表すグラフを示す。

【図３】結合体化に使用した精製ｒＰｏｒＢの染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。

【図４】様々な担体タンパク質とのＨｉｂ結合体についてラットにおけるＨｉｂ多糖体
特異的ＩｇＧ応答を示す棒グラフを示す。

【図５Ａ】ＥＬＩＳＡにより測定したＨｉｂ−ＴＴ、Ｈｉｂ−ｒＰｏｒＢおよびＨｉｂ−
ｒＰ２で免疫化したＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットの血清抗体を示す表を
示す。

【図５Ｂ】ＥＬＩＳＡにより測定したＨｉｂ−ＴＴ、Ｈｉｂ−ｒＰｏｒＢおよびＨｉｂ−
ｒＰ２で免疫化したＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットの血清抗体を示す表を
示す。

【図５Ｃ】ＥＬＩＳＡにより測定したＨｉｂ−ＴＴ、Ｈｉｂ−ｒＰｏｒＢおよびＨｉｂ−
ｒＰ２で免疫化したＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットの血清抗体を示す表を
示す。

【図５Ｄ】ＥＬＩＳＡにより測定したＨｉｂ−ＴＴ、Ｈｉｂ−ｒＰｏｒＢおよびＨｉｂ−
ｒＰ２で免疫化したＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットの血清抗体を示す表を
示す。

【図５Ｅ】ＥＬＩＳＡにより測定したＨｉｂ−ＴＴ、Ｈｉｂ−ｒＰｏｒＢおよびＨｉｂ−
ｒＰ２で免疫化したＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットの血清抗体を示す表を
示す。

【図５Ｆ】ＥＬＩＳＡにより測定したＨｉｂ−ＴＴ、Ｈｉｂ−ｒＰｏｒＢおよびＨｉｂ−
ｒＰ２で免疫化したＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットの血清抗体を示す表を
示す。

【図５Ｇ】ＥＬＩＳＡにより測定したＨｉｂ−ＴＴ、Ｈｉｂ−ｒＰｏｒＢおよびＨｉｂ−
ｒＰ２で免疫化したＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットの血清抗体を示す表を
示す。

【図５Ｈ】ＥＬＩＳＡにより測定したＨｉｂ−ＴＴ、Ｈｉｂ−ｒＰｏｒＢおよびＨｉｂ−
ｒＰ２で免疫化したＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットの血清抗体を示す表を
示す。

【図６Ａ】異なる担体タンパク質とのＨｉｂ結合体ワクチンについて、ラットにおけるＰ
ＲＰ特異的ＥＬＩＳＡＩｇＧ応答を示すデータを示す。２つの異なるＨｉｂ−
ｒＰｏｒＢ調製物が試験された（−１および−２）。図６Ａは、図６Ｂに示す表
で表したデータのグラフ表示である。

【図６Ｂ】異なる担体タンパク質とのＨｉｂ結合体ワクチンについて、ラットにおけるＰ
ＲＰ特異的ＥＬＩＳＡＩｇＧ応答を示すデータを示す。２つの異なるＨｉｂ−
ｒＰｏｒＢ調製物が試験された（−１および−２）。図６Ａは、図６Ｂに示す表
で表したデータのグラフ表示である。

【図７】ＣＤ−１マウスにおけるＨｉｂ結合体ワクチンにより誘発された多糖体特異的
ＩｇＧを示すグラフを示す。

【図８】ラットにおけるＨｉｂ結合体ワクチンにより誘発された多糖体特異的ＩｇＧを
示すグラフを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ミッション，フランシスアメリカ合衆国メリーランド 20814, ベセスダイースト，ローズデイルアベニュー 4401 (72)発明者ファスコ，ピーターシー. アメリカ合衆国メリーランド 20866, バートンズビル，レッドセダーレーン 4205 (72)発明者ヘロン，アイバーアメリカ合衆国メリーランド 20817, ベセスダ，ジョンソンアベニュー 5913

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型（Ｈｉｂ）多糖体と実質的
に純粋で再折り畳みした髄膜炎菌外膜タンパク質（ｒＰｏｒＢ）との結合体。
【請求項２】前記多糖体が、５，０００〜５０，０００の範囲の分子量を
有する、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】前記結合体が、Ｈｉｂ多糖体およびｒＰｏｒＢの還元的アミ
ノ化により得られ、該Ｈｉｂ多糖体が、アルデヒド基を得るために酸化または選
択的に加水分解されている、請求項１に記載の結合体。
【請求項４】前記結合体が、Ｈｉｂ多糖体およびｒＰｏｒＢの還元的アミ
ノ化により得られ、該Ｈｉｂ多糖体が、アルデヒド基を得るために酸化されてい
る、請求項１に記載の結合体。
【請求項５】前記ｒＰｏｒＢが、クラス３ｒＰｏｒＢである、請求項１〜
４のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項６】Ｈｉｂ多糖体−ｒＰｏｒＢ結合体を調製する方法であって、
以下の工程：（ａ）Ｈｉｂ多糖体を得る工程；（ｂ）該多糖体を酸化または選択的に加水分解して、アルデヒド基を得る工程；（ｃ）ｒＰｏｒＢを得る工程；および（ｄ）還元的アミノ化により、アルデヒド基を含む多糖体を、該ｒＰｏｒＢに結合体化させる工程、を包含する、方法。
【請求項７】前記Ｈｉｂ多糖体が酸化され、５，０００〜５０，０００の
範囲の分子量を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記ｒＰｏｒＢが、クラス３ｒＰｏｒＢである、請求項６〜
７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】請求項６に記載の方法に従って得た結合体。
【請求項１０】請求項８に記載の方法に従って得た結合体。
【請求項１１】請求項１または９に記載の結合体および薬学的に受容可能
な担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１２】請求項１０に記載の結合体および薬学的に受容可能な担体
を含む、薬学的組成物。
【請求項１３】動物においてＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する免疫応答
を誘導する方法であって、請求項１または９に記載の結合体を、該免疫応答を誘
導するのに有効な量、該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】動物においてＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する免疫応答
を誘導する方法であって、請求項１０に記載の結合体を、該免疫応答を誘導する
のに有効な量、該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１５】前記結合体が、Ｈｉｂ多糖体およびｒＰｏｒＢの還元的ア
ミノ化により得られ、該Ｈｉｂ多糖体が、アルデヒド基を得るために酸化されて
いる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】前記結合体が、Ｈｉｂ多糖体およびｒＰｏｒＢの還元的ア
ミノ化により得られ、該Ｈｉｂ多糖体が、アルデヒド基を得るために酸化されて
いる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】前記多糖体が、５，０００〜５０，０００の範囲の分子量
を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】前記多糖体が、５，０００〜５０，０００の範囲の分子量
を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】前記ｒＰｏｒＢが、クラス３ｒＰｏｒＢである、請求項１
３に記載の方法。