KR20010021953A - Ｂ군 수막염균 포린 및 에이치.인플루엔자 다당류를포함하는 면역원성 접합체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에이치.인플루엔자(H. influenzae) b형 다당류-수막염균 외막 단백질 접합체, 이의 약학 조성물과, 동물에서 에이치.인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

Ｂ군 수막염균 포린 및 에이치. 인플루엔자 다당류를 포함하는 면역원성 접합체{IMMUNOGENIC CONJUGATES COMPRISING A GROUP B MENINGOCOCCAL PORIN AND AN H. INFLUENZAE POLYSACCHARIDE}

헤모필러스 인플루엔자(Hemophilus influenzae)는 작은 다형성의, 그람 음성 구간균이다. 분리체는 6개의 항원적으로 구별되는 협막형(a-f)의 균주와 유형을 정할 수 없는 비협막성 균주로 분류할 수 있다. 헤모필러스 인플루엔자는 수막염, 중이염, 정맥동염, 후두개염, 패혈성 관절염, 잠재성 열성 균혈증, 봉와직염, 폐렴 및 종양을 유발할 수 있으며, 때로 이 유기체는 신생아 수막염 및 패혈증을 유발한다. 기타 에이치. 인플루엔자 감염으로는 화농성 심막염, 심내막염, 결막염, 골수염, 복막염, 고환부고환염, 설염, 구개수염 및 패혈성 혈전정맥염이 있다. 에이치. 인플루엔자 b형(Hib) 접합체를 예방 접종하기 전에 아이들에게 있어서 대부분의 침입성 질병은 b형에 의해 유발되었다. 비협막성 유기체는 신생아의 침입성 질병을 유발할 수 있다. 비협막성 균주는 중이염, 정맥동염 및 기관지염을 비롯한 상부 기도 감염을 유발하고, 폐렴을 일으킬 수 있다.

유기체의 공급원은 인간의 상부 기도이다. 전달 방식은 아마도 사람 대 사람의 직접적인 접촉, 또는 유기체를 포함하는 소적의 기도 분비물의 흡입을 통해서 인것 같다. 비협막성 균주에 의한 무증상 콜로니화가 빈번하다. 유기체는 어린이 60%∼90%의 후두로부터 회수된다. 그러나, b형 유기체에 의한 콜로니화는 백신을 처리하기 전에도 어린의 2∼5% 정도에서만 빈번하지 않게 발생하고, 널리 보급되어 있는 Hib 접합체 예방 접종으로도 그 발생이 빈번하지 않게 나타난다. 전염성의 정확한 기간은 알려져 있지 않지만 유기체가 상부 기도내에 존재하는 한 전염성이 있을 수 있다.

유효 백신의 도입 전에, Hib는 미국 및 다수의 국가내 박테리아성 수막염을 유발하는 가장 일반적인 원인이었다. 수막염 및 기타 침입성 감염은 3개월 내지 3세의 어린이에게 가장 일반적이며, 사례의 약 1/2이 12개월 미만의 유아에게서 발생하였다. 각 나라의 상이한 개체군에서 침입성 b형 질병의 연령 특이적 발병은 다양하였다. 12개월 미만의 유아에서의 질병 비율은 최대 총 발병률을 나타내는 개체군에서 최대인 경향이 있으며, 그 결과 사례의 평균 연령이 더 낮아진다. 수막염 및 대부분의 기타 침입성 Hib 질병과는 대조적으로, 후두개염은 12 개월 미만의 유아에게는 잘 발병하지 않는다. 이 질병은 예방 접종하기 전 2∼4세에 발생률이 가장 높다. 후두개염은 더 나이가 많은 예방접종하지 않은 어린이 및 성인에게도 발생할 수 있다.

침입성 질병은 소년, 아프리카-아메리카인, 알라스카 에스키모인, 아파치 및 나바조 인디안, 어린이 보호 센터 출석자, 과밀집 상황에 사는 어린이 및 모유를 먹지 않은 어린이에게서 더욱 빈번하게 발생하였다. 면역화되지 않은 어린이, 특히 침입성 Hib 질병이 있는 어린이와 장기간 닫힌 곳에서의 접촉(예, 가구내에서)된 4세 미만의 어린이는 이 유기체로부터 중증 감염될 위험이 커진다. 침입성 질병에 대한 소인이 되는 기타 인자로는 겸상 세포 질병, 비장결손증, HIV 감염, 특정 면역결핍 증후군 및 악성종양일 수 있다. 연속적으로 예방 접종하지 않으면 기록된 침입성 감염된 1세 미만의 유아는 약 1%의 재발 위험이 있다.

Hib 접합체 백신이 도입된 1988년 이래로, 침입성 Hib 질병의 발병율은 유아 및 어린이에서 95%로 감소하였고, 기타 협막형에 의해 유발되는 침입성 감염의 발병율은 b형이 유발하는 것과 유사하다. 이러한 성공 결과로서, 미국 공중보건국은 미국내 5세 미만의 어린이에게서 Hib 질병을 제거하기로 목표를 세웠다. 침입성 Hib 질병은 현재 미국에서 과소 예방 접종된 어린이와 너무 어려서 1차 계열의 예방접종을 완성하지 못한 유아에게 주로 발생한다.

4개의 Hib 접합체 백신이 미국에서 허가를 받았다. 이들 백신은 담체 단백질에 직접 공유 결합되거나 또는 개재된 스페이서 분자를 통해 공유 결합된 Hib 협막 다당류(즉, 폴리리보실리보톨 포스페이트[PRP] 또는 PRP 올리고머)로 구성된다. 보호성 항체는 조성 및 면역원성이 다른 PRP 접합체 백신에 대해 유도되고, 결과적으로 사용을 위한 권장사항이 다르다. 예를 들어, PRP-D는 12개월 이상의 어린이를 위해서만 사용권장되는 반면, 기타 3개의 백신, 즉 HbOC, PRP-T 및 RPR-OMP는 2개월부터의 유아에게 권장된다.

보조제는 항원에 대한 면역 반응을 증대시키는 물질이므로, 다수의 백신 및 백신 후보에 사용된다. 보조제는 항원의 여러 상이한 유형에 대하여 면역반응을 추가 자극하기 때문에 보조제의 면역 자극 효과는 항원 특이적이지 않다. FDA가 인간에게 사용해도 좋다고 현재 동의한 유일한 보조제는 알루미늄염이지만, 동물 예방 접종 및 신규의 백신 후보로 사용되는 여러 보조제는 기원이 미생물인 것(61), 예컨대 프로인트 보조제, 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum), 무라밀 디펩티드, 파상풍 톡소이드 등이 있다. 미생물 물질의 면역강화 능력에 대한 기작은 알려져 있지 않다.

병원성 나이세리아속[나이세리아 고노르호에(Neisseria gonorrhoeae) 및 나이세리 멘인기티디스(Neisseria meningitidis)]의 주요 외막 단백질을 보조제 가능성(36, 37, 39, 40, 60) 및 그의 면역강화력 이면의 기작에 대해 조사하였다. 해당 단백질은 임균의 단백질 IA(PIA) 및 단백질 IB(PIB)와 수막염균의 클래스 1, 2 또는 3(각각 C1, C2 및 C3)이다(4). 이들은 모두 포린으로서 기능하고(41, 42, 62), 서로 상당한 아미노산 서열 상동성이 있으며(6, 7, 21, 59), 그람 음성 포린 상과의 일부로 생각된다(26).

말라리아 펩티드와 비공유적으로 복합된 경우 나이세리아의 포린은, 펩티드를 단독으로 또는 기타 포린과 공유 결합된 면역원으로서 사용한 경우와 비교하여 펩티드에 대한 항체 반응을 증가시키는 것으로 나타났다(39, 40). 또한, A군 스트렙토코커스(38), 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소(38), 또는 트리파노섬 부루세이(Trypanosome bruceii)(40)에서 유도된 펩티드는, 마우스를 펩티드 단독으로 면역화시킨 경우와 비교하여 나이세리아 포린을 포함하는 복합체내로 병입시켰을 때 마우스에서 더욱 면역원성을 나타내는 것으로 확인되었다. 주로 클래스 2 단백질로 구성된 수막염균의 외막 소포(OMV)는 Merck등이 개발한 최근 허가된 에이치.인플루엔자 b형 백신내에서 에이치. 인플루엔자 다당류 캡슐에 대한 면역 반응을 추가자극하기 위한 담체로서 사용하였다. 또한, Livingstone은 흑색종 억제 백신내 보조제로서 정제된 나이세리아 포린의 용도에 대해 검사하였다. 흑색종 세포는 정상 흑색 세포와 비교하여 표면상의 인간의 강글리오시드 GM2 또는 GD3을 휠씬 더 다량으로 발현한다. GM2 및 GD3에 대한 면역반응을 증대시키고, 가능하게는 흑색종 환자의 종양 면역성을 유도하기 위해서, GM2 및 GD3를 정제된 나이세리아 포린과 비공유적으로 회합시키고, 악성 흑생종이 있는 지원자를 백신 작제물로 면역화시켰다. 항GM2 또는 항GD3 항체 반응은 단독 또는 BCG와 복합된 강글리오시드로 면역화시킨 환자와 비교하여 포린/GM2 또는 포린/GD3 복합체로 면역화시킨 환자에서 상당히 증가하였다(36, 37). 또한, 포린/GM2로 면역화시킨 환자에서 종양 적재량은 상당히 감소하였다(개인적인 연락, P. Livingstone).

나이세리아 포린이 보조제로서 작용하는 기작은 알려져있지 않다. 헤모필러스 다당류 협막-수막염균 OMV 접합체 백신을 개발한 Merck(10, 35, 56)의 그룹은, 클래스 2 단백질에 의한 직접적인 T 세포 자극에 기인할 수도 있다고 생각했다. 이들은 클래스 2 단백질이 직접적으로 T 림프구를 자극한다는 것을 초기에 입증하였고, 따라서 이들 클래스 2 단백질을 수막염균 면역 증강 단백질(MIEP)로서 재명명하였다(35). 그러나, 후에 고 농도(>50 ㎍)에서 단지 변성된 클래스 2 단백질이 T 세포를 자극하지만 천연 단백질은 아무런 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다(56). 또한, 대부분의 나이세리아 포린이 백신 후보 또는 보조제로서 사용될 때 천연 구조이기 때문에, 변성된 포린에 의한 비특이적 T 세포 자극이 면역강화력을 설명할 수 있는 가능성은 적다.

지난 몇년 동안, 항원 인식, 림프구 자극 및 항체 생성에 필요한 T 림프구 및 B 림프구 간의 상호 작용에 관한 세부 사항이 해명되었다. T 림프구 자극의 현재 모델에서, 항원 공여 세포(APC) 및 T 림프구 간의 2개의 시그널 세트가 필요한 것으로 확인되었다(24, 25, 51). 제1 시그널(시그널 1)은 항원 공여 세포(예, B 림프구, 수상돌기, 대식 세포 등)상의 주요 조직적합성(MHC) 복합체와 T 림프구상의 T 세포 수용체간의 상호작용을 통해 전달된다. MHC 복합체상의 홈은 일반적으로 프로세싱된 항원(T 세포 에피토프)으로부터 유도된 올리고펩티드가 점유한다. 반응의 특이성은 시그널 1이 부여한다. 제2 또는 동시자극 시그널(시그널 2)은 B 림프구 및 T 림프구간의 상호작용 동안 2 세트의 반대수용체를 결합시켜 전달한다(도 1). 이어서, 활성화된 T 림프구가 시토킨을 방출하여, 예컨대 B 림프구가 항체 생성 세포가 되도록 하는 효과기 세포를 자극한다. 반대 수용체의 상호작용에 의한 동시자극 유도는 종양 면역성(1,3,8,11,51,55), 용인성 보호(19, 45, 54) 및 세포독성 림프구 활성(1)에 중요한 것으로 보인다.

T 림프구 반대 수용체는 CD28 및 CTLA-4이다. 이들은 모두 면역글로불린 상과의 구성원이다(9). CD28은 휴지 세포 및 활성화된 T 세포에 존재하지만(1, 8, 27, 30, 32, 34, 46), CTLA-4는 활성화된 T 세포에서만 발현한다(17, 23, 31, 33, 51). 활성화된 T 세포상의 CD28의 레벨은 CTLA-4보다 20배 높지만, B 세포 반대 수용체에 대한 CD28의 친화도는 휠씬 낮다(31, 33). B 림프구 반대수용체는 B7이고(14,20,32,48,49), 더 최근에는 B7-2가 발견되었다(2,12,13,16,24). B7 및 B7-2는 면역글로불린 상과의 구성원이고(13-15), 활성화된 B 림프구에만 존재한다(14). 몇몇 증거가 T 림프구 동시자극에 대한 신규한 리간드 B7-2의 관계를 입증한다: 1) 활성화된 B 세포에 대한 CTLA-4 결합은 항-B7 모노클론 항체(mAb)에 의해 부분적으로만 억제된다(24). 2) B7 발현이 결핍된 마우스로부터 유도된 림프구는 여전히 T 세포를 동시자극할 수 있다(12, 13). 3) B7-2만을 발현하는 형질전환체는 T 세포를 자극할 수 있다(13,16). 4) B7-2에 특이적인 mAb는 B 세포(24)에 의해 또는 B7-2 형질전환체(13)에 의해 T 림프구 동시자극을 억제할 수 있다. 동시자극 반대 수용체로서 초기에 개시된 B7 항원의 중요성에 대해서는 논쟁의 여지가 있는데, 그 이유는 B7-2의 발현이 B7 발현보다 휠씬 초기에 발생하고, B7 보다는 활성화된 B 림프구의 표면에서 B7-2가 더 많이 존재하기 때문이다(24). T 림프구 동시자극 및 동시자극성 반대 수용체의 개략적인 표시가 도 1에 도시되어 있다.

미생물 생성물이 B 림프구를 자극할 수 있다는 각종 조사자에 의해 제공된 예비적인 증거가 있다. Liu 등은 리포다당류(LPS), 미토젠 인플루엔자 바이러스 및 바이러스 감염을 모방하는 항원(폴리이노신-폴리시티딜산)은 모두 B 림프구를 자극하고, 따라서 T 림프구를 자극한다는 것을 입증하였다(25). Vordermeier는 정제된 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 포린(LPS 없음)이 유효한 B 세포 자극인자이지만, T 림프구에 대한 효과는 최소라는 것을 입증하였다(57,58). 또한, 주로 수막염균 포린으로 구성된 수막염균의 외막 제제는 B 세포 미토젠으로 작용하고 T 림프구를 자극하지 않는다(44,52,53). 이러한 증거는 나이세리아 포린 및 가능하게는 기타 그람 음성 포린이 B 림프구를 자극시킬 수 있고 B7-2 발현을 증가시킬 수 있다는 것을 제안한다. B7-2의 증가된 발현은 T 림프구 동시자극을 매개하고, 포린이 여기에 제공된 PRP 다당류와 같은 기타 항원에 대한 면역반응을 증가시키는 기작일 수 있다.

본 발명은 동물에서 면역반응을 상승시키는데 유용한 백신에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 에이치. 인플루엔자(H. influenzae) 다당류-엔. 메닌기티디스(N.miningitidis) 외막 단백질 접합체, 약학 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

도 1은 T-림프구 동시자극을 그림으로 도시한 것이다.

도 2는 B1HB 1030 발효 프로필을 나타내는 그래프이다.

도 3은 접합체에 대해 사용된 정제된 rPorB의 염색된 SDS-PAGE 겔을 도시한 것이다.

도 4는 각종 담체 단백질과 Hib 접합체에 대한 래트내에서의 Hib 다당류 특이적 IgG 반응을 보여주는 막대 그래프를 도시한 것이다.

도 5a-도 5h는 ELISA에 의해 측정된 Hib-TT, Hib-rPorB 및 Hib-rP2로 면역화시킨 Sprague Dawley 래트의 혈청 항체를 보여주는 표를 도시한 것이다.

도 6a 및 6b는 상이한 담체 단백질과 Hib 접합체 백신에 대한 래트에서의 PRP 특이적 ELISA IgG 반응을 보여주는 자료를 도시한 것이다. 2개의 상이한 Hib-rPorB 제제를 시험하였다(-1 및 -2). 도 6a는 도 6b에 도시된 표 데이타를 그래프로 표시한 것이다.

도 7은 CD-1 마우스에서 Hib 접합체 백신에 의해 유발되는 다당류 특이적 IgG를 보여주는 그래피를 도시한 것이다.

도 8은 래트에서 Hib 접합체 백신이 유발하는 다당류 특이적 IgG를 보여주는 그래프를 도시한 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 약학적 허용 희석제, 담체 또는 부형제와 함께 Hib 다당류에 결합된 외막 수막염균 B군 포린 단백질을 포함하는, 동물에서 면역 반응을 유도하기 위한 백신에 관한 것으로서, 동물에서 에이치.인플루엔자에 대한 면역 반응을 유발하기 위한 유효량으로 백신을 투여할 수 있다. 바람직한 양태에서, 동물은 인간, 소, 돼지, 양, 및 닭으로 구성된 군에서 선택된 포유류이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 포유류는 인간이다.

"rPorB"는 T7 유전자 φ10 캡시드 단백질의 아미노산 1∼20 또는 1∼22를 포함하는 엔.멘인기티디스 및 이의 융합체에서 유래한 성숙한 재중첩 클래스 2 또는 클래스 3 외막 단백질이다. 성숙 클래스 2 및 클래스 3 rPorB와 이의 융합체의 다량 발현, 재중첩 및 정제 방법이 본원에서 참고로 인용한 (47) 및 미국 특허 제5,439,808호에 개시되어 있다. 재조합 포린은 미국 특허 제5,439,808호에 따라 이.콜리로부터 또는 08/792,302에 따라 효모로부터 다량 발현시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, 클래스 3 rPorB는 rPorB에 대해 암호화하는 유전자로 형질전환된 숙주 BL21(DE3)ΔompA로부터 발현시킬 수 있고, 실질적으로 순수하며, 미국 특허 제5,439,808호에 따라 재중첩시킨다.

에이치.인플루엔자 협막 다당류는 당업계에 공지된 방법에 따라 분리할 수 있다. Schneerson et al., J.Exp.Med. 152:361-376(1980); Marburg et al. J.Am.Chem.Soc. 108:5282(1986); Jennings et al., J.Immunol. 127:1011-1018(1981); 및 Beuvery et al., Infect. Immunol.40:39-45(1983) 참고. 바람직한 양태에서, 유기체를 배양하고, 배양 상청액을 미세여과하고, 여과물을 300,000 분자량 분급 필터에 통과시킨다. 그 다음, 예컨대 100,000 분자량 분급 필터로 침투물을 여과시킨다. 100,000 내지 300,000 분자량 물질을 메타페리오데이트와 같은 온화한 산화제로 산화시키고 생성물을 30,000 분자량 필터를 통해 여과시킨 다음 5,000 분자량 필터로 농축시켜 접합에 직접 사용할 수 있는 알데히드기를 가진 다당류를 제공한다. 바람직한 다당류는 분자량이 약 5,000∼50,000이다. 더욱 바람직한 다당류의 분자량은 약 10,000 내지 50,000이지만, 필요에 따라 기타 분자량 범위를 사용할 수 있다.

백신의 협막 다당류 단백질 담체 접합체를 일부 상이한 방법으로 생성할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 단백질 담체에 다당류를 커플링시키는 공유 결합의 유형과 이를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 2 부분을 결합시킬 수 있는 화학적 수단에 관한 상세한 설명은 본원에서 그 전문을 참고로 인용한 미국 특허 제5,623,057호, 제5,371,197호, 제5,192,540호, 제4,902,506호 및 제4,356,170호에 개시되어 있다. 검토를 위해서, Microbiology and Immunology, vol10, Conjugate Vaccines, volume editors J.M. Cruse and R.E.Lewis, Jr., 1989, 및 (29) 참조. 이러한 한 방법은 Schwartz 및 Gray의 문헌[Arch.Biochim.Biophys. 181:542-549 (1977)]에 개시된 환원성 아민화 과정이다. 이 과정은 환원성 말단기를 가지는 형태로 다당류를 생성하는 단계, 및 시아노보로하이드리드 이온 또는 또 다른 환원제의 존재하에 협막성 다당류와 rPorB를 반응시키는 단계를 포함한다. 환원성 기는 선택적 가수분해 또는 특이적 산화성 절단, 또는 이 둘의 조합으로 형성할 수 있다.

본 발명의 백신은 투여 경로에 따라 유효량의 Hib-rPor 접합체를 포함한다. 피하 또는 근육내 투여 경로가 바람직하지만, 본 발명의 수막염균 B 포린 단백질, 융합 단백질 또는 백신은 복강내, 정맥내, 또는 비강내 경로로 투여할 수 있다. 당업자라면 임의의 특정 프로토콜에 대해 투여하고자 하는 양을 과도한 실험없이 쉽게 결정할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 적절한 양은 동물 1 마리당 5∼50 ㎍, 더욱 바람직하게는 약 10 ㎍로 예상된다.

본 발명의 백신은 경구 투여용 캡슐, 액상 용액, 현탁액 또는 엘릭시르와 같은 형태나, 용액 또는 현탁액과 같은 무균 액상 형태로 사용할 수 있다. 임의의 불활성 담체로는 염수, 인산염 완충 염수, 또는 접합체 백신이 적절한 가용성 특성을 가질 수 있는 임의의 담체가 있다. 백신은 대량 예방 접종 프로그램에 사용할 수 있는 단일 용량 제제 또는 다용량 플라스크의 형태일 수 있다. 백신 제조 및 사용 방법에 대해서 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, Osol(ed.)(1980); 및 New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al. (eds.), University Park Press, Baltimore, MD(1978).

본 발명의 백신은 에이치.인플루엔자 특이적 항체 생성을 증가시키는 보조제를 더 포함한다. 이러한 보조제의 비제한적인 예로는, 각종 오일성 제제, 예컨대 프로인트 완전 보조제(CFA), 스테아릴 티로신(ST, 미국 특허 제4,258,029호), MDP로 알려진 디펩티드, 사포닌, 수산화알루미늄 및 림프 시토킨이 있다.

프로인트 보조제는 면역원성 물질과 혼합된 광유 및 물의 유화액이다. 프로인트 보조제는 강력하지만, 일반적으로 인간에게 투여하지 않는다. 대신, 보조제 명반(수산화알루미늄) 또는 ST를 인간에 대한 투여에 사용할 수 있다. 접합체 백신은 수산화알루미늄상에 흡수시켜 주사후에 서서히 방출시킬 수 있다. 접합체 백신은 미국 특허 제4,235,877호(Fullerton)에 개시된 리포좀내에 캡슐화시킬 수 있다.

또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 접합체는 동물을 예방 접종하는데 사용된 기타 면역원과 조합한다. 따라서, 본 발명의 접합체는 동물에게 투여하기 위한 DTaP 또는 DTaP IPV와 조합할 수 있다. DTaP는 디프테리아, 파상풍 및 무세포성 백일해에 대한 조합 백신이며, 미국 메릴랜드주 벨츠빌에 소재하는 아메박스 인코포레이티드로부터 입수할 수 있다. 바람직한 양태에서, 무세포성 백일해는 산화된 형태이며 아메박스 인코포레이티드에서 입수할 수 있다.

또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 면역 반응을 유도하기 위한 유효량으로 본 발명의 백신을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여 동물에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 임의적으로, 본 발명의 백신은 전술한 기타 면역원의 유효량을 동시 투여하여 동물에서 다중 면역 반응을 생성할 수 있다.

다음 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 예시하기 위한 것이나, 이에 국한되는 것은 아니다. 당업자들에게는 자명한, 당업계에서 일반적인 각종 조건 및 매개변수의 기타 적절한 변형 및 개조는 본 발명의 범위 및 취지내에 있다.

발명의 개요

본 발명은 에이치.인플루엔자 b형(Hib) 다당류와 실질적으로 순수하고 재중첩된 수막염균 외막 단백질(rPorB)의 접합체에 관한 것이다.

본 발명은

(a) Hib 다당류를 얻는 단계;

(b) 다당류를 산화시키거나 또는 선택적으로 가수분해하여 알데히드기를 생성하는 단계;

(c) rPorB를 얻는 단계; 및

(d) 환원성 아민화로 rPorB에 알데히드기를 포함하는 다당류를 접합시키는 단계를 포함하여 Hib 다당류-rPorB 접합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따라 얻은 접합체에 관한 것이다. 임의적으로, 본 발명의 접합체는 DTaP(디프테리아, 파상풍, 무세포성 백일해 백신)과 조합하였다.

또한, 본 발명은 DTaP를 임의적으로 포함하는 본 발명의 접합체와 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 면역 반응을 유도하기에 유효한 양으로 동물에게 본 발명의 접합체를 투여하는 단계를 포함하여 에이치.인플루엔자에 대한 동물의 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 Hib-rPorB 접합체가, 에이치.인플루엔자 유래의 재조합적으로 생성된 외막 P2 단백질 및 파상풍 독소가 항원 단백질로서 사용된 경우와 비교한 경우 동물에서 실질적으로 더 큰 면역 반응을 유도한다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 레더레 래보러터리즈(미국 뉴욕주 펄 리버에 소재한 디비젼 오브 아메리칸 시안아미드 캄파니)에서 입수가능한 Hib-CRM 접합체와 비교하여 실질적으로 더 큰 면역원성 반응을 얻었다. CRM₁₉₇은 코르네박테리움 디프테리아 C7(β197)의 배양물로부터 분리된 디프테리아 톡신의 부위 돌연변이, 비독성 변형체이다. Seid, R.C. Jr. et al., Glycoconj. J. 6: 489-498 (1989).

또한, 본 발명의 접합체는 성분 사이의 면역학적 상호작용 뿐 아니라 에피토프 억제로서 DTaP를 포함하는 조성물에 특히 유용할 뿐 아니라, 파상풍 톡소이드와 같은 종래의 담체 단백질과 함께 관찰된다. 본 발명의 접합체는 조합 백신 조성물에서의 심각한 한계를 극복한다.

실시예 1 rPorB 발현, 분리, 재중첩 및 정제

박테리아 균주, 증식 조건, 및 시약

게놈 DNA는 표준 절차를 사용한 B군 엔.멘인기티디스 균주 44/76(혈청형 15)로부터 분리하고, 전술한 클래스 3 단백질 유전자의 증폭에 대한 폴리머라제 연쇄 반응 주형으로서 사용하였다(47). 증폭된 생성물은 콤피턴트 이.콜리 DH5α를 형질전환시키는데 사용한 pET17b 플라스미드(노바겐 인코포레이티드)의 NdeI 및 XhoI 부위내로 클로닝하였다. 선택된 DH5α클론으로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 이를 사용하여 이.콜리 BL21[DE3]-ΔompA를 형질전환시켰다. 형질전환체를 카르베니실린으로 선별하고, 0.4 mm의 최종 농도로 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다.

이.콜리내 PorB의 과발현 및 재중첩 정제 과정

유도 후에 각종 시점에서 발현된 rPorB 단백질의 양은, Novex계(미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 노벡스에서 입수가능)를 사용하여 세포 추출물을 8∼16% 구배 겔내 SDS-PAGE한 다음, 코마씨 브릴리언트 블루 염색하고, 디지탈 영상계 모델 IS-1000(미국 캘리포니아주 샌 레안드로에 소재하는 알파 인노텍크 캄파니)를 사용하여 농도분석함으로써 모니터링하였다. 과발현된 rPorB는 TEN 완충액(50 mm 트리스-HCl, 1 mm EDTA, 100 mm NaCl, pH8.0)내 스탠스티드 공기 추진된 세포 분쇄기(스탠스티드 플루이드 파워 리미티드)로 박테리아 세포를 재현탁 및 용해시켜 분리한 다음, 봉입체(IB)의 형태로 집합된 rPorB를 포함하는 펠렛을 원심분리 및 분리하였다. TEN 완충액내 0.5% 데옥시콜레이트로 펠렛을 세척한 후에, TEN 완충액으로 2회 세정하고, 수조 초음파기를 사용하여 5 분 동안 새로 제조된 8M 우레아 용액내 IB를 재현탁 및 초음파처리하여 단백질을 용해시켰다. 세정제 보조된 재중첩 과정을 사용하여 rPorB를 천연 구조로 재중첩하였다. 동부피의 우레아 용해된 IB 및 10% Z3-4(칼비오켐)을 혼합하고, 100 mm 트리스 HCl, 200 mm NaCl, 10 mm EDTA, 20 mm CaCl₂, 및 0.05% Z3-14 pH8.0으로 구성된 완충액내에서 평형화시킨 세파크릴 S-100(5 ×100 cm) 컬럼(파마시아 바이오텍 인코포레이티드)에 최종 포린 추출물을 가하였다. rPorB를 포함하는 분획물을 SDS-PAGE로 확인하고, 모은 다음, 25 mm 트리스 HCl, 200 mm NaCl, 1.0 mm EDTA, 및 0.05% Z3-14 pH8.0으로 평형화시킨 힐로드 Q-세파로스 HP 이온 교환(2.6 ×20 cm) 컬럼(파마시아)에 가하였다. 0.2∼1.0 mm NaCl 구배를 적용하고, 단일 피크로서 rPorB를 용출시켰다. 다이오드 어레이 검출기가 장착된 HP 모델 8453 UV/가시광선 고속 스캔 분광분석기(미국 캘리포니아 팔로알토에 소재하는 휴렛 팩커드 캄파니)를 이용하고, Mach 등의 문헌(42)에 따라 PorB 방향족 아미노산 함량을 기초로 계산한 41,960의 흡광계수를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 단백질 농도를 추정하였다.

실시예 2 PRP 다당류 생성, 정제 및 산화

에이치.인플루엔자 B형 14ℓ를 다음과 같이 MAE II 배지를 사용하여 발효시켰다. 에이치.인플루엔자 B형 균주 Eagan을 극저 액체 질소 냉동기로부터 4 ㎖ 종자 배양물 바이알내에 얻고, 실온에서 30분 동안 해동시켰다. MME II 배지(10 ㎎/ℓ 헤민) 50 ㎖가 있는 250 ㎖ 진탕 플라스크에 종자 배양물 1 ㎖를 접종하여 종자 I(SI)을 얻었다. SI 플라스크는 진탕 항온기(인노바 4330, 뉴 브룬스위크 사이언스)내 37℃ 및 150 RPM에서 10 시간 동안 항온처리하였다. SI 12 ㎖를 사용하여 2.8 ℓ페른배치 플라스크내 MME II(10 ㎎/1-헤민) 600 ㎖를 접종하여 S11을 생성하였다. S11 플라스크는 진탕 항온기내에서 37℃ 및 150 RPM하에 9 시간 동안 항온처리하였다. S11 배양물 600 ㎖[4%(v/v) 접종]를 사용하여 20 ℓ BIOFLO IV 발효기(뉴 브룬스위크 사이언스)내 MME II(10 g/ℓ 크실로스, 10 ㎎/ℓ 헤민) 13.4 ℓ를 접종하였다. 발효 프로필의 예는 도 2에 도시되어 있다. 10시간 발효한 후에, 폴리설폰(밀리포어)으로 된 0.14 m²표면적으로 분류한 기공 크기가 0.2 ㎛인 중공 섬유 카트리지를 사용하여 미소여과에 의한 수거를 개시하였다. 침투물은 20 ℓ용기내로 무균여과하고, 용기를 추가의 처리시까지 2∼8 ℃에 두었다. 그 다음 여과물을 300,000 MWCO 필터(밀리포어)를 통해 한외여과시키고 침투물을 보유하였다. 이 침투물을 100,000(MWCO) 필터(밀리포어)에 가하고 20 ㎎/㎖ 이상으로 농축시켰다. 보유물을 나트륨 메타페리오데이트로 2 시간 동안 25℃에서 산화시켰다. 산화된 PRP는 30,000 MWCO 필터(밀리포어)를 통해 한외여과시키고, 침투물을 보유하였다. 그 다음 이 침투물을 5,000 MWCO 필터(밀리포어)에 가하고, 90 ㎎/㎖ 이상의 최종 농도로 농축한 다음, DI수에 대해 다이아필터레이션하고(diafiltrate), 동결건조하였다.

실시예 3 PRP-PorB 접합체 제제

접합을 위해서 사용된 정제된 rPorB는 도 3에 도시되어 있다. 미리 산화시킨 PRP 다당류를 rPorB 용액(0.25 M HEPES, 0.2 M NaCl 및 pH 8.5의 0.05% 쯔비터겐 3, 14 중 10 ㎎/㎖ 농도)에 첨가하여 10 ㎎/㎖ 다당류 용액을 만들었다. 용액을 1분 동안 혼합한 다음 나트륨 시아노보로히드리드를 6 ㎎/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 용액을 16∼24 시간 동안 28∼30 ℃에서 수조에 두었다. pH8.5에서 2M 에탄올아민 용액을 첨가하여 접합 반응은 정지시키고, 추가의 16∼24 시간 동안 28∼30℃에서 항온처리하였다. 그 다음 반응 혼합물을 미리평형화시킨 슈퍼덱스 200 예비 등급 컬럼(파마시아)에 가하고 0.01 % 치메로살을 함유하는 PBS로 흘려보냈다. UV-280 nm 흡광도에 의해 모니터링하면서 이 컬럼의 공극 부피내에서 유출시킨 분획물을 수거하고, 모은 다음 분석하기 전에 4℃에서 저장하였다. 2가지 화학 분석을 수행하여 PRP 함량(오르시놀/염화철/염산 분석(50)) 및 rPorB 함량(쿠마씨 단백질 분석(5))을 평가하였다.

실시예 4 래트에서 PRP-rPorB 접합체의 평가

10군의 암컷 Spargue-Dawley 래트(4∼6 주령)에게, 0일, 28일 및 49일에 수산화알루미늄(알히드로겔, 수퍼포스, 덴마크)(최종 원소 알루미늄 농도 1 ㎎/㎖)상에서 미흡수되거나 또는 미리흡수된 0.01% 치메로살을 함유하는 PBS 0.5 ㎖내 접합된 PRP 10 ㎍을 피하주사하였다. 0일, 28일, 38일, 49일에 방혈시키고, 59일째에 동물을 빈혈상태로 만들었다.

ELISA에 의한 혈청 항체 측정

ELISA를 위해 사용된 인간 혈청 알부민(HSA)(미조리주 세인트루이스주 시그마) 접합체를 전술한 바와 같은 환원성 아민화로 제조하였다. 산화된 PRP 다당류를 HSA에 첨가한 다음 전술한 바와 같이 NaBH₃CN으로 환원시켰다(28). 접합체를 겔 여과 크로마토그래피로 분리하고, -70℃에서 냉동건조하여 저장하였다. PRP 특이적 항체 역가를 효소 결합된 면역흡착 분석(ELISA)으로 측정하였다. 37℃에서 1 시간 동안 항온처리한 다음 PSB-트윈(PBS중 0.05%[v/v] 트윈 20)으로 세척(5회)함으로써 폴리스티렌로 된 96-웰의 평편한 하부가 있는 평판(NUNC 폴리소르브)(미국 일리노이주 네이퍼빌에 소재하는 눈크)을 PBS(0.01 M 인산나트륨, 0.15 M NaCl, pH7.4)에서 중 PRP-HSA 접합체를 사용하여 0.25 ㎍/웰(100 ㎍/웰)로 코팅하였다. 모든 후속 항온처리를 실온에서 수행하였다. PBS-트윈은 모든 필요한 세척에 사용하였다. 코팅된 평판을 1시간 동안 0.15 ㎖/웰에서 IgM ELISA에 대해 PBS 및 0.1%(w/v) 카네이션 탈지 건유로 차단한 다음 세척하였다. 혈청을 100 ㎍/웰에서 평판내 2배로 이중 희석하고 1시간 동안 항온처리한 다음, 세척하였다. 항체 접합체(퍼옥시다제 표지된 염소 항래트)[미국 매릴랜드주 게티스버그 Kirkegaard & Perry Lab]를 100 ㎍/웰로 첨가하고 30분 동안 항온처리한 다음 세척하였다. 1:1 염료 대 기질 용액(Kirkegaard & Perry TMB 및 퍼옥시드)를 0.05 ㎖/웰로 첨가하고 10분 동안 항온처리하였다. 퍼옥시다제 반응을 0.05 ㎖/웰에서 1 M H₃PO₄로 정지시키고, 기준 파장으로서 650 nm를 사용하여 450 nm 파장에서 Molecular Devices Emax 미량평판 판독기(미국 캘리포니아주 멘로 파크 몰리큘라 디바이스)상에서 평판을 판독하였다. 일부 무혈청 대조웰에서 배경 흡광도를 측정하였고 각 평판에 대해 평균하였다. 각 혈청 희석액에 대해, 평균 배경 흡광도를 감한 다음, 이중 혈청 흡광도 값을 평균하였다. 흡광도(y축)는 흡광도와 희석율 역수의 곱(x 축)에 대해 플롯한 변형된 스캐치하드 플롯을 후속 데이타 분석에 사용하였다(18,22). 평형 및 과량의 항체의 조건하에서, 직선은 일련의 각 혈청 희석액에 대해 얻었다. 이 직선은 항체 역가를 측정하기 위해서 x-축에 대해 외삽하였다. 모든 혈청을 표준화한 기준을 제공하기 위해서 항체 역가를 미리 측정한 양성 대조군 혈청을 각 평판에서 사용하여 평판 대 평판 및 일수 대 일수의 편차를 최소화하였다. 이들 분석의 결과는, PorB-PRP 접합체(명반의 존재 및 부재하에)와 파상풍 톡소이드 CRM으로부터 작제된 접합체를 비교하여 도 4 및 도 5a 내지 도 5h에 도시하였다.

실시예 5 Hib-rPorB, Hib-TT 및 2개의 시판용 Hib 백신의 비교

2개의 제제, 즉 Hib-rPorB 접합체(Hib-rPorB-1 및 Hib-rPorB-2), Hib-TT(파상풍 톡소이드) 접합체와, 2개의 시판용 백신, 즉 미국 뉴욕주 펄 리버 디비즌 오브 아메리칸 시안아미드 캄파니, 레덜 래보러터리즈에서 입수가능한 HbOC(CRM 담체) 및 미국 펜실베니아 스위프트워터에 소재하는 콘너프트 래보러터리즈 인코포레이티드에서 입수가능한 PRP-T(파상풍 톡소이드 담체)의 면역 자극 효과를 비교하였다.

래트(4∼6 주령)를 1일, 28일 및 49일에 10 ㎍ 용량의 접합된 PRP로 면역화시켰다. 예비면역 시료외에, 혈청 시료를 28일, 38일, 49일 및 59일에 취하였다. 결과는 도 6a 및 6b에 제시되어 있다. ELISA IgG 역가는 항다당류 항체에 대한 것이다.

도 6a에 도시된 자료의 그래프는 Hib-rPorB 접합체가 기타 접합체 백신보다 2배 이상의 반응을 생성한다는 것을 보여준다. 도 6b는 상응하는 자료를 표로 만든 데이타이다. "반응자"는, 모든 예비면역 값이 <50이고 계산을 위해 25로 조정한 경우, 예비면역 값보다 4배 이상 큰 IgG ELISA 역가를 나타내는 것으로 정의한다. Hib-TT, Hib-rPorB-1 및 Hib-rPorB-2와 비교한 유사 실험을 5.0 ㎍ 및 0.5 ㎍의 접합체 용량을 사용하여 마우스에서 수행하였다. 데이터는 도 7에 도시되어 있다.

마지막으로 8개의 상이한 제제 Hib-rPorB(도 8에서의 A-H)를 Hib-TT 및 Hib-CRM 접합체와 비교하였다. 래트에서 항다당류 IgG 항체의 ELISA 분석으로 확인할 수 있는 바와 같이 Hib-rPorB 제제는 일관하여 Hib-TT 또는 Hib-CRM 접합체보다 2배 이상의 자극성을 나타내었다. 데이타는 도 8에 도시되어 있다.

본 발명을 완전히 기술하였지만, 당업자라면 본 발명의 범위 또는 임의의 기타 양태에 영향을 주지 않고 조건, 제제 및 기타 매개변수를 광범위한 등가의 범위내에서 실시할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 본원에서 언급한 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 그 전문을 참고로 인용한 것이다.

참조 문헌

Claims (19)

1. 에이치.인플루엔자(H.influenzae) b형(Hib) 다당류와 실질적으로 순수한 재중첩 수막염균 외막 단백질(rPorB)의 접합체.
2. 제1항에 있어서, 다당류가 분자량이 5,000 내지 50,000인 것이 특징인 접합체.
3. 제1항에 있어서, 접합체가 Hib 다당류와 rPorB의 환원성 아민화 반응에 의해 얻어지고, Hib 다당류가 산화되거나 또는 선택적으로 가수분해되어 알데히드기를 형성하는 것이 특징인 접합체.
4. 제1항에 있어서, 접합체가 Hib 다당류와 rPorB의 환원성 아민화 반응에 의해 얻어지고, Hib 다당류가 산화되어 알데히드기를 형성하는 것이 특징인 접합체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, rPorB가 클래스 3 rPorB인 것이 특징인 접합체.
6. (a) Hib 다당류를 얻는 단계;

   (b) 다당류를 산화시키거나 또는 선택적으로 가수분해하여 알데히드기를 생성시키는 단계;

   (c) rPorB를 얻는 단계; 및

   (d) 환원성 아민화로 rPorB에, 알데히드기를 포함하는 다당류를 접합시키는 단계를 포함하여 Hib 다당류-rPorB 접합체를 제조하는 방법.
7. 제6항에 있어서, Hib 다당류가 산화되고, 그 분자량이 5,000 내지 50,000인 것이 특징인 방법.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, rPorB가 클래스 3 rPorB인 것이 특징인 방법.
9. 제6항에 기재된 방법으로 얻은 접합체.
10. 제8항에 기재된 방법으로 얻은 접합체.
11. 제1항 또는 제9항에 기재된 접합체 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
12. 제10항에 기재된 접합체 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
13. 면역 반응을 유도하기 위한 유효량으로 제1항 또는 제9항에 기재된 접합체를 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 에이치.인플루엔자에 대한 면역 반응을 동물에서 유도하는 방법.
14. 면역 반응을 유도하기 위한 유효량으로 제10항에 기재된 접합체를 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 에이치.인플루엔자에 대한 면역 반응을 동물에서 유도하는 방법.
15. 제13항에 있어서, 접합체가 Hib 다당류와 rPorB의 환원성 아민화 반응에 의해 얻어지고, Hib 다당류가 산화되어 알데히드기를 형성하는 것이 특징인 방법.
16. 제14항에 있어서, 접합체가 Hib 다당류와 rPorB의 환원성 아민화 반응에 의해 얻어지고, Hib 다당류가 산화되어 알데히드기를 형성하는 것이 특징인 방법.
17. 제13항에 있어서, 다당류가 분자량이 5,000 내지 50,000인 것이 특징인 방법.
18. 제14항에 있어서, 다당류가 분자량이 5,000 내지 50,000인 것이 특징인 방법.
19. 제13항에 있어서, rPorB가 클래스 3 rPorB인 것이 특징인 방법.