CZ200087A3 - Imunogenní konjugáty obsahující peptin meningokoků skupiny B a polysacharid H. influenzae - Google Patents

Abstract

Popisuje se konjugát proteinu vnější membránymeningokoků a poylsacharidu mikroorganizmu H. influenzae typ b, jeho farmaceutická kompozice ajeho použití při indukci imunitní odezvy u živočicha na mikroorganizmus H. influenzae

Description

Oblast techniky

Vynález se týká oblasti vakcín použitelných pro vyvolání imunitní odezvy u zvířat. Vynález se zvláště týká konjugátů, které tvoří polysacharid mikroorganizmu H. influenzae a protein vnější membrány mikroorganizmu N. meningitidis. Dále vynález zahrnuje farmaceutické kompozice a jejich využití.

Dosavadní stav techniky

Mikroorganizmus Haemophilus influenzae je malý, pleomorfní gram-negativní kok. Izoláty se zařazují do šesti antigenně rozlišných kapsulárních typů (a až f) a do kmenů, které nejsou typovatelné a netvoří kapsle. Mikroorganizmus Haemophilus influenzae může způsobovat meningitidu, zánět středního ucha, zánět paranazálních dutin, zánět příklopky hrtanové, septickou artritidu, skrytou febrilní bakteriémii, difuzní zánět pojivové tkáně, zápal plic a hnisavý zánět tělních dutin. Tento organizmus také způsobuje neonatální meningitidu a septicaemii. Jiné infekce způsobené mikroorganizmem H. influenza zahrnují hnisavou periokarditidu, zánět srdeční nitroblány, zánět oční spojivky, zár.ět kosti a kostní dřeně, zánět pobřišnice, epididymo-orchitidu, zánět jazyka, zánět patrového čípku a septický zánět žil provázený srážením krve. Dříve než se začala aplikovat konjugační vakcína proti mikroorganizmu H. influenza typu b (Hib) většinu případů invazivního onemocnění u dětí způsoboval uvedený mikrooragnizmus typu b. Organizmy, které nemají kapsid způsobují invazivní onemo.cnění u novorozenců. Kmeny, které nemají kapsid způsobují infekci horních cest dýchacích, jenž zahrnují zánět středního ucha,. zánět paranazálních dutin a zánět průdušek a mohou způsobit také zápal plic.

Zdrojem organizmů jsou horní cesty dýchací u lidí. Způsob přenosu je pravděpodobně přenos z osoby na osobu přímým kontaktem kapénkovou nákazou. Častý je výskyt kmenů, které nemají kapsid, aniž se projevují příznaky onemocnění. Organizmy je možné izolovat z krku 60 až 90 % dětí. Kolonizace organizmy'typu b není častá. V období před výskytem vakcíny se objevuje u 2 až 5 % dětí. Frekvence výskytu dokonce klesla z rozšířením konjugační vakcíny Hib. Skutečné období nakažlivosti není známo, ale může být tak dlouhé, dokud se organizmus vyskytuje v horních cestách dýchacích.

V období před zavedením vakcíny, v USA a v mnoha dalších zemích byl Hib nejběžnějším agents způsobující bakteriální meningitidu u dětí. Meningitida a jiné invazivní infekce se nejběžněji vyskytují u dětí od 3 měsíců do 3 let a přibližně polovinu případů tvoří děti mladší 12-ti měsíců. Výskyt věkově specifického invazivního onemocnění způsobeného uvedeným mikroorganizmem typu b v různých populacích v různých zemích kolísá. U populací s nejvyšším celkovým výskytem je největší výskyt onemocnění u dětí mladších 12-ti měsíců. Výsledkem je málo případů u jedinců středního věku. Na rozdíl od meningitidy a většiny jiných invazivních onemocnění způsobených Hib v období před vývojem vakcíny, epiglotitida se řídce vyskytuje u dětí mladších 12-ti let. K maximálnímu výskytu v období před vývojem vakcíny dochází u dětí ve věku 2 až 4 roky. Epiglotitida se také objevuje u starších dětí nebo dospělých, kteří nebyli očkováni.

Invazivní onemocnění se častěji objevuje u chlapců, afroameričanů, aljašských eskymáků, apačských a navajských indiánů, u dětí, které navštěvují mateřskou školku, u dětí žijících v početné rodině a u dětí, které nebyly krmeny mateřským mlékem. Neimunizované děti, zvláště ty mladší čtyř let , které setrvávají v kontaktu (například v jedné domácnosti) s dítětem s invazivním onemocněním způsobeným Hib, jsou ve zvýšeném nebezpečí nákazy tímto mikroorganizmem. Jiné

faktory, které tvoří predispozici invazivního onemocnění zahrnují onemocnění srpkovitých buněk, asplenii, infekci HIV, jisté syndromy imunologické nedostatečnosti a maligní nádory. U dětí mladších jednoho roku, které prodělaly invazivní infekci a nejsou vakcinovány, existuje 1 % nebezpečí opětného výskytu infekce.

Od roku 1998, kdy se objevila konjugační vakcína proti Hib, výskyt invazivního onemocnění u kojenců a malých dětí klesl o 95 %. Výskyt invazivních infekcí způsobených jinými typy, které netvoří kapsid, je nyní podobný jako výskyt onemocnění způsobeným typem b. V USA si Ústav národního zdraví vzal za úkol v této zemi eliminovat výskyt Hib onemocnění u dětí mladších pěti let. Invazivní onemocnění způsobené Hib se nyní v USA vyskytuje primárně u dětí s nedostatečnou vakcinací nebo u dětí, které jsou příliš malé, aby se uskutečnila primární série vakcinace.

V USA se patentovaly čtyři konjugační vakcíny Hib. Tyto vakcíny obsahují polysacharid kapsidu Hib (to znamená polyribosylribotolfosfát (PRP) nebo PRP oligomery) kovalentně spojené s nosičovým proteinem a to buď přímo nebo prostřednictvím molekuly mezerníku. Ochranné protilátky proti konjugačním vakcínám PRP se liší ve složení a' imunogenicitě, což znamená, že doporučení pro jejich použití se liší. Přípravek PRP-D se doporučuje pouze pro děti od jednoho roku, zatímco další tři vakcíny HbOC, PRP-T a PRP-OMP se doporučují pro děti stáří od dvou měsíců.

Adjuvans jsou látky, které zvyšují imunitní odezvu proti antigenům a proto se používají v mnoha vakcínách a v kandidátech vakcín. Imunitní stimulační účinek adjuvans není antigenně specifický, jak je tomu u imunitní odezvy proti řadě různých typů antigenů. Jediným adjuvans vhodným pro použití u lidí schváleným FDA jsou sole hliníku. Ale řada adjuvans, které se používají při vakcinaci zvířat a v nových kandidátech vakcín jsou mikrobiálního původu (popisuje se v publikaci White, R. G. 1976. The

9 adjuvant effect of mucrobial products on the immune response. Ann. Rev. Microbiol. 30: 579-595.). Jsou to například

Freundovo adjuvans, Corynebacterium parvum, muramyldipeptid, toxoid tetanu atd.. Mechanizmy schopnosti mikrobiální sloučeniny posílit imunitní odezvu nejsou známy.

U hlavních proteinů vnějších membrán mikrooragnizmu Neisserie (Neisseria gonorrhoeae meningitidis) se zkoumal jejich potenciál jako adjuvans (popisuje se v publikacích Livingston, P. O. 1993. Approaches patogenního a Nesseria

IgG antibody response Ann. N. Y. Acad. Sci. J. Calves, F. Helling, W.

to melanoma 690: 204-213; D. Zollinger, to augmenting the ganglioside vaccines Livingston, P. 0., M

M. S. Blake and G. H. Lowell. 1993. GD3/proteosome vaccines induce consistent IgM antibodies against the ganglioside GD3. Vaccine 11: 1199-1204; Lowell, G. H., W. R. Ballou, L. F. Smith, R. A. Wirtz, W. D. Zollinger and W. T. Hockmeyer. 1988. Proteosome-lipopeptide vaccines: enhancement of immunogenicity for malaria CS peptides. Science 240: 800-802; Lowell, G. H., L. F. Smith, R. C. Seid and W. D. Zollinger. 1988. Peptides bound to proteosomes via hydrophobic feet become highly

167: 658-663;

C. Gotschlich immunogenic without adjuvans. J. Exp. Med.

Wetzer, L. Μ. , M. S. Blake, K. Barry and E 1992. Gonococcal porin vaccine evaluation: comparison of Por proteosomes, liposomes, and blebs isolated from rmp deletion mutants. J. Infect, Dis. 166: 551-555.) a mechanizmus jejich schopnosti vyvolat imunitní odezvu. Proteiny, které stojí ve středu zájmu, jsou protein IA (PIA) a IB (PIB) z gonokoků a třídy proteinů 1, 2 a 3 pocházející z meningokoků (Cl, C-2 a

C3' (popisuje se v publikaci Blake,

M.

S.

Gotschlich. 1986. Functional and immunological properties of pathogenic neisserial surface proteins

377-400

In: M.

John

Inouye, Bacterial Outer Membranes as Model Systems.

Wiley, New Yourk.). Všechny tyto proteiny působí jako poriny (Lynch, E. C., M. S. Blake, E. C. Gotschlich and A. Mauro.

1984. Studies of porins: Spontaneously transferred from whole cells and reconstituted from purified proteins of Neisseria gonorrhoeae and Neisseriea meningitidis. Biophys. J. 45: 104107; Mauro, A., M. S: Blake and P. Labarca. 1988. Voltage gating of conductance in lipid bilayers induced by porin from outer membranes of Neisseria gonorrhoeae. Proč. Nat. Acad. Sci. USA. 85:1071-1075; Young, J. D. Ε., M. S. Blake, A. Mauro and Z. A. Cohn. 1983. Properties of the major outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae incorporated into model lipid membranes. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 3831-3835.) a vykazuji mezi sebou podstatnou aminokyselinovou homologii ( Ward, M. J. , P. R. Lambden and J. E,

1992.

Sequence analysis and relationships sekvenční

Heckels.

between meningococcal class 3 serotype proteins and other porins from pathologenic and non-pathogenic Nesseria species.

FEMS

Microbial. Lett Runeberg-Nyman.

73: 283-289; Butcher, S., M. Sarvas and K.

1991

Neisseria

Gene 105:

protein I, gonorrhoeae. Gostchliche, 1987

Proč. Nat, E. C., Μ. E.

Class-3 porin protein meningitidis: Cloning and structure of the gene 125-128; Carbonetti, N. H. and P. F. Sparling. 1987. Molecular clonning and characterization of the structural gene for the major outer membrane protein Neisseria Acad. Sci. USA. 84: 9084-9088;

Seiff, M. S. Blake and J. M. Koomey.

Porin protein of Neisseria gonorrhoeae: clonning and gene structure. Proč. Nat. Sci. USA. 84: 8135-8139.) a uvažuje se, že jsou součástí super-rodiny gram-negativních porinů (Jeanteur, D. , J. H. Lakely and F. Pattus. 1991. The bacterial porin seperfamily: sequence alignment and structure prediction. Molec. Microbiol. 5: 2153-2164).

Ukázalo se, že poriny Nesserie, když jsou nekovalentně spojeny v komplexu s malárickými peptidy, zesilují protilátkovou odezvu proti těmto peptidům. Tato skutečnost se porovnávala, když se peptidy používaly jako imunogen samostatně nebo ve spojení s jinými proteiny, na které se

vážou kovalentní vazbou (Lowell, G. H., W. R. Ballou, L. F. Smith, R. A. Wirtz, W. D. Zollinger and W. T. Hockmeyer. 1988. Proteosome-lipopeptide vaccines: enhancement of immunogenicity for malaria CS peptides. Science 240: 800-802; Lowell, G. H.,

L. F. Smith, R. C. Seid and W. D. Zollinger. 1988. Peptides bound to proreosomes via hydrophobic feet become highly immunogenic without adjuvans. J. Exp. Med. 167: 658-663).

Navíc se ukázalo, že peptidy získané ze streptokoků skupiny A (Lowell, G. H. 1990. Proteosomes, hydrophobic anchors, iscoms, and liposomes for improved presentation of peptides and protein vaccines. P. 141-160. In: G. C. Woodrow and Μ. M. Levine, New Generation Vaccines. Marcel Dekker, lne., New York) a Trypanosome bručeli (Lowell, G. H., W. R. Ballou, L.

F. Smith, R. A. Wirtz, W. D. Zollinger and W. T. Hockmeyer. 1988. Proteosome-lipopeptide vaccines: enhancement of immunogenicity for malaria CS peptides. Science 240: 800-802) jsou u myší více imunogenní, když se začlení do komplexů, které obsahují poriny Neisserie, což se porovnává se situací, kdy. se myši imunizovaly se samotnými, peptidy. Vezikuly meningokokové vnější membrány (OMV), které hlavně obsahují protein třídy 2, se použily jako nosič k vyvolání imunitní odezvy proti kapsidovému polysacharidů H. ínfluenzae v určitých typech vakcíny proti H. ínfluenzae typu b,. které vyvinula firma Merck (Donnelly, J. J. , R. R. Deek and M. A. Liu. 1990. Immunogenicity of a Haemophilus Ínfluenzae polysaccharide-Weisseria meningitidis outer membrane protein complex conjugate vaccine. J. Immunol. 145:3071-3079). Livingston dále objevil, že je možné použít čištěné poriny Nesserie jako adjuvans ve vakcinách proti melanomu. Buňky melanomu exprimují na svém povrchu v porovnání s normálními melanocyty velké množství lidských gangliosidů GM2 nebo GD3. Aby se zesílila imunitní odezva proti GM2 a GD3 a tak se indukovala imunita proti nádoru u pacientů s melanomem, se GM2 a GD3 kovalentně spojily s čištěnými poriny Nesserie.

·· ·

Dobrovolníci s maligním melanomem se imunizovali touto zkonstruovanou vakcínou. Protilátková odezva proti GM2 a GD3 značně zesílila u pacientů, kteří se imunizovali komplexy porin/GM2 nebo porin/GD3, v porovnání s pacienty, kteří se imunizovali samotnými gangliozidy nebo s jejich komplexem s BCG (publikacích Livingston, P. 0. 1993. Approaches to augmenting the IgG antibody response to melanoma ganglioside vaccines. Ann. Ν. Y. Acad. Sci. 690: 204-213; Livingston, P.

O., M. J. Calves, F. Helling, W. D. Zollinger, M. S. Blake and

G. H. Lowell. 1993. GD3/proteosome vaccines induce consistent IgM antibodies against the ganglioside GD3. Vaccine 11: 11991204;). Navíc u pacientů imunizovaných komplexem porin/GM2 se podstatně zmenšila velikost nádorů (osobní sdělení, P. Livingston).

Mechanizmy, kterými poriny Nesserie působí jako adjuvans nejsou známy. Skupina pracující pro firmu Merck (Liu, M. A., A. Friedman, A. I. Oliff, et al. 1992. A vaccine carrier derived from Neisseria meningitidis with mitogenic activity for lymphocytes. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 4633-4637;

J. Burke, C. Shi, A. Friedman, J. J. Donnelly Póre formation and mitogenicity in blood 2 protein of Neisseria meningitidis. J. Biol. Chem. 267: 19266-19271; Donnelly, J. J., R. R. Deek and

M. A. Liu. 1990. Immunogenicity of a Haemophilus influenzae polysaccharide-Neissería meningitidis outer membrane protein complex conjugate vaccine. J. Immunol. 145:3071-3079), která vyvinula konjugovanou vakcínu kapsidového polysacharidu Haemophilus/meningokokový OMV, uvažuje, že poriny mohou působit přímou stimulaci T buněk pomocí proteinu třídy 2. Tato skupina prokázala, že protein třídy 2 může přímo stimulovat T lymfocyty a proto přejmenovala protein třídy 2 na meningokokový protein zvyšující imunitní odezvu (Meningococcal Immune Enhancing Protein (MIEP) (Liu, M. A., A. Friedman, A.

I. Oliff, et al. 1992. A vaccine carrier derived from

Ulmer, J.	B. ,	C. J.
and M. A.	Liu	. 1992
cells by	the	class

• 9 99

Neisseria meningitidis lymphocytes. Proč. Nati Později se však ukázalo, with mitogenic activity for

Acad. Sci. USA 89: 4633-4637).

že pouze vysoké koncentrace (vyšší než 50 pg) denaturovaného proteinu třídy 2 mohou stimulovat T buňky, zatímco přirozený protein nevykazuje takový účinek (Ulmer, J. B., C. J. Burke, C. Shi, A. Friedman, J. J. Donnelly and M. A. Liu. 1992. Póre formation and mitogenicity in blood cells meningitidis. J. většina porinů Neisserie se by the class 2 protein of Neisseria Biol. Chem. 267: 19266-19271). Protože vyskytují ve své přirozené

Jr. And K responses.

konfiguraci, když se používají jako vakcinační kandidáti nebo jako adjuvans, je pravděpodobné, že nespecifická stimulace T buněk denaturovanými poriny je nízká.

Během posledních několika let se získaly detailní informace o interakci mezi T a B lymfocyty, které jsou nutné pro rozeznávaní antigenů, stimulaci lymfocytů a produkci protilátek. Ukázalo se, že v současném modelu stimulace T lymfocytů jsou nutné dvě sady signálů mezi buňkou prezentující antigen (APC) a T lymfocyty (Hathcock, K. S., G. Laszlo, Η. B. Dickert, J. Bradshaw, P. S. Linsley and R. J. Hodes. 1993. Identification of an alternativě CTLA-4 ligand costimulatory for T cell activation. Science 261: 905-907; Janeway, C. A.,

Bottomly. 1994. Signals and signs for lymphocyte Cell 76: 275-285; Schwartz, R. H. 1992.

Costimulation of T lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4 a B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy. Cell 71: 1065-1068). První signál (signál 1) se zavede prostřednictvím interakce hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) na buňky, které prezentují antigen (např. B lymfocyty, dendritické buňky, makrofágy atd.) a na T receptor na T lymfocytech. Žlábek na komplexu MHC je obvykle obsazen oligopeptidem odvozeným od zpracovaných antigenů (epitop T buňky). Specifita reakce se potvrdila signálem 1. Druhý nebo kostimulační signál (signál 2) se zavede navázáním dvou sad • ·

·· · · · · · • · · · · · ♦ • · ····· · • · · 9 9·· ·· ···· 19 19 receptorů během interakce mezi B a T lymfocyty (obrázek č. 1). Aktivované T lymfocyty pak uvolňují cytokiny, které stimulují efektorové buňky. Například způsobují, že B lymfocyty se stávají buňkami produkujícími protilátky. Ukázalo se, že vyvolání ko-stimulace interakcí těchto receptorů je důležité v nádorové imunitě (Schwartz, R. H. 1992. Costimulation of T lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4 a B7/BB1 in interleukin2 production and immunotherapy. Cell 71: 1065-1068; Townsend,

S. E. and J. P. Allison. 1993. Tumor rejection after direct costimulation of CD8+ T cells by B7-transfected melanoma cells. Science 259: 368-370; Azuma, Μ. , M. Cayabyab, D. Buck,

J. H. Philips and L. L. Lanier. 1992. CD28 interaction with B7 costimulates primary allogeneic proliferative responses and cytotoxicity mediated by smáli, resting T lymphocytes. J. Exp. Med. 175: 353-360; Baskar, S., S. Istrand-Rosenberg, N.

Nabavi, L. M. Nadler, G. J. Freeman and L. H. Glimcher. 1993. Constitutive expression of B7 restores immunogenicity of tumor cells expressing truncated major histocompatibility complex class II molecules. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5687-5690;

Chen, L., S. Ashe, W. A. Brady, et al. 1992. Costimulation of antitumor immunity by the B7 counterreceptor for the T lymphocyte molecules CD28 and CTLA-4. Cell 71: 1093-1102;

Falkow, S. 1997. What is a pathogen? ASM News 63: 359-365.) , při prevenci tolerance (Gimmi, C. D., G. J. Freeman, J. G. Gribben, G. Gray and L. M. Nadler. 1993. Human T-cell clonal allergy is induced by antigen presentation in the absence of B7 costimulation. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6586-6590;

Mueller, D. L., Μ. K. Jenkins and R. H. Schwartz. 1989. Clonal expansion versus functional clonal anactivation: a costímulatory signalling pathway determines the outcome of T cell antigen receptor occupancy. Annu. Rev. Immunol. 7: 445480; Tan, P., C. Anasetti, J. A. Hansen, et al. 1993. Induction of alloantigen-specific hypersponsiveness in human T lymphocytes by blocking interaction of CD28 with its natural • · · fe · · ligand B7/BB1. J. Exp. Med. 177: 165-173) a cytotoxické aktivity lymfocytů (Azuma, Μ. , M. Cayabyab, D. Buck, J. H. Philips and L. L. Lanier. 1992. CD28 interaction with B7 costimulates primary allogeneic proliferative responses and cytotoxicity mediated by smáli, resting T lymphocytes. J. Exp. Med. 175: 353-360;).

Receptory T lymfocytů jsou CD28 a CTLA-4. Oba uvedené receptory jsou členy super-rodiny imunoglobulinů (Connell, T. D. , D. Shaffer and J. G. Cannon. 1990. Characterization of the repertoire of hypervariable regions in the protein II (opa) gene family of Nesseria gonorrhoeae. Molec. Microbiol. 4: 439449). Receptor CD28 se nachází na zbývajících a aktivovaných T buňkách (Azuma, Μ. , M. Cayabyab, D. Buck, J. H. Philips and L.

L. Lanier. 1992. CD28 interaction with B7 costimulates primary allogeneic proliferative responses and cytotoxicity mediated by smáli, resting T lymphocytes. J. Exp. Med. 175: 353-360; Chen, L., S. Ashe, W. A. Brady, et al. 1992. Costimulation of antitumor immunity by the B7 counterreceptor for the T lymphocyte molecules CD28 and CTLA-4. Cell 71: 1093-1102;

Jenkins, Μ. K. and J.

Johnson. 1993. Molecules involved in

T-cell costimulation. Curr. Opin. Immunol. 5: 36-367; June, C.

H., J. A. Bluestone, L. M. Nadler and G. B. Thompson. 1994. The B7 and CD28 receptor families. Immunol. Today 15: 321-331; Linsley, P. S., W. Brady, L. Grosmaire, A. Aruffo, N. K. Damle and J. A. Ledbetter. 1991. Binding of the B cell activation antigen B7 to CD28 costimulates T cell prolifaratíon and interleukín 2 mRNA accumulation. J. Exp. Med. 173: 721-730;

Linsley, P. S., E. A. Clark and J. A. Ledbetter. 1990. T-cell antigen CD28 madiates adhesion with B cells by interacting with activation antigen B7/BB-1. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 5031-5035; Norton, S. D., L. Zuckerman, K. B. Urdahl, R.

Shefner, J. Miller and Μ. K. Jenkins. 1992. The CD28 ligand, B7, enhances IL-2 production by providing a costimulatory signál to T cells. J. Immunol. 149: 1556-1561.), zatímco • · · « φ • φ · • φ · « · · · • Φ φφφφ production. Balzano, Ε.

CTLA-4 se exprimuje pouze na aktivovaných T buňkách (Schwartz, R. H. 1992. Costimulation of T lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4 a B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy. Cell 71: 1065-1068; Freeman, G. J. , D. B. Lombard, C. D.

Gimmi, et al., 1992. CTLA-4 and CD28 mRNA are coexpressed in most T cells after activation. Expression of CTLA-4 and CD28 mRNA does not correlate with the pattern of lymphokine J. Immunol. 149: 3795-3801; Harper, K. , C.

Rouvier, M. G. Mattei, M. F. Luciani and P.

Golstein. 1991. CTLA-4 and CD28 activated lymphocyte molecules are dosely related in both mouše and human as to sequence, message expression, gene structure, and chromosomal location. J. Immunol. 147: 1037-1044; Lindsten, T., K. P. Lee, E. S.

Harris, et al. 1993. Characterization of CTLA-4. structure and expression on human T cells. J. Immunol. 151: 3489-3499;

Linsley, P. S., W. Brady, M. Urnes, L. S. Grosmaire, Ν. K. Damle and J. A. Ledbetter. 1991. CTLA-4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7. J. Exp. Med. 174: 561569) . Množství CD28 na aktivovaných T buňkách je 20 x vyšší než CTLA-4, ale afinita CD28 vůži receptoru B buňky je daleko menší (Lindsten, T., K. P. Lee, E. S. Harris, et al. 1993. Characterization of CTLA-4 structure and expression on human T cells. J. Immunol. 151: 3489-3499; Linsley, P. S., W. Brady,

M. Urnes, L. S. Grosmaire, Ν. K. Damle and J. A. Ledbetter. 1991. CTLA-4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7. J. Exp. Med. 174: 561-569). Receptory B lymfocytů jsou B7 (Linsley, P. S., W. Brady, M. Urnes, L. S. Grosmaire, Ν. K. Damle and J. A. Ledbetter. 1991. CTLA-4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7. J. Exp. Med. 174: 561-569; Razi-Wolf, Z., G. J. Freeman, F. Galvin, B.

Benacerraf, L. Nadler and H. Reiser. 1992. Expression and function of the murine B7 antigen, the major costimulatory molecule expressed by perironeal exudate cells. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 4210-4214; Reiser, H., G. J. Freeman, Z.

Φ 9 9 1

99

4444

Razi-Wolf, C. D. Gimmi, B. Benacerraf and L. M. Nadler. 1992. Murine B7 antigen provides an efficient costimulatory signál for activation of murine T lymphocytes via the T-cell receptor/CD3 komplex. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 271-275;

Freeman, G. J. , A. S. Freedman, J. M. Segil, G. Lee, J. F. Whitman and L. M. Nadler. 1989. B7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic B cells. J. Immunol. 143: 2714-2722; Gimmi, C. D. , G. J.

Freeman, J. G. Gtribben, et al. 1991. B-cell surface antigen B7 provides a costimulatory signál that induces T cells to proliferate and secrete interleukin 2. Proč. Nati. Acad. S Linsley, P. S., W. Brady, M. Urnes, L. S. Grosmaire, Ν. K. Damle and J. A. Ledbetter. 1991. CTLA-4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7. J. Exp. Med. 174: 561569ci. USA 88: 6575-6579.) a B7-2 (Azuma, M., D. Ito, H. Yagita, et al., 1993. B70 antigen is a second ligand for CTLA4 and CD28. Nátuře 366: 76-79; Freeman, G. J. , F. Borriello,

R. J. Hodes, et al. 1993. Uncovering of functional alternativě CTLA-4 counter-receptorin B7-deficient mice. Science 262: 907909; Freeman, G. J. , F. Borrielo, R. J. Hodes, et al., 1993.

Murine B7-2, an costimulates T alternativě CTLA-4 counter-receptor that cell proliferation and interleukin-2 production. J. Exp. Med. 178: 2185-2192; Freeman, G. J., J. G. Gribben, V. A. Boussiotis, et al. 1993. Cloning of B7-2: a CTLA-4 counter-receptor that costimulates human T cell proliferation (see comments). Science 262: 909-911; Hathcock,

K. S., G. Laszlo, Η. B. Dickert, J. Bradshaw, P. S. Linsley and R. J. Hodes. 1993. Identification of an alternativě CTLA-4 ligand costimulatory for T cell activation. Science 261: 905907). Receptory B7 a B7-2 jsou členové super-.rodiny imunoglobinů (Freeman, G. J. , F. Borriello, R. J. Hodes, et al. 1993. Uncovering of functional alternativě CTLA-4 counterreceptorin B7-deficient mice. Science 262: 907-909; Freeman,

G. J. , A. S. Freeman, J. M. Segil, G. Lee, J. F. Whitman and • · •

»· · • o

L. M. Nadler. 1989. B7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic B cells. J. Immunol. 143: 2714-2722; Freeman, G. J. , G. S. Gray, C. D.

Gimmi, et al., 1991. Structure, expression, and T cell costimulatory activity of the murine homologue of the human B lymphocyte activation antigen B7. J. Exp. Med. 174: 625-631) a a nacházejí se pouze na aktivovaných B lymfocytech (Freeman,

G. J. , A. S. Freeman, J. M. Segil, G. Lee, J. F. Whitman and L. M. Nadler. 1989. B7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic B cells. J. Immunol. 143: 2714-2722.). Několik důkazů demonstruje vztah novějšího ligar.du B7-2 s ko-stimulací T-lymf ocytů: 1) navázání

CTLA-4 na aktivované buňky B se pouze částečně inhibuje monoklonálními protilátkami proti B7 (mAb) (Hathcock, K. S., G. Laszlo, H. 3. Dickert, J. Bradshaw, P. S. Linsley and R. J. Hodes. 1993. Identification of an alternativě CTLA-4 ligand costimulatory for T cell activation. Science 261: 905-907) 2) lymfocyty odvozené od myší s nedostatečnou expresí B7 mohou stále ko-stimulovat T buňky (Freeman, G. ’J. , A. S. Freedman, J. M. Segil, G. Lee, J. F. Whitman and L. M. Nadler. 1989. B7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic B cells. J. Immunol. 143:. 2714-2722; Freeman, G. J. , F. Borrielo, R. J. Hodes, et al., 1993. Murine B7-2, an alternativě CTLA-4 counter-receptor that costimulates T cell proliferation and interleukin-2 production. J. Exp. Med. 178: 2185-2192), 3) transfektanty exprimující samotný B72 mohou ko-stimulovat T buňky (Freeman, G. J. , F. Borrielo, R. J. Hodes, et al., 1993. Murine B7-2, an alternativě CTLA-4 counter-receptor that costimulates T cell proliferation and interleukin-2 production. J. Exp. Med. 178: 2185-2192;

Freeman, G. J. , J. G. Gribben, V. A. Boussiotis, et al. 1993. Cloning of B7-2: a CTLA-4 counter-receptor that costimulates human T cell proliferation (see comments). Science 262: 909911;) a 4) mAb specifické pro B7-2 mohou inhibovat ko• · (Hathcock, K. S., G. S. Linsley and R. J. alternativě CTLA-4

Laszlo, Hodes. ligand mikroorganizmu Salmonella stimulaci T lymfocytů B buňkami Η. B. Dickert, J. Bradshaw, P.

1993. Identification of an costimulatory for T cell activation. Science 261: 905-907) nebo transfektanty B7-2 (Freeman, G. J., F. Borrielo, R. J. Hodes, et al., 1993. Murine B7-2, an alternativě CTLA-4 counter-receptor that costimulates T cell proliferation and interleukin-2 production. J. Exp. Med. 178: 2185-2192).

Důležitost zpočátku popsaného antigenu B7 jako ko-stimulačního receptorů je kontraverzní, protože exprese B7-2 se vyskytuje dříve než exprese B7 a na povrchu aktivovaných B lymfocytů je přítomno větší množství B7-2 než B7 (Hathcock, K. S., G. Laszlo, Η. B. Dickert, J. Bradshaw, P. S. Linsley and R. J. Hodes. 1993. Identification of an alternativě CTLA-4 ligand costimulatory for T cell activation. Science 261: 905-907).

Schéma ko-stimulace T lymfocytů a kostimulační receptory jsou zobrazeny na obrázku č. 1.

Existuje důkaz, že mikrobiální produkty mohou stimulovat B lymfocyty. Liu et al. ukázali, že lipopolysacharid (LPS), mitogenní virus chřipky a antigen, který napodobuje virovou infekci (polyinosin-polycytidylová kyselina), může stimulovat B lymfocyty, které naopak ko-stimulují T lymfocyty (Janeway,

C. A., Jr. And K. Bottomly. 1994. Signals and signs for lymphocyte responses. Cell 76: 275-285; Schwartz, R. H. 1992.

Costimulation of T lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4 a B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy. Cell 71: 1065-1068). Vordermeier ukazuje, že čištěné typhi (volné LPS) jsou ponny silnými stimulátory B buňky, ale vykazují minimální účinek na T lymfocyty (Vordermeier, Η., H. Drexler and W. G. Bessler. 1987. Polyclonal activation of human peripheral blood lymphocytes by bacteriel porins and defined porin fragments. Immunol. Lett. 15: 121-126; Vordermeier, Η., H. Drexler and W. G. Bessler. 1987. Polyclonal activation of human peripheral • · · · · · ♦ · blood lymphocytes by bacterial porins and defined porin fragments. Immunol. Lett. 15: 121-126.). Přípravky meningokokové vnější membrány, které obsahují meningokokální poriny, působí jako mitogeny B buněk a nestimulují T lymfocyty (Melancon, J. , R. A. Murgita and R. H. Schwartz. 1989. Clonal expansion versus functional clonal inactivation: a costimulatory signalling pathaway determines the outcome of T cell antigen receptor occupancy. Annu. Rev. Immunol. 7: 445480; Sparkes, B. G. 1983. Immunomodulating activity of meningococcal antigens. Can. J. Microbiol. 29: 1611-1618;

Sparkes, B. G. 1983. Duál effect of meningococcal antigens on a T cell dependent immune response. Can. J. Microbiol. 29: 1619-1625). Tento důkaz naznačuje, že poriny Nesserie a pravděpodobně i jiné poriny gram-negativních bakterií mohou stimulovat B lymfocyty a posílit expresi B7-2. Zvýšená exprese B7-2 může zprostředkovat ko-stimulaci T lymfocytů a to může být mechanizmus, kterým poriny zesilují imunitní odezvu k jiným antigenům, jako polysacharid PRP.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje konjugát v podstatě čistého polysacharidů mikroorganizmu H. influenze typ b (Hib) a znovu svinutého proteinu meningokokové vnější membrány (rPorB).

Vynález se také týká způsobu přípravy konjugátu polysacharid Hib-rPorB, který obsahuje (a) získání polysacharidů Hib, (b) oxidaci nebo selektivní hydrolýzu uvedeného polysacharidů za vzniku aldehydových skupin, (c) získání rPorB a (d) konjugaci polysacharidů, který obsahuje aldehydové skupiny, s rPorB redukční aminací.

Vynález také popisuje konjugáty získané způsoby přípravy podle vynálezu. Konjugáty podle vynálezu se mohou kombinovat s DT'aP (s vakcínou proti diftérii, tetanu a černému kašli).

• · o · · · ·· · « 1 · · · · · « · · · · · · · · »

Vynález se také týká farmaceutických kompozic, které obsahují konjugáty podle vynálezu dále mohou obsahovat DtaP a farmaceuticky přijatelný nosič.

Vynález se také týká způsobu indukce imunitní odezvy u zvířat proti mikroorganizmu H. influenzae, který zahrnuje aplikaci konjugátů podle vynálezu zvířeti v množství, které je účinné pro indukci uvedené imunitní odezvy.

Vynález se částečně týká objevu, že konjugáty Hib-rPorB podle vynálezu vyvolávají podstatně větší imunitní odezvu u zvířat ve srovnání se situací, kdy se jako antigenní protein používá toxoid tetanu a rekombinantně produkovaný protein P2 vnější membrány mikroorganizmu H. influenzae. Podstatně silnější imunogení odezvy se s konjugátem Hib-CRM, který je

Laderle Laboratories, Division of American Cyanamide Company, Pearl River, NY. CRM197 je místně specifický mutant, netoxická varianta toxinu difterie, který se izoloval z kultur Cornebacterium diphtheriae Ο7(β197) (popisuje se v publikaci Seid, R. C. Jr. Et al., Glycoconj. J. 6: 489-498 (1989)).

Konjugát podle vynálezu se zvláště používá v kompozicích, které také obsahují DTaP. V případě běžných nosičových proteinů, jako je toxoid tetanu, je možné mezi komponenty pozorovat imunologické interakce a epitopickou supresi. Konjugáty podle vynálezu v kombinaci s kompozicemi vakcín obchází toto vážné omezení.

také získaly v porovnání komerčně dostupný u firmy

Vynález popisuje vakcínu pro vyvolání imunitní odezvy u živočichů, která obsahuje protein porinu vnější membrány meningokoků skupiny B, spojených s polysacharidem Hib a farmaceuticky přijatelné ředidlo, nosič nebo ekcipient. Vakcína se může aplikovat v množství, které je účinné pro vyvolání imunitní odezvy u živočichů proti mikrooragnizmu H. influenzae. V preferovaném provedení vynálezu je živočichem savec ·» ·· • » · 9 · · · · · «·· ·«· 99 9·9· 9· 9· vybraný ze skupiny zahrnující člověka, tele, prase, ovci a kuře. V jiném provedení vynálezu je uvedeným savcem člověk.

Termín „rPorB znamená zralý, znovu svinutý protein třídy 2 nebo 3 vnější membrány z mikroorganizmu N. meningitidis a jeho fúze, které obsahují aminokyseliny 1 až 20 nebo 1 až 22 genu T7 kapsidového proteinu Φ10. Způsoby silné exprese proteinu rPorB třídy 2 a 3 a jejich fúze, opětné svinutí a čištění se popisuje v publikaci Qi, H. L., J. Y. Tai and M. S. Blake. 1994. Expression of large amounts of Neisserial porin proteins in Escherichia coli and refolding of the proteins into native trimers. Infect. Immun. 62: 2432-2439 a v US patentu č. 5 439 808. Rekombinantní porin se může exprimovat ve vysokém množství v mikroorganizmu E. coli, což popisuje US patent č. 5 439 808 nebo v kvasinkách podle 08/792,302. V preferovaném provedení vynálezu se protein rPorN třídy 3 exprimuje v hostiteli BL21(DE3)ÁompA, který se transformoval genem kódujícím rPorB. Tento protein je podstatně čistý a opětně se svine podle US patentu č. 5 439 808.

Kapsulární polysacharid mikroorganizmu H. influenzae se může izolovat způsobem, který je dobře znám v oboru (popisuje se v publikaci Schneerson et al. J. Exp. Med. 152:361-376 (1980); Marburg et al. J. Am. Chem. Soc. 108: 5282 (1986);

Jennings et al., J. Immunol. 127: 1011-1018 (1981) a Beuvery et al., Inject. Immunol. 40: 39-45 (1983). V preferovaném provedení vynálezu se připraví kultura organizmus, supernatant kultury se filtruje přes mikro-filtr a filtrát dále prochází přes filtr, který odděluje molekuly o molekulové hmotnosti 300 000. Permeát se pak koncentruje například na filtru, který odděluje molekuly o molekulové hmotnosti 100 000. Materiál o molekulové hmotnosti v rozmezí 100 000 až 300 000 se pak oxiduje středně silným oxidačním činidlem, jako je metaperiodát. Produkt se filtruje přes filtr, který odděluje molekuly s molekulovou hmotností 30 000 a koncentruje se na filtru oddělujícím molekuly s molekulovou hmotností 5 000.

Vzniká polysacharid, který má aldehydové skupiny, jenž se mohou přímo použít pro konjugaci. Preferovaný polysacharid má molekulovou hmotnost přibližně 5 000 až 50 000. Více se preferuje polysacharid s molekulovou hmotností 10 000 až 50 000. Mohou se však použít i polysacharidy s jiným rozmezím molekulových hmotností.

Odborníkovi je známo, že vakcína obsahující konjugáty kapsulární polysacharid-proteinový nosič se může připravit několika různými způsoby. Typy kovalentních vazeb, které spojují polysacharid s proteinovým nosičem, a způsoby jejich produkce jsou dobře známy v oboru. Detaily obsahující chemické způsoby , kterými je možné spojit uvedené dvě části konjugátu, se popisují v dokumentu US patent č. 5 623 057, 5 371 197, uz _w

192 540, 4 902 506 a 4 356 170. Sdnrňé informace lze získat v publikaci Contributions to Microbilogy and Immunology, vol. 10, Conjugate Vaccines, volume editors J. M. ruse and R. E. Lewis, Jr. 1989 a Jennings, H. J. and R. K. Sood. 1994. Synthetic glycoconjugates as human vaccines. P. 325-371. In: Y.C. Lee and R. T. Lee, Neoglycoconjugates: Preparation and applications. Academie Press, New Yourk. Jedna taková metoda je proces redukční aminace popsaný v publikaci Schwartz and Gray (Arch. Biochim. Biophys. 181: 542-549 (1977)). Tento proces zahrnuje produkci polysacharidu ve formě, která vykazuje koncové redukční skupiny a reaguje s kapsulárním polysacharidem, a rPorB v přítomnosti s ionty cyanoborohydridu nebo s jiným redukčním činidlem. Redukční skupiny se mohou tvořit selektivní hydrolýzou nebo specifickým oxidačním štěpením nebo kombinací uvedených metod.

Vakcína podle vynálezu obsahuje konjugát Hib-rPor v množství, které účinně závisí na způsobu aplikace. Ačkoli se preferují podkožní a intramuskulární způsoby aplikace , porinový protein meningokoků skupiny B, fúzní protein nebo vakcína podle vynálezu se může aplikovat intraperitonálním, intravenózním nebo intranasálním způsobem. Pro odborníka je

výhodné, že množství, které se bude aplikovat v případě léčebného protokolu, se může snadno stanovit, aniž se musí provádět experimenty. Očekává se, že vhodné množství je v rozmezí 5 až 50 μς na jednoho živočicha. Více se upřednostňuje množství 10 pg na jednoho živočicha.

Vakcína podle vynálezu se může aplikovat orálně ve formě kapslí, kapalných roztoků, suspenzí nebo elixíru nebo ve formě sterilní kapaliny, jako jsou roztoky nebo suspenze. Může se přednostně použít libovolný inertní nosič, jako je fyziologický roztok, fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem nebo libovolný nosič, ve kterém konjugační vakcína vykazuje vhodnou rozpustnost. Vakcíny se mohou připravit ve formě přípravku s jedinou dávkou nebo formě přípravku, který obsahuje velké množství dávek, jenž se může použít pro masový vakcinační program. Informace o způsobu přípravy a použití vakcíny je možné nalézt v publikaci Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, Osol (ed.) (1980) a New Trends and Developments in Vaccines, Voliér et al. (eds.), University Park Press, Baltimore, MD (1978) .

Vakcíny podle vynálezu mohou dále obsahovat adjuvans, které zvyšuje produkci protilástek specifických pro mikroorganizmus H. influenzae. Takové adjuvans zahrnuje, ale není omezeno na různé olejové formulace, jako je Freundovo úplné adjuvans (CFA), stearyltyrozin (ST; popisuje se v dokumentu US patent č. 4 258 029), dipeptid známý jako MDP, saponin, hydroxid hlinitý a lymfatický cytokin.

Freundovo adjuvans je emulze minerálního oleje a vody, která se smísí s imunogenní sloučeninou. Ačkoli Freundovo adjuvans je silné, ve většině případů se lidem nepodává. Místo něj se může člověku aplikovat adjuvans alum (hydroxid hlinitý) nebo ST. Konjugační vakcína se může absorbovat na hydroxid hlinitý, ze kterého se po zavedením injekcí pomalu uvolňuje.

• · · »

·

Konjugační vakcína se může také uzavřít do kapslí s lipozomy, což se popisuje v US patentu č. 4 235 877.

V preferovaném provedení vynálezu se konjugát podle vynálezu kombinuje s DTap nebo DTaP IPV, přičemž tato kombinace se může aplikovat zvířatům. DtaP je kombinace vakcín proti difterii, tetanu a černému kašli, která je dostupná u firmy Amvax, Inc., Beltsville, Maryland. V preferovaném provedení vynálezu je vakcína proti černému kašli v oxidované formě, jak je dostupná u firmy Amvax. Inc.

V jiném preferovaném provedení se vynález vztahuje k metodě indukující imunitní odezvu u živočicha, která zahrnuje aplikaci vakcíny podle vynálezu v množství, které je účinné k indukci imunitní odezvy. Vakcína podle vynálezu se může aplikovat dohromady s účinným množstvím jiných imunogenů, jak se popisuje shora v textu, přičemž se generuje u zvířete velké množství imunních odezev.

Následující příklady ukazují způsob přípravy a kompozice podle vynálezu. Vynález popisuje jiné vhodné modifikace a úpravy, které jsou odborníkovi, zřejmé a spadají do rozsahu vynálezu.

Přehled obrázků	na	výkrese
Obrázek č.	1	znázorňuje grafickou prezentaci ko-stimulace
T-lymfocytů.
Obrázek č.	2	znázorňuje graf ukazující profil fermentace
B1HB1030.
Obrázek č.	3	znázorňuje obarvený gel SDS-PAGE čištěného
rPorB užívaného	při konjugaci.

Obrázek č. 4 znázorňuje graf ukazující specifickou IgG odezvu pro polysacharid Hib u krys na konjugáty Hib s různými nosičovými proteiny.

Obrázky č. 5A až 5H znázorňují tabulky ukazující sérové protilátky krys Sprague Dawley imunizovaných Hib-TT, Hib-rPorB • · · · · · * • · · · · · · ·>

• · · · · · « • 9 · · · · fefe · · a Hib-rP2, které se měří pomocí testu ELISA (enzymová imunoanalýza).

y

Obrázky č. 6A a 6b znázorňuji specifikou ELISA IgG odezvu pro RPR u krys proti konjugačním vakcínám Hib s různými nosičovými proteiny. Testovaly se dva různé přípravky HibrPorB (-1 a -2). Obrázek č. 6A je grafické znázornění tabulkových dat zobrazených na obrázku č. 6B.

Obrázek č. 7 znázorňuje graf zobrazující IgG specifiké pro polysacharid vyvolané konjugačními vakcínami Hib u myší CD-I.

Obrázek č. 8 znázorňuje graf ukazující IgG specifické pro polysacharid, které vyvolaly u krys konjugační vakcíny Hib.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Exprese, izolace, opětné svinutí a čištění rPorB

Bakteriální kmeny, růstové podmínky a reakční činidla.

Z organizmu N. miningitidis skupiny B kmen 44/76 (serotyp 15) se izolovala genomová DNA, přičemž se použily standardní postupy. Tato genomová DNA se použila jako templát pro polymerázovou řetězcovou reakci při amplifikaci genu proteinu třídy 3, jak se popisuje v publikaci Qi, H. L., J. Y. Tai and

M. S. Blake. 1994. Expression of large amounts of Neisserial porin proteins in Escherichia coli and refolding of the proteins into native trimers. Infect. Immun. 62: 2432-2439. Amplifikovaný produkt se klonoval do restrikčních míst Ndel a Xhol plazmidů pETl7b (firma Novagen), který se použil pro transformaci kompetentních buněk E. coli DH5ct. Z. vybraných klonů DH5a se izolovala plazmidová DNA . a použila se k transformaci buněk E. coli BL21 [DE3]-ÁompA. Transformanty se vybraly pomocí karbenicilinu a exprese se indukovala přidáním IPTG, až se dosáhlo konečné koncentrace 0,4 mM.

Nadměrná exprese proteinu rPorB v bakteriích E. coli a postupy opětného balení a čištění.

Množství exprimovaného proteinu rPorB v různých časech po indukci se monitorovalo tak, že se buněčné extrakty podrobily testu SDS-PAGE na gelech s 8 až 16 % gradientem za použití systému Novex (Novex, San Diego, CA) . Pak následuje obarvení briliantovou modří podle Comassie a denzitometrická analýza za použití Digital Imaging Systém, model IS-1000 (Alpha Innotech Co., San Leandro, CA). Nadměrně exprimovaný protein rPorB se izoloval resuspendováním a lyží bakteriálních buněk v Stanstedově zařízení na porušování buněk, kde se využívá vzduch (Stansted Fluid Power Ltd.), v pufru TEN (50 mM TrisHC1, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8,0). Pak následovala centrifugace a izolace peletu, který obsahuje agregovaný rPorB ve formě inkluzních tělísek (IB) . Po promýtí peletu 0,5 % deoxycholátem v pufru TEN, následují dvě promytí pufrem TEN. Protein se rozpustil resuspendováním a sonikací inkluzních tělísek v čerstvě připraveném roztoku 8 M močoviny po dobu 5 minut za použití sonikátoru s vodní lázní. Opětného svinutí rPorB do své přirozené konformace se dosáhlo použitím postupu opětného svinutí spojeného s použitím detergentu. Spojily se stejné objemy inkluzních tělísek rozpuštěných v močovině a 10 % Z 3-14 (Calbiochem). Konečný extrakt porinu se aplikoval na kolonu Sephacryl S-300 (5 x 100 cm) (Pharmacia Biotech lne.) uvedenou do rovnováhy pufrem, který obsahoval 100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA, 20 mM CaCl₂ a 0,05 % Z 3-14, pH 8,0. Testem SDS PAGE se identifikovaly frakce obsahující rPorB, spojily se a aplikovaly se na iontoměničovou kolonu Hiload QSepharose HP (2,6 x 20 cm) (Pharmacia) uvedenou do rovnováhy roztokem obsahujícím 25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1,0 mM EDTA a 0,05 % Z 3-14 pH 8,0. Na kolonu se aplikoval gradient 0,2 až 1,0 mM NaCl a protein rPorB se eluoval jako jediný pík. Koncentrace proteinu se odhadla měřením absorbance při vlnové délce 280 nm za použití HP model 8453 UV/Vis rychlého skenovacího spektrofotometru vybaveného detektorem se souborem diod (Hewlett-Packard Company, Palp Alto, CA) za použití koeficientu molární extinkce 41,960, který se vypočítal na základě obsahu aromatických aminokyselin v PorB podle publikace Mach et al. (Mach, H., C.R. Middaugh and R. V. Lewis. 1992. Statistical determination of the average values of the extinction coefficients of tryptophan and tyrosine in native proteins. Anal. Biochem. 200: 74-80).

Příklad 2: Produkce polysacharidů PRP, jeho čištění a oxidace

Fermentace organizmu H. ínfluenzae typ B o objemu 14 1 se uskutečnila za použití média MAE II. Organizmus H. ínfluenzae typ B kmen Eagan se získal ve formě inokulační kultury v objemu 4 ml uchovávané v mrazáku s ultra nízkou teplotou s kapalným dusíkem. Kultura se rozmrazila při teplotě místnosti po dobu .30 minut. 50 ml média MME II (10 mg/ml heminu) v láhvi o objemu 250 ml se inokulovalo inokulační kulturou o objemu 1 ml za vzniku kultury I (SI). Láhev s kulturou SI se inkubovala po dobu 10 hodin při teplotě 37 °C za stálého míchání při rychlosti 150 ot./min. v inkubátor’/ s možností míchání (Innova 4330, New Brunswick Sci.). 12 ml kultury SI se použilo pro inokulaci 600 ml kultivačního média MME II (10 mg/1 heminu) v Fernbachově nádobě o objemu 2,8 1, přičemž vzniká kultura Sil. Kultivační nádoba s kulturou Sil se inkubovala po dobu 9 hodin při teplotě 37 °C a při rychlosti míchání 150 ot./min. v inkubátoru s možností stálého míchání. K inokulaci 13,4 1 kultivačního média MME II (10 g/1 xylózy, 10 mg/1 heminu) ve fermentátoru BIOFLO IV (New Brunswick Sc.) o objemu 20 1 se použilo 600 ml (4 % (objemová procenta) inokulum) kultury Sil. Příklad fermentačního profilu je zobrazen na obrázku č. 2. Po deseti hodinách fermentace se začaly buňky sklízet mikrofiltrací za použití náplně s dutých vláken s velikostí pórů 0,2 pm s plochou povrchu 0,14 m², kterou tvoří polysulfon (Milipore). Permeát se sterilně filtroval do skleněného balónu o objemu 20 1 a ten se uchovával při teplotě 2 až 8 °C až do doby dalšího zpracování.

• 4 «# ·· 44 »4 · 99 4 4 4 4 · »4 6

4 4 4 · · * 4 « • 444 4 444 44 4

4 444 4444

44» 444 4· 4444 4· 44

Filtrát se pak prošel filtrem oddělující látky s molekulovou hmotností 300 000 (MWCO) (firma Milipore) a uchovával se dialyzovaný. Tento permeát se pak aplikoval na filtr oddělující látky s molekulovou hmotností 100 000 (MWCO) (firma Milipore) a jeho koncentrace se zvýšila na hodnotu vyšší než 20 mg/ml. Dialyzovaný roztok se oxidoval při teplotě 25 °C po dobu 2 hodin metaperiodátem sodným. Oxidovaný PRP se podrobil ultra filtraci na filtru 30 000 MWCO (firma Milipore) a dialyzovaný roztok se zachoval. Permeát se pak aplikoval na filtr 5 000 MWCO (Millipore) a jeho konečná koncentrace je vyšší než 90 mg/ml. Roztok se diafiltroval proti lyofilizoval se.

Příklad 3: Příprava konjugátu PRP-PorB

Čištěný rPorB se používaný při konjugaci je uveden na obrázku č. 3. Dříve popsaný oxidovaný polysacharid PRP se přidal k roztoku rPorB (v koncentraci 10 mg/ml v 0,25 M HEPES, 0,2 M NaCl a 0,05 % Zwittergen 3,14 pH 8,5) za vzniku roztoku polysacharidu o koncentraci 10 mg/ml. Po přidání kyanoborohydridu sodného, aby konečná koncentrace byla 6 mg/ml se roztok míchal po dobu 1 minuty. Roztok se pak umístil do vodní lázně s teplotou 28 až 30 °C na dobu 16 až 24 hodin.

Konjugační reakce se zastavila přidáním 2M roztoku etanolaminu s hodnotou pH 8,5 a roztok se inkuboval při teplotě 28 až 30 °C po dalších 16 až 24 hodin. Reakční směs se pak aplikovala na kolonu Superdex 200 prep Grade (Pharmacia), která se dříve uvedla do rovnováhy roztokem PBS obsahujícím 0,01 % thimerosal. Shromáždily se eluované frakce v objemu odpovídajícímu mezerovému prostoru kolony, jak se monitoruje absorbancí při UV s vlnovou délkou 280 nm, frakce se spojily a uchovávají se při teplotě 4 °C, pak se použijí k další analýze. Aby se odhadl obsah PRP provedly se dvě chemické analýzy (test orkinol/chlorid železitý/kyselina chlorovodíková (popisuje se v publikaci Reuter, G. And R. Schauer. 1994.

• φ φφ φφ φ· »· «· · · φ · φ φ · φφ φ φ φ φφ φφφφφ φ «φφφ «φφφφφ φ φ »«· ΦΦΦΦ • ΦΦ ·Φ· φφ ΦΦΦ· φ* φφ

Determination of sialic acids. P. 168-199. In: W. J. Lennarz and G. W. Hart, Methods in Enzymology Vol. 230 Techniques in Glycobiology. Academie Press, New York) a obsah rPorB (Coomassieův proteinový test (Bradford, Μ. M. 1976. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem. 72: 248-254.).

Příklad 4: Hodnocení konjugátu PRP-rPorB u krys

Samicím krys Sprague-Dawley (ve věku 4 až 6 týdnů) ve skupinách po deseti se v den 0, 28 a 49 zavedlo podkožní injekcí 10 μς konjugovaného PRP v 0,5. ml PBS, který obsahuje 0,01 % thimerasolu buď neabsorbovaném nebo předem absorbovaném na hydroxidu hlinitém (Alhydrogel, Superfos, Dánsko) (konečná elementární koncentrace hliníku je 1 mg/ml) . Zvířatům se krev . odebírala v den 0, 28, 38 a 49 a zvířata se nechala vykrvácet v den 59.

Stanovení protilátek v séru testem ELISA.

Konjugáty lidského sérového albuminu (HSA) (Sigma, St.

Louis, MO) používané v testech ELISA se připravily redukční aminací, jak se popisuje shora v textu. K HSA se přidal oxidovaný polysacharid PRP. Pak následuje redukce NaBH₃CN, jak se popisuje v publikaci Jennings, H. J., A. Gamian, F. Michon and F. E. Ashton. 1989. Unique intermolecular bacterial epitop involving the homosialopolysaccharide capsule on the cellular surface of group B Neisseria meningitidis and Escherichia coli K1. J. Immunol. 142: 3585-3591. Konjugáty se izolovaly gelovou filtrační chromatografii a uchovávaly se v suché a vysušené formě při teplotě -70 °C. Titry protilátek specifických pro PRP se stanovily testem ELISA. Polystyrénové mikrotitrační destičky s plochým dnem s 96 buňkami (NUNC Polysorb) (Nunc, Naperbille, IL) se potáhly konjugáty PRP-HSA v PBS (0,01 M fosforečnan sodný, 0,15 M NaCI, pH 7,4) «www· ·· ·· · « ♦ • · · · • r · 9

9 9 9

9 49 v množství 0,25 pg na prohlubeň (100 μΐ na prohlubeň) inkubací po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Pak následuje 5 krát promytí roztokem PBS-Tween (0,05 % (objem.) Tween 20 v PBS). Všechny následné inkubace se provedly při teplotě místnosti. Pro všechny promytí se používal roztok PBS-Tween. Potažené destičky se blokovaly PBS a 0,1 % (hmotn./objem.) karafiátovým sušeným netučným mlékem v množství 0,1 ml na jednu prohlubeň po dobu jedné hodiny. Pak následuje promytí. Sérum se dvakrát zředilo a vytvořily se duplikáty destiček, přičemž do jedné prohlubně se naneslo 100 μΐ séra a vše se inkubovalo po dobu jedné hodiny, pak následovalo promytí. Přidal se konjugát protilátek (peroxidázou značené kozí proti krysím protilátkám) (Kirkegaard and Perry Lab., Gaithersburg, MD) v množství 100 μΐ na prohlubeň a vše se inkubovalo po dobu 30 minut, pak následuje promytí. Přidal se roztok barviva a substrátu 1:1 (Kirkegaard and Perry TMB a peroxid) v množství 0,5 ml na prohlubeň a vše se inkubovalo po dobu 10 minut. Peroxidázová reakce se pak zastavila H₃PO₄ v množství 0,05 ml na prohlubeň. Destičky se odečítaly na zařízení Molecular Devices Emax (Molecular Devices, Menlo Park, CA) při vlnové délce 450 nm za použití referenční vlnové délky 650 nm. Absorbance pozadí se stanovila v několika prohlubních, které neobsahují sérum, a pro každou destičku se stanovily průměrné hodnoty. V případě každého ředění séra se odečetla průměrná hodnota absorbance pozadí. Pak se stanovil průměr duplicitních hodnot absorbance séra. Pro následnou analýzu dat se použil upravený Scatchardův graf, kde na osu Y se vynesly hodnoty absorbance a na osu X absorbance násobeno obrácenou hodnotou ředění (Fusco, P. C. 1983. Studies on Escherichia coli somatic pili: Phenotypic expression, serological specifity, and physicochemical characterization. Ph. D. Thesis, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA; Hanson, M. S. and C. C. Brinton, Jr. 1988. Identification and characterization of the Escherichia coli type 1 pilus tip adhesion protein. Nátuře 332: 265-268). Za «9 ·* 99 99 • 9 9 9 9 9 9 9 9 • *9·· · 9 · 9 9 9 • · ··· 9 9 9 9

999 999 99 9999 9· 99 podmínek, kdy se dosáhne rovnováhy a při nadbytku protilátek se pro každou sérii ředění séra získá přímá čára. Tato čára se za účelem stanovení titru protilátek extrapolovala k ose X. Aby se standardizovaly všechny séra, čímž se minimalizují odchylky jednotlivých dní a destiček, použilo se pozitivní kontrolní sérum s předem stanoveným titrem. Výsledky uvedených testů, které porovnávají konjugát PorB-PRP (s nebo bez adjuvans alum) s konjugáty konstruovanými z toxoidu tetanu CRM, se uvádějí na obrázcích 4 a 5A až 5H.

Příklad 5: Porovnání Hib-rPorB, Hib-TT a dvou běžně dostupných vakcín Hib

Porovnaly se imunostímulační účinky dvou přípravků konjugátu Hib-rPorB (Hib-rPorB-Ι a Hib-rPorB-2), konjugátu Hib-TT (toxoid tetanu a dvou běžně dostupných vakcín (HbOC od firmy Lederle Laboratories, Division of American Cyanamide Company, Pearl River, NY (nosič je CRM) a PRP-T od firmy Connaught Laboratories, lne., Swiftwater, PA (nosičem je toxoid tetanu).

Krysy (4 až 6 týdnů staré) se imunizovaly 10 pg konjugovaného PRP v den 1, 28 a 49. V den 28, 38, 49 a 59 se odebraly vedla pre-imunizovaných vzorků také vzorky séra. Výsledky jsou uvedeny na obrázcích č. 6A a 6B. IgG titr stanovený testem ELISA ukazuje na přítomnost protilátek proti pólysacharidům.

Grafické zobrazení dat na obrázku č. 6A ukazuje, že konjugáty Hib-rPorB produkují odezvu přibližně dvakrát vyšší než jiné . konjugované vakcíny. Obrázek č. 6B zobrazuje odpovídající data v tabulce. Termín „reagující zvíře znamená zvíře, které vykazuje titry IgG stanovené testem ELISA vyšší nebo rovny čtyřnásobku pre-imunizovaných hodnot, kde tyto hodnoty jsou nižší než 50 a v případě výpočtu se upravily na hodnotu 25. Podobné experimenty srovnávající Hib-TT, Hib28

• · · »· · rPorB-1 a Hib-rPorB-2 se uskutečnily u myší za použití dávek konjugátů 5,0 μg a 0,5 μg. Data jsou uvedena na obrázku č. 7.

S konjugáty Hib-TT a Hib-CRM se porovnávalo osm různých přípravků Hib-rPorB (zobrazeno na obrázku č. 8 A až H) . Přípravky Hib-rPorB vykazují stále dvakrát vyšší stimulační schopnost ve srovnání s konjugáty Hib-TT nebo Hib-CRM, což ukazuje množství anti-polysacharidových IgG protilátek u krys stanovených testem ELISA. Tůto data jsou zobrazen;) na obrázku č. 8 .

Claims (19)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Konjugát opětně svinutého proteinu (rPorB) vnější membrány meningokoků a v podstatě čistého polysacharidu mikroorganizmu H. influenzae typ b (Hib).
2. 2. Konjugát podle nároku 1, kde molekulová hmotnost uvedeného polysacharidu je v rozmezí 5 000 až 50 000.
3. 3. Konjugát podle nároku 1, který se získal redukční aminací polysacharidu Hib a rPorB, přičemž polysacharid Hib se oxidoval nebo selektivně hydrolyzoval za vzniku aldehydových skupin.
4. 4. Konjugát podle nároku 1, který se získal redukční aminací polysacharidu Hib a rPorB, přičemž polysacharid Hib se oxidoval za vzniku aldehydových skupin.
5. 5. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že uvedený rPorB je rPorB třídy 3.
6. 6. Způsob přípravy konjugátu polysacharid Hib-rPorB, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) získání polysacharidu Hib, (b) oxidaci a selektivní hydrolýzu uvedeného polysacharidu za vzniku aldehydových skupin, (c) získání rPorB a (d) konjugaci polysacharidu obsahujícího aldehydové skupiny s rPorB redukční aminací.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující setím, ž e uvedený polysacharid Hib se oxiduje a jeho molekulová hmotnost je v rozmezí 5 000 až 50 000.
8. 8. Způsob podle libovolného z nároků 6 až 7, vyznačující se tím, že uvedený rPorB je rPorB třídy 3.
9. 9. Konjugát získaný způsobem podle nároku 6.
10. 10. Konjugát získaný způsobem podle nároku 8.

    • φ φφ φφ φφ ·· φφ φφ · · φ φ φφφφ • · · · · · φ · φ • φφφφ φφφ φφφ • · φφφ φφφφ φφφ φφφ φφ φφφφ φφ φφ
11. 11. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje konjugát podle nároku 1 nebo 9 a farmaceuticky přijatelný nosič.
12. 12. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje konjugát podle nároku 10 a farmaceuticky přijatelný nosič.
13. 13. Způsob vyvolání imunitní odezvy na mikroorganizmus H.

    Ínfluenzae u živočicha, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci konjugátu podle nároku 1 nebo 9 živočichovi v množství, které je účinné pro vyvolání uvedené imunitní odezvy.
14. 14. Způsob vyvolání imunitní odezvy na mikroorganizmus H. ínfluenzae u živočicha, vyznačující se tím, ž e zahrnuje aplikaci konjugátu podle nároku 10 živočichovi v množství, které je účinné pro vyvolání uvedené imunitní odezvy.
15. 15. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, ž e se uvedený konjugát získal redukční aminací polysacharidů Hib a rPorB, přičemž se polysacharid Hib oxidoval za vzniku aldehydových skupin.
16. 16. Způsob podle nároku 14, vyzná čuj ící se tím, že uvedený konjugát se získal redukční aminací polysacharidů Hib a rPorB, přičemž se polysacharid Hib oxidoval za vzniku aldehydových skupin.
17. 17. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že uvedený polysacharid má molekulovou hmotnost v rozmezí 5 000 až 50 000.
18. 18. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedený polysacharid má molekulovou hmotnost v rozmezí 5 000 až 50 000.
19. 19. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že uvedený rPorB je rPorB třídy 3.