BRPI0607374B1

BRPI0607374B1 - vacinas de vesículas baseadas em gna1870 para proteção de amplo espectro contra doenças causadas por neisseria meningitidis

Info

Publication number: BRPI0607374B1
Application number: BRPI0607374A
Authority: BR
Inventors: M Granoff Dan; Hou Victor
Original assignee: Childrens Hospital & Res Center At Oakland
Priority date: 2005-01-27
Filing date: 2006-01-23
Publication date: 2020-04-22
Also published as: EP1855715B1; US20210308247A1; CA2590974A1; AU2006208208A1; EP2682126B1; JP4993750B2; US20170065699A1; CA2590974C; US9452208B2; MX2007008785A; JP2008528597A; US20120093867A1; US9034345B2; NZ555937A; BRPI0607374B8; BRPI0607374A2; AU2006208208B2; US20180369356A1; SI2682126T1; CY1118732T1

Abstract

vacinas de vesículas baseadas em gna187o para proteção de amplo espectro contra doenças causadas por neisseria meningitidis. a presente invenção refere-se geralmente métodos e composições para elicitar uma resposta imunológica contra bactérias da espécie neisseria em um paciente, particularmente contra uma cepa do sorogrupo b de neisseria meningitídís.

Description

(54) Tftulo: VACINAS DE VESÍCULAS BASEADAS EM GNA1870 PARA PROTEÇÃO DE AMPLO ESPECTRO CONTRA DOENÇAS CAUSADAS POR NEISSERIA MENINGITIDIS (51) Int.CI.: A61K 39/02; A61K 39/116; A61K 39/00; A61K 39/095; A61K 38/00; (...).

(30) Prioridade Unionista: 27/01/2005 US 60/647,911.

(73) Titular(es): CHILDREN'S HOSPITAL & RESEARCH CENTER AT OAKLAND.

(72) Inventor(es): DAN M. GRANOFF; VICTOR HOU.

(86) Pedido PCT: PCT US2006002523 de 23/01/2006 (87) Publicação PCT: WO 2006/081259 de 03/08/2006 (85) Data do Início da Fase Nacional: 24/07/2007 (57) Resumo: VACINAS DE VESÍCULAS BASEADAS EM GNA187O PARA PROTEÇÃO DE AMPLO ESPECTRO CONTRA DOENÇAS CAUSADAS POR NEISSERIA MENINGITIDIS. A presente invenção refere-se geralmente métodos e composições para elicitar uma resposta imunológica contra bactérias da espécie Neisseria em um paciente, particularmente contra uma cepa do sorogrupo B de Neisseria meningitidis.

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para VAGINAS DE VESÍCULAS BASEADAS EM GNA1870 PARA PROTEÇÃO DE AMPLO ESPECTRO CONTRA DOENÇAS CAUSADAS POR NEISSERIA MENINGITIDIS.

Referência-Cruzada a Pedidos de Patente Relacionados . Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade de pedido de patente provisório US 60/647 911, depositado em 27 de janeiro de 2005, cujo pedido de Patente é incorporado por referência em sua totalidade.

Declaração Com Relação a Pesquisa Patrocinada Federalmente

Esta invenção foi realizada com suporte governamental sob subvenções de Public Health Service N^& RO1 AI46464, R21 AI061533, do National Institute of Allergy and Infectious Diseases of the National Institutes of Health, e T32-HL007951, do National Heart, Lung e Blood Institute of the 15 National Institutes of Health. O governo pode ter certos direitos nesta invenção.

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se a vacinas de amplo espectro para a prevenção de doenças causadas por Neisseria meningitidis.

Antecedentes da Invenção

Neisseria meningitidis é uma bactéria Gram-negativa que coloniza o trato respiratório superior humano e é responsável por surtos epidêmicos cíclicos e esporádicos em todo mundo de, mais notavelmente, meningite e sepsia. As taxas de ataque e morbidez são mais altas em crianças abaixo 25 de 2 anos de idade. Como bactérias Gram negativas, Neisseria meningitidis tipicamente possui uma membrana citoplásmica, uma camada peptidoglicano, uma membrana externa que junto com o polissacarídeo capsular constitui a parede bacterial, e pêlos que projetam no ambiente externo. Cepas encapsuladas de Neisseria meningitidis são a principal causa de meningite 30 bacterial e septicemia em crianças e adultos jovens (Rosenstein e outros. J Infect Dis 1999;180:1894-901).

Humanos são o único reservatório para Neisseria meningitidis spp. Da mesma maneira, espécies Neisserial evoluíram uma ampla variedade de estratégias altamente eficazes para iludir o sistema imune humano. Estas incluem expressão de uma cápsula de polissacarídeo que é estruturalmente idêntica com ácido poli siálico de hospedeiro (isto é, sorogrupo B) e alta mutabilidade antigênica para os epitopos não-capsulares imunodominantes, isto é, epitopos de antígenos que estão presentes na superfície em quantidades relativamente grandes, são acessíveis a anticorpos, e elicitam uma forte resposta anticorpo.

A predominância e importância econômica de infecções invasi10 vas de Neisseria meningitidis dirigiram a pesquisa por vacinas eficazes que possam conferir imunidade através de sorotipos, e particularmente através de grupo B de sorotipos ou sorosubtipos. Entretanto, muitos esforços para desenvolvimento de vacinas de amplo espectro foram impedidos por uma ampla variedade de estratégias altamente eficazes usadas por espécies 15 Neisseriais para iludir o sistema imune humano.

Vacinas de base capsular são disponíveis para prevenção de doença causada por grupo de cepas A, C, Y e W-135 (revisto em Granoff e outros., Meningococcal Vaccines. In: Plotkin AS, Orenstein WA, eds. Vaccines. 4^th ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company, 2003). Entretanto, não 20 há vacina aprovada para uso nos Estados Unidos ou Europa para prevenção de doença causada -por cepas de grupo B, que totalizam cerca de 30% de doença em América do Norte (Lingappa e outros. Vaccine 2001; 19:4566-75; Raghunathan e outros. Annu Ver med 2004: 55:333-5) e mais que doisterços de casos na Europa (Cartwright e outros. Vaccine 2001; 19:4347-56; 25 Trotter e outros. Lancet 2004; 364:365-7). Uma razão para a falta de uma vacina de base capsular de grupo B é que a cápsula de grupo B pode elicitar uma resposta de auto-anticorpo em seres humanos (Finne e outros. Lancet 1983; 2:355-7), e o polissacarídeo é pobremente imunogênico, mesmo quando conjugado a proteínas veiculares (Jennings e outros. J Immunol 30 1981;127:1011-8). Também existem potenciais assuntos de segurança para uma vacina de grupo B de base capsular que seja capaz de elicitar anticorpos anticapsulares grupo B auto-reativos. Por isso, recente pesquisa de va cina meningocócica de grupo B focalizou sobre o uso de antígenos nãocapsulares.

Vacinas de vesícula de membrana externa (OMV) foram provadas ©licitarem imunidade protetora contra doença meningocócica de grupo B 5 em seres humanos (revisto por Jodar e outros. Lancet 2002;359:1499-1508).

Recentemente uma vacina OMV foi licenciada e introduzida na Nova Zelândia em resposta a uma intervenção na saúde pública para impedir epidemia de grupo B que prosseguia por mais de uma década (Thomas e outros. NZ Med J2004; 117:U1016; Desmond e outros. Nurs N Z 2004; 10:2; Baker e 10 outros. J Paediatr Child Health 2001; 37:813-9). Outras abordagens baseadas em vesículas para imunização foram descrita (ver, por exemplo, Cartwright K e outros., 1999, Vaccine; 17:2612-2619; de Kleinjn e outros., 2000, Vaccine, 18:1456-1466; Rouupe van der Voort ER, 2000, Vaccine, 18:13341343; Tappero e outros., 1999, JAMA 281:1520; Rouupe van der Voort ER, 15 2000, Vaccine, 18:1334-1343; US 2002/0110569: WO 02/09643).

Imunização de crianças e adultos com vacinas de vesícula de membrana exterior meningocócica (OMV) induz anticorpos bactericidas de soro, um correlato sorológico de proteção contra doença (Goldschneider e outros., 1969, J. Exp. Med. 129:1307). A eficácia de vacinas OMV para pre20 vençâo de doença meningocócica B também foi diretamente demonstrada em crianças mais velhas e adultos em experimentos clínicos prospectivos, randomizados, e em estudos de controle - caso retrospectivos. Assim, a eficácia clínica de vacinas de vesícula de membrana exterior não está em disputa. Tais vacinas são licenciadas para uso em crianças em Nova Zelândia, 25 e perto de licenciamento em Noruega para uso em crianças mais velhas e adultos, e estão em desenvolvimento clínico de estágio avançado para licenciamento em outros países Europeus. Uma vacina OMV preparada pelo Finley Institute em Cuba também é comercialmente disponível e tem sido dada a milhões de crianças na América do Sul.

Entretanto, a resposta de anticorpo bactericida de soro para vacinas OMV tende a ser específica de cepa (Tappero e outros., 1999, JAMA 281:1520; e Rouupe van der Voort ER, 2000, Vaccine, 18:1334-1343). Além

J disso, vacinas OMV correntemente disponíveis também são limitadas em que as respostas de anticorpo bactericida são grandemente direcionadas contra laços expostos na superfície de uma principal proteína porina, PorA (Tappero e outros. JAMA 1999; 281:1520-7), que é antigenicamente variável (Sacchi e outros. J Infect Dis 2000; 182:1169-76). Devido à imunodominância de PorA, a imunidade induzida é predominantemente específica para as cepas a partir das quais as vesículas de membrana foram obtidas ((Tappero e outros., 1999, JAMA 281:1520; Martin SL e outros., 2000, Vaccine, 18:2476-2481). Assim, vacinas OMV são úteis para prevenção de doença em situações epidêmicas causadas por uma cepa meningocócica predominante com um sorosubtipo PorA simples, tal como a cepa epidêmica P1.4 na Nova Zelândia (Baker e outros. 2001, supra). Entretanto, existe considerável diversidade PorA entre cepas causando doença endêmica tal como aquela encontrada nos US (Sacchi e outros. 2000, supra). Além disso, mesmo menores polimorfismos de aminoácido podem diminuir suscetibilidade de cepas à atividade bactericida de anticorpos para PorA (Martin e outros., Vaccine 2000;18:2476-81).

O término de projetos de seqüenciamento de genoma para várias cepas de Neisseria meningitidis proporcionou um catálogo de todos os potenciais antígenos de proteína meningocócica. Através de uma combinação de bioinformática, tecnologia de microarranjo, proteômicas e seleção imunológica, um grande número de novos candidatos a vacina meningocócica foram identificados (Pizza e outros. Science 2000; 287:1816-20; De Groot e outros. Expert Rev Vaccines 2004; 3:59-76), Entre estes numerosos candidatos está o Antígeno Neisserial derivado de Genoma 1870 (GNA1870). GNA1870, que é também conhecido como NMB 1870 (WO 2004/048404) ou LP2086 (ver, por exemplo, Fletcher e outros. Infect Immun 2004 72:20882100), é uma lipoproteína de aproximadamente 27 kDa expressa em todas as cepas de N. meningitidis testadas (Masignani e outros. J Exp Med 2003;197:789-99; Giuliani e outros. Infect. Immun 2005; 73:1151-60; Welsch e outros. J Immunol 2004; 172:5606-15).

Cepas de N. meningitidis podem ser subdivididas em três grupos variantes GNA1870 (v.1, v.2 e v.3) baseado em variabilidade de seqüência de aminoácidos e reatividade - cruzada imunológica (Masignani e outros. J Exp Med 2003; 197:789-99). Cepas variante 1 são responsáveis por cerca de 60% de isolados de grupo B produzindo doença (Masignani e outros.

2003, supra). Dentro de cada grupo variante, existe da ordem de cerca de

92% ou maior conservação de seqüência de aminoácidos.

Camundongos imunizados com GNA1870 recombinante desenvolveram altas respostas de anticorpo bactericida em soro contra cepas expressando proteínas GNA1870 do grupo variante homólogo (Masignani e 10 outros. 2003, supra; Welsch e outros. 2004, supra). Entretanto, um número de cepas que expressaram subvariantes da respectiva proteína GNA1870 foram resistentes a bacteriólise mediada com complemento anti-GNA1870. Embora a causa deste fenômeno não seja conhecida, concebivelmente isto pode ser devido a menores polimorfismos de GNA1870, ou devido a diferen15 ças de cepa na capacidade de acesso de epitopos de GNA1870 críticos sobre a superfície das bactérias que resulta em diminuída ligação e/ou ativação de complemento pelos anticorpos anti-GNAl870. A vacina de proteína GNA1870 recombinante usada nos estudos de imunogenicidade acima foi expressa em E.coli como uma proteína His-Tag destituída do peptídeo líder. 20 A proteína recombinante também careceu de motivo necessário para lipidação pós-transducional, que pode diminuir imunogenicidade (Fletcher e outros. Infect Immun 2004; 72:2088-100).

O potencial de vacina de uma combinação de PorA recombinante e GNA1870 recombinante foi explorado (Fletcher e outros. Infect Immun 25 2004, 72:2088-1200). Não houve interferência aparente nas respostas de anticorpo para os dois antígenos quando a vacina combinação foi dada a camundongos. Entretanto, a combinação recombinante requereu restauração de conformação de epitopos PorA, que são necessários para elicitação de anticorpos bactericides anti-PorA (ver, por exemplo, Christodoulides e 30 outros., Microbiology, 1998;144:3027-37 e Muttilainen e outros., Microb Pathog 1995;18:423-36). Também, a vacina recombinante de combinação não foi mostrada para aperfeiçoar anticorpos bactericides anti-GNA1870 contra cepas de N. meningitidis expressando subvariantes da proteína GNA1870 usada na vacina.

0’Dwyer © outros. (Infect Immun 2004;72:6511-80) descreve preparação de uma vacina de vesícula de membrana exterior (OMV) a partir 5 de uma cepa de N.ílavescens comensal que foi engenheirada geneticamente para expressar proteína A de superfície Neisserial (NspA), um candidato a vacina de proteína de membrana meningocócica altamente conservada que não é expressa naturalmente por N. flavescens. Os camundongos imunizados desenvolveram atividade opsonofagocítica de soro específica - NspA.

Também, após absorção de anticorpos para a OMV, os anticorpos anti-NspA residuais conferiram proteção passiva para camundongos que receberam um desafio letal de uma cepa de N. meningitidis encapsulada. Entretanto, os anticorpos elicitados pela vacina OMV de N.ílavescens modificada neste estudo não foram mostrados renderem superior proteção para aqueles elicita- dos pela OMV de N. flavescens que não expressa o antígeno heterólogo. Também, a OMV de N. flavescens modificada não elicita respostas de anticorpo bactericida em soro enquanto em estudos prévios, camundongos imunizados com NspA recombinante expressa em vesículas de E. coli (Moe e outros, infect Immun 1999;67:5664-75; Moe e outros. Infect Immun

2001;69:3762-71), ou reconstituída em lipossomas (Martin e outros, em:

Thirteenth International Pathogenic Neisseria Conference. Oslo: Nordberg Aksidenstrykkeri AS, 2002), desenvolveram anticorpo bactericida em soro. Publicação PCT WO 02/09746 e publicação US 2004012689 também descreve OMV preparada de cepas engenheiradas para superexpressarem um antígeno Neisserial, com NspA, Omp85, pili (PilQ, PilC), PorA, PorB, Opa,

Tbp2, TbpA, TbpB, Hsf, P1dA, HasR, FrpA/C, FrpB, Hap, LbpA/LbpB, FhaB, Iipo02, M1tA, e ctrAi listadas como exemplos específicos de tais antígenos.

A presente invenção supera as desvantagens das abordagens da técnica anterior para vacinação e elicita imunidade protetora contra um 30 amplo espectro de cepas de Neisseria meningitidis, notavelmente (mas não exclusivamente) incluindo cepas pertencendo ao sorogrupo B.

Literatura

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Sumário da Invenção

A presente invenção provê geralmente processos e composições para elicitação de uma resposta imune contra bactérias Neisseria spp.

em um sujeito, particularmente contra uma cepa de sorogrupoB de Neisseria meningitidis.

Em um aspecto, a invenção caracteriza composições compreendendo vesículas antigénicas preparadas de uma primeira bactéria de espécie Neisseria, onde a bactéria de espécie Neisseria produz um nível de um 10 polipeptídeo GNA1870 suficiente para prover a produção de uma vesícula que, quando administrada a um sujeito, elicita anticorpos anti-GNA1870; e um veículo farmaceuticamente aceitável. A vesícula pode ser vesículas de membrana exterior (OMVs), microvesículas (MV), ou uma mistura de OMVs e MVs. A bactéria de espécie Neisseria pode ser uma bactéria ocorrendo 15 naturalmente, ou modificada geneticamente em produção de polipeptídeo

GNA1870 (por exemplo, para prover expressão de um polipeptídeo GNA1870 de um promotor heterólogo, para expressar um polipeptídeo GNA1870 exógeno, e similares). O polipeptídeo GNA1870 pode ser endógeno para a célula hospedeira. Em algumas modalidades, a bactéria da espécie Neisseria é geneticamente modificada para interromper produção de um polipeptídeo GNA1870 endógeno, e é geneticamente modificada para produzir um polipeptídeo GNA1870 a partir de um ácido nucléico exógeno para a célula hospedeira. Em outras modalidades, a bactéria de espécie Neisseria é geneticamente modificada para produzir pelo menos dois diferentes polipeptídeos GNA1870 (por exemplo, polipeptídeos GNA1870 de diferentes grupos variantes (v.1, v.2, e v.3). Ainda em modalidades relacionadas, a bactéria de espécie Neisseria é deficiente em produção de polissacarídeo capsular.

Em uma modalidade, a composição ainda compreende uma vesícula antigênica preparada a partir de uma segunda bactéria de espécie Neisseria, onde a segunda bactéria de espécie Neisseria produz um nível de um polipeptídeo GNA1870 suficiente para prover produção de vesículas que, quando administradas a um sujeito, elicitam anticorpos anti-GNA1870, e onde a segunda bactéria espécie Neisseria é geneticamente diversa da primeira bactéria de espécie Neisseria (por exemplo, as primeira e segundas bactéria diferem em pelo menos um de sorogrupo, sorotipo, ou sorosubtipo). Ainda em modalidades relacionadas, o polipeptídeo GNA1870 da segunda bactéria de espécie Neisseria é diferente do polipeptídeo GNA1870 das primeiras bactérias de espécie Neisseria.

Em uma outra modalidade, a composição ainda compreende uma vesícula antigênica preparada a partir de uma terceira bactéria de espécie Neisseria, onde a segunda bactéria de espécie Neisseria produz um nível de um polipeptídeo GNA1870 suficiente para prover produção de vesículas que, quando administradas a um sujeito elicitam anticorpos antiGNA1870, e onde a terceira bactéria de espécie Neisseria é geneticamente diferente da primeira bactéria de espécie Neisseria (por exemplo, difere em peto menos um de sorogrupo, sorotipo, ou sorosubtipo). Em modalidades relacionadas os polipeptídeos GNA1870 da primeira, segunda e terceira bactéria da espécie Neisseria são diferentes.

Em uma modalidade de interesse específico, a composição compreende uma primeira vesícula antigênica preparada a partir de uma 5 primeira bactéria Neisseria meningitidis geneticamente modificada para superexpressar um polipeptídeo GNA1870; uma segunda vesícula antigênica preparada de uma segunda bactéria Neisseria meningitidis geneticamente modificada para superexpressar um polipeptídeo GNA1870: e um veículo farmaceuticamente aceitável; onde o polipeptídeo GNA1870 das primeira e 10 segunda bactérias são diferentes grupos variantes de polipeptídeo GNA1870, e as primeira e segunda bactérias produzem diferentes polipeptídeos PorA. Em uma modalidade relacionada, a composição ainda compreende uma terceira vesícula antigênica preparada de uma terceira bactéria de Neisseria menigitidis geneticamente modificada para superexpressar um 15 polipeptídeo GNA1870, onde o polipeptídeo GNA 1870 da terceira bactéria é de um diferente grupo variante de polipeptídeo GNA1870 que aquele das primeira e segunda bactérias, e onde a terceira bactéria produz um polipeptídeo PorA diferente do polipeptídeo PorA das primeira e segunda bactérias. Ainda em modalidades relacionadas, as vesículas são preparadas sem o 20 uso de um detergente.

Em um outro aspecto a invenção caracteriza um processo de produção de uma composição antigênica através de cultura de uma bactéria de espécie Neisseria produzindo um polipeptídeo GNA1870, onde o polipeptídeo GNA1870 é produzido em um nível suficiente para prover produção de 25 vesículas que, quando administradas a um sujeito, elicitam anticorpos antiGNA1870; preparação de vesículas a partir da bactéria cultivada; e combinação de vesículas com um veículos farmaceuticamente aceitável para produzir uma composição antigênica apropriada para administração a um sujeito. As primeira e segunda vesículas podem ser, independentemente, uma 30 vesícula de membrana externa (OMV) ou uma microvesícula (MV). A bactéria da espécie Neisseria pode ser uma bactéria ocorrendo naturalmente e assim expressarem GNA1870 endógeno, ou geneticamente modificadas em

JI to produção de polipeptídeo GNA1870 (por exemplo, para provimento de expressão de um polipeptídeo GNA1870 a partir de um promotor heterólogo, para expressar um polipeptídeo GNA1870 exógeno, e similares). O polipeptídeo GNA1870 pode ser endógeno para a célula hospedeira. Em algumas 5 modalidades, a bactéria de espécie Neisseria é geneticamente modificada para interromper produção de um polipeptídeo GNA1870 endógeno. Em outras modalidades, a bactéria de espécie Neisseria é geneticamente modificada para produzir pelo menos dois diferentes polipeptídeos GNA1870 (por exemplo, polipeptídeos GNA1870 de diferentes grupos variantes (v.1, v.2, e 10 v.3). Em outras modalidades, a bactéria de espécie Neisseria é geneticamente modificada para interromper produção de um polipeptídeo GNA1870 de inteiro comprimento endógeno, e produz um polipeptídeo GNA1870 a partir de um ácido nucléico exógeno para a célula hospedeira. Ainda em modalidades relacionadas, a bactéria da espécie Neisseria é deficiente em 15 produção de polissacarídeo capsular.

Em um outro aspecto a invenção caracteriza um processo de elicitaçâo de uma resposta imune contra Neisseria através de administração a um mamífero de uma quantidade imunologicamente efetiva de uma composição compreendendo uma primeira preparação antigênica compreenden20 do vesículas preparadas a partir de uma primeira bactéria da espécie Neisseria, onde a bactéria de espécie Neisseria produz um nível de polipeptídeo GNA1870 suficiente para prover produção de vesículas que, quando administradas a um sujeito, elicitam anticorpos anti-GNA1870; onde a dita administração é suficiente para elicitar uma resposta imune para um polipeptídeo 25 GNA1870 presente nas vesículas. As vesículas podem ser vesículas de membranma externa (OMVs), microvesículas (MVs), ou uma mistura de OMVs e MVs. A bactéria espécie Neisseria pode ser uma bactéria ocorrendo naturalmente e assim expressar um GNA1870 endógeno, ou geneticamente modificada em produção de polipeptídeo GNA1870 (por exemplo, para pro30 ver expressão de um polipeptídeo GNA1870 a partir de um promotor heterólogo, para expressar um polipeptídeo GNA1870 exógeno, e similares). O polipeptídeo GNA1870 pode ser endógeno para a célula hospedeira. Em /0 algumas modalidades, a bactéria de espécie Neisseria é geneticamente modificada para interromper produção de um polipeptídeo GNA1870 endógeno. Em outras modalidades, a bactéria de espécie Neisseria foi engenheirada para superexpressar GNA1870. Ainda em outras modalidades, o polípeptí5 deo GNA1870 é uma proteína quiméríca (uma proteína de fusão), onde a proteína quiméríca contém pelo menos uma porção antigênica de GNA1870 para apresentação sobre vesículas (por exemplo, OMVs, MVs). Ainda em modalidades relacionadas, a bactéria de espécie Neisseria é deficiente em produção de polissacarídeo capsular.

Em outras modalidades, a bactéria da espécie Neisseria é geneticamente modificada para produzir pelo menos dois polipeptídeos GNA1870 diferentes (por exemplo, polipeptídeos GNA1870 de diferentes grupos variantes (v.1, v.2, e v.3). Em outras modalidades, a bactéria espécies Neisseria é geneticamente modificada para interromper a produção de um polipeptídeo 15 GNA1870 de inteiro comprimento endógeno. e produz um polipeptídeo

GNA1870 a partir de um ácido nucléico exógeno para a célula hospedeira.

Em modalidades relacionadas, a composição administrada no processo compreende uma quantidade imunologicamente efetiva de uma segunda preparação antigênica compreendendo vesículas preparadas a par20 tir de uma segunda bactéria da espécie Neisseria, onde a segunda bactéria da espécie Neisseria produz um nível de um polipeptídeo GNA1870 suficiente para prover produção de vesículas que, quando administradas a um sujeito, elicitam anticorpos anti-GNA1870, e onde a segunda bactéria da espécie Neisseria é geneticamente diferente da primeira bactéria da espécie Neisse25 ria (por exemplo, as primeira e segunda bactérias são de um diferente sorogrupo, ou sorosubtipo). O polipeptídeo GNA1870 da segunda bactéria de espécie Neisseria pode ser diferente do polipeptídeo GNA da primeira bactéria de espécie Neisseria.

Ainda em modalidades relacionadas, a composição ainda com30 preende uma terceira preparação antigênica isolada compreendendo vesículas preparadas de uma terceira bactéria de espécie Neisseria, onde a segunda bactéria de espécie Neisseria produz um nível de um polipeptídeo

GNA1870 suficiente para prover produção de vesículas que, quando administradas a um sujeito, elicitam anticorpos anti-GNA1870, e onde a terceira bactéria de espécie Neisseria é geneticamente diferente das primeira e segunda bactérias de espécies neisseria (por exemplo, a primeira, segunda e terceira bactérias de espécies Neisseria sâo geneticamente diferentes em que elas diferem em pelo menos um de sorogrupo, sorotipo ou sorosubtipo). Os polipeptídeos GNA1870 da primeira, segunda e terceira bactérias de espécies Neisseria podem ser diferentes.

O método pode prover elicitação de uma resposta imune protetorano sujeito contra mais de uma cepa de Neisseria, particularmente N. meningitidis, mais particularmente Neisseria meningitidis sorogrupo B.

As composições antigênicas aqui descritas podem elicitar uma combinação de ótimas repostas de anticorpo bactericida anti-GNA1870, antiPorA, e/ou anti-OpC e, pelo que, conferir ampla proteção contra doença meningocócica.

Vacinas preparadas de cepas superexpressando GNA1870 como aqui descrito podem elicitar uma resposta de anticorpo que é bactericida para cepas Neisseriais que compartilham a variante GNA 1870 e/ou PorA da cepa a partir da qual as vesículas foram preparadas, assim como uma resposta de anticorpo que é bactericida para cepas Neisseriais que têm uma subvariante de GNA1870 e têm PorA heterólogo em relação à cepa de produção de vesícula.

Vacinas preparadas de cepas superexpressando GNA1870 também podem diminuir a probabilidade de seleção e emergência de cepas de N.meningitidis causando doença na população com diminuída expressão de PorA. Estes mutantes são de particular conceito se vacinas OMV convencionais são amplamente usadas na população. Proque expressão de PorA é variável - fase (van der Ende e outros., J. Bacteriology 1995:177:24752480), e mutantes deficientes em expressão de PorA são relativamente co30 muns e podem ser facilmente selecionados através de morte de N. meningitidis com anticorpo anti-PorA e complemento. Cepas deficientes -PorA também são virulentas e capazes de causarem doença.

A presente descrição também provê processos que podem ser vantajosos com relação à facilidade de preparação de uma composição efetiva de vacina em relação apreparaçâo de vacina envolvendo um polipeptídeo recombinante, ou uma formulação de vacina combinação que incorpora 5 múltiplos antígenos individuais, ou uma proteína recombinante tal como PorA que requer renaturação de epitopos conformacionais para elicitar anticorpo bactericida.

Aspectos, características, e vantagens da invenção serão facilmente aparentes para aqueles versados na técnica com leitura da presente 10 descrição.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1A mostra os resultados de um experimento de citometria de fluxo medindo ligação de anticorpos anti-GNA1870 sobre a superfície de células de N.meningitidis encapsuladas vivas de cepa RM1090 e mutan15 tes RM1090 como determinada por fluorescência indireta. Fila A. cepa RM1090AGNA1870. Fila B. cepa tipo selvagem de RM1090. Fila C. cepa RM1090 transformada com vetor lançador pFP12 contendo o gene GNA1870. Coluna 1. Soro controle negativo (diluição 1:10) de camundongos imunizados com fosfato de alumínio sozinho. Coluna 2. Controle positivo de 20 polissacarídeo mAb anti-grupo C (10 pg/mL). Coluna 3. Controle positivo mAb anti-PorA (anti-P1.2, diluição 1:500). Coluna 4. mAb anti-GNA1870 (v.1) (2 pg/mL). Coluna 5. Anti-soros anti-GNA1870 policlonais preparados contra proteínas recombinantes dev.1,2e3 (diluição 1:10). Coluna 6. Idêntica a coluna 5 mas uma diluição 1:250 de soro.

A Figura 1B mostra a ligação de anticorpos à superfície de células de N. meningitidis Grupo B como determinada por citometria de fluorescência indireta. Fila 1: cepa H44/76 tipo selvagem (área cinza); mutante H44/76 superexpressando GNA1870 (área negra). Fila 2. H44/76âGNA1870. Painel A, anti-soro controle negativo antiadjuvante diluição 1:10; painel B, mAb anti-PorA (P1.16) diluição 1:500; Painel C, mAb anticapsular 10 pg/mL; painel D, mAb JAR 3 anti-rGNA1870 10 pg/mL; Painel E, anti-soro policlonal anti-rGNA1870 diluição 1:10; Painel F, o mesmo como Painel E com uma

2[ diluição 1:250.

A Figura 2A provê resultados de análises SDS PAGE e Western blot de OMVs. Painel A é uma fotografia de uma SDS PAGE manchada com Commassie. Faixas 1 a 5, preparações OMV (cerca de 5 pg de proteína em cada faixa exceto em faixa 5 onde 10 pg foram carregados). Faixa 1, cepa tipo selvagem (WT) de RM1090; faixa 2, cepa WT transformada com vetor lançador pFP12 sem o gene GNA1870; faixa 3.RM1090AGNA1870 nocaute (KO); faixa 4, RM1090AGNA1870KO transformado com pFP12 sem o gene GNA1870; faixa 5, RM1090AGNA1870 KO transformado com vetor lançador pFP12-GNA1870 contendo o gene GNA1870; faixa 6, rGNA1870 (cerca de 1 pg). Painéis B e C sâo fotografias de Western blots usando antisoro antiGNA1870 policlonais de camundongos imunizados com variante 1, 2 e 3 de proteínas rGNA1870. Painel B: A sensitividade de detecção deste anti-soro foi levemente maior para a proteína GNA1870 recombinante variante 2 (v.2)como comparada com a proteína GNA1870recombinante variante 1 (v.1). Painel C: Faixa 1, v.1 GNA1870 recombinante; Faixa 2. OMV de RM1090 WT; Faixa 3, OMV de RM1090AGNA1870; Faixa 4, OMV de RM1090 transformada com o vetor lançador pFP12 contendo o gene GNA1870. A superexpressão de v.1 GNA1870na cepa RM1090AGNA1870 transformada com o vetor lançador é maior que o nível de expressão nativo de GNA1870 na cepa tipo selvagem (faixa 2).

A Figura 2B provê resultados de análises Western blot de vacinas OMV sondadas com anticorpo policlonal anti-rGNA1870. OMV tipo selvagem preparada a partir de cepa H44/76 tipo selvagem; AGNA1870, OMV preparada de um mutante de H44/76 onde o gene codificando GNA1870 foi inativado; OE GNA1870, OMV de um mutante de H44/76 engenheirado para superexpressar GNA1870; rGNA1870, purificado His-Tag GNA1870 expresso em E.coli.

A Figura 3A mostra gráficos dos títulos bactericidas em soro de camundongos como medidos contra quatro cepas de N. meningitidis encapsuladas: Cu385, M6190, Z1092 e NZ98/254. Os grupos de vacina foram: barra 1, adjuvante fosfato de alumínio sozinho; barra 2, vacina OMV de

RM1090 tipo selvagem; barra 3, vacina OMV de RM1090ÁGNA1870; barra 4, mistura de vacina OMV de RM1090aGNA1870 + proteína GNA1870 recombinante; barra 5, vacina OMV de GNA1870 superexpresso em RM1090; barra 6, proteína GNA 1870 recombinante. Barras que mostram os intervalos de confiança de 95% ao redor de médias geométricas representam grupos de vacina onde soros foram ensaiados de 9 a 10 animais individuais. Barras com asteriscos (*) representam média geométrica de resultados de ensaio de duas reuniões de soro de cada grupo de vacina (cada reunião de soros de 4 a 5 diferentes camundongos).

A Figura 3B mostra gráficos da atividade bactericida de soro (1/GMT + DP) de soros de camundongos imunizados com vacinas OMV H44/76. Reuniões de soros foram preparadas como descrito em legenda para Figura 3A. Grupos de camundongos imunizados com (1) Adjuvante, (2) rGNA1870, (3) H44/76 tipo selvagem, (4) Η44/76ΔΘΝΑ1870, (5) GNA1870

OE H44/76. Embora não mostrado nos painéis, todas as cepas foram mortas por anticorpos monoclonais anti-PorA e/ou anticapsular controle positivo plus complemento.

A Figura 4A é uma série de gráficos mostrando ativação de C3b humana e deposição de complemento iC3b sobre a superfície de células de 20 N. meningitidis encapsuladas vivas como determinada por citometria de fluxo de fluorescência indireta. Fila A. Cepa NZ98/254. Fila B. Cepa M1390. Coluna 1, complemento plus um Mab anticapsular grupo B controle positivo, 25 pg/mL (área aberta) ou uma diluição 1:40 de uma reunião de soro de camundongos controles negativos imunizados com fosfato de alumínio sozinho 25 (área fechada). Coluna 2, complemento plus Mab JAR3 anti-GNA1870, 1 pg/mL (aberto) ou complemento termoinativado + o Mab anti-GNA1870, 5 pg/mL (fechado). Colunas 3, 4 e 5, complemento plus diluição 1:100 de reuniões de soro de camundongos imunizados com: coluna 3 (vacina rGNA1870); Coluna 4 (vacina OMV de cepa WT de RM1090); ou coluna 5 (u30 ma mistura de vacina rGNA1870 e vacina OMV de cepa RM1090âGNA1870). Coluna 6, complemento plus diluições de uma reunião de soros de camundongos imunizados com vacina OMV de cepa RM1090 superexpressando GNA1870 (área aberta; diluição 1:100 e área cinza diluição 1:400). Para comparação, painéis na coluna 6 também mostram dados de complemento plus uma diluição 1:100 de uma reunião de soros de camundongos imunizados com vacina OMV de cepa RM1090AGNA1870 (área fechada).

A Figura 4B é uma série de gráficos mostrando ativação de C3b humano e deposição de complemento iC3b sobre a superfície de células de N. meningitidis encapsuladas vivas como determinada por citometria de fluxo de fluorescência indireta. Cepas NZ98/254, BZ198, Z1092 e M6190. Painel 10 A, área aberta: complemento plus mAb anticapsular (25 pg/mL para cepas NZ98/254, BZ198, e M61903 de Grupo B, e 1 pg/mL para cepa Z1092 de GrupoA); área enchida: complemento plus diluição 1:100 de anti-soros de antiadjuvantes. Painel B, área aberta: complemento plus mAb JAR3 antirGNA1870 25 pg/mL; área enchida: complemento plus diluição 1:100 de an15 ti-soros anti-rGNA1870 policlonal. Painel C, complemento plus diluição 1:100 de anti-soros contra OMV de H44/76 tipo selvagem; Painel D, área aberta: complemento plus diluição 1:100 de anti-soros preparados contra OMV com

GNA1870 superexpresso que foi absorvido com uma coluna de controle negativo (somente Ni-NTA); área enchida: complemento plus diluição 1:25 de 20 anti-soros preparados contra OMV com GNA1870 superexpresso após absorção com uma coluna de GNA1870 de fase sólida.

A Figura 5 é um gráfico de barras mostrando respostas de anticorpos anti-GNA1870 de soro como medidas por ELISA (GMT ± DP). O antígeno sobre a placa foi rGNA1870 variante 1. O anticorpo secundário foi 25 IgG+A+M anticamundongo cabra conjugado com fosfatase alcalina. As barras representam os respectivos títulos de média geométrica de 2 reuniões de anti-soro (4-5 camundongos por reunião) de grupos de camundongos imunizados com (1) Adjuvante; (2) rGNA 1870; (3) OMV tipo selvagem de H44/76;

(4) OMV áGNA1870 de H44/76; (5) OMV GNA1870 OE H44/76.

A Figura 6 provê gráficos mostrando resultados de análises de proteção passiva no modelo de bactereimia meningocócica de rato bebê. Em tempo 0, ratos bebês foram tratados intraperitonealmente (IO) com diluições de reuniões de soros de camundongos imunizados (N = 9 a 10 soros individuais por reunião) e desafiados duas horas depois com cepa NZ98/294 grupo B (cerca de 60 000 CFU/rato dadas IP). Culturas de sangue quantitativas foram obtidas 4 a 6 horas após o desafio bacterial. Painel A: diluições de soro 1:15. Painel B: diluições de soro 1:60. Barra 1: Soro de camundongos imunizados com somente fosfato de alumínio; barra 2: mAb anticapsular (10 pg/rato); barra 3: mAb anti-GNA1870 (10 pg/rato); barra 4: soro de camundongo imunizado com vacina OMV de AGNA1870 de RM1090; barra 5: soro de camundongos imunizados com mistura de vacina OMV de ΔΘΝΑ 10 RM1090 plus vacina de proteína GNA1870 recombinante; barra 6: soro de camundongos imunizados com vacina OMV de RM1090 superexpressando GNA1870; barra 7: soro de camundongos imunizados com vacina de proteína GNA1870 recombinante.

A Figura 7 é um alinhamento de sequências de aminoácidos e15 xemplares de GNA1870 variantes 1, 2 e 3 de N. meningitidis cepas MC58, 951-5945, e M1239, respectivamente. 1 indica que o primeiro aminoácido da proteína madura, com aminoácidos indicados por parte de números negativos da seqüência líder. Fundos cinzas e negros indicam resíduos de aminoácidos conservados e idênticos, respectivamente.

As Figuras 8A-8H proveem sequências de aminoácidos de polipeptídeos GNA1870 exemplares úteis na invenção, incluindo alinhamentos de seqüência de aminoácido de polipeptídeos GNA1870 exemplares selecionados (Figura 8H).

A Figura 9 provê alinhamentos das sequências de aminoácidos 25 de protótipo de família VR1 PorA exemplares (Painel A) e as sequências de aminoácidos de protótipo de família VR2 PorA exemplares (Painel B).

Antes da presente invenção e específicas modalidades exemplares da invenção serem descritas, é para ser entendido que esta invenção não é limitada a particulares modalidades descritas, na medida em que tais 30 podem, é claro, variar. Também deve ser entendido que a terminologia aqui usada é para o propósito de descrição de particulares modalidades somente, e não é pretendida ser limítante, uma vez que o escopo da presente inven18 ção será limitado somente pelas reivindioações apostas.

Onde uma faixa de valores é provida, é entendido que cada valor interveniente, ao décimo da unidade do limite inferior à menos que o contexto claramente dite de outro modo, entre o limite superior e inferior daquela faixa e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente faixa estabelecida é encerrado na invenção. Os limites superior e inferior destas menores faixas podem ser independentemente incluídos nas menores faixas também são abrangidos dentro da invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído na faixa estabelecida. Onde a faixa estabelecida inclui um ou ambos limites, faixas excluindo ambos daqueles limites incluídos também são incluídas na invenção.

A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm os mesmos significados como comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer processos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos também possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os processos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações aqui mencionadas são aqui incorporadas por referência para mostrar e descrever os processos e/ou materiais em conexão com os quais as publicações são citadas.

Tem de ser notado que como aqui usadas e nas reivindicações apostas, as formas singulares “um¹’, e, e o incluem os referentes plurais à menos que o contexto ciaramente dite de outro modo. Assim, por exemplo, referência a um antígeno inclui uma pluralidade de tais antígenos e referência a “a vesícula inclui referência a uma ou mais vesículas e equivalentes dos mesmos conhecidos por aqueles versados na técnica, e assim por diante.

As publicações aqui discutidas são unicamente providas por sua descrição antes da data de depósito do presente pedido de patente. Nada aqui é para ser construído como uma admissão de que a presente invenção não é intitulada para preceder tal publicação em virtude de invenção anterior. Ainda, as datas de publicação providas podem ser diferentes das reais datas de publicação que podem necessitar ser independentemente confirmadas. Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção é baseada na verificação de que uma vacina de OMV preparada a partir de uma cepa de N. meningitidis mutante engenheirada para superexpressar GNA1870 elicita respostas de anticorpo bactericida mais amplas em camundongos que uma vacina de proteína GNA1870 recombinante (rGNA1870) ou uma OMV preparada a partir de uma cepa ocorrendo naturalmente, ou uma combinação de uma vacina de proteína recombinante e uma vacina de OMV.

Vacinas de OMV foram administradas seguramente a milhões de humanos, e são provadas serem eficazes contra desenvolvimento de doença meningocócica. Como notado na seção de introdução, sua principal limitação é que elas elicitam respostas de anticorpos bactericidas específicas de cepa. Também há conceito de que se vacinas OMV são amplamente usadas na população que a resposta imune pode selecionar emergência de mutantes de escape de cepas de N. meningitidis (isto é, cepas com mutações em sequência de aminoácido PorA de laços acessíveis - superfície ou com diminuída expressão de PorA). Em resumo, a invenção provê que, através de seleção de um sorotipo PorA predominante e preparação de um mutante que superexpressa GNA1870, é possível preparar uma vacina baseada em vesícula (por exemplo, OMV, MV) que elicita uma combinação de respostas de anticorpo bactericida anti-PorA e anti-GNA1870 ótimas e, pelo que, confere ampla proteção contra doença meningocócica. Uso de uma tal vacina também tem um risco menor que uma vacina OMV convencional para seleção de cepas mutantes deficientes de PorA produzindo doença na população.

Em adição, vesículas preparadas a partir de uma cepa superexpressando GNA1870 têm um perfil de proteína alterado comparadas com vesículas preparadas a partir de uma cepa que expressa um nível relativamente menor de GNA1870. Como discutido em mais detalhes nos Exemplos, OMV preparada a partir de cepas superexpressando GNA1870 mostrou diminuída expressão de um número de outras proteínas de envelope

2l· comparado com OMV preparada a partir de uma vacina tipo selvagem de cepa RM1090, ou a cepa nocaute ΔΘΝΑ1870 de RM1090. Embora a habilidade de anti-soros de camundongos imunizados com OMV superexpressando GN1870 para elicitar anticorpo bactericida para cepa Cu385 ou ativar de5 posição de C3b sobre cepa NZ98/294 foi um resultado de anticorpos elicitados por GNA1870, a diminuição nestas outras proteínas envelopes de célula exteriores pode servir para ainda aperfeiçoar a imunogenicidade e resposta imune protetora elicitadas por vesículas preparadas de cepas superexpressando GNA1870 (por exemplo, devido a nâo-mascaramento de outros an10 tígenos na vesícula).

Os exemplos aqui providos ilustram a amplitude de proteção elicitada através de imunização com uma vacina OMV preparada a partir de uma cepa de N. meningitidis que superexpressa (por exemplo, é geneticamente engenheirada para superexpressar) GNA1870. Atividades funcionais 15 dos anticorpos anti-GNA1870 elicitadas pela vacina OMV que superexpressou GNA1870 foram maiores que aquelas de anticorpos elicitados pela vacina GNA1870 recombinante, ou uma combinação de GNA1870 recombinante e OMV preparada a partir da cepa tipo selvagem. Por exemplo, à despeito de uma menor magnitude da resposta de anticorpo anti-GNA1870 como me20 dida por ELISA (Tabela 2), soros de camundongos imunizados com a vacina OMV preparada a partir da cepa engenheirada para superexpressar GNA1870 mostraram maior atividade bactericida contra cepa Z1092 que aquela de soros de camundongos imunizados com a vacina GNA1870 de proteína recombinante, ou com vacinas OMV preparadas a partir de cepas 25 RM1090 nocaute GNA1870 ou tipo selvagem, ou com vacina OMV misturada com a vacina de proteína GNA1870 recombinante (Figura 3).

Além disso, mesmo na ausência de forte atividade bactericida, os anticorpos elicitados pela vacina OMV que superexpressou GNA1870 renderam maior deposição de C3b sobre a superfície de cepas NZ98/254 ou 30 M1390 (Figura 4A, coluna 6) que anticorpos elevados para as outras vacinas, e a anterior também conferiu maior proteção passiva contra bactereimia em ratos novos desafiados com cepa NZ98/254 (Figura 6, Painéis A-B). A habilidade para ativar deposição de C3b sobre cepa NZ98/254 foi perdida após absorção de anticorpos anti-GNAl870 (Tabela 3). Em resumo, a vacina OMV modificada conferiu atividade protetora mais ampla que a proteína recombinante GNA1870 ou a vacina OMV a partir de cepa de vacina tipo sel5 vagem como um resultado da habilidade da vacina OMV modificada elicitar ambas, atividade bactericida específica de sorosubtipo contra cepas expressando uma molécula PorA homóloga àquela da cepa de vacina, e anticorpos anti-GNA1870 com maior atividade funcional contra cepas expressando subvariantes da proteína variante e GNA1870 que elicitada por vacina GNA1870 10 recombinante.

A vacina OMV modificada preparada de cepa superexpressando GNA1870 foi vantajosa sobre GNA1870 recombinante contra cepas expressando subvariantes da proteína GNA1870 variante 1 e/ou expressando um sorosubtipo PorA homólogo. Interessantemente, camundongos imunizados 15 com uma vacina de vesícula preparada a partir de uma cepa de N. meningitidis (RM1090) engenheirada para superexpressar NspA teve títulos de anticorpo anti-NspA ELISA mais de 10 vezes maiores mas menores títulos bactericidas em soro contra algumas cepas de N. meningitides como Cu385 ou Z1092 que camundongos controles imunizados com uma vacina de vesícula 20 controle preparada a partir de cepa RM1090 onde o gene codificando NspA foi inativado (Tabela 5). O’Dwyer e outros, também observaram falta de atividade bactericida em soro em camundongos vacinados com uma vacina OMV preparada a partir de uma cepa de N. flavescens engenheirada para superexpressar NspA (Infect. Innun. 2004;72:6511-80). Assim, as presentes 25 verificações mostrando aperfeiçoadas respostas de anticorpo protetoras e bactericidas para uma vacina OMV superexpressando GNA1870 são surpreendentes.

Superexpressão de GNA1870 v.1 em cepa H44/76 resultou em ~3 vezes mais GNA1870 na OMV comparado com as quantidades natural30 mente maiores de GNA1870 em OMV preparada a partir da cepa tipo selvagem H44/76. Em contraste com nosso prévio estudo de camundongos imunizados com OMV de cepa RM1090 tipo selvagem, camundongos imuniza

21' dos com OMV preparada de H44/76 tip© selvagem desenvolveram respostas de anticorpo anti-GNA1870como medidas por ELISA (Figura 5). Entretanto, o grupo de camundongos recebendo OMV da cepa com GNA1870 superexpressa teve títulos ~10 vezes maiores. Os títulos medidos por ELISA não correlacionam bem com atividade funcional de anticorpo. Por exemplo, os títulos de anti-GNA1870 em soro mais altos foram em camundongos imunizados com a vacina GNA1870 recombinante mas a atividade de deposição de C3b e bactericidade soro de camundongos imunizados com a proteína recombinante foram limitadas a cepa H44/76. Suscetibilidade desta cepa foi esperada porque virtualmente todas as cepas de N. meningitidis com cepa genética de ET 5 sâo altos expressadores da proteína v.1 GNA1870 canônica (seqüência de aminoácidos idêntica àquela de MC58) e estas cepas são altamente suscetíveis a atividade bactericida mediada por complemento de anticorpos anti-GNA1870 (Masignani e outros. 2003, supra; Welsch e outros.

2004, supra). As restantes cinco cepas testes de N. meningitidis em nosso estudo expressam menores quantidades de GNA1870 que cepa H44/76, e as respectivas proteínas são subvariantes de GNA1870 v.1. As cinco cepas também têm moléculas PorA heterólogas àquela da cepa de vacina H44/76. Estas cinco cepas foram resistentes a atividade bactericida e ativação de complemento por anticorpos elicitados pela vacina GNA1870 recombinante, ou petos anticorpos anti-PorA elicitados pelas vacinas OMV. Em contraste, quatro das cinco cepas foram suscetíveis a atividade bactericida e/ou atividade de deposição de complemento de soros de camundongos imunizados com vacina OMV H44/76 que superexpressou GNA1870. Ativação de C3b sobre a superfície de bactérias vivas conduziu a prevista proteção passiva de ratos jovens contra bactereimia meningocócica (Welsch e outros., J Infect

Dis 2003:188:1730-40; Welsch e outros J Immunol 2004;172:5606-15; Hou e outros. J Infect Dis 2005;192:580-90; Moe e outros. Infect Immun 2002;70:6021-31). A vacina OMV com GNA1870 superexpressa consiste em uma mistura complexa de antígenos e pode ser esperada elicitar anticorpo para um número de alvos antigénicos. Entretanto, em experimentos de absorção, a atividade funcional de anticorpo contra estas cepas foi direcionada contra GNA1870 (Tabela 3).

Notadamente, uma vacina OMV preparada a partir de uma cepa mutante com somente um modesto aumento em nível de GNA1870 elicitou respostas de anticorpo bactericida específicas - GNA1870 maiores e mais amplas e/ou maior deposição de C3 que uma vacina OMV preparada a partir de uma cepa tipo selvagem para ter expressão relativamente alta de GNA1870. Assim, mesmo uma leve mudança na razão de GNA1870 para proteína total na preparação de vacina de OMV parece determinar se ou não há uma resposta de anticorpo para GNA1870. Ainda, a qualidade dos anticorpos elicitados pela vcina OMV com GNA1870 superexpressa é superior àquela de anticorpos elicitados pela vacina GNA1870 recombinante. Por exemplo, a vacina recombinante elicitou títulos de ligação de anticorpo ELISA maiores que aqueles elicitados pela vacina OMV com GNA1870 superexpressa, mas os anticorpos para a proteína recombinantetiveram menor atividade de ativação de complemento e bactericida. Definição de mecanismos através dos quais a vacina GNA1870-OMV modificada elicita anticorpos de soro com atividade funcional mais ampla que a vacina OMV controle ou proteína recombinante requererá ainda estudo.

A presente invenção assim provê processos e composições para elicitaçâo de uma resposta imune que é amplamente reativa com diversas cepas de N. meningitidis produzindo doenças. A invenção dribla ou problema de imuno-dominância de domínios antigenicamente variáveis de PorA em vacinas baseadas em PorA ou vesícula através de aperfeiçoamento de resposta de anticorpo a GNA1870 e, possivelmente, a outros antígenos comuns nas cepas de vacina. Importantemente, os processos da invenção elicitam anticorpo bactericida de soro, o único correlato sorológico provado de proteção em seres humanos (Goldschneider e outros. 1969, supra), contra cepas de Neisseria expressando epitopos sorosubtipos que não foram usados nas preparações de vacina. Ainda, o processo elicita anticorpo bactericida de soro contra cepas que não são mortas por anticorpo para uma proteína conservada tal como proteína A de superfície Neisserial, um candidato de vacina meningocócica (Martin e outros., 2000. J. Biotechnol. 83:27-31; Moe e outros. (1999 Infect. Immun. 67:5664; Moe e outros. Infect Immun. 2001 69:3762). Sem ser preso por teoria, o regime de vacina e imunização da invenção provê suas inesperadas vantagens em imunidade protetora de amplo espectro através de elicitaçâo de anticorpos que são específicos para ambos antígenos conservados e não-conservados.

Definições

O termo imunidade protetora significa que um esquema de vacina ou imunização que é administrada a um mamífero induz uma resposta imune que previne, retarda o desenvolvimento de, ou reduz a severidade de 10 uma doença que é causada por Neisseria meningitidis, ou diminui ou elimina totalmente os sintomas da doença.

A frase uma doença causada por uma cepa de sorogrupo B de Neisseria meningitidis abrange qualquer sintoma clínico ou combinação de sintomas clínicos que estão presentes em uma infecção com um membro de 15 sorogrupo B de Neisseria meningitidis. Estes sintomas incluem mas não são limitados a: colonização do trato respiratório superior (por exemplo, mucosa da nasofaringe e amígdalas) através de uma cepa patogênica de sorogrupo B de Neisseria meningitidis, penetração das bactérias na mucosa e o leito vascular submucosa, septicemia, choque séptico, inflamação, lesões hemor20 rágicas de pele, ativação de fibrinólise e de coagulação de sangue, disfunção de órgão como rim, pulmão, e insuficiência cardíaca, infartação muscular e hemorrágica adrenal, vazamento capilar, edema, isquemia de membro periférico, síndrome de doença respiratória, pericardite e meningite.

A frase amplo espectro de imunidade protetora significa que 25 uma vacina ou esquema de imunização elicita imunidade protetora contra pelo menos uma ou mais (ou contra pelo menos duas, pelo menos três, peto menos quatro, pelo menos cinco, contra pelo menos oito, ou pelo menos contra mais de oito) cepas de Neisseria meningitidis, onde cada uma das cepas pertence a um diferente sorosubtipo como as cepas usadas para pre30 parar a vacina. A invenção especificamente contempla e abrange uma vacina ou regime de vacinação que confere proteção contra uma doença causada por um membro de sorogrupo B de Neisseria meningitidis e também con25 tra outros sorogrupos, particularmente sorogrupos A, C, Y e W-135.

A frase liga-se especificamente a um anticorpo” ou imunoreativo especificamente com, quando referindo-se a um antígeno como um polissacarídeo, fosfolipídeo, proteína ou peptídeo, refere-se a uma reação de 5 ligação que é baseada em e/ou é comprovadora da presença do antígeno em uma amostra que também pode incluir uma população heterogênea de outras moléculas. Assim, sob condições designadas de ensaio imune, o especificado anticorpo ou anticorpos se ligam a um particular antígeno ou antígenos em uma amostra e não se ligam em uma significante quantidade a 10 outras moléculas presentes na amostra. Específica ligação a um anticorpo sob condições pode requerer um anticorpo ou anti-soro que é selecionado por sua especificidade para um particular antígeno ou antígenos.

A frase em uma quantidade suficiente para elicitar uma resposta imune para epitopos presentes na dita preparação” significa que há uma di15 ferença detectável entre um indicador de resposta imune medida antes e após administração de uma particular preparação de antígeno. Indicadores de resposta imune incluem mas não são limitados a: título de anticorpo ou especificidade, como detectada através de um ensaio tal como ensaio imune ligado a enzima (ELISA), ensaio bactericida, citometria de fluxo, imuno 20 precipitação,, imunodifusão de Ouchter-Lowny; ensaios de deteção de ligação de, por exemplo, ponto, Western blot ou arranjos de antígeno; ensaios de citotoxicidade, etc.

Um antígeno de superfície é um antígeno que está presente em uma estrutura de superfície de Neisseria meningitidis (por exemplo, a 25 membrana externa, membrana interna, espaço periplásmico, cápsula, pêlos, etc.).

A frase geneticamente diferente como usada no contexto de cepas geneticamente diversas de Neisseria meningitidis, refere-se a cepas que diferem umas das outras na seqüência de aminoácidos de pelo menos 30 um, e usualmente pelo menos dois, mais usualmente peto menos três polípeptídeos, particularmente polipeptídeos antigênicos. Diversidade genética de cepas pode ser obtida através de seleção de cepas que diferem em pelo menos um ou mais, preferivelmente pelo menos dois ou mais, de sorogrupo, soro tipo, ou sorosubtipo (por exemplo, duas cepas que diferem em pelo menos uma das proteínas selecionadas da membrana exterior, proteínas PorA e PorB, são ditas geneticamente diversas com relação uma à outra).

Diversidade genética também pode ser definido através de, por exemplo, tipificação de seqüência multi-locus e/ou tipificação de enzima multi-locus (ver, por exemplo, Maiden e outros., 1998, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:3140; Pizza e outros. 2000 Science 287:1816), eletroforese de enzima multi-locus, e outros processos conhecidos na técnica.

Sorogrupo como aqui usado refere-se a classificação de Neisseria meningitidis em virtude de variações imunologicamente detectáveis no polissacarídeo capsular. Cerca de 12 sorogrupos são conhecidos: A, B, C, X, Y, Z, 29-E, W-135, Η, I, Ke L Qualquer um sorogrupo pode abranger múltiplos sorotipos e múltiplos sorosubtipos.

Sorotipo” como aqui usado refere-se a classificação de cepas de Neisseria meningitidis baseado em diferenças antigénicas definidas por anticorpo monoclonal na proteína de membrana externa Porina B. Um sorotipo simples pode ser encontrado em múltiplos sorogrupos e múltiplos sorosubtipos.

sorosubtipo como aqui usado refere-se a classificação de cepas de Neisseria meningitidis baseado em variações antigénicas definidas por anticorpo sobre uma proteína de membrana externa chamada Porina A, ou com tipificação VR de sequências de aminoácidos deduzidas de seqüenciamento de DNA (Sachi e outros., 2000, J. Infect. Dis. 182:1169; ver tam25 bém o Multi Locus Sequence Typing web site). Maior parte de variabilidade entre proteínas PorA ocorre em dois (laços I e IV) de oito laços expostos na superfície, putativos. Os laços variáveis I e IV foram designados VR1 e VR2, respectivamente. Um sorosubtipo simples pode ser encontrado em múltiplos sorogrupos e múltiplos soro-tipos.

Enriquecido significa que um antigen© em uma composição de antígeno é manipulado por um experimentador ou um clínico de modo que ele está presente em uma concentração pelo menos três vezes maior por peso total, usualmente uma concentração pelo menos 5 vezes maior, mais preferivelmente uma concentração peto menos 10 vezes maior, mais usualmente uma concentração 100 vezes maior que a concentração daquele antígeno na cepa da qual a composição de antígeno foi obtida. Assim, se a 5 concentração de um particular antígeno é 1 micrograma por grama de preparação bacterial total (ou de proteína bacterial total), uma preparação enriquecida pode conter pelo menos 3 microgramas por grama de preparação bacterial total (ou de proteína bacterial total).

O termo heterólogo refere-se a dois componentes biológicos 10 que não são encontrados juntos em natureza. Os componentes podem ser células hospedeiras, genes, ou regiões reguladoras, tais como promotores. Embora os componentes heterólogos não sejam encontrados juntos em natureza, eles podem funcionar juntos, como quando um promotor heterólogo para um gene é ligado operavelmente ao gene. Um outro exemplo é onde 15 uma seqüência Neisserial é heteróloga para um hospedeiro Neisserial de uma diferente cepa. Heteróloga é aqui usada no contexto de proteínas expressas em duas diferentes cepas bacteriais, por exemplo, PorA heteróloga ou GNA1870 heteróloga, indica que a proteína em questão difere em seqüência de aminoácido. Por exemplo, uma primeira cepa Neisserial ex20 pressando PorA 1.5-2,10 e uma segunda cepa Neisserial expressando PorA7-2,4 são ditas terem proteínas PorA heterólogas ou são heterólogos com relação a PorA.

O termo “imunologicamente ingênuo com relação a Neisseria meningitidis representa um indivíduo (por exemplo, um mamífero tal como 25 um paciente humano) que nunca foi exposto (através de infecção ou administração) a Neisseria meningitidis ou a uma composição de antígeno derivada de Neisseria meningitidis em quantidades suficientes para elicitar imunidade protetora, ou se exposto, falhou para montar uma resposta imune protetora. (Um exemplo do último pode ser um indivíduo exposto em uma 30 idade muito jovem quando respostas imunes protetoras podem não ocorrer.

Molages e outros., 1994, Infect. Immun. 62:4419-4424). É ainda desejável (mas nâo necessário) que o indivíduo imunologicamente ingênuo também não tenha sido exposto a uma espécie Neisseria outra que não Neisseria meningitidis (ou uma composição de antígeno preparada de espécies Neisseriais), particularmente não a uma cepa reagindo cruzado de espécies Neisseriais (ou composição de antígeno). Indivíduos que foram expostos (através de infecção ou administração) a espécies Neisseiais ou a uma composição de antígeno derivada daquelas espécies Neisseriais em quantidades suficientes para elicitarem uma resposta imune para os epitopos exibidos por aquelas espécies, são primadas*¹ para responderem imunologicamente aos epitopos exibidos por aquelas espécies.

Cepas Neisseriais Expressando GNA1870 Para Uso Em Produção de Vesícula

Em geral, a invenção envolve produção de vesículas (microvesículas ou vesículas de membrana exterior) a partir de uma cepa Neisserial geneticamente modificada que produz um nível de proteína GNA1870 suficiente para prover vesículas que, quando administradas a um sujeito, evocam anticorpos anti-GNA1870. Os anticorpos anti-GNA1870 produzidos facilitam imunoproteção contra 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais cepas Neisseriais, cujas cepas podem ser geneticamente diferentes (ou heterólogas) com relação a, por exemplo, sorogrupo, sorotipo, sorosubtipo (por exemplo, como determinado por proteína PorA), tipo de seqüência, tipo eletroforético, variante GNA1870, e/ou subvariante de GNA1870.

Qualquer uma de uma variedade de cepas Neisseria spp. que produza ou possa ser modificada para produzir GNA1870, e, opcionalmente, que produza ou possa ser modificada para produzir outros antígenos de interesse, tais como PorA, pode ser usada nos processos da invenção. Características de apropriadas cepas com relação a produção de GNA1870 são discutidas em mais detalhes abaixo.

Neisseria spp. patogênica ou cepas derivadas de Neisseria spp. patogênica, particularmente cepas patogênicas para humanos ou derivadas de cepas patogênicas ou comensais para humanos, são de particular interesse. Neisseria spp. exemplares incluem N. meningitidis, N. flavescens, N. gonorrhoeae, N. lactamica, N. polysaccharea, N. cinérea, N. mucosa, N. sub fiava, N. sicca, N. elongata, e similares. “Derivada de no contexto de cepas bacteriaís é pretendido indicar que uma cepa foi obtida através de passagem in vivo, ou em cultura in vitro, de uma cepa parente e/ou é uma célula recombinante obtida por modificação de uma cepa parente.

Cepas de N. meningitidis são de particular interesse na presente invenção. Cepas de N. meningitidis podem ser divididas em grupos sorológicos, sorotipos e subtipos nas bases de reações com anticorpos policlonais (Frasch, C.E. and Chapman, 1973, J. Infect, Dis. 127:149-154) ou monoclonais que interagem com diferentes antígenos de superfície. Sorogrupo é ba10 seado em variações imunologicamente detectáveis no polissacarídeo capsular. Cerca de 12 sorogrupos (A, B, C, X, Y, Z, 29-E, e W-135) são conhecidos. Cepas dos sorogrupos A, B, C, Ye W-135 totalizam aproximadamente todas as doenças meningocócicas.

Sorotipificaçâo é baseada em diferenças antigênicas definidas 15 por anticorpo monoclonal em uma proteína de membrana exterior chamada

Porina B (PorB). Anticorpos definindo cerca de 21 sorotipos são correntemente conhecidos (Sacchi e outros., 1998, Clin. Diag. Lab. Immunol. 5:348). Sorosuptificação é baseada em variações antigênicas definidas por anticorpo sobre uma proteína de membrana exterior chamada Porina A (PorA). An20 ticorpos definindo certa de 18 sorosubtipos são atualmente conhecidos. Sorosuptificação é especialmente importante em cepas de Neisseria meningitidis onde imunidade pode ser específica de sorosubtipo. Maior parte de variabilidade entre proteínas PorA ocorre em dois (laços I e IV) de oito laços expostos na superfície, putativos. Os laços variáveis I e IV foram designados 25 VR1 e VR2, respectivamente. Uma vez que mais variantes de seqüência

VR1 e VR2 de PorA exitem que não foram definidas por específicos anticorpos, uma nomenclatura alternativa baseada em tipificação de VR de sequência de aminoácido deduzida de seqüenciamento de DNA foi proposta (Sacchi e outros., 2000, J. Infect. Dis. 182:1169: vide também o sítio na web 30 Multi Locus Sequence Typing). Lipopoiissacarídeos também podem ser usados como antígenos tipificantes, rendendo os assim chamados imunotipos LI, L2, etc.

N. meningitidis também pode ser dividida em grupos ou subgrupos clonais, usando várias técnicas que direta ou indiretamente caracterizam o genoma bacterial. Estas técnicas incluem eletroforese de enzima multilocus (MLEE), baseada em variação de mobilidade eletroforética de uma en5 zima, que reflete os polimorfismos subjacentes em um particular locus genético. Através de caracterização de variantes de um número de tais proteínas, distância genética entre duas cepas pode ser inferida a partir da proporção de desemparelhamentos. Similarmente, clonalidade entre dois isolados pode ser inferida se os dois têm idênticos padrões de variantes eletroforéticas em 10 um número de loci. Mais recentemente, tipificação de seqüência multilocus (MLST) suplantou MLEE como o processo de escolha para caracterização de microorganismos. Usando MLST, a distância genética entre dois isolados, ou clonalidade é inferida a partir da proporção de desemparelhamentos nas sequências de DNA de 11 genes domésticos em cepas de Neisseria menin15 gitidis (Maiden e outros., 1998, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:3140).

A cepa usada para produção de vesícula pode ser selecionada de acordo com um número de diferentes características que podem ser desejadas. Por exemplo, em adição a seleção de acordo com um nível de produção de GNA1870, a cepa pode ser selecionada de acordo com: um dese20 jado tipo de PorA (um sorosubtipo, como descrito acima), sorogrupo, sorotipo, e similares: diminuída produção de polissearídeo capsular; e similares.

Por exemplo, a cepa de produção pode produzir qualquer desejado polipeptídeo PorA, e pode expressar um ou mais polipeptídeos PorA (tanto naturalmente como devido a engenharia genética). Cepas exemplares 25 incluem aquelas que produzem um polipeptídeo PorA que confere um sorosubtipo de P1.7.16; Pl.19, 15; P1.7,1; P1.5,2; P1.22a,14;P1.14; P1.5,10,P1.7,4; P1.12,13: assim como variantes de tais polipeptídeos PorA que podem ou não reter reatividade com convencionais reagentes sorológicos usados em soro-subtipificaçâo.

Também são de interesse polipeptídeos PorA caracterizados de acordo com tipificação de região variável(VR) PorA (vide, por exemplo, Russell e outros. Emerging Infect Dis 2004 10:674-678; Sacchi CT, e outros.,

Clin Diagn Lab Immunol 1998;5:845-55; Sacchi e outros., J. Infect Dis 2000;182:1169-1176). Um substancial número de distintos tipos de VR foram identificadas, as quais podem ser classificadas em protótipos de família VR1 e VR2. Uma base de dados acessível na web descrevendo esta no5 menclatura e sua relação a prévios esquemas de tipificação é encontrada em neisseria.org/nm/typing/pora. Alinhamentos de tipos de VR1 e VR2 de PorA exemplares sâo providos em Russell e outros. Emerging Infect Dis 2004 10:674-678. e providos em Figura 9 para conveniência do leitor.

Polipeptídeos PorA exemplares como caracterizados por soro10 subtipos PorA incluem

PI.5,2; Pl.5a.2a; P1.5a,2c; Pl.5a.2c; P1.5a,2c; Pl .5b, 10; P1.5b,10; P1.5b,C; Pl.7,16;

P1.7d,l; P1.7d,l; Pl,7d.l; P1.7d,l; P1.7b,3; P1.7b,4; P1.7b,4; Pl.12,16; P1.12a,13a;

Pl.22.9; Pl.23,14; Pl.23,14; Pl.19,15; P1.C,1; ΡΙ.Ε,Α; ΡΙ.Ε,Α; P1.E.A; ;P1.5,2;

Pl.5,2;P1.5aJ0a;P1.5b,10; P1.5b,10; PI.5b,10b; Pl.7.16; Pl.7,16; Pl.7b,1; P1.7b,13e; P1.7b,4; P1.7b,4; P1.7d.l: P1.7d,l; P1.7b,13a; PI .23,3; P1.23,3;P1.23,3; Pl.19,15; PI.19,1; Pl. 19,15; Pl.19,15; Pl.19.15; Pl.19,15; Pl.19,15; Pl. 19,15; Pl. 19,15; Ρ1.ΕΛ; P1.E.A;

Pl.E,16a; PLEAa; Pl.E,4a; Pl.Ea,3; Pl.Eb,9; Pl .Eb,9; Pl.Eb,9; Pl.Eb,9; Pl.Eb,9; P1.F,16; P1.7aJ; Pl,7b,3; P1.7d,l; Pl.Ea.3; P1.5b,10; PI.5b,10; P1.5b,10; P1.5b,10; P1.5b,10; .

P1.5b,10; P1.5b,10b; P1.5b,10; Pl.22,14a;; P1.FJ6; PLD,2d;Pl.D₍2;Pl.D,2d; Pl J9c,2c; Pl.DJOf; Pl.A,10e; Pl.A,10g; Pl.AJO; Pl.19,15; Pl.19,15; Pl.19,15; Pl.19,15; Pl.7b,16; P1.7,16b; Pl.7,16; P 1.19,1'5; Pl.Eb,9; P1.5,2e; Pl.E,A; P1.7b,13d; Pl.Ea,3; P1.7,16b;

Pl.Ec,l; P1.7b,4; P1.7b,4; Pl.7,9; Pl.19,15; Pl.19,15; Pl.19,15; Pl. 19,15a; Pl.19a.15b; Pl.19,15; Pl.5b.16; Pl.19b,13a; P1.5,16;Pl.5,2; P1.5,2b; P1.7b,16;P1.7,16b; Pl,7b,3;

Pl.Ea,3; P1.5a,2c; P1.F,16; P1.5a,9;P1.7c,10c; P1.7b,13a; P1.7,13a; P1.7a,10; Pl.20,9; P1.22.B; P1.5b,del; P1.5bJ0; P1.7,13a; Pl.12a,13f; Pl,12aJ3; Pl J2a,l3a; Pl J2a,13a; P1.12aJ3; Pl.12a.13; PLE,13b; P1.7b,13a; P1.7b,13; Pl.5,2; Pl.5,2; Pl.Ea,3; Pl.22,9; Pl.5,2; Pl.5,2; Pl.19,15; Pl.5,2; P1.12b,13a; P1.5c,10a; Pl.7e,16e; Pl.BJÓd; PLF,16e; Pl.Fj6e;P1.7bJ3e;Pl.B,16d;PL7e,16e;P1.7b,13g; PJ.BJÓf;;P1.7,16c;P1.22,14b; Pl.22,14c; Pl.7,14;Pl.7,14; e Pl.23,14.

Sequências de aminoácidos de polipeptídeos PorA exemplares sâo encontradas nos N°®‘ de acesso GenBank X57182, X57180, U92941, U92944, U92927, U92931, U92917,

U92922, X52995, X57184, U92938, U92920, U92921, U92929, U92925, U92916, X57178, AF051542, X5718I, U92919, U92926, X57177, X57179, U92947, U92928, U92915, X57183, U92943, U92942, U92939, U92918, U92946, U92496, U97260, U97259,

AF042541, U92923, AF051539, AF051538. U92934, AF029088, U92933, U97263, U97261, U97262, U92945, AF042540, U92935, U92936, U92924, AF029086, AF020983, U94958, U97258, U92940, AF029084, U92930, U94959, U92948, AF016863, AF029089, U92937, AF029087, U92932, AF029090, AF029085, AF051540, AF051536, AF052743, AF054269, U92495, U92497, U92498, U92499, U92500, U92501, U92502, U92503, AF051541. X12899, Z48493, Z48489, Z48485, Z48494, Z48487, Z48488, Z48495, Z48490, Z48486, Z48491, Z48492,X66478, X66479, X66477, X66480, X81110, X79056, X78467, X81111, X78802, Z14281/82, Z14273/74, Z14275/76, Ζ1426Ϊ/62, Z14265/66, Z14277/78, Z14283/84, Z14271/72, Z14269/70, Z14263/64, ZK259/60, Z14257/58, Z14293/94, Z14291 /92, Z14279/80, Z14289/90. Z14287/88, Z14267/68, Z14285/86, L02929. X77423. X77424, X77433, X77426, X77428, X77430, X77427, X77429, X77425, X77432, X77431, X77422, Z48024/25, Z48032/33, Z48020/21, Z48022/23, Z48028/29, Z48016/17. Z48012/13, Z48014/15, Z48018/19, Z48026/27, U31060, U3106L U31062, U31063, U31064, U31065, U31066, U31O67, U93898, U93899, U93900, U93901, U93902, U93903, U93904, U939O5, U93906, U93907, e ©3908.,

Alternativamente ou em adição, a cepa de produção pode ser uma cepa deficiente de cápsula. Cepas deficientes de cápsula podem provêer vacinas baseadas em vesícula que provêm um risco reduzido de elicifação de uma significante resposta de auto-anticorpo em um sujeito a quem 5 a vacina é administrada (por exemplo, devido a produção de anticorpos que reagem - cruzado -com ácido siálico sobre superf ícies de células hospedeiras). Deficiente de cápsula ou deficiente em polissacarídeo capsular como aqui usado refere-se a um nível de um polissacarídeo capsular sobre a superfície bacterial que é menor que aquele de uma cepa ocorrendo natu10 ralmente, onde a cepa é geneticamente modificada, é menor que aquele de uma cepa parente a partir da qual a cepa deficiente de cápsula é derivada. Uma cepa deficiente de cápsula inclui cepas que são diminuídas em produção de polissacarídeo capsular de superfície por pelo menos 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90% ou mais, e inclui cepas 15 nas quais polissacarídeo capcular não é detectável sobre a superfície bacterial (por exemplo, através de ELISA de célula integral usando anticorpo polissacarídeo anticapsular).

Cepas deficientes de cápsula incluem aquelas que são deficientes de cápsula devido a uma modificação genética ocorrendo naturalmente

4° ou gerada recombinantemente. Cepas deficientes de cápsula ocorrendo naturalmente (ver, por exemplo, Dolan-Livengood e outros. J. Infect. Dis. (2003) 187(10):1616-28), assim como processos de identificação e/ou geração de cepas deficientes de cápsula (ver, por exemplo, Fisseha e outros. (2005) Infect. Immun. 73(7):4070-4080: Stephens e outros. (1991) Infect Immun 59(11):4907-102: Frosch e outros. (1990) Mol Microbiol. 1990 4(7):1215-1218) são conhecidas na técnica.

Modificação de uma célula hospedeira Neisserial para prover diminuída produção de polissacarídeo capsular pode incluir modificação de um ou mais genes envolvidos em síntese de cápsula, onde a modificação provê, por exemplo, diminuídos níveis de polissacarídeo capsular em relação a uma célula parente antes de modificação. Tais modificações genéticas podem incluir alterações em seqüências de nucleotídeos e/ou aminoácido em um ou mais genes de biossíntese de cápsula tornando a cepa deficiente de cápsula (por exemplo, devido a uma ou mais inserções, supressões, substituições, e similares em um ou mais genes de biossíntese de cápsula). Cepas deficientes de cápsula podem carecer de ou serem não-funcionais para um ou mais genes de cápsulas.

De particular interesse sâo cepas que são deficientes em biossíntese de ácido siálico. Tais cepas podem prover produção de vesículas que têm reduzido risco de elicitação de anticorpos anti-ácido siálico que reagem - cruzado com antígenos de ácido siálico humano, e ainda podem prover aperfeiçoada segurança de fabricação. Cepas tendo um defeito em biossíntese de ácido siálico (devido a uma modificação ocorrendo naturalmente ou uma modificação engenheirada) podem ser defeituosas em qualquer um de um número de diferentes genes no caminho de biossíntese de ácido siálico. De particular interesse são cepas que sâo defeituosas em um produto gene codificado pelo gene N-acetil glucosamina-6-fosfato-2-epimerase (conhecido como synX AAF40537.1 ou siaA AAA20475), com cepas tendo este gene inativado sendo de especial interesse. Por exemplo, em uma modalidade, uma cepa deficiente de cápsula é gerada através de interrupção de produção de um produto gene synX funcional (ver, por exemplo, Swartley e outros. (1994) J Bacteriol. 176(5):1530-4).

Cepas deficientes capsulares também podem ser geradas a partir de cepas ocorrendo naturalmente usando técnicas não-recombinantes, por exemplo, através de uso de anticorpos anticapsulares bactericidas para ‘ 5 selecionar cepas que reduzidas em polissacarídeo capsular.

Onde a invenção envolve o uso de duas ou mais cepas (por exemplo, para produzir composições antigênicas de vesículas a partir de diferentes cepas, como discutido abaixo em mais detalhes), as cepas podem ser í ! selecionadas de modo a diferirem em uma ou mais características de cepa, 10 por exemplo, para provimento de vesículas que diferem em tipo de PorA e/ou grupo variante GNA1870.

Produção de GNA1870 em células hospedeiras de Neisseria ' Em geral como notado acima, vesículas podem ser produzidas de acordo com a invenção usando uma cepa Neísserial ocorrendo não15 naturalmente modificada ou ocorrendo naturalmente que produz vesículas com suficiente proteína GNA1870 que, quando administradas a um sujeito, provêm produção de anticorpos anti-GNA1870.

Em uma modalidade, a cepa Neísserial usada para produzir vesículas de acordo com a invenção pode ser uma cepa ocorrendo natural20 mente que expressa um maior nível de GNA1870 em relação a cepas que expressam um baixo nível de GNA1870 ou expressam níveis nãodetectáveis. RM1090 é um exemplo de uma cepa que produz um baixo nível de GNA1870. Cepas ocorrendo naturalmente que produzem GNA1870 em um nível que é 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 25 ou 10 vezes ou maior sobre produção de GNA1870 em uma cepa de baixa produção de GNA1870, tal como RM1090, são de particular interesse. Exemplos de cepas ocorrendo naturalmente que expressam um alto nível de GAN1870 incluem cepas ET-5 como H44/76, Cu385, e MC58. Para uma discussão de cepas que expressam níveis indetectáveis ou baixos de 30 GNA1870, níveis intermediários de GNA1870, ou altos níveis de GNA1870 ver Masignani e outros. 2003, J Exp Med 197:789-199. Em modalidades particulares, a cepa produz um nível de GNA1870 que maior que aquele produ ίιλ zido em RM1Q90, e pode ser pete menos 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6,

6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, ου 10 vezes ou maior que aquele em RM1090.

Em uma outra modalidade, a cepa Neisserial é modificada através de técnicas recombinantes ou não-recombinantes para provimento de 5 um nível suficientemente alto de produção de GNA1870. Tais cepas modificadas geralmente são produzidas de modo a proverem um aumento em produção de GNA187G que é 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, ou 10 vezes ou maior sobre produção de GNA1870 na célula parente não-modificada ou sobre produção de GNA1870 da cepa RM1090.

Qualquer cepa apropriada pode ser usada nesta modalidade, incluindo cepas que produzem níveis índetectáveis ou baixos de GNA1870 antes de modificação e cepas que naturalmente produzem altos níveis de GNA1870 em relação a cepas que expressam um nível não detectável ou baixo de GNA1870.

Cepas modificadas podem ser geradas através de técnicas nãorecombinantes tais como, por exemplo, descrição a compostos químicos, radiação, ou outro agente de danificação ou modificação de DNA, e similares. Cepas modificadas tendo um desejado perfil de expressão de proteína, particularmente com relação a produção de GNA1870, podem ser identifica20 das através de seleção para cepas produzindo um desejado nível de GNA1870 (por exemplo, um aumentado nível de GNA1870 comparado à cepa parente não-modificada ou um baixo produtor de GNA1870 (tal como RM1090), ou um nível similar àquele de uma cepa que produz GNA1870 em níveis aceitavelmente altos).

Alternativamente, e mais usualmente, cepas modificadas são produzidas usando técnicas recombinantes, usualmente através de introdução de ácido nucleico codificando um polipeptídeo GNA1870 ou manipulação de um gene GNA1870 endógeno para prover aumentada expressão de GNA1870 endógeno.

Processos para determinação de níveis de produção de

GNA1870 são conhecidos na técnica. Tais processos incluem, por exemplo, Western blot (opcionalmente com análise auxiliada por exploração de densi tometria), análise citométrica de fluxo (por exemplo, FACS) usando anticorpo anti-GNA1870, detecção de níveis de ARN GNA1870, e similares. Cepas que têm maiores níveis de produção de GNA1870, tanto naturalmente como devido a modificação genética, são algumas vezes referidas aqui como su5 per-expressadoras” de GNA1870 ou são ditas ''superexpressarem¹' GNA1870.

Produção de cepas Neísseriais geneticamente modificadas

Como notado acima, através de introdução de ácido nucléico codificando um polipeptídeo GNA1870 ou manipulação de um gene 10 GNA1870 endógeno proporciona aumentada expressão de GNA1870 endógeno.

Células hospedeiras Neísseriais geneticamente modificadas para provimento de aumentada expressão de um GNA1870 endógeno

Expressão de GNA1870 endógena pode ser aumentada através 15 de alteração in situ de região reguladora controlando a expressão de

GNA1870. Processos para provimento para aumentada expressão de um gene Neisserial endógeno são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, WO 02/09746). Além disso, as seqüências de ácidos nucléicos de genes codificando variantes e subvariantes de GNA1870 genômicas sâo conhecidas, 20 provendo fácil adaptação de tais processos na regulação ascendente de expressão de GNA1870 endógena.

A GNA1870 endógena pode ser de qualquer desejado grupo variante (por exemplo, v.1, v.2, v.3, e similares) ou subvariante de GNA 1870. Um polipeptídeo GNA1870 v.1 canônico de cepa MC58 é de particu25 lar interesse. Também de interesse é uma subvariante de polipeptídeo

GNA1870 de cepa NZ98/294, e polipeptídeo GNA1870 v.2 de cepa 2996.

Modificação de uma célula hospedeira Neisserial para prover aumentada produção de GNA1870 endógeno pode incluir substituição parcial ou total de todo ou uma porção do gene endógeno controlando expressão 30 de GNA1870, onde a modificação provê, por exemplo, aperfeiçoada atividade transcricional em relação à cepa parente não-modificada. Aumentada atividade transcricional pode ser conferida por variantes (mutações de ponto, supressões e/ou inserções) das regiões controles endógenas, através de ’ promotores heterólogos modificados ou ocorrendo naturalmente ou através de uma combinação de ambos. Em geral, a modificação genética confere uma atividade transcricional maior que aquela de atividade transcricional ' 5 endógena nâo-modificada (por exemplo, através de introdução de um promotor forte), resultando em uma aperfeiçoada expressão de GNA1870.

Típicos promotores fortes que podem ser úteis em aumento de produção de transcrição de GNA1870 podem incluir, por exemplo, os promotores de porA, porB, IbpB, tbpB, p110, hpuAB, IgtF, Opa, p110, 1st, e hpuAB.

PorA, RMp e PorB são de particular interesse como promotores fortes, constitutivos. Atividade promotora PorB está contida em um fragmento correspondendo a nucleotídeos -1 a -250 a montante do códon de iniciaâo de porB.

Processos são disponíveis na técnica para realizar a introdução de um promotor em um genoma de célula hospedeira de modo a ligar operavelmente o promotor a um ácido nucléico codificando GNA1870 endógeno. Por exemplo, tecnologia de recombinação homóloga cruzamento duplo para introduzir um promotor em uma região a montante da seqüência codificante, por exemplo, cerca de 1000 pb, de cerca de 30-970 pb, cerca de 200-600 pb, cerca de 300-500 pb, ou cerca de 400pb a montante (5’) do códon ATG de iniciação da seqüência de ácido nucléico codificando GNA1870 para prover regulação ascendente. Ótima substituição do promotor pode ser determinada através de uso rotineiro de processos disponíveis na técnica.

Por exemplo, um promotor altamente ativo (por exemplo, promo25 tores PorA, PorB ou Rmp) a montante do gene alvejado. Como um exemplo, o promotor PorA pode ser otimizado para expressão como descrito por van der Ende e outros. Infect Immun 2000;68:6685-90. Inserção do promotor pode ser realizada através de, por exemplo, amplificação PCR do segmento a montante do gene GNA1870 alvejado, clonagem de segmento a montante em um vetor, e inserção de apropriados sítios de restrição durante amplificação PCR, ou usando sítios de restrição ocorrendo naturalmente para inserir o segmento promotor PorA. Por exemplo, um segmento a montante de cerca de 700 pb do gene GNA1870 pode ser clonado. Usando sítios de enzima de restrição ocorrendo naturalmente localizados em uma apropriada distância (por exemplo, cerca de 400 pb) a montante do promotor GNA1870 dentro deste segmento clonado um segmento promotor PorA é inserido. Um casse5 te de resistência a antibiótico (por exemplo, eritromicina) pode ser inserido no segmento ainda a montante do promotor PorA e o contructo foi usada para substituir o segmento GNA1870 a montante tipo selvagem através de recombinação homóloga.

Uma outra abordagem envolve introdução de uma seqüência 10 codificando polipeptídeo GNA1870 a jusante de um promotor endógeno que exibe forte atividade transcricional no genoma de célula hospedeira. Por exemplo, a região codificante do gene Rmp pode ser substituída com uma seqüência codificando um polipeptídeo GNA1870. Esta abordagem toma vantagem do promotor Rmp constitutivo altamente ativo para dirigir expres15 são.

Células hospedeiras Neisseriais geneticamente modificadas para expressarem um GNA1870 exóqeno

Cepas Neisseriais podem ser geneticamente modificadas para superexpressarem GNA1870 através de introdução de uma construção codi20 ficando um polipeptídeo GNA1870 em uma célula hospedeira Neisserial. O

GNA1870 introduzido para expressão é aqui referido como um GNA1870 exógeno. As células hospedeiras produzem um GNA1870 endógeno, o GNA1870 exógeno pode ter a mesma ou diferente seqüência de aminoácidos comparada ao GNA1870 endógeno.

A cepa usada como a célula hospedeira nesta modalidade pode produzir qualquer nível de GNA1870 (por exemplo, alto nível, nível intermediário, ou baixo nível de produção de GNA1870). De particular interesse é o uso de uma cepa que é selecionada para baixo nível ou nâo-detectável produção de GNA1870, ou que é modificada para exibir um nível não detectá30 vel, ou baixo, de produção de GNA1870. Por exemplo, a célula hospedeira pode ser geneticamente modificada de modo que o gene GNA1870 endógeno seja interrompido de modo de GNA1870 não é produzido ou não está presente no envelope de célula (e assim não está presente em níveis detectáveis em uma vesícula preparada a partir de uma tal célula modificada). Em outras modalidades, a célula hospedeira produz um nível intermediário ou alto de GNA1870 (isto é, em relação a um nível de GNA1870 produzido, por 5 exemplo, por RM1090).

Polipeptídeos GNA1870

A célula hospedeira pode ser geneticamente modificada para expressar qualquer polipeptídeo GNA1870 apropriado, incluindo variantes ou subvariantes de GNA1870. Como descrito em mais detalhes abaixo, as se10 qüências de aminoácidos de muitos polipeptídeos GNA1870 são conhecidas; alinhamento destas sequências provê orientação para resíduos que são conservados entre as variantes, assim provendo orientação para modificações de aminoácido (por exemplo, substituições, inserções, supressões) que podem ser feitas.

Da mesma maneira, polipeptídeo GNA1870 como aqui usado abrange polipeptídeos sintéticos e ocorrendo naturalmente que compartilham pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou maior identidade de seqüência no nível de nucleotídeo ou aminoácido com um polipeptídeo GNA1870 ocorrendo naturalmente, e que são capazes de 20 elicitarem anticorpos que se ligam especificamente a polipeptídeo GNA1870 ocorrendo naturalmente presente sobre uma bactéria Neisserial de célula integral. Polipeptídeo GNA1870 também abrange proteínas de fusão, por exemplo, um polipeptídeo GNA1870 tendo um polipeptídeo heterólogo no termino-N e/ou C.

A célula hospedeira pode ser geneticamente modificada para expressar peto menos 1 polipeptídeo GNA1870, e pode ser modificada para expressar 2, 3, 4 ou mais polipeptídeos GNA1870 na mesma célula hospedeira. Por exemplo, uma célula hospedeira simples pode ser geneticamente modificada para expressar pelo menos um polipeptídeo GNA1870 variante 1, 30 pelo menos um polipeptídeo GNA1870 variante 2, e pelo menos um polipeptídeo GNA1870 variante 3.

Onde expressão de múltiplos polipeptídeos GNA1870 satisfaz

Al40 corn dificuldade devido a toxicidade para a célula hospedeira, os diferentes polipeptídeos GNA1870 podem ser expressos a partir de diferentes promotores de modo a permitir uma faixa de expressão. Por exemplo, variação de ambos, a composição de base e número de bases entre as regiões -10 e 5 35 do promotor PorA deve resultar em uma ampla faixa de expressão da desejada proteína recombinante (van der Ende e outros. Infect Immun 2000;68:6685-90).

Ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo GNA1870 para uso na invenção sâo conhecidos na técnica. Apropriados polipeptídeos 10 GNA1870 sâo descritos em, por exemplo, WO 2004/048404; Masignani e outros. 2003 J Exp Med 197:789-799; Fletcher e outros. Infect Immun 2004 2088-2100; Welsch e outros. J Immunol 2004 172:5606-5615; e WO 99/57280. Ácido nucléico (e sequências de aminoácidos) para variantes e subvariantes de GNA1870 também são providas em GenBank como N^os de 15 acessoNC-003112, GenelD: 904318 (NCBI Ref. NP-274866) (de N. meningitidis cepa MC58); AY548371 (AAT01290.1) (de N. meningitidis cepa CU385); AY548370 (AAT01289.1) (de N. meningitidis cepa H44/76); AY548377 (AAS56920.1) (de N.meningitidis cepa M4105); AY548376 (AAS56919.1) (de N. cepa M1390); AY548375 (AAS56918.1) (de N. meningitidis cepa 20 N98/254); AY548374 (AAS56917.1) (de N.meningitidis cepa M6190);

AY548373 (AAS56916.1) (de N. meningitidis cepa 4243); e AY548372 (AAS56915.1) (de N. meningitidis cepa BZ83).

A Figura 7 é um alinhamento de sequências de aminoácidos exemplares de GNA1870 variantes 1, 2 e 3 de N. meningitidis cepas MC58, 25 951-5945, e M1239, respectivamente (WO 2004/048404). A proteína

GNA1870 imatura inclui uma seqüência líder de cerca de 19 resíduos, com cada variante usualmente contendo uma cisteína terminal-N à qual uma metade lipídeo pode ser covalentemente ligada. Este resíduo cisteína é usualmente lipidado na proteína ocorrendo naturalmente. 1 indica o primeiro a30 minoácido da proteína madura, com aminoácidos indicados por números negativos de parte da seqüência líder. Fundos cinza e negro indicam resíduos de aminoácidos conservados e idênticos, respectívamente. Adicionais seqüências de aminoácidos de polipeptídeos GNA1870, incluindo variantes ocorrendo não-naturalmente, são providas nas Figuras 8A-8H e 9.

O GNA1870 pode ser lipídado ou não-lipidado. É geralmente preferido que o GNA1870 seja lipídado, de modo a prover posicionamento 5 do polipeptídeo na membrana. GNA1870 lipídado pode ser preparado através de expressão do polipeptídeo GNA1870 tendo o peptídeo sinal Nterminal para direcionar lipidação através de diacil gliceril transferase, seguida por divagem através de peptidase sinal (tipo II) específica - lipoproteína.

O polipeptídeo GNA1870 útil na invenção inclui polipeptídeos 10 GNA1870 ocorrendo não-naturalmente (artificial ou mutante) que diferem em sequência de aminoácidos de um polipeptídeo GNA1870 ocorrendo naturalmente, mas que estão presentes na membrana de um hospedeiro Neisserial de modo que vesículas preparadas a partir de hospedeiro contêm GNA1870 em uma forma que provê apresentação de epitopos de interesse, preferivel15 mente um epitopo bactericida, e provê uma resposta de anticorpo antiGNA1870. Em uma modalidade, o polipeptídeo GNA1870 é uma variante 1 (v.1) ou variante 2 (v.2) ou variante 3 (v.3) de polipeptídeo GNA1870, com subvariantes de v.1, v.2 e v.3 sendo de interesse, incluindo subvariantes de v.1 (ver, por exemplo, Welsch e outros., J Immunol 2004 172:5606-5615).

Em uma modalidade, o polipeptídeo GNA1870 compreende uma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo GNA1870 que é mais predominante entre as cepas endêmicas para a população a ser vacinada.

Polipeptídeos GNA1870 úteis na invenção também incluem proteínas de fusão, onde a proteína de fusão compreende um polipeptídeo 25 GNA1870 tendo um parceiro de fusão em seu termino-N ou termino-C. Parceiros de fusão de interesse incluem, por exemplo, glutationa S transferase (GST), proteína de ligação de maltose (MBP), His-tag, e similares, assim como peptídeos líderes de outras proteínas, particularmente lipoproteínas (por exemplo, a seqüência de aminoácidos antes da cisteína terminal-N po30 de ser substituída com um outro peptídeo líder de interesse).

Outros ácidos nucléicos codificando polipeptídeo GNA1870 podem ser identificados usando técnicas bem conhecidas, onde polipeptídeos όι

GNA1870 podem ser identificados baseados em similaridade de seqüência de aminoácido para um polipeptídeo GNA1870 conhecido. Tais polipeptídeos GNA1870 geralmente compartilham pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou maior identidade de seqüência no nível de nucleotídeo ou aminoácido. Identidade de seqüência pode ser determinada usando processos para alinhamento e comparação de sequências de ácido nucléico ou aminoácido, cujos processos são bem conhecidos na técnica. Comparação de seqüências mais longas pode requerer processos mais sofisticados para obtenção de ótimo alinhamento de duas seqüências. Ótimo 10 alinhamento de seqüências para alinhamento de uma janela de comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de^ Needleman and Wunsch (-1970) J. Mol. Biol. 48:443, através de busca de processo de similaridade de Pearson and Lipman (1988) Proc. Na15 tl. Acad. Sci. (USA) 85:2444, através de implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA na Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science ill·»

Dr., Madison, Wl), ou através de inspeção, e o melhor alinhamento (isto é, resultando na mais alta porcentagem de similaridade de seqüência sobre a janela de comparação) gerada pelos vários processos é selecionado.

Os termos idêntico'¹ ou porcentagem de identidade, no contexto de duas ou mais seqüências de polipeptídeos ou ácidos nucléicos, referem-se a suas ou mais seqüências ou sub-seqüências que são idênticas ou têm uma especificada porcentagem de resíduos de aminoácidos ou nucleo25 tídeos que são os mesmos, quando comparados e alinhados para máxima correspondência, como medida usando um ou mais dos seguintes algoritmos de comparação ou através de inspeção visual. Polipeptídeos de interesse incluem aqueles tendo peto menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais identidade de resíduo de aminoácido ou nucleotídeo, quando 30 comparados e alinhados para máxima correspondência, como medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de seqüência ou através de inspeção visual. Preferivelmente, a região compartilhando identidade de se qüência existe sobre uma região das sequências que é pelo menos cerca de 10 ,20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 100 resíduos contíguos em comprimento. Em uma modalidade mais preferida, identidade das sequências é determinada através de comparação das sequências sobre o inteiro comprimento da 5 região codificando de um polipeptídeo referência.

Para comparação de seqüência, tipicamente uma seqüência atua como uma seqüência de referência (por exemplo, uma seqüência de polipeptídeo GNA1870), à qual seqüências testes são comparadas. Quando usando um algoritmo de comparação de seqüência, seqüências teste e refe10 rência são entradas em um computador, coordenadas de sub-sequência são designadas, se necessário, e parâmetros de programa algoritmo de sequência são designados. O algoritmo de comparação de seqüência então calcula a porcentagem de identidade de seqüências para a sequência(s) teste em relação à seqüência referência, baseado nos parâmetros de programa de15 signados.

Ótimo alinhamento de seqüências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela busca 20 através de processo de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad.

Sci. USA 85:2444 (1988), através de implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA na Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison,, Wl), ou através de inspeção visual (ver geralmente, Current Protocols 25 in Molecular Biology, F.M. Ausubel e outros., eds., Current Protocols, a joint venture between Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (1995 Supplement) (Ausubel).

Exemplos de algoritmos que são apropriados para determinação de porcentagem de identidade de seqüência e similaridade de seqüên30 cia são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul e outros. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 e Altschul e outros. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, respectivamente. Software para modalidade de análises BLAST é publicamente disponível de National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiro identificação de pares de seqüência de alto escore (HSPs) através de identificação de palavras curtas de comprimento W na seqüência questão, que emparelham ou satisfazem algum escore limite de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de base de dados. T é referido como o limite de escore de palavra de vizinhança (Altschul e outros., supra).

Estes impactos de palavra de vizinhança iniciais atuam como sementes para início de buscas para encontrar HSPs mais longos contendo as mesmas. Os impactos de palavra sâo então estendidos em ambas direções ao longo de cada seqüência por tão longe quanto o escore de alinhamento cumulativo pode ser aumentado. Escores cumulativos sâo calculados usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (escore recom15 pensa para um par de resíduos emparelhando; sempre > 0) e N (escore penalidade para resíduos desemparelhando; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz escore é usada para calcular o escore cumulativo. Extensão dos acertos de palavra em cada direção são impedidos quando: o escore de alinhamento cumulativo falha pela quantidade X a partir de seu valor máximo obtido; o escore cumulativo segue para zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduo de escore negativo; ou o fim de qualquer seqüência ser atingido. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensitividade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências de nucleotídeos) usa como defaults uma comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=4, e uma comparação de ambas as fitas. Para seqüências de aminoácidos, o programa BLASTO usa como defaults um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de escore BLOSUM62 (ver Heniokoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).

Em adição a cálculo de porcentagem de identidade de seqüência, o algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas seqüências (ver, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Natl

Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Uma medida de similaridade provida peto algoritmo BLAST é a probabilidade de menor soma (P(N)), que provê uma indicação da probabilidade através da qual um emparelhamento entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos pode ocorrer por chance.

Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma sequência referência se a probabilidade de menor soma em uma comparação do ácido nucléico teste ao ácido nucléico de referência é menos que cerca de 0,1, mais preferivelmente menos que cerca de 0,01, e mais preferivelmente menos que cerca de 0,001.

Ainda uma indicação de que duas sequências de ácidos nucléicos ou polipeptídeos compartilham identidade de seqüência é que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucléico é imunologicamente reativo cruzado com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucléico. como descrito abaixo. Assim, um polipeptídeo tipicamente compartilha identidade de seqüência com um segundo polipeptídeo, por exemplo, onde os dois polipeptídeos diferem somente por substituições conservativas. Uma outra indicação de que duas sequências de ácido nucléicos compartilham identidade de seqüência é que as duas moléculas hibridizam uma à outra sob condições rigorosas. A seleção de um particular conjunto de condições de hibridi20 zação é selecionada seguindo processos padrões na técnica (ver, por exemplo, Sambrook, e outros., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Um exemplo de condições rigorosas de hibridização é hibridização a 50°C ou mais e OJxSSC (cloreto de sódio 15 mM/citrato de sódio 1,5 mM). Um outro exemplo de condições rigorosas de hibridização é incubação por toda noite a 42°C em uma solução: 50% formamida, 5xSSC (NaCI 150 mM, citrato de triSsódio 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), 5x solução de Denhardt, sulfato de dextrano 10%, e DNA de esperma de salmão cisalhado, desnaturado, 20 mg/mL, seguido por lavagem de filtros em 0,1xSSC em cerca de 65°C. Condições rigorosas de hibridização são condições de hibridização que são pelo menos tão rigorosas como as condições representativas acima, onde condições são consideradas serem pelo menos tão rigorosas se elas são pelo menos cerca de 80% tão rigorosas, tipicamente pelo menos cerca de 90% tão rigorosas como as condições rigorosas específicas acima. Outras condições rigorosas de hibridízação são conhecidas na técnica e também podem ser empregadas para identificação de ácidos nucléicos desta particular modalidade da 5 invenção.

Preferivelmente, posições de resíduos que não são idênticos diferem por substituições conservativas de aminoácidos. Substituições conservatives de aminoácidos refere-se à permutabilidade de resíduos tendo cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos tendo ca10 deias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais hidroxila alifática é serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina: um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas é fenil alanina, tirosina, e triptofano; um grupo de aminoácidos 15 tendo cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina.

Preferidos grupos de substituição conservativa de aminoácidos são: valina leucina - isoleucina, fenil alanina - tirosina, lisina - arginina, alanina - valina, e aspragina - glutamina.

Vetor e métodos para introdução de material genético em células hospedeiras Neisse riais

Métodos e composições que podem ser facilmente adaptados para provimento de modificação genética de uma célula hospedeira Neisserial para expressão de um polipeptídeo GNA1870 exógeno são conhecidos 25 na técnica. Vetores e métodos exemplares são providos em WO 02/09746 e

O'Dwyer e outros. Infect. Immun 2004;72:6511-80.

Métodos para transferência de material genético em hospedeiro Neisserial incluem, por exemplo, conjugação, transformação, eletroporação, processos de fosfato de cálcio e similares. O processo para transferência 30 deve prover expressão estável do ácido nucléico codificando GNA1870 introduzido. O ácido nucléico codificando GNA1870 pode ser provido como um elemento epissomal que pode ser herdado (por exemplo, plasmídeo) ou po47

de ser genomicamente integrado.

Apropriados vetores irão variar em composição dependendo de que tipo de evento de recombinação é para ser realizado. Vetores integrantes podem ser condicionalmente replicatívos ou plasmídeos suicidas, bacte' 5 riófagos, transposons ou fragmentos lineares de DNA obtidos por hidróltse de restrição ou amplificação de PCR. Seleção do evento de recombinação pode ser realizada por meio de marcador genético selecionável tais como genes conferindo resistência a antibióticos (por exemplo, canamicina, eritromicina, cloranfenicol, ou gentamicina), genes conferindo resistência a com10 postos tóxicos e/ou de metais pesados ou genes complementando mutações auxotróficas (por exemplo, pur, leu, met, aro).

Em uma modalidade, o vetor é um vetor de expressão baseado ' em plasmídeos epissomais contendo marcadores de resistência de fármaco selecionáveis que replicam autonomamente em ambos, E. coli e N. meningi15 tidis. Um exemplo de um tal ‘‘vetor lançador é o plasmídeo pFP10 (Pagotto e outros. Gene 2000 244:13-19).

Preparação de vesículas de Neisseria meningitidis

As composições antigénicas para uso na invenção geralmente incluem vesículas preparadas a partir de células Neisseriais que expressam 20 um aceitável de GNA1870, tanto naturalmente como devido a modificação genética (por exemplo, devido a expressão de um GNA1870 recombinante). Como aqui referido “vesículas é pretendido abranger vesículas de membrana exterior assim como microvesículas (que também são referidas como vesículas).

Em uma modalidade, a composição antigênica compreende vesículas de membrana exterior (OMV) preparadas a partir de membrana exterior de uma cepa cultivada de Neisseria meningitidis spp. OMVs podem ser obtidas de uma Neisseria meningitidis crescida em meio de cultura caldo ou sólido, preferivelmente através de separação de células bacteriais do meio 30 de cultura (por exemplo, por filtraçâo ou através de uma centrifugação de baixa velocidade que forma péletes de células, ou similares), lisando as células (por exemplo, através de adição de detergente, choque osmótico, sonifi48 cação, cavitação, homogeneização, ou similares) e separação de uma fração de membrana exterior a partir de moléculas citoplásmicas (por exemplo, através de filtração; ou por precipitação diferencial ou agregação de membranas exteriores e/ou vesículas de membrana exterior, ou através de processos de separação de afinidade usando ligantes que reconhecem especificamente moléculas de membrana exterior; ou através de uma centrifugação de alta velocidade que peletiza membranas exteriores e/ou vesículas de membrana exterior, ou similares); frações de membrana exterior podem ser usadas para produção de OMVs.

Em uma outra modalidade, a composição antigénica compreende microvesiculas (MV) ou vesículas que são liberadas durante cultura da dita Neisseria meningitidis spp. MVs podem ser obtidas através de cultura de uma cepa de Neisseria meningitidis em caldo de meio de cultura, separando células integrais do caldo de meto de cultura (por exemplo, por filtração, ou através de uma centrifugação de baixa velocidade que peletiza somente as células e não as vesículas menores, ou similares), e então coletando as MVs que estão presentes no meio de cultura livre de células (por exemplo, por filtração, precipitação diferencial ou agregação de MVs, ou através de uma centrifugação de alta velocidade que peletiza as vesículas, ou similares). Cepas para uso em produção de MVs geralmente podem ser selecionadas nas bases da quantidade de vesículas produzidas em cultura (por exemplo, bactérias podem ser cultivadas em um número razoável para prover produção de vesículas apropriadas para isolamento e administração nos processos aqui descritos). Uma cepa exemplar que produz altos níveis de vesículas é descrita em publicação PCT WO 01/34642. Em adição a produção de vesícula, cepas para uso em produção de MV também podem ser selecionadas nas bases de produção de NspA, onde cepas que produzem maiores níveis de NspA podem ser preferíveis (para exemplos de cepas de N. meningitidis tendo diferentes níveis de produção de NspA, ver, por exemplo, Moe e outros. (1999 Infect. Immun. 67:5664).

Em uma outra modalidade, a composição antigénica compreende vesículas de uma cepa, ou de 2, 3, 4, 5 ou mais cepas, cujas cepas po dem ser homólogas ou heterólogas, usualmente heterólogas, uma à outra com relação a uma ou ambas GNA1870 ou PorA. Em uma modalidade, as vesículas são preparadas a partir de uma cepa que expressa 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais proteínas GNA1870, que podem ser diferentes variantes (v.1, v.2. v.3) ou subvariantes (por exemplo, uma subvariante de v.1, v.2, ou v.3). Em uma outra modalidade, as composições antigênicas compreendem uma mistura de OMVs e MVs, que podem ser das mesmas ou diferentes cepas. Em tais modalidades, vesículas de diferentes cepas podem ser administradas como uma mistura. Ainda, ©MVs e MVs das mesmas ou diferentes cepas podem ser administradas como uma mistura. Em adição a vesículas (OMVs e/ou MVs), antígenos isolados ou particulares combinações de antígenos podem ser incluídos nas composições antigênicas da invenção.

Redução de toxicidade de lipídeo

Onde desejado (por exemplo, onde as cepas usadas para produzir vesículas sâo associadas com endotoxina ou particulares altos níveis de endotoxina), as vesículas são opcionalmente tratadas para redução de endotoxina, por exemplo, para reduzir toxicidade seguindo administração. Embora menos desejável como discutido abaixo, redução de endotoxina pode ser realizada através de extração com um apropriado detergente (por exemplo, BRIJ-96, desoxicolato de sódio, lauroil sarcossinato de sódio, Empigen BB, Triton X-100, TWEEN 20 (monolaurato polioxietileno sorbitano), TWEEN 80, em uma concentração de 0,1-10%, preferivelmente 0,5-2%, e SDS). Onde extração com detergente é usada, é preferível usar um detergente outro que não desoxicolato. Em algumas modalidades, vesículas são produzidas sem o uso de detergente, por exemplo, sem uso de desoxicolato ou outro detergente.

Em modalidades de particular interesse, as vesículas das composições antigênicas são preparadas sem detergente. Embora tratamento com detergente seja útil para remoção de atividade de endotoxina, ele pode esgotar a lipoproteína GNA1870 nativa através de extração durante produção de vesícula. Assim pode ser particularmente desejável diminuir atividade de endotoxina usando tecnologia que não requer um detergente. Em uma abordagem, cepas que são produtoras relativamente baixas de endotoxina (lipopolissacarídeo, LPS) sâo usadas de modo a evitar a necessidade de remoção de endotoxina a partir da preparação final antes de uso em seres humanos. Por exemplo, as vesículas podem ser preparadas de mutantes Neisseria nos quais lipooligossacarídeo ou outros antígenos que podem ser indesejáveis em uma vacina (por exemplo, Rmp) são reduzidos ou eliminados.

Por exemplo, vesículas podem ser preparadas a partir de cepas de N. meningitidis que contêm modificações genéticas que resultam em atividade tóxica não-detectável ou diminuída de lipídeo A. Por exemplo, tal cepa pode ser geneticamente modificada em biossíntese de lipídeo A (Steeghs e outros. Infect Immun 1999;67:4988-93; van der Ley e outros. Infect Immun 2001:69:5981-90; Steeghs e outros. J Endotoxin Res 2004;10:113-9). Mutações em genes responsáveis pelas etapas de modificações terminais conduzem a fenótipos sensíveis à temperatura (htrB) ou permissivos (msbB). Mutações resultando em uma diminuída (ou nenhuma) expressão destes genes (ou diminuída ou nenhuma atividade do produto destes genes) resulta em alterada atividade tóxica de lipídeo A. Lipídeo A não-lauroilado (mutante htrB) ou não-miristoilado (mutante msbB) sâo menos tóxicos que o lipídeo A tipo selvagem. Mutações no gene codificando lipídeo A 4’-cinase (IpxK) também diminuem a atividade tóxica de lipídeo A.

Atividade tóxica de LPS também pode ser alterada através de introdução de mutações em genes/loci envolvidos em resistência a polimixina B (tal resistência foi correlacionada com adição de aminoarabinose sobre o 4’ fosfato de lipídeo A). Estes genes/loci podem ser pmrE que codifica uma UDP-glicose desidrogenase, ou uma região de genes de resistência - peptídeo antimicrobial comum a muitas enterobacteriaciae que podem estar envolvidas em síntese e transferência de aminoarabinose. O gene pmrF que está presente nesta região codifica uma dolicol-fosfato manosil transferase (Gunn J. S., Kheng, B.L., Krueger J., Kim K., Guo L, Hackett M., Miller S.l. 1998. Mol. Microbiol. 27:1171-1182).

Mutações no sistema regulador PhoP-PhoQ, que é um sistema regulador de dois componentes substituição - tosto (por exemplo, fenótipo constitutivo PhoP, PhoP^c), ou baixo Mg⁺⁺ ambiental ou condições de cultura (que ativam o sistema regulador PhoP-PhoQ) conduzem à adição de amino5 arabinose sobre 4Mosfato e 2-hidróxi miristato substituindo miristato (hidroxilação de miristato). Este lipídeo A modificado mostra reduzida habilidade para estimular expressão de E-seletina por células endoteliais humanas e secreção de TNF-alfa de monócitos humanos.

Cepas resistentes a polimixina B também são apropriadas para 10 uso na invenção, na medida em que tais cepas foram mostradas terem reduzida toxicidade LPS (ver, por exemplo, van der Ley e outros., 1994. Em: Proceedings of the ninth international pathogenic Neisseria conference. The Guildhall, Winchester, England). Alternativamente, peptídeos sintéticos que imitam a atividade de ligação de polimixina B podem ser adicionados às 15 composições antigênicas para reduzir atividade tóxica LPS (ver, por exemplo, Rustici e outros. 1993, Science 259:361-365; Porro e outros.Prog Clin Biol Res. 1998;397:315-25).

Endotoxina também pode ser reduzida através de seleção de condições de cultura. Por exemplo, cultura de cepa em um meto de cresci20 mento contendo 0,1 mg-100 mg de aminoarabinose por litro de mete provê reduzida toxicidade de lipídeo (ver, por exemplo, WO 02/097646).

Formulações

Composições imunogênicas usadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente efetiva de antígeno, particularmente 25 uma quantidade imunologicamente efetiva de GNA1870, assim como quaisquer outros componentes compatíveis, como necessário. Por quantidade imunologicamente efetiva é pretendido que a administração daquela quantidade a um indivíduo, tanto em dose simples como parte de uma série, é efetiva para elicitar tratamento ou prevenção. Esta quantidade varia dependen30 do da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, idade, o grupo taxonômico do indivíduo a ser tratado (por exemplo, primata não-humano, primata, ser humano, etc.), a capacidade do sistema imune individual sintetizar y'-l anticorpos, o grau de proteção desejado, a formulação da vacina, a avaliação do médico atendente da situação médica, e outros fatores relevantes. Ê esperado que a quantidade caia em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada, através de experimentos de rotina.

Regime de dosagem pode ser um esquema de dose simples ou um esquema de dose múltipla (por exemplo, incluindo doses de reforço) com uma forma de dosagem unitária da composição antigênica administrada em momentos diferentes. O termo forma de dosagem unitária, como aqui usado·, refere-se a unidades fisicamente discretas apropriadas como dosagens 10 unitárias para sujeitos humanos e animais, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada das composições antigênicas da presente invenção em uma quantidade suficiente para produzir o desejado efeito, cujas composições são providas em associação com um excipiente farmaceuticamente aceitável (por exemplo, diluente, ou veículo farmaceuticamente acei15 tável). A vacina pode ser administrada em conjunção com outros agentes imunorreguladores.

As composições antigênicas a serem administradas são providas em um diluente farmaceuticamente aceitável tal como uma solução a quosa, frequentemente uma solução salina, uma forma semi - sólida (por exemplo, gel), ou em forma pulverizada. Tais diluentes podem ser inertes, embora as composições da invenção também possam incluir um adjuvante. Exemplos de adjuvantes apropriados conhecidos que podem ser usados em seres humanos incluem, mas não são necessariamente limitados a, alúmen, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, MF59 (4,3% peso/volume esqua25 leno, 0,5% peso/volume Tween 80, 0,5% peso/volume Span 85), ácido nucléico contendo CpG (onde a citosina é não-metilada), QS21, MPL. 3DMPL, extratos de Aquilla, ISCOMS, mutantes LT/CT, micropartículas de poli(D,Llactídeo-co-glicolídeo) (PLG), Quil A, interleucinas, e similares. Para animais experimentais, pode-se usar Freund’s, N-acetil muramil-L-treonil-D30 isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP

11637, referida como nor-MDP), N-acetil muramíl-L-alanil-D-isoglutaminil-Lalanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glícero-3-hidróxi fosforilóxi) etil amina (CGP

19835A, referida como MTP-PE), e RIBI, que contém três componentes extraídos de bactérias, monofosforil lipídeo A, dimicolato de trealose e esqueleto de parede de célula (MPL+TDM+CWS) em uma emulsão 2% de esqualeno/Tween 80. A eficácia de um adjuvante pode ser determinada através de 5 medição de quantidade de anticorpos direcionados contra o antígeno imunogênico.

Ainda adjuvantes exemplares para aperfeiçoamento de eficácia da composição incluem, mas não são limitados a: (1) formulações de emulsão óleo-em-água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específi10 cos como peptídeos muramila (ver abaixo) ou componentes de parede de célula bacterial), tais como, por exemplo, (a) MF59® (WO 90/14837; capítulo 10 em Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), contendo 5% esqualeno, 0,5% Tween 80, 0,5% Span 85 (opcionalmente contendo MTP-PE) formulado em partículas 15 submicron usando um microfluidizador, (b) SAF, contendo 10% Esqualeno, 0,4% Tween 80, 5% polímero L121 bloqueado - pluronic, e thr-MDP tanto microfluidizado em uma emulsão submicron como feito vórtex para gerar uma emulsão de maior tamanho de partícula, e (c) sistema adjuvante RIBI® (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) contendo 2% Esqualeno, 0,2% 20 Tween 80, e um ou mais componentes de parede de célula bacterial tais como mono fosforil lipídeo A (MPL), dimicolato de trealose (TDM), e esqueleto de parede de célula (CWS), preferivelmente MPL + CWS (DETOX); (2) adjuvantes saponina, tais como QS21 ou STIMULON® (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) podem ser usados ou partículas geradas dos mesmos 25 como ISCOMs (complexos imunoestimulantes), cujos ISCOMS podem ser destituídos de adicional detergente, por exemplo, WO 00/07621; (3) Adjuvante de Freund Completo (CFA) e Adjuvante de Freund Incompleto (IFA);

(4) citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6,

IL-7, IL-12 (WO99/44636), etc.), interferons (por exemplo, interferon gama), 30 fator de estimulação de colônia de macrófago (M-CSF), fator de necrose de tumor (TNF), etc.; (5) monofosforil lipídeo A (MPL) ou MPL 3-O-desacilado (3dMPL), por exemplo, GB-2220221, EP-A-0689454, opcionalmente na c

substancial ausência de alúmen quando usado com sacarídeos pneumococais, por exemplo, WO 00/56358; (6) combinações de 3dMPL com, por exemplo, QS21 e/ou emulsões óleo-em-água, por exemplo, EP-A-0835318,

EP-A-0735898, EP-A-0761231; (7) oligonucleotídeos compreendendo moti5 vos CpG [Krieg Vaccine 2000, 19, 618-622; Krieg Curr opin Mol Ther 2001 3:15-24; Roman e outros., Nat. Med., 1997, 3, 849-854; Weiner e outros.,

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WO 98/37919 e WO 98/52581], isto é, contendo pelo menos um dinucleotídeo CG, onde a citosina está não-metilada; (8) um polioxietileno éter ou um polioxietileno éster, por exemplo, WO 99/52549; (9) um tensoativo polioxietileno sorbitano éster em combinação com um octoxinol (WO 01/21207) ou um tensoativo polioxietileno alquil éter ou éster em combinação com peto menos um adicional tensoativo não-iônico tal como um octoxinol (WO 01/21152); (10) uma saponina e um oligonucleotídeo imunoestimulador (por exemplo, um oligonucleotídeo CpG) (WO 00/62800); (11) um imunoestimulante e uma partícula de sal de metal, por exemplo, WO 00/23105; (12) uma saponina e uma emulsão de óleo-em-água, por exemplo, WO 99/11241; (13) uma saponina (por exemplo, QS21) + 3dMPL + IM2 (opcionalmente + um esterol), por exemplo, WO 98/57659; (14) outras substâncias que atuam como agentes imunoestimulantes para aperfeiçoar a eficácia da composição.

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Peptídeos muramila incluem N-acetil muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thrMDP), N-25-acetil normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetil muramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina^-O’^’-dipalmitoil-sn-glicero-Shidróxi fosforilóxi) etil amina MTP-PE), etc.

As composições antigênicas podem ser combinadas com um excipiente farmaceuticamente aceitável convencional, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sucrose, magnésio, carbonato, e similares. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como requerido para aproximar condições fisiológicas tais como agentes de tamponamento e ajuste de pH, agentes de ajuste de toxicidade e similares, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, e similares. A concentração de antígeno nestas formulações pode variar amplamente, e será selecionada baseado primariamente em volumes de fluidos, viscosidades, peso de corpo e similares de acordo com o particular modo de administração selecionado e as necessidades de paciente. As resultantes composições podem estar na forma de uma solução, suspensão, comprimido, pílula, cápsula, pulverizado, gel, creme, loção, pomada, aerossol, ou similares.

A concentração de proteína de composições antigênicas da invenção nas formulações farmacêuticas pode variar amplamente, isto é, de menos que cerca de 0,1%, usualmente em, ou peto menos cerca de 2% a tanto quanto 20% a 50%, ou mais em peso, e será selecionada primariamente por volumes fluidos, viscosidades, etc., de acordo com o particular modo de administração selecionado.

Imunização

Em geral, os métodos da invenção provêm administração de uma ou mais composições antigênicas da invenção a um sujeito mamífero (por exemplo, um ser humano) de modo a elicitar uma resposta imune prote30 tora contra mais de uma cepa de bactérias de espécies Neisseria, e assim proteção contra doenças causadas por tais bactérias. Em particular, os métodos da invenção podem prover uma resposta imuno imunoprotetora contra

1, 2, 3, 4, ou mais cepas de espécies de Neisseria meningitidis, onde as cepas diferem em pelo menos um de sorogrupo, sorotipo, sorosubtipo, ou polipeptídeo GNA1870 (por exemplo, diferentes variantes e/ou subvariantes de GNA1870). De particular interesse é a indução de uma resposta imune pro5 tetora contra múltipla cepas de Neisseria meningitidis de sorogrupo B, particularmente onde as cepas diferem em sorosubtipo (por exemplo, têm PorAs heterólogas). Também de particular interesse é a indução de uma resposta imune protetora contra cepas que são heterólogas umas às outras em termos de PorA e/ou GNA1870.

As composições antigênicas da invenção podem ser administradas oralmente, nasalmente, nasofaringealmente, parenteralmente, entericamente, gastricamente, topicamente, transdermicamente, subcutaneamente, intramuscularmente, em forma de comprimido, sólida, pulverizada, líquida, aerossol localmente ou sistemicamente, com ou sem excipientes adiciona15 dos. Real métodos para preparação de composições parenteralmente administráveis serão conhecidos ou visíveis para aqueles versados na técnica e sâo descritos em mais detalhes em publicações tais como Remington’s Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).

É reconhecido que administração oral pode requerer proteção das composições a partir de digestão. Isto é tipicamente realizado tanto através de associação da composição com um agente que a torna resistente a hidrólise ácida ou enzimática como através de embalagem de composição em um veículo apropriadamente resistente. Meios para proteção a partir de 25 digestão são bem conhecidos na técnica.

As composições são administradas a um animal que está em risco de adquirir uma doença Neisserial para prevenir ou pelo menos parcialmente impedir o desenvolvimento de doença e suas complicações. Uma quantidade adequada para realizar isto é definida como uma “dose terapeu30 ticamente efetiva”. Quantidades eficazes para uso terapêutico dependerão, por exemplo, de composição antigênica, a maneira de administração, o peso e estado geral de saúde do paciente, e o julgamento do médico atendente.

»	Doses simples ou múltiplas das composições antigênicas podem ser administradas dependendo da dosagem e freqüência toleradas peto paciente, e
	rota de administração. As composições antigênicas aqui descritas podem compreender
' 5	uma mistura de vesículas (por exemplo, OMV e MV), cujas vesículas podem ser das mesmas ou diferentes cepas. Em uma outra modalidade, as composições antigênicas podem compreender uma mistura de vesículas de 2, 3, 4,
_#ífc.	5 ou mais cepas, onde as vesículas podem ser OMV, MV ou ambas. As composições antigênicas são administradas em uma quanti-
10	dade efetiva para elicitarem uma resposta imune, particularmente uma resposta imune umoral, no hospedeiro. Quantidades para imunização da mistura geralmente variam de cerca de 0,001 mg a cerca de 1,0 mg por 70 quilo-
*	gramas de paciente, mais comumente de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,2
15	mg por 70 quilogramas paciente. Dosagens de 0,001 até cerca de 10 mg por paciente por dia podem ser usadas, particularmente quando o antígeno é administrado a um sítio retirado e não na corrente sanguínea, tal como em uma cavidade de corpo ou em um lúmen de um órgão. Dosagens substancialmente maiores (por exemplo, 10 a 100 mg ou mais) são possíveis em ad-
	ministração oral, nasal, ou tópica. A administração inicial da mistura pode ser seguida por imunização de reforço da mesma ou diferente mistura, com pelo menos um reforçador, mais usualmente dois reforçadores, sendo preferidos. Em uma modalidade, as composições antigênicas usadas para primar e reforçar são preparadas de cepas de Neisseria que possuem antígenos imunodominantes (os principais antígenos que sào rotineiramente
25	detectados por anti-soros a partir de diferentes animais hospedeiros que foram infectados com Neisseria; exemplos representativos incluem Porina A, Porina B, pilina, NspA, fosfolipídeos, polissacarídeos, lipopolissacarídeos, pilinas, OmpA, Opa, Opc, etc.) e/ou proteínas GNA1870 variantes. As cepas também podem variar com relação à molécula de cápsula, como refletido por
30	seu sorogrupo. Classificação de sorotipo e soro-sub-tipo é atualmente determi- nada através de detecção de um painel de monoclonais conhecidos, que são

conhecidos reconhecerem específicas moléculas Porina, ligam a uma cepa desconhecida (Sacchi e outros., 1998, Clin. Diag. Lab. Immunol. 5:348). É provável que outros monoclonais sejam identificados. O uso de quaisquer novos sorotipos e sorosubtipos que possam ser definidos através de quais5 quer novos monoclonais é especificamente contemplado pela invenção. Em adição, sorotipos e sorosubtipos podem ser definidos, não somente através de interação com anticorpos monoclonais, mas também estruturalmente através de ausência e/ou presença de definidos resíduos de peptídeos e epitopos de peptídeos (Sacchi e outros., 2000, J. Infect. Dis. 182:1169). Es10 quemas de classificação de sorotipo e soro subtipo que são baseados em características estruturais das Porinas (conhecidas ou que podem ser descobertas em uma data posterior) são específicamente abrangidas pela invenção.

Em uma outra modalidade, as composições antigênicas adminis15 tradas são preparadas a partir de 2, 3, 4, 5 ou mais cepas, cujas cepas podem ser homólogas ou heterólogas, usualmente heterólogas, umas às outras com relação a uma ou ambas de GNA1870 ou PorA. Em uma modalidade, as vesículas são preparadas a partir de cepas que expressam diferentes proteínas GNA1870, cujas proteínas GNA1870 podem ser diferentes varian20 tes (v.1, v.2, v.3) ou subvariantes (por exemplo, uma subvariante de v.1, v.2, ou v.3). Em uma outra modalidade, as vesículas são preparadas a partir de cepas que são heterólogas umas às outras com relação a PorA.

Em modalidades de particular interesse, vesículas são preparadas a partir de cepas Neisseriais que são geneticamente diversas umas das 25 outras (por exemplo, as cepas pertencem a diferentes sorotipos e/ou soro subtipos; expressam diferentes proteínas PorA: expressam diferentes variantes ou subvariantes de GNA1870; e/ou podem também opcionalmente pertencer a diferentes sorogrupos capsulares). As vesículas podem ser usadas para preparação de uma composição antigênica que é uma mistura de vesí30 cuias preparada a partir de peto menos 2, 3, 4, ou mais de tais cepas geneticamente diversas. Por exemplo, proteína GNA1870 e/ou PorA da segunda cepa Neisserial a partir da qual composições antigênicas são preparadas e administradas é/são diferente daquela da primeira cepa usada para produzir vesículas.

A segunda, terceira, e ainda composições antigênicas administradas opcionalmente podem ser preparadas a partir de cepas Neisseriais 5 que sâo geneticamente diferentes da segunda cepa (por exemplo, as cepas pertencem a diferentes sorotipos e/ou sorosubtipos; expressam diferentes proteínas GNA1870; expressam diferentes proteínas PorA; e/ou pertencem a diferentes sorogrupos capsulares). Por exemplo, uma terceira cepa usada para preparação de uma terceira composição antigênica pode ser genetica10 mente diferente das primeira e segunda cepas usadas para preparar as primeira e segunda composições antigênicas, mas pode, em algumas modalidades, não ser geneticamente diferente com relação à primeira cepa.

A invenção também contempla que as composições antigênicas podem ser obtidas de uma ou mais cepas de Neisseria, particularmente 15 Neisseria meningitidis, que são geneticamente engenheiradas através de processos conhecidos (ver, por exemplo, patente US 6 013 267) para expressarem um ou mais ácidos nucléicos que codificam GNA1870. A célula hospedeira pode expressar um polipeptídeo GNA1870 endógeno ou pode ser modificada ou selecionada de modo a não expressar qualquer polipeptí20 deo GNA1870 endógeno detectável. O polipeptídeo GNA1870 expresso na célula hospedeira através de técnicas recombinantes (isto é, o polipeptídeo GNA1870 exógeno) pode ser do mesmo ou diferente tipo variante como um polipeptídeo GNA1870 endógeno.

As células hospedeiras ainda podem ser modificadas para ex25 pressarem adicionais antígenos de interesse, tais como Porina A, Porina B, NspA, pilina, ou outras proteínas Neisseriais. Em adição, as composições antígenas da invenção podem compreender adicionais antígenos Neisseriais tais como aqueles exemplificados em Publicação PCT WO 99/24578, WO 99/36544; WO 99/57280, WO 00/22430, e WO 00/66791, assim como frag30 mentos antigênicos de tais proteínas.

As composições de antígenos são tipicamente administradas a um mamífero que é imunologicamente ingênuo com relação a Neisseria, par6Θ ticularmente com relação a Neisseria meningitidis. Em uma modalidade particular, o mamífero é uma criança humana de cerca de cinco anos ou mais jovem, e preferivelmente de cerca de dois anos ou mais jovem, e as composições de antígenos sâo administradas em qualquer um ou mais dos seguin5 tes momentos: duas semanas, um mês,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11 meses, ou um ano ou 15, 18, ou 21 meses após nascimento, ou em 2, 3, 4, ou 5 anos de idade.

Em geral, administração a qualquer mamífero é preferivelmente iniciada antes do primeiro sinal de sintomas de doença, ou no primeiro sinal 10 de possível ou real descrição a Neisseria.

imunidade Passiva

A invenção também contempla anticorpos imunoprotetores gerados por imunização com uma composição antigênica da invenção, e processos de uso. Tais anticorpos podem ser administrados a um indivíduo (por 15 exemplo, um paciente humano) para prover imunidade passiva contra uma doença Neisserial, tanto para prevenir infecção como ocorrência de doença, ou como uma terapia para aperfeiçoar o resultado clínico em pacientes com doença estabelecida (por exemplo, diminuída taxa de complicação tal como choque, diminuída taxa de mortalidade, ou diminuída morbidez, tal como 20 surdez).

Anticorpos administrados a um sujeito que são de uma outra espécie que não a espécie na qual eles sâo elevados são frequentemente ímunogênicos. Assim, por exemplo, anticorpos murinos ou suínos administrados a um ser humano frequentemente induzem uma resposta imunológica 25 contra o anticorpo. As propriedades imunogênicas do anticorpo são reduzidas através de alteração de porções, ou todo, o anticorpo em seqüências caracteristicamente humanas pelo que produzindo anticorpos quiméricos ou seres humanos, respectivamente.

Anticorpos quiméricos são moléculas de imunoglobulina com30 preendendo uma porção humana e não-humana. Mais especificamente, a região combinando antígeno (ou região variável) de um anticorpo quimérico humanizado é derivada de uma fonte não-humana (por exemplo, murina), e a região constante do anticorpo quimérico (que confere função efetora biológica à imunoglobulina) é derivada de uma fonte humana. O anticorpo quimérico deve ter especificidade de ligação de antígeno da molécula de anticorpo não-humano e a função efetora conferida pela molécula de anticorpo huma5 no. Um grande número de processos de geração de anticorpos quiméricos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, patente US 5 502 167, 5 500 362, 5 491 088, 5 482 856, 5 472 693, 5 354 847, 5 292 867, 5 231 026, 5 204 244, 5 202 238, 5 169 939, 5 081 235, 5 075 431 e 4 975 369). Uma abordagem alternativa é a geração de anticorpos 10 humanizados através de ligação de regiões CDR de anticorpos nãohumanos a regiões constantes humanas através de técnicas de DNA recombinante. Ver Queen e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1002910033 (1989) e WO 90/07861.

Em uma modalidade, vetor DNA recombinante é usado para 15 transfectar uma linha de células que produz um anticorpo contra um peptídeo da invenção. O novo vetor DNA recombinante contém um gene substituição” para substituir todo ou uma porção do gene codificando a região constante de imunoglobulina na linha de célula (por exemplo, um gene substituição pode codificar toda ou uma porção de uma região constante de uma 20 imunoglobulina humana, ou uma classe de imunoglobulina específica), e uma seqüência alvo que permite uma recombinação homóloga alvejada com seqüências de imunoglobulina dentro de célula produzindo anticorpo.

Em uma outra modalidade, um vetor DNA recombinante é usado para transfectar uma linha de células que produz um anticorpo tendo uma 25 desejada função efetora (por exemplo, uma região constante de uma imunoglobulina humana), em cujo caso, o gene de substituição contido no vetor recombinante pode codificar toda ou uma porção de uma região de um anticorpo e a seqüência alvo contida no vetor recombinante permite a recombinação homóloga e modificação de gene alvejada dentro de célula produzin30 do anticorpo. Em qualquer modalidade, quando somente uma porção da região variável ou constante é substituída, o resultante anticorpo quimérico pode definir o mesmo antígeno e/ou ter a mesma função efetora ainda ser alterado ou aperfeiçoado de modo que o anticorpo quimérico possa demonstrar uma maior especificidade de antígeno, maior constante de ligação de afinidade, função efetora aumentada, ou aumentada secreção e produção pela linha de células produzindo anticorpo transfectado, etc.

Em uma outra modalidade, esta invenção provê anticorpos inteiramente humanos. Anticorpos humanos consistem inteiramente em sequências de polipeptídeos caracteristicamente humanas. Os anticorpos humanos desta invenção podem ser produzidos através de uma ampla variedade de processos (ver, por exemplo, Larrick e outros., patente US 5 001 065). Em 10 uma modalidade, os anticorpos humanos da presente invenção são produzidos inicialmente em células trioma (descendentes de três células, duas humanas e uma de camundongo). Genes codificando os anticorpos são então clonados e expressos em outras células, particularmente células mamíferas não-humanas. A abordagem genérica para produção de anticorpos humanos 15 através de tecnologia trioma foi descrita por Ostberg e outros. (1983), Hybridoma 2:361-367, Ostberg, patente US 4 634 664, e Engelman e outros., patente US 4 634 666. Triomas foram verificadas produzirem anticorpos mais estavelmente que hibridomas comuns fabricados a partir de células humanas.

Métodos para produção e formulação de anticorpos apropriados para administração a um sujeito (por exemplo, um sujeito humano) são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos podem ser providos em uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade efetiva de um anticorpo e um excipiente farmacêutico (por exemplo, solução salina). A 25 composição farmacêutica opcionalmente pode incluir outros aditivos (por exemplo, tampões, estabilizadores, conservantes, e similares). Uma quantidade efetiva de anticorpo é geralmente uma quantidade efetiva para prover proteção contra doença ou sintomas Neisseriais por um desejado período, por exemplo, um período de pelo menos cerca de 2 dias a 10 dias ou 1 mês 30 a 2 meses).

Ensaios Diagnósticos

As composições antigênicas da invenção, ou anticorpos produ63

zidos através de administração de tais composições, também podem ser usadas para propósitos diagnósticos. Por exemplo, as composições antigênicas podem ser usadas para seleção de soros pré-imune e imunes para assegurar que a vacinação foi efetiva. Anticorpos também podem ser usados em ensaios imunes para detecção da presença de particulares moléculas de antígenos associadas com doença Neisserial.

Exemplos

É entendido que os exemplos e modalidades aqui descritos sâo somente para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou mudanças em sua luz serão sugeridas para pessoas versadas na técnica e sâo para serem incluídas no espírito e corpo deste pedido de patente e escopo das reivindicações apostas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados são pelo que incorporados por referência em sua totalidade para todos os propósitos.

Materiais e Métodos

Os seguintes métodos e materiais foram usados nos exemplos abaixo.

Cepas bacteriais. As nove cepas de N. meningitidis usadas neste estudo (seis grupo B capsular, e um grupo A capsular e dois grupo C capsular) sâo listadas na Tabela 1. Cepas foram coletadas sobre um período de 25 anos de pacientes hospitalizados em Cuba, Holanda, Alemanha, Nova Zelândia, ou Estados Unidos. Baseado em análises de cacho eletroforético e/ou tipificação de seqüencíamento, as cepas são geneticamente diversas.

Tabela 1. Sumário das cepas de N. Menigitidis
Cepa	País de ori- gem	Classificação Sorológica	Seqüência de VR de PorA tipo^a	Grupamento do tipo Eletroforéstico (ET) (Tipo de Seqüência, ST)^b	Grupo de Variante de GNA1870 (% de identidade aminoácidos)^c	Título bactericida de rGNA1870 anti-soro^d
Z1092	Alemanha	A: 4,21:P1.10	1,5-2,10	ST-1 Complexo/ subgrupo l/ll	1(96)	1:10.....
BZ198	Países baixos	B:NST‘P1,4	7-2,4	ET154	1 (92)	<1:10
CU385	Cuba	B:4,7:1.19,15	19,15	Complexo (33) ET5	1 (100)	1:2500
M1390	U.S.	B:15:P1.7,4	ND	Cepa 3 (41)	1(92)	<1:10
M6190	U.S.	B:2^a.P1.5.2	ND	Complexo (1988) ET37	1(94)	<1:10
NZ98/254	NZ	B:4:P1.4	1,7-2,4	Cepa 3 (42)	1 (92)	<1:10
RM1090	Ü.S.	C:2«p1.5,2	5-1,2	ND	2(70)	NO
4243	U.S.	C:2^Bp1.5,2	ND	Complexo (11 ) ET37	1 (95)	<1:10
H44/76	Noruega	B:15:P1.7,16	1.7,16	Complexo (32) ET5	1 (100)	1:900

22.

Cepa RM1090 do Grupo C (C:2a:501,2) e mutantes descritos abaixo que foram derivados desta cepa, e a cepa H44/76 od grupo B e mu_t tantes descritos abaixo que foram derivados desta cepa, foram usadas para preparar as vacinas de vesículas de membrana externa (OMV). A cepa ' 5 RM1090 expressa naturalmente baixos níveis de uma proteína de variante 2 de GNA1870. A cepa RM1090 na qual o gene de GNA1870 foi inativado .(áGNA1870 de RM1090), descrita abaixo) foi usada para superexpressão da variante 1 de GNA 1870. A cepa H44/76 é relativamente alto expressador de variante 1 de GNA1870. As sete cepas remanescentes expressam natu10 ralmente subvariantes da proteína de variante 1 de GNA1870 e foram sele15

expressam 1 foram esisolados do

Med

2003;

de cepa cionadas como organismo de teste para determinar a extensão da imunidade protetora da variante 1 anti-GNA1870 induzida por vacina. Essas cepas são geneticamente diversas, conforme definidas por tipo eletroforético e/ou tipo de seqüenciamento multilocal, e elas expressam também diferentes tipo de seqüência de PorA VR. As cepas de variante colhidas porque elas são responsáveis por cerca de 60% de grupo B produtores de doenças (Masignani e outros., J Exp 197:789-99).

A cepa Cu385 e a cepa H44/76 expressam a variante GNA1870 com uma seqüência de aminoácidos idêntica àquela da

MC58 (Welsh e outros., J Immunol 2004;172:5606-15), o gene usado para expressar a proteína de variante 1 de GNA1870 recombinante em E. coli, e também usado no vetor lançador para superexpressar GNA1870 em cepa RM1090 de vacina de N. meningitidis (vide abaixo). As sete cepas remanescentes expressam subvariantes de variante 1 de GNA1870 com ligeiras variações de seqüência da proteína de GNA1870 codifica pelo gene da cepa MC58 (Masignani e outros. 2003 supra). Em um estudo anterior, a cepa Cu385 era altamente suscetível de atividade bactericida mediada por complementos de anticorpos elicitados em camundongos imunizados com uma vacina de proteína de GNA1870 recombinante (Tabela 1). Em contraste, as cepas de N. meningitidis BZ198, M1390 e Nz98/294 foram selecionadas porque elas são resistentes à atividade bactericida de anti-soros preparados contra a vacina de GNA1870 recombinante (título bactericidas <1:10).

Construção de vetor lançador pFP12-GNA1870. Superexpressão de GNA1870 em N. meningitidis foi obtida usando o vetor lançador FP12, que tem ordem de replicação de um plasm ídio de ocorrência natural em N.

gonorrheas e mostrou transformar estavelmente E. coli e N. meningitidis (Pagotto e outros. Gene 2000;244:13-9). O gene de GNA1870 de variante 1, incluindo o promotor de caixa FUR putativo da cepa de N. meningitidis MC58 foi amplificada de DNA genômico por PCR usando os seguintes iniciadores:

GNA1879FURSphlF 5. 5” - ATCGGCATGCGCCGTTCGGACGACATTTG10 3 e gna1870fursTUir3'5” - AAGAAGGCCTTTATTGCTTGGCGGCAAGGC3. O produto de PCR foi então digerido com endonuclease de restrição Sphl e Stul e ligado no plasmídio pFPl2 digerido com Sphl e Stul, removendo a gene de GFP. O plasmídio resultante, pFP12-GNA1870, foi transformado e propagado nas células competentes da cepa de E. co//TOP10 (Invitrogen), 15 que foi crescida no médio Luria-Bertani a 37°C, sob seleção de cloranfenicol (50 pg/mL).

Transformação de N. meningitidis. A cepa RM1090 na qual o gene de GNA1870 foi inativado (ΔΘΝΑ1870 de RM1090) foi feita por recombinação homóloga por transformação com o plasmídio pBSUDG20 NA1870ERM usando seleção de eritromicina (5 pg/mL). Para a preparação de um mutante que superexpressa GNA1870, 3 a 4 colônias da cepa de nocaute de ΔΘΝΑ1870 de RM1090 foram selecionadas de uma placa de agar de chocolate que tinha sido crescida durante à noite. As colônias de bactérias foram misturadas com 3 pg do plasmídio pFP12-GNA1870 em 20 pL de 25 tampão de EB (Qiagen), semeadas em uma placa de ágar de chocolate, e incubadas por 5 horas a 37°C. Diluições em série das bactérias foram recultivadas em placas de ágar de chocolate contendo cloranfenicol (5 pg/mL). As placas de cultura foram incubadas durante à noite a 37°C, e as colônias foram selecionadas para expressão de GNA1870 por ensaio de blot de colô30 nia suando anticorpo policlonal anti-rGNA1870 de camundongo. Colônias individuais positivas foram selecionadas e re-cultivadas em placas de ágar de chocolate contendo cloranfenicol. As células bacterianas meningococci68

cas foram congeladas em leite desnatado a 2% (p/v), e armazenadas a 8O⁰C.

Um procedimento análogo foi usado para transformar a cepa H44/76 e um mutante deste que superexpressa GNA1870. gna1870 cromossõmico em cepa H44/76 foi inativado por transformação com pBSUDAgna1870erm (Hou e outros., Infect Immun 2003;71:6844-49). O mutante (z\gna1870 de H44/76) foi então transformado com o plasmídio PFP120GNA1870 que codificou a variante 1 de GNA1870 a partir da cepa MC58. Os transformantes foram selecionados em placas de ágar de chocolate contendo 5 pg/mL de cloranfenicol.

Preparações das membranas. N. meningitidis foi subcultivada de estoque congelado em placas de ágar de chocolate (Remei, Laztakas, Kans.). Depois da incubação durante à noite a 37°C em 5% de CO₂, várias colônias foram selecionadas e inoculadas em cerca de 6 mL de caldo de Mueller-Hinton contendo 0,25% de glicose e 0,02mM de CMP-ΝΑΝΑ em uma atmosfera contendo 5% de CO2 para um densidade ótica a 620 nm (OD₆₂o) de 0,1. Todas as cepas contendo o vetor lançador de pFPl2GNA1870 introduzido foram crescidas em presença de 5 pg/mL de cloranfenicol. O caldo inoculado foi incubado a 37°C e 5% de CO? com rotação até que a OD₆2o atingisse 0,6 a 0,7 (2 a 3 h). Seis culturas de partida de 6 mL foram usadas para inocular 1L de caldo de Mueller-Hinton. A cultura maior foi crescida a 37°C com agitação vigorosa para uma OD₆2o de 0,8 a 1,0. Fenol foi adicionado (0,5% p/v), e o caldo foi deixado a 4°C durante à noite para destruir as bactérias. As células bacterianas foram precipitadas por centrifugaçâo (10.000 X g) por 30 minutos a 4°C, e congeladas e armazenadas a 20°C até serem usadas para preparação das vacinas de vesículas de membrana externa.

Para as culturas contendo a cepa H44/76 e o mutante desta, seis culturas de partida de 7 mL foram usadas. As células foram transferidas para 1 L de caldo de Mueller-Hinton sem cloranfenicol foi adicionado e foram crescidas com agitação vigorosa até atingir OD₆₂o de 0,8 a 1,0. Foi adicionado fenol (0,5% p/v) e a cultura foi deixada a 37°C por duas horas e incubada . durante à noite a 4°C para destruir a bactérias. As células foram precipitadas por centrifugação (11.000 X g) por 30 minutos a 4°C.

Frações de membrana de Λ/. meningitidis para OMVs foram preparadas co* mo anteriormente descrito sem o uso de detergentes para evitar extração da 5 liporroteína de GNA1870 (Moe e outros., 2002, supra). Em resumo, as células bacterianas congeladas foram suspensas em 40 ml de PBS e sonicadas em gelo com um sonicador equipado com uma microponta (Branson, Danbury, Coon.) por 4 explosões de 15 segundos, que foi suficiente para liberar as flictena, mas sem causar lise completa das bactérias. As suspensões 10 bacterianas foram resfriadas em gelo entre as explosões. Fragmentos de células foram removidos por centrifugação a 5.000 X g, e a fração de membrana que permaneceu na membrana foi obtida por ultracentrifugaçâo a 100.00 X por 1 hora, a 4°C, e re-suspensa em 5 mL de PBS. Essas preparações foram denominadas OMVs. Alternativamente, MVs podem ser usadas, 15 as quais são obtidas de flictenas liberadas pelas bactérias para os sobrenadantes conforme descrição de Moe e outros., 2002, acima; vide também WO 02/09643.

Para H44/76 (mutante desta), as células bacterianas congeladas foram re-suspensas em 20 mL de tampão PBS, e sonicadas com quatro ex20 plosões de 15s. Fragmentos de células foram removidos por centrifugação (16.000 X g) por 30 minutos, a 4°C, e a membranas celulares, que estavam enriquecidas com proteínas de membrana externa, foram coletadas da fração solúvel por centrifugação (100.000 X g) por 2 horas.

Caracterização das vacinas. As concentrações de proteína foram determi25 nadas pelo ensaio de proteína DC (Bio-Rad, Richmond, CA.) e o Kit de Ensaio de Proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). As preparações de OMV foram analisadas por SDS-PAGE 15% (SDS-PAGE a 12,5% para as preparações de H44/76) conforme descrição de Laemmli (Nature 1970; 227:680-5) empregando um aparelho de eletroforese Mini-Protean II (Bio-Rad), e Western 30 blot. As amostras foram suspensas em um tampão de amostra (0.06M de Tris.HCI, pH 6,8, 10% (v/v) de glicerol, 2% (p/v) de SDS, 5% (v/v) de 2mercaptoetanol, 10 pg/mL de azul de bromofenol) e aquecidas para 100°C, por 5 minutos de carregamento diretamente sobre o gel.

Para Western blots, o gel foi equilibrado com tampão (48 mM de

Tris.HCI, 39 mM de glicina 20% (v/v) de metanol) e transferido para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad) usando uma célula de transferência 5 eletroforética semi-seca Trans-Blot™ (Bio-Rad). As membranas de nitrocelulose foram bloqueadas com 2% (p/v) de leite não gorduroso em PBS, e reagidas com uma diluição de 1:20.000 de anti-soro anti-rGNA1870 em PBS contendo 1% (p/v) de BSA e 1% (p/v) de Tween-20. Anticorpo ligado foi detectado usando anticorpo policlonal conjugado com raiz forte peroxidase de 10 IgG+A+M de anticamundongo de coelho (Zymed, South San Francisco, CA) e reagentes quimioluminescentes Western Lightning (PerkinElmer Life Scineces, Inc., Boston, MA). O anti-soro anti-GNA1870 de detecção era de ca

mundongos imunizados seqüencialmente com uma injeção, cada, de 10 pg de v.1 de GNA1870 recombinante (gene de cepa de Λ/. meningitidis MC58), seguido por uma dose de proteína de v.3 recombinante (gene de cepa M1239), seguido por uma dose de proteína de v.2 recombinante (gene de cepa 2996). Cada injeção foi separada por 3 a 4 semanas.

Imunização. A vacina de proteína recombinante foi expressa em E. coti como previamente descrito usando-se seqüência de DNA de GNA1870 que codifica seis histidinas COOH-terminal (marcação de His) e isenta da seqüência N-terminal que codifica o peptídeo líder putativo (Weslch e outros. J. Immunol 2004;172:5606-15). Essa proteína de GNA1870 com marcação His não lipidifiçada foi usada já que ela proporciona maior facilidade de preparação que a lipoproteína recombinante, e dados de estudos anteriores indicaram que o antígeno não lipidificado dado com adjuvantes completos e incompletos de Freund elicitaram respostas bactericidas fortes em camundongos contra a maioria das cepas testadas.

As preparações de OMV ou proteína de GNA1870 recombinante foram diluídas em PBS e absorvida com igual volume de adjuvante de fosfato de alumínio (1% de concentração final de Alhydrogel [p/v; Superfos Biosector, Frederikssund, Dinamarca]) que havia sido incubado com tampão de PBS). Grupos de camundongos fêmeas de 4 a 6 semanas de idade CD1 (Charles River Breeding Laboratories, Raleigh, NC)(N=10 por grupo) foram imunizados via intraperitonial (i.p.). Cada camundongo recebeu uma dose contendo 5 pg de proteína total (para o grupo de mistura, 2,5 pg cada de OMV e rGNA1870), Foi dado um total de três injeções, cada separada por 5 intervalos de 3 semanas. Duas semanas depois da terceira dose, os camundongos foram sangrados por punção cardíaca e sacrificados. Os soros foram separados e armazenados congelados a -20°C.

[00184 Para as preparações de H44/75, cada camundongo recebeu uma dose de 1,25 pg da proteína total presente na OMV e 170 pg de fosfato 10 de alumínio. Três injeções foram dadas separadas por três semanas. Sangue foi coletado por punção cardíaca três semanas depois da terceira dose.

Os soros foram separados por centrifugação e armazenados congelados a 70°0 até uso.

Absorção de anticorpos anti-GNA1870. Para testar a contribui15 ção de anticorpos anti-GNA1870 para a atividade funcional dos anticorpos, reuniões de soro foram absorvidas para remover anticorpos anti-GNAl870.

Em resumo, 100 pL de reuniões de soro diluídas 1:2 em tampão de PBS contendo 10mM de imidazol foram adicionados a uma coluna que continha 250 pL de Ni-NTA Sefarose (Qiagen, Valencia, CA) que havia sido comple20 xado com 200 pg de proteína com marcador His de GNA1870 recombinante ou, como controle negativo, proteína com marcador His de NadA (Comanducci e outros. J Exp Med 2002;195;1445-54; Hou e outros. 2005, supra). As colunas foram incubadas durante à noite a 4°C. e lavadas com 500 pL de tampão de PBS contendo 10mM de imidazol. Cinco frações (100 pL cada) 25 que passaram através da coluna foram combinadas e concentradas para os volumes de soro de 50 pL por filtração em membrana (Microcon YM-10, 10.000 MWCO, Millipore Corp., Bedford, MA). Com base em ELISA, mais que 98-99% dos anticorpos anti-GNA1870 foram removidos pela coluna de GNA1870.

Anti-corpo anti-GNA1870. ELISA foi usado para medir títulos de anticorpos de soro para GNA1870, que foi realizado como previamente descrito (Welsch e outros., J Immunol 2004;172:5606-1). O antígeno de fase sólida consistia em proteínas de v.1 ou de v.2 de rGNA1870. O anticorpo secundário foi uma diluição de 1:2000 de IgM+G+A de anticamundongo de coelho conjugado com fosfatas© alcalina (Zymed). O título do soro foi definido como a diluição dando OD405 de 0,5 depois de uma incubação de 30 mi 5 nutos com substrato.

Atividade dos anticorpos bactericidas mediada por complemente. O ensaio bactericida foi realizado como previamente descrito (Moe e outros., 2002, supra) usando-se bactérias na fase mid-log crescidas em caldo de Mueller Hinton com 0.25% de glicose. A mistura reacional final continha dife10 rentes diluições de soros de teste, 20% (v/v) de complemento humano, e tampão de Gey contendo 1% de BSA. A fonte do complemento era soro humano de um adulto saudável com atividade bactericida intrínseca não detec tável (Granoff e outros. J Immunol 1998;160:6028-36; Welsch e outros., 2003, supra). Títulos bactericidas séricos foram definidos como a diluição de soro resultando em um decréscimo de 50% em CFU por mL depois de 60 minutos de incubação de bactérias na mistura reacional, em comparação com CFU de controle por mL no tempo zero. Tipicamente, as bactérias incubadas com anticorpo de controle negativo e complemento mostraram um aumento de 150 a 200% de CFU/mL durante os 60 minutos de incubação.

Ligação dos anticorpos à superfície de /V. meningitidis encapsulada viva. A capacidade dos anticorpos anti-GNA1870 de se ligarem à superfície de N. meningitidis viva foi determinada por detecção por citometria de fluxo de ensaio de fluorescência indireta, realizada como descrita anteriormente (Granoff e outros., J Immunol 2001;167:3487-3496). Controles positivos incluíram anticorpos monoclonais específicos de camundongo para a cápsula de polissacarídeo do grupo C (1076.1 (Garcia-Ojeda e outros., Infect Immun 2000;68:239-46)), PorA P1.2 (Granoff e outros., J Immunol 2001;167:3487-3496), e variante 1 de GNA1870 (JAR3)(Welsch e outros., J Immunol 2004;172:5606-15) e uma diluição de 1:300 de IgG (H+L) de (Fab’)2 anticamundongo de bode conjugado ao FITC (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA).

Ativação de deposição de complemento humano na superfície de meningococos encapsulados. Deposição dependente de anticorpo antiGNA1870 de C3b ou iC3b na superfície bacteriana de bactérias de M meningiditis vivas foi determinada por citometria de fluxo, realizada conforme descrição anterior (Weslch e outros., J Infect Dis 2003;188:1730-40). As bac5 térias em log-fase, lavadas, foram incubadas em uma mistura reacíonal contendo 5% (v/v) de complemento humano e diluições apropriadas de soro em tampão de Veranol. A deposição do complemento foi detectada com complemento C3c anti-humano de carneiro conjugado ao FITC (BioDesign Intl., Saco, ME), que reage com ambos os C3b e iC3b. A fonte do complemento 10 foi o mesmo soro humano descrito acima para o ensaio bactericida.

Proteção passiva em ratos jovens. A capacidade do anti-soro de conferir proteção passiva contra a bacteriemia no grupo B de N. meningitidis foi testada em ratos jovens desafiados i.p. com cepa NZ98/254 do grupo B de Welsch e outros., 2003, supra: Moe e e outros. Infect Immun 15 199:67:5664-75; Moe e outros. Infect Immun 2001;69:3762-71). Em resumo, filhotes de 4 dias de idade de ninhadas provenientes de cruzamento de ratos Wistar (Charles River, Hollister, CA) foram aleatoriamente redistribuídos para os alimentadores maternos. No tempo zero, grupos de oito animais foram administrados com anti-soros ou anticorpos, i.p., que haviam sido diluídos 20 em PBS contendo 15% de BSA. Duas horas mais tarde, os animais foram desafiados i.p. com cerca de 6 x 10⁴ CFU de bactérias em log-fase, lavadas, crescidas em Mueller-Hinton suplementados com 0,25% de glicose e 10 μΜ de CMP-ΝΑΝΑ (Sigma, St. Louis, MO). De quatro a seis horas depois do desafio bacteriano, espécimes de sangue foram obtidos por punção cardíaca 25 e alíquotas de 1, 10 e 100 pL de sangue foram semeados sobre agar de chocolate para checagem CFU/mL.

EXEMPLO 1: ACESSABILIDADE À SUPERFÍCIE DE GNA1870 SOBRE CEPA DE M meningitidis RM1090.

Para determinar se a proteína GNA180 expressa pela cepa 30 RM1090 transformadas com pFP12-GNA1870 é parte integral da membrana externa e exposta na superfície da célula, e para determinar se GNA1870 superexpressa na cepa H44/76 está ancorada e acessível à superfície na membrana externa, ligação de anti-GNA1870 e anticorpos de contrate às células bacterianas encapsuladas vivas foram medidas por citometría de fluxo (Figura 1).

Como mostrado na Figura 1A, mAbs de controle positivo especí5 fico para polissacarídeo capsular do grupo C (coluna 2) ou PorA (anti-P1.2, coluna 3) mostrou forte ligação para a cepa RM1090 parente (fileira B) e para as duas cepas mutantes de RM1090: um nocaute de GNA1870 transfor_a»**»Sí_s,

III!

mado com o vetor lançador sem o gene de GNA1870 (fileira A), e o nocaute transformado com o vetor lançador que codifica a proteína de variante 1 de GNA1870 (fileira C). Com todas as três cepas não houve ligação significante com uma diluição de 1:10 de uma reunião de soro de controle negativo de camundongos imunizados com fosfato de alumínio sozinho (coluna 1). Também não houve ligação significante de anticorpos monoclonais ou policlonais anti-GNA1870 com a cepa de nocaute de GNA1870 (Fileira A, colunas 5 e 6, respectivamente). A cepa RM1090 do tipo selvagem, que naturalmente expressa baixos níveis de uma proteína de v.2 de GNA1870, não tinha ligação detectável com um mAb anti-GNAl870 específico para proteína de v.1 (Fileira B, coluna 4), e mostrou ligação mínima acima do residual com um antísoro de camundongo policlonal (colunas 5 e 6) preparado contra proteínas de GNA1870 de v.1,2e 3, recombinantes (vide abaixo). Em contraste, a cepa transformada com o vetor lançador que codifica GNA1870 (variante 1) mostrou forte ligação com ambos os anticorpos anti-GNA1870 policlonais e monoclonais. Assim, GNA1870 é exposta na superfície da cepa RM1090 transformada com o vetor lançador de pFP12-GNA1870.

Como mostrado na Figura 1B, os anticorpos anticapsulares de controle positivo e monoclonais anti-PorA (P1.16) ligados à cepa H44/76 do tipo selvagem e a um mutante da cepa H44/76 que superexpressa GNA1870 (ambos mostrados nas fileira 1). Os anticorpos de controle positivo também se ligaram a AGNA1870 de H44/76 (mostrados na fileira 2). Como esperado, não houve ligação dos anticorpos monoclonais ou policlonais anti-GNA1870 à cepa mutante de H44/76 na qual o gene codificado de GNA1870 foi inativado (colunas D a F). A incubação da cepa com os anticorpos anti-GNA1870 mostrou boa ligação, um resultado que refletiu o nível relativamente alto da expressão de GNA1870 natural na cepa H44/76. Houve um modesto aumento da ligação à cepa mutante que havia sido engenheirada para superexpressar GNA1870, como evidenciado por um pequeno deslocamento para a direita da imunofluorescência. Assim, a superexpressão de GNA1870 resultou em um pequeno aumento da quantidade da proteína na membrana ex10 terna, e a proteína é exposta à superfície.

EXEMPLO 2. ANÁLISE DA VACINA DE OMV

As principais proteínas nas preparações de OMV da cepa

RM1090 e dos respectivos mutantes foram separadas por SDS-PAGE e visualizadas por coloração de Azul de Coomasie (Figura 2A. Painel A). Como é típico de OMV preparada de N. meningitidis, houve um número limitado de proteínas principais resolvendo com as massas aparentes entre 29kDa (Opa/Opc) e 43 kDa (PorA). A OMV preparada da cepa do tipo selvagem (faixa 15 1) e cepa de nocaute de GNA1879 (faixa 3) expressaram quantidades respectivas similares de cada uma dessas proteínas. Em contraste, OMV das cepas transformadas com o vetor lançador de pFP12 que não continha o gene codificador de GNA1870 (faixas 2 e 4, respectivamente) mostrou expressão relativa diminuída de três proteínas migrando com massas aparentes entre 38 e 43 kDa. Esse resultado reflete, provavelmente, em parte, a expressão reduzida das proteínas porina por seleção com antibiótico a partir da presença de 5 pg/mL de cloranfenicol nos meios de crescimento (Tommassen e outros., Infect Immun 1990;58:1355-9). A faixa 5 mostra a OMV preparada da cepa RM1090 transformada com o vetor lançador que codifica 25 GNA1870. Para mais bem visualizar as proteínas, essa faixa foi carregada com duas vezes mais proteína (cerca de 10 pg) que as faixas 1 a 4. Em comparação com as outras preparações de OMV, a OMV preparada da cepa transformada com o vetor lançador contendo o gene de GNA1870 mostrou expressão reduzida de proteínas resolvendo entre 29 e 32 kDa. Por SDS30 PAGE, GNA1870 não é prontamente aparente em qualquer uma das preparações de OMV incluindo a OMV preparada da cepa que superexpressa GNA1870 (FAIXA 5). (Para comparação, 1 pg da proteína de variante de

GNA1870 recombinante é mostrada na Faixa 6).

Na Figura 2A, Western Blot com um anti-soro de camundongo policlonal produzido contra proteínas recombinantes GNA1870 de v.1, 2 e 3 foi usado para avaliar a expressão de GNA1870 nas diferentes preparações 5 de vacina. Como mostrado no Painel B, o anti-soro foi ligeiramente mais reativo com a proteína de v.2 de rGNA1870 que a proteína recombinante de v.1. Mesmo com essa tendência, a OMV preparada de RM1090 transformada com pFP12-GNAl870 mostrou reatividade aumentada por Western blot em comparação com a OMV preparada da cepa RM1090 do tipo selvagem que 10 expressa naturalmente uma proteína de v.2 (Figura 2A, Painel C). Em contraste, a OMV de controle negativo do mutante de nocaute de GN1870 (AGNA1870 de RM1090) não apresentou reatividade detectável. Os resultados de medição de densitometria indicaram que a expressão da proteína de GNA1870 de v.1 na cepa transformada com o vetor lançador era aproxima15 damente 10 vezes maior que a da proteína de v.2 expressa naturalmente pela cepa RM1090 parente do tipo selvagem.

A preparações de OMV de H44/176 foram analisadas por Western blot usando anti-soro policlonal para GNA1870 (Figura 2B). A quantidade de OMV carregada no gel foi padronizada com base no teor total de pro20 teína das preparações. Como esperado, GNA1870 foi expressa nas preparações de membrana a partir da cepa do tipo selvagem e foi aumentada na preparação correspondente a partir do mutante engenheirado para superexpressar essa proteína. Contudo, o aumento de GNA1870 foi modesto (aproximadamente de três vezes).

EXEMPLO 3: ANÁLISE DE RESPOSTAS DE ANTICORPO SÉRICO

A Tabela 2 e a Figura 5 sumarizam as respostas de antiGNA1870 sérico dos diferentes grupos de camundongos conforme medidas por ELISA. As maiores respostas à proteína de variante 1 na Tabela 2 foram em camundongos imunizados com vacina de v.1 de GNA1870 recombinante 30 dada como uma mistura com uma vacina de OMV (títulos contra a proteína de variante 1 de 1:120.000 e 1:300.000, respectivamente). Os camundongos imunizados com OMV preparada da cepa RM1090 que superexpressa

GNA1870 de variante 1 tinham de 4 a 10 vezes menor que o título de antiGNA1870 (1:32.000). De interesse, camundongos imunizados com OMV preparada da cepa RM1090 do tipo selvagem tinham respostas de anticorpos anti-GNA1870 não detectáveis e desprezíveis conforme medição contra cada uma das proteínas de variante 1 ou 2. Esse resultado sugere que na ausência de superexpressão, GNA1870 em OMV da cepa tipo selvagem é fracamente imunogênica.

Grupos de camundongos foram imunizados com OMV de H44/76 (1,25 pg de proteína total) ou 5 pg de rGNA1870 dados com fosfato de alumínio. Amostras de soro foram obtidas 3 semanas depois da terceira dose e reunidas (2 reuniões por grupo de vacina, cada reunião preparada de 4 a 5 camundongos). Como mostrado na Figura 5, camundongos de controle imunizados com o adjuvante de alumínio sozinho não tinha anticorpo antiGNA1870 detectável (GMT <1:10, barra 1), enquanto camundongos imunizados com rGNA1870 mostraram as maiores respostas (GMT 1:23.500, barra 2). Camundongos imunizados com OMV preparada de H44/76 que superexpressou GNA1870 tinham -10 vezes mais respostas de anticorpos antiGNA1870 que o respectivo grupo imunizado com OMV da cepa do tipo selvagem (compare barras 5 e 3). Camundongos imunizados com OMV preparada de ÁGNA1870 de H44/76 tinham respostas de anticorpos desprezíveis (GMT <1:10, barra 4).

----——--— Tabela 2. Respostas de anticorpos anti-GNAl870 de camundongos confor-
me medidas por ELISA
	1/Título do Anticorpo¹³
	rGNA1870	rGNA1870 Variante 2
Vacina^a	Variante 1
AI₂(PO₄)3 sozinho	<50	<50
rGNA1870(v.1)	120.000	3.200
rGNA1870 (v.2)	NO	1.600.000
RM1090 0MV
Tipo selvagem	55	<50
âGNA1870	<50	<50

Tabela 2. Respostas de anticorpos anti-GNA1870 de camundongos conforme medidas por ELISA
Super-expressão GNA1870 AGNA1870+ rGNA1870 v.1	32.000 300.000	1.200 4.000
⁸ As vacinas consistiram em 5 pg de proteína total absorvida com AI₂(PO₄)3. A OMV + vacina de rGNA1870 consistiram em uma mistura de 2,5 pg de OMV e 2,5 pg de rGNAI 870 (v.1). ^bDiluiçâo de soro em ELISA dando OD de 0,5 depois de 30 minutos de incubação com substrato. Os dados mostrados são as respectivas médias geométrica de títulos medidos em 2 reuniões de soro provenientes de cada grupo de vacina. Cada reunião continha volumes iguais de soros a partir de 4 a 5 camundongos imunizados.

A Figura 3A resume as respostas de anticorpos bactericidas séricas dos diferentes grupos de camundongos conforme medidas contra quatro das cepas de teste. Camundongos imunizados com a vacina de proteína 5 GNA1870 recombinante sozinha, ou com a vacina de GNA1870 recombinante em combinação com uma vacina de OMV, ou com OMV que superexpressa GNA1870 desenvolveram altos títulos bactericidas contra a cepa Cu385 que não foram significantemente diferentes uns dos outros (compare as barras 4, 5 e 6 do painel superior). Em contraste, não houve atividade 10 bactericida detectável contra a cepa Cu385 em soros de camundongos de controle imunizados com vacinas de OMC preparadas das cepas RM1090 do tipo selvagem ou de nocaute de GNA1870 (barras 2 e 3, respectivamente; títulos <1:10). Note que a cepa Cu385 expressa a proteína de v.1 de GNA1870 canônica (seqüência de aminoácidos idêntica àquela da cepa 15 MC58, o gene usado para expressar a proteína GNA1870 recombinante), e foi constatado em nosso estudo anterior como sendo altamente suscetível de atividade bactericida do anticorpo elicitada em camundongos pela vacina de GNA1870 recombinante (Tabela 1). Também, Cu385 tem um sorosubtipo de PorA heterólogo (pl. 19,15) àquele da cepa RM1090 (P1.5,2) da vacina, e, portanto, esperou-se que a cepa Cu385 fosse resistente à atividade bactericida de anticorpos produzidos contra a vacina de controle de OMV que não superexpressou a variante 1 de GNA1870 (Tappero e outros., JAMA 1999;

281:1520-7; Moe e outros., 2002, supra).

A Figura 3A mostra também os títulos de soro correspondentes medidos contra a cepa M6190 (segundo painel a partir do alto) que expressa uma subvariante da proteína de GNA1870 de v.1 em comparação com aquela da cepa de vacina engenheirada. Não houve atividade bactericida detec10 tável nos soros dos camundongos imunizados com a proteína de variante 1 de GNA1870 recombinante (barra 6, título médio geométrico <1:10), um resultado idêntico àquele de nosso estudo prévio (Tabela 1). Contudo, devido ao fato do sorosubtipo de PorA (P1.5,2) da cepa M6190 ser homólogo àquele da cepa RM1090 da vacina, os soros dos camundongos imunizados com 15 qualquer uma das vacinas contendo OMV eram altamente bactericidas (barras 2, 3, 4 ou 5).

A Figura 3A (terceiro e quarto painéis a partir do alto) mostram as respostas bactericidas correspondentes contra as cepas Z1092 e NZ98/254, respectivamente. Ambas as cepas expressam as moléculas de 20 PorA que são heterólogas àquela da cepa RM1090 da vacina (Tabela 1), e não foram destruídas pelos soros de camundongos imunizados com vacinas de OMC preparadas das cepas tipo selvagem RM1090 ou nocaute de GNA1870B (barras 2 e 3, títulos médios geométricos <1:10). Contudo, os camundongos imunizados com vacina de OMV preparada da cepa RM1090 25 que superexpressou GNA1870 (barra 5) tinham um título de anticorpo bactericida, médio, geométrico, mais alto contra a cepa Z1092 que aquele de camundongos imunizados com GNA1870 recombinante (barra 6, P<0,02), ou com uma mistura da proteína de GNA1870 recombinante e vacina de OMV (barra 4, P<0,04). Tendências similares foram observadas nas respostas 30 bactericidas recombinantes do soro, respectivas, medidas contra a cepa NZ98/254 (painel do fundo), ou contra as cepas BZ198 e M1390 (dados não mostrados). Contudo, para essas três últimas cepas, a magnitude das res postas bactericidas séricas dos camundongos imunizados com a vacina de

OMC com GNA1870 superexpressado foi menor que aquelas medidas com a cepa Z1092. Também, os títulos bactericidas de soro de média geométrica contra as cepas NZ98/294, BZ198 e M1390 dos camundongos imunizados com OMV que superexpressaram GNA1870 não foram significante e estatisticamente diferentes em comparação com os títulos médios geométricos respectivos dos camundongos nos outros grupos de vacina (P>0,10).

A Figura 3B sumariza as respostas de anticorpos bactericidas no soro contra seis cepas, incluindo H44/76, que foram usadas para preparar a vacina de OMV. Cindo das seis cepas têm sorosubtipos de PorA heterólogos àquele de H44/76. A cepa H44/76 também expressa uma seqüência de proteínas de variante 1 de GNA1870 idêntica àquela da cepa MC58, que contém o gene usado para clonar e expressar a vacina de proteína de GNA1870 recombinante. Todas as preparações de vacina, exceto o adjuvant© de alu15 mínío de controle negativo, ©licitaram altas respostas de anticorpo bactericida sérico quando medidas contra a cepa H44/76 da vacina (Figura 3B, Painel A). Em contraste, quando medidos contra cepas heterólogas 4243 (Painel B), Z1092, NZ98/254, e BZ198 (Painel C), ou M6190 (Painel D), os soros de camundongos imunizados com a vacina de rGNA1870, ou com as vací20 nas de OMC preparadas a partir das cepas do tipo selvagem H44/76 ou

AGNA1870 de H44/76, tinham baixos ou não detectáveis títulos bactericidas (barras 2, 3, e 4, respectivamente). Os camundongos imunizados com a vacina de OMV com GNA1870 superexpressado (barra 5) tinha altas respostas de anticorpos bactericidas contra a cepa 4243, mas baixas respostas bacte25 ricidas detectáveis contra as cepas NZ98/254, BZ198, e Z1092, e atividade não detectável contra M6190 (título <1:10). Embora não mostradas na Figura 3B, todas as cepas foram prontamente destruídas pelo complemento juntamente com os anticorpos de controle positivo para as respectivas cápsulas de PorA e/ou de polissacarídeo.

EXEMPLO 4: ATIVAÇÃO DE DEPOSIÇÃO DE COMPLEMENTO C3B SOBRE A SUPERFÍCIE DE CÉLULAS DE A/, meningiditis ENCAPSULADAS WAS

Em estudos anteriores, verificou-se que certos anticorpos anti5 meningocóccicos de camundongo que careciam de atividade bactericida conferiam proteção passiva contra bacteriemia meningocóccica em ausência de atividade bactericida (Welsch e outros. J. Immunol 2004;172:5606-15; Welsch e outros. 2003, supra). Proteção correlacionada com a capacidade dos anticorpos de ativarem a deposição de componentes do complemento 10 C3 na superfície de meningococos encapsulados vivos como medidos por citometria de fluxo. A presença de C3b proporciona um ligante para opsonização, que é o mecanismo mais provável de conferir proteção em ausência da atividade bacteriana. Portanto, foi investigada a capacidade dos antisoros de camundongos imunizados com diferentes vacinas de OMV de ati15 varem a deposição de C3b humano (Figura 4). Duas cepas de teste N. meningitidis de teste, NZ98/254 (Figura 4A, fileira A) e M1390 (Figura 4A, fileira B) e quatro cepas de N. meningitidis de teste, NZ98/254, BZ198, Z1092, e M6190 (Figura 4B) foram usadas para esses experimentos. Essas cepas foram para as quais os anti-soros de camundongos imunizados com a vaci20 na de OMC que superexpressaram GNA1870 nâo mostraram títulos estatisticamente significantemente mais altos que os outros grupos de vacinas.

Não houve evidência de deposição de complemento quando as células bacterianas de cada cepa de teste foram incubadas com a fonte de complemento humano juntamente com uma diluição 1:40 de um soro de 25 uma reunião de soro de controle negativo de camundongos imunizados com somente fosfato de alumínio (áreas cheias dos painéis na Figura 4A, coluna 1). Similarmente, nâo havia deposição de C3b detectável com complemento ativado por calor mais 5 pg/mL de um anticorpo monoclonal de camundongo para GNA1870 (JAR3) (áreas cheias dos painéis na Figura 4A, coluna 2). 30 Em contraste, a adição do complemento ativo a 25 pg/mL de um anticorpo anticapsular monoclonal do grupo B de controle positivo (áreas abertas de painéis na Figura 4A, coluna 1), ou 1 pg/mL de um anticorpo monoclonal anti-GNA1870 (áreas abertas de painéis na Figura 4A, coluna 2), elícitou forte deposição de C3b sobre a superfície bacteriana de ambas as cepas de teste, como evidenciado por aumento das percentagens mostrando forte imunofluorescência com anticorpo anti-C3c, que reconhece tanto o C3b co5 mo iC3bi.

Os painéis nas colunas 3 a 6 da Figura 4A mostram o efeito de adicionar complemento às diluições de reuniões de soro obtidos dos grupos de camundongos imunizados com as diferentes vacinas. A adição de complemento a uma diluição de 1:100 de soro de camundongos com GNA1870 10 recombinante (coluna 3), ou OMV preparada da cepa do tipo selvagem RM1090 (coluna 4), ou OMV misturada com GNA1870 recombinante (coluna 5), nâo ativou a deposição de C3b em cada cepa de teste. Em contraste, diluições de 1:100 ou 1:400 de uma reunião de soro de camundongos imunizados com OMV preparada de cepa RM1090 que superexpressou GNA1870 15 ativou forte deposição de C3b contra ambas as cepas de teste (coluna 6).

Como mostrado na Figura 4B, mAbs anticapsular de controle positivo elícitou a deposição do complemento em cada uma das cepas (áreas abertas na Coluna A), enquanto uma diluição 1:100 se o anti-soro de controle negativo de camundongos imunizados com o adjuvante de alumínio 20 sozinho fosse negativo (áreas cheias na coluna A). Uma diluição de 1:100 de soros de camundongos imunizados com a vacina de rGNA 1870 (áreas cheias na coluna B), ou vacina de OMV de H44/76 preparada da cepa do tipo selvagem (áreas cheias na coluna C), também não elícitou sígnificante deposição de complemento sobre quaisquer das cepas. Em contraste, um 25 mAb anti-rGNA1870 elícitou a deposição de complemento sobre as cepas NZ98/254, BZ198, e Z1092, mas não sobre a cepa M6190 (áreas abertas na coluna B). Similarmente, uma diluição de 1:100 de anti-soro de camundongos imunizados com a vacina H44/76 com GNA1870 superexpressada ativou a deposição de C3 para as cepas Z1092, NZ98/54, e BZ198 (áreas a30 bertas na coluna D), mas não para a cepa M6190.

EXEMPLO 5. DEFINIÇÃO DO ALVO ANTIGÉNICO DE ANTICORPOS QUE SÃO BACTERIRICADAS OU ATIVAM A DEPOSIÇÃO DE C3b NAS CEPAS

HETERÓLOGAS

Uma coluna de afinidade Ni-NTA carregada com GNA1870 recombinante marcado com His foi usada para absorver anticorpos antiGNA1870 de uma reunião de soro preparada de camundongos imunizados 5 com OMV de H44/76 com GNA1780 superexpresso. Como mostrado na Tabela 3, por ELISA, 98% dos anticorpos anti-GNA1870 foram removidos por essa coluna em comparação com aquela de soro absorvida com uma coluna de controle negativo contendo somente a matriz de Ni-NTA. Depois da absorção na coluna de controle negativo, a atividade bactericida contra a cepa 10 4243 era similar àquela da reunião de soro nâo absorvida original, enquanto a absorção dos anticorpos anti-GNA1870 resultou em perda completa da atividade bactericida.

O efeito da absorção de anticorpos anti-GNA1870 na deposição de C3 foi analisado contra as cepas Z1092, NZ98/254, BZ198, e M6190 (Ta15 bela 3 e Figura 4B, Fileira 4). Como mostrado na Figura 4B, coluna D, a remoção dos anticorpos anti-GNA1870 dos soros de camundongos imunizados com OMV de H44/76 com GNA1870 superexpressa resultou em completa perda da capacidade dos anti-soros de ativarem a deposição de complemento nas três cepas suscetíveis de ativação e deposição de iC3b/C3b (á20 reas cheias da Figura 4B). Esses resultados, bem como os dados bactericides nos soros absorvidos resumidos acima indicam que para as cepas com proteínas PorA heterólogas àquelas da cepa H44/76 da vacina, ativação da deposição C3 e atividade bactericida de anti-soros preparados contra OMV de H44/76 contendo GNA1870 superexpressa são mediadas por anticorpos 25 antí-GNAI 870.

Tabela 3: Atividade dos soros de camundongos imunizados com OMV com GNA1870 superexpressada após absorção de anticorpos antiGNA1870,

1/título de anticorpo

Ensaio, Cepa	Soro não absorvido	Soro absorvido com coluna de controle negativo	Soro absorvido com coluna de rGNA1870
Anti-GNA1870 ELISA Bactericida	14000	8300	138
4243	50	45	<10
Deposição do complemento C3
NZ98/294	>100	>100	<25
BZ198	>100	>100	<25
Z1092	>100	>100	<25

Uma reunião preparada de soros de camundongos imunizados com OMV de H44/76 com GNA1870 superexpressa foi absorvida em uma coluna contendo uma matriz de Ni-NTA (Qiagen) que havia sido incubada 5 durante à noite com 50 pg/mL de GNA1870 marcado com His recombinante.

O fluxo todo foi coletado, e concentrado, para o volume original. A coluna de controle continha matriz de Ni-NTA sem a proteína marcada com His.

. EXEMPLO 6. PAPEL DO ANTICORPO ANTI-GRNA1870 NA

ATIVIDADE FUNCIONAL.

A vacina de OMC preparada da cepa de N. meningitis que é engenheirada para superexpressar GNA1870 mostrou expressão diminuída de várias outras proteínas envelope celular em comparação com as respectivas proteínas na OMV preparada da cepa de RM1090 de vacina do tipo selvagem, ou a cepa de nocaute AGNA1870 de RM1090 (Figura 2A, Painel A).

Portanto, foi possível que a atividade funcional mais alta dos anti-soros de camundongos imunizados com OMV que superexpressou GNA1870 resultasse de anticorpos elicitados por antígenos que não GNA1870. Para investigar essa possibilidade, uma reunião de soro de camundongos imunizados com OMV de RM1090 que superexpressam GNA1870 foi absorvida usando20 se uma coluna de atividade anti-GNA1870. Por ELISA, 99% dos anticorpos anti-GNA1870 foram removidos. O anticorpo absorvido resultante perdeu

também toda a capacidade de ativa a deposição de C3b humano na cepa de M meningitidis NZ98/294 (Tabela 4). Em contraste, não houve efeito na deposição de C3b por absorção da reunião de soro em uma coluna de afinidade de anti-NadA, que serviu como um controle negativo (Tabela 4).

Tabela 4. Atividade funcional de anti-soro a partir de camundongo imunizado com OMV que superexpressa GNA1870 depois da depleção de anticorpos anti-GNA1870^a
		1/Título de Anticorpo
Ensaio	Soro não absorvido	Sore Absorvido com G NA 1870	Soro Absorvido com NadA
Anti-GNA187 ELI- SA	40.000	400	30.000
Deposição de complemento C3b (citometria de fluxor	>400	<25	>400
Atividade Bactericida Cepa Cu385 Cepa M6190	r-o i 8	<10 600	3000 600
^aUma reunião de soro foi preparada a partir de cinco camundongos imunizados com a vacina de OMV a partir de cepa RM109 engenheirada para superexpressar GNA1870. 0 anti-soro foi absorvido em uma coluna de afinidade DE GNA1870 recombinante, ou como, controle negativo, uma coluna de afinidade contendo NadA recombinante (Vide métodos). As frações atravessantes foram combinadas e concentradas para seu volume original de soro por filtração em membrana (vide métodos). ^bDiluição de soro o ensaio de ativação de complemente citométrico de fluxo que elicitou um aumento de dez vezes da imunofluorescência em comparação com soro de controle negativo (Vide Figura 4).

A Tabela 4 também sumariza os títulos bactericidas das coleções de soro absorvidas como medidos contra as cepas Cu385 e M6190.

Absorção dos anticorpos anti-GNA1870 removeu completamente a atividade bactericida contra Cu385, mas não apresentou efeito significante no título contra a cepa M6190. Esse último resultado era esperado já que a cepa 10 M6190 expressa PorA com sorosubtipo homólogo à PorA expressa pela cepa RM1090 de vacina e os anticorpos anti-PorA bactericidas não seriam removidos pelas colunas de afinidade de GNA1870 ou de NadA.

EXEMPLO 8: PROTEÇÃO PASSIVA NO MODELO DE BACTERIEMIA MENINGOCÓCCICA DE RATO JOVEM.

Ratos jovens foram pré-tratados com coleções de soro de diferentes grupos de camundongos e desafiados 2 horas mais tarde com cepa de N. meningitidis NZ98/254. A Figura 6 mostra a média geométrica de CFU/mL no sangue obtida 4 a 6 horas após o desafio. Todos os 10 ratos tratados com uma diluição 1:15 da reunião de soro de camundongos de controle negativo imunizados com apenas fosfato de alumínio tiveram bacteriemia com· uma média geométrica de CFU/mL de ~10^δ (Painel A, barra 1). Em contraste, o pré-tratamento com 10 pg/rato de um grupo B de anticorpo anticapsular do grupo B de controle positivo (barra 2) ou um anticorpo mono clonal anti-GNSl870 (barra 3) resultou em uma média geométrica de CFU/mL de 3 a 4 log inferiores (P<0,001). Em comparação com os animais tratados com o soro de controle negativo, nâo houve atividade protetora passiva significante por coleções de soro de camundongos imunizados com a vacina de OMV preparada da cepa nocaute de AGNA1870 de RM1090 (barra 4), ou a vacina de OMV misturada com GNA1870 (barra 5). Em contraste, a reunião de soro de camundongos imunizados com a vacina de OMV que superexpressou GNA1870 (barra 6) conferiu proteção (decréscimo de 4 log na média geométrica de CFU/mL, p<0,0001). A reunião de soro de camundongos imunizados com apenas a vacina de GNA1870 recombinante (barra 7) conferiu modesta proteção (decréscimo de -2 log, P<0,0001), mas a atividade protetora foi menor que aquela da reunião de soro dos camundongos imunizados com OMV que superexpressou GNA1870 (P<0,0001, em comparação com a média geométrica respectiva da CFU/mL).

A Figura 6, Painel B mostra a média geométrica correspondente de CFU/mL de ratos pré-tratados com diluições de 1:60 das coleções de soro. Nessa diluição maior, a reunião de soro dos camundongos imunizados com a vacina de OMV que superexpressou GNA1870 (barra 6) conferiu proteção (P<0,003 em comparação com a média geométrica dos ratos tratados com uma diluição 1:15 do soro de controle negativo), mas não houve atividade protetora significante pela diluição maior das coleções de soro dos ca ‘tt mundongos imunizados com qualquer um dos outros 3 grupos de vacina testados, inclusive o soro de camundongos que receberam vacina de

GNA1870 recombinante (barra 7, P>0,10).

EXEMPLO 9. IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS COM UMA VACINA DE

VESÍCULA PREPARADA DA CEPA RM1090 QUE SUPEREXPRESSA PROTEÍNA A DE SUPERFÍCIE NEISSERIAL (NspA) NÃO ESTÁ ASSOCIADA À RESPOSTA DE ANTICORPO BACTERICIDA DE SORO INTENSE ’ FICADA

Era de interesse determinar se a proteção intensificada induzida pela vacina de vesícula preparada da cepa RM1090 engenheirada para superexpressar GNA1870 era específica para GNA1870, ou também ocorrería com vacinas de vesícula preparadas de cepas engenheiradas para superexpressar um outro alvo da vacina. Portanto, uma vacina de microvesículas foi preparada de cepa RM1090 em que o gene para NspA na cepa do tipo sel15 vagem havia sido inativado. Uma segunda vacina de vesículas foi preparada da cepa nocaute de NspA de RM1090 transformada com o vetor lançador pFP12 contendo o gene NspA da cepa 8047. Por SDS PAGE, as vesículas resultantes da cepa transformada com o vetor lançador continham expressão aumentada de 10 vezes da proteína NspA em comparação a cepa

RM1090 do tipo selvagem -(dados não mostrados).

Os grupos de camundongos foram imunizados com 3 doses das vacinas de vesícula fornecidas com fosfato de alumínio, e o soro foi coletado semanas após a última imunização. A que superexpressa NspA elicitou altos títulos de anticorpo de anti-Nspa conforme medidos por ELISA (1:19.000 em comparação com um título de 1:700 em camundongos imunizados com a vacina de vesícula preparada da cepa nocaute NspA, e um título de <1:50 de camundongos imunizados com apenas fosfato de alumínio). A Tabela 5 resume as respostas de anticorpo bactericida do soro conforme medida contra quatro cepas de teste, BZ198, NZ98/254, Cu385 e Z1090.

Tabela 5. Imunização de camundongos com vacinas de vesícula preparadas de uma cepa mutante de RM1090 geneticamente engenheirada para superexpressar Proteína A de Superfície Neisserial (NspA)
Cepa de N. meningitidis	Tipo de qüência (Poráa	Se-^; VR	MAb Anticapsular (BC₆„)^bpg/mL	Camundongos de Controle Negativo imunizados com fosfato de alumínio (1/Título)⁰	Camundongos imunizados com vesículas de cepa de N. meningitidis RM 1090^a
Superexpressa NspA^d (1/Título)^c	Nocaute NspA (1/TítutóF
BZ198	(7,4)		<6	<1:10	1:16	1:4
NZ98/254	(7-2,4)		8	<1:10	<1:4	<1:4
Cu385	(19,15)		10	<1:10	<:4	1:12
Z1092	(5-2,10)		<1	<1:10	1:12	1:250

^a Microvesículas foram preparadas conforme descrição de Moe e outros (Infection /mnwn/ty 2002:70:6021-6031) de nocaute de NspA, a cepa de nocaute transformada com um vetor lançadro pFP12 contendo o gene NsPA da cepa 8047. Camundongos foram imunizados com três injeções e sangrados depois de ~3 semanas depois da última injeção. Os títulos mostrados do soro reunido de 9 a 10 camundongos em cada grupo de vacina. Ao títulos de anticorpos anti-NspA conforme medidos por ELISA foram <1:50 (grupo de fosfato de alumínio), 1:700 (vesículas de cepa nocaute de NspA RM1090)e 1:19.000 (vesículas de cepa RM1090 que superexpressa NspA).

^b Concentração mais baixa que rende 50% da destruição de bactérias depois de 1 hora de incubação com complemento humano.

^c Maior diluição de soro que rende 50% de destruição de bactérias depois de 1 hora de incubação com complemento humano ^d Expresso no fundo nocaute de NspA

Todas as quatro cepas expressaram PorA heteróloga em comparação com da cepa RM109 de vacina. Com a cepa BZ198, que foi selecionada para teste de atividade bactericida nesse experimento com base nos dados anteriores mostrando alta suscetibilidade à atividade bactericida de anti-soros anti-NspA preparados contra NspA recombinante expressada em vesículas E. coli (Moe e outros., Infection and Immnunity 1999;67:56645675), houve evidência de atividade bactericida aumentada no anti-soro de camundongos imunizados com a vacina de vesícula derivada da cepa que superexpressa NspA. Contudo, contra a cepa NZ98/254 não houve aumento da atividade bactericida, e para as cepas Cu385 e Z190 não houve evidência de que a imunização com uma vacina de vesícula que superexpressou NspA induziu de 3 a 10 vezes menos respostas de anticorpos bactericidas que aquelas induzidas por uma vacina de vesícula de controle preparada da cepa de nocaute de NspA. Assim, em contraste com as vacinas de vesícula que superexpressam GNA1870, uma vacina de vesícula que superexpressa NspA não proporcionaram consistentemente respostas de anticorpos bactericidas intensificada, e parece haver respostas de anticorpos bactericidas

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição, caracterizada pelo fato que compreende:

vesículas antigênicas isoladas preparadas de uma primeira bactéria da espécie Neisseria geneticamente modificada para interromper a produção de um polipeptídio GNA1870 endógeno e para expressar um polipeptídio GNA1870 heterólogo para a primeira a primeira bactéria da espécie Neisseria,; e um veículo farmaceuticamente aceitável.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as vesículas são vesículas de membrana externa (OMVs), microvesículas (MV), ou uma mistura de OMVs e MVs.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a bactéria da espécie Neisseria é geneticamente modificada para proporcionar a expressão de um polipeptídeo GNA1870 heterólogo proveniente de um promotor heterólogo.
4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a bactéria da espécie Neisseria é deficiente em polissacarídeo capsular.
5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a bactéria da espécie Neisseria é geneticamente modificada para fornecer uma atividade tóxica diminuída de seu lipídio A em relação à sua bactéria da espécie Neisseria não modificada.
6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 5, caracterizada pelo fato de que a bactéria da espécie Neisseria é H44/76.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda:

uma vesícula antigênica isolada preparada a partir de uma segunda bactéria da espécie Neisseria, , e em que a segunda bactéria da espécie Neisseria é geneticamente diversa para a primeira espécie Neisseria.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a primeira e a segunda bactérias da espécie Neisseria são geneticamente diversas em que elas diferem em um ou mais de sorogrupo,

Petição 870190074852, de 05/08/2019, pág. 5/12 um sorotipo, e sorosubtipo.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o polipeptídio GNA1870 expresso na segunda bactéria da espécie Neisseria é diferente do polipeptídio GNA1870 expresso na primeira bactéria da espécie Neisseria.
10. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a primeira e a segunda bactérias da espécie Neisseria produzem diferentes polipeptídios PorA.
11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada pelo fato de que a segunda bactéria da espécie Neisseria é geneticamente modificada para interromper a produção de um polipeptídio GNA1870 endógeno e para expressar um polipeptídio heterólogo GNA1870 para uma segunda bactéria da espécie Neisseria.
12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a GNA1870 heteróloga expressa nas primeira e segunda bactérias da espécie Neisseria são diferentes.
13. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o polipeptídio GNA 1870 heterólogo expresso na primeira bactéria é de um grupo de variante de GNA187 diferente que aquele da segunda bactéria, e as primeira e segunda bactérias produzem polipeptídios PorA diferentes.
14. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que as vesículas antigênicas são preparadas sem o uso de um detergente.
15. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que os polipeptídeos GNA1870 heterólogos são de diferentes grupos de variantes de polipeptídeo de GNA1870, em que os grupos de variantes são v.1, v.2 e v.3.
16. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que é para uso em um método de induzir uma resposta imune contra Neisseria em um indivíduo mamífero.
17. Método para produzir uma composição antigênica,

Petição 870190074852, de 05/08/2019, pág. 6/12 caracterizado pelo fato de que compreende:

cultivar uma bactéria da espécie Neisseria geneticamente modificada para interromper a produção de um polipeptídio GNA1870 endógeno e para expressar um polipeptídio GNA1870 heterólogo à primeira 5 espécie de bactéria Neisseria;

preparar vesículas a partir da bactéria cultivada; e combinar as vesículas com um veículo farmaceuticamente aceitável para produzir uma composição antigênica.

Petição 870190074852, de 05/08/2019, pág. 7/12