RU2304617C2 - Гибридная экспрессия белков neisseria - Google Patents
Гибридная экспрессия белков neisseria Download PDFInfo
- Publication number
- RU2304617C2 RU2304617C2 RU2002125880/13A RU2002125880A RU2304617C2 RU 2304617 C2 RU2304617 C2 RU 2304617C2 RU 2002125880/13 A RU2002125880/13 A RU 2002125880/13A RU 2002125880 A RU2002125880 A RU 2002125880A RU 2304617 C2 RU2304617 C2 RU 2304617C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- sequence
- proteins
- buffer
- expression
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ гетерологичной экспрессии белка Neisseria meningitidis в Е. coli. При этом экспрессируемый белок обладает иммуногенной активностью в отношении Neisseria meningitidis. Изобретение позволяет получать иммуногенные белки с высокой степенью эффективности. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 26 ил., 1 табл.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Данное изобретение относится к области экспрессии белков. В частности, оно относится к гетерологичной экспрессии белков из Neisseria (например, N. gonorrhoeae или предпочтительно N. meningitidis).
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Международные патентные заявки WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/57280 и WO 00/22430 описывают белки из Neisseria meningitidis и Neisseria gonorrhoeae. Эти белки обычно описываются как экспрессируемые в Е. coli (т.е. при гетерологичной экспрессии) в виде либо N-концевых GST-гибридов, либо С-концевых His-метка-гибридов, хотя описаны также другие экспрессионные системы, в том числе экспрессия в нативной Neisseria.
Целью данного изобретения является обеспечение альтернативных и улучшенных подходов для гетерологичной экспрессии этих белков. Эти подходы обычно влияют на уровень экспрессии, легкость очистки, клеточную локализацию экспрессии и/или иммунологические свойства экспрессируемого белка.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с данным изобретением, два или более (например, 3, 4, 5, 6 или более) белков данного изобретения экспрессируются в виде единого гибридного белка. Предпочтительно, чтобы не был использован гибридный партнер, не относящийся к Neisseria (например, GST или поли-His).
Это дает два преимущества. Во-первых, белок, который может быть нестабильным или слабо экспрессируемым в отдельности, может преодолеть эти недостатки при добавлении подходящего гибридного партнера, который преодолевает эту проблему. Во-вторых, упрощается коммерческое получение - необходимо использование только одной экспрессии и очистки для получения двух раздельно применимых белков.
Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ одновременной гетерологичной экспрессии двух или более белков данного изобретения, в котором гибридизуются указанные два или более белков данного изобретения (т.е. они транслируются в виде единой полипептидной цепи).
Способ обычно включает стадии: получения первой нуклеиновой кислоты, кодирующей первый белок данного изобретения; получения второй нуклеиновой кислоты, кодирующей второй белок данного изобретения; лигирования первой и второй нуклеиновых кислот. Полученная нуклеиновая кислота может быть встроена в экспрессирующий вектор или может уже быть частью экспрессирующего вектора.
При соединении всего лишь двух белков гибридный белок может быть представлен просто формулой NH2-A-B-COOH. А и В, каждый, могут быть выбраны из любых белков Neisseria и, в частности, белков, представленных SEQ ID NO: 1-4326. Этот способ удобен для экспрессии белков orf1, orf4, orf25, orf40, orf46/46.1, orf83, 233, 287, 292L, 564, 687, 741, 907, 919, 953, 961 и 983.
Предпочтительными являются 42 гибрида, указанные «X» в следующей таблице, формулы NH2-A-B-COOH:
↓А В→ | ORF46.1 | 287 | 741 | 919 | 953 | 961 | 983 |
ORF46.1 | X | X | X | X | X | X | |
287 | X | X | X | X | X | X | |
741 | X | X | X | X | X | X | |
919 | X | X | X | X | X | X | |
953 | X | X | X | X | X | X | |
961 | X | X | X | X | X | X | |
983 | X | X | X | X | X | X |
Таким образом, предпочтительными белками для экспрессии в качестве гибридов являются ORF46.1, 287, 741, 919, 953, 961 и 983. Они могут быть использованы в их по существу полноразмерной форме или могут быть использованы формы с полиглициновой делецией (ΔG) (например, ΔG-287, ΔGTbp2, ΔG741, ΔG983 и т.д.) или могут быть использованы укороченные формы (например, Δ1-287, Δ2-287 и т.д.) или версии с делетированными доменами (например, 287В, 287С, 287ВС, ORF461-433, ORF433-608, ORF46, 961с и т.д.) и т.д.
Особенно предпочтительными являются: (а) гибридный белок, содержащий 919 и 287; (b) гибридный белок, содержащий 953 и 287; (с) гибридный белок, содержащий 287 и ORF46.1; (d) гибридный белок, содержащий ORF1 и ORF46.1; (е) гибридный белок, содержащий 919 и ORF46.1; (f) гибридный белок, содержащий ORF46.1 и 919; (g) гибридный белок, содержащий ORF46.1, 287 и 919; (h) гибридный белок, содержащий 919 и 519; и (i) гибридный белок, содержащий ORF97 и 225.
Следующие варианты показаны на рисунках и включают ΔG287-919, ΔG287-953, ΔG287-961, ΔG983-ORF46.1, ΔG983-741, ΔG983-961, ΔG983-961C, ΔG741-961, ΔG741-961C, ΔG741-983, ΔG741-ORF46.1, ORF46.1-741, ORF46.1-961, ORF46.1-961С, 961-ORF46.1, 961-741, 961-983, 961C-ORF46.1, 961С-741, 961С-983, 961CL-ORF46.1, 961CL-741 и 961CL-983.
При применении 287 он предпочтительно находится на С-концевой стороне гибрида; если он должен использоваться на N-конце, предпочтительно использовать форму ΔG287 (например, в виде N-конца гибрида с ORF46.1, 919, 953 или 961).
При применении 287 он предпочтительно происходит из штамма 2996 или из штамма 394/98.
При применении 961 он предпочтительно находится на N-конце. Могут быть использованы формы доменов 961.
Сопоставления полиморфных форм ORF46, 287, 919 и 953 описаны в WO 00/66741. Любые из этих полиморфных форм могут быть использованы в соответствии с данным изобретением.
Предпочтительно составляющие белки (А и В) в гибридном белке в соответствии с данным изобретением происходят из одного и того же штамма.
Гибридные белки в гибриде могут быть соединены непосредственно или могут быть соединены через линкерный пептид, например, через полиглициновый линкер (т.е. Gn, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) или через короткую пептидную последовательность, которая облегчает клонирование. Очевидно, что предпочтительно не присоединять ΔG-белок к С-концу полиглицинового линкера.
Гибридные белки могут быть лишены лидерных пептидов или могут включать в себя последовательность лидерного пептида N-концевого гибридного партнера.
Хозяин
Предпочтительно использовать гетерологичного хозяина. Гетерологичный хозяин может быть прокариотическим или эукариотическим. Предпочтительно он является Е. coli, но другие подходящие хозяева включают Bacillus subtilis. Vibrio cholerae. Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (например, М. tuberculosis), дрожжи и т.д.
Векторы, хозяева и т.д.
Кроме описанных выше способов, данное изобретение обеспечивает (а) нуклеиновую кислоту и векторы, применимые в этих способах; (b) клетки-хозяева, содержащие указанные векторы; (с) белки, экспрессируемые или способные экспрессироваться этими способами; (d) композиции, содержащие эти белки, которые могут быть пригодны, например, в качестве вакцин или в качестве диагностических реагентов или в качестве иммуногенных композиций; (е) эти композиции для применения в качестве лекарственных средств (например, в качестве вакцин) или в качестве диагностических реагентов; (f) применение этих композиций в приготовлении (1) лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria; (2) диагностического реагента для обнаружения присутствия бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria, и/или (3) реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria; и (g) способ лечения пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества этих композиций.
Последовательности
Данное изобретение обеспечивает также белок или нуклеиновую кислоту, имеющие любую из последовательностей, представленных в следующих примерах. Оно обеспечивает также белки и нуклеиновые кислоты, имеющие идентичность последовательности в отношении указанных последовательностей. Степень "идентичности последовательности" предпочтительно является более высокой, чем 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более).
Применяемая здесь номенклатура
2166 последовательностей белков, описанных в WO 99/24578, WO 99/36544 и WO 99/57280, называются здесь следующими SEQ ID NO:-номерами:
Заявка | Последовательности белков | SEQ ID NO: здесь |
WO 99/24578 | Четные SEQ ID 2-892 | SEQ ID NO:1-446 |
WO 99/36544 | Четные SEQ ID 2-90 | SEQ ID NO:447-491 |
WO 99/57280 | Четные SEQ ID 2-3020 | SEQ ID NO:492-2001 |
Четные SEQ ID 3040-3114 | SEQ ID NO:2002-2039 | |
SEQ ID 3115-3241 | SEQ ID NO:2040-2166 |
Кроме этой SEQ ID NO: - нумерации, используются также стандартные наименования, используемые в WO 99/24578, WO 99/36544 и WO 99/57280 (например, 'ORF4', 'ORF40', 'ORF40-1' и т.д., которые используются в WO 99/24578 и WO 99/36544; 'm919', 'g919' и 'а919' и т.д., которые используются в WO 99/57280).
2160 белков NMB0001-NMB2160 из Tettelin et al. [Science (2000) 287:1809-1815] называются здесь SEQ ID NO:2167-4326 [см. также WO 00/66791].
Термин «белок данного изобретения» в применении здесь относится к белку, содержащему
(a) одну из последовательностей SEQ ID NO:1-4326; или
(b) последовательность, имеющую идентичность последовательности относительно одной из SEQ ID NO:1-4326;
или
(c) фрагмент одной из SEQ ID NO: 1-4326.
Степень «идентичности последовательности», упоминаемой в (b), является предпочтительно выше 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более). Это включает мутанты и аллельные варианты (например, см. WO 00/66741). Идентичность предпочтительно определяют при помощи алгоритма поиска гомологии Smith-Waterman, имеющегося в программе MPSRCH (Oxford Molecular), с использованием поиска аффинного гэпа с параметрами штрафа открывания гэпа=12 и штрафа удлинения гэпа=1. Обычно 50%-ную или более высокую идентичность между двумя белками считают указанием на функциональную эквивалентность.
«Фрагмент», упоминаемый в (с), должен содержать по меньшей мере n последовательных аминокислот из одной из SEQ ID NO:1-4326 и, в зависимости от конкретной последовательности, n равен 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более). Предпочтительный фрагмент содержит эпитоп из одной из SEQ ID NO:1-4326. Предпочтительными фрагментами являются фрагменты, описанные в WO 00/71574 и WO 01/04316.
Предпочтительные белки данного изобретения обнаружены в серологической группе В N. meningitidis.
Предпочтительными белками для применения в соответствии с данным изобретением являются белки штамма 2996 или штамма 394/98 (Ново-Зеландского штамма) N. meningitidis серологической группы В. Если нет иных указаний, упомянутые здесь белки являются белками из штамма 2996 N. meningitidis. Однако должно быть понятно, что данное изобретение в общем не ограничивается штаммом. Ссылки на конкретный белок (например, "287", "919" и т.д.) могут иметь в виду данный белок из любого штамма.
Должно быть понятно, что ссылки на "нуклеиновую кислоту" включают в себя ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как содержащие модифицированные скелеты, а также пептиднуклеиновые кислоты (ПНК) и т.д.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигуры 1-26 показывают гибридные белки данного изобретения.
СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пример 1 гибриды ORF46
Полный белок ORF46 из N. meningitidis (серологическая группа В, штамм 2996) имеет следующую последовательность:
Лидерный пептид подчеркнут.
Последовательности ORF46 из других штаммов могут быть найдены в WO 00/66741.
ORF46 гибридизован на его С-конце и N-конце с 287, 919 и ORF1. Эти гибридные белки были обычно нерастворимыми, но давали некоторые хорошие результаты ELISA и бактерицидные результаты (против гомологичного штамма 2996):
Белок | ELISA | Бактерицидные Ab |
Qrf1-Orf46.1-His | 850 | 256 |
919-Orf46.1-His | 12900 | 512 |
919-287-Orf46-His | не опр. | не опр. |
Orf46.1-287His | 150 | 8192 |
Orf46.1-919His | 2800 | 2048 |
Orf46.1-287-919His | 3200 | 16384 |
Для сравнения, конструировали «тройные» гибриды ORF46.1, 287 (либо в виде GST-гибрида, либо в форме ΔG287) и 919 и тестировали их против различных штаммов (в том числе гомологичного штамма 2996) в сравнении с простой смесью этих трех антигенов. FCA (полный адъювант Фрейнда) использовали в качестве адъюванта:
2996 | BZ232 | МС58 | NGH38 | F6124 | BZ133 | |
Смесь | 8192 | 256 | 512 | 1024 | >2048 | >2048 |
ORF46.1-287-919his | 16384 | 256 | 4096 | 8192 | 8192 | 8192 |
ΔG287-919-ORF46.1his | 8192 | 64 | 4096 | 8192 | 8192 | 16384 |
ΔG287-ORF46.1-919his | 4096 | 128 | 256 | 8192 | 512 | 1024 |
И в этом случае эти гибриды обнаруживают эквивалентную или превосходящую иммунологическую активность.
Гибриды двух белков (штамма 2996) сравнивали с индивидуальными белками против различных гетерологичных штаммов:
1000 | МС58 | F6124 (MenA) | |
ORF46.1.His | <4 | 4096 | <4 |
ORF1-His | 8 | 256 | 128 |
ORF1-ORF46.1-His | 1024 | 512 | 1024 |
Опять гибриды обнаруживают эквивалентную или превосходящую иммунологическую активность.
Пример 2 гибриды ΔG287
Было обнаружено, что делеция (Gly)6-последовательности в 287 оказывает сильное действие на экспрессию белка. Белок, лишенный N-концевых аминокислот вплоть до GGGGGG, называют «ΔG287». В штамме МС58 его основная последовательность (лидерный пептид подчеркнут) представлена ниже:
ΔG287, с His-меткой или без His-метки (″ΔG287-His" и «ΔG287K», соответственно), экспрессируется при очень хороших уровнях в сравнении с «287-His» или «287немеченный».
На основании данных по вариабельности генов, варианты ΔG287-His экспрессировали в Е. coli из ряда штаммов MenB, в частности, из штаммов 2996, МС58, 1000 и BZ232. Результаты также были хорошими: каждый из них давал высокие титры ELISA, а также сывороточные бактерицидные титры >8192. ΔС287К, экспрессируемый из плазмиды рЕТ-24b, давал превосходные титры в ELISA и сывороточном бактерицидном анализе.
Делеция поли-Cly-последовательностей также применима к Tbp2 (NMB0460), 741 (NMB 1870) и 983 (NMB1969). При клонировании в вектор рЕТ и экспрессии в Е. coli без последовательности, кодирующей их лидерные пептиды и без поли-Gly (т.е. в виде «ΔG-форм»), наблюдали одно и то же действие - экспрессия была хорошей в клонах, несущих делецию полиглицинового отрезка, и слабой или отсутствующей, если глицины присутствовали в экспрессируемом белке.
ΔG287 гибридизовали непосредственно в рамке считывания против хода транскрипции (слева) 919, 953, 961 (последовательности показаны ниже) и ORF46.1:
ELISA | Бактерицидный тест | |
ΔG287-953-His | 3834 | 65536 |
ΔG287-961-ffis | 108627 | 65536 |
Бактерицидная эффективность (гомологичный штамм) антител, индуцированных против гибридных белков, сравнивали с антителами, индуцированными против простых смесей составляющих антигенов (с использованием 287-GST) для 919 и ORF46.1:
Смесь с 287 | Гибрид с ΔG287 | |
919 | 32000 | 128000 |
ORF46.1 | 128 | 16000 |
Получали также данные бактерицидной активности против гетерологичных штаммов MenB и против серотипов А и С:
919 | ORF46.1 | |||
Штамм | Смесь | Гибрид | Смесь | Гибрид |
NGH38 | 1024 | 32000 | - | 16384 |
МС58 | 512 | 8192 | - | 512 |
BZ232 | 512 | 512 | - | - |
MenA (F6124) | 512 | 32000 | - | 8192 |
MenC (C11) | >2048 | >2048 | - | - |
MenC (BZ133) | >4096 | 64000 | - | 8192 |
Таким образом, гибридные белки с ΔG287 на N-конце превосходят иммунологически простые смеси, причем ΔС287-ORF46.1 является особенно эффективным, даже против гетерологичных штаммов. ΔG287-ORF46.1К может экспрессироваться в рЕТ-24b.
Такие же гибридные белки получали с использованием Ново-Зеландского штамма 394/98, а не 2996:
Пример 5 гибриды 287
Экспрессия 287 в виде полноразмерного белка с С-концевой His-меткой или без его лидерного пептида, но с С-концевой His-меткой дает довольно низкие уровни экспрессии. Лучшая экспрессия достигается с использованием N-концевого GST-гибрида. В качестве альтернативы использованию GST в качестве N-концевого гибридного партнера, 287 помещали на С-конце белка 919 ("919-287"), белка 953 ("953-287") и белков ORF46.1 ("ORF46.1-287"). В обоих случаях лидерные пептиды были делегированы и гибриды были прямыми гибридами в рамке считывания.
Для генерирования гибрида 953-287 лидерные пептиды этих двух белков удаляли конструированием прямого праймера по ходу транскрипции (справа) от лидера каждой последовательности; последовательность стоп-кодона удаляли в обратном праймере 953, но включали в обратный праймер 287. Для гена 953 5' и 3' праймеры, использованные для амплификации, включали в себя сайты рестрикции Ndel и BamHI, соответственно, тогда как для амплификации гена 287 5' и 3' праймеры включали в себя сайты рестрикции BamHI и XhoI, соответственно. Таким путем могло достигаться последовательное направленное клонирование этих двух генов в рЕТ21b+, с использованием NdeI-BamHI (для клонирования первого гена) и затем BamHI-XhoI (для клонирования второго гена).
Гибрид 919-287 получали клонированием последовательности, кодирующей зрелую часть 287 в сайт XhoI на 3'-конце 919-His-клона в рЕТ21b+. Праймеры, используемые для амплификации гена 287, конструировали введением сайта рестрикции Sail при 5'-и сайта XhoI при 3'-конце этого ПЦР-фрагмента. Поскольку липкие концы, продуцируемые рестриктазами SalI и XhoI, являются совместимыми, ПЦР-продукт 287, расщепленный SalI-XhoI, мог быть встроен в клон рЕТ21b-919, расщепленный XhoI.
Гибрид ORF46.1-287 получали сходным образом.
Бактерицидную активность (против гомологичного штамма) антител, индуцированных против гибридных белков, сравнивали с антителами, индуцированными против простых смесей составляющих антигенов:
Смесь с 287 | Гибрид с 287 | |
919 | 32000 | 16000 |
953 | 8192 | 8192 |
ORF46.1 | 128 | 8192 |
Получали также данные бактерицидной активности против гетерологичных штаммов MenB и против серотипов А и С для 919-287 и 953-287:
919 | 953 | ORF46.1 | ||||
Штамм | Смесь | Гибрид | Смесь | Гибрид | Смесь | Гибрид |
МС58 | 512 | 1024 | 512 | 1024 | - | 1024 |
NGH38 | 1024 | 2048 | 2048 | 4096 | - | 4096 |
BZ232 | 512 | 128 | 1024 | 16 | - | - |
MenA (F6124) | 512 | 2048 | 2048 | 32 | - | 1024 |
MenC (C11) | >2048 | неопр. | >2048 | не опр. | - | не опр. |
MenC (BZ133) | >4096 | >8192 | >4096 | <16 | - | 2048 |
Конструировали также гибриды ORF46.1 и 919. Наилучшие результаты (в четыре раза более высокие титры) были достигнуты с 919 на N-конце.
Испытывали также гибриды 919-519His, ORF97-225His и 225-ORF97His. Они дали умеренные титры ELISA и умеренные реакции в виде бактерицидных антител.
Поскольку гибриды двух белков А и В могут быть либо NH2-A-B-COOH, либо NH2-В-А-СООН, получали также «обращенные» гибриды с 287 на N-конце, но с использованием ΔG287. Использовали панель штаммов, в том числе гомологичный штамм 2996. FCA использовали в качестве адъюванта:
287 и 919 | 287 и 953 | 287 и ORF46.1 | ||||
Штамм | ΔС287-919 | 919-287 | ΔG287-953 | 953-287 | ΔG287-46.1 | 46.1-287 |
2996 | 128000 | 16000 | 65536 | 8192 | 16384 | 8192 |
BZ232 | 256 | 128 | 128 | <4 | <4 | <4 |
1000 | 2048 | <4 | <4 | <4 | <4 | <4 |
МС58 | 8192 | 1024 | 16384 | 1024 | 512 | 128 |
NGH38 | 32000 | 2048 | >2048 | 4096 | 16384 | 4096 |
394/98 | 4096 | 32 | 256 | 128 | 128 | 16 |
MenA (F6124) | 32000 | 2048 | >2048 | 32 | 8192 | 1024 |
MenC (BZ133) | 64000 | >8192 | >8192 | <16 | 8192 | 2048 |
Лучшие бактерицидные титры обычно наблюдали с 287 на N-конце.
При гибридизации с белком 961 (NH2-ΔG287-961-COOH-последовательность, показанная выше) полученный белок является нерастворимым и должен денатурироваться и ренатурироваться для очистки. Было обнаружено, что после ренатурации около 50% этого белка оставались нерастворимыми. Растворимые и нерастворимые белки сравнивали, и гораздо лучшие бактерицидные титры получали с растворимым белком (с использованием FCA в качестве адъюванта):
2996 | BZ232 | МС58 | NGH38 | F6124 | BZ133 | |
Растворимый | 65536 | 128 | 4096 | >2048 | >2048 | 4096 |
Нерастворимый | 8192 | <4 | <4 | 16 | не опр. | не опр. |
Однако титры с нерастворимой формой улучшались с использованием квасцов в качестве адъюванта:
Нерастворимый | 32768 | 128 | 4096 | >2048 | >2048 | 2048 |
961с также использовали в гибридных белках (см. выше). Поскольку 961 и его «доменные» варианты направляют эффективную экспрессию, они идеально пригодны в качестве N-концевой части гибридного белка.
Пример 23 - другие гибриды
Другие гибридные белки данного изобретения показаны на чертежах и имеют представленные ниже последовательности. Они обладают преимуществами в сравнении с индивидуальными белками:
Должно быть понятно, что данное изобретение было описано только в виде примера, и могут быть произведены модификации без отклонения от идеи и объема данного изобретения. Например, предполагается применение белков из других штаммов (например, см. WO 00/66741 в отношении полиморфных последовательностей для ORF4, ORF40, ORF46, 225, 235, 287, 519, 726, 919 и 953).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДРОБНОСТИ
Стратегия клонирования и конструирование олигонуклеотидов
Гены, кодирующие представляющие интерес антигены, амплифицировали при помощи ПЦР с использованием олигонуклеотидов, сконструированных на основе геномной последовательности N. meningitidis В МС58. Геномную ДНК из штамма 2996 использовали всегда в качестве матрицы в ПЦР-реакциях, если нет других указаний, и амплифицированные фрагменты клонировали в экспрессирующий вектор рЕТ21b+ (Novagen) для экспрессии белка в виде His-меченого на С-конце продукта или в pET-24b+ (Novagen) для экспрессии «немеченной» формы (например, ΔG287K).
Когда белок экспрессировали без гибридного партнера и с его собственным лидерным пептидом (если он присутствует), выполняли амплификацию открытой рамки считывания (кодоны ATG-СТОП-кодон).
Когда белок экспрессировали в «немеченной» форме, лидерный пептид удаляли конструированием 5'-концевого праймера амплификации справа от предсказанной лидерной последовательности.
Температура плавления праймеров, используемых в ПЦР, зависела от числа и типа гибридизующихся нуклеотидов в целом праймере, и ее определяли с использованием формул:
Тпл1=4(G+C)+2(А+Т) | (хвост исключен) |
Тпл2=64,9+0,41(%GC)-600/N | (полный праймер) |
Температуры плавления выбранных олигонуклеотидов были обычно 65-70°С для полного олигонуклеотида и 50-60°С только для гибридизующегося участка.
Олигонуклеотиды синтезировали с использованием ДНК/РНК-синтезатора Perkin Elmer 394, элюировали из колонок в 2,0 мл NH40H и освобождали от защитных групп 5-часовой инкубацией при 56°С. Олигонуклеотиды осаждали добавлением 0,3 М Na-ацетата и 2 объемов этанола. Пробы центрифугировали и осадки ресуспендировали в воде.
Прямые праймеры использовали в комбинации с Обратным праймером 287-His.
NB - Все ПЦР-реакции используют штамм 2996, если нет других указаний (например, штамм МС58).
Во всех конструкциях, начинающихся с ATG, не сопровождающегося уникальным сайтом NheI, кодон ATG является частью сайта NdeI, используемого для клонирования. Конструкции, приготовленные с использованием NheI в качестве сайта клонирования при 5'-конце (например, все конструкции, содержащие 287 на N-конце), имеют два дополнительных кодона (GCT AGC), гибридизованные с кодирующей последовательностью антигена.
Получение матриц хромосомной ДНК
Штаммы N. meningitidis 2996, МС58, 394.98, 1000 и BZ232 (и другие) выращивали до экспоненциальной фазы в 100 мл GC-среды, собирали центрифугированием и ресуспендировали в 5 мл буфера (20% масса/объем сахароза, 50 мМ Трис-HCl, 50 мМ ЭДТА, рН 8). После 10 минут инкубирования на льду бактерии лизировали добавлением 10 мл лизисного раствора (50 мМ NaCI, 1% Na-саркозил, 50 мкг/мл Протеиназы К) и суспензию инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Выполняли две экстракции фенолом (уравновешенным до рН 8) и одну экстракцию смесью CHCl3/изоамиловый спирт (24:1). ДНК осаждали добавлением 0,3 М ацетата натрия и 2 объемов этанола и собирали центрифугированием. Осадок промывали один раз 70% (об./об.) этанолом и перерастворяли в 4,0 мл ТЭ-буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Концентрацию ДНК измеряли считыванием OD260.
ПЦР-амплификация
Стандартный протокол ПЦР был следующим: 200 нг геномной ДНК из штаммов 2996, МС58, 1000 или BZ232 или 10 нг препарата плазмидной ДНК рекомбинантных клонов использовали в качестве матрицы в присутствии 40 мкМ каждого олигонуклеотидного праймера, 400-800 мкМ раствора dNTP, 1 x ПЦР-буфера (включающего 1,5 мМ MgCl2), 2,5 единиц ДНК-полимеразы TaqI (с использованием Perkin Elmer AmpliTaQ, Boehringer Mannheim Expand™ Long Template).
После предварительной 3-минутной инкубации всей смеси при 95°С, каждую пробу подвергали двухстадийной амплификации: первые 5 циклов выполняли с использованием температуры гибридизации, которая исключала хвост рестриктазы праймера (Tпл1). Затем следовали 30 циклов в соответствии с температурой гибридизации, рассчитанной для полноразмерных олигонуклеотидов (Тпл2). Время элонгации, выполняемой при 68°С или 72°С, варьировалось в соответствии с длиной Orf, подлежащего амплификации. В случае Orf1 время элонгации, начинаясь с 3 минут, увеличивалось на 15 секунд с каждым циклом. Циклы завершались 10-минутной стадией удлинения при 72°С.
Амплифицированную ДНК наносили непосредственно на 1% агарозный гель. ДНК-фрагмент, соответствующий полосе правильного размера, очищали из геля с использованием набора для экстракции гелей Qiagen Gel Extraction Kit согласно протоколу изготовителя.
Расщепление ПЦР-фрагментов и клонирующих векторов
Очищенную ДНК, соответствующую амплифицированному фрагменту, расщепляли подходящими рестриктазами для клонирования в рЕТ-21b+, рЕТ22b+ или рЕТ-24b+. Расщепленные фрагменты очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR purification kit (согласно инструкциям изготовителя) и элюировали либо Н2O, либо 10 мМ Трисом, рН 8,5. Плазмидные векторы расщепляли подходящими рестриктазами, наносили на 1,0% агарозный гель и полосу, соответствующую расщепленному вектору, очищали с использованием набора для экстракции гелей Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit.
Клонирование
Фрагменты, соответствующие каждому гену, предварительно расщепленные и очищенные, лигировали в рЕТ21b+, рЕТ22b+ или рЕТ-24b+. Использовали молярное отношение 3:1 фрагмент/вектор с ДНК-лигазой Т4 в буфере для лигирования, поставляемом изготовителем.
Рекомбинантную плазмиду трансформировали в компетентные клетки Е. coli DH5 или НВ101 инкубированием раствора лигазной реакции и бактерий в течение 40 минут на льду, затем при 37°С в течение 3 минут. Затем следовало добавление 800 мкл LB-бульона и инкубирование при 37°С в течение 20 минут. Клетки центрифугировали при максимальной скорости в микрофуге Эппендорфа, ресуспендировали в приблизительно 200 мкл супернатанта и высевали на содержащем LB-ампициллин (100 мг/мл) агаре.
Скрининг на рекомбинантные клоны выполняли выращиванием случайно выбранных колоний в течение ночи при 37°С в 4,0 мл смеси LB-бульон + 100 мкг/мл ампициллин. Клетки осаждали и плазмидную ДНК экстрагировали с использованием набора Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit согласно инструкциям изготовителя. Приблизительно 1 мкг каждого индивидуального минипрепарата расщепляли подходящими рестриктазами и продукт расщепления наносили на 1-1,5% агарозный гель (в зависимости от ожидаемого размера вставки) параллельно с маркером молекулярной массы (1 т.п.н. ДНК-лэддер, GIBCO). Позитивные клоны отбирали на основании размера вставки.
Экспрессия
После клонирования каждого гена в экспрессирующий вектор рекомбинантные плазмиды трансформировали в штаммы Е. coli, пригодные для экспрессии рекомбинантного белка. 1 мкл каждой конструкции использовали для трансформации Е. coli BL21-DE3, как описано выше. Отдельные рекомбинантные колонии инокулировали в 2 мл LB + Амп (100 мкг/мл), инкубировали при 37°С в течение ночи, затем разводили 1:30 в 20 мл LB + Амп (100 мкг/мл) в колбах на 100 мл с получением OD600 между 0,1 и 0,2. Колбы инкубировали при 30°С или при 37°С во вращательном шейкере с водяной баней до тех пор, пока OD600 не указывал экспоненциальный рост, подходящий для индукции экспрессии (0,4-0,8 OD). Экспрессию белка индуцировали добавлением 1,0 мМ IPTG (изопропилтиогалактозида). После 3 часов инкубирования при 30°С или при 37°С измеряли OD600 и исследовали экспрессию. 1,0 мл каждой пробы центрифугировали в микрофуге, осадок ресуспендировали в ЗФР и анализировали при помощи электрофореза в ДСН/ПААГ и окрашивания Кумасси синим.
Очистка His-меченых белков
Разные формы 287 клонировали из штаммов 2996 и МС58. Их конструировали с His-меченым гибридом на С-конце и они включали зрелую форму (аминокислоты 18-427), конструкции с делециями (Δ1, Δ2, Δ3 и Δ4) и клоны, состоящие либо из В-, либо из С-доменов. Для каждого клона, очищенного в виде His-гибрида, отдельную колонию высевали штрихом и выращивали в течение ночи при 37°С на чашке с агаром LB/Амп (100 мкг/мл). Выделенную колонию из этой чашки инокулировали в 20 мл жидкой среды LB/Амп (100 мкг/мл) и выращивали в течение ночи при 37°С при встряхивании. Ночную культуру разводили 1:30 в 1,0 л жидкой среды LB-Амп (100 мкг/мл) и выращивали при оптимальной температуре (30 или 37°С), пока OD550 не достигала 0,6-0,8. Экспрессию рекомбинантного белка индуцировали добавлением IPTG (конечная концентрация 1,0 мМ) и эту культуру инкубировали еще в течение 3 часов. Бактерии собирали центрифугированием при 8000 g в течение 15 минут при 4°С. Осадок бактерий ресуспендировали в 7,5 мл (i) холодного буфера А (300 мМ NaCl, 50 мМ фосфатный буфер, 10 мМ имидазол, рН 8,0) для растворимых белков или (ii) буфера В (10 мМ Трис-HCl, 100 мМ фосфатный буфер, рН 8,8 и, необязательно, 8 М мочевина) для нерастворимых белков. Белки, очищенные в виде растворимой формы, включали 287-His, Δ1, Δ2, Δ3 и Δ4287-His, Δ4287MC58-His, 287c-His и 287cMC58-His. Белок 287bMC58-His был нерастворимым и его очищали соответствующим образом. Клетки разрушали обработкой ультразвуком на льду четыре раза в течение 30 секунд при 40 W с использованием ультразвукового дезинтегратора 450 Бренсона и центрифугировали при 13000хg в течение 30 минут при 4°С. Для нерастворимых белков осадки ресуспендировали в 2,0 мл буфера С (6 М гидрохлорид гуанидина, 100 мМ фосфатный буфер, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5) и обрабатывали 10 активациями гомогенизатора Даунса. Гомогенат центрифугировали при 13000 g в течение 30 минут и супернатант сохраняли. Супернатанты как растворимого, так и нерастворимого препаратов смешивали с 150 мкл Ni2+-смолы (предварительно уравновешенной буфером А или буфером В, как требуется) и инкубировали при комнатной температуре с осторожным перемешиванием в течение 30 минут. Смолой была хелатирующая Сефароза Fast Flow (Pharmacia), полученная в соответствии с протоколом изготовителя. Получаемый периодически препарат центрифугировали при 700 g в течение 5 минут при 4°С и супернатант отбрасывали. Смолу промывали дважды (при периодическом получении) 10 мл буфера А или В в течение 10 минут, ресуспендировали в 1,0 мл буфера А или В и наносили на одноразовую колонку. Смолу продолжали промывать либо (i) буфером А при 4°С, либо (ii) буфером В при комнатной температуре, пока OD280 протекающего раствора не достигала 0,02-0,01. Смолу дополнительно промывали либо (i) холодным буфером С (300 мМ NaCl, 50 мМ фосфатный буфер, 20 мМ имидазол, рН 8,0), либо (ii) буфером D (10 мМ Трис-HCl, 100 мМ фосфатный буфер, рН 6,3, и, необязательно, 8 М мочевина), пока OD280 протекающего через колонку раствора не достигала 0,02-0,01. His-гибридный белок элюировали добавлением 700 мкл либо (i) холодного буфера для элюции А (300 мМ NaCI, 50 мМ фосфатный буфер, 250 мМ имидазол, рН 8,0), либо (ii) буфера для элюции В (10 мМ Трис-HCl, 100 мМ фосфатный буфер, рН 4,5, и, необязательно, 8 М мочевина) и фракции собирали, пока OD280 не показывала, что получен весь рекомбинантный белок. Аликвоты по 20 мкл каждой фракции элюции анализировали при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ. Концентрацию белка определяли по способу Бредфорда.
Ренатурация денатурированных His-гибридных белков
Денатурация требовалась для солюбилизации 287bМС8, поэтому перед иммунизацией применяли стадию ренатурации. К денатурированным фракциям, полученным, как описано выше, добавляли глицерин с получением конечной концентрации 10% (об./об.). Белки разбавляли до 200 мкг/мл с использованием диализного буфера I (10% об./об. глицерин, 0,5 М аргинин, 50 мМ фосфатный буфер, 5,0 мМ восстановленный глутатион, 0,5 мМ окисленный глутатион, 2,0 М мочевина, рН 8,8) и диализовали против того же буфера в течение 12-14 часов при 4°С. Дополнительный диализ проводили с буфером II (10% об./об. глицерин, 0,5 М аргинин, 50 мМ фосфатный буфер, 5,0 мМ восстановленный глутатион, 0,5 мМ окисленный глутатион, рН 8,8) в течение 12-14 часов при 4°С. Концентрацию белка определяли с использованием формулы:
Белок (мг/мл)=(1,55×OD280)-(0,76 ×OD260)
Иммунизация
Мышей BALB/c иммунизировали антигенами в дни 0, 21 и 35 и сыворотки анализировали в день 49.
Анализ сывороток ELISA
Лишенный капсулы MenB M7 и инкапсулированные штаммы высевали на чашки с шоколадным агаром и инкубировали в течение ночи при 37°С с 5% CO2. Колонии бактерий собирали из чашек с агаром с использованием стерильного тампона (dracon swab) и инокулировали в бульон Mueller-Hinton (Difco), содержащий 0,25% глюкозу. Бактериальный рост отслеживали каждые 30 минут определением OD620. Бактерии выращивали, пока OD620 не достигала величины 0,4-0,5. Культуру центрифугировали в течение 10 минут при 4000 об/мин. Супернатант отбрасывали и бактерии промывали дважды ЗФР, ресуспендировали в ЗФР, содержащем 0,025% формальдегид, и инкубировали в течение 1 часа при 37°С и затем в течение ночи при 4°С при перемешивании. 100 мкл бактериальных клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета Greiner и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем лунки промывали три раза ЗФР-буфером для промывок (0,1% Твин-20 в ЗФР). 200 мкл буфера насыщения (2,7% поливинилпирролидон 10 в воде) добавляли в каждую лунку и планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37°С. Лунки промывали три раза ЗФР. 200 мкл разбавленных сывороток (буфер для разведения: 1% БСА, 0,1% Твин-20, 0,1% NaN3 в ЗФР) добавляли в каждую лунку и планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37°С. Лунки промывали три раза ЗФР. 100 мкл HRP-конъюгированной кроличьей антимышиной сыворотки (Dako), разведенной 1:2000 в буфере для разведения, добавляли в каждую лунку и планшеты инкубировали в течение 90 минут при 37°С. Лунки промывали три раза ЗФР-буфером. 100 мкл субстратного буфера для HRP (25 мл цитратного буфера рН 5, 10 мг О-фенилдиамина и 10 мкл Н2О2) добавляли в каждую лунку и планшеты оставляли при комнатной температуре на 20 минут. 100 мкл 12,5% H2SO4 добавляли в каждую лунку и определяли OD490. Титры ELISA рассчитывали в относительных единицах в виде разведения сывороток, которое давало величину OD490 0,4 над уровнем предымунных сывороток. Анализ ELISA считался позитивным, когда разведение сывороток с OD490 0,4 было больше, чем 1:400.
Анализ сывороток FACS-Scan-анализ связывания бактерий
Лишенный капсулы штамм MenB M7 высевали на чашки с шоколадным агаром и инкубировали в течение ночи при 37°С с 5% CO2. Колонии бактерий собирали из чашек с агаром с использованием стерильного тампона (dracon swab) и инокулировали в 4 пробирки, содержащие, каждая, 8 мл бульона Mueller-Hinton (Difco), содержащего 0,25% глюкозу. Бактериальный рост отслеживали каждые 30 минут определением OD620. Бактерии выращивали, пока OD620 не достигала величины 0,35-0,5. Культуру центрифугировали в течение 10 минут при 4000 об/мин. Супернатант отбрасывали и осадок ресуспендировали в блокирующем буфере (1% БСА в ЗФР, 0,4% NaN3) и центрифугировали в течение 5 минут при 4000 об/мин. Клетки ресуспендировали в блокирующем буфере с получением OD620 0,05. 100 мкл бактериальных клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета Costar. 100 мкл разведенных (1:100, 1:200, 1:400) сывороток (в блокирующем буфере) добавляли в каждую лунку и планшеты инкубировали в течение 2 часов при 4°С. Клетки центрифугировали в течение 5 минут при 4000 об/мин, супернатант отсасывали и клетки промывали добавлением 200 мкл на лунку блокирующего буфера в каждую лунку. В каждую лунку добавляли 100 мкл конъюгированнных с R-фикоэритрином козьих F(ab)2 против мышиных антител, разведенных 1:100, и планшеты инкубировали в течение 1 часа при 4°С. Клетки откручивали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 5 минут и промывали добавлением 200 мкл на лунку блокирующего буфера. Супернатант отсасывали и клетки ресуспендировали в 200 мкл на лунку ЗФР, 0,25% формальдегида. Пробы переносили в пробирки FACScan и считывали показатели. Условия для установки FACScan (мощность лазера 15 мВ) были следующими: FL2 вкл.; порог FSC-H: 92; напряжение FSC РМТ: Е 01; SSC РМТ: 474; коэффициенты усиления 6,1; FL-2 РМТ: 586; величины компенсации: 0.
Анализ сывороток - бактерицидный анализ
Штамм N. meningitidis 2996 выращивали в течение ночи при 37°С на чашках с шоколадным агаром (исходный материал брали из замороженного исходного раствора) с 5% CO2. Колонии бактерий собирали и использовали для инокуляции 7 мл бульона Mueller-Hinton, содержащего 0,25% глюкозу, для получения OD620 0,05-0,08. Культуру инкубировали в течение приблизительно 1,5 часов при 37°С со встряхиванием, пока величина OD620 не достигала 0,23-0,24. Бактерии разбавляли в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 10 мМ MgCl2, 10 мМ CaCl2 и 0,5% (масса/объем) БСА (буфер для анализа) при рабочем разведении 105 КОЕ (колониеобразующих единиц) на мл. Общий объем реакционной смеси был 50 мкл с 25 мкл серийных 2-кратных разведении тест-сыворотки, 12,5 мкл бактерий при рабочем разведении, 12,5 мкл комплемента детеныша кролика (конечная концентрация 25%).
Контроли включали бактерии, инкубированные с сывороткой комплемента, иммунные сыворотки, инкубированные с бактериями и с комплементом, инактивированные нагреванием при 56°С в течение 30 минут. Сразу же после добавления комплемента детенышей кролика 10 мкл контролей высевали на чашки с агаром Mueller-Hinton с использованием метода с наклоном (время 0). 96-луночный планшет инкубировали в течение 1 часа при 37°С с вращением. 7 мкл каждой пробы высевали на чашки с агаром Mueller-Hinton в виде пятен, в то время как 10 мкл контролей высевали на чашки с агаром Mueller-Hinton с использованием метода с наклоном (время 1). Чашки с агаром инкубировали в течение 18 часов при 37°С и считали колонии, соответствующие времени 0 и времени 1.
Анализ сывороток - вестерн-блоты
Очищенные белки (500 нг на дорожку), пузырьки (везикулы) наружных мембран (5 мкг) и общие клеточные экстракты (25 мкг), полученные из штамма MenB 2996, наносили на 12% ДСН-полиакриламидный гель и переносили на нитрофеллюлозную мембрану. Перенос выполняли в течение 2 часов при 150 мА при 4°С с использованием буфера для переноса (0,3% Трис-основание, 1,44% глицин, 20% (об./об.) метанол). Мембрану насыщали ночным инкубированием при 4°С в буфере для насыщения (10% обезжиренное молоко, 0,1% Тритон Х-100 в ЗФР). Мембрану промывали дважды промывочным буфером (3% обезжиренное молоко, 0/1% Тритон Х-100 в ЗФР) и инкубировали в течение 2 часов при 37°С с мышиными сыворотками, разведенными 1:200 в промывочном буфере. Мембрану промывали дважды и инкубировали в течение 90 минут с разведением 1:2000 меченого пероксидазой хрена антимышиного Tg. Мембрану промывали дважды 0,1% Тритоном Х-100 в ЗФР и проявляли с использованием субстратного набора Opti-4CN Substrate Kit (Bio-Rad). Реакцию останавливали добавлением воды.
OMV (везикулы наружных мембран) получали следующим образом: штамм N. meningitidis 2996 выращивали в течение ночи при 37°С с 5% CO2 на GC-чашках, собирали петлей и ресуспендировали в 10 мл 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 2 мМ ЭДТА.
Инактивацию нагреванием выполняли при 56°С в течение 45 минут и бактерии разрушали обработкой ультразвуком в течение 5 минут на льду (50% рабочий цикл, 50% выход, микронаконечник 3 мм ультразвукового дезинтегратора Бренсона). Неразрушенные клетки удаляли центрифугированием при 5000 g в течение 10 минут, супернатант, содержащий тотальную фракцию оболочек клеток, извлекали и дополнительно центрифугировали в течение ночи при 50000 g при температуре 4°С. Осадок, содержащий мембраны, ресуспендировали в 2% саркозиле, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 2 мМ ЭДТА и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут для солюбилизации внутренних мембран. Суспензию центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут для удаления агрегатов, супернатант дополнительно центрифугировали при 50000 g в течение 3 часов. Осадок, содержащий наружные мембраны, промывали в ЗФР и ресуспендировали в том же самом буфере. Концентрацию белка измеряли по способу D.C. Bio-Rad Protein assay (модифицированному способу Лоури) с использованием БСА в качестве стандарта.
Общие клеточные экстракты получали следующим образом: штамм N. meningitidis 2996 выращивали в течение ночи на GC-чашке, собирали петлей и ресуспендировали в 1 мл 20 мМ Трис-HCl. Инактивацию нагреванием выполняли при 56°С в течение 30 минут.
Claims (9)
1. Способ одновременной гетерологичной экспрессии в Е. coli первого белка и второго белка, где
(a) первый белок и второй белок транслируются в единую полипептидную цепь;
(b) первый белок содержит
аминокислотную последовательность AG287 из Neisseria meningitidis:
SPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGSQDMAAVSEENTGNGGAVTA
DNPKNEDEVAQNDMPQNAAGTDSSTPNHTPDPNMLAGNMENQATDAGESSQPANQPDMANAADG
MQGDDPSAGGQNAGNTAAQGANQAGNNQAAGSSDPIPASNPAPANGGSNFGRVDLANGVLIDGP
SQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDKFVGLVADSVQMKGI
NQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGN
YRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPAKGEMLAGAAVYNGEVLHFHTENGRPYPTRGRFAAKVDFG
SKSVDGIIDSGDDLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGSGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTD
AEKGGFGVFAGKKEQD
или последовательность, которая более чем на 80% идентична этой последовательности и сохраняет ее функцию, или иммуногенный фрагмент эпитопа указанного белка с последовательностью, содержащей по меньшей мере 7 последовательных аминокислот; и
(с) второй белок содержит аминокислотную последовательность 953 из Neisseria meningitidis
ATYKVDEYHANARFAIDHFHTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPVANLQSGSQHFTD
HLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMAKTE
VCGGDFSTTIDRTKWGVDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ
или последовательность, которая более чем на 80% идентична этой последовательности и сохраняет ее функцию, или иммуногенный фрагмент эпитопа указанного белка с последовательностью, содержащей по меньшей мере 7 последовательных аминокислот.
2. Способ по п.1, где первый белок расположен перед вторым белком в полипептидной цепи.
3. Способ по п.1, где первый белок расположен после второго белка в полипептидной цепи.
4. Гибридный белок формулы NH2-А - В-СООН, полученный способом по п.1 и обладающий иммунологической активностью в отношении Neisseria meningitidis, в котором А содержит
(i) аминокислотную последовательность ΔG287 из Neisseria meningitidis
SPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGSQDMAAVSEENTGNGGAVTA
DNPKNEDEVAQNDMPQNAAGTDSSTPNHTPDPNMLAGNMENQATDAGESSQPANQPDMANAADG
MQGDDPSAGGQNAGNTAAQGANQAGNNQAAGSSDPIPASNPAPANGGSNFGRVDLANGVLIDGP
SQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDKFVGLVADSVQMKGI
NQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGN
YRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPAKGEMLAGAAVYNGEVLHFHTENGRPYPTRGRFAAKVDFG
SKSVDGIIDSGDDLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGSGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTD
AEKGGFGVFAGKKEQD
или последовательность, которая более чем на 80% идентична этой последовательности и сохраняет ее функцию, или иммуногенный фрагмент эпитопа указанного белка с последовательностью, содержащей по меньшей мере 7 последовательных аминокислот; и В содержит
(ii) аминокислотную последовательность 953 из Neisseria meningitidis
ATYKVDEYHANARFAIDHFHTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPVANLQSGSQHFTD
HLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMAKTE
VCGGDFSTTIDRTKWGVDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ
или последовательность, которая более чем на 80% идентична этой последовательности и сохраняет ее функцию, или иммуногенный фрагмент эпитопа указанного белка с последовательностью, содержащей по меньшей мере 7 последовательных аминокислот.
5. Белок по п.4, где А и В соединены непосредственно.
6. Белок по п.4, где А и В соединены через линкерный пептид.
7. Белок по п.6, где линкерный пептид представляет собой полиглициновый линкер.
8. Белок по п.4, где белок экспрессируется в клетке-хозяине Е. coli.
9. Экспрессионный вектор, содержащий последовательность ДНК, которая кодирует гибридный белок по п.4.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB0004695A GB0004695D0 (en) | 2000-02-28 | 2000-02-28 | Protein expression |
GB0004695.3 | 2000-02-28 | ||
GB0027675.8 | 2000-11-13 | ||
GB0027675A GB0027675D0 (en) | 2000-11-13 | 2000-11-13 | Protein Expression |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2002125880A RU2002125880A (ru) | 2004-03-10 |
RU2304617C2 true RU2304617C2 (ru) | 2007-08-20 |
Family
ID=26243750
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2002125882/13A RU2299906C2 (ru) | 2000-02-28 | 2001-02-28 | Гетерологичная экспрессия белков neisseria |
RU2002125880/13A RU2304617C2 (ru) | 2000-02-28 | 2001-02-28 | Гибридная экспрессия белков neisseria |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2002125882/13A RU2299906C2 (ru) | 2000-02-28 | 2001-02-28 | Гетерологичная экспрессия белков neisseria |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (9) | US20040092711A1 (ru) |
EP (6) | EP1947187B9 (ru) |
JP (8) | JP4763210B2 (ru) |
CN (7) | CN100334214C (ru) |
AT (3) | ATE503837T1 (ru) |
AU (4) | AU3947801A (ru) |
BR (2) | BR0108713A (ru) |
CA (5) | CA2875231A1 (ru) |
CY (6) | CY1106532T1 (ru) |
DE (3) | DE60144353D1 (ru) |
DK (4) | DK1261723T3 (ru) |
ES (5) | ES2281409T3 (ru) |
HK (4) | HK1064120A1 (ru) |
LU (1) | LU92240I2 (ru) |
MX (2) | MXPA02008314A (ru) |
NL (1) | NL300605I2 (ru) |
NZ (2) | NZ521531A (ru) |
PT (4) | PT1790660E (ru) |
RU (2) | RU2299906C2 (ru) |
WO (2) | WO2001064920A2 (ru) |
Families Citing this family (86)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001500738A (ja) | 1996-09-17 | 2001-01-23 | カイロン コーポレイション | 細胞内疾患を処置するための組成物および方法 |
WO1999036544A2 (en) * | 1998-01-14 | 1999-07-22 | Chiron S.P.A. | Neisseria meningitidis antigens |
US20070026021A1 (en) * | 1998-05-01 | 2007-02-01 | Chiron S.R.I. | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
EP2261349A3 (en) | 1998-05-01 | 2012-01-11 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
PT1154790E (pt) * | 1999-02-26 | 2005-03-31 | Chiron Srl | Reforco da actividade bactericida de antigenios contra a neisseria com oligonucleotidos contendo motivos cg |
WO2000066741A2 (en) | 1999-04-30 | 2000-11-09 | Chiron S.P.A. | Conserved neisserial antigens |
EP1860191A3 (en) | 1999-05-19 | 2008-02-13 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Combination neisserial compositions |
GB9911683D0 (en) * | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
ES2541830T3 (es) | 1999-10-29 | 2015-07-27 | Novartis Vaccines And Diagnositics S.R.L. | Péptidos antigénicos de Neisseria |
GB9928196D0 (en) | 1999-11-29 | 2000-01-26 | Chiron Spa | Combinations of B, C and other antigens |
EP2275129A3 (en) * | 2000-01-17 | 2013-11-06 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Outer membrane vesicle (OMV) vaccine comprising N. meningitidis serogroup B outer membrane proteins |
ES2281409T3 (es) * | 2000-02-28 | 2007-10-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Expresion heterologa de proteinas de neisseria. |
WO2002083711A2 (en) * | 2001-04-17 | 2002-10-24 | Chiron Corporation | Molecular mimetics of meningococcal b epitopes which elicit functionally active antibodies |
GB0115176D0 (en) | 2001-06-20 | 2001-08-15 | Chiron Spa | Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines |
US6928463B1 (en) * | 2001-07-06 | 2005-08-09 | Nortel Networks Limited | Broadband content delivery via personal content tunnel |
GB0118249D0 (en) | 2001-07-26 | 2001-09-19 | Chiron Spa | Histidine vaccines |
JP4592284B2 (ja) * | 2001-07-27 | 2010-12-01 | カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | 髄膜炎菌付着因子 |
GB0121591D0 (en) * | 2001-09-06 | 2001-10-24 | Chiron Spa | Hybrid and tandem expression of neisserial proteins |
AU2014201962B2 (en) * | 2001-09-06 | 2016-06-09 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Hybrid and tandem expression of Neisserial proteins |
US7838015B2 (en) | 2001-10-03 | 2010-11-23 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Adjuvanted meningococcus compositions |
AU2002334844B2 (en) * | 2001-10-03 | 2007-08-02 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Adjuvanted meningococcus compositions |
AR045702A1 (es) | 2001-10-03 | 2005-11-09 | Chiron Corp | Composiciones de adyuvantes. |
MX339524B (es) * | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
WO2004014419A1 (en) | 2002-08-02 | 2004-02-19 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine composition comprising transferrin binding protein and hsf from gram negative bacteria |
US7785608B2 (en) | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
DK2351579T3 (en) | 2002-10-11 | 2017-01-09 | Novartis Vaccines And Diagnostics S R L | Polypeptide vaccines for broad protection against hypervirulent meningococcal lineages. |
PT1556477T (pt) | 2002-11-01 | 2017-11-14 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Processo de secagem |
EP2279746B1 (en) | 2002-11-15 | 2013-10-02 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Surface proteins in neisseria meningitidis |
GB0227346D0 (en) * | 2002-11-22 | 2002-12-31 | Chiron Spa | 741 |
EP2289546A3 (en) | 2003-01-30 | 2011-03-30 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Injectable vaccines against multiple meningococcal serogroups |
US7851433B2 (en) | 2003-08-13 | 2010-12-14 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Method of purifying TFPI and TFPI analogs |
EP1670506B1 (en) * | 2003-10-02 | 2012-11-21 | Novartis AG | Liquid vaccines for multiple meningococcal serogroups |
GB0323103D0 (en) | 2003-10-02 | 2003-11-05 | Chiron Srl | De-acetylated saccharides |
GB0408977D0 (en) | 2004-04-22 | 2004-05-26 | Chiron Srl | Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins |
GB0409748D0 (en) * | 2004-04-30 | 2004-06-09 | Chiron Srl | Lactoferrin cleavage |
GB0419408D0 (en) * | 2004-09-01 | 2004-10-06 | Chiron Srl | 741 chimeric polypeptides |
GB0424092D0 (en) | 2004-10-29 | 2004-12-01 | Chiron Srl | Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins |
WO2006089264A2 (en) | 2005-02-18 | 2006-08-24 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | Proteins and nucleic acids from meningitis/sepsis-associated escherichia coli |
JP2008530245A (ja) | 2005-02-18 | 2008-08-07 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス, インコーポレイテッド | 尿路病原性菌株由来の抗原 |
CN100475965C (zh) * | 2005-07-22 | 2009-04-08 | 上海高科联合生物技术研发有限公司 | 一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法 |
GB0524066D0 (en) | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Chiron Srl | 741 ii |
US20110008279A1 (en) * | 2005-12-06 | 2011-01-13 | Vega Masignani | Methods and Compositions Relating to Adhesins as Adjuvants |
US20100166788A1 (en) | 2006-08-16 | 2010-07-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics | Immunogens from uropathogenic escherichia coli |
AR064642A1 (es) | 2006-12-22 | 2009-04-15 | Wyeth Corp | Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi |
GB0700562D0 (en) | 2007-01-11 | 2007-02-21 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Modified Saccharides |
GB0713880D0 (en) | 2007-07-17 | 2007-08-29 | Novartis Ag | Conjugate purification |
PT2200642E (pt) | 2007-10-19 | 2012-05-30 | Novartis Ag | Formulações de vacinas meningocócicas |
CA2716212A1 (en) | 2008-02-21 | 2009-08-27 | Novartis Ag | Meningococcal fhbp polypeptides |
WO2009111337A1 (en) | 2008-03-03 | 2009-09-11 | Irm Llc | Compounds and compositions as tlr activity modulators |
US20100105875A1 (en) * | 2008-06-09 | 2010-04-29 | Maria Scarselli | Antibodies against neisserial factor H binding protein |
JP5487463B2 (ja) * | 2008-08-08 | 2014-05-07 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 非拡散植物ウイルスベクター |
US20120070458A1 (en) | 2009-03-24 | 2012-03-22 | Novartis Ag | Adjuvanting meningococcal factor h binding protein |
JP5867952B2 (ja) | 2009-06-10 | 2016-02-24 | ノバルティス アーゲー | ベンゾナフチリジン含有ワクチン |
WO2011008400A2 (en) | 2009-06-16 | 2011-01-20 | Novartis Ag | High-throughput complement-mediated antibody-dependent and opsonic bactericidal assays |
NZ598458A (en) | 2009-08-27 | 2014-03-28 | Novartis Ag | Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences |
CN102844047B (zh) | 2009-09-02 | 2017-04-05 | 诺华股份有限公司 | 含tlr活性调节剂的免疫原性组合物 |
TWI445708B (zh) | 2009-09-02 | 2014-07-21 | Irm Llc | 作為tlr活性調節劑之化合物及組合物 |
CN102724988B (zh) | 2009-09-30 | 2014-09-10 | 诺华股份有限公司 | 脑膜炎球菌fHBP多肽的表达 |
JP5960055B2 (ja) | 2009-10-27 | 2016-08-02 | ノバルティス アーゲー | 改変髄膜炎菌fHBPポリペプチド |
WO2011057148A1 (en) | 2009-11-05 | 2011-05-12 | Irm Llc | Compounds and compositions as tlr-7 activity modulators |
BR112012014624A8 (pt) | 2009-12-15 | 2017-12-26 | Novartis Ag | suspensão homogênea de compostos de imunopotenciação e usos dos destes |
AU2011232421B2 (en) | 2010-03-23 | 2015-08-13 | Novartis Ag | Compounds (cystein based lipopeptides) and compositions as TLR2 agonists used for treating infections, inflammations, respiratory diseases etc. |
EP2585106A1 (en) | 2010-06-25 | 2013-05-01 | Novartis AG | Combinations of meningococcal factor h binding proteins |
ES2850973T3 (es) | 2010-08-23 | 2021-09-01 | Wyeth Llc | Formulaciones estables de antígenos rLP2086 de Neisseria meningitidis |
CA2810971C (en) | 2010-09-10 | 2020-11-03 | Novartis Ag | Developments in meningococcal outer membrane vesicles |
ES2585328T5 (es) | 2010-09-10 | 2022-12-14 | Wyeth Llc | Variantes no lipidadas de antígenos ORF2086 de Neisseria meningitidis |
GB201102090D0 (en) * | 2011-02-08 | 2011-03-23 | Univ Sheffield | Antigenic polypeptide |
WO2013033398A1 (en) | 2011-08-31 | 2013-03-07 | Children' S Hospital & Research Center Oakland | Engineered sequences to facilitate expression of antigens in neisseria and methods of use |
MX2018011291A (es) | 2012-03-09 | 2023-01-31 | Pfizer | Composiciones de neisseria meningitidis y metodos de las mismas. |
SA115360586B1 (ar) | 2012-03-09 | 2017-04-12 | فايزر انك | تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها |
ES2847923T3 (es) | 2012-06-14 | 2021-08-04 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vacunas contra el meningococo del serogrupo X |
WO2014016152A1 (en) | 2012-07-27 | 2014-01-30 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Cd147 as receptor for pilus-mediated adhesion of meningococci to vascular endothelia |
WO2014084432A1 (ko) * | 2012-11-30 | 2014-06-05 | 경상대학교 산학협력단 | 헬리코박터 파일로리 발현 벡터 |
EP2964665B1 (en) | 2013-03-08 | 2018-08-01 | Pfizer Inc | Immunogenic fusion polypeptides |
KR101905278B1 (ko) | 2013-09-08 | 2018-10-08 | 화이자 인코포레이티드 | 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법 |
WO2015128480A1 (en) | 2014-02-28 | 2015-09-03 | Novartis Ag | Modified meningococcal fhbp polypeptides |
AU2016221318B2 (en) | 2015-02-19 | 2020-06-25 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
GB201522153D0 (en) | 2015-12-15 | 2016-01-27 | Univ Southampton | Meningococcal infection and modified neisseria lactamica |
US20190282684A1 (en) | 2016-09-02 | 2019-09-19 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Vaccines for neisseria gonorrhoeae |
EP3312192B1 (en) * | 2016-10-24 | 2023-02-22 | BiOMVis Srl | Immunogenic compositions containing bacterial outer membrane vesicles |
KR102567845B1 (ko) | 2017-01-31 | 2023-08-17 | 화이자 인코포레이티드 | 네이세리아 메닌기티디스 조성물 및 그의 방법 |
CN110516550B (zh) * | 2019-07-26 | 2022-07-05 | 电子科技大学 | 一种基于fpga的车道线实时检测方法 |
JP2024507828A (ja) | 2021-02-19 | 2024-02-21 | サノフィ パスツール インコーポレイテッド | B群髄膜炎菌組換えワクチン |
GB202208089D0 (en) | 2022-06-01 | 2022-07-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunogenic composition |
GB202208093D0 (en) | 2022-06-01 | 2022-07-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunogenic composition |
WO2024030931A1 (en) | 2022-08-03 | 2024-02-08 | Sanofi Pasteur Inc. | Adjuvanted immunogenic composition against neisseria meningitidis b |
Family Cites Families (131)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4239749A (en) | 1979-09-27 | 1980-12-16 | United States Of America | Neisseria gonorrhoeae vaccine |
CA1282721C (en) | 1984-06-04 | 1991-04-09 | Bernard Roizman | Herpes simplex virus as a vector |
US5288641A (en) | 1984-06-04 | 1994-02-22 | Arch Development Corporation | Herpes Simplex virus as a vector |
EP0273116A3 (en) | 1986-10-09 | 1990-05-02 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Gonococcal and meningococcal polypeptides, vaccines and diagnostics |
GB8702816D0 (en) | 1987-02-07 | 1987-03-11 | Al Sumidaie A M K | Obtaining retrovirus-containing fraction |
US5270176A (en) * | 1987-11-20 | 1993-12-14 | Hoechst Aktiengesellschaft | Method for the selective cleavage of fusion proteins with lysostaphin |
CA1340506C (en) * | 1987-11-24 | 1999-04-20 | Nicholas H. Carbonetti | Production of gonorrheal pi proteins and vaccines |
US5591624A (en) | 1988-03-21 | 1997-01-07 | Chiron Viagene, Inc. | Retroviral packaging cell lines |
WO1989009271A1 (en) | 1988-03-21 | 1989-10-05 | Viagene, Inc. | Recombinant retroviruses |
US5422120A (en) | 1988-05-30 | 1995-06-06 | Depotech Corporation | Heterovesicular liposomes |
AP129A (en) | 1988-06-03 | 1991-04-17 | Smithkline Biologicals S A | Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells |
NL8803111A (nl) | 1988-12-19 | 1990-07-16 | Nederlanden Staat | Multivalent meningococcen klasse i buitenmembraaneiwit vaccin. |
JP3436756B2 (ja) | 1988-12-19 | 2003-08-18 | アメリカン・サイアナミド・カンパニー | 髄膜炎菌のクラスiの外膜タンパク質のワクチン |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
DE69032284T2 (de) | 1989-03-21 | 1998-10-08 | Vical Inc | Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren |
GB8919607D0 (en) | 1989-08-30 | 1989-10-11 | Wellcome Found | Novel entities for cancer therapy |
CU22302A1 (es) * | 1990-09-07 | 1995-01-31 | Cigb | Secuencia nucleotidica codificante para una proteina de la membrana externa de neisseria meningitidis y uso de dicha proteina en preparados vacunales |
EP0467714A1 (en) | 1990-07-19 | 1992-01-22 | Merck & Co. Inc. | The class II protein of the outer membrane of neisseria meningitidis |
WO1992005266A2 (en) | 1990-09-21 | 1992-04-02 | Viagene, Inc. | Packaging cells |
US5965424A (en) * | 1991-01-11 | 1999-10-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Methods for making neisseria or hemophilus IgA protease and DNA encoding the proteases |
JP3213313B2 (ja) * | 1991-03-14 | 2001-10-02 | イムクローン システムズ インコーポレーテッド | 組み換えハイブリッドポーリンエピトープ |
FR2681786A1 (fr) | 1991-09-27 | 1993-04-02 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs recombinants d'origine virale, leur procede d'obtention et leur utilisation pour l'expression de polypeptides dans des cellules musculaires. |
IL103059A0 (en) | 1991-09-30 | 1993-02-21 | Boehringer Ingelheim Int | Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells |
NZ244306A (en) | 1991-09-30 | 1995-07-26 | Boehringer Ingelheim Int | Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation |
US6100380A (en) | 1991-10-28 | 2000-08-08 | Cytran, Inc. | Immunomodulating peptides and methods of use |
JPH07503372A (ja) | 1992-01-23 | 1995-04-13 | バイカル・インコーポレイテッド | 生体外遺伝子導入 |
FR2692592B1 (fr) * | 1992-06-19 | 1995-03-31 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Fragments d'ADN codant pour les sous-unités du récepteur de la transferrine de Neisseria meningitidis et procédés les exprimant. |
CA2139847C (en) | 1992-07-07 | 2002-05-21 | Akio Matsuhisa | Probe for diagnosing infectious disease |
US6592873B1 (en) | 1992-10-30 | 2003-07-15 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids |
DK0647655T3 (da) | 1993-01-23 | 1999-08-23 | Inmunologia & Genetica Aplic | Syntetiske peptider og vacciner mod parvovirus |
US5439808A (en) | 1993-07-23 | 1995-08-08 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis |
JPH11501203A (ja) * | 1993-07-30 | 1999-02-02 | ザ ユニバーシティー オブ ノースカロライナ アット チャペル ヒル | 大腸菌およびサルモネラ菌中における淋菌piタンパクおよびワクチンの製造 |
US5914254A (en) * | 1993-08-02 | 1999-06-22 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Expression of fusion polypeptides transported out of the cytoplasm without leader sequences |
US5510264A (en) | 1993-09-28 | 1996-04-23 | Insight Biotech Inc. | Antibodies which bind meningitis related homologous antigenic sequences |
RO116341B1 (ro) | 1993-11-16 | 2001-01-30 | Depotech Corp La Jolia | Lipozom multivezicular si procedeu de obtinere a acestuia |
ATE381624T1 (de) | 1994-05-09 | 2008-01-15 | Oxford Biomedica Ltd | Retrovirale vektoren mit verminderter rekombinationsrate |
FR2720408B1 (fr) * | 1994-05-31 | 1996-08-14 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Fragments Tbp2 de Neisseria meningitidis. |
US6245337B1 (en) | 1994-08-25 | 2001-06-12 | Washington University | Haemophilus adherence and penetration proteins |
IL117483A (en) | 1995-03-17 | 2008-03-20 | Bernard Brodeur | MENINGITIDIS NEISSERIA shell protein is resistant to proteinase K. |
US5646259A (en) | 1995-03-24 | 1997-07-08 | St. Louis University | DNA encoding haemophilus adhesion proteins |
US6265567B1 (en) | 1995-04-07 | 2001-07-24 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Isolated FrpB nucleic acid molecule |
CA2704354A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Connaught Laboratories, Inc. | Expression of lipoproteins |
JP4033489B2 (ja) | 1995-09-18 | 2008-01-16 | ユナイテッド ステイツ アーミー メディカル リサーチ マテリアル コマンド (ユーエスエイエムアールエムシー) | 非共有結合的に複合体を形成した、多価プロテオソームサブユニットワクチンの産生のための改善された方法 |
DE19534579C2 (de) | 1995-09-18 | 2000-06-08 | Max Planck Gesellschaft | Nucleinsäure-Moleküle codierend Proteine, die die Adhäsion von Neisseria-Zellen an humane Zellen vermitteln |
FR2739624B1 (fr) * | 1995-10-10 | 1997-12-05 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Nouvelle sous-unite tbp2 de neisseria meningitidis |
ZA9610456B (en) * | 1995-12-20 | 1997-06-20 | Novo Nordisk As | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
AU2115897A (en) * | 1996-02-01 | 1997-08-22 | North American Vaccine, Inc. | Expression of group b neisseria meningitidis outer membrane (mb3) protein from yeast and vaccines |
US6083499A (en) | 1996-04-19 | 2000-07-04 | Mycogen Corporation | Pesticidal toxins |
AU5426098A (en) | 1996-10-24 | 1998-05-15 | Emory University | Invasion associated genes from (neisseria meningitidis) serogroup |
US5980898A (en) | 1996-11-14 | 1999-11-09 | The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command | Adjuvant for transcutaneous immunization |
KR100615109B1 (ko) | 1996-12-20 | 2006-08-22 | 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 모렉셀라 카타르할리스의 uspa1, uspa2 항원 |
US6017531A (en) | 1997-06-02 | 2000-01-25 | W. R. Grace & Co. | Hydrophilic composition containing protease produced by Vibrio |
US6583275B1 (en) | 1997-07-02 | 2003-06-24 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid sequences and expression system relating to Enterococcus faecium for diagnostics and therapeutics |
ATE476508T1 (de) * | 1997-11-06 | 2010-08-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Neisseriale antigene |
US6914131B1 (en) * | 1998-10-09 | 2005-07-05 | Chiron S.R.L. | Neisserial antigens |
GB9726398D0 (en) | 1997-12-12 | 1998-02-11 | Isis Innovation | Polypeptide and coding sequences |
WO1999036544A2 (en) * | 1998-01-14 | 1999-07-22 | Chiron S.P.A. | Neisseria meningitidis antigens |
CA2319404C (en) * | 1998-02-03 | 2014-01-07 | Edwin W. Ades | Recombinant lipidated psaa protein, methods of preparation and use |
AU739292B2 (en) * | 1998-02-11 | 2001-10-11 | Eli Lilly And Company | Processes and intermediates useful to make antifolates |
GB9808734D0 (en) | 1998-04-23 | 1998-06-24 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
GB9808866D0 (en) | 1998-04-24 | 1998-06-24 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
US6150502A (en) | 1998-04-29 | 2000-11-21 | Genesis Research & Development Corporation Limited | Polypeptides expressed in skin cells |
EP2261349A3 (en) * | 1998-05-01 | 2012-01-11 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
US20070026021A1 (en) | 1998-05-01 | 2007-02-01 | Chiron S.R.I. | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
US6615024B1 (en) * | 1998-05-01 | 2003-09-02 | Arraycomm, Inc. | Method and apparatus for determining signatures for calibrating a communication station having an antenna array |
US5990085A (en) * | 1998-05-04 | 1999-11-23 | Michigan State University | Inhibin-HBc fusion protein |
GB9810276D0 (en) | 1998-05-13 | 1998-07-15 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
US6248329B1 (en) * | 1998-06-01 | 2001-06-19 | Ramaswamy Chandrashekar | Parasitic helminth cuticlin nucleic acid molecules and uses thereof |
EP1144998A3 (en) * | 1998-10-09 | 2002-08-07 | Chiron Corporation | Neisseria genomic sequences and methods of their use |
CA2359486A1 (en) | 1999-01-15 | 2000-07-20 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Neisseria meningitidis polypeptide basb052 |
AU2292800A (en) | 1999-01-22 | 2000-08-07 | Smithkline Beecham Biologicals (Sa) | Neisseria meningitidis antigenic polypeptides, corresponding polynucleotides andprotective antibodies |
GB9902084D0 (en) | 1999-01-29 | 1999-03-24 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
PT1154790E (pt) * | 1999-02-26 | 2005-03-31 | Chiron Srl | Reforco da actividade bactericida de antigenios contra a neisseria com oligonucleotidos contendo motivos cg |
WO2000066791A1 (en) | 1999-04-30 | 2000-11-09 | Chiron Corporation | Neisseria genomic sequences and methods of their use |
WO2000066741A2 (en) * | 1999-04-30 | 2000-11-09 | Chiron S.P.A. | Conserved neisserial antigens |
GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
EP1860191A3 (en) * | 1999-05-19 | 2008-02-13 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Combination neisserial compositions |
GB9916529D0 (en) * | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
ES2541830T3 (es) * | 1999-10-29 | 2015-07-27 | Novartis Vaccines And Diagnositics S.R.L. | Péptidos antigénicos de Neisseria |
CN1433471A (zh) * | 1999-11-29 | 2003-07-30 | 启龙股份公司 | 85kgDa奈瑟球菌的抗原 |
GB9928676D0 (en) | 1999-12-03 | 2000-02-02 | Provalis Uk Ltd | Pseudomonas aeruginosa antigens |
US20010031268A1 (en) * | 1999-12-17 | 2001-10-18 | Baldwin Thomas John | Antigen preparations |
EP2275129A3 (en) | 2000-01-17 | 2013-11-06 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Outer membrane vesicle (OMV) vaccine comprising N. meningitidis serogroup B outer membrane proteins |
WO2001055182A1 (en) | 2000-01-25 | 2001-08-02 | The University Of Queensland | PROTEINS COMPRISING CONSERVED REGIONS OF NEISSERIA MENINGITIDIS SURFACE ANTIGEN NhhA |
ES2281409T3 (es) * | 2000-02-28 | 2007-10-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Expresion heterologa de proteinas de neisseria. |
CA2407352A1 (en) | 2000-04-21 | 2001-11-01 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of acne vulgaris |
US20040005667A1 (en) | 2000-07-03 | 2004-01-08 | Giuloi Ratti | Immunisation against chlamydia pneumoniae |
GB0017149D0 (en) | 2000-07-12 | 2000-08-30 | Chiron Spa | Helicobacter pylori mutants |
GB0103170D0 (en) | 2001-02-08 | 2001-03-28 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine composition |
US20040073294A1 (en) * | 2002-09-20 | 2004-04-15 | Conor Medsystems, Inc. | Method and apparatus for loading a beneficial agent into an expandable medical device |
GB0103424D0 (en) * | 2001-02-12 | 2001-03-28 | Chiron Spa | Gonococcus proteins |
GB0118249D0 (en) | 2001-07-26 | 2001-09-19 | Chiron Spa | Histidine vaccines |
AU2002330681C1 (en) | 2001-07-26 | 2015-04-02 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccines comprising aluminium adjuvants and histidine |
GB0121591D0 (en) * | 2001-09-06 | 2001-10-24 | Chiron Spa | Hybrid and tandem expression of neisserial proteins |
JP4592284B2 (ja) | 2001-07-27 | 2010-12-01 | カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | 髄膜炎菌付着因子 |
MX339524B (es) | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
GB0129007D0 (en) * | 2001-12-04 | 2002-01-23 | Chiron Spa | Adjuvanted antigenic meningococcal compositions |
WO2004014419A1 (en) | 2002-08-02 | 2004-02-19 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine composition comprising transferrin binding protein and hsf from gram negative bacteria |
US7785608B2 (en) | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
DK2351579T3 (en) * | 2002-10-11 | 2017-01-09 | Novartis Vaccines And Diagnostics S R L | Polypeptide vaccines for broad protection against hypervirulent meningococcal lineages. |
GB0227346D0 (en) * | 2002-11-22 | 2002-12-31 | Chiron Spa | 741 |
WO2004065603A2 (en) | 2003-01-15 | 2004-08-05 | Wyeth Holdings Corporation | Methods for increasing neisseria protein expression |
EP2289546A3 (en) * | 2003-01-30 | 2011-03-30 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Injectable vaccines against multiple meningococcal serogroups |
CA2522751A1 (en) | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Wyeth Holdings Corporation | Novel immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
GB0315021D0 (en) * | 2003-06-26 | 2003-07-30 | Chiron Srl | Immunogenic gonococcal compositions |
EP1670506B1 (en) * | 2003-10-02 | 2012-11-21 | Novartis AG | Liquid vaccines for multiple meningococcal serogroups |
GB0323103D0 (en) * | 2003-10-02 | 2003-11-05 | Chiron Srl | De-acetylated saccharides |
GB0408977D0 (en) * | 2004-04-22 | 2004-05-26 | Chiron Srl | Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins |
GB0409748D0 (en) * | 2004-04-30 | 2004-06-09 | Chiron Srl | Lactoferrin cleavage |
GB0410866D0 (en) * | 2004-05-14 | 2004-06-16 | Chiron Srl | Haemophilius influenzae |
GB0419408D0 (en) * | 2004-09-01 | 2004-10-06 | Chiron Srl | 741 chimeric polypeptides |
EP2433647A3 (en) | 2005-01-27 | 2012-06-06 | Children's Hospital & Research Center at Oakland | GNA1870-based vesicle vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by Neisseria meningitidis |
GB0524066D0 (en) | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Chiron Srl | 741 ii |
AU2007229449A1 (en) | 2006-03-22 | 2007-10-04 | Novartis Ag | Regimens for immunisation with meningococcal conjugates |
TW200806315A (en) | 2006-04-26 | 2008-02-01 | Wyeth Corp | Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions |
CA2656474A1 (en) * | 2006-06-29 | 2008-01-03 | Novartis Ag | Polypeptides from neisseria meningitidis |
AR064642A1 (es) * | 2006-12-22 | 2009-04-15 | Wyeth Corp | Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi |
WO2008125985A2 (en) | 2007-04-11 | 2008-10-23 | Novartis Ag | Blocking interaction between pathogen factors and factor h to inhibit hemorrhagic syndromes |
MX2009013112A (es) | 2007-06-04 | 2010-03-01 | Novartis Ag | Formulacion de vacunas para meningitis. |
CA2716212A1 (en) | 2008-02-21 | 2009-08-27 | Novartis Ag | Meningococcal fhbp polypeptides |
WO2009111337A1 (en) * | 2008-03-03 | 2009-09-11 | Irm Llc | Compounds and compositions as tlr activity modulators |
EP2265640B1 (en) | 2008-03-10 | 2015-11-04 | Children's Hospital & Research Center at Oakland | Chimeric factor h binding proteins (fhbp) containing a heterologous b domain and methods of use |
WO2010028096A2 (en) | 2008-09-03 | 2010-03-11 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Peptides presenting an epitope of an a domain of factor h binding protein and methods of use |
IT1394288B1 (it) | 2008-09-12 | 2012-06-06 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Immunogeni di proteine che legano il fattore h. |
GB0819633D0 (en) | 2008-10-25 | 2008-12-03 | Isis Innovation | Composition |
US20120070458A1 (en) | 2009-03-24 | 2012-03-22 | Novartis Ag | Adjuvanting meningococcal factor h binding protein |
EP2719395A1 (en) * | 2010-09-01 | 2014-04-16 | Novartis AG | Adsorption of immunopotentiators to insoluble metal salts |
US9057716B2 (en) * | 2010-09-04 | 2015-06-16 | Novartis Ag | Bactericidal antibody assays to assess immunogenicity and potency of meningococcal capsular saccharide vaccines |
CA2810971C (en) * | 2010-09-10 | 2020-11-03 | Novartis Ag | Developments in meningococcal outer membrane vesicles |
CN108714212A (zh) * | 2011-05-11 | 2018-10-30 | 儿童医疗中心有限公司 | 多抗原提呈免疫原性组合物及其方法和用途 |
US9184727B2 (en) * | 2012-06-11 | 2015-11-10 | Phonon Corporation | SAW device and method for post-seal frequency trimming |
-
2001
- 2001-02-28 ES ES01914109T patent/ES2281409T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-28 MX MXPA02008314A patent/MXPA02008314A/es active IP Right Grant
- 2001-02-28 DK DK01914098T patent/DK1261723T3/da active
- 2001-02-28 CN CNB2003101036036A patent/CN100334214C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-28 US US10/220,480 patent/US20040092711A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-28 CN CN2010101656630A patent/CN101906413A/zh active Pending
- 2001-02-28 PT PT06076718T patent/PT1790660E/pt unknown
- 2001-02-28 JP JP2001563611A patent/JP4763210B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-28 DK DK10178586.3T patent/DK2270030T3/da active
- 2001-02-28 CN CNB2003101028453A patent/CN100473663C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-28 RU RU2002125882/13A patent/RU2299906C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-02-28 CN CN200510116305XA patent/CN1800385B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-28 JP JP2001563609A patent/JP4846160B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-28 WO PCT/IB2001/000420 patent/WO2001064920A2/en active IP Right Grant
- 2001-02-28 US US10/220,481 patent/US7803387B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-28 DK DK06076718.3T patent/DK1790660T3/da active
- 2001-02-28 DE DE60144353T patent/DE60144353D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-28 AT AT08075111T patent/ATE503837T1/de active
- 2001-02-28 EP EP08075111A patent/EP1947187B9/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-28 PT PT08075111T patent/PT1947187E/pt unknown
- 2001-02-28 CN CNB018087388A patent/CN100339482C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-28 AT AT01914109T patent/ATE352631T1/de active
- 2001-02-28 AU AU3947801A patent/AU3947801A/xx active Pending
- 2001-02-28 AT AT01914098T patent/ATE387502T1/de active
- 2001-02-28 MX MXPA02008313A patent/MXPA02008313A/es active IP Right Grant
- 2001-02-28 CN CN2007101391568A patent/CN101139590B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-28 AU AU2001239488A patent/AU2001239488B2/en not_active Ceased
- 2001-02-28 DK DK08075111.8T patent/DK1947187T5/da active
- 2001-02-28 CA CA2875231A patent/CA2875231A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-28 BR BR0108713-4A patent/BR0108713A/pt active Pending
- 2001-02-28 DE DE60126249T patent/DE60126249T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-28 WO PCT/IB2001/000452 patent/WO2001064922A2/en active IP Right Grant
- 2001-02-28 AU AU3948801A patent/AU3948801A/xx active Pending
- 2001-02-28 RU RU2002125880/13A patent/RU2304617C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-02-28 NZ NZ521531A patent/NZ521531A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-02-28 ES ES06076718T patent/ES2391153T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-28 ES ES01914098T patent/ES2299476T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-28 PT PT10178586T patent/PT2270030E/pt unknown
- 2001-02-28 EP EP10178586A patent/EP2270030B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-28 CA CA2744921A patent/CA2744921C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-28 BR BR0108711-8A patent/BR0108711A/pt not_active Application Discontinuation
- 2001-02-28 NZ NZ521396A patent/NZ521396A/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-02-28 AU AU2001239478A patent/AU2001239478B2/en not_active Ceased
- 2001-02-28 CA CA2689666A patent/CA2689666C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-28 EP EP01914098A patent/EP1261723B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-28 PT PT01914098T patent/PT1261723E/pt unknown
- 2001-02-28 EP EP10178655A patent/EP2270031A3/en not_active Ceased
- 2001-02-28 EP EP06076718A patent/EP1790660B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-28 ES ES08075111T patent/ES2360746T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-28 CN CNB018087507A patent/CN1201011C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-28 DE DE60132978T patent/DE60132978T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-28 ES ES10178586T patent/ES2386534T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-28 EP EP01914109A patent/EP1259627B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-28 CA CA2400570A patent/CA2400570C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-28 CA CA2400562A patent/CA2400562C/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-11-05 HK HK04106762A patent/HK1064120A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2003-11-05 HK HK03107975A patent/HK1055993A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2003-11-19 HK HK03108413A patent/HK1056197A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2003-11-19 HK HK05103907.1A patent/HK1071147A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-02-25 US US11/067,260 patent/US9267163B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-04-19 CY CY20071100540T patent/CY1106532T1/el unknown
-
2008
- 2008-04-30 CY CY20081100464T patent/CY1107447T1/el unknown
-
2010
- 2010-06-28 US US12/825,210 patent/US8114960B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-12-24 JP JP2010288968A patent/JP5346004B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-01-12 JP JP2011004414A patent/JP2011101657A/ja active Pending
- 2011-06-27 CY CY20111100604T patent/CY1111591T1/el unknown
- 2011-12-29 US US13/340,549 patent/US8703914B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-08-13 CY CY20121100728T patent/CY1113032T1/el unknown
- 2012-09-19 CY CY20121100861T patent/CY1113477T1/el unknown
- 2012-09-27 JP JP2012214120A patent/JP2013005816A/ja not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-07-03 CY CY2013025C patent/CY2013025I2/el unknown
- 2013-07-04 LU LU92240C patent/LU92240I2/fr unknown
- 2013-07-15 NL NL300605C patent/NL300605I2/nl unknown
- 2013-09-18 JP JP2013192617A patent/JP5941027B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-03-18 JP JP2014054817A patent/JP2014121333A/ja active Pending
- 2014-04-03 US US14/244,806 patent/US20140294885A1/en not_active Abandoned
- 2014-07-31 US US14/448,792 patent/US9150898B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-04-11 JP JP2016078708A patent/JP2016128520A/ja active Pending
- 2016-12-02 US US15/368,429 patent/US20170080076A1/en not_active Abandoned
- 2016-12-02 US US15/368,435 patent/US20170080077A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2304617C2 (ru) | Гибридная экспрессия белков neisseria | |
AU2001239478A1 (en) | Hybrid expression of neisserial proteins | |
ES2609039T3 (es) | Nuevas composiciones inmunogénicas para la prevención y tratamiento de enfermedad meningocócica | |
US6258359B1 (en) | Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions, and nucleic acid sequences encoding said polypeptides | |
US6248330B1 (en) | Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions, and nucleic acid sequences encoding said polypeptides | |
JPH10504444A (ja) | モラクセラ・カタルハリス(Moraxella catarrhalis)に対するワクチン | |
JP4358909B2 (ja) | 歯周炎の診断および治療用のポルフィロモナス・ジンジバリス抗原 | |
EP1017714A1 (en) | SYNTHETIC PEPTIDE CONSTRUCTS FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF PERIODONTITIS ASSOCIATED WITH $i(PORPHYROMONAS GINGIVALIS) | |
WO1996034624A1 (en) | Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions, and nucleic acid sequences encoding said polypeptides | |
AU2004201216A1 (en) | Hybrid expression of Neisserial proteins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180301 |