CZ303515B6

CZ303515B6 - Adjuvantní prostredek

Info

Publication number: CZ303515B6
Application number: CZ20013774A
Authority: CZ
Inventors: Friede@Martin; Garcon@Nathalie; Hermand@Philippe
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date: 1999-04-19
Filing date: 2000-04-04
Publication date: 2012-11-07
Also published as: PL351893A1; DE60014076T2; US6544518B1; HUP0200815A2; NO331688B1; NO20015073D0; US7399472B2; ATE276758T1; DE60014076D1; AU4114900A; DK1187629T3; CN1227030C; JP2008063342A; KR100922031B1; PL203951B1; CA2370697C; JP4897547B2; US20080311156A1; JP2007191491A; HK1044484A1

Abstract

Predkládaný vynález se týká adjuvantních prostredku, které jsou vhodné pro použití ve vakcínách. Adjuvantní prostredky podle predkládaného vynálezu obsahují saponin a imunostimulacní oligonukleotid, poprípade spolu s nosicem. Predkládaný vynález také poskytuje vakcíny obsahující adjuvans podle predkládaného vynálezu a antigen. Dále se poskytují zpusoby výroby adjuvantních prostredku a vakcín podle predkládaného vynálezu a jejich použití jako léku. Predkládaný vynález se týká adjuvantních prostredku, které obsahují saponin ve forme liposomu a imunostimulacní oligonukleotid obsahující nemethylovaný dinukleotid CpG, použití techto prostredku pri výrobe vakcíny pro prevenci virových, bakteriálních a parazitárních infekcí, alergie, rakoviny, atd., a vakcinacního prostredku je obsahující.

Description

Ad ju van tni prostředek

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových adjuvantních prostředků pro použití ve vakcínách. Adjuvantní prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují kombinaci saponinu a imunostimulačního oligonukleotidu, kde tato kombinace popřípadě dále obsahuje nosič. Předkládaný vynález také poskytuje vakcíny obsahující adjuvantní prostředky podle předkládaného vynálezu a alespoň io jeden antigen. Dále se poskytují způsoby výroby adjuvantních prostředků a vakcín podle předkládaného vynálezu ajejich použití jako farmaceutických prostředků. Předkládaný vynález dále popisuje způsoby léčení jednotlivce vnímavého k onemocnění nebo trpícího onemocněním, parenterálním podáváním nebo podáváním přes sliznice vakcín podle předkládaného vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Imunostimulační oligonukleotidy obsahující nemethylované dinukleotidy CpG („CpG“) jsou v oboru známé pro své adjuvantní účinky při podávání jak systémově, tak i přes sliznice (WO 96/02555, EP 468520, Davis a další, J. Immunol, 1998, 160(2): 870 - 876; McCluskie a Davis, J. Immunol., 1998, 161(9): 4463 - 6). CpG je zkratka pro dinukleotidové motivy cytosinguanosin přítomné v DNA. Historicky bylo pozorováno, že frakce DNA BCG by mohla mít antitumorové účinky. V dalších studiích bylo ukázáno, že syntetické oligonukleotidy odvozené od genových sekvencí BCG jsou schopné indukovat imunostimulační účinky (jak in vitro, tak in vivo). Autoři těchto studií došli k závěru, že tuto aktivitu nesly určité palindromické sekvence včetně centrálního motivu CG. Centrální úloha motivu CG při imunostimulaci byla později osvětlena v publikaci Krieg, Nátuře 374, p546, 1995. Podrobná analýza ukázala, že motiv CG musí být v kontextu určité sekvence, a že tyto sekvence jsou běžné u bakteriální DNA, ale vyskytují se zřídka v DNA obratlovců. Imunostimulační sekvence má často následující strukturu:

purin, purin, C, G, pyrimidin, pyrimidin; kde motiv dinukleotidu CG není methylovaný, ale je známo, že imunostulační účinky mají i jiné nemethylované sekvence CpG, které mohou být použity v předkládaném vynálezu.

V některých kombinacích těchto šesti nukleotidů je přítomna palindromická sekvence. Ve stej35 ném oligonukleotidu může být přítomno několik těchto motivů, bud jako opakování jednoho motivu nebo jako kombinace různých motivů. Přítomnost jedné nebo více těchto imunostimulačních sekvencí obsahujících oligonukleotidy může aktivovat různé podskupiny imunitního systému, včetně přirozených buněk - zabíječů (které produkují interferon γ a mají cytolytickou aktivitu) a makrofágů (Wooldrige a další, díl 89 (no. 8), 1977). Nyní však bylo ukázáno, že imuno40 modulační účinky mají i další nemethylované sekvence obsahující CpG, které nemají tuto konvenční sekvenci.

CpG, jestliže se formuluje do vakcín, se obecně podává ve volném roztoku spolu s volným antigenem (WO 96/02555; McCluskie a Davis, výše), nebo kovalentně konjugovaný k antigenu (zve45 řejněná PCT přihláška WO 98/16247), nebo se formuluje s nosičem jako je hydroxid hlinitý ((povrchový antigen hepatitidy, Hepatitis surface antigen) Davis a další, výše; Brazolot-Millan a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 1998, 95(26), 15553 - 8).

Saponiny se popisují v publikaci Lacaille-Dubois, M. a Wagner H. (1996, A review of the biolo50 gical and pharmacological activities of saponins, Phytomedicine, díl 2, str. 363 - 386). Saponiny jsou steroidy nebo triterpenové glykosidy, které jsou široce rozšířeny v rostlinách a mořských živočiších. Saponiny jsou charakteristické vytvářením koloidních roztoků ve vodě, které při třepání pění, a srážením cholesterolu. Jestliže se dostanou saponiny do blízkosti buněčných membrán, vytvářejí v membráně struktury podobné pórům, které způsobí prasknutí membrány. Pří55 kladem tohotojevu je hemolýza erythrocytů, což je vlastnost některých, ale ne všech saponinů.

- 1 CZ 303515 B6

Saponiny jsou známé jako adjuvantní látky u vakcín pro systémové podávání. Adjuvantní a hemolytická aktivita jednotlivých saponinů byla důkladně studována (Lacaille-Dubois a Wagner, výše). Například Quil A (odvozený z kůry jihoamerického stromu Quillaja saponaria Molina) a jeho frakce, se popisují v US 5 057 540 v článku „Saponins as vaccine adjuvants“, Kensil, C. R., Crit. Rev. Ther. DrugCarrier. Syst., 1996, 12(1-2); 1 - 55; a EP 0 362 279 Bl.

Částicové struktury nazývané imunostimulační komplexy (Immune Stimulating Complexes (ISCOMS)), které obsahují frakce Quil A, jsou hemolytické a byly používány při výrobě vakcín (Morein, B., EP 0 109 942 Bl). Ukázalo se, že tyto struktury mají adjuvantní aktivitu (EP 0 109 942 B1; WO 96/11711).

Hemolytické saponiny QS21 a QS17 (frakce Quil A čištěné HPLC) se popisují jako silná systémová adjuvans, a způsob jejich výroby se popisuje v US patentu 5 057 540 a EP 0 362 279 BL V těchto odkazech se také popisuje použití Q27 (nehemolytická frakce Quil-A), který působí jako silné adjuvans pro systémové vakcíny. Použití QS21 se dále popisuje v Kensil a další (1991, J. Immunology, díl 146, 431 - 437). Kombinace QS21 a polysorbátu nebo cyklodextrinu jsou rovněž známé (WO 99/10008). Adjuvantní systémy ve formě částic obsahující frakce Quil A, jako je QS21 a QS7, se popisují ve WO 96/33739 a WO 96/11711.

Jiné saponiny, které se používaly při studiích systémové vakcinace, zahrnují látky odvozené od jiných rostlinných druhů jako je Gypsophila a Saponaria (Bomford a další, Vaccine, 10(9): 572 577, 1992).

Je známo, že se saponiny také používají při studiích vakcín aplikovaných pres sliznice, přičemž takové vakcíny dosahovaly při indukci imunitních odpovědí střídavých výsledků. Saponin Quil A neměl podle dosavadních studií žádný vliv na indukci imunitní odpovědi, jestliže byl antigen podáván intranazálně (Gizurarson a další, 1994, Vaccine Research 3, 23 - 29). Další autoři však používali toto adjuvans úspěšně (Maharaj a další, Can. J. Microbiol., 1986, 32(5): 414 - 20; Chavali a Campbell, Immunobiology, 174(3): 347 - 59). Struktury ISCOM obsahující saponin Quil A byly používány v intragastrických a intranazálních vakcinačních formulacích a prokázaly adjuvantní aktivitu (Mel Mowat a další, 1991, Immunology, 72, 317-322; Mel Mowat a Donachie, Immunology Today, 12, 383 - 385).

QS21, netoxická frakce Quil A, byla také popsána jako orální nebo intranazální adjuvans (Sumino a další, J. VitoL, 1998, 72(6): 4931 - 9; WO 98/56415). Bylo také popsáno použití jiných saponinů při studiích intranazální vakcinace. Například saponiny Chenopodium quinoa se používaly jak v intranazálních, tak i intragastrických vakcínách (Estrada a další, Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 1998, 21(3): 225 - 36).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká překvapivého zjištění, že kombinace imunostimulačních oligonukleotidů (CpG) a saponinů jsou extrémně účinná adjuvans. Poskytuje se tedy adjuvantní prostředek obsahující kombinaci saponinu a imunostimulačního oligonukleotidu, kde imunostimulační olígonukleotid obsahuje nemethylovaný dinukleotid CpG a saponin je ve formě liposomu. Adjuvans podle předkládaného vynálezu dále obsahuje nosič. Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu působí saponin a oligonukleotidy v adjuvantních a vakcinačních prostředcích synergicky při indukci protilátky specifické pro antigen, a jsou účinné při indukci imunitních odpovědí běžně spojovaných s imunitním systémem typu Thl. Adjuvantní kombinace tedy nejsou vhodné pouze pro imunoprofylaxi onemocnění, ale překvapivě také pro imunoterapii onemocnění, jako jsou přetrvávající virové, bakteriální nebo parazitické infekce, a také chronická onemocnění jako je rakovina.

Výhodné oligonukleotidy pro použití v adjuvantních prostředcích nebo vakcínách podle předkládaného vynálezu s výhodou obsahují dva nebo více motivů dinukleotidu CpG oddělených alespoň třemi, s výhodou alespoň šesti nebo více nukleotidy. Oligonukleotidy podle předkládaného vynálezu jsou typicky deoxynukleotidy. Ve výhodném provedení je vazba mezi nukleotidy v oligonukleotidů fosforodithioátová, nebo výhodněji fosforothioátová vazba, ačkoli do rámce vynálezu patří také fosfodiesterové a jiné vazby mezi nukleotidy, včetně oligonukleotidů se smíšenými intemukleotidovými vazbami. Způsoby výroby fosforothioátových oligonukleotidů nebo fosforodithiátových oligonukleotidů se popisují v patentech US 5 666 153, US 5278 302 a WO 95/26204.

io

Příklady výhodných oligonukleotidů mají následující sekvence. Sekvence s výhodou obsahují fosforothiátové modifikované mezinukleotidové vazby.

OLIGO 1 (SEQ ID No. 1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)

OLIGO 2 (SEQ ID No. 2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)

OLIGO 3 (SEQ ID No. 3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

OLIGO 4 (SEQ ID No. 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)

OLIGO 5 (SEQ ID No. 5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)

Alternativní oligonukleotidy CpG mohou obsahovat výhodné sekvence výše, ve kterých jsou obsaženy delece nebo adice, které do sekvence nepatří.

Oligonukleotidy CpG používané v předkládaném vynálezu mohou být syntetizovány jakýmkoli způsobem známým v oboru (např. EP 468 520). Takové oligonukleotidy mohou být syntetizovány výhodně s použitím automatického syntezátoru.

Oligonukleotidy používané v předkládaném vynálezu jsou typicky deoxynukleotidy. Ve výhodném provedení je vazba mezi nukleotidy (intemukleotidová vazba) fosforodithioátová, nebo s výhodou fosforothioátová vazba, ačkoli do rámce předkládaného vynálezu patří také fosfodiestery. Jsou zahrnuty oligonukleotidy obsahující rozdílné intemukleotidové vazby, například směsné fosforothioátové fosfodiestery. Mohou být také použity další intemukleotidové vazby, které stabilizují oligonukleotid.

Mezi saponiny, které mohou být použity v adjuvantních kombinacích podle předkládaného vynálezu, patří látky odvozené z kůry Quillaja Saponaria Molina, nazývané Quil A, a jejich frakcí, popisovaných vUS 5 057 540 ačlánku „Saponins as vacci ne adjuvans“, Kensil, C. R., Crit. Rev.

Ther. Drug Carrier. Syst., 1996, 12(1-2): 1 - 55; a EP 0 362 279 Bl. Zvláště výhodné frakce Quil Ajsou QS21, QS7 aQS17.

Další výhodné hemolytické saponiny pro použití v adjuvantních prostředcích podle předkládaného vynálezu obsahuje β-escin. Escin se popisuje v Merckově indexu (12. vyd., položka 3737) jako směs saponinů, které se vyskytují ve stromu koňském kaštanu, lat: Aesculus hippocastanum.

-3CZ 303515 B6

Jeho izolace se provádí chromatografickým čištěním (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)), a iontoměničovým i pryskyřicemi (Erbring a další, US 3,238,190), Byly vyčištěny frakce escinu a a β, u kterých bylo zjištěno, že jsou biologicky účinné (Yoshikawa M., a další, {Chem. Pharm. Bull. (Tokio), srpen 1996; 44(8): 1454 - 1464)). β-escin je také známý pod názvem „aescin“.

Další výhodný hemolytický saponin pro použití v předkládaném vynálezu je digitonin. Digitonin se popisuje v Merckově indexu (12. vyd., položka 3204) jako saponin odvozený ze semen Digitalis purpurea a čištěný postupem popsaným v Gisvold a další, J. Am. Pharm. Assoc., 1934, 23, to 664; a Ruhenstroth-Bauer, Physiol. Chem., 1955, 301, 621. Popisuje se jeho použití jako klinického reakčního činidla pro stanovení cholesterolu.

Adjuvantní kombinace podle předkládaného vynálezu dále obsahují nosič, takže saponin nebo

CpG nebo obě tyto složky mohou být asociovány s jednotkou nosiče ve formě částice pro zvýšení is adjuvantního účinku kombinace. Zvláště výhodné systémové vakcíny obsahují například molekulu nosiče. CpG používaný v adjuvantních kombinacích podle předkládaného vynálezu může být ve volném roztoku nebo může být v komplexu s nosiči ve formě částic, jako jsou minerální soli (například bez omezení solí hliníku nebo vápníku), liposomy, komplexy ISCOM, emulze (olej ve vodě, voda v oleji, voda v oleji ve vodě), polymery (jako bez omezení kyselina poly20 mléčná, kyselina polyglykolová, polyfosfasin, polyaminokyselina, alginát, chitosan) nebo mikročástice. Výhodné nosiče jsou kationtové. Vakcíny podle předkládaného vynálezu dále obsahují antigen, který může být asociován s komplexem CpG-nosič, nebo nemusí být asociovány s komplexem CpG-nosič. V tomto případě může být antigen volná suspenze nebo suspenze asociovaná s odděleným nosičem.

Saponiny, které jsou součástí předkládaného vynálezu, mohou být oddělené ve formě micel, nebo mohou být ve formě velkých uspořádaných struktur jako jsou ISCOM (EP 0 109 942 Bl) nebo liposomy (WO 96/33739), při formulaci s cholesterolem a lipidem, nebo mohou být ve formě emulze typu olej ve vodě (WO 95/17210). Saponiny mohou být s výhodou asociovány s kovovou solí jako je hydroxid hlinitý nebo fosforečnan hlinitý (WO 98/15287 definuje pro tento význam termín „alum“). Alternativně může být saponin asociován s nosičem ve formě částic, jako je chitosan. Saponin může být také v suchém stavu ve formě prášku. Konečné formulace ve formě, jak jsou podány na povrch sltznice vakcíny, mají s výhodou hernolytickou povahu. Saponin může nebo nemusí být asociován fyzicky s antigenem buď přímou vazbou nebo společnou interakcí se stejnou molekulou nosiče ve formě částic (GB 9822712.7; WO 98/16247). CpG a saponin v adjuvantních prostředcích nebo vakcínách podle předkládaného vynálezu mohou být samy oddělené nebo asociované. Například CpG a saponin mohou být ve formě volné suspenze nebo mohou být asociovány prostřednictvím nosiče, výhodněji nosiče ve formě částic jako je hydroxid hlinitý nebo kationtový liposom nebo imunostimulační komplex ISCOM.

Výhodná adjuvantní kombinace podle předkládaného vynálezu je složena z jednoho nebo více oligonukleotidů CpG obsahující alespoň 3, s výhodou alespoň 6 nukleotidů mezi dvěma sousedícími motivy CG, spolu s QS21 a nosičem ve formě částic zvoleným ze skupiny emulze typu olej ve vodě nebo DQ. Nej výhodněji obsahuje adjuvantní kombinace CpG 2006 (SEQ ID No. 4), nebo CpG 1758 (SEQ ID No. 2) nebo CpG 1826 (SEQ ID No. 1) ve směsi sQS21, a nosič ve formě částic zvolený ze skupiny emulze typu olej ve vodě nebo DQ. Zvláště výhodné vakcíny tedy obsahují například takové adjuvantní kombinace a antigen. Výhodná vakcína podle předkládaného vynálezu se používá pro vyvolávání systémových imunitních odpovědí po systémovém podání jednotlivci.

Adjuvantní kombinace podle předkládaného vynálezu mohou být používány jak pomocí systémového podávání, tak i podávání přes sliznice. V jedné konkrétní formě podle vynálezu se poskytuje systémová vakcína pro podávání systémovou nebo parenterální cestou, jako je intramuskulámí, intradermální, transdermální, subkutánní, intraperitoneální nebo intravenózní podá55 vání. výhodný způsob podávání je transdermální, například ve formě náplastí na kůži.

-4CZ 303515 B6

Systémové vakcinační prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být používány pro ochranu nebo léčení savce, který je vnímavý nebo který trpí onemocněním, prostřednictvím podávání uvedené vakcíny intramuskulámí, intraperitoneální, intradermální, transdermální, intra5 venózní nebo subkutánní cestou. Způsoby systémového podávání vakcinačních prostředků mohou zahrnovat běžné stříkačky a jehly nebo zařízení navržená pro balistické dodávání pevných vakcín (WO 99/27961), nebo zařízení pro tlakové vstřikování kapaliny bez jehly (US 4 596 556; US 5 993 412), nebo transdermální náplasti (WO 97/48440; WO 98/28037). Předkládaný vynález může být také použit pro zesílení imunogenicity antigenů aplikovaných na kůži (transdermální io nebo transkutánní dodávání podle WO 98/20734; WO 98/28037). Předkládaný vynález proto poskytuje dodávací zařízení pro systémové podání, které je předem naplněné vakcinační mi nebo adjuvantními prostředky podle předkládaného vynálezu. Popisuje se způsob indukce imunitní odpovědi u jednotlivce, který zahrnuj podávání vakcíny obsahující antigen a imunosti mu lačního oligonukleotidu a saponinu a nosiče jednotlivci, kde vakcína se podává parenterálně nebo systé15 mově. Výhodné metody indukce imunitní odpovědi zahrnují podávání vakcíny obsahující oligonukleotid SEQ ID No. 1,2, 3, 4 nebo 5, se saponinem odvozeným z Quil A, jako je QS21, a nosičem, jako je emulze typu olej ve vodě, liposom s obsahem cholesterolu nebo alum (hydroxid hlinitý),

Vakcinační prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být alternativně používány pro ochranu nebo léčení savce vnímavého k onemocnění nebo trpícího onemocněním prostřednictvím podávání uvedené vakcíny pres sliznici, jako je orální/al i mentám í nebo nazální způsob. Alternativní způsoby podávání pres sliznice jsou intravaginální a intrarektální. Výhodný způsob podávání přes sliznice je nazální způsob, který se nazývá intranazální vakctnace. Metody intranazální vakcinace jsou v oboru dobře známy, včetně podávání kapiček, spreje nebo suché práškové formy vakcíny do nosohltanu imunizovaného jednotlivce. Součástí vynálezu jsou také nebulizované nebo aerosolované vakcinační prostředky. Součástí vynálezu jsou také enterícké formulace, jako jsou gastrorezistentní kapsle a granule pro orální podávání a čípky pro rektální nebo vaginální podávání,

Adjuvantní kombinace podle předkládaného vynálezu představují třídu adjuvans podávaných přes sliznice, vhodných pro aplikaci u lidí pro náhradu systémové vakcinace vakcínací přes sliznice. Ve výhodné formě předkládaného vynálezu mohou být použity v kombinaci s imunostimulačními oligonukleotidy čisté saponiny jako je Quil A, nebo jeho deriváty, včetně QS21; escin;

digitonin; nebo saponiny Gypsophila nebo saponiny Chenopodium quinoa jako adjuvans pro podávání antigenů přes sliznice pro dosažení systémové imunitní odpovědi.

Adjuvantní kombinace podle předkládaného vynálezu se používají při formulaci vakcín, kde tyto vakcíny mohou být podávány systémovým způsobem nebo přes sliznice. Jestliže se vakcíny pou40 žívají pro podávání přes sliznice, adjuvantní kombinace s výhodou obsahuje hemolytický saponin.

Pro podávání přes sliznice obsahuje prostředek podle vynálezu s výhodou hemolytický saponin. Hemolytický saponin nebo saponinový preparát ve významu podle předkládaného vynálezu se zjišťuje následujícím testem,

1. Čerstvá krev morčat se promyje fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem (PBS) 3x ve stolní centrifuze. Po resuspendování na původní objem se krev dále lOx zředí v PBS.

2. 50 μΐ této krevní suspenze se přidá do 800 μΐ PBS obsahujícího dvojnásobná ředění povrchově aktivní látky nebo saponinu.

3. po 8 h se vizuálně nebo měřením optické hustoty supematantu zjišťuje hemolýza. Přítomnost červeného supematantu, který absorbuje světlo při 570 nm, ukazuje na přítomnost herno lýzy.

-5 CZ 303515 B6

4. Výsledky se vyjádří jako koncentrace prvního ředění saponinu, při které se již hemolýza nevyskytuje,

Pro úěely předkládaného vynálezu je saponinový adjuvantní prostředek hemolytický, pokud lyžuje erythrocyty v koncentraci méně než 0,1 %. Pro referenci je možno uvést, že v podstatě čisté vzorky saponinu Quil A, QS21, QS7, digitoninu a β-escinu jsou všechny hemolytické saponíny, tak jak je definováno tímto testem. V rámci nezbytné experimentální variability takového biologického stanovení mají saponiny podle předkládaného vynálezu s výhodou hemolytickou ío aktivitu v koncentraci přibližně mezi 0,5 až 0,00001 %, výhodněji mezi 0,05 až 0,00001 %, ještě výhodněji mezi 0,005 až 0,00001 %, a nej výhodněji mezi 0,001 až 0,0004 %. V ideálním případě by měly mít uvedené saponiny hemolytickou aktivitu (tj. v rámci desetinásobného rozdílu) podobnou hemolytické aktivitě QS21.

Vakcíny podle předkládaného vynálezu mohou být také podávány orálním způsobem. V takových případech může farmaceuticky přijatelná pomocná látka obsahovat také alkalické pufry nebo enterosolventní kapsle nebo mikrokapsle. Vakcíny podle předkládaného vynálezu mohou být také podávány vaginálně. V takových případech mohou mezi farmaceuticky přijatelné pomocné látky patřit také emulgátory, polymery jako je CARBOPOL®, ajiné známé stabilizátory vaginálních krémů a čípků. Vakcíny podle předkládaného vynálezu mohou být podávány rektálně. V takových případech mohou mezi pomocné látky patřit také vosky a polymery známé v oboru výroby rektálních čípků.

Součástí vynálezu mohou být také prostředky obsahující v adjuvantních kombinacích podle vynálezu více než jeden saponin. Patří sem také kombinace alespoň dvou látek z následující skupiny zahrnující QS21, QS7, Quil A, β-escin nebo digitonin. Navíc mohou prostředky podle předkládaného vynálezu obsahovat kombinace více než jednoho i munosti mu lačního oligonukleotidu.

V podobném provedení předkládaného vynálezu mohou být kombinace CpG/saponin jak pro systémové, tak i mukosální podávání, dále kombinovány s jinými adjuvans, včetně monofosforyllipidu A a jeho netoxického derivátu 3-de-O-acylováného monofosforyllipidu A. Alternativně mohou být saponinové formulace kombinovány s vakcinačními vehikuly složenými zchitosanu nebo jiných póly kat iontových polymerů, polylaktidových a polylaktíd-ko-glykolidových částic, polymemími matricemi založenými na poly-N-acetylglukosaminu, částicemi slože35 nými z polysacharidů nebo chemicky modifikovaných polysacharidů, liposomy a částicemi na bázi lipidů, částicemi složenými z monoesterů glycerolu apod. Saponiny mohou být také formulovány v přítomnosti cholesterolu za vytvoření struktur ve formě částic, jako jsou liposomy nebo komplexy ISCOM. Navíc mohou být saponiny formulovány společně s polyoxyethylenovým etherem nebo esterem, buď v roztoku nebo suspenzi, které nejsou ve formě částic, nebo ve struktuře ve formě částic, jako je paucilamelámí liposom nebo ISCOM. Saponiny mohou být také formulovány s pomocnými látkami jako je Carbopol* pro zvýšení viskozity, nebo mohou být formulovány ve formě suchého prášku s práškovou pomocnou látkou jako je laktóza.

De-O-acylovaný monofosforyllipid A je dobře známé adjuvans vyráběné firmou Ribi Immu45 nochem, Montana. Může být připraveno způsoby popisovanými vGB2122204B. Výhodná forma 3 De-O-acylováného monofosforyllipidu A je forma emulze s malou velikostí částic o průměru méně než 0,2 pm (EP 0 689 454 Bl). Zvláště výhodná adjuvans jsou kombinace 3DMPL a QS21 (EP0 671 948 Bl), emulze typu olej ve vodě obsahující 3D-MPL a QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414), nebo 3D -MPL formulovaný sjinými nosiči (EP 0 689 454 Bl).

Vakcinaění prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují s výhodou antigen nebo antigenní prostředek schopný vyvolat imunitní odpověď proti lidskému patogenů, kde tento antigen nebo antigenní prostředek je odvozen od viru H1V-1 (jako je tat, nef, gp!20 nebo gpl60), lidských herpetických virů, jako je gD nebo jeho deriváty, nebo protein Immediate Early protein, ICP27 zHSVl nebo HSV2, cytomegaloviru ((esp Human) (jako je gB nebo jeho deriváty), rotaviru

-6CZ 303515 B6 (včetně živých oslabených virů), viru Epstein-Barrové (jako je gp35O nebo jeho deriváty), viru Varicetla Zoster (jako je gpl, II a IE63), nebo od viru hepatitidy jako je virus hepatitidy B (například povrchový antigen hepatitidy B nebo jeho derivát), viru hepatitidy A, viru hepatitidy C a viru hepatitidy E, nebo od jiných virových patogenů, jako jsou paramyxoviry: respirační syncy5 tiálni virus (jako jsou proteiny F a G nebo jejich deriváty), virus parainfluenzy, virus spalniček, virus příušnic, lidské papillomaviry (například HPV6, 11, 16, 18), flaviviry (např. virus žluté horečky, virus Dengue, virus klíšťové encefalitidy, virus japonské encefalitidy) nebo virus chřipky (úplný živý nebo inaktivovaný virus, rozštěpený virus chřipky pomnožený ve vejcích nebo buňkách MDCK nebo celé virosomy chřipky (jak je popsáno v R. Gluck, Vaccine, 1992, io 10, 915 - 920) nebo jejich čištěné nebo rekombinantní proteiny, jako je HA, NP, NA nebo M, nebo jejich kombinace) nebo odvozený od bakteriálních patogenů jako je Neisseria spp., včetně N. gonorrhea a N. meningitidis (například kapsulámí polysacharidy a jejich konjugáty, proteiny vázající se na transferin, proteiny vázající se na laktoferin, PilC, adheriny); 5. pyrogenes (například proteiny M nebo jejích fragmenty, proteáza C5A, kyseliny lipoteichové), N. agalactiae, S.

mutans; H ducreyi; Moraxella spp., včetně ΛΖ catarrhalis, známá také jako Branhamella catarrhalis (například adhesiny a invasiny s vysokou a nízkou molekulovou hmotností); Bordatella spp., včetně B. pertussis (například pertactin, toxin černého kašle nebo jeho deriváty, vlákenný hemaglutinin, adenylátcykláza, fimbrie), B. parapertussis a B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., včetně M tuberculosis (například ESAT6, antigen 85A, -B nebo -C), M. bovis, M.

leprae, M avium, M paratuberculosis, M smegmatis; Legionella spp., včetně L. pneumophila; Escherichia spp., včetně enterotoxické E. coli (například faktory kolonizace, termolabilní toxin nebo jeho deriváty, termostabilní toxin nebo jeho deriváty), enterohemoragická E. coli, enteropatogenní E. coli (například toxin podobný shigatoxinu nebo jeho deriváty); Yibrio spp., včetně K cholerae (například cholerový toxin nebo jeho deriváty); Shigella spp., včetně S. sonnei, S.

dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp., včetně Y. enterocolitica (například protein Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp., včetně C. jejtmi (například toxiny, adhesiny a invasiny) a C. coli; Salmonella spp., včetně Š. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteridis; Listeria spp., včetně L. monocytogenes; Helicobacter. spp., včetně H. pylori (například ureáza, kataláza, vakuolační toxin); Pseudomonas spp., včetně P. aeruginosa; Staphylococcus spp., včetně 5.

aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., včetně E, faecalis. E. faexium; Clostridium spp., včetně C. tetani (například tetanový toxin ajeho deriváty); C. botulinum (například butolotoxin a jeho deriváty), C. difficile (například klostridiové toxiny A nebo B a jejich deriváty); Bacillus spp., včetně B. anthracis (například botulotoxin a jeho deriváty); Corynebacterium spp., včetně C. diphtheriae (například difierický toxin a jeho deriváty); Borrelia spp., včetně B. burgdorferi (například OspA, OspC, DbpA, DpbB), B. garinii (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (například OspA, OspC, DpbA, DpbB), B. andersonii (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., včetně E. equi a vyvolávající příčina lidské granulocytámí ehrlichiosy; Rickettsia spp., včetně R rickettsii; Chlamydia spp., včetně C. trachomatis (například MOMP, proteiny vázající se na heparin), C. pneumoniae (například MOMP, proteiny váza40 jící se na heparin), C. psittaci; Leptospira spp., včetně L. interrogans; Treponema spp., včetně T. palladium (například vzácné proteiny vnější membrány), T. denticola, I hyodysentariae·, nebo odvozený od parazitů jako je Plasmodium spp., včetně P. falciparum. Toxoplasma spp., včetně T. gondii (například SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba ssp., včetně E. histolytica; Babesia spp., včetně B. microti; Trypanosoma spp., včetně T. erozi; Giardia spp., včetně G. lamblia;

Leshmania spp., včetně L major; Pneumocystis spp., včetně P. carinii; Trichomonas spp., včetně T vaginalis; Schisostoma spp., včetně S. mansoni, nebo odvozený kvasinek jako je Candida spp., včetně C. albicans; Cryptococcus spp., včetně C. neoformans.

Další výhodné specifické antigeny M. tuberculosis jsou například Tb Rat2, Tb H9, Tb Ra35,

Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 a hTCCl (WO 99/51748). Mezi proteiny

M tuberculosis patří také fúzní proteiny a jejich varianty, kde alespoň dva, s výhodou tri polypeptidy M, tuberculosis jsou fúzovány do většího proteinu. Mezi výhodné fúze patří Ral2TbH9-Ra35, Erdl4-DPV~MTI, DPV-MTI-MSL, Erdl4-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erdl4DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748).

-7CZ 303515 B6

Mezi nej výhodnější anti geny pro chlamydie patří například protein s vysokou molekulovou hmotností (High Molecular Weight Protein, HWMP), (WO 99(17741) , ORF3 (EP366 412), a domnělé membránové proteiny (Pmp). Další antigeny Chlamydie vakcinového prostředku mohou být zvoleny ze skupiny popsané ve WO 99/28475.

Výhodné bakteriální vakcíny obsahují antigeny odvozené ze Streptococcus spp., včetně 5. pneumoniae (například kapsulámí polysacharidy a jejich konjugáty, PsaA, PspA, streptolysin, proteiny vázající se na cholin) a proteinový antigen pneumolysin (Biochem. Biophys. Acta, 1989, 67, 1007; Rubins a další, Microbial Pathogenesis, 25, 337 - 342), ajeho mutantní detoxikované deri10 váty (WO 90/06951; WO 99/03884). Další výhodné bakteriální vakcíny obsahující antigeny odvozené od Haemophilus spp., včetně H. influenzae typ B (například PRP a jeho konjugáty, netypovatelné H. influenzae, například OMP26, adhesiny s vysokou molekulovou hmotností, P5, P6, protein D a lipoprotein D, a fimbrin a peptidy odvozené od fimbrinu (US 5 843 464) nebo jejich varianty s větším počtem kopií nebo fúzní proteiny.

Deriváty povrchového antigenu hepatitidy B jsou dobře známé v oboru a zahrnují mj. povrchové antigeny PreSl, PreS2, uváděné v evropských patentových přihláškách EP-A-414 374; EP-A0304 578, a EP 198 474. V jednom výhodném provedení obsahuje vakcinační prostředek podle vynálezu antigen HIV-1, gpl20, zvláště jestliže je exprimován v buňkách CHO. V dalším prove20 dění obsahuje vakcinační prostředek podle vynálezu gD2t, jak bylo popsáno výše.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu obsahují vakcíny s obsahem nárokovaného adjuvans antigen odvozený z lidského papillomaviru (Human Papilloma Virus, HPV), který je považován za odpovědného za genitální bradavice (HPV 6 nebo HPV 11 a další), a viry HPV odpovědné za rakovinu čípku (HPV 16, HPV 18 a další).

Zvláště výhodné formy vakcín s preventivními nebo léčebnými účinky na genitální bradavice obsahují částice LI nebo kapsomery a fúzní proteiny obsahující jeden nebo více antigenů zvolených ze skupiny HPV 6 a HPV 11 proteinů E6, E7, LI a L2.

Nej výhodnější formy fúzního proteinu jsou: L2E7, jak se popisuje ve WO 96/26277, a protein D (l/3)-E7 popsaný v GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285).

Výhodná vakcína pro prevenci nebo léčení infekce nebo rakoviny čípku může obsahovat antige35 ny HPV16 nebo 18. Například monomery antigenu LI nebo L2 předkládané společně jako částice podobné viru (VLP) nebo samotný protein LI předkládaná samostatně ve VLP nebo struktuře kapsomeru. Tyto antigeny, částice podobné viru a kapsomery jsou o sobě známé, viz například WO 94/00152, WO 94/20137, WO 94/05792 a WO 93/02184.

Další časné proteiny mohou být zahrnuty samostatně nebo jako fúzní proteiny, jako jsou například E7, E2 nebo s výhodou E5; zvláště výhodná provedení zahrnují VLP obsahující fúzní proteiny L1E7 (WO 96/11272).

Zvláště výhodné antigeny HPV 16 obsahují časné proteiny E6 nebo E7, ve fúzi s nosičem pro45 teinu D za vytvoření fúzí protein D-E6 nebo E7 z HPV 16, nebo jejích kombinace; nebo kombinace E6 nebo E7 s L2 (WO 96/26277).

Alternativně mohou být předkládány časné proteiny E6 a E7 HPV 16 nebo 18 v jediné molekule, s výhodou fúzním proteinu protein D-E6/E7. Tato vakcína může popřípadě obsahovat jeden nebo oba proteiny E6 a E7 z HPV 18, s výhodou ve formě fúzního proteinu protein D - E6 nebo protein D - E7, nebo fúzního proteinu protein D E6/E7.

Vakcína podle předkládaného vynálezu může dále obsahovat antigeny z jiných kmenů HPV,s výhodou z kmenů HPV31 nebo 33.

-8 CZ 303515 Β6

Vakcíny podle předkládaného vynálezu dále obsahují antigeny odvozené z parazitů způsobujících malárii. Například mezi výhodné antigeny z Plasmodia falciparum patří RTS,S a TRAP, RTS je hybridní protein obsahující v podstatě veškerou C-koncovou část coirkumsporozoitálního (CS) proteinu P. falciparum navázanou přes čtyři aminokyseliny části preS2 povrchového antigenu hepatitidy B na povrchový (S) antigen hepatitidy B. Jeho plná struktura se popisuje v mezinárodní patentové přihlášce PCT/EP92/02591, zveřejněné pod číslem WO 93/10152, která nárokuje priority z UK patentové přihlášky 9124390.7. Při expresi v kvasinkách se RTS produkuje jako lipoproteinová Částice, a jestliže se společně exprimuje s antigenem S z HBV, produkuje směsnou částici známou jako RTS,S. Antigeny TRAP se popisují v mezinárodní patentové přihlášce PCT/GB89/00895, zveřejněné pod číslem WO 90/01496. Výhodné provedení předkládaného vynálezu je vakcína proti malárii, kde antigenní prostředek obsahuje kombinaci antigenů RTS,S a TRAP. Dalšími antigeny plasmodií, které jsou pravděpodobnými kandidáty na složky vícestupňové vakcíny proti malárii, jsou P, falciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAPI, RAP2, sekvestrin, PfEMPI, PÍ332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPI, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfsló, Pfs48/45, Pfs230 a jejich analogy v rodu Plasmodium spp.

Formulace mohou také obsahovat antitumorový antigen a mohou být použitelné pro imunoterapeutické léčení rakovin. Například adjuvantní formulace může nalézt použití s antigeny pro odmítání tumoru, například u rakoviny prostaty, mléčné žlázy, tlustého střeva a rekta, plic, pankreatu, ledvin, nebo melanomu. Mezi příklady antigenů patří antigeny MÁGE 1 a MÁGE 3 nebo jiné antigeny MÁGE (pro léčení melanomu), PRÁME, BAGE, nebo GAGE (Robbins a Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, str. 628 - 636; Van den Eynde a další, International Journal of Clinical & Laboratory Research (předloženo do tisku 1997); Correale a další (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293. Tyto antigeny se ovšem exprimuji v celé řadě typu tumorů jako je melanom, karcinom plic, sarkom a karcinom močového měchýře. Jiné antigeny specifické pro tumor jsou vhodné pro použití s adjuvantními prostředky podle předkládaného vynálezu a patří sem bez omezení gangliosidy specifické pro tumor, antigen specifický pro prostatu (PSA) nebo Her-2/neu, KSA (GA733), PAP, mamaglobin, MUC-1, karcinoembryonický antigen (CEA). Podle jednoho provedení předkládaného vynálezu se poskytuje vakcína obsahující adjuvantní prostředek podle vynálezu a antigen odmítání tumoru (tumor rejection antigen).

Zvláště výhodné provedení předkládaného vynálezu je provedení, ve kterém vakcíny obsahují tumorový antigen; tyto vakcíny mají překvapivou účinnost při léčení rakoviny, jako je rakovina prostaty, mléčné žlázy, kolorektální rakovina, rakovina plic, pankreatu, ledvin, vaječníků nebo melanom. Formulace mohou tedy obsahovat antigen spojený s tumorem, stejně jako antigeny asociované s mechanismy podporujícími tumor (například angiogenezi a invazi tumoru). Navíc patří mezi antigeny, které jsou zvláště významné pro použití ve vakcínách při léčení rakoviny, také membránový antigen specifický pro prostatu (Prostate-specific membráně antigen, PSMA), antigen prostatických kmenových buněk (Prostatě Stem Cell Antigen, PSCA), tyrosináza, survivin, NY-ESO1, prostáza, PS 108 (WO 98/50567), RAGE, LAGE, HAGE. Navíc může být tento antigen vlastní peptidový hormon jako hormon uvolňující gonadotropin s úplnou délkou (GnRH, WO 95/20600), krátký peptid o délce 10 aminokyselin použitelný při léčení mnoha druhů rakoviny nebo při imunokastraci.

Předpokládá se, že prostředky podle předkládaného vynálezu se budou používat pro formulaci vakcín obsahujících antigeny odvozené z Borellia spp. Tyto antigeny mohou například zahrnovat nukleovou kyselinu, antigen nebo antigenní preparáty odvozené od patogenu, rekombinantně vyrobené proteiny nebo peptidy a chimémí fúzní proteiny. Antigenem je zvláště OspA. OspA může být úplný zralý protein v lipidované formě, tak jak je poskytuje hostitelská buňka (E. coli), nazývaný Lipo-OspA, nebo ve formě nelipidovaného derivátu. Mezi takové nelipidované deriváty patří nelipidovaný fúzní protein NSl-OspA, který obsahuje prvních 81 N-koncových aminokyselin nestruktumího proteinu (NS1) viru chřipky, a úplný protein OspA, a další derivát, MDP-OspA je nelipidovaná forma OspA nesoucí tři dodatečné aminokyseliny na N~konci.

-9CZ 303515 B6

Vakcíny podle předkládaného vynálezu mohou být používány pro léčení nebo prevenci alergie. Takové vakcíny by obsahovaly antigeny specifické pro alergen (například Der pl) a antigeny nespecifické pro alergen (například peptidy odvozené od lidského IgE, včetně bez omezení Stanworthova dekapeptidu (EP 0 477 231 B1)).

Vakcíny podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro prevenci nebo léčení chronických onemocnění jiných než alergie, rakovina nebo infekční onemocnění. Tato chronická onemocnění jsou například ateroskleróza a Alzheimerova choroba.

Antigeny vhodné pro prevenci a léčení pacientů vnímavých nebo trpících Alzheimerovou neurodegenerativní chorobou, jsou zvláště N-koncový fragment o délce 39 až 43 aminokyselin (Αβ) amyloidního prekurzorového proteinu a malé fragmenty. Tento antigen se popisuje v mezinárodní patentové přihlášce WO 99/27944 - (Athéna Neurosciences).

Množství proteinu v každé vakcíně se volí jako množství, které indukuje v typických vakcínách imunoprotektivní odpověď bez významných nepříznivých vedlejších účinků. Toto množství bude záviset na tom, který specifický imunogen se použije a v jaké formě se předkládá. Obecně se očekává, že každá dávka bude obsahovat 1 až 1000 pg proteinu, s výhodou 1 až 500 pg, výhodněji 1 až 100 pg, nej výhodněji 1 až 50 pg. Optimální množství určité vakcíny je možno zjistit standardními studiemi, které zahrnují pozorování příslušných imunitních odpovědí u vakcinovaných pacientů. Po počáteční vakcinaci mohou pacienti dostat v příslušných intervalech jednu nebo několik zesilujících imunizaěních dávek. Taková vakcinační formulace může být aplikována na povrch sliznice savce buď v režimu uváděcí nebo zesilující vakcinace; nebo může být alternativně podávána systémově, například transdermální, subkutánní nebo intramuskulámí cestou. Množství imunostimulačních oligo nukleotidů nebo CpG v adjuvans nebo vakcínách podle předkládaného vynálezu je obecně malé, ale v závislosti na složení vakcíny může být v rozmezí 1 až 1000 pg na dávku, s výhodou 1 až 500 pg na dávku a výhodněji mezi 1 až 100 pg na dávku.

Množství saponinu pro použití v adjuvantních prostředcích podle vynálezu může být v oblasti 1 až 1000 pg na dávku, s výhodou 1 až 500 pg na dávku, výhodněji l až 250 pg na dávku a nejvýhodněji mezi 1 až 100 pg na dávku. Poměr CpG : saponin (hmotnost/hmotnost) bude proto v rozmezí 1 : 1000 až 1000 : 1, a typicky bude v rozmezí 1 : 100 až 100: 1, a s výhodou v rozmezí 1 : 10 až 1 : 1 nebo 1 : 1 až 10 : l, a nejvýhodněji 1:1,4:1 nebo 10 : 1.

Formulace podle předkládaného vynálezu mohou být použity jak k preventivním, tak i k léčebným účelům. Poskytuje se tedy použití kombinace saponinu a molekuly CpG při výrobě vakcíny pro prevenci a léčení virových, bakteriálních a parazitických infekcí, alergie, rakoviny a jiných nechronických onemocnění. Předkládaný vynález tedy popisuje způsob léčení savce vnímavého nebo trpícího infekčním onemocněním nebo rakovinou nebo alergií nebo autoimunitním onemocněním. V dalším provedení podle předkládaného vynálezu se poskytuje vakcína nebo adjuvantní kombinace obsahující saponin a CpG, jak se zde popisuje, pro použití jako lék. Vakcinační prostředek se obecně popisuje v publikaci New Trends and Developments in Vacci nes, ed. Voliér a další, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978.

Předpokládá se, že se prostředky podle předkládaného vynálezu budou používat pro sestavování vakcín obsahujících antigeny odvozené z široké řady zdrojů. Antigeny mohou například zahrnovat lidské, bakteriální nebo virové nukleové kyseliny, antigeny nebo antigenní preparáty odvozené z patogenu, antigeny nebo antigenní preparáty odvozené z tumoru, antigeny odvozené z hostitele, včetně peptidů odvozených z IgE, jako je dekapeptid IgE uvolňující histamin (známý jako Stanworthův dekapeptid), rekombinantně vyrobené proteiny nebo peptidy a chimémí fúzní proteiny.

Předkládaný vynález poskytuje systémový vakcinační prostředek obsahující antigen, saponin a imunostimulaČní oligonukleotid. Popisuje se způsob léčení jednotlivce vnímavého k onemocnění

- 10CZ 303515 B6 nebo trpícího onemocněním, podáváním prostředku tak jak se zde v podstatě popisuje, uvedenému jednotlivci systémovým způsobem. Popisuje se také způsob prevenci jednotlivce před postižením onemocněním zvoleným ze skupiny zahrnující infekční, bakteriální a virová onemocnění, parazitická onemocnění, rakoviny prostaty, mléčné žlázy, kolorektální rakoviny, rakoviny plic, pankreatu, ledvin, vaječníkům nebo melanom; nerakovinná chronická onemocnění, alergie, Alzheimerovu chorobu a aterosklerózu; který zahrnuje podávání prostředku v podstatě popisovaného v předkládaném vynálezu uvedenému jednotlivci systémovým způsobem.

Předkládaný vynález alternativně poskytuje vakcinační prostředek pro podávání přes sliznice, obsahující antigen a hemolytický saponin. Poskytuje se tedy způsob léčení jednotlivce vnímavého k onemocnění nebo trpícího onemocněním, podáváním prostředku tak jak se zde v podstatě popisuje, uvedenému jednotlivci na povrch sliznic.

Navíc se popisuje způsob indukce systémové imunitní odpovědi, specifické pro antigen u savce, který zahrnuje podávání prostředku obsahujícího antigen a hemolytický saponin uvedenému savci na povrch sliznice. Dále se popisuje způsob výroby vakcíny nebo adjuvans, který zahrnuje vložení saponinu a vložení molekuly CpG ajejich smísení s antigenem.

Mezi příklady vhodných farmaceuticky přijatelných pomocných látek pro použití v předkláda20 něm vynálezu patří voda, fyziologický roztok s fosfátovým pufrem a isotonické pufrační roztoky.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1: Títry IgG specifického pro OspA 14 dní po zesilující dávce podané nosní sliznicí.

Obr. 2: Titry LA2 specifického pro OspA 14 dní po zesilující dávce podané nosní sliznicí.

Obr. 3: Titry IgG v séru specifické pro kmeny chřipky 14 dní po zesilující dávce podané nosní sliznicí.

Obr. 4: Titry inhibice hemaglutinace (HAI) specifické pro kmen chřipky v séru 14 dní po zesi30 lující dávce podané nosní sliznicí.

Obr. 5: Titry LA2 specifického pro OspA u myší.

Obr. 6: gp!20-specifická lymfoproliferaění aktivita buněk sleziny z imunizovaných myší.

Aktivita specifická pro antigen je vyjádřena jako SI pro různé koncentrace antigenu pro všechny čtyři experimentální skupiny.

Obr. 7: Aktivita HBsAg-specifického CTL buněk sleziny imunizovaných myší. Buněčná aktivita efektoru byla testována zjišťováním uvolňování ⁵¹Cr z buněk P815 (prázdné kroužky) nebo s-transfekovaných buněk P815 (plné kroužky).

Obr. 8: Odpovědi HBsAg-specifických protilátek u imunizovaných myší. Titry specifických protilátek (vyjádřené jako EU/ml) a profily isotypů byly vyhodnocovány použitím testů

ELISA. Hodnoty ze spojených sér jsou uvedeny v tabulce a distribuce isotypů jsou rovněž znázorněny graficky.

Obr. 9: HBSAg- a gpl20-specifická lymfoproliferační aktivita buněk sleziny z imunizovaných myší. Aktivita specifická pro antigen je vyjádřena jako SI pro různé koncentrace antigenu pro všechny čtyři experimentální skupiny.

Obr. 10: HBsAg- a gpl20-specifická aktivita CTL buněk sleziny z imunizovaných myší. Aktivita efektoru v buňkách byla zjišťována stanovením uvolňování ^5ICr z kontrolních buněk (prázdné symboly) nebo buněk PS15 zpřístupňujících epitop HBsAg nebo gpl20 CTL (plné symboly).

Obr. 11: gpl20-specifické a HbsAg-specifické odpovědi protilátek u imunizovaných myší. Titry specifických protilátek (vyjádřeny v pg/ml) (obr. 11 A) a ísotypové profily byly vyhodnocovány použitím testů ELISA. Hodnoty ze spojených sér jsou ukázány v tabulce a

- II CZ 303515 B6 distribuce isotypů jsou také znázorněny graficky. Obr. 1 IB ukazuje obraz isotypů protilátek specifických pro gp!20.

Obr. 12: Vývoj středního růstu tumorů ve skupinách deseti zvířat v závislosti na čase. Předkládaný vynález je ilustrován bez omezení následujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Použití QS21 a CpG pro intranazální posilování (boosting) systémových protilátek proti LipoOspA

V tomto příkladu autoři vynálezu testovali, zda lytické saponiny jako je QS21 a imunostimulační látky jako je CpG byly schopny zesilovat synergickým způsobem systémové imunologické odpovědi na intranazální zesilující vakcinaci u myší. Samice myší Balb/c (5 zvířat ve skupině) stáří 8 týdnů byly imunizovány intramuskulámě materiálem lipo-OspA (1 pg) formulovaným na kamenci (50 pg). Po 3 měsících byla myším podána zesilující intranazální dávka (v anestézii) 10 pl roztoku (5 pl na nosní otvor, dodáváno ve formě kapiček pipetou) obsahujícího 5 pg lipoOspA v buď A: PBS; B: 20 pg CpG 1001 (TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT, Krieg 1826); C: 5 pg QS21 (získáno od Cambridge Biotech., USA); D: 20 pg CpG 1001 + 5 pg QS21; nebo E: intramuskulámí injekce 1 pg lipo-OspA adsorbovaného na kamenci (50 pg). Obr. 1 a 2 ukazují titry IgG specifického pro OspA a titry LA2 14 dnů po zesilující dávce podané nosní sliznici. Metody

Metoda ELISA pro měření koncentrace IgG specifického pro OspA v séru u myší

Imunologické destičky Maxisorp Nunc se potahují přes noc pri 4 °C v množství 50 pl/jamku roztoku 1 pg/ml OspA zředěného v PBS (v řadách B až H destičky), nebo 50 pl 5 pg/ml čištěného kozího anti-myšího Ig (Boehringer) v PBS (řada A). Volná místa na destičkách se blokují (1 h, 37 °C) saturačním pufrem: PBS s obsahem 1% BSA, 0,1% polyoxyethylensorbitanmonolaurátu (TWEEN 20), a 4% normálního bovinního séra (NBS), Potom se přidají dvojnásobná ředění směsi isotypů IgG získaná ředěním v saturačním pufru (50 pl na jamku) ve formě standardní křivky (směs myších monoklonálních protilátek IgGl, IgG2a a IgG2b firmy Sigma, počínaje koncentrací 200 ng/ml v řadě A), a vzorků séra (počínaje ředěním 1/100 v radách B až H) a destičky se inkubují 1 h 30 min při 37 °C. Destičky se potom promyjí (3x) promývacím pufrem (PBS, 0,1% polyoxyethylensorbitanmonolaurát (TWEEN 20)). Potom se inkubují přídavky biotinylovaného kozího anti-myšího IgG (Amersham) v ředění 1/5000 v saturačním pufru (50 pl/jamka) 1 h 30 min při 37 °C. Po třech promytích a následném přídavku konjugátu streptavidinu s křenovou peroxidázou (Amersham) se destičky pětkrát promyjí a inkubují při 20 min pri teplotě místnosti s 50 pl/jamka vyvíjecího pufru (OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) a H₂O₂ 0,03 % v 50mM citrátovém pufru pH 4,5). Vyvíjení se zastaví přidáním 50 pl/jamka H2SO4 2N. Při vlnových délkách 492 a 630 nm se odečítají optické hustoty na čtecím zařízení Biorad 3550 immunoreader. Titry protilátek se vypočtou čtyřparametrovou matematickou metodou s použitím softwaru SoftMaxPro,

Inhibiční test pro měření titrů protilátky podobné LA2 proti lipo-OspA v séru

Titry protilátek ve vakcínách byly studovány vzhledem k jejich specificitě podobné LA2. LA2 je myší monoklonální protilátka, která rozpoznává konformační epitop OspA na povrchu bakterie, a u které bylo ukázáno, že je schopná zabíjet B. burgdorferi in vitro a chránit myši proti laboratorně

- 12CZ 303515 B6 pěstovaným spirochetám (Schaible U. E. a další, 1990, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 87: 3768 3772). Navíc bylo ukázáno, že monoklonální protilátka LA-2 koreluje s baktericidními protilátkami a studie na lidských sérech rovněž ukázaly dobrou korelaci mezi celkovými titry IgG specifického proti OspA a titry LA-2 (při měření metodou ELISA).

Imunologické destičky Maxisorp Nunc se potahují přes noc při 4 °C 50 μϊ/jamka 0,5 pg/ml lipoOspA zředěného v PBS. Volná místa byla blokována saturačním pufrem l h při 37 °C (100 pl/jamka saturaěního pufru: PBS/BSA 1%/Tween 20 0,1 %/NBS 4%). Sériová dvojnásobná ředění monoklonální protilátky LA2 (mAb) byla ředěna v saturačním pufru (50 μϊ na jamku) počínaje io koncentrací 4 pg/ml za získání standardní křivky. Byla rovněž přidána ředění vzorků séra z vakcín (počínaje ředěním 1/10) a destičky byly inkubovány 2 h při 37 °C. Destičky byly promývány po inkubaci 3x směsí PBS/TWEEN 20 (0,1%). Do každé jamky byl přidán konjugát LA2-mAbperoxidáza (1/10 000) ředěný v saturačním pufru (50 μϊ/jamka) a inkubován 1 h při 37 °C. Po pěti promytích se destičky inkubují 20 min při teplotě místnosti (v temnu) s 50 pl/jamku vyvíjecího pufru (OPDA 0,4 mg/ml a H₂O₂ 0,03 % v 50mM citrátovém pufru pH 4,5). Reakce a vytváření zbarvení byly zastaveny H₂SO₄ 2N. Optické hustoty se odečítají při 492 a 630 nm použitím čtecího zařízení pro imunologii Biorad 3550. Titry protilátek podobné LA2 se počítají ětyřparametrovou matematickou metodou s použitím softwaru SoftMaxPro. Titry protilátky podobné LA2 byly zjištěny porovnáním se standardní křivkou.

Výsledky

CpG stejně jako QS21 podstatně zvyšují intranazální zesilující účinek u systémových protilátek proti Lipo-OspA. Navíc, jestliže se kombinují obě adjuvans, je jasně ukázán jejich synergický účinek na tyto odpovědi, zvláště co se týče protilátek LA2. Humorální odpovědi vyvolané v přítomnosti QS21 a CpG jsou podstatně vyšší než odpovědi indukované parenterální zesilující dávkou. Souhrnem je možno říci, že tyto výsledky jasně ukazují schopnost intranazálních formulací kombinovat lytický saponin a imunostimulační látku.

Příklad 2

Synergická kombinace QS21 a CpG pro zvýšení účinku intranazální zesilující dávky systémových protilátek proti viru chřipky

V tomto příkladu bylo zjišťováno, zda hemolytické saponiny jako je QS21 (viz příklad) a imunostimulační látky jako je CpG byly schopny zvyšovat synergíckým způsobem účinnost intranazální zesilující dávky na tvorbu systémových protilátek u myší, které byly aktivovány intranazálně inaktivovaným úplným virem chřipky.

Samice myší Balb/c (10 zvířat na skupinu), stáří 8 týdnů, byly nejprve aktivovány (primed) intranazálně trivalentním úplným virem chřipky inaktivovaným β-propiolaktonem (A/Perking/262/95; A/Johannes-burg/33/94; B/Panama/45/90; 5 pg HA/kmen) pro napodobení aktivace, ke které dochází přirozeně u lidí. Po 28 dnech byla myším intranazálně podána zesilující dávka (v anestézi) 20 μϊ roztoku (10 μϊ na nosní dírku, dodáváno ve formě kapiček pipetou) obsahujícího 1,5 pg HA/kmen trivalentního rozštěpeného úplného viru chřipky inaktivovaného β-propiolaktonem (stejné kmeny jako při aktivační imunizaci) v bud A: PBS; B: 50 pg CpG (TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT, Krieg 2006); C: 4,5 pg QS21 (získáno od firmy Cambridge Biotech, USA); D: 50 pg CpG + 4,5 pg QS21; nebo E: intramuskulámí injekcí 1,5 pg HA/kmen trivalent50 ního rozštěpeného viru chřipky (stejné kmeny jako při aktivační imunizaci). Antigeny chřipky byly dodány výrobcem SSD GmbH (Dresden, Německo).

Obr. 3 a 4 ukazují titry IgG specifické pro kmeny chřipky v séru a titry inhibice hemaglutinace (HAI) 14 dnů po zesilující dávce podané nosem.

- 13CZ 303515 B6

Metody

Metoda ELISA pro měření titrů IgG proti chřipce u myší

Imunologické destičky Maxisorp Nunc se potahují přes noc při 4 °C 50 μΙ/jamku 1 gg/ml antigenu úplného viru chřipky zředěného PBS (v řadách B až H destičky), nebo 50 μΐ 5 μ§/ιη1 čištěného kozího anti-myšího Ig (Boehringer), v PBS (řada A). Neobsazená místa na destičkách se blokují (1 h, 37 °C) s použitím saturačního pufru: PBS obsahující 1% BSA, 0,1% polyoxyethylenío sorbitanmonolaurát (TWEEN 20), a 4% normální bovinní sérum (NBS). Potom se přidají sériová dvojnásobná ředění směsi isotypů IgG zředěné v saturačním pufru (50 μΐ na jamku) jako standardní křivka (směs myších monoklonálních protilátek IgGl, IgG2a a IgG2b firmy Sigma, počínaje koncentrací 200 ng/ml v řadě A), a vzorky séra (počínaje ředěním 1/100 v řadách B až H) a provádí se inkubace 1 h 30 min při 37 °C. Destičky se potom promyjí (3x) promývacím pufrem (PBS, 0,1% polyoxyethylensorbitanmonolaurát (TWEEN 20)). Potom se inkubuje s biotinylovaným kozím anti-myším IgG (Amersham) ve zředění 1/5000 v saturačním pufru (50 μg/jamku) 1 h 30 min při 37 °C. Po třech promytích a následném přidání konjugátu streptavidin-křenová peroxidáza (Amersham), se destičky pětkrát promyjí a inkubují 20 min při teplotě místnosti 50 μΙ/jamku vyvíjecího pufru (OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) a H₂O₂ 0,03 % v 50mM citrátovém pufru pH 4,5). Vyvíjení se zastaví přídavkem 50 μΙ/jamku H2SO4 2N. Optické hustoty se odečítají při vlnových délkách 492 a 630 nm na čtecím zařízení pro imunologii Biorad 3550. Titry protilátek se vypočtou čtyřparametrovou matematickou metodou použitím softwaru SoftMaxPro. Úplný virus chřipky použitý pro potahování (kmen A/Perking/262/95) inaktivovaný β-propiolaktonem (BPL) byl dodán výrobcem SSD GmbH (Dresden, Německo).

Hemaglutinačni inhibiční (HAI) aktivita sérových protilátek specifických pro chřipku u myší

Na séra (25 μΐ) se nejprve působí 20 min při teplotě místnosti 100 μΙ borátového 0,5M pufru (pH 9) a 125 μΐ kaolinu firmy Dade Behring. Po centrifugaci (30 min, 3000 ot/min nebo 860 g) se odebere 100 μΐ supematantu (odpovídá ředění séra 1/10) a inkubuje se 1 h při 4 °C s 0,5% kuřecími červenými krvinkami. Supematant se po centrifugaci 10 min při 3200 ot/min (970 g) oddělí. Obě operace se provádějí pro eliminaci přirozených hemaglutinačních faktorů obsažených v séru. Potom se 25 μΐ zpracovaných sér ředí 25 μΐ PBS (sériová dvojnásobná ředění počínaje ředěním 1/20) v 96-jamkových destičkách Greiner. Přidá se úplný virus inaktivovaný BPL (25 μΙ/jamka) při koncentraci 4 hemaglutinaČní jednotky (HU, tj. ředění, které je čtyřnásobně nižší než poslední ředění, které vyvolá aglutinaci červených krvinek) na 30 min při teplotě místnosti za míchání. Potom se přidají kuřecí červené krvinky (25 μΙ/jamku) na 1 h při teplotě místnosti. Destičky se nakonec udržují přes noc při 4 °C před odečítáním. Titr HAI odpovídá poslednímu ředění séra, které inhibuje virem indukovanou hemaglutinaci,

Výsledky

CpG stejně jako QS21 nezlepšuje zvýšení koncentrací protilátek IgG nebo HAI proti kmenům chřipky po podání intranazální zesilující dávky. Když se však obě adjuvans kombinují, jasně se ukazuje synergický účinek na tyto odpovědi. Odpovědi HAI vyvolané v přítomnosti QS21 a CpG jsou podobné jako výsledky indukované parenterálním zesilujícím podáním. Tyto výsledky potvrzují schopnost intranazálních formulací kombinujících hemolytický saponin a imunostimulační látku. Ukazují také, že v této souvislosti může být účinných několik sekvencí CpG (Krieg 2006 v tomto příkladu a Krieg 1826 v příkladech 3 a 5).

- 14CZ 303515 Β6

Příklad 3

Synergická kombinace β-escinu a CpG pro zesílení systémových protilátek proti Lipo-OspA po intranazálním podání

V předkládaném příkladu se zjišťuje možnost, že by mohla být získána synergie podobná synergii pozorované mezi QS21 a CpG s jinými hemolytickými saponiny (viz příklad) jako je β-escin. Testuje se také nehemolytický saponin, kyselina lékořicová.

Samice myší Balb/c (6 zvířat ve skupině), stáří 8 týdnů, byly aktivovány intramuskulámě lipoOspA (1 pg) na kamenci (50 pg). Po třech měsících byly myším podány intranazálně (v anestézii) zesilující dávky 10 pl roztoku (5 pl do každé nosní dírky, podávání ve formě kapiček pipetou) obsahujícího 5 pg lipo-OspA buď v A: PBS; B; 50 pg CpG 1001 (TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT, Krieg 1826); C: 5 pg (3-escinu (firmy Sigma); D: 50 pg CpG 1001 + 5 pg βescinu; E: 5 pg kyseliny lékořicové (firmy Sigma); F: 50 pg CpG 1001 +5 pg kyseliny lékoricové, nebo G: intramuskulámí injekce 1 pg lipo-OspA adsorbovaný na alum (hydroxid hlinitý) (50 pg). Obr. 5 ukazuje titry LA2 specifické pro OspA 14 dnů po podání nazální zesilující dávky. Metody

Metody jsou stejné jako se popisuje podrobně v příkladu 1.

Výsledky β-Escin a CpG působí synergicky pro zvýšení koncentrace systémových protilátek LA2 po intranazálnt zesilující dávce. Tyto kombinace vyvolávají vyšší odpovědi protilátek než parenterální zesilující podání. Na druhé straně, této synergie se nedosáhne kombinací CpG s kyselinou lékořicovou.

Tyto výsledky i předcházející výsledky v této přihlášce společně ukazují schopnost CpG a různých hemolytických saponinů dosáhnout adjuvantních imunitních odpovědí synergickým způsobem.

Příklad 4

Studie imunogenicity s použitím RTS,S P. falciparum a gpl20 HIV-l formulovaných sCpG a/nebo DQS21

1. Popis experimentu

Pro vyhodnocení možného aditivního nebo synergického účinku oligonukleotidů CpG (CpG) a QS21 byly prováděny dvě studie imunogenicity na myších. Skupiny myší byly imunizovány RTS,S a gpl20 formulovaných sCpG a QS21 samostatně nebo v kombinaci. Tyto adjuvantní kombinace byly také testovány v přítomnosti nosiče A1(OH)₃ nebo emulze typu olej ve vodě (o/w).

Imunogenicita těchto formulací byla zjišťována po dvou parenterálních imunizacích. Séra byla analyzována na přítomnost protilátek specifických pro antigen a na distribuci isotypů protilátek. Pro vyhodnocování imunitních odpovědí zprostředkovaných buňkami byly používány buňky sleziny. Tyto buňky byly testovány na přítomnost cytotoxických T-lymfocytů (CTL) a lymfoproliferativních (lymfoproliferaěních) buněk.

- 15CZ 303515 B6

Tabulka I

Skupiny myší v experimentu 1

Skupina	Antigen	Adjuvans
1	RTS,S/gp120	CpG/DQS21
2	RTS,S/gp120	DQS21
3	RTS_tS/gp120	CpG/DQS21/AI(OH)₃
4	RTS,S/gp120	CpG/Al(OH)₃

Tabulka 2 io Skupiny myší v experimentu 2

Skupina	Antigen	Adjuvans
1	RTS,S/gp120	CpG
2	RTS,S/gp120	CpG/DQS21
3	RTS,S/gp120	CpG/QS21/emulze o/w

Formulace

2.1. Experiment 1 Postup formulace

Prostředky byly připravovány tři dny před každou injekcí. V případě potřeby byly RTS,S (10 gg) a gpl20 (10 gg) adsorbovány na 100 gg A1(OH)₃. V případě potřeby byl přidán MPL (5 gg) a byla provedena inkubace 30 min před přidáním pufru jako směsi desetinásobně koncentrovaného PBS pH 7,4 a H2O kromě skupiny bez DQ, po kterou byl jako pufr použit PO₄, NaCl 10/150 pH 6,8. Po 30 min byl v případě potřeby QS21 (5 gg) míchán s liposomy v hmotnostním poměru

QS21/cholesterol 1/5 (označováno jako DQ) a přidán k formulaci. O 30 min později bylo v případě formulací s oligo přidáno 100 gg CpG 30 min před přidáním 50 gg/min thiomersalu jako ochranné látky.

AI(OH)3 + RTS.S + gp120 - 1 hod - MPL - 30 min - předsměs -30 min DQ - 30 min - CpG - 30 min - Thio

Všechny inkubace byly prováděny při teplotě místnosti za míchání.

-16CZ 303515 B6

2.2. Experiment 2 Postup formulace

Sestavování prostředků se provádí pro obě injekce současně. Objem injekce u jedné myši je 100 pl. Jako ochranná látka se přidá 50 pg/ml thiomersalu.

Skupina 1 io RTS,S (10 pg) a gpl20 (10 pg) se zředí H2O a PBS pH 7,4 pro dosažení isotonického stavu. Po 30 min se adsorbují RTS,S a gpl20 na DQ (5 pg). Po 30 min adsorpce se formulace adsorbuje na CpG 1856(100 pg).

Skupina 2

RTS,S (10 pg) a gpl20 (10 pg) se zředí H₂O a PBS pH 7,4 pro dosažení isotonického stavu. Po 30 min se adsorbují RTS,S a gp 120 na DQ (5 pg). Po 30 min adsorpce se formulace adsorbuje na CpG 1856(100 pg).

Skupina 3

RTS,S (10 pg) a gpl20 (10 pg) se zředí H₂O a PBS pH 6,8 pro dosažení isotonického stavu. Po 5 min se formulace adsorbuje na emulzi typu olej ve vodě. Po 5 min adsorpce se tato formulace adsorbuje na QS21 (5 pg) před přidáním CpG (100 pg).

3. Imunologické metody

Devět myší F1 (Balb/C x C57B1/6) ve skupině dostalo do každé zadní tlapky 2x 50 pl vakcíny ve dvoutýdenních intervalech. O dva týdny později byla odebrána séra pro stanovení odpovědí pro30 ti látek a byly odebrány buňky sleziny pro zjištění imunitních odpovědí zprostředkovaných buňkami.

Pro lymfoproliferační analýzu byly buňky zaočkovány s použitím čtyřnásobných opakování do 95-jamkových mikrotitračních destiček s kulatým dnem na koncentraci 2x 10⁶ na ml. Buňky byly inkubovány 72 nebo 96 h v médiu RPMI-1640 doplněném protilátkami, glutaminem a 1% (obj,/obj.) normálním myším sérem v přítomnosti různých koncentrací RTS,S nebo antigenu gpl20. Kontrolní buňky byly kultivovány bez antigenu. Potom byly buňky přes noc pulzně značeny 1 pCi/jamku (37 kBq) [³H]-thymidinu, sklizeny a inkorporovaná radioaktivita byla zjišťována na beta-čítači. Výsledky jsou vyjádřeny jako střední počty impulzů za minutu (cpm).

Pro analýzu CTL byly buňky kultivovány 7 dnů v 6-jamkových destičkách v přítomnosti 10pg/ml syntetického peptidu pCMI003 (IPQSLDSWWTSL) odpovídajícího epitopu CTL HBsAg (Schimbeck a další, 1995) nebo peptidu pCM!007 (GIHIGPGRAFYAARK) odpovídajícího CTL epitopu gpl20 (Casement a další, 1995). Na konci kultivace byla u buněk zjišťována při použití dvojnásobného opakování cytolytická aktivita specifická pro HBsAg standardními testy s uvolňováním [⁵¹Cr] s použitím kontroly a S-transfekovaných buněk P815. Cytotoxicita specifická pro Gpl20 byla zjišťována použitím cílových buněk P815, které byly buď ponechány intaktní nebo byly pulzně značeny 1 h peptidem pCMI007. U cílových buněk bez efektorových buněk, popřípadě s přidáním 3% (obj./obj.) Tritonu X-100, bylo zjišťováno maximální a mini50 mální uvolňování. Výsledky jsou vyjádřeny jako procenta uvolňování [^5ICr] (cpm experimentální kultury - cpm spontánního uvolňování/cpm maximálního uvolňování - cpm spontánního uvolňování).

- 17CZ 303515 B6

Titrace a zjišťování isotypů spojených sér bylo prováděno standardním testem na imunosorbentu s navázaným enzymem (ELISA) s použitím destiček potažených HbsAg. Séra byla zředěna v PBS/BAS počínaje ředěním 1 : 400. Pro detekci navázaných protilátek byly použity biotinylované sekundární protilátky specifické pro Ig isotypů IgGl, IGg2a a lgG2b s následným přidáním konjugátu křenová peroxidáza - streptavidin. Titry ELISA byly vypočteny z referenčních hodnot pomocí programu SoftmaxPro a vyjádřeny v jednotkách ELISA (ELJ/ml). Titry protilátek specifických proti gpl20 byly zjišťovány standardní metodou ELISA s použitím destiček potažených proteinem gpl20. Séra byla zředěna směsí PBS/Tween20/BSA počínaje koncentrací 1 : 100. Pro detekci navázaných protilátek byly použity biotinylované sekundární protilátky specifické pro Ig nebo pro isotypy IgGl, IgG2a a IgG2b s následným přidáním konjugátu křenová peroxidáza streptavidin. Titry byly vypočteny proti standardním myším Ig a vyjádřeny v pg/ml.

4. Výsledky

Experiment 1

Analýza lymfoproliferačních odpovědí neukázala žádné významné rozdíly v reaktivitě na RTS,S mezi skupinami. Naopak skupiny 1 a 3 obsahující jak CpG, tak DQS21, ukázaly lepší gpl20specifické lymfoproliferační odpovědi než skupiny obsahující CpG nebo DQS21 samostatně (obr. 6).

V tomto experimentu byly měřeny pouze HBsAg-specifické CTL (cytotoxické T-lymfocyty). Nebyl žádný významný rozdíl v indukci CTL mezi skupinami 1 a 3, které dostaly CpG a DQS21 v kombinaci a skupinami 2 a 4 imunizovanými pouze jednou z těchto dvou adjuvantních složek, zatímco přítomnost A1(OH)₃ zmenšovala aktivitu CTL pozorovanou pro kombinaci CpG a DQS21 ve skupině 1 (obr. 7). Byl však pozorován trend, že CpG a DQS21 byly v kombinaci lepší než samostatný DQS21, a kombinace indukovala více CTL v přítomnosti A1(OH)₃ než samotný CpG (obr. 7).

Humorální imunitní odpověď u myší byla vyšetřována pouze pro přítomnost protilátek specifických pro HBsAg. Titry byly podobné ve všech skupinách kromě skupiny 3, která ukázala přibližně trojnásobné zvýšení, což ukazuje, že v přítomnosti A1(OH)₃ je kombinace DQS21 a CpG více imunogenní než samotný CpG (obr. 8). Distribuce isotypů byla podobná pro skupiny 3 a 4 obsahující A1(OH)₃, zatímco v nepřítomnosti A1(OH)₃ indukovala kombinace CpG a DQS21 silnější isotypový obraz podobný T_Hi než samotný DQS21 (obr. 8).

Experiment 2

V tomto experimentu byly lymfoproliferační odpovědi specifické pro RTS,S a gpl20 velmi podobné. Údaje ukazují, že přídavek DQS21 (bud’ samostatně nebo s emulzí typu olej ve vodě) zvyšuje lymfoproliferační odpovědi na oba antigeny (obr. 9).

Odpovědi CTL byly vyhodnocovány s použitím peptidu epitopu CTL HBsAg i gpl20. V obou případech mohl být CTL detekován po imunizaci skupiny 1 samotným CpG (obr. 10). Přidání DQS21 však vedlo k podstatnému zvýšení CTL pro oba antigeny (obr. 10), Přítomnost emulze typu olej ve vodě buď neutralizovala kladný účinek DQS21 (gpl 20) nebo zvyšovala pozadí v testu in vitro (HBsAg).

Odpovědi protilátek na HBsAg a gpl20 se zvyšovaly přidáním DQS21 k adjuvans CpG (obr,

IA). Další zvýšení bylo pozorováno, jestliže byla ve formulaci zahrnuta emulze typu olej ve vodě (obr. 11 A). Přídavek DQS21 kCpG posunul isotypové profily gpl20 směrem k vyjádřenější T_Hi (obr. 11B), zatímco vliv na isotypové profily HBsAg byly v tomto experimentu vyjádřeny méně.

- 18CZ 303515 B6

5. Závěry

Imunizace RTS,S a gpl20 formulovaných s kombinací CpG a DQS21 vede k silným imunitním odpovědím specifickým pro antigen. Kombinace adjuvantních složek CpG a DQS21.

- zvyšuje lymfoproliferační odpovědi

- zvyšuje aktivitu CTL

- zesiluje titry protilátek a obrazy isotypu T_Hi ve srovnání s jednotlivými složkami.

Příklad 5

Terapeutický potenciál formulací CpG a/nebo DQS21 v modelu tumoru TC1

1. Návrh experimentu

Čtyři skupiny 10 myší C57bI/6 dostaly IO⁶ (200 pl) buněk TC1 (buňky tumoru exprimující E7) subkutánně v den 0 do boku.

Myši byly potom vakcinovány dvakrát ve dnech 14 a 21 po zkušebním podání tumoru 5 pg formulace PD1/3E7 HPV16 vstříknuté do tlapky. Růst tumoru byl měřen jednotlivě dvakrát týdně.

Skupiny myší:

1. Bez vakcíny

2. PD1/3E7 + CPG (10 pg ODN 2006)

3, PD1/3E7 + DQS21 (0,5 pg)

4. PD1/3 E7 + CPG + DQS21

Růst tumorů byl monitorován měřením jednotlivých tumorů dvakrát týdně.

2. Formulace

Sestavování prostředků bylo prováděno ve dnech injekce. Objem injekce pro jednu myš byl 100 pl. V případě potřeby byl PD1/3E7 (5 pg) zředěn H₂O a PBS pH 7,4 pro dosažení isotonic35 kého stavu. Po 5 min byl v případě potřeby QS21 (0,5 pg) smíchán s liposomy v hmotnostním poměru QS21/cholesterol 1/5 (označeno jako DQ) a přidán k formulaci. O 30 min později bylo přidáno k formulaci s oligo 10 pg CpG (ODN 2006) 30 min před přidáním 1 pg/ml thiomersalu jako ochranné látky.

H₂O + PBS pH 7,4 + PD1/3E7- 5 min + DQ - 30 min + CpG - 30 min Thio

3. Výsledky

Vývoj středního růstu tumorů ve skupinách 10 zvířat v závislosti na čase je ukázán na obr. 12. U 45 1 00 % zvířat, kterým byly podány tumorové buňky TC1 v množství 10⁶ docházelo k progresivnímu vývoji rostoucího tumoru.

až 80 % nevakcinovaných zvířat nebo zvířat vakcinovaných proteinem E7 v DQS21 uhynulo v den 35.

- 19CZ 303515 B6

Dvě vakcinace proteinem E7 formulovaným v DQS21 neměly téměř žádný vliv na růst tumoru. Naopak dvě vakcinace, IFP (dny 14, 21) s 5 pg ProtD 1/3 E7 HPV16 v adjuvans CPG indukovaly ústup těchto předem vytvořených tumorů a ochránily myši před uhynutím: 70 až 80 % myší bylo v den 35 ještě naživu. Kombinace dvou imunostimulačních látek CPG a DQS21 ukázala mírný prospěšný účinek ve srovnání s CpG použitým samostatně.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Adjuvantní prostředek obsahující saponin a imunostimulaČní oligonukleotid, vyznačující se tím, že imunostimulaČní oligonukleotid obsahuje nemethylovaný dinukleotid CpG a saponin je ve formě liposomů.
2. Adjuvantní prostředek podle nároku I, vyznačující se tím, že imunostimulaČní oligonukleotid je zvolený ze skupiny

TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (SEQ ID No. 1);

TCT CCC AGC GTG CGC CAT (SEQ ID No. 2); ACC GAT GAC

GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG (SEQ ID No. 3); TCG

TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (SEQ ID No. 4); TCC ATG

ACG TTC CTG ATG CT (SEQ ID No. 5).
3. Adjuvantní prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že imunostimulaČní oligonukleotid obsahuje alespoň dvě nemethylovaná opakování CG oddělená alespoň třemi nukleotidy.
4. Adjuvantní prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že imunostimulaČní oligonukleotid obsahuje alespoň dvě nemethylovaná opakování CG oddělená šesti nukleotidy.
5. Adjuvantní prostředek podle některého z nároků laž4, vyznačující se tím, že saponin je odvozený od QuilA.
6. Adjuvantní prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že derivátem QuilA jeQS21.
7. Vakcinační prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje adjuvantní prostředek podle některého z nároků l až 6 a dále obsahuje antigen.
8. Vakcinační prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že antigen je odvozený od organismu zvoleného ze skupiny: virus lidské imunitní nedostatečnosti, virus varicella zoster, virus herpes simplex typu 1, virus herpes simplex typu 2, lidský cytomegalovirus, virus dengue, virus hepatitidy A, B, C nebo E, respirační syncytiálnt virus, lidský papillomavirus, virus chřipky, virus Hib a virus meningitidy, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Streptococcus, Mycoplasma, Mycobacteria, Haemophilus, Plasmodium nebo Toxoplasma, Stanworthův dekapeptid; nebo antigenů spojených s tumorem (TAA), MÁGE, BAGE, GAGE, MUC-1, Her-2 neu, CEA, PSA, KSA nebo PRÁME; nebo vlastního peptidového hormonu, GnRH.

-20CZ 303515 B6
9. Vakcinační prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že antigen je odvozený ze skupiny zahrnující (a) antigeny spojené s tumorem PSMA, PSCA, tyrosináza, survivin, NY-ESO1, prostáza, PS108, RAGE, LAGE, HAGE; (b) nebo N-koncový fragment (Abeta) o délce 39 až 43 aminokyselin amyloidního prekurzorového proteinu; (c) nebo antigeny spojené

5 s aterosklerózou.
10. Vakcinační prostředek podle některého z nároků 7 až 9, vyznačující se tím, že vakcína je ve formě pro systémové podávání.

io
11. Vakcinační prostředek podle některého z nároků 7 až 9, vyznačující se tím, že vakcína je ve formě pro podávání přes sliznice.
12. Vakcinační prostředek podle nároku 11, vyznačující se tím, že saponin přítomný v adjuvantním prostředkuje hemolytický.
13. Vakcinační prostředek podle nároku 7 až 9 pro použití jako lék.
14. Použití adjuvantního prostředku podle některého z nároků 1 až 6 při výrobě vakcíny pro prevenci a léčení vírových, bakteriálních a parazitárních infekcí, alergie, rakoviny nebo jiných

20 chronických onemocnění.