ES2859673T3 - Vacunas que comprenden polipéptidos de nucleósido hidrolasa no específica y esterol 24-c-metiltransferasa (SMT) para el tratamiento y el diagnóstico de la leishmaniasis - Google Patents

Abstract

Un polipéptido de fusión que comprende una secuencia polipeptídica de esterol 24-c-metiltransferasa (SMT) de Leishmania y una secuencia polipeptídica de nucleósido hidrolasa (NH) no específica de Leishmania, en donde la secuencia polipeptídica de NH de Leishmania comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 3 y 5, o una secuencia que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 % o al menos 97 % de identidad con las mismas; y en donde la secuencia polipeptídica de SMT de Leishmania comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 9 y 11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 % o al menos 97 % de identidad con las mismas.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacunas que comprenden polipéptidos de nucleósido hidrolasa no específica y esterol 24-c-metiltransferasa (SMT) para el tratamiento y el diagnóstico de la leishmaniasis

Antecedentes

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente a composiciones y métodos para prevenir, tratar y detectar la leishmaniasis en pacientes. Más particularmente, la invención se refiere a composiciones y métodos que comprenden antígenos de Leishmania y polipéptidos de fusión, así como polinucleótidos que codifican dichos antígenos y polipéptidos de fusión.

Descripción de la técnica relacionada

Los organismos de Leishmania son parásitos intracelulares obligados que causan un amplio espectro clínico de enfermedades denominadas leishmaniasis. Los organismos de Leishmania son parásitos protozoarios intracelulares del género Leishmania. Los organismos de Leishmania se dirigen a los macrófagos del huésped; lo que causa así un amplio espectro de enfermedades clínicas en humanos y animales domésticos, principalmente perros. En algunas infecciones, el parásito puede permanecer inactivo durante muchos años. En otros casos, el huésped puede desarrollar una de las diversas formas de leishmaniasis. Las leishmaniasis se clasifican en tres tipos de enfermedades, leishmaniasis cutánea (CL), leishmaniasis mucosal (ML) y leishmaniasis visceral (VL), de acuerdo con las manifestaciones clínicas.

La leishmaniasis es un problema grave en gran parte del mundo, incluidos Brasil, China, África Oriental, India y áreas del Medio Oriente. La enfermedad también es endémica en la región mediterránea, incluidos el sur de Francia, Italia, Grecia, España, Portugal y el norte de África. El número de casos de leishmaniasis ha aumentado drásticamente en los últimos 20 años y ahora existen millones de casos de esta enfermedad en todo el mundo. Cada año se diagnostican alrededor de 2 millones de casos nuevos, el 25 % de los cuales son leishmaniasis visceral. Se ha informado leishmaniasis visceral (VL) en 88 países, pero cerca del 90 % de los casos de VL ocurren en Brasil, India, Sudán, Bangladesh y Nepal (Mendez y otros J Immunol 2001; 166(8): pp. 5122-8). Se estima que la incidencia anual es de aproximadamente 500000 casos de VL y la población en riesgo es de 350 millones (Engwerda y otros Eur J Immunol 1998; 28(2): pp. 669-80; Squires y otros J Immunol 1989; 143(12): pp. 4244-9). La leishmaniasis visceral, generalmente es causada por especies del complejo L. donovani, es decir, L. donovani y L. infantum (chagasi). L. donovani es el agente causante de la leishmaniasis visceral en África y Asia, L. infantum/chagasi en los países mediterráneos y en el Nuevo Mundo (Piedrafita y otros J Immunol 1999; 163(3): pp. 1467-72). La VL es una enfermedad debilitante grave que evoluciona con una infección visceral que afecta el bazo, el hígado y los ganglios linfáticos, que, si no se trata, es generalmente una enfermedad mortal. Los síntomas de la leishmaniasis visceral aguda incluyen hepatoesplenomegalia, fiebre, leucopenia, anemia e hipergammaglobulinemia. La VL activa es generalmente fatal a menos que se trate adecuadamente.

Los parásitos de Leishmania se transmiten por la picadura de jejenes y los promastigotes infectantes se diferencian y se reproducen como amastigotes dentro de los macrófagos del huésped mamífero. Al igual que otros patógenos intracelulares, las respuestas inmunitarias celulares son críticas para la protección contra la leishmaniasis. Las respuestas inmunitarias Th1 desempeñan un papel importante en la mediación de la protección contra Leishmania, que incluye los roles de las células T CD4+ y CD8+, IFN-^y, IL-12, TNF-a y NO, mientras que se han informado efectos inhibidores para IL-10 y TGF-p (Engwerda y otros Eur J Immunol 1998; 28(2): pp. 669-80; Murphy y otros Eur J Immunol. 2001; 31(10): pp. 2848-56; Murray y otros J Exp Med. 1999; 189(4): pp.741-6; Murray y otros Infect Immun.

2000; 68(11): pp. 6289-93; Squires y otros J Immunol 1989; 143(12): pp. 4244-96; Taylor y Murray. J Exp Med. 1997; 185(7): pp. 1231-9; Kaye y Bancroft. Infect Immun. 1992; 60(10): pp. 4335-42; Stern y otros J Immunol. 1988; 140(11): pp. 3971-7; Wilson y otros J Immunol. 1998; 161(11): pp. 6148-55).

La inmunización contra leishmaniasis en modelos animales puede afectarse por el suministro de vectores de ADN que codifican al antígeno (Gurunathan y otros J Exp Med. 1997; 186(7): pp. 1137-47; Piedrafita y otros J Immunol.

1999;163(3):1467-72; Mendez y otros J Immunol. 2001; 166(8): pp. 5122-8) o por administración de proteínas formuladas con adjuvantes que inducen Th1, incluidas IL-12 (Afonso y otros Science. 1994; 263(5144): pp. 235-7; Stobie y otros Proc Natl Acad Sci EE.UU. 2000; 97(15): pp. 8427-32; Kenney y otros J Immunol. 1999; 163(8): pp.

4481-8) o ligandos TLR tales como oligonucleótidos CpG (Rhee y otros J Exp Med. 2002; 195(12): pp. 1565-73; Stacey y Blackwell. Infect Immun. 1999; 67(8): pp. 3719-26; Walker y otros Proc Natl Acad Sci EE.UU. 1999; 96(12): pp. 6970-5) y monofosforil lípido A (Coler y otros Infect Immun. 2002; 70(8): pp. 4215-25; Skeiky y otros Vaccine.

2002; 20(2728): pp. 3292-303).

El documento WO2009/143006 divulga composiciones y métodos para prevenir, tratar y detectar la leishmaniasis. Las composiciones comprenden generalmente polipéptidos de fusión que comprenden múltiples antígenos de Leishmania, en particular, KMP11, SMT, A2 y/o CBP, o porciones o variantes inmunogénicas de los mismos, así como polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos de fusión.

A pesar de algunas evidencias de que las vacunas de subunidades pueden ser eficaces en ciertos modelos de VL (Basu y otros J Immunol. 2005; 174(11): pp. 7160-71; Stager y otros J Immunol. 2000; 165(12): pp. 7064-71; Ghosh y otros Vaccine. 2001; 20(12): pp. 59-66; Wilson y otros Infect Immun. 1995; 63(5): pp. 2062-9; Tewary y otros J Infect Dis. 2005; 191(12): pp. 2130-7; Aguilar-Be y otros Infect Immun. 2005; 73(2): pp. 812-9. Rafati y otros Vaccine.

2006; 24(12):2169-75), ha faltado progreso hacia la definición de candidatos a antígenos eficaces contra VL in vivo. Las estrategias que emplean vacunas que consisten en organismos completos para prevenir o tratar la leishmaniasis no han sido eficaces en humanos. Además, se necesitan reactivos más eficaces para diagnosticar con precisión la leishmaniasis en los pacientes. Por consiguiente, aún existe una necesidad significativa de composiciones inmunogénicas y vacunas que puedan prevenir, tratar y/o diagnosticar eficazmente la leishmaniasis en humanos y otros mamíferos (por ejemplo, caninos). La presente invención satisface estas necesidades y ofrece otras ventajas relacionadas.

Breve resumen

La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.

En pocas palabras, la presente invención proporciona composiciones, estuches y métodos para prevenir, tratar y detectar la leishmaniasis. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la invención, se proporcionan polipéptidos de fusión que comprenden al menos una secuencia polipeptídica de esterol 24-c-metiltransferasa (SMT) de Leishmania y una secuencia polipeptídica de nucleósido hidrolasa (NH) no específica de Leishmania, como se establece en las reivindicaciones.

Por ejemplo, en ciertas modalidades, un polipéptido de fusión como se describe en la presente descripción comprende secuencias que tienen al menos una porción inmunogénica de una proteína SMT y al menos una porción inmunogénica de una proteína NH como se establece en las reivindicaciones.

Una secuencia de NH de Leishmania usada en un polipéptido de fusión incluye una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con una secuencia de NH de Leishmania de L. donovani, L. infantum y L. major. Una secuencia polipeptídica de NH de Leishmania usada en un polipéptido de fusión de la invención comprende al menos una porción inmunogénica de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 3 y 5, o una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con las mismas como se establece en las reivindicaciones.

Una secuencia polipeptídica de SMT de Leishmania usada en un polipéptido de fusión o combinación de polipéptidos de la invención comprende al menos una porción inmunogénica de una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con una secuencia de SMT de Leishmania de L. donovani, L. infantum y L. major. Una secuencia de SMT de Leishmania usada en un polipéptido de fusión o combinación de polipéptidos de la invención comprende al menos una porción inmunogénica de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 9 y 11, o una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con las mismas, como se establece en las reivindicaciones.

En una modalidad más específica, un polipéptido de fusión o una combinación de polipéptidos de la invención comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 3 y 5, y además comprende una secuencia polipeptídica de SMT de Leishmania seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 9 y 11.

En una modalidad aún más específica, un polipéptido de fusión o una combinación de polipéptidos de la invención comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 13, o una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con la misma.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de fusión como se establece en las reivindicaciones.

Además, de acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende al menos un componente seleccionado de un polipéptido de fusión y/o un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión o una combinación de polipéptidos como se establece en las reivindicaciones, en combinación con al menos un inmunoestimulante. Se conocen muchos inmunoestimulantes y pueden usarse en las composiciones de la presente descripción, ejemplos ilustrativos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, un oligonucleótido que contiene CpG, lípido A sintético, MPL™, 3D-MPL™, saponinas, miméticos de saponina, AGP, agonistas de receptores de tipo Toll, o una combinación de los mismos. Otros inmunoestimulantes ilustrativos comprenden, por ejemplo, un agonista de TLR4, un agonista de TLR7/8 y/o un agonista de TLR9. Otros inmunoestimulantes más comprenden, por ejemplo, imiquimod, gardiquimod y/o resiquimod.

De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporciona un método para estimular una respuesta inmunitaria contra Leishmania en un mamífero que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una composición como se establece en las reivindicaciones.

En otro aspecto más de la invención, se proporciona un método para detectar la infección por Leishmania en una muestra biológica, que comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica con un polipéptido de fusión como se establece en las reivindicaciones; y (b) detectar en la muestra biológica la presencia de anticuerpos que se unen al polipéptido de fusión, lo que detecta así la infección por Leishmania en una muestra biológica. El método puede analizar cualquier tipo de muestra biológica adecuada, cuyos ejemplos ilustrativos pueden incluir, por ejemplo, sueros, sangre y saliva.

En ciertas modalidades de los métodos de diagnóstico divulgados, el polipéptido de fusión se une a un soporte sólido. Por consiguiente, la presente invención proporciona además reactivos de diagnóstico que comprenden un polipéptido de fusión como se describe en la presente descripción, inmovilizado sobre un soporte sólido.

También se proporcionan estuches de diagnósti

biológica, que generalmente comprenden un polipéptido de fusión como se describe en la presente descripción y un reactivo de detección. Se entenderá que el estuche puede emplear un polipéptido de fusión o una combinación de polipéptidos de la invención en cualquiera de una variedad de formatos de ensayo conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, un ensayo de tira de prueba de flujo lateral, un ensayo de plataforma de doble vía (DPP) y un ensayo ELISA. Estos estuches y composiciones de la invención pueden ofrecer valiosa información de diagnóstico en el punto de atención. Además, los estuches y composiciones también pueden usarse ventajosamente como estuches de prueba de curación para controlar el estado de la infección en un individuo infectado a lo largo del tiempo y/o en respuesta al tratamiento.

Estos y otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes con referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un esquema de un polipéptido de fusión de NS de Leishmania ilustrativo.

La figura 2 muestra los títulos de anticuerpos de punto final de IgG1 e IgG2a específicos a NS. Los ratones se inyectaron i.m. tres veces con 3 semanas de diferencia con solución salina, antígeno NS (10 pg) solo, NS (10 pg) GLA-SE (5 pg) o NS (10 pg) MPL-SE (20 pg). Se recolectó suero de ratones inmunizados 3 semanas después de la tercera inmunización. Las diluciones recíprocas medias se representan como el título de punto final (Log¹⁰) /- SE. La figura 3 muestra respuestas de células T INF-gamma específicas de NS en ratones Balb/c. Los ratones se inyectaron i.m. tres veces con 3 semanas de diferencia con solución salina, antígeno NS (10 pg) solo, NS (10 pg) GLA-SE (5 pg) o NS (10 pg) MPL-SE (20 pg). Los esplenocitos recolectados 3 semanas después del último refuerzo se cultivaron con medio o proteína de fusión NS (10 pg/mL) durante 72 horas. Los sobrenadantes de cultivo se analizaron para determinar la producción de IFN-y mediante un ELISA tipo sándwich.

La figura 4 muestra la protección contra la exposición a Leishmania donovani en un modelo de enfermedad Balb/c. Se inmunizaron s.c. ratones BALB/c 3 veces con 3 semanas de diferencia con 7,4 pg de NS (a) o 0,74 pg de NS (b) formulado con GLA-SE (5 pg) o MPL-SE (20 pg). Los ratones fueron retados i.c. con 5x106 promastigotes de L. donovani un mes después del último refuerzo y los hígados cosechados un mes después del reto. Las cargas parasitarias se estimaron mediante un ensayo de dilución limitante. Se muestran los números de parásitos individuales y medios (log¹⁰) de cada grupo de ratones. * P<0,05, *** P<0,001 por prueba t no apareada en comparación con el grupo de solución salina.

La figura 5 muestra los títulos de anticuerpos IgG específicos a NS determinados por ELISA en diferentes grupos de monos. Los anticuerpos contra NS se midieron al inicio del estudio (d-8) y luego nuevamente al d15, d36 y d64. Los grupos experimentales se han numerado como se enumera en la tabla I.

La figura 6 muestra el desarrollo de respuestas inmunes de células T inducidas por vacuna. Los sobrenadantes de WBA se analizaron para la producción de IFN-^y e IL-5 mediante el uso del ensayo Milliplex.

Breve descripción de los identificadores de secuencia

SEQ ID NO: 1 es una secuencia de aminoácidos para un polipéptido de nucleósido hidrolasa (NH) no específica de longitud completa de L. infantum.

SEQ ID NO: 2 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 3 es una secuencia de aminoácidos para un polipéptido de nucleósido hidrolasa (NH) no específica de longitud completa de L. donovani.

SEQ ID NO: 4 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 5 es una secuencia de aminoácidos para un polipéptido de nucleósido hidrolasa (NH) no específica de longitud completa de L. major.

SEQ ID NO: 6 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 7 es una secuencia de aminoácidos para un polipéptido de esterol 24-c-metiltransferasa (SMT) de longitud completa de L. infantum.

SEQ ID NO: 8 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 9 es una secuencia de aminoácidos para un polipéptido de esterol 24-c-metiltransferasa (SMT) de longitud completa de L. donovani.

SEQ ID NO: 10 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 9.

SEQ ID NO: 11 es una secuencia de aminoácidos para un polipéptido de esterol 24-c-metiltransferasa (SMT) de longitud completa de L. major.

SEQ ID NO: 12 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 11. SEQ ID NO: 13 es una secuencia de aminoácidos para un polipéptido de fusión NS ilustrativo de la invención.

SEQ ID NO: 14 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 13. Descripción detallada

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, ADN recombinante y química, que están dentro de los conocimientos de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual,

2da Ed., Sambrook y otros, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D. N.

Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis y otros, Patente de Estados Unidos No:

4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); y en Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, Baltimore, Maryland (1989).

La invención se expone en las reivindicaciones.

Como se señaló anteriormente, la presente invención se dirige generalmente a composiciones y métodos para prevenir, tratar y detectar la leishmaniasis. Las composiciones de la invención incluyen, por ejemplo, polipéptidos de fusión y combinaciones de polipéptidos que comprenden polipéptidos de esterol 24-c-metiltransferasa (SMT) y de nucleósido hidrolasa (NH) no específica de Leishmania, o porciones o variantes inmunogénicas de los mismos, en donde las porciones y variantes preferentemente conservan sustancialmente las mismas o similares propiedades inmunogénicas que un polipéptido de SMT y/o NH de longitud completa correspondiente, o un polipéptido de fusión o combinación de polipéptidos de los mismos. Las estrategias de inmunización que usan las composiciones de la invención pueden aplicarse a la protección in vivo contra, por ejemplo, L. infantum, L. donovani y L. major, que son agentes causantes de VL en humanos y perros. La presente invención también contempla, en otras modalidades, el uso de polipéptidos de fusión y combinaciones de polipéptidos descritos en la presente descripción en aplicaciones de diagnóstico, que incluyen, pero no se limitan a, serodiagnóstico y ensayos de sangre completa en pacientes y perros, preferentemente en un formato ameno para proporcionar resultados de diagnóstico rápido en el punto de atención, tales como un ensayo de flujo lateral o un ensayo de plataforma de doble vía.

Polipéptidos de fusión de leishmania y usos de los mismos

En un aspecto general, la divulgación proporciona polipéptidos de Leishmania aislados, como se describe en la presente descripción, que incluyen polipéptidos de fusión y composiciones que los contienen. Se entenderá que aunque la descripción siguiente se refiere principalmente a polipéptidos de fusión de la presente invención, las secuencias antigénicas unidas covalentemente en un polipéptido de fusión de la invención también pueden emplearse en combinaciones de polipéptidos en las que las secuencias antigénicas no están unidas covalentemente.

Por lo tanto, en ciertas modalidades, se divulgan un polipéptido de fusión o combinación de polipéptidos que contiene secuencias derivadas de o relacionadas con (estructural o inmunológicamente) las proteínas esterol 24-c metiltransferasa (SMT) y nucleósido hidrolasa (NH) no específica de Leishmania. Las secuencias de SMT y NH usadas en un polipéptido de fusión de la invención (o en una composición que comprende una combinación de polipéptidos de ^s M^t y NH separados) incluyen preferentemente aquellas capaces de provocar una respuesta inmunológica deseada y/o capaces de proporcionar protección contra la leishmaniasis en un modelo representativo in vivo. En determinadas modalidades relacionadas, el polipéptido de fusión comprende un fragmento de polipéptido (por ejemplo, una porción antigénica/inmunogénica), múltiples fragmentos de polipéptido o un polipéptido de longitud completa, derivado de las proteínas SMT y NH de Leishmania. Los polipéptidos de SMT y NH de Leishmania usados de acuerdo con la presente divulgación pueden, en ciertas modalidades, ser polipéptidos de SMT y/o NH de Leishmania derivados de L. donovani, L. major y/o L. infantum, o porciones o variantes inmunogénicas de los mismos como se describe en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, el término "polipéptido" abarca cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluidas proteínas de longitud completa, en donde los residuos de aminoácidos se unen por enlaces covalentes. Un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de un polipéptido de Leishmania puede consistir únicamente en una porción inmunogénica, puede contener dos o más porciones inmunogénicas y/o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales pueden derivarse de un polipéptido de Leishmania nativo o pueden ser heterólogas, y dichas secuencias heterólogas pueden (pero no es necesario) ser inmunogénicas.

Un "polipéptido aislado" es uno que se elimina de su entorno original. Por ejemplo, una proteína de origen natural se aísla si se separa a partir de algunas o de todas las técnicas coexistentes en el sistema natural. Preferentemente, dichos polipéptidos son al menos aproximadamente 90 % puros, con mayor preferencia al menos aproximadamente 95 % puros y con la máxima preferencia al menos aproximadamente 99 % puros. Un experto en la técnica apreciaría que también se podrían obtener fragmentos de polipéptidos antigénicos a partir de aquellos que ya están disponibles en la técnica. Los polipéptidos de la invención, sus fragmentos antigénicos/inmunogénicos y otras variantes pueden prepararse mediante el uso de técnicas convencionales recombinantes y/o sintéticas.

Las secuencias de SMT y/o NH usadas en un polipéptido o composición de fusión pueden ser polipéptidos de SMT y NH de longitud completa o sustancialmente completa, o variantes de los mismos como se describe en la presente descripción. Alternativamente, un polipéptido o composición de fusión puede comprender o consistir en porciones o fragmentos inmunogénicos de un polipéptido de SMT y/o NH de Leishmania de longitud completa, o variantes de los mismos.

En ciertas modalidades más específicas, una porción inmunogénica de un polipéptido de SMT y/o NH de Leishmania es una porción que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria (es decir, celular y/o humoral) en un paciente infectado actual o previamente con Leishmania (tal como un ser humano o un perro) y/o en cultivos de células de nódulos linfáticos o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas a partir de individuos infectados actualmente o previamente con Leishmania. Las células en las que se provoca una respuesta pueden comprender una mezcla de tipos de células o pueden contener células componentes aisladas (que incluyen, pero no se limitan a, células T, células NK, macrófagos, monocitos y/o células B). En una modalidad particular, las porciones inmunogénicas de un polipéptido de fusión de la invención son capaces de inducir la proliferación de células T y/o una respuesta de citoquinas predominantemente de tipo Th1 (por ejemplo, producción de IL-2, IFN-y y/o TNF-a por células T y/o células NK, y/o producción de IL-12 por monocitos, macrófagos y/o células B). Las porciones inmunogénicas de los antígenos descritos en la presente descripción pueden identificarse generalmente mediante el uso de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, que incluyen los métodos representativos resumidos en Paul, Fundamental Immunology, 5ta ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2003 y las referencias allí citadas. Dichas técnicas incluyen la detección de polipéptidos de fusión para determinar la capacidad de reaccionar con anticuerpos, antisueros y/o líneas o clones de células T específicos de antígeno. Como se usa en la presente descripción, los antisueros y anticuerpos son "específicos de antígeno" si se unen específicamente a un antígeno (es decir, reaccionan con la proteína en un inmunoensayo y no reaccionan de forma detectable con proteínas no relacionadas). Dichos antisueros y anticuerpos pueden prepararse como se describe en la presente descripción y mediante el uso de técnicas bien conocidas.

Las porciones inmunogénicas de un polipéptido de NH y/o SMT de Leishmania pueden tener esencialmente cualquier longitud; siempre que conserve una o más de las regiones inmunogénicas de SMT y/o NH que son responsables o contribuyen a la protección in vivo proporcionada contra la leishmaniasis por uno o más polipéptidos de fusión de la invención, como se divulga en la presente descripción. En una modalidad, la capacidad de una porción inmunogénica para reaccionar con antisueros específicos de antígeno puede mejorar o no modificarse, en relación con la proteína nativa, o puede disminuir en menos del 50 %, y preferentemente en menos del 20 %, en relación con la proteína nativa. Las porciones ilustrativas serán generalmente de al menos 10, 15, 25, 50, 150, 200, 250, 300 o 350 aminoácidos de longitud, o más, hasta e incluido el polipéptido de SMT y/o NH de longitud completa.

En una modalidad particular, las porciones inmunogénicas de un polipéptido de SMT y/o NH de Leishmania son aquellas que, cuando se usan en combinación, son capaces de proporcionar protección contra, por ejemplo, en un ensayo in vivo como se describe en la presente descripción, o serodiagnóstico de especies de Leishmania tales como L. donovani, L. major y/o L. infantum, que se cree que son agentes causantes de VL en humanos y perros. Además, las composiciones de la invención también pueden ser útiles para bloquear la transmisión del agente causante de VL de perros a humanos, por ejemplo, al reducir o eliminar el número de parásitos en la sangre y piel de perros infectados.

Como reconocerá el experto en la técnica, una composición polipeptídica de la invención también puede comprender uno o más polipéptidos que son inmunológicamente reactivos con células T y/o anticuerpos generados contra un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos divulgada en la presente descripción, o un fragmento inmunogénico o variante del mismo. En una modalidad específica, el polipéptido es un polipéptido de fusión, como se describe en la presente descripción.

Como se indicó, los polipéptidos de fusión generalmente comprenden al menos una porción o variante inmunogénica de los polipéptidos de SMT y NH de Leishmania descritos en la presente descripción. En algunos casos, se identificarán porciones inmunogénicas preferidas que tengan un nivel de actividad inmunogénica mayor que la del polipéptido de longitud completa correspondiente, por ejemplo, que tengan más de aproximadamente 100 % o 150 % o más de actividad inmunogénica. En modalidades particulares, la inmunogenicidad del polipéptido de fusión de longitud completa tendrá una inmunogenicidad aditiva o mayor que la de cada una de las porciones antigénicas/inmunogénicas contenidas en el mismo.

En otro aspecto, los polipéptidos de fusión divulgados en la presente descripción pueden contener múltiples copias de fragmentos polipeptídicos, repeticiones de fragmentos polipeptídicos o fragmentos polipeptídicos multiméricos, incluidos fragmentos antigénicos/inmunogénicos, tales como polipéptidos de SMT y/o N^h de Leishmania que comprenden al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fragmentos contiguos de un polipéptido de SMT y/o NH, en cualquier orden, y que incluye todas las longitudes de una composición polipeptídica establecida en la presente descripción, o aquellos codificados por una secuencia de polinucleótidos establecida en la presente descripción.

En modalidades más específicas, un polipéptido de fusión de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de NH establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 3 o 5, y además comprende una secuencia de aminoácidos de SMT establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 9 u 11. Alternativamente, el polipéptido de fusión puede comprender secuencias que tiene al menos 90 % o 95 % o 98 % de identidad con las mismas. En otras modalidades más específicas, el polipéptido de fusión comprende, consiste en o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 13, o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 % o 98 % de identidad con la misma.

En otro aspecto más, se proporcionan polipéptidos de fusión que comprenden una o más variantes de los polipéptidos de SMT y/o NH de Leishmania descritos en la presente descripción. Las variantes de polipéptidos generalmente abarcadas por la presente invención exhibirán típicamente al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % o más de identidad (determinada como se describe a continuación), a lo largo de su longitud, con una secuencia polipeptídica expuesta en la presente descripción, tal como una secuencia polipeptídica NH como se establece en las SEQ ID NO: 1, 3 y 5, y/o una secuencia polipeptídica de SMT como se establece en las SEQ ID NO: 7, 9 y 11.

En otras modalidades relacionadas, una "variante" de polipéptido incluye polipéptidos que difieren de una proteína de SMT y/o NH nativa en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones, de modo que la inmunogenicidad deseada del polipéptido variante no está sustancialmente disminuido en relación con un polipéptido de SMT y/o NH nativo.

Por ejemplo, ciertas variantes incluyen polipéptidos que se han modificado para reemplazar uno o más residuos de cisteína con residuos alternativos. Dichos polipéptidos se denominan en lo sucesivo como polipéptidos modificados con cisteína o polipéptidos de fusión modificados con cisteína. Preferentemente, los polipéptidos modificados conservan sustancialmente las mismas o similares propiedades inmunogénicas como los polipéptidos no modificados correspondientes. En una modalidad más específica, los residuos de cisteína se reemplazan con residuos de serina debido a la similitud en la disposición espacial de sus respectivas cadenas laterales. Sin embargo, resultará evidente para un experto en la técnica que cualquier aminoácido que sea incapaz de formar enlaces disulfuro intercatenarios o intracatenarios puede usarse como sustituto de la cisteína. Cuando se reemplazan todos o sustancialmente todos los residuos de cisteína en un polipéptido o polipéptido de fusión de esta invención, la variante modificada con cisteína resultante puede ser menos propensa a la agregación y, por lo tanto, más fácil de purificar, más homogénea y/u obtenible con mayores rendimientos después de la purificación.

En una modalidad, la capacidad de una variante para reaccionar con antisueros específicos de antígeno puede estar mejorada o sin cambios, en relación con la proteína nativa, o puede disminuir en menos del 50 %, y preferentemente en menos del 20 %, en relación con una proteína nativa correspondiente o polipéptido de control. En una modalidad particular, una variante de un polipéptido de SMT y/o NH es una capaz de proporcionar protección, por ejemplo, en un ensayo in vivo como se describe en la presente descripción, contra una especie de Leishmania tal como L. donovani, L. infantum y/o L. mayor.

En modalidades particulares, un polipéptido de fusión divulgado en la presente descripción comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones dentro de un polipéptido de SMT y/o NH de Leishmania, donde el polipéptido de fusión es capaz de proporcionar protección contra, por ejemplo, en un ensayo in vivo como se describe en la presente descripción, especies de Leishmania tales como L. donovani, L. major y/o L. infantum. En modalidades relacionadas, un polipéptido de fusión divulgado en la presente descripción comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones dentro de un polipéptido de SMT y/o NH de Leishmania, donde el polipéptido de fusión es capaz del serodiagnóstico de especies de Leishmania tales como L. donovani, L. major y/o L. infantum.

En muchos casos, una variante contendrá sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es aquella en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de modo que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanecieran sustancialmente sin cambios. Como se describió anteriormente, pueden realizarse modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención y todavía obtener una molécula funcional que codifica una variante o polipéptido derivado con características deseables, por ejemplo, con características inmunogénicas. Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para crear un equivalente, o incluso una variante o porción inmunogénica mejorada de un polipéptido de la invención, un experto en la técnica cambiará típicamente uno o más de los codones que codifican la secuencia de ADN codificante de acuerdo con la tabla 1.

Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin una pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígenos de anticuerpos o sitios de unión en moléculas de sustrato. Dado que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de esa proteína, pueden hacerse ciertas sustituciones de la secuencia de aminoácidos en una secuencia de proteína y, por supuesto, su secuencia de codificación de ADN subyacente, y sin embargo obtener una proteína con similares propiedades. Por tanto, se contempla que pueden realizarse varios cambios en las secuencias de péptidos de las composiciones divulgadas, o las secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos sin una pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica.

Tabla 1

Aminoácidos Codones

Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU

Cisteína Cys C UGC UGU

Ácido aspártico Asp D GAC GAU

Ácido glutámico Glu E GAA GAG

Fenilalanina Phe F UUC UUU

Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidina His H CAC CAU

Isoleucina Ile I AUA AUC AUU

Lisina Lys K AAA AAG

Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Metionina Met M AUG

Asparagina Asn N AAC AAU

Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU

Glutamina Gln Q CAA CAG

Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU

Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU

Valina Val V GUA GUC GUG GUU

(Continuación)

Triptófano Trp W UGG

Tirosina Tyr Y UAC UAU

Al realizar tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva en una proteína se entiende generalmente en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático sobre la base de sus características de hidrofobicidad y carga (Kyte y Doolittle, 1982). Estos valores son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (­ 1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (­ 4,5).

Se sabe en la técnica que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y todavía dan como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, todavía obtienen una proteína biológica funcionalmente equivalente. Al realizar tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ± 2, se prefieren particularmente aquellos dentro de ± 1, y se prefieren aún más particularmente aquellos dentro de ± 0,5. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse de forma eficaz sobre la base de la hidrofilicidad.

Como se detalla en la Patente de Estados Unidos 4,554,101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ±1); glutamato (+3,0 ±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ±1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y todavía obtener una proteína biológicamente equivalente, y en particular, una proteína inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ± 2, se prefieren particularmente aquellos dentro de ± 1, y se prefieren aún más particularmente aquellos dentro de ± 0,5.

Como se indicó anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Las sustituciones ilustrativas que tienen en cuenta varias de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse además sobre la base de la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservadores incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante puede contener también, o alternativamente, cambios no conservadores. En una modalidad preferida, los polipéptidos variantes se diferencian de una secuencia nativa por sustitución, deleción o adición de cinco aminoácidos o menos. Las variantes también pueden modificarse (o alternativamente) mediante, por ejemplo, la eliminación o adición de aminoácidos que tienen una influencia mínima sobre la inmunogenicidad, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido.

Como se indicó anteriormente, los polipéptidos pueden comprender una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína, que cotraduccional o post-traduccionalmente dirige la transferencia de la proteína. El polipéptido también puede conjugarse con un enlazador u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo, etiqueta de poli-Histidina (6XHis), GST, MBP, TAP/TAG, epítopo FLAG, epítopo MYC, epítopo V5, epítopo VSV-G, etc.), o para potenciar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse con una región Fc de inmunoglobulina.

Cuando se comparan secuencias de polinucleótidos o polipeptídicas, se dice que dos secuencias son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para una correspondencia máxima, como se describe a continuación. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan típicamente al comparar las secuencias en una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", como se usa en la presente descripción, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, generalmente de 30 a aproximadamente 75, de 40 a aproximadamente 50, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas de manera óptima.

El alineamiento de secuencias para la comparación puede realizarse mediante el uso de, por ejemplo, el programa Megalign en el conjunto de software de bioinformática Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), mediante el uso de parámetros predeterminados. Este programa incorpora varios esquemas de alineamiento descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff, MO (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Supl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. y Lipman, D.J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. EE.UU 80:726-730.

Alternativamente, el alineamiento de secuencias para la comparación puede realizarse mediante el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, mediante el algoritmo de alineamiento de identidad de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante la búsqueda de métodos de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (gAp , BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.

Un ejemplo de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y otros (1977) Nucl. Acids Res.

25:3389-3402 y Altschul y otros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 pueden usarse, por ejemplo, con los parámetros descritos en la presente descripción, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los polinucleótidos y polipéptidos de la invención. El software para realizar el análisis de BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica. En un ejemplo ilustrativo, las puntuaciones acumulativas se pueden calcular mediante el uso de, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, puede usarse una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación del alineamiento acumulativo cae en la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto alineamientos de una longitud de palabra (W) de 11 y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase, Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 89:10915), (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas.

Preferentemente, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, brechas) del 20 por ciento o menos, usualmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las que aparecen bases de ácido nucleico o residuos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, al dividir el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicar los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

Por lo tanto, como se indicó anteriormente, se divulgan secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que tienen una identidad sustancial con las secuencias divulgadas en la presente descripción, por ejemplo, aquellas que comprenden al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % o más, identidad de secuencia en comparación con una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos de esta divulgación (por ejemplo, como se establece en las SEQ ID NO: 1-14) mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción, (por ejemplo, análisis de BLAST mediante el uso de parámetros estándar, como se describe a continuación). Un experto en esta técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos al tener en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura y similares. Además, los expertos en la técnica entenderán que los polipéptidos de fusión divulgados en la presente descripción pueden comprender al menos 2, al menos 3, o al menos 4 o más porciones o fragmentos antigénicos/inmunogénicos de un polipéptido que comprende al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o superior, identidad de secuencia con un polipéptido de SMT y/o NH de Leishmania que es capaz de proporcionar protección contra, por ejemplo, en un ensayo in vivo como se describe en la presente descripción, o serodiagnóstico de especies de Leishmania tales como L. donovani, L. major y/o L. infantum.

En otro aspecto, se proporcionan polipéptidos de fusión que comprenden al menos una porción inmunogénica de un polipéptido de SMT y/o NH de Leishmania y además comprenden un compañero de fusión heterólogo, así como polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos de fusión. Por ejemplo, un polipéptido de fusión comprende una o más porciones o fragmentos inmunogénicos de un polipéptido de SMT y/o NH de Leishmania y una o más secuencias inmunogénicas de Leishmania adicionales, que se unen a través de un enlace peptídico en una única cadena de aminoácidos.

Un polipéptido de fusión puede comprender múltiples epítopos antigénicos de Leishmania en donde al menos uno de los epítopos es de un polipéptido de SMT y/o NH de Leishmania. Como se usa en la presente descripción, un "epítopo" es una porción de un antígeno que reacciona con muestras de sangre de individuos infectados por Leishmania (es decir, un epítopo se une específicamente por uno o más anticuerpos y/o células T presentes en tales muestras de sangre.

En ciertas modalidades, un polipéptido de fusión puede comprender además al menos una pareja de fusión heteróloga que tiene una secuencia que ayuda a proporcionar epítopos T auxiliares (una pareja de fusión inmunológica), preferentemente epítopos T auxiliares reconocidos por humanos, o que ayudan a expresar la proteína (una potenciador de expresión) con mayores rendimientos que la proteína recombinante nativa. Ciertas pareja de fusión preferidas incluyen parejas de fusión tanto inmunológicas como potenciadoras de la expresión. Pueden seleccionarse otras parejas de fusión para aumentar la solubilidad de la proteína o para permitir que la proteína se dirija a los compartimentos intracelulares deseados. Otras parejas de fusión adicionales incluyen etiquetas de afinidad, tales como V5, 6XHIS, MYC, FLAG y GST, que facilitan la purificación de la proteína. Un experto en la técnica entenderá que aquellas secuencias no relacionadas pueden estar presentes, pero no es necesario, en un polipéptido de fusión usado de acuerdo con la presente invención. En una modalidad particular, una pareja de fusión inmunológica comprende una secuencia derivada de la proteína D, una proteína de superficie de la bacteria gramnegativa Haemophilus influenza B (documento WO 91/18926). Por ejemplo, un derivado de la proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína (por ejemplo, los primeros 100 110 aminoácidos N-terminales), y un derivado de la proteína D puede estar lipidado. En ciertas modalidades, los primeros 109 residuos de una pareja de fusión de lipoproteína D se incluyen en el extremo N para proporcionar al polipéptido epítopos de células T exógenos adicionales y aumentar el nivel de expresión en E. coli (lo que funciona así como un potenciador de la expresión). La cola de lípidos asegura la presentación óptima del antígeno a las células presentadoras de antígeno. Otras parejas de fusión ilustrativas incluyen la proteína no estructural a partir del virus influenzae, NS1 (hemaglutinina). Típicamente, se usan los 81 aminoácidos N-terminales, aunque también pueden usarse diferentes fragmentos que incluyen epítopos T auxiliares.

En otra modalidad particular, una pareja de fusión inmunológica comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la proteína conocida como LYT^a , o una porción de la misma (preferentemente una porción C-terminal). LYTA se deriva de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gene 43:265-292 (1986)). LYTA es una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la estructura principal del peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad por la colina o por algunos análogos de colina tal como la DEAE. Esta propiedad se ha aprovechado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en el extremo amino terminal (véase, Biotechnology 10:795-798 (1992)). En una modalidad particular, se puede incorporar una porción repetida de LYTA en una proteína de fusión. Se encuentra una porción repetida en la región C-terminal que comienza en el residuo 178. Una porción repetida más particular incorpora los residuos 188-305.

Las secuencias de fusión pueden unirse directamente (es decir, sin que intervengan aminoácidos) o pueden unirse mediante una secuencia enlazadora (por ejemplo, Gly-Cys-Gly) que no disminuye significativamente las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos componentes. Los polipéptidos que forman la proteína de fusión se unen típicamente del extremo C-terminal al N-terminal, aunque también pueden estar unidos del extremo C-terminal al C-terminal, N-terminal al N-terminal, o N-terminal al C-terminal. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden. Los polipéptidos de fusión o proteínas de fusión también pueden incluir variantes modificadas de forma conservadora, variantes polimórficas, alelos, mutantes, subsecuencias, homólogos interespecies y fragmentos inmunogénicos de los antígenos que componen la proteína de fusión.

Los polipéptidos de fusión generalmente pueden prepararse mediante el uso de técnicas estándar, que incluyen tecnología recombinante, conjugación química y similares. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican los componentes polipeptídicos de una fusión pueden ensamblarse por separado y ligarse en un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente polipeptídico se liga, con o sin un enlazador peptídico, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente polipeptídico de modo que los marcos de lectura de las secuencias estén en el marco. Esto permite la traducción en un único polipéptido de fusión que conserva o en algunos casos excede la actividad biológica de los polipéptidos componentes.

Puede emplearse una secuencia enlazadora peptídica para separar los componentes de fusión a una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliegue en sus estructuras secundarias y/o terciarias deseadas. Tal secuencia enlazadora peptídica puede incorporarse en el polipéptido de fusión mediante el uso de técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Las secuencias enlazadoras peptídicas adecuadas pueden elegirse, por ejemplo, en base a uno o más de los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pudiera interactuar con epítopos funcionales en el primer y segundo polipéptidos; y (3) la falta de residuos hidrófobos o cargados que puedan reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Ciertas secuencias enlazadoras peptídicas preferidas contienen residuos de Gly, Asn y Ser. También pueden usarse otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala, en la secuencia enlazadora. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de forma útil como enlazadoras incluyen aquellas divulgadas en Maratea y otros, Gene 40:39-46, 1985; Murphy y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 83:8258-8262, 1986; Patente de Estados Unidos No. 4,935,233 y Patente de Estados Unidos No. 4,751,180. La secuencia enlazadora puede tener generalmente de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. No se requieren secuencias enlazadoras cuando el primer y segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia estérica.

Las secuencias de ADN ligadas están operativamente unidas a elementos reguladores de la transcripción o traducción adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresión del ADN están ubicados solo en 5' de la secuencia de ADN que codifica los primeros polipéptidos. De manera similar, los codones de parada necesarios para finalizar la traducción y las señales de terminación de la transcripción solo están presentes en 3' de la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.

Además de la expresión del polipéptido de fusión recombinante, pueden generarse polipéptidos de SMT y/o NH de Leishmania, porciones inmunogénicas, variantes y fusiones de los mismos por medios sintéticos o recombinantes. Los polipéptidos sintéticos que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos, y generalmente menos de aproximadamente 50 aminoácidos, pueden generarse mediante el uso de técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, dichos polipéptidos pueden sintetizarse mediante el uso de cualquiera de las técnicas de fase sólida disponibles comercialmente, tales como el método de síntesis de fase sólida de Merrifield, donde los aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena de aminoácidos en crecimiento (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963). El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos está disponible comercialmente de proveedores tales como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA, y puede operarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Así, por ejemplo, los antígenos de SMT y/o NH de Leishmania, o porciones de los mismos, pueden sintetizarse mediante este método.

Los polipéptidos recombinantes que contienen porciones y/o variantes de un polipéptido de SMT y/o NH nativo pueden prepararse fácilmente a partir de una secuencia de ADN que codifica el antígeno, mediante el uso de técnicas bien conocidas y establecidas. En modalidades particulares, puede prepararse fácilmente un polipéptido de fusión que comprende antígenos de SMT y/o NH de Leishmania a partir de una secuencia de ADN que codifica los antígenos fusionados clonados. Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas huésped/vector adecuados que secretan la proteína recombinante en medios de cultivo pueden concentrarse primero mediante el uso de un filtro disponible comercialmente. Después de la concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación adecuada, tal como una matriz de afinidad, una matriz de cromatografía de exclusión por tamaño o una resina de intercambio iónico.

Alternativamente, puede emplearse cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos por los expertos en la técnica para expresar polipéptidos recombinantes. La expresión puede lograrse en cualquier célula huésped apropiada que haya sido transformada o transfectada con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica un polipéptido recombinante. Preferentemente, las células huésped son E. coli, levadura, una línea celular de insecto (tal como Spodoptera o Trichoplusia) o una línea celular de mamífero, que incluye (pero sin limitarse a) CHO, COS, HEK-293T y nS-1. Las secuencias de ADN expresadas de esta manera pueden codificar proteínas de origen natural y proteínas de fusión que comprenden antígenos de Leishmania, tales como aquellos descritos en la presente descripción, porciones de los mismos y repeticiones u otras variantes de tales proteínas. Los polipéptidos de fusión expresados de esta invención generalmente se aíslan en forma sustancialmente pura. Preferentemente, los polipéptidos de fusión se aíslan hasta una pureza de al menos 80 % en peso, con mayor preferencia, hasta una pureza de al menos 95 % en peso y con la máxima preferencia hasta una pureza de al menos 99 % en peso. Generalmente, tal purificación puede lograrse mediante el uso de, por ejemplo, las técnicas estándar de fraccionamiento con sulfato de amonio, electroforesis SDS-PAGE y cromatografía de afinidad.

Los polipéptidos y polinucleótidos de SMT y NH de Leishmania pueden prepararse o aislarse mediante el uso de cualquiera de una variedad de procedimientos y mediante el uso de cualquiera de una variedad de especies de Leishmania que incluyen, pero no se limitan a, L. donovani, L. chagasi, L. infantum, L. major, L. amazonensis, L. braziliensis, L. panamensis, L. mexicana, L. tropica y L. guyanensis. Tales especies están disponibles, por ejemplo, a partir de la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD.

Independientemente del método de preparación, los polipéptidos de SMT y NH o los polipéptidos de fusión producidos como se describió anteriormente son preferentemente inmunogénicos. En ciertas modalidades, por ejemplo, los polipéptidos (o porciones inmunogénicas de los mismos) son capaces de provocar una respuesta inmunitaria en cultivos de células de nódulos linfáticos y/o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas a partir de individuos infectados actualmente o previamente con Leishmania. Más específicamente, en ciertas modalidades, los antígenos, y las porciones inmunogénicas de los mismos, tienen la capacidad de inducir la proliferación de células T y/o de provocar una respuesta de citoquina predominantemente de tipo Th1 (por ejemplo, producción de IL-2, IFN-y, y/o TNF-a por células T y/o células NK; y/o producción de IL-12 por monocitos, macrófagos y/o células B) en células aisladas a partir de individuos infectados actualmente o previamente con Leishmania. Un individuo infectado con Leishmania puede padecer una forma de leishmaniasis (como subclínica, cutánea, mucosal o visceral activa) o puede ser asintomática. Dichos individuos pueden identificarse mediante el uso de métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los individuos con leishmaniasis pueden identificarse en base a los hallazgos clínicos asociados con, por ejemplo, al menos uno de los siguientes: aislamiento del parásito a partir de las lesiones, una prueba cutánea positiva con lisado de Leishmania o una prueba de serodiagnóstico positiva. Las personas asintomáticas son personas infectadas que no presentan signos ni síntomas de la enfermedad. Tales individuos pueden identificarse, por ejemplo, en base a una prueba serológica positiva y/o una prueba cutánea con lisado de Leishmania.

El término "PBMC", que se refiere a una preparación de células nucleadas que consiste principalmente de linfocitos y monocitos que están presentes en la sangre periférica, abarca tanto mezclas de células como preparaciones de uno o más tipos de células purificadas. Las PBMC pueden aislarse mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las PBMC pueden aislarse mediante centrifugación por densidad a través de, por ejemplo, Ficoll™ (Winthrop Laboratories, Nueva York). Los cultivos de ganglios linfáticos pueden prepararse generalmente al inmunizar ratones BALB/c (por ejemplo, en la almohadilla de la pata trasera) con promastigotes de Leishmania emulsionados en adyuvante completo de Freund. Los ganglios linfáticos que drenan pueden extirparse después de la inmunización y las células T pueden purificarse en una columna de anti-Ig de ratón para eliminar las células B, seguido de un paso a través de una columna Sephadex G10 para eliminar los macrófagos. De manera similar, las células de los ganglios linfáticos pueden aislarse de un ser humano después de una biopsia o extirpación quirúrgica de un ganglio linfático.

La capacidad de un polipéptido de fusión para inducir una respuesta en cultivos de células de nódulos linfáticos o PBMC puede evaluarse, por ejemplo, al poner en contacto las células con el polipéptido y medir una respuesta adecuada. Generalmente, la cantidad de polipéptido que es suficiente para la evaluación de aproximadamente 2 x 105 células varía de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 100 pg o de 100 ng a aproximadamente 50 pg, y preferentemente es de aproximadamente 1 pg a 10 pg. La incubación del polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de fusión) con células se realiza típicamente a 37 °C durante aproximadamente 1-3 días. Después de la incubación con polipéptido, las células se analizan para determinar una respuesta apropiada. Si la respuesta es una respuesta proliferativa, puede emplearse cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las células pueden exponerse a un pulso de timidina radiactiva y medirse la incorporación del marcador en el ADN celular. Generalmente, un polipéptido que da como resultado un aumento de al menos tres veces en la proliferación por encima del fondo (es decir, la proliferación observada para las células cultivadas sin polipéptido) se considera que puede inducir la proliferación.

Alternativamente, la respuesta a medir puede ser la secreción de una o más citoquinas (tales como interferón-y (IFN-y), interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-12 (p70 y/o p40), interleuquina-2 (IL-2) y/o factor de necrosis tumoral-a (TNF-a)) o el cambio en el nivel de ARNm que codifica una o más citoquinas específicas. Por ejemplo, la secreción de interferón-y, interleuquina-2, factor de necrosis tumoral-a y/o interleuquina-12 es indicativa de una respuesta Th1, que contribuye al efecto protector contra Leishmania. Los ensayos para cualquiera de las citoquinas anteriores pueden realizarse generalmente mediante el uso de métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, tales como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Los anticuerpos adecuados para usar en tales ensayos pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes tales como Chemicon, Temucula, CA y PharMingen, San Diego, CA y generalmente pueden usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel de ARNm que codifica una o más citoquinas específicas puede evaluarse, por ejemplo, mediante amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Generalmente, un polipéptido que es capaz de inducir, en una preparación de aproximadamente 1-3 x 105 células, la producción de 30 pg/mL de lL-12, IL-4, IFN-y, TNF-a o IL-12 p40, o 10 pg/mL de IL-12 p70, se considera que son capaces de estimular la producción de una citoquina.

Composiciones polinucleótidas

También se proporcionan polinucleótidos aislados, particularmente aquellos que codifican las combinaciones de polipéptidos y/o polipéptidos de fusión de la invención, así como composiciones que comprenden dichos polinucleótidos. Como se usa en la presente descripción, los términos "ADN" y "polinucleótido" y "ácido nucleico" se refieren a una molécula de ADN que se ha aislado libre del ADN genómico total de una especie particular. Por lo tanto, un segmento de ADN que codifica un polipéptido se refiere a un segmento de ADN que contiene una o más secuencias codificantes pero que está sustancialmente aislado o purificado libre del ADN genómico total de la especie de la que se obtiene el segmento de ADN. Incluidos dentro de los términos "segmento de ADN" y "polinucleótido" están los segmentos de ADN y fragmentos más pequeños de dichos segmentos, y también vectores recombinantes, que incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagémidos, fagos, virus y similares.

Como entenderán aquellos expertos en la técnica, las secuencias de polinucleótidos de esta invención pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extragenómicas y codificadas por plásmidos y segmentos génicos más pequeños diseñados por ingeniería genética que expresan o pueden adaptarse para expresar proteínas, polipéptidos de fusión, péptidos y similares. Dichos segmentos pueden ser aislados naturalmente, recombinantes o modificados sintéticamente por la mano del hombre.

Como reconocerá el experto en la técnica, los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Cualquier polinucleótido puede modificarse adicionalmente para aumentar la estabilidad in vivo. Las posibles modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3'; el uso de fosforotioato o 2' O-metil en lugar de enlaces fosfodiesterasa en la estructura principal; y/o la inclusión de bases no tradicionales tales como inosina, queosina y wybutosina, así como acetil-, metil-, tio- y otras formas modificadas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina. Las secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no se limitan a, estar presentes dentro de un polinucleótido de la presente invención, y un polinucleótido puede, pero no se limita a, estar unido a otras moléculas y/o soportes técnicos.

Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un antígeno de Leishmania o una porción del mismo) o pueden comprender una variante o un equivalente funcional biológico o antigénico de dicha secuencia. En modalidades particulares, los polinucleótidos pueden codificar dos o más porciones, fragmentos o variantes antigénicas/inmunogénicas derivadas de los antígenos SMT y/o NH de Leishmania. En ciertas modalidades, los polinucleótidos de la presente invención comprenden una secuencia de NH como se establece en las SEQ ID NO: 2, 4 y 6, y una secuencia de SMT como se establece en las SEQ ID NO: 8, 10 y 12. En un aspecto relacionado, se proporciona un polinucleótido como se establece en la SEQ ID NO: 14, que codifica un polipéptido de fusión de NS particular de la presente invención. Por supuesto, también pueden emplearse porciones de estas secuencias y secuencias variantes que comparten identidad con estas secuencias (por ejemplo, aquellas que tienen al menos aproximadamente 90 %, 95 % o 98 % de las mismas).

Las variantes de polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, como se describe adicionalmente a continuación, preferentemente de modo que la inmunogenicidad del polipéptido codificado no disminuya, en relación con la proteína nativa. El efecto sobre la inmunogenicidad del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en la presente descripción.

Por ejemplo, en ciertas modalidades, las variantes incluyen polinucleótidos modificados con cisteína en los que los codones que codifican la cisteína se reemplazan con codones que codifican otros aminoácidos que no pueden formar enlaces disulfuro intracatenarios o intercatenarios. En modalidades más específicas, algunos o todos los codones de reemplazo codifican serina debido a la similitud espacial de la cadena lateral de serina con la cadena lateral de cisteína en el polipéptido resultante. En otra modalidad específica, algunos o todos los codones de reemplazo codifican alanina. Los métodos ilustrativos que reemplazan la cisteína y otros codones dentro de un polinucleótido son bien conocidos (por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 4,816,566 y Proc Natl Acad Sci 97 (15): 8530, 2000).

El término "variantes" también abarca genes homólogos de origen xenogénico.

En modalidades adicionales, los polinucleótidos aislados divulgados en la presente descripción comprenden diversas longitudes de tramos de secuencia contiguos idénticos o complementarios a SMT y NH, tales como aquellas secuencias divulgadas en la presente descripción. Por ejemplo, se proporcionan polinucleótidos que comprenden al menos aproximadamente 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 o 1000 o más nucleótidos contiguos de dos o más de las secuencias divulgadas en la presente descripción, así como todas las longitudes intermedias entre ellas. Se entenderá fácilmente que "longitudes intermedias", en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores citados, tales como 16, 17, 18, 19, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; que incluye todos los números enteros entre 200-500; 500-1000 y similares.

Los polinucleótidos de la presente invención, o fragmentos de los mismos, independientemente de la longitud de la secuencia codificante en sí, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiples, otros segmentos codificantes y similares, de modo que su longitud total puede variar considerablemente. Por tanto, se contempla que pueda emplearse un fragmento polinucleotídico de casi cualquier longitud; con la longitud total preferentemente limitada por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido.

Además, aquellos expertos en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe en la presente descripción. Algunos de estos polinucleótidos tienen una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, la presente invención contempla específicamente polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones, por ejemplo, polinucleótidos que están optimizados para la selección de codones en humanos y/o primates. Además, los alelos de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en la presente descripción están dentro del alcance de la presente invención. Los alelos son genes endógenos que se alteran como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden, pero no es necesario, tener una estructura o función alterada. Los alelos pueden identificarse mediante el uso de técnicas estándar (tales como hibridación, amplificación y/o comparación de secuencias de bases de datos).

Los polinucleótidos de Leishmania y sus fusiones se pueden preparar, manipular y/o expresar mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas bien establecidas conocidas y disponibles en la técnica. En modalidades particulares, las fusiones comprenden dos o más secuencias de polinucleótidos que codifican antígenos SMT y NH de Leishmania.

Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos o fragmentos de las mismas que codifican polipéptidos de la invención, o proteínas de fusión o equivalentes funcionales de las mismas, pueden usarse en moléculas de ADN recombinantes para dirigir la expresión de un polipéptido en células huésped apropiadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, pueden producirse otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente y estas secuencias pueden usarse para clonar y expresar un polipéptido dado de la presente invención.

Como entenderán los expertos en la técnica, en algunos casos puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de fusión que posean codones de origen no natural. Por ejemplo, los codones preferidos por un huésped procariota o eucariota particular pueden seleccionarse para aumentar la tasa de expresión de proteínas o para producir un transcripto de ARN recombinante que tiene propiedades deseables, tales como una vida media que sea más larga que la de un transcripto generado a partir de la secuencia natural.

Además, las secuencias de polinucleótidos pueden diseñarse por ingeniería genética mediante el uso de métodos generalmente conocidos en la técnica para alterar las secuencias que codifican el polipéptido de fusión por una variedad de razones, que incluyen, pero no se limitan a, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento, expresión y/o inmunogenicidad del producto génico.

Para expresar un polipéptido de fusión deseado que comprende dos o más fragmentos antigénicos/inmunogénicos o porciones de polipéptidos de SMT y/o NH, puede insertarse una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de fusión, o un equivalente funcional, en el vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Pueden usarse métodos que son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican un polipéptido de interés y elementos de control de la transcripción y traducción apropiados. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Tales técnicas se describen en Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2001), y Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology (enero de 2008, edición actualizada).

Se conocen una variedad de sistemas huésped/vector de expresión y pueden utilizarse para contener y expresar secuencias de polinucleótidos. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófagos, plásmidos o cósmidos recombinantes; levadura (tales como Saccharomyces o Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transformadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales.

Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión son aquellas regiones no traducidas del vector--potenciadores, promotores, regiones no traducidas 5' y 3'--que interactúan con las proteínas celulares del huésped para llevar a cabo la transcripción y traducción. Dichos elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. En dependencia del sistema de vector y huésped utilizado, puede usarse cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluidos los promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como el promotor híbrido lacZ del fagémido PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, CA) o el plásmido PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.) y similares. En los sistemas de células de mamíferos, generalmente se prefieren los promotores de genes de mamíferos o a partir de virus de mamíferos. Si es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de la secuencia que codifica un polipéptido, pueden usarse ventajosamente vectores en base a SV40 o EBV con un marcador seleccionable apropiado.

En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse un número de vectores de expresión en dependencia del uso previsto para el polipéptido expresado. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades, pueden usarse vectores que dirigen un alto nivel de expresión de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, los vectores de expresión y clonación de E. coli multifuncionales tales como PBLUESCRIPT (Stratagene), en los que la secuencia que codifica el polipéptido de interés puede ligarse en el vector en marco con secuencias para el extremo amino terminal Met y los 7 residuos subsecuentes de pgalactosidasa para que se produzca una proteína híbrida; vectores pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem.

264:5503 5509 (1989)); y similares. Los vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) también pueden usarse para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). Generalmente, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción en perlas de glutatión-agarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Las proteínas preparadas en dichos sistemas pueden diseñarse para incluir heparina, trombina o sitios de escisión de la proteasa factor XA de modo que el polipéptido clonado de interés pueda liberarse del resto GST.

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, pueden usarse un número de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH. Para revisiones, véase, Ausubel y otros (supra) y Grant y otros, Methods Enzymol. 153:516-544 (1987).

En los casos donde se usan vectores de expresión vegetales, la expresión de secuencias que codifican polipéptidos puede ser impulsada por cualquiera de un número de promotores. Por ejemplo, los promotores virales tales como los promotores 35S y 19S de CaMV pueden usarse solos o en combinación con la secuencia líder omega de TMV (Takamatsu, EMBo J. 6: 307-311 (1987)). Alternativamente, pueden usarse promotores vegetales tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi y otros, EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie y otros, Science 224:838-843 (1984); y Winter y otros, Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)). Estos constructos pueden introducirse en células vegetales mediante transformación directa de ADN o transfección mediada por patógenos. Dichas técnicas se describen en un número de revisiones generalmente disponibles (véase, por ejemplo, Hobbs en McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, pp. 191-196 (1992)).

También puede usarse un sistema de insectos para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en uno de tales sistemas, el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se usa como un vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican el polipéptido pueden clonarse en una región no esencial del virus, tales como el gen de la polihedrina, y colocarse bajo el control del promotor de la polihedrina. La inserción satisfactoria de la secuencia que codifica el polipéptido rendirá el gen de la polihedrina inactivo y producirá un virus recombinante que carece de la proteína de la cubierta. A continuación, los virus recombinantes pueden usarse para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se puede expresar el polipéptido de interés (Engelhard y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 91:3224-3227 (1994)).

En las células huésped de mamíferos, generalmente están disponibles un número de sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en los casos donde se usa un adenovirus como vector de expresión, las secuencias que codifican un polipéptido de la presente invención pueden ligarse en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral puede usarse para obtener un virus viable que sea capaz de expresar el polipéptido en células huésped infectadas (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 81:3655-3659 (1984)). Además, pueden usarse potenciadores de la transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para aumentar la expresión en células huésped de mamíferos.

También pueden usarse señales de iniciación específicas para lograr una traducción más eficaz de secuencias que codifican un polipéptido de fusión de interés. Dichas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En los casos donde las secuencias que codifican el polipéptido, su codón de iniciación y las secuencias cadena arriba se insertan en el vector de expresión apropiado, pueden no necesitarse señales de control de la transcripción o de la traducción adicionales. Sin embargo, en los casos donde solo se inserta la secuencia codificante, o una porción de la misma, deben proporcionarse señales de control de la traducción exógenas que incluyen el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción de todo el inserto. Los elementos de traducción y los codones de iniciación exógenos pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de expresión puede mejorarse mediante la inclusión de potenciadores que sean apropiados para el sistema celular particular que se use, tales como aquellos descritos en la literatura (Scharf. y otros, Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)).

Además, puede elegirse una cepa de célula huésped por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína de fusión expresada de la forma deseada. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraduccional que escinde una forma "prepro" de la proteína también puede usarse para facilitar la inserción, el plegamiento y/o la función de forma correcta. Pueden elegirse diferentes células huésped como CHO, HeLa, MDCK, HEK293 y W138, que tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades postraduccionales, para asegurar la modificación y el procesamiento de forma correcta de la proteína extraña.

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, generalmente se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable un polinucleótido de fusión de la presente invención pueden transformarse mediante el uso de vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo vector o en un vector separado. Después de la introducción del vector, puede dejarse las células crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a un medio selectivo. El objetivo del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células transformadas de forma estable pueden proliferar mediante el uso de técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para el tipo de célula.

Puede usarse cualquier número de sistemas de selección para recuperar líneas celulares transformadas. Estos incluyen, pero no se limitan a, genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler y otros, Cell 11:223-232 (1977)) y la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y otros, Cell 22:817-823 (1990)) que pueden emplearse en células tk o aprt, respectivamente. Además, la resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas puede usarse como base para la selección; por ejemplo, dhfr que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Ee . UU 77:3567-70 (1980)); npt, que confiere resistencia a los aminoglucósidos, neomicina y G-418 (Colbere-Garapin y otros, J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)); y als o pat, que confieren resistencia a clorsulfurón y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murry, supra). Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo, trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 85:8047-51 (1988)). El uso de marcadores visibles ha ganado popularidad con marcadores como antocianina s, p-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, al ser ampliamente usados no solo para identificar transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión proteica transitoria o estable atribuible a un sistema de vector específico (Rhodes y otros, Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995)).

Se conocen en la técnica una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de productos codificados por polinucleótidos, mediante el uso de anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para el producto. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA) y la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Estos y otros ensayos se describen, entre otros lugares, en Hampton y otros, Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) y Maddox y otros, J. Exp. Med. 158:1211-1216 (1983).

Los expertos en la técnica conocen una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación y pueden usarse en diversos ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir sondas de PCR o de hibridación marcadas para detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos incluyen oligoetiquetado, traducción de muescas, marcaje de extremos o amplificación por PCR mediante el uso de un nucleótido marcado. Alternativamente, las secuencias, o cualquier parte de las mismas, pueden clonarse en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores son conocidos en la técnica, están disponibles comercialmente y pueden usarse para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos pueden realizarse mediante el uso de una variedad de estuches disponibles comercialmente. Las moléculas reporteras o marcadores adecuados, que pueden usarse, incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.

Las células huésped transformadas con una secuencia de polinucleótidos de interés pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante puede ser secretada o contenida intracelularmente en dependencia de la secuencia y/o el vector usado. Como entenderán aquellos expertos en la técnica, los vectores de expresión que contienen los polinucleótidos de la invención pueden diseñarse para contener secuencias señal que dirigen la secreción del polipéptido codificado a través de una membrana celular procariota o eucariota. Pueden usarse otras construcciones recombinantes para unir secuencias que codifican un polipéptido de interés a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio polipeptídico que facilitará la purificación de proteínas solubles.

Además de los métodos de producción recombinantes, los polipéptidos de fusión de la invención y sus fragmentos pueden producirse por síntesis directa de péptidos mediante el uso de técnicas en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)). La síntesis de proteínas puede realizarse mediante el uso de técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, mediante el uso del sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Alternativamente, diversos fragmentos, por ejemplo, fragmentos inmunogénicos de antígenos SMT y NH de Leishmania, pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse mediante el uso de métodos químicos para producir la molécula de longitud completa.

Composiciones farmacéuticas y vacunas

En ciertos aspectos, los polipéptidos, polinucleótidos, porciones, variantes, polipéptidos de fusión, etc., como se describe en la presente descripción, se incorporan en composiciones farmacéuticas o vacunas. Las composiciones farmacéuticas generalmente comprenden uno o más polipéptidos, polinucleótidos, porciones, variantes, polipéptidos de fusión, etc., como se describe en la presente descripción, en combinación con un portador fisiológicamente aceptable. Las vacunas, también denominadas composiciones inmunogénicas, generalmente comprenden uno o más de los polipéptidos, polinucleótidos, porciones, variantes, proteínas de fusión, etc., como se describe en la presente descripción, en combinación con un inmunoestimulante, tal como un adyuvante. En modalidades particulares, las composiciones farmacéuticas comprenden polipéptidos de fusión que contienen antígenos polipeptídicos de SMT y NH de Leishmania (o porciones o variantes de los mismos) que son capaces de proporcionar protección contra, por ejemplo, en un ensayo in vivo como se describe en la presente descripción, especies de Leishmania tales como L. donovani, L. major y/o L. infantum.

Un inmunoestimulante puede ser cualquier sustancia que mejora o potencia una respuesta inmunitaria (mediada por anticuerpos y/o células) a un antígeno exógeno. Los ejemplos de inmunoestimulantes incluyen adyuvantes, microesferas biodegradables (por ejemplo, galactida poliláctica) y liposomas (en los que el compuesto se incorpora; véase, por ejemplo, Fullerton, Patente de Estados Unidos No. 4,235,877). La preparación de vacunas se describe generalmente en, por ejemplo, Powell & Newman, eds., Vaccine Design (el enfoque de subunidades y adyuvantes) (1995).

Cualquiera de una variedad de inmunoestimulantes puede emplearse en las vacunas divulgadas en la presente descripción. Por ejemplo, puede incluirse un adyuvante. Muchos adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el antígeno del catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador de respuestas inmunes, tal como lípido A (natural o sintético), Bordetella pertussis o especies de Mycobacterium o proteínas derivadas de Mycobacterium. Los adyuvantes adecuados están disponibles comercialmente como, por ejemplo, adyuvante incompleto y adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Michigan); Adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, Nueva Jersey); AS-2 y derivados del mismo (GlaxoSmithKline Beecham, Filadelfia, Pensilvania); CWS, TDM, LeIF, sales de aluminio tales como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o zinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónicamente o aniónicamente; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforil lípido A y quil A. También pueden usarse como adyuvantes citoquinas, tales como GM-CSF o interleuquina-2, -7 o -12.

También se divulgan composiciones de vacunas y farmacéuticas que incluyen uno o más agonistas de receptores de tipo Toll (agonistas de TLR). En modalidades más específicas, por ejemplo, las composiciones de la invención incluyen agonistas de receptores de tipo Toll, tales como agonistas de TLR7 y agonistas de TLR7/8. En ciertas modalidades, el agonista de TLR es capaz de suministrar una señal biológica al interactuar con al menos un TLR que se selecciona de TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR- 8 y TLR-9.

Los receptores tipo Toll (TLR) incluyen receptores transmembrana de la superficie celular del sistema inmune innato que confieren capacidad de reconocimiento de fase temprana a las células huésped para una variedad de estructuras moleculares microbianas conservadas, tales como las que pueden estar presentes en o sobre un gran número de patógenos infecciosos. (por ejemplo, Armant y otros, 2002 Genome Biol. 3(8):reviews3011.1-3011.6; Fearon y otros, 1996 Science 272:50; Medzhitov y otros, 1997 Curr. Opin. Immunol. 9:4; Lustre 2002 Curr. Opin. Immunol. 14:129; Lien y otros 2003 Nat. Immunol. 4:1162; Medzhitov, 2001 Nat. Rev. Immunol. 1:135; Takeda y otros, 2003 Ann Rev Immunol. 21:335; Takeda y otros 2005 Int. Immunol. 17:1; Kaisho y otros, 2004 Microbes Infecí.

6:1388; Datta y otros, 2003 J. Immunol. 170:4102).

La inducción de la transducción de señales mediada por TLR para potenciar la iniciación de respuestas inmunes a través del sistema inmune innato puede ser efectuada por agonistas de TLR, que activan TLR de superficie celular o TLR citoplásmico. Por ejemplo, el lipopolisacárido (LPS) puede ser un agonista de TLR a través de TLR2 o TLR4 (Tsan y otros, 2004 J. Leuk. Biol. 76:514; Tsan y otros, 2004 Am. J. Physiol. Cell Phsiol. 286:C739; Lin y otros, 2005 Shock 24:206); poli(inosina-citidina) (polil:C) puede ser un agonista de TLR a través de TLR3 (Salem y otros, 2006 Vaccine 24: 5119); secuencias CpG (oligodesoxinucleótidos que contienen citosina-guanosina no metilada o motivos dinucleótidos "CpG", por ejemplo, CpG 7909, Cooper y otros, 2005 AIDS 19:1473; CpG 10101 Bayes y otros Methods Find Exp Clin Pharmacol 27:193; Vollmer y otros Expert Opinion on Biological Therapy 5:673; Vollmer y otros, 2004 Antimicrob. Agents Chemother. 48:2314; Deng y otros, 2004 J. Immunol. 173:5148) pueden ser agonistas de TLR a través de TLR9 (Andaloussi y otros, 2006 Glia 54:526; Chen y otros, 2006 J. Immunol.

177:2373); los peptidoglicanos pueden ser agonistas de TLR2 y/o TLR6 (Soboll y otros, 2006 Biol. Reprod. 75:131; Nakao y otros, 2005 J. Immunol. 174:1566); 3M003 (hidrato de 4-amino-2-(etoximetil)-a,a-dimetil-6,7,8,9-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-1-etanol, peso molecular 318 Da de 3M Pharmaceuticals, St. Paul, MN, que también es una fuente de los compuestos relacionados 3M001 y 3M002; Gorden y otros, 2005 J. Immunol. 174:1259) puede ser un agonista de TLR7 (Johansen 2005 Clin. Exp. Allerg. 35:1591) y/o un agonista de TLR8 (Johansen 2005); la flagelina puede ser un agonista de TLR5 (Feuillet y otros, 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. EE. UU 103:12487); y los antígenos de la hepatitis C pueden actuar como agonistas de TLR a través de TLR7 y/o TLR9 (Lee y otros, 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. EE.u U 103:1828; Horsmans y otros, 2005 Hepatol. 42:724). Se conocen otros agonistas de TLR (por ejemplo, Schirmbeck y otros, 2003 J. Immunol. 171:5198) y pueden usarse de acuerdo con algunas de las modalidades descritas actualmente.

Por ejemplo, y a modo de antecedentes (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 6,544,518) los oligonucleótidos inmunoestimuladores que contienen dinucleótidos CpG no metilados ("CpG") se conocen como adyuvantes cuando se administran tanto por vía sistémica como por vía mucosal (WO 96/02555, EP 468520, Davis y otros, J. Immunol, 1998. 160(2):870-876; McCluskie y Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6). CpG es una abreviatura de motivos dinucleótidos de citosina-guanosina presentes en el ADN. El papel central del motivo CG en la inmunoestimulación fue aclarado por Krieg, Nature 374, p546 1995. Un análisis detallado ha demostrado que el motivo CG tiene que estar en un cierto contexto de secuencia, y que tales secuencias son comunes en el ADN bacteriano, pero son raras en el ADN de vertebrados. La secuencia inmunoestimuladora es a menudo: purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina; en donde el motivo CG de dinucleótido no está metilado, pero se sabe que otras secuencias CpG no metiladas son inmunoestimulantes y pueden usarse en ciertas modalidades de la presente invención. Cuando el CpG se formula en vacunas, puede administrarse en solución libre junto con antígeno libre (documento WO 96/02555; McCluskie y Davis, supra) o conjugarse covalentemente a un antígeno (publicación PCT No. WO 98/16247), o formularse con un portador tal como hidróxido de aluminio (por ejemplo, Davis y otros supra, Brazolot-Millan y otros, Proc.Natl.Acad.Sci., EE. UU, 1998, 95(26), 15553-8).

Otros oligonucleótidos ilustrativos para usar en las composiciones de la presente invención a menudo contendrán dos o más motivos CpG de dinucleótidos separados por al menos tres, con mayor preferencia al menos seis o más nucleótidos. Los oligonucleótidos de la presente invención son típicamente desoxinucleótidos. En una modalidad, el internucleótido en el oligonucleótido es fosforoditioato, o con mayor preferencia un enlace fosforotioato, aunque los enlaces fosfodiéster y otros enlaces internucleotídicos están dentro del alcance de la invención, que incluye oligonucleótidos con uniones internucleotídicas mixtas. Los métodos para producir oligonucleótidos de fosforotioato o fosforoditioato se describen en las Patente de Estados Unidos Nos. 5,666,153, 5,278,302 y WO95/26204.

Otros ejemplos de oligonucleótidos tienen secuencias que se divulgan en las siguientes publicaciones; para ciertas modalidades divulgadas en la presente descripción, las secuencias contienen preferentemente uniones internucleotídicas modificadas con fosforotioato: CPG 7909: Cooper y otros, "CPG 7909 adjuvant improves hepatitis B virus vaccine seroprotection in antiretroviral-treated HIV-infected adults." AIDS, 2005 Sep 23;19(14):1473-9.

CpG 10101: Bayes y otros, "Gateways to clinical trials." Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. Abril de 2005; 27(3):193-219.

Vollmer J., "Progress in drug development of immunostimula-tory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9." Opinión de expertos sobre terapia biológica. Mayo de 2005; 5(5):673-682

Los oligonucleótidos CpG alternativos pueden comprender variantes de las secuencias preferidas descritas en las publicaciones citadas anteriormente que se diferencian en que tienen sustituciones, inserciones, deleciones y/o adiciones de secuencias de nucleótidos intrascendentes. Los oligonucleótidos CpG utilizados en determinadas modalidades de la presente invención pueden sintetizarse mediante cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, EP 468520). Convenientemente, tales oligonucleótidos pueden sintetizarse mediante el uso de un sintetizador automatizado. Los oligonucleótidos son típicamente desoxinucleótidos. En una modalidad preferida, el enlace internucleotídico en el oligonucleótido es fosforoditioato, o con mayor preferencia un enlace fosforotioato, aunque los fosfodiésteres también están dentro del alcance de las modalidades actualmente contempladas. También se contemplan oligonucleótidos que comprenden diferentes uniones internucleotídicas, por ejemplo, fosforodiésteres de fosforotioato mixtos. También pueden usarse otros enlaces internucleotídicos que estabilizan el oligonucleótido.

En ciertas modalidades más específicas, el agonista de TLR se selecciona de lipopolisacárido, peptidoglicano, polil:C, CpG, 3M003, flagelina, homólogo de Leishmania del factor de elongación e iniciación ribosómica eucariota 4a (LeIF) y al menos un antígeno de hepatitis C.

Otros adyuvantes ilustrativos más incluyen imiquimod, gardiquimod y resiquimod (todos disponibles de Invivogen) y compuestos relacionados, que se sabe que actúan como agonistas de TLR7/8. Vogel y otros, Pharm Biotechnol 6:141 (1995) proporcionan un compendio de adyuvantes que pueden ser útiles en vacunas.

Las composiciones de la invención también pueden emplear sistemas adyuvantes diseñados para inducir una respuesta inmunitaria predominantemente del tipo Th1. Los niveles altos de citoquinas de tipo Th1 (por ejemplo, IFN-y, TNF-a., IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células a un antígeno administrado. Por el contrario, niveles elevados de citoquinas de tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales. Después de la aplicación de una vacuna como se proporciona en la presente descripción, un paciente apoyará una respuesta inmunitaria que incluye respuestas de tipo Th1 y Th2. Dentro de una modalidad preferida, en la que una respuesta es predominantemente de tipo Th1, el nivel de citoquinas de tipo Th1 aumentará en mayor medida que el nivel de citoquinas de tipo Th2. Los niveles de estas citoquinas pueden evaluarse fácilmente mediante el uso de ensayos estándar. Para una revisión de las familias de citoquinas, véase, Mossman & Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173 (1989).

Ciertos adyuvantes para usar en la provocación de una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferentemente monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3d-MPL™), junto con una sal de aluminio (Patentes de Estados Unidos Nos. 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 y 4,912,094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en los que el dinucleótido CpG no está metilado) también inducen una respuesta predominantemente Th1. Dichos oligonucleótidos son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/02555, WO 99/33488 y las Patentes de Estados Unidos Nos. 6,008,200 y 5,856,462. Las secuencias de ADN inmunoestimuladoras también se describen, por ejemplo, por Sato y otros, Science 273:352 (1996). Otro adyuvante ilustrativo comprende una saponina, tal como Quil A, o derivados de la misma, que incluyen QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, Mass.); escina; digitonina; o saponinas de Gypsophila o Chenopodium quinoa. Otras formulaciones ilustrativas incluyen más de una saponina en las combinaciones de adyuvantes de la presente invención, por ejemplo, combinaciones de al menos dos del siguiente grupo que comprende QS21, QS7, Quil A, p-escina o digitonina.

En una modalidad particular, el sistema adyuvante incluye la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, tal como la combinación de adyuvante QS21 y 3D-MPL™, como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica donde el QS21 se inactiva con colesterol, como se describe en el documento WO 96/33739. Otras formulaciones comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Otra formulación de adyuvante que emplea adyuvante QS21, 3D-MPL™ y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.

En ciertas modalidades preferidas, el adyuvante usado en la presente invención es un adyuvante de glucopiranosil lípido A (GLA), como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 20080131466. Por ejemplo, en una modalidad, el adyuvante de GLA usado en el contexto de la presente invención tiene la siguiente estructura:

donde: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C¹¹-C²⁰; y R2 y R4 son alquilo C¹²-C²⁰.

En una modalidad más específica, el GLA tiene la fórmula expuesta anteriormente en donde R1, R3, R5 y R6 son alquilo C^11-14 y R2 y R4 son alquilo C^12-15.

En una modalidad más específica, el GLA tiene la fórmula expuesta anteriormente en donde R1, R3, R5 y R6 son alquilo C¹¹; y R2 y R4 son alquilo C¹³.

Otro sistema adyuvante mejorado implica la combinación de un oligonucleótido que contiene CpG y un derivado de saponina como se divulga en el documento WO 00/09159.

Otros adyuvantes ilustrativos incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), la serie SBAS de adyuvantes (por ejemplo, SBAS-2, AS2', AS2," SBAS-4, o SBAS6, disponibles de SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox, RC-529 (Corixa, Hamilton, Mont.) y otros aminoalquil glucosaminida 4-fosfatos (AGP), tales como aquellos descritos en las Solicitudes de Patentes de Estados Unidos Ser. Nos. 08/853,826 y 09/074,720, y adyuvantes de éter de polioxietileno tales como aquellos descritos en el documento WO 99/52549A1.

La vacuna y las composiciones farmacéuticas pueden formularse mediante el uso de cualquiera de una variedad de procedimientos bien conocidos. En ciertas modalidades, la vacuna o las composiciones farmacéuticas se preparan como emulsiones estables (por ejemplo, emulsiones de aceite en agua) o como soluciones acuosas.

Las composiciones de la invención también pueden, o alternativamente, comprender células T específicas para polipéptidos de fusión que comprenden porciones o fragmentos inmunogénicos/antigénicos de antígenos SMT y NH de Leishmania o variantes de los mismos, descritos en la presente descripción. Generalmente, tales células pueden prepararse in vitro o ex vivo, mediante el uso de procedimientos estándar. Por ejemplo, las células T pueden aislarse de la médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica de un paciente. Alternativamente, las células T pueden derivarse de seres humanos relacionados o no, mamíferos no humanos, líneas celulares o cultivos.

Las células T pueden estimularse con un polipéptido de fusión que comprende antígenos SMT y NH de Leishmania o porciones o variantes inmunogénicas de los mismos, el polinucleótido que codifica dicho polipéptido de fusión y/o una célula presentadora de antígeno (APC) que expresa dicho polipéptido de fusión. Tal estimulación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la generación de células T que son específicas para el polipéptido. En ciertas modalidades, el polipéptido o polinucleótido está presente dentro de un vehículo de administración, tal como una microesfera, para facilitar la generación de células T específicas.

Se considera que las células T son específicas para un polipéptido de fusión de la invención si las células T proliferan específicamente, secretan citoquinas o destruyen las células diana recubiertas con el polipéptido de fusión o que expresan un gen que codifica el polipéptido de fusión. La especificidad de las células T puede evaluarse mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas estándar. Por ejemplo, dentro de un ensayo de liberación de cromo o ensayo de proliferación, un índice de estimulación de más del doble de aumento en lisis y/o proliferación, en comparación con los controles negativos, indica especificidad de células T. Tales ensayos pueden realizarse, por ejemplo, como se describe en Chen y otros, Cancer Res. 54:1065-1070 (1994)). Alternativamente, la detección de la proliferación de células T puede lograrse mediante una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, la proliferación de células T puede detectarse al medir una tasa aumentada de síntesis de ADN (por ejemplo, mediante marcaje con pulsos cultivos de células T con timidina tritiada y marcar la cantidad de timidina tritiada incorporada en el ADN). El contacto con un polipéptido de la invención (100 ng/mL-100 ng/mL, preferentemente 200 ng/mL-25 pg/mL) durante 3-7 días debería dar como resultado un aumento de al menos el doble en la proliferación de las células T. El contacto como se describió anteriormente durante 2-3 horas debería dar como resultado en la activación de las células T, como se midió mediante el uso de ensayos de citoquinas estándar en los que un aumento del doble en el nivel de liberación de citoquinas (por ejemplo, TNF o IFN-^y) es indicativo de activación de células T (véase, Coligan y otros, Current Protocols in Immunology, vol. 1 (1998)). Las células T que se han activado en respuesta a un polipéptido, polinucleótido o APC que expresa un polipéptido pueden ser CD4+ y/o CD8+. Las células T específicas de proteína pueden expandirse mediante el uso de técnicas estándar. Dentro de las modalidades preferidas, las células T se derivan de un paciente, un donante relacionado o un donante no relacionado, y se administran al paciente después de la estimulación y expansión.

En las composiciones de la invención, la formulación de soluciones excipientes y portadoras farmacéuticamente aceptables es bien conocida por aquellos expertos en la técnica, al igual que el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en la presente descripción en una variedad de regímenes de tratamientos, que incluyen, por ejemplo, administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal, intradérmica, subcutánea e intramuscular.

En ciertas aplicaciones, las composiciones divulgadas en la presente descripción pueden administrarse por vía oral a un sujeto. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un portador comestible asimilable, o pueden estar encerradas en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en tabletas, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta.

En ciertas circunstancias, será deseable administrar las composiciones divulgadas en la presente descripción por vía parenteral, intravenosa, intramuscular o incluso intraperitoneal como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 5,543,158; la Patente de Estados Unidos No. 5,641,515 y la Patente de Estados Unidos No.

5,399,363. Pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables en agua mezcladas de manera adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (Patente de Estados Unidos No. 5,466,468, en todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que se pueda inyectar fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede facilitarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero debe volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán un medio acuoso estéril que puede emplearse a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 mL de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 mL de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15ta Edición, pp. 1035-1038 y 1570­ 1580). Necesariamente ocurrirá alguna variación en la dosificación en dependencia de la condición del sujeto a ser tratado. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para la administración humana, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad y de seguridad y pureza generales requeridos por los estándares de la Oficina de Productos Biológicos de la FDA.

Las soluciones inyectables estériles se preparan al incorporar los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan al incorporar los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente esterilizada filtrada del mismo.

Las composiciones divulgadas en la presente descripción pueden formularse en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que es terapéuticamente eficaz para el tratamiento de la leishmaniasis. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Como se usa en la presente descripción, "portador" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, revestimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, tampones, soluciones portadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido por un experto en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse a las composiciones ingredientes activos suplementarios.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción adversa alérgica o similar cuando se administran a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como ingrediente activo es bien conocida por un experto en la técnica. Típicamente, tales composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse.

En ciertas modalidades, las composiciones de la presente invención pueden administrarse mediante pulverizaciones intranasales, inhalación y/u otros vehículos de suministro de aerosol. Se han descrito métodos para administrar genes, polinucleótidos y composiciones de péptidos directamente a los pulmones mediante pulverizaciones de aerosoles nasales, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 5,756,353 y la Patente de Estados Unidos No.

5,804,212. Asimismo, la administración de fármacos mediante el uso de resinas de micropartículas intranasales (Takenaga y otros, 1998) y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (Patente de Estados Unidos No. 5,725,871, también son bien conocidos en las técnicas farmacéuticas. Asimismo, la administración transmucosal de fármacos en forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5,780,045.

En ciertas modalidades, la administración puede producirse mediante el uso de liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas y similares, para la introducción de composiciones que comprenden un polipéptido de fusión como se describe en la presente descripción en células huésped adecuadas. En particular, las composiciones de la presente invención pueden formularse para la administración encapsuladas en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, una nanopartícula o similares. La formulación y el uso de tales vehículos de administración se pueden llevar a cabo mediante el uso de técnicas conocidas y convencionales.

Una composición farmacéutica o inmunogénica puede contener, alternativamente, un inmunoestimulante y una molécula de ADN que codifica uno o más de los polipéptidos o polipéptidos de fusión descritos anteriormente, de manera que se genere in situ un polipéptido deseado. En tales composiciones, el ADN que codifica la proteína de fusión puede estar presente en cualquiera de una variedad de sistemas de administración conocidos por los expertos en la técnica, incluidos los sistemas de expresión de ácidos nucleicos sistemas de expresión de bacterias y virales. Los sistemas de expresión de ácido nucleico apropiados contienen las secuencias de ADN necesarias para la expresión en el paciente (tales como un promotor y una señal de terminación adecuados). Los sistemas de liberación bacterianos implican la administración de una bacteria (tal como Bacillus-Calmette-Guerrin) que expresa una porción inmunogénica del polipéptido en su superficie celular. En una modalidad particular, el ADN puede introducirse mediante el uso de un sistema de expresión viral (por ejemplo, vaccinia u otro poxvirus, retrovirus o adenovirus), que puede implicar el uso de un virus no patógeno (defectuoso) competente en replicación. Las técnicas para incorporar ADN en tales sistemas de expresión son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. El ADN también puede estar "desnudo", como se describe, por ejemplo, en Ulmer y otros, Science 259:1745-1749 (1993) y revisado por Cohen, Science 259:1691-1692 (1993). La captación de ADN desnudo puede incrementarse al revestir el ADN sobre perlas biodegradables, que se transportan de manera eficiente al interior de las células.

Las composiciones farmacéuticas y vacunas divulgadas en la presente descripción pueden usarse, en ciertas modalidades, para inducir inmunidad protectora contra especies de Leishmania tales como L. donovani, L. major y/o L. infantum en un paciente, tal como un ser humano o un perro, para prevenir la leishmaniasis o disminuir su gravedad. Las composiciones y vacunas también pueden usarse para estimular una respuesta inmunitaria, que puede ser celular y/o humoral, en un paciente, para tratar a un individuo ya infectado. En una modalidad, para los pacientes infectados con Leishmania, las respuestas inmunes generadas incluyen una respuesta inmunitaria Th1 preferencial (es decir, una respuesta caracterizada por la producción de las citoquinas interleuquina-1, interleuquina-2, interleuquina-12 y/o interferón-y, así como el factor de necrosis tumoral-a). En otra modalidad, para pacientes no infectados, la respuesta inmunitaria implica la producción de interleuquina-12 y/o interleuquina-2, o la estimulación de células T gamma delta. En cualquier categoría de paciente, la respuesta estimulada puede incluir la producción de IL-12. Dichas respuestas también pueden producirse en muestras biológicas de PBMC o componentes de las mismas derivados de individuos infectados o no infectados con Leishmania. Como se indicó anteriormente, los ensayos para cualquiera de las citoquinas anteriores, así como para otras citoquinas conocidas, generalmente pueden realizarse mediante el uso de métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las dosis y los métodos apropiados de administración de polipéptidos de fusión para estos fines mediante el uso de los conocimientos disponibles en la técnica y/o técnicas de rutina. Las vías y la frecuencia de administración, así como la dosificación, para los aspectos anteriores de la presente invención pueden variar de individuo a individuo y pueden ser paralelas a aquellas que se usan actualmente en la inmunización contra otras infecciones, que incluye las infecciones protozoarias, virales y bacterianas. Por ejemplo, en una modalidad, se administran entre 1 y 12 dosis de composición que tienen un polipéptido de fusión, que comprende polipéptidos de SMT y NH de Leishmania o porciones inmunogénicas/antigénicas, fragmentos o variantes de los mismos, durante un período de 1 año. Las vacunas de refuerzo pueden administrarse periódicamente a partir de entonces según sea necesario o deseado. Por supuesto, los protocolos alternativos pueden ser apropiados para pacientes individuales. En una modalidad particular, una dosis adecuada es una cantidad de polipéptido de fusión o ADN que codifica dicho péptido que, cuando se administra como se describe anteriormente, es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un paciente inmunizado suficiente para proteger al paciente de la leishmaniasis causada por especies de Leishmania tales como L. donovani, L. major y/o L. infantum durante al menos 1-2 años. Generalmente, la cantidad de polipéptido de fusión presente en una dosis (o producido in situ por el ADN en una dosis) varía de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 1 mg por kg de huésped, típicamente de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 100 pg. Los tamaños de dosis adecuados variarán con el tamaño del paciente, pero típicamente, oscilarán entre aproximadamente 0,1 mL y aproximadamente 5 mL.

Composiciones, métodos y estuches de diagnóstico

En otro aspecto, esta invención proporciona compuestos y métodos para detectar leishmaniasis en individuos y en suministros de sangre. En modalidades particulares, el individuo es un mamífero. En modalidades más particulares, el mamífero es un ser humano o un canino.

Por ejemplo, los polipéptidos de fusión y polinucleótidos pueden usarse como reactivos de diagnóstico eficaces para detectar y/o seguimiento de la infección por Leishmania en un paciente. Por ejemplo, las composiciones, polipéptidos de fusión y polinucleótidos de la invención pueden usarse en ensayos in vitro e in vivo para detectar anticuerpos humorales o inmunidad mediada por células contra Leishmania para el diagnóstico de infección, seguimiento de la progresión de la enfermedad o evaluación de la prueba de curación. En modalidades particulares, los polipéptidos de fusión y polinucleótidos son reactivos de diagnóstico útiles para serodiagnóstico y análisis de sangre completa en pacientes que tienen leishmaniasis causada por especies de Leishmania tales como L. donovani, L. major y/o L. infantum.

En un aspecto, los métodos y estuches de diagnóstico emplean preferentemente un polipéptido de fusión o una combinación de polipéptidos como se describe en la presente descripción, tal como un polipéptido de fusión que comprende fragmentos de polipéptidos de SMT y/o NH, repeticiones de fragmentos de polipéptidos o fragmentos de polipéptidos multiméricos, que incluyen fragmentos antigénicos/inmunogénicos. En otro aspecto más específico, los polipéptidos de fusión de la presente invención pueden comprender dos o más fragmentos antigénicos de Leishmania en donde al menos un fragmento es a partir de una secuencia de aminoácidos de NH establecida en las SEQ ID NO: 1, 3 o 5, y al menos un fragmento es de una secuencia de aminoácidos de SMT establecida en las SEQ ID NO: 7, 9 u 11. En una modalidad más particular, un polipéptido de fusión ilustrativo comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 13. En otra modalidad, los métodos y estuches de diagnóstico emplean preferentemente un polipéptido de fusión que comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 porciones o fragmentos inmunogénicos/antigénicos de polipéptidos de SMT y NH de Leishmania, variantes o similares, opcionalmente en combinación con uno o más de otros antígenos de Leishmania o secuencias distintas de Leishmania, como se describe en la presente descripción u obtenibles en la técnica.

Los antígenos pueden usarse esencialmente en cualquier formato de ensayo deseado, por ejemplo, como antígenos individuales ensayados por separado, como ensayos de múltiples antígenos simultáneamente (por ejemplo, un polipéptido de fusión), como antígenos inmovilizados sobre un soporte sólido tal como una matriz, o similares.

En una modalidad, se proporcionan estuches de diagnósti

muestra biológica, que comprenden (a) un polipéptido de fusión que comprende polipéptidos de SMT y NH de Leishmania o variantes de los mismos como se describe en la presente descripción, y (b) un reactivo de detección. En otra modalidad, se proporcionan estuches de diagnósti

muestra biológica, que comprenden (a) anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos que son específicos para un polipéptido de fusión que comprende polipéptidos de SMT y NH de Leishmania o variantes de los mismos como se describe en la presente descripción, y (b) un reactivo de detección.

En otra modalidad, se proporcionan métodos para detectar la presencia de infección por Leishmania en una muestra biológica, que comprenden (a) poner en contacto una muestra biológica con un polipéptido de fusión que comprende polipéptidos de s Mt y NH de Leishmania o variantes de los mismos descritos en la presente descripción; y (b) detectar en la muestra biológica la presencia de anticuerpos que se unen al polipéptido de fusión.

En otra modalidad, se proporcionan métodos para detectar la presencia de infección por Leishmania en una muestra biológica, que comprenden (a) poner en contacto una muestra biológica con al menos 2 anticuerpos monoclonales que se unen a un polipéptido de fusión que comprende polipéptidos de SMT y NH de Leishmania o variantes de los mismos descritos en la presente descripción; y (b) detectar en la muestra biológica la presencia de proteínas de Leishmania que se unen al anticuerpo monoclonal.

Un experto en la técnica reconocería que los métodos y estuches descritos en la presente descripción pueden usarse para detectar todos los tipos de leishmaniasis, en dependencia de la combinación particular de porciones inmunogénicas de antígenos de Leishmania presentes en el polipéptido de fusión.

Existe una variedad de formatos de ensayo conocidos por los expertos en la técnica para mediante el uso de un polipéptido de fusión detectar anticuerpos en una muestra. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. En una modalidad, el ensayo implica el uso de polipéptido de fusión inmovilizado sobre un soporte sólido para unirse y eliminar el anticuerpo de la muestra. A continuación, el anticuerpo unido puede detectarse mediante el uso de un reactivo de detección que se une al complejo anticuerpo/péptido y contiene un grupo reportero detectable. Los reactivos de detección adecuados son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, anticuerpos que se unen al complejo anticuerpo/polipéptido y polipéptido libre marcado con un grupo reportero (por ejemplo, en un ensayo semicompetitivo). Los grupos reporteros adecuados también son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, radioisótopos, marcadores quimioluminiscentes, marcadores electroquimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes, polímeros, partículas poliméricas, partículas metálicas, haptenos y colorantes. Alternativamente, puede utilizarse un ensayo competitivo, en el que un anticuerpo que se une a un polipéptido de fusión de la presente invención marcado con un grupo reportero y se deja que se una al polipéptido de fusión inmovilizado después de la incubación del polipéptido de fusión con la muestra. El grado en el que los componentes de la muestra inhiben la unión del anticuerpo marcado al polipéptido de fusión es indicativo de la reactividad de la muestra con el polipéptido de fusión inmovilizado.

El soporte sólido puede ser cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica al que se pueda unir el polipéptido de fusión. Por ejemplo, el soporte puede ser un pocillo de prueba en una placa de microtitulación o una nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser una perla o un disco, tal como vidrio, fibra de vidrio, látex o una técnica plástica tal como poliestireno o cloruro de polivinilo. El soporte también puede ser una partícula magnética o un sensor de fibra óptica, como aquellos divulgados, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 5,359,681.

El polipéptido de fusión puede unirse al soporte sólido mediante el uso de una variedad de técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica, que se describen ampliamente en la patente y literatura científica. En el contexto de la presente invención, el término "unido" se refiere tanto a la asociación no covalente, como la adsorción, y al enlace covalente (que puede ser una unión directa entre el antígeno y los grupos funcionales en el soporte o puede ser una unión por la vía de un agente de reticulación). Se prefiere la unión por adsorción a un pocilio en una placa de microtitulación o a una membrana. En tales casos, la adsorción puede lograrse al poner en contacto el polipéptido, en un tampón adecuado, con el soporte sólido durante un período de tiempo adecuado. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero típicamente, está entre aproximadamente 1 hora y 1 día. Generalmente, poner en contacto un pocillo de una placa de microtitulación de plástico (tal como poliestireno o cloruro de polivinilo) con una cantidad de polipéptido de fusión que varía de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 1 pg, y preferentemente aproximadamente 100 ng, es suficiente para unir una cantidad adecuada de antígeno. La nitrocelulosa se unirá aproximadamente a 100 pg de proteína por cm3.

La unión covalente del polipéptido de fusión a un soporte sólido generalmente se puede lograr al hacer reaccionar primero el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionará tanto con el soporte como con un grupo funcional, tal como un grupo hidroxilo o amino, en el polipéptido de fusión. Por ejemplo, el polipéptido de fusión puede unirse a un soporte que tiene un recubrimiento de polímero apropiado mediante el uso de benzoquinona o por condensación de un grupo aldehído en el soporte con una amina y un hidrógeno activo en el polipéptido (véase, por ejemplo, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook (1991) en A12-A13).

En ciertas modalidades, el ensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Este ensayo puede realizarse al poner en contacto primero un polipéptido de fusión de la presente invención que ha sido inmovilizado en un soporte sólido, comúnmente el pocillo de una placa de microtitulación, con la muestra, de modo que los anticuerpos contra los antígenos de Leishmania del polipéptido de fusión dentro de la muestra se permite que se unan al polipéptido de fusión inmovilizado. A continuación, la muestra no unida se elimina del polipéptido de fusión inmovilizado y se añade un reactivo de detección capaz de unirse al complejo anticuerpo-polipéptido inmovilizado. La cantidad de reactivo de detección que permanece unido al soporte sólido se determina luego mediante el uso de un método apropiado para el reactivo de detección específico.

Una vez que el polipéptido de fusión se inmoviliza en el soporte, los sitios de unión a proteínas restantes en el soporte son típicamente bloqueados. Puede emplearse cualquier agente de bloqueo adecuado conocido por aquellos expertos en la técnica, tal como albúmina de suero bovino (BSA) o Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). A continuación, el polipéptido inmovilizado se incuba con la muestra y se deja que el anticuerpo (si está presente en la muestra) se una al antígeno. La muestra puede diluirse con un diluyente adecuado, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la incubación. Generalmente, un tiempo de contacto apropiado (es decir, tiempo de incubación) es ese período de tiempo que es suficiente para permitir la detección de la presencia de anticuerpo dentro de una muestra infectada con Leishmania. Preferentemente, el tiempo de contacto es suficiente para lograr un nivel de unión que es al menos 95 % del logrado en el equilibrio entre el anticuerpo unido y no unido. Los expertos en la técnica reconocerán que el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio puede determinarse fácilmente al ensayar el nivel de unión que se produce durante un período de tiempo. A temperatura ambiente, generalmente es suficiente un tiempo de incubación de aproximadamente 30 minutos.

La muestra no unida puede eliminarse al lavar el soporte sólido con un tampón apropiado, tal como PBS que contiene 0,1 % de Tween 20™. A continuación, puede añadirse el reactivo de detección al soporte sólido. Un reactivo de detección apropiado es cualquier compuesto que se une al complejo anticuerpo-polipéptido inmovilizado y que pueda detectarse por cualquiera de una variedad de medios conocidos por aquellos expertos en la técnica. Preferentemente, el reactivo de detección contiene un agente de unión (tal como, por ejemplo, proteína A, proteína G, inmunoglobulina, lectina o antígeno libre) conjugado con un grupo reportero. Los grupos reporteros preferidos incluyen enzimas (tales como peroxidasa de rábano picante), sustratos, cofactores, inhibidores, colorantes, radionúclidos, grupos luminiscentes, grupos fluorescentes, oro coloidal y biotina. La conjugación del agente de unión al grupo reportero puede lograrse mediante el uso de métodos estándar conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los agentes de unión comunes también pueden comprarse conjugados con una variedad de grupos reporteros de muchas fuentes (por ejemplo, Zymed Laboratories, San Francisco, CA y Pierce, Rockford, III).

A continuación, el reactivo de detección se incuba con el complejo polipeptídico de anticuerpo inmovilizado durante un tiempo suficiente para detectar el anticuerpo unido. Generalmente, puede determinarse una cantidad de tiempo apropiada a partir de las instrucciones del fabricante o al ensayar el nivel de unión que se produce durante un período de tiempo. A continuación, se elimina el reactivo de detección no unido y se detecta el reactivo de detección unido mediante el uso del grupo reportero. El método empleado para detectar el grupo reportero depende de la naturaleza del grupo reportero. Para los grupos radiactivos, los métodos de recuento por centelleo o autorradiográficos son generalmente apropiados. Pueden usarse métodos espectroscópicos para detectar colorantes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina puede detectarse mediante el uso de avidina, acoplada a un grupo reportero diferente (comúnmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Los grupos reporteros de enzimas pueden detectarse generalmente mediante la adición de sustrato (generalmente durante un período de tiempo específico), seguido de análisis espectroscópico o de otro tipo de los productos de reacción.

Para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos anti- Leishmania en la muestra, la señal detectada del grupo reportero que permanece unido al soporte sólido se compara generalmente con una señal que corresponde a un valor de corte predeterminado. En una modalidad, el valor de corte es preferentemente la señal media promedio obtenida cuando el polipéptido inmovilizado se incuba con muestras de un paciente no infectado. Generalmente, una muestra que genera una señal que está tres desviaciones estándar por encima del valor de corte predeterminado se considera positiva (es decir, reactiva con el polipéptido). En una modalidad alternativa, el valor de corte se determina mediante el uso de una Curva de Operador de Receptor, de acuerdo con el método de Sackett y otros, Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, p. 106-7 (Little Brown and Co., 1985). Brevemente, en esta modalidad, el valor de corte puede determinarse a partir de una gráfica de pares de tasas de verdaderos positivos (es decir, sensibilidad) y tasas de falsos positivos (100 % de especificidad) que corresponden a cada posible valor de corte para el resultado de la prueba diagnóstica. El valor de corte en el gráfico que está más cerca de la esquina superior izquierda (es decir, el valor que encierra el área más grande) es el valor de corte más exacto, y una muestra que genera una señal que es superior que el valor de corte determinado por este método puede considerarse positiva. Alternativamente, el valor de corte puede desplazarse hacia la izquierda a lo largo del gráfico, para minimizar la tasa de falsos positivos, o hacia la derecha, para minimizar la tasa de falsos negativos.

En otras modalidades, se realiza un ensayo en un formato de ensayo de flujo continuo, en donde el antígeno se inmoviliza en una membrana tal como nitrocelulosa. En la prueba de flujo continuo, los anticuerpos dentro de la muestra se unen al polipéptido inmovilizado cuando la muestra pasa a través de la membrana. Luego, un reactivo de detección (por ejemplo, proteína A-oro coloidal) se une al complejo anticuerpo-polipéptido a medida que la solución que contiene el reactivo de detección fluye a través de la membrana. A continuación, puede realizarse la detección del reactivo de detección unido como se describió anteriormente.

En otras modalidades, un ensayo si se realiza en un formato de prueba de tira, también se conoce como formato de flujo lateral. Aquí, un extremo de la membrana a la que se une el polipéptido se sumerge en una solución que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo de la membrana a través de una región que contiene el reactivo de detección y al área del polipéptido de fusión inmovilizado. La concentración del reactivo de detección en el polipéptido de fusión indica la presencia de anticuerpos a Leishmania en la muestra. Normalmente, la concentración del reactivo de detección en ese sitio genera un patrón, tal como una línea, que se puede leer visualmente. La ausencia de tal patrón indica un resultado negativo. Generalmente, la cantidad de polipéptido de fusión inmovilizado en la membrana se selecciona para generar un patrón discernible visualmente cuando la muestra biológica contiene un nivel de anticuerpos que sería suficiente para generar una señal positiva en un ELISA, como se discutió anteriormente. Preferentemente, la cantidad de polipéptido de fusión inmovilizado en la membrana varía de aproximadamente 25 ng a aproximadamente 1 pg, y con mayor preferencia de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 500 ng. Típicamente, tales pruebas pueden realizarse con una cantidad muy pequeña (por ejemplo, una gota) de suero o sangre del paciente. Las pruebas de flujo lateral pueden funcionar como ensayos competitivos o sándwich.

En otras modalidades más, un polipéptido de fusión de la invención está adaptado para usar en un ensayo plataforma de doble vía (DPP). Tales ensayos se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No.

7,189,522.

Por supuesto, existen muchos otros protocolos de ensayo que son adecuados para usar con los polipéptidos de fusión de la presente invención. Se entenderá que las descripciones anteriores están destinadas a ser solo a modo de ejemplo.

Los ensayos discutidos anteriormente pueden usarse, en ciertos aspectos de la invención, para detectar específicamente la leishmaniasis visceral. En este aspecto, los anticuerpos en la muestra pueden detectarse mediante el uso de un polipéptido de fusión de la presente invención, por ejemplo, que comprende una secuencia de aminoácidos de fragmentos antigénicos/inmunogénicos o epítopos de antígenos SMT y NH de Leishmania. Preferentemente, los antígenos de Leishmania se inmovilizan mediante adsorción a un soporte sólido, tal como un pocillo de una placa de microtitulación o una membrana, como se describió anteriormente, en cantidades aproximadamente similares, de modo que la cantidad total de polipéptido de fusión en contacto con el soporte oscila entre aproximadamente 10 ng a aproximadamente 100 pg. El resto de las etapas en el ensayo pueden realizarse generalmente como se describió anteriormente. Será fácilmente evidente para los expertos en la técnica que, al combinar los polipéptidos descritos en la presente descripción con otros polipéptidos que pueden detectar leishmaniasis cutánea y mucosal, los polipéptidos divulgados en la presente descripción pueden usarse en métodos que detectan todos los tipos de leishmaniasis.

En otro aspecto de esta invención, pueden usarse polipéptidos de fusión inmovilizados para purificar anticuerpos que se unen a ellos. Dichos anticuerpos pueden prepararse mediante cualquiera de una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Land, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. En una de tales técnicas, se inyecta inicialmente un inmunógeno que comprende un polipéptido de fusión de la presente invención en cualquiera de una amplia variedad de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas y cabras). En esta etapa, el polipéptido puede servir como inmunógeno sin modificación. Alternativamente, de forma particular para polipéptidos relativamente cortos, puede provocarse una respuesta inmunitaria superior si el polipéptido se une a una proteína portadora, tal como albúmina de suero bovino o hemocianina de lapa californiana. El inmunógeno se inyecta en el animal huésped, preferentemente de acuerdo con un programa predeterminado que incorpora una o más inmunizaciones de refuerzo, y los animales se sangran periódicamente. Los anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido pueden luego purificarse a partir de dichos antisueros mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad mediante el uso del polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales específicos para el polipéptido de fusión antigénico de interés, por ejemplo, mediante el uso de la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976 y mejoras de las mismas. Brevemente, estos métodos implican la preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tienen la especificidad deseada (es decir, reactividad con el polipéptido de interés). Dichas líneas celulares pueden producirse, por ejemplo, a partir de células de bazo obtenidas de un animal inmunizado como se describió anteriormente. A continuación, las células del bazo se inmortalizan, por ejemplo, mediante fusión con una pareja de fusión de células de mieloma, preferentemente uno que sea singénico con el animal inmunizado. Puede emplearse una variedad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células del bazo y las células de mieloma pueden combinarse con un detergente no iónico durante unos minutos y luego colocarse en placas a baja densidad en un medio selectivo que apoye el crecimiento de las células híbridas, pero no de células de mieloma. Una técnica de selección preferida usa la selección con HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, usualmente alrededor de 1 a 2 semanas, se observan colonias de híbridos. Las colonias individuales se seleccionan y prueban para determinar la actividad de unión contra el polipéptido. Se prefieren los hibridomas que tienen alta reactividad y especificidad.

Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse de los sobrenadantes de colonias de hibridomas en crecimiento. En este proceso, pueden emplearse varias técnicas para mejorar el rendimiento, tales como la inyección de la línea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado adecuado, tal como un ratón. A continuación, pueden recolectarse los anticuerpos monoclonales del líquido ascítico o de la sangre. Los contaminantes pueden eliminarse de los anticuerpos mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción. Pueden usarse uno o más polipéptidos en el proceso de purificación en, por ejemplo, una etapa de cromatografía de afinidad.

Pueden usarse anticuerpos monoespecíficos que se unen a un polipéptido de fusión que comprende dos o más porciones inmunogénicas de antígenos de Leishmania, por ejemplo, para detectar la infección por Leishmania en una muestra biológica mediante el uso de uno de una variedad de inmunoensayos, que pueden ser directos o competitivos. Brevemente, en un formato de ensayo directo, un anticuerpo monoespecífico puede inmovilizarse sobre un soporte sólido (como se describió anteriormente) y ponerse en contacto con la muestra que se va a analizar. Después de eliminar la muestra no unida, puede añadirse un segundo anticuerpo monoespecífico, que se ha marcado con un grupo reportero, y usarlo para detectar el antígeno unido. En un ensayo competitivo ilustrativo, la muestra puede combinarse con el anticuerpo monoclonal o policlonal, que se ha marcado con un grupo reportero adecuado. La mezcla de muestra y anticuerpo puede luego combinarse con antígeno polipeptídico inmovilizado sobre un soporte sólido adecuado. Se deja que el anticuerpo que no se ha unido a un antígeno en la muestra se una al antígeno inmovilizado y se elimina el resto de la muestra y el anticuerpo. El nivel de anticuerpo unido al soporte sólido está inversamente relacionado con el nivel de antígeno en la muestra. Por tanto, un nivel más bajo de anticuerpo unido al soporte sólido indica la presencia de Leishmania en la muestra. Otros formatos para usar anticuerpos monoespecíficos para detectar Leishmania en una muestra serán evidentes para aquellos expertos en la técnica, y los formatos anteriores se proporcionan únicamente con fines ejemplares.

Ejemplos

Ejemplo 1

Inmunogenicidad del polipéptido de fusión y protección contra la Leishmaniasis

Polipéptido de fusión NS. El polipéptido de fusión denominado NS (también conocido como LEISH F3) se generó mediante el enlace en tándem de dos marcos de lectura abiertos de Leishmania que codifican las proteínas, nucleósido hidrolasa no específica (NH) y esterol 24-c-metiltransferasa (SMT). LEISH F3 tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 13, que contiene los residuos 1 a 314 de la proteína NH de Leishmania infantum/donovani de longitud completa, y los residuos 2 a 353 de la proteína SMT de Leishmania infantum de longitud completa. El polipéptido de fusión de 666 aminoácidos tiene una masa predicha de 73992 Da y se expresó en E. coli y purificó por cromatografía.

Respuesta humoral. Se realizaron experimentos para comparar los niveles de anticuerpos inducidos contra NS en ausencia o presencia de adyuvantes en ratones Balb/c. Los ratones se inmunizaron intramuscularmente tres veces con 3 semanas de diferencia con solución salina, antígeno NS solo (10 pg), NS (10 pg) GLA-SE (5 pg: glucopiranosil lípido A en una emulsión estable) o NS (10 pg) MPL-SE (20 pg; monofosforil lípido A en una emulsión estable). Se recolectó el suero de ratones inmunizados 3 semanas después de la tercera inmunización. Los ratones inyectados con NS en ausencia de un adyuvante montan una respuesta de anticuerpo específico a NS que es predominantemente IgG1, lo que indica una respuesta similar a Th-2. Sin embargo, los ratones BALB/c inyectados con NS formulado en adyuvantes de emulsión estable basados en TLR4 (GLA-SE o MPL-SE) generaron una IgG específica a NS fuerte que era predominantemente IgG2a, lo que indica una respuesta de tipo Th1 (figura 2). No se detectaron respuestas de anticuerpos contra NS en animales inmunizados con solución salina.

Respuesta celular. Para determinar si la inmunización con NS indujo una respuesta de células T, se evaluaron las respuestas de recuperación específicas a antígeno, 4 semanas después del último refuerzo. Los esplenocitos aislados de ratones inmunizados con NS formulados en GLA-SE o MPL-SE secretaron grandes cantidades de la citoquina de tipo Th1, IFN-y en respuesta al antígeno. En contraste, el grupo de antígeno solo mostró respuestas de IFN-^y mucho más débiles (figura 3), en concordancia con la respuesta humoral observada en estos ratones (figura 2). Estudios profilácticos. El polipéptido de fusión NS también se evaluó con respecto a la protección contra la leishmaniasis visceral (VL) mediante el uso del modelo de ratón Balb/c. Los ratones se inmunizaron subcutáneamente 3 veces con 3 semanas de diferencia con NS (7,4 pg o 0,74 pg) formulado con GLA-SE (5 pg) o MPL-SE (20 pg). Los animales inmunizados con solución salina actuaron como control negativo para el experimento. Un mes después de la última inmunización, los ratones se expusieron por vía intracardíaca a 5 x 106 de promastigotes de L. donovani. Los hígados se recolectaron un mes después de la exposición y se determinaron las cargas de parásitos mediante un ensayo de dilución limitante. 7,4 pg de NS formulado con GLA-SE (5 pg) o MPL-SE (20 pg) dieron como resultado reducciones del 73 % y 85 % en la carga de parásitos en el hígado, respectivamente.

0,74 pg de NS formulado como anteriormente dieron como resultado reducciones del 70 % y 87 % en la carga de parásitos del hígado, respectivamente, en comparación con el grupo de control de solución salina (figura 4).

Ejemplo 2

Estudio de seguridad e inmunogenicidad en primates no humanos

Se realizó un estudio de eficacia y seguridad de dosis múltiples en monos Rhesus para evaluar la seguridad e inmunogenicidad de una vacuna de Leishmania que consiste en el antígeno NS con GLA-SE o MPL-SE, en comparación con antígeno solo, después de la administración intramuscular los días 1, 29 y 57 en monos rhesus machos y hembras.

Tabla I: Diseño del estudio de primates no humanos

Se asignaron al azar quince machos y catorce hembras de monos Rhesus vírgenes (Macaca mulatta) de origen chino (de 2 a 9 años y de 3 a 9 kg en el examen previo al estudio) en cuatro grupos de dosis (tabla I). Las observaciones clínicas se realizaron dos veces al día, los pesos corporales se midieron una vez a la semana y las temperaturas rectales se tomaron diariamente durante tres días después de la administración de cada dosis. Los sitios de inyección se controlaron durante tres días después de la administración de cada dosis mediante el uso de un sistema de puntuación de observación dérmica. Se recolectaron muestras de patología clínica (hematología, coagulación y química del suero, incluida la electroforesis) en los puntos de tiempo programados. Se recolectaron muestras de sangre para estimulación (análisis de sangre completa) y análisis de anticuerpos en suero en los puntos de tiempo programados.

Respuestas humorales a la vacuna NS en primates no humanos. Los niveles de IgG totales específicos a NS se evaluaron en sueros de animales individuales para todos los grupos de monos rhesus vacunados al inicio del estudio (día -8; d-8) y posteriormente 2 semanas después de la primera inmunización (día 15; d15), 1 semana después del 1er refuerzo (día 36; d36) y finalmente 1 semana del 2do refuerzo (day64; d64) por ELISA (figura 5). Ninguno de los animales presentó respuesta de anticuerpos contra NS al inicio del estudio (día -8). En animales inmunizados con antígeno solo (grupo #1) no se detectaron respuestas de anticuerpos al d15 o d36 y las respuestas de anticuerpos fueron muy débiles al d64. Por el contrario, los grupos 2-4 que contienen NS en presencia de un adyuvante montaron respuestas de anticuerpos después de la primera vacunación (d 15) y los títulos de anticuerpos fuertes se observaron en todos los animales al d36 (1 semana después del 1er refuerzo) y permanecieron altos al d64 (1 semana después del 2do refuerzo).

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de fusión que comprende una secuencia polipeptídica de esterol 24-c-metiltransferasa (SMT) de Leishmania y una secuencia polipeptídica de nucleósido hidrolasa (NH) no específica de Leishmania, en donde la secuencia polipeptídica de NH de Leishmania comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 3 y 5, o una secuencia que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 % o al menos 97 % de identidad con las mismas; y en donde la secuencia polipeptídica de SMT de Leishmania comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 9 y 11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 % o al menos 97 % de identidad con las mismas.

2. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, en donde la secuencia polipeptídica de NH de Leishmania comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 3 y 5, y la secuencia polipeptídica de SMT de Leishmania comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 9 y 11.

3. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de fusión comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 13, o una secuencia que tiene al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % de identidad con la misma.

4. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Una composición que comprende al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un polinucleótido de la reivindicación 4, en combinación con al menos un inmunoestimulante.

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el inmunoestimulante se selecciona del grupo que consiste en un oligonucleótido que contiene CpG, lípido A sintético, monofosforil lípido A (MPL™), monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL™), saponinas, miméticos de saponina, aminoalquil glucosaminida 4-fosfatos (AGP), agonistas de receptores de tipo Toll (TLR) tales como un agonista de TLR4, un agonista de TLR7/8 o un agonista de TLR9, adyuvante glucopiranosil lipídico (GLA), imiquimod, gardiquimod y resiquimod o una combinación de los mismos.

7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5 o 6 para usar en un método para estimular una respuesta inmunitaria contra Leishmania en un mamífero, en donde el polipéptido o polinucleótido de fusión en la composición se incorpora a un sistema de expresión de ácido nucleico o sistema de expresión bacteriano o viral.

8. Un método para detectar la infección por Leishmania en una muestra biológica, que comprende:

a. poner en contacto una muestra biológica con un polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el polipéptido de fusión está opcionalmente unido a un soporte sólido; y b. detectar en la muestra biológica la presencia de anticuerpos que se unen al polipéptido de fusión, lo que detecta así la infección por Leishmania en una muestra biológica.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sueros, sangre y saliva.

10. Un reactivo de diagnóstico que comprende un polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 inmovilizado sobre un soporte sólido.

11. Un estuche de diagnósti

comprende un polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un reactivo de detección.

12. El estuche de la reivindicación 11, en donde el estuche comprende un formato de ensayo seleccionado del grupo que consiste en un ensayo de tira de prueba de flujo lateral, un ensayo de plataforma de doble vía y un ensayo ELISA.

13. Un estuche de diagnóstico en el punto de atención para detectar la infección por Leishmania en una muestra biológica que comprende un polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 inmovilizado sobre un soporte sólido en un formato de tira de prueba de flujo lateral.