ES2528928T3 - Vacunas de poliproteína recombinante para el tratamiento y diagnóstico de leishmaniosis - Google Patents

Abstract

Un polipéptido de fusión que comprende una porción inmunogénica de al menos cuatro antígenos de Leishmania, en el que los antígenos de Leishmania son KMP11, SMT, A2 y CPB, en el que el polipéptido de fusión comprende una secuencia aminoacídica exhibida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 23, 33 o 37, o una secuencia que tiene al menos un 97 % de identidad con la misma; y en el que el polipéptido de fusión es capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora para prevenir la leishmaniosis o reducir la gravedad de la leishmaniosis en un mamífero.

Description

Vacunas de poliproteína recombinante para el tratamiento y diagnóstico de leishmaniosis

5 ANTECEDENTES

Campo técnico

[0001] La presente descripción se refiere en general a composiciones y procedimientos para prevenir, tratar y detectar leishmaniosis en pacientes. Más particularmente, la descripción se refiere a composiciones y procedimientos que comprenden polipéptidos de fusión de Leishmania, así como a polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos de fusión.

Descripción de la técnica relacionada

15 [0002] Los organismos Leishmania son parásitos intracelulares obligados que causan un gran espectro clínico de enfermedades denominadas leishmaniosis. Los organismos Leishmania son parásitos protozoarios intracelulares del género Leishmania. Los organismos Leishmania se orientan a macrófagos hospedadores, causando por tanto un amplio espectro de enfermedades clínicas en seres humanos y animales domésticos, principalmente perros. En algunas infecciones, el parásito puede permanecer latente durante muchos años. En otros casos, el hospedador puede desarrollar una de una variedad de formas de leishmaniosis. Las leishmaniosis se clasifican a grandes rasgos en tres tipos de enfermedades, leishmaniosis cutánea (LC), leishmaniosis mucosa (LM) y leishmaniosis visceral (LV), según las manifestaciones clínicas.

25 [0003] La leishmaniosis es un problema grave en gran parte del mundo, incluyendo Brasil, China, África oriental y zonas de Oriente medio. La enfermedad es también endémica en la región mediterránea, incluyendo el sur de Francia, Italia, Grecia, España, Portugal y norte de África. El número de casos de leishmaniosis ha aumentado drásticamente en los últimos 20 años, y existen ahora millones de casos de esta enfermedad en todo el mundo. Se diagnostican aproximadamente 2 millones de casos nuevos cada año, un 25 % de los cuales son de leishmaniosis visceral.

[0004] La leishmaniosis visceral (LV) se ha reseñado en 88 países, pero aproximadamente un 90 % de los casos de LV aparecen en Brasil, India, Sudán, Bangladesh y Nepal (Méndez y col. J. Immunol. 2001; 166(8): pág. 5122-8). La incidencia anual se estima que es de aproximadamente 500.000 casos de LV, y la población en riesgo

35 es de 350 millones (Engwerda y col. Eur. J. Immunol. 1998; 28(2): pág. 669-80; Squires y col. J. Immunol. 1989; 143(12): pág. 4244-9). La leishmaniosis visceral, está causada generalmente por especies del complejo L. donovani, concretamente L. donovani y L. infantum (chagasi). L. donovani es el agente causante de leishmaniosis visceral en África y Asia, L. infantumlchagasi en los países mediterráneos y en el Nuevo Mundo (Piedrafita y col. J. Immunol. 1999; 163(3): pág. 1467-72). La LV es una enfermedad debilitante grave que evoluciona hasta infección visceral que afecta a bazo, hígado y nódulos linfáticos que, no tratada, es generalmente una enfermedad mortal. Los síntomas de leishmaniosis visceral aguda incluyen hepatoesplenomegalia, fiebre, leucopenia, anemia e hipergammaglobulinemia. La LV activa es generalmente mortal a menos que se trate apropiadamente.

[0005] Los parásitos de Leishmania se transmiten por la picadura de moscas de la arena y los promastigotes

45 infecciosos se diferencian y replican como amastigotes en macrófagos del hospedador mamífero. Al igual que con otros patógenos intracelulares, las respuestas inmunitarias celulares son críticas para la protección frente a leishmaniosis. Las respuestas inmunitarias Th1 desempeñan un papel importante en la mediación de la protección frente a Leishmania, incluyendo papeles para linfocitos T CD4+ y CD8+, IFN-γ, IL-12, TNF-α y NO, mientras que se han reseñado efectos inhibidores para IL-10 y TGF-β (Engwerda y col. Eur. J. Immunol. 1998; 28(2): pág. 669-80; Murphy y col. Eur. J. Immunol. 2001; 31(10): pág. 2848-56; Murray y col. J. Exp. Med. 1999; 189(4): pág. 741-6; Murray y col. Infect. Immun. 2000; 68(11): pág. 6289-93; Squires y col. J. Immunol. 1989; 143(12): pág. 4244-96; Taylor y Murray. J. Exp. Med. 1997; 185(7): pág. 1231-9; Kaye y Bancroft. Infect. Immun. 1992; 60(10): pág. 433542; Stern y col. J. Immunol. 1988; 140(11): pág. 3971-7; Wilson y col. J. Immunol. 1998; 161(11): pág. 6148-55).

55 [0006] La inmunización contra leishmaniosis en modelos animales puede efectuarse mediante el suministro de vectores de ADN que codifica antígeno (Gurunathan y col. J. Exp. Med. 1997; 186(7): pág. 1137-47; Piedrafita y col.

J. Immunol. 1999; 163(3): 1467-72; Méndez y col. J. Immunol. 2001; 166(8): pág. 5122-8) o mediante la administración de proteínas formuladas con coadyuvantes inductores de Th1 incluyendo IL-12 (Afonso y col. Science. 1994; 263(5144): pág. 235-7; Stobie y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97(15): pág. 8427-32; Kenney y col. J. Immunol. 1999; 163(8): pág. 4481-8) o ligandos de TLR tales como oligonucleótidos CpG (Rhee y col. J. Exp. Med. 2002; 195(12): pág. 1565-73; Stacey y Blackwell. Infect. Immun. 1999; 67(8): pág. 3719-26; Walker y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96(12): pág. 6970-5) y monofosforil-lípido A (Coler y col. Infect. Immun. 2002; 70(8): pág. 4215-25; Skeiky y col. Vaccine. 2002; 20 (2728): pág. 3292-303).

65 [0007] A pesar de algunas pruebas de que las vacunas de subunidades pueden ser eficaces en ciertos modelos de LV (Basu y col. J. Immunol. 2005; 174(11): pág. 7160-71; Stager y col. J. Immunol. 2000; 165(12): pág.

7064-71; Ghosh y col. Vaccine. 2001; 20(12): pág. 59-66; Wilson y col. Infect. Immun. 1995; 63(5): pág. 2062-9; Tewary y col. J. Infect. Dis. 2005; 191(12): pág. 2130-7; Aguilar-Be y col. Infect. Immun. 2005; 73(2): pág. 812-9. Rafati y col. Vaccine. 2006; 24(12): 2169-75), faltan progresos hacia la definición de candidatos a antígeno eficaces contra LV in vivo.

5 [0008] Las estrategias que emplean vacunas consistentes en organismos enteros para prevenir o tratar leishmaniosis no han sido eficaces en seres humanos. En consecuencia, sigue habiendo una significativa necesidad de composiciones inmunogénicas y vacunas que puedan prevenir y/o tratar eficazmente la leishmaniosis en seres humanos y otros mamíferos (por ejemplo, caninos). La presente descripción satisface estas necesidades y ofrece

10 otras ventajas relacionadas.

BREVE SUMARIO

[0009] La presente invención proporciona un péptido de fusión que comprende una porción inmunogénica de

15 al menos cuatro antígenos de Leishmania, en el que los antígenos de Leishmania son KMP11, SMT, A2 y CPB, en el que el polipéptido de fusión comprende una secuencia aminoacídica exhibida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 23, 33 o 37, o una secuencia que tiene al menos un 97 % de identidad con ellas; y en el que el polipéptido de fusión es capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora para prevenir la leishmaniosis o reducir la gravedad de la leishmaniosis en un mamífero.

20 [0010] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de fusión de la presente invención.

[0011] En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende al menos un 25 componente seleccionado del grupo consistente en un polipéptido según la presente invención y un polinucleótido según la presente invención, en combinación con al menos un inmunoestimulante.

[0012] La presente invención proporciona, en otro aspecto, la composición según la presente invención para uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria contra leishmaniosis en un mamífero.

30 [0013] La presente invención proporciona, en un aspecto adicional, la composición según la presente invención para uso en la inducción de inmunidad protectora frente a leishmaniosis en un mamífero.

[0014] En otro aspecto, la presente invención proporciona la composición según la presente invención para 35 uso en la inducción de inmunidad protectora frente a leishmaniosis en un canino, en la que el inmunoestimulante es GLA y en la que la composición se formula como una emulsión de aceite en agua estable.

[0015] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar infección por Leishmania en una muestra biológica, que comprende: 40 a) poner en contacto una muestra biológica con un polipéptido de fusión de la presente invención; y

b) detectar en la muestra biológica la presencia de anticuerpos que se unen al polipéptido de fusión, detectando así la infección por Leishmania en una muestra biológica.

45 [0016] En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit de diagnóstico para detectar infección por Leishmania en una muestra biológica que comprende:

a) un polipéptido de fusión de la presente invención; y 50 b) un reactivo de detección.

[0017] En pocas palabras, la presente descripción proporciona composiciones y procedimientos para prevenir, tratar y detectar leishmaniosis. En un aspecto, se proporcionan polipéptidos de fusión de la descripción que 55 comprenden una porción inmunogénica de al menos dos antígenos de Leishmania seleccionados del grupo consistente en KMP11, SMT, A2 y/o CPB, o secuencias que tienen al menos un 90 % de identidad con los mismos. En una realización más particular, los polipéptidos de Leishmania KMP11, SMT, A2 y/o CPB, o una porción o variante inmunogénica de los mismos, comprenden una secuencia aminoacídica de una secuencia de KMP11, SMT, A2 y/o CPB de L. donovani, L infantum o L. major, o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con las

60 mismas.

[0018] En una realización más específica, un polipéptido de fusión de la descripción comprende una secuencia aminoacídica exhibida en la SEQ ID NO: 21 (por ejemplo, polipéptido de fusión KSA) o SEQ ID NO: 23 (por ejemplo, polipéptido de fusión KSAC) o SEQ ID NO: 33 (por ejemplo, KSAFLC, en el que se usa una secuencia

65 de A2 completa).

[0019] En otra realización de la descripción, se modifica un polipéptido de fusión de la presente memoria reemplazando uno o más de los residuos de cisteína del polipéptido por residuos alternativos, tales como serina o alanina, o cualquier otro residuo incapaz de formación de enlaces disulfuro intercatenarios o intracatenarios, produciendo un polipéptido de fusión de cisteína modificada. En una realización más específica, el polipéptido de

5 fusión de cisteína modificada comprende una secuencia aminoacídica exhibida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 37 (por ejemplo, polipéptido de fusión KSAC de cisteína modificada) o SEQ ID NO: 35 (por ejemplo, polipéptido de fusión KSA de cisteína modificada).

[0020] En otras realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden polipéptidos de fusión en combinación con inmunoestimulantes. En aún otras realizaciones, se proporcionan también composiciones que comprenden polinucleótidos que codifican los polipéptidos de fusión. Dichas composiciones de la descripción son preferiblemente capaces de proporcionar protección frente a leishmaniosis tal como la causada por infección por L. major, L. infantum o L. donovani en un ensayo in vivo.

15 [0021] Se proporcionan también por la descripción vectores de expresión recombinante y suministro que comprenden secuencias polinucleotídicas de la descripción y células hospedadoras transformadas o transfectadas con dichos vectores de expresión.

[0022] En otras realizaciones, la presente descripción proporciona procedimientos para estimular una respuesta inmunitaria contra leishmaniosis en un mamífero, que comprende administrar una composición como se describe en la presente memoria.

[0023] En todavía otras realizaciones, la presente descripción proporciona procedimientos para inducir inmunidad protectora frente a leishmaniosis en un mamífero, que comprenden administrar una composición como se

25 describe en la presente memoria.

[0024] En aún otras realizaciones, la presente descripción contempla procedimientos para detectar infección por Leishmania en una muestra biológica, por ejemplo, sueros, sangre, saliva, etc., que comprenden poner en contacto la muestra biológica con un polipéptido de fusión de la invención y detectar en la muestra biológica la presencia de anticuerpos que se unen al polipéptido de fusión, detectando así la infección por Leishmania en una muestra biológica. En realizaciones relacionadas, el polipéptido de fusión puede estar opcionalmente unido a un soporte sólido.

[0025] Diversas realizaciones de la presente descripción proporcionan también kits para uso en la detección

35 de infección por Leishmania en una muestra biológica, que comprenden un polipéptido de fusión o polinucleótido de la invención y un reactivo de detección.

[0026] Estos y otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos adjuntos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE VARIAS VISTAS DE LOS DIBUJOS

[0027]

45 La Figura 1 muestra la protección frente a infección por L. infantum mediante inmunización con polipéptidos de fusión KSA o KSAC. Se expusieron a L. infantum ratones C57BL/6 inoculados con disolución salina solo, SMT+MPL-SE, KSA+MPL-SE o KSAC+MPL-SE, y se midió el número de parásitos en el hígado mediante dilución limitante 4 semanas después de la infección. Se muestran la media y EEM de 5 ratones en cada grupo. **P<0,01 y ***P<0,001 mediante prueba de t no emparejada en comparación con el grupo salino.

La Figura 2 muestra la protección frente a infección por L. donovani mediante inmunización con polipéptidos de fusión KSA o KSAC. Se expusieron a L. donovani ratones BALB/c inoculados con disolución salina solo, KSA+MPL-SE o KSAC+MPL-SE y se midió el número de parásitos en el hígado mediante dilución limitante 4 semanas después de la infección. Se muestran media y EEM de 5 ratones en cada grupo. *P<0,05 mediante prueba de t no

55 emparejada en comparación con el grupo salino.

La Figura 3 muestra la protección frente a infección por L. major mediante inmunización con un polipéptido de fusión KSAC. Se expusieron a L. major por vía intradérmica en ambas orejas derecha e izquierda ratones BALB/c inoculados con disolución salina (círculos/barras blancos) o KSAC+MPL-SE (círculo/barras negros). (A) Se midieron los tamaños de lesión cada semana hasta las 8 semanas. Se muestran la media y EEM de 5 ratones en cada grupo.

(B) Se midieron los números de parásitos en las lesiones de oreja a las 8 semanas de la infección por dilución limitante.

La Figura 4 muestra la secuencia polinucleotídica (SEQ ID NO: 22) que codifica un polipéptido de fusión KSA que

65 comprende una secuencia polinucleotídica de una porción inmunogénica de KMP11 representada por los polinucleótidos 1-276 de SEQ ID NO:29 (en cursiva), que está fusionada con una porción inmunogénica de SMT

representada por los polinucleótidos 1-1056 de SEQ ID NO: 30 (subrayado), que está adicionalmente fusionada con una porción inmunogénica de A2 representada por los polinucleótidos 1345-1974 de SEQ ID NO: 22 (en negrita). Las secuencias polinucleotídicas de ligamiento están en texto simple y delimitadas por paréntesis. El codón de terminación TAA terminal está también en texto simple.

5 Las Figuras 5A-5B muestran la secuencia polinucleotídica (SEQ ID NO: 24) que codifica un polipéptido de fusión KSAC que comprende una secuencia polinucleotídica de una porción inmunogénica de KMP11 representada por los polinucleótidos 1-276 de SEQ ID NO:29 (en cursiva), que está fusionada con una porción inmunogénica de SMT representada por los polinucleótidos 1-1056 de SEQ ID NO: 30 (subrayado), que está adicionalmente fusionada con

10 una porción inmunogénica de A2 representada por los polinucleótidos 1345-1974 de SEQ ID NO: 24 (en negrita), que está adicionalmente fusionada con una porción inmunogénica de CBP representada por los polinucleótidos 1948 de SEQ ID NO: 32 (texto simple). Las secuencias polinucleotídicas de ligamiento están en texto simple y delimitadas por paréntesis. El codón de terminación TAA terminal está también en texto simple.

15 La Figura 6 muestra la secuencia aminoacídica de un polipéptido de fusión KSA (SEQ ID NO: 21) que comprende una secuencia aminoacídica de una porción inmunogénica de KMP11 representada por los aminoácidos 1-92 de SEQ ID NO: 25 (en cursiva), que está fusionada con una porción inmunogénica de SMT representada por los aminoácidos 1-352 de SEQ ID NO: 26 (subrayado), que está adicionalmente fusionada con una porción inmunogénica de A2 representada por los aminoácidos 1-210 de SEQ ID NO: 27 (en negrita). Los aminoácidos de

20 ligamiento están en texto simple y delimitados por paréntesis.

La Figura 7 muestra la secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido de fusión KSAC (SEQ ID NO: 23) que comprende la secuencia aminoacídica de una porción inmunogénica de KMP11 representada por los aminoácidos 192 de SEQ ID NO: 25 (en cursiva), que está fusionada con una porción inmunogénica de SMT representada por los

25 aminoácidos 1-352 de SEQ ID NO: 26 (subrayado), que está adicionalmente fusionada con una porción inmunogénica de A2 representada por los aminoácidos 1-210 de SEQ ID NO: 27 (negrita), que está adicionalmente fusionada con una porción inmunogénica de CBP representada por los aminoácidos 1-316 de SEQ ID NO: 28 (texto simple). Los aminoácidos de ligamiento están en texto simple y delimitados por paréntesis.

30 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS IDENTIFICADORES DE SECUENCIA [0028]

La SEQ ID NO: 1 es una secuencia aminoacídica de un polipéptido KMP 11 completo de L. infantum. 35 La SEQ ID NO: 2 es una secuencia aminoacídica de un polipéptido KMP 11 completo de L. donovani.

La SEQ ID NO: 3 es una secuencia aminoacídica de un polipéptido KMP 11 completo de L. major.

40 La SEQ ID NO: 4 es una secuencia aminoacídica de un polipéptido de esterol 24-c-metiltransferasa (SMT) completo de L. infantum.

La SEQ ID NO: 5 es una secuencia aminoacídica de un polipéptido de esterol 24-c-metiltransferasa (SMT) completo de L. donovani.

45 La SEQ ID NO: 6 es una secuencia aminoacídica de un polipéptido de esterol 24-c-metiltransferasa (SMT) completo de L. major.

La SEQ ID NO: 7 es una secuencia aminoacídica de un polipéptido A2 completo de L. infantum. 50 La SEQ ID NO: 8 es una secuencia aminoacídica de un polipéptido CBP completo de L. infantum.

La SEQ ID NO: 9 es una secuencia aminoacídica de un polipéptido CBP completo de L. donovani.

55 La SEQ ID NO: 10 es una secuencia aminoacídica de un polipéptido CBP completo de L. major.

La SEQ ID NO: 11 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 12 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2. 60 La SEQ ID NO: 13 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 3.

La SEQ ID NO: 14 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 4.

65 La SEQ ID NO: 15 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 5.

La SEQ ID NO: 16 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 6. La SEQ ID NO: 17 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 7.

5 La SEQ ID NO: 18 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 8. La SEQ ID NO: 19 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 9. La SEQ ID NO: 20 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 10. La SEQ ID NO: 21 es una secuencia aminoacídica de un polipéptido de fusión KSA (KMP11, SMT, A2). La SEQ ID NO: 22 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 21.

15 La SEQ ID NO: 23 es una secuencia aminoacídica de un polipéptido de fusión KSAC (KMP11, SMT, A2, CPB). La SEQ ID NO: 24 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 23. La SEQ ID NO: 25 es la secuencia aminoacídica de una porción inmunogénica de un polipéptido KMP 11. La SEQ ID NO: 26 es la secuencia aminoacídica de una porción inmunogénica de un polipéptido SMP. La SEQ ID NO: 27 es la secuencia aminoacídica de una porción inmunogénica de un polipéptido A2.

25 La SEQ ID NO: 28 es la secuencia aminoacídica de una porción inmunogénica de un polipéptido CBP. La SEQ ID NO: 29 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 25. La SEQ ID NO: 30 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 26. La SEQ ID NO: 31 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 27. La SEQ ID NO: 32 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 28.

35 La SEQ ID NO: 33 es una secuencia aminoacídica de una versión alternativa de un polipéptido de fusión KSAC (KMP11, SMT, A2, CPB), en la que se usa la secuencia de A2 completa.

La SEQ ID NO: 34 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 33. La SEQ ID NO: 35 es una secuencia aminoacídica de una versión alternativa de un polipéptido de fusión KSA (KMP11, SMT, A2), en la que los residuos de cisteína presentes en el polipéptido de fusión se han reemplazado por serinas o alaninas.

La SEQ ID NO: 36 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 35.

45 La SEQ ID NO: 37 es una secuencia aminoacídica de una versión alternativa de un polipéptido de fusión KSAC (KMP11, SMT, A2, CPB), en la que los residuos de cisteína presentes en el polipéptido de fusión se han reemplazado por serinas o alaninas.

La SEQ ID NO: 38 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 37.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0029] Como se observa anteriormente, la presente descripción está dirigida en general a composiciones y

55 procedimientos para prevenir, tratar y detectar leishmaniosis. Las composiciones de la descripción incluyen, por ejemplo, polipéptidos de fusión y combinaciones de polipéptidos que comprenden al menos dos porciones o fragmentos inmunogénicos/antigénicos de los polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania o una variante de dicho polipéptido, en los que la porción o variante retiene sustancialmente las mismas o similares propiedades inmunogénicas que el correspondiente polipéptido completo. Como se demuestra adicionalmente en la presente memoria, las estrategias de inmunización que usan composiciones de la invención proporcionan una protección in vivo significativa frente a L. infantum, L. donovani y L. major, que son los agentes causantes de LV en seres humanos y perros. Adicionalmente, el efecto profiláctico conseguido usando composiciones de la presente invención muestra mejoras y ventajas sustanciales respecto a estrategias de vacuna reseñadas anteriormente. La presente descripción contempla también, en otras realizaciones, usar los polipéptidos de fusión descritos en la presente

65 memoria en aplicaciones de diagnóstico incluyendo, pero sin limitación, serodiagnóstico y ensayo en sangre completa en pacientes y perros.

[0030] Como se usa en la presente memoria, el término “polipéptido” engloba cadenas aminoacídicas de cualquier longitud, incluyendo proteínas completas, en el que los residuos aminoacídicos están ligados por enlaces covalentes. Un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de un polipéptido de Leishmania puede 5 consistir únicamente en una porción inmunogénica, puede contener dos o más porciones inmunogénicas y/o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales pueden derivar de un polipéptido nativo de Leishmania

o pueden ser heterólogas, y dichas secuencias heterólogas pueden (pero no necesariamente) ser inmunogénicas.

[0031] En diversas realizaciones, las composiciones y procedimientos de la presente invención proporcionan un polipéptido de fusión que comprende dos o más porciones o fragmentos inmunogénicos/antigénicos de los polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania, o una variante de los mismos. En realizaciones particulares, un polipéptido de fusión comprende dos o más fragmentos de antígeno de Leishmania como se indica en las SEQ ID NO: 1-10 y 25-28. En realizaciones relacionadas, el polipéptido de fusión comprende la secuencia aminoacídica exhibida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 21 o 35 (por ejemplo, KSA) o en las SEQ ID NO: 23 o 33 o 37 (por

15 ejemplo, KSAC).

[0032] En otras realizaciones, los polipéptidos de fusión y combinaciones de polipéptidos se modifican para reemplazar los residuos de cisteína contenidos en los mismos por residuos de serina, en las que los polipéptidos de cisteína modificada retienen sustancialmente las mismas o similares propiedades inmunogénicas que los correspondientes polipéptidos no modificados. Por ejemplo, un polipéptido de fusión de cisteína modificada, en ciertas realizaciones específicas, comprende una secuencia aminoacídica exhibida en las SEQ ID NO: 35 (KSA) o 37 (KSAC).

POLIPÉPTIDOS DE FUSIÓN DE LEISHMANIA Y USOS DE LOS MISMOS

25 [0033] En un aspecto, la presente descripción proporciona polipéptidos aislados de Leishmania, como se describen en la presente memoria, incluyendo polipéptidos de fusión y composiciones que contienen los mismos. Generalmente, un polipéptido de la presente descripción será un polipéptido aislado y puede comprender un fragmento polipeptídico (por ejemplo, una porción antigénica/inmunogénica), múltiples fragmentos polipeptídicos o un polipéptido completo de una secuencia aminoacídica de dos o más genes de Leishmania incluyendo, pero sin limitación, KMP11, SMT, A2 y/o CPB. Un “polipéptido aislado” es aquel que se retira de su entorno original. Por ejemplo, una proteína de origen natural está aislada si está separada de algunos o todos de los materiales coexistentes en el sistema natural. Preferiblemente, dichos polipéptidos son al menos aproximadamente un 90 % puros, más preferiblemente al menos aproximadamente un 95 % puros, y lo más preferiblemente al menos

35 aproximadamente un 99 % puros. Un especialista en la materia apreciaría que los fragmentos polipeptídicos antigénicos podrían obtenerse también a partir de aquellos ya disponibles en la materia. Los polipéptidos de la descripción y fragmentos antigénicos/inmunogénicos de los mismos, y otras variantes, pueden prepararse usando técnicas recombinantes y/o sintéticas convencionales.

[0034] Es una porción inmunogénica de un polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania una porción que es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria (concretamente, celular y/o humoral) en un paciente infectado actual o anteriormente por Leishmania (tal como un ser humano o un perro) y/o en cultivos de células de nódulo linfático o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de individuos infectados actual o anteriormente por Leishmania. Las células en que se desencadena una respuesta pueden comprender una mezcla 45 de tipos celulares o pueden contener células de componentes aislados (incluyendo, pero sin limitación, linfocitos T, linfocitos NK, macrófagos, monocitos y/o linfocitos B). En una realización particular, las porciones inmunogénicas de un polipéptido de fusión que comprende al menos dos polipéptidos antigénicos de Leishmania seleccionados de KMP11, SMT, A2 y/o CBP son capaces de inducir la proliferación de linfocitos T y/o una respuesta de citocina predominantemente de tipo Th1 (por ejemplo, producción de IL-2, IFN-γ y/o TNF-α por linfocitos T y/o linfocitos NK y/o producción de IL-12 por monocitos, macrófagos y/o linfocitos B). Las porciones inmunogénicas de los antígenos descritos en la presente memoria pueden identificarse generalmente usando técnicas conocidas por los especialistas en la materia, incluyendo los procedimientos representativos resumidos en Paul, “Fundamental Immunology”, 5ª ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2003 y referencias citadas en el mismo. Dichas técnicas incluyen el cribado en polipéptidos de fusión de la capacidad de reaccionar con anticuerpos específicos de antígeno,

55 antisueros y/o líneas o clones de linfocitos T. Como se usan en la presente memoria, los antisueros y anticuerpos son “específicos de antígeno” si se unen específicamente a un antígeno (concretamente, reaccionan con la proteína en un inmunoensayo y no reaccionan detectablemente con proteínas no relacionadas). Dichos antisueros y anticuerpos pueden prepararse como se describe en la presente memoria y usando técnicas bien conocidas.

[0035] Las porciones inmunogénicas de polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania pueden ser esencialmente de cualquier longitud, a condición de que retengan una o más de las regiones inmunogénicas de KMP11, SMT, A2 y/o CPB que son responsables de y/o contribuyen a la protección in vivo proporcionada frente a leishmaniosis por uno o más polipéptidos de fusión de la descripción, como se dan a conocer en la presente memoria. En una realización, la capacidad de una porción inmunogénica de reaccionar con antisueros específicos 65 de antígeno puede potenciarse o no cambiarse, respecto a la proteína nativa, o puede reducirse en menos de un 50 %, y preferiblemente menos de un 20 %, respecto a la proteína nativa. Las porciones ilustrativas serán generalmente

de al menos 10, 15, 25, 50, 150, 200, 250, 300 o 350 aminoácidos de longitud, o más, hasta e incluyendo polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB completos. En una realización particular, es una porción inmunogénica de un polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania aquella que, cuando se usa en combinación, es capaz de proporcionar protección frente a, por ejemplo, en un ensayo in vivo como se describe en la presente memoria, o

5 serodiagnóstico de, una especie de Leishmania tal como L. donovani, L. major y/o L. infantum, que se cree que son los agentes causantes de LV en seres humanos y perros. Además, las composiciones de la invención pueden ser también útiles en el bloqueo de la transmisión del agente causante de LV de perros a seres humanos, por ejemplo, al reducir o eliminar el número de parásitos en la sangre y piel de perros infectados.

[0036] Como reconocería un especialista en la materia, una composición polipeptídica de la descripción puede comprender también uno o más polipéptidos que son inmunológicamente reactivos con linfocitos T y/o anticuerpos generados contra un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica dada a conocer en la presente memoria, o contra un fragmento o variante inmunogénico del mismo. En realizaciones particulares, el polipéptido es un polipéptido de fusión como se describe en la presente memoria.

15 [0037] En diversas realizaciones de la presente descripción, los polipéptidos de fusión de la presente descripción pueden comprender al menos 2 porciones o fragmentos antigénicos o inmunogénicos de los polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania, o una variante dada a conocer en la presente memoria. En algunos casos, se identificarán porciones inmunogénicas preferidas que tienen un nivel de actividad inmunogénica mayor que el del correspondiente polipéptido completo, por ejemplo, que tienen más de aproximadamente un 100 % o 150 % o más de actividad inmunogénica. En realizaciones particulares, la inmunogenicidad del polipéptido de fusión completo tendrá una inmunogenicidad aditiva, o más que aditiva, contribuida por cada una de las porciones antigénicas/inmunogénicas contenidas en el mismo.

25 [0038] En otra realización de la descripción, se proporcionan polipéptidos de fusión que comprenden dos o más porciones inmunogénicas de polipéptidos de Leishmania seleccionados de KMP11, SMT, A2 y/o CBP que son capaces de desencadenar linfocitos T y/o anticuerpos que son inmunológicamente reactivos con dos o más polipéptidos descritos en la presente memoria, o dos o más polipéptidos codificados por secuencias polinucleotídicas contiguas contenidas en las secuencias polinucleotídicas dadas a conocer en la presente memoria,

o fragmentos o variantes inmunogénicas de las mismas, o dos o más secuencias polinucleotídicas que hibridan con dos o más de estas secuencias en condiciones de rigor moderado a alto.

[0039] En realizaciones particulares, un polipéptido de fusión de la presente descripción puede comprender al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10

35 porciones o fragmentos inmunogénicos/antigénicos de polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania, o una variante de dichos polipéptidos, en el que las porciones o fragmentos retienen sustancialmente las mismas o similares propiedades inmunogénicas que el correspondiente polipéptido completo.

[0040] En otro aspecto, los polipéptidos de fusión de la presente descripción contienen múltiples copias de fragmentos polipeptídicos, repeticiones de fragmentos polipeptídicos o fragmentos polipeptídicos multiméricos, incluyendo fragmentos antigénicos/inmunogénicos tales como los polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania, que comprenden al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fragmentos contiguos, en cualquier orden, e incluyendo todas las longitudes de una composición polipeptídica exhibida en la presente memoria, o aquellos codificados por una secuencia polinucleotídica exhibida en la presente memoria. En otro

45 aspecto, los polipéptidos de fusión de la presente descripción pueden comprender dos o más fragmentos de antígeno de Leishmania como se indican en las SEQ ID NO: 1-10 y 25-28 o una porción inmunogénica de las mismas. En una realización particular, el polipéptido de fusión comprende una secuencia aminoacídica exhibida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 21, 23, 33, 35 o 37.

[0041] En todavía otro aspecto, la presente descripción proporciona polipéptidos de fusión que comprenden dos o más, tres o más o cuatro o más variantes de los polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania descritos en la presente memoria. Las variantes polipeptídicas englobadas generalmente por la presente descripción exhibirán típicamente al menos aproximadamente un 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % o más identidad (determinada como se describe a continuación) a lo largo de su longitud con una secuencia polipeptídica

55 exhibida en la presente memoria.

[0042] Las composiciones y procedimientos de la presente descripción engloban también variantes de los polipéptidos anteriores. Ciertas “variantes” polipeptídicas incluyen polipéptidos que difieren de una proteína KMP11, SMT, A2 y/o CPB nativa en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones, de tal modo que la inmunogenicidad deseada del polipéptido variante no se reduzca sustancialmente respecto a un polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB nativo.

[0043] Por ejemplo, ciertas variantes de la descripción incluyen polipéptidos de la descripción que se han modificado para reemplazar uno o más residuos de cisteína por residuos alternativos. Se hace referencia a dichos 65 polipéptidos de aquí en adelante como polipéptidos de cisteína modificada o polipéptidos de fusión de cisteína modificada. En una realización más específica, los residuos de cisteína se reemplazan por residuos de resina debido

a la similitud en la disposición espacial de sus cadenas laterales respectivas. Sin embargo, resultará evidente para un especialista en la materia que puede usarse como reemplazo para cisteína cualquier aminoácido que sea incapaz de formar un enlace disulfuro intercatenario o intracatenario. Cuando todos o sustancialmente todos los residuos de cisteína de un polipéptido o polipéptido de fusión de esta descripción están reemplazados, la variante de cisteína

5 modificada resultante puede tender menos a la agregación y por tanto ser más fácil de purificar, más homogénea y/u obtenible con mayores rendimientos después de la purificación.

[0044] En una realización, puede potenciarse o no cambiarse la capacidad de una variante de reaccionar con antisueros específicos de antígeno respecto a la proteína nativa, o puede reducirse en menos de un 50 %, y

10 preferiblemente menos de un 20 %, respecto a la proteína nativa. En una realización particular, es una variante de un polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB aquel capaz de proporcionar protección, por ejemplo, en un ensayo in vivo como se describe en la presente memoria, frente a una especie de Leishmania tal como L. donovani, L. infanfum y/o

L. major.

15 [0045] En realizaciones particulares, un polipéptido de fusión de la presente descripción comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 o más variantes de un polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania que es capaz de proporcionar protección frente a, por ejemplo, en un ensayo in vivo como se describe en la presente memoria, o en serodiagnóstico de, especies de Leishmania tales como L. donovani, L. major y/o L. infantum.

20 [0046] Un polipéptido de fusión de la presente descripción comprende dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más o diez o más variantes de un polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania que es capaz serodiagnosticar una especie de Leishmania tal como L. donovani, L. major y/o L. infanfum.

25 [0047] En muchos casos, una variante contendrá sustituciones conservativas. Una “sustitución conservativa” es aquella en que se sustituye un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de tal modo que un especialista en la materia de la química peptídica esperaría que la estructura secundaria y naturaleza hidropática del polipéptido no cambiaran sustancialmente. Como se describe anteriormente, pueden hacerse modificaciones en

30 la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente descripción y seguir obteniendo una molécula funcional que codifica un polipéptido variante o derivado con características deseables, por ejemplo, con características inmunogénicas. Cuando se desea alterar la secuencia aminoacídica de un polipéptido para crear una variante o porción inmunogénica equivalente, o incluso mejorada, de un polipéptido de la descripción, un especialista en la materia cambiará típicamente uno o más de los codones de la secuencia de ADN codificante según la Tabla 1.

35 [0048] Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión a moléculas de sustrato. Puesto que es la capacidad interactiva y naturaleza de una proteína lo que define esa actividad funcional biológica de la proteína, pueden hacerse ciertas

40 sustituciones aminoacídicas en una secuencia proteica y, por supuesto su secuencia de codificación de ADN subyacente, y obtener no obstante una proteína con propiedades similares. Por tanto, se contempla que puedan hacerse diversos cambios en las secuencias peptídicas de las composiciones dadas a conocer o las correspondientes secuencias de ADN que codifican dichos péptidos sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica.

45 Tabla 1

Aminoácidos

Codones

Alanina

Ala A GCA GCC GCG GCU

Cisteína

Cys C UGC UGU

Ácido aspártico

Asp D GAC GAU

Ácido glutámico

Glu E GAA GAG

Fenilalanina

Phe F UUC UUU

Glicina

Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidina

His H CAC CAU

Isoleucina

Ile I AUA AUC AUU

Lisina

Lys K AAA AAG

Leucina

Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Metionina

Met M AUG

Asparagina

Asn N AAC AAU

Prolina

Pro P CCA CCC CCG CCU

Glutamina

Gln Q CAA CAG

Arginina

Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Serina

Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU

Treonina

Thr T ACA ACC ACG ACU

Valina

Val V GUA GUC GUG GUU

Triptófano Trp W UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU

[0049] Al hacer dichos cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice aminoacídico hidropático para conferir función biológica interactiva a una proteína se entiende en general en la materia (Kyte y Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la 5 estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares. Cada aminoácido tiene asignado un índice hidropático basado en sus características de hidrofobia y carga (Kyte y Doolittle, 1982). Estos valores son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0.4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1.3); prolina (-1,6);

10 histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (-4,5).

[0050] Es conocido en la materia que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropático similar y seguir dando como resultado una proteína con actividad biológica similar, concretamente, seguir obteniendo una proteína funcionalmente bioequivalente. Al hacer dichos cambios, se

15 prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén a ± 2, se prefieren particularmente aquellos a ± 1 y se prefieren aún más particularmente a ± 0,5. Se entiende también en la materia que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse eficazmente basándose en la hidrofilia.

[0051] Como se detalla en la patente de EE. UU. nº 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de

20 hidrofilia a los residuos aminoacídicos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tiene un valor de hidrofilia similar y seguir obteniendo una proteína biológicamente equivalente, y en particular, inmunológicamente equivalente. En

25 dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia están a ± 2, se prefieren particularmente aquellos a ±1 y se prefieren más particularmente aquellos a ± 0,5.

[0052] Como se esboza anteriormente, las sustituciones aminoacídicas están generalmente basadas por lo tanto en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, su hidrofobia, hidrofilia,

30 carga, tamaño y similares. Las sustituciones ejemplares que tienen en consideración varias de las características anteriores son bien conocidas por los especialistas en la materia e incluyen: arginina y lisina, glutamato y aspartato, serina y treonina, glutamina y asparagina y valina, leucina e isoleucina.

[0053] Las sustituciones aminoacídicas pueden hacerse adicionalmente basándose en la similitud de

35 polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico, los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina y los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores de hidrofilia similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservativos

40 incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante puede contener también, o como alternativa, cambios no conservativos. En una realización preferida, los polipéptidos variantes difieren de la secuencia nativa por sustitución, deleción o adición de 5 aminoácidos o menos. Las variantes pueden modificarse también (o como alternativa), por ejemplo, mediante la deleción o adición de aminoácidos que tienen una influencia mínima sobre la inmunogenicidad, estructura

45 secundaria y naturaleza hidropática del polipéptido.

[0054] Como se observa anteriormente, los polipéptidos pueden comprender una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína que dirige cotraduccionalmente o postraduccionalmente la transferencia de la proteína. El polipéptido puede estar también conjugado con un ligador u otra secuencia para facilitar la síntesis,

50 purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo, marcador de polihistidina (6XHis), GST, MBP, TAP/TAG, epítopo FLAG, epítopo MYC, epítopo V5, epítopo VSV-G, etc.) o para potenciar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse con una región Fc de inmunoglobulina.

[0055] Cuando se comparan secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas, se dice que dos secuencias son

55 “idénticas” si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para correspondencia máxima, como se describe a continuación. Las comparaciones entre dos secuencias se efectúan típicamente comparando las secuencias en una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una “ventana de comparación”, como se usa en la presente memoria, hace referencia a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, habitualmente de 30 a

60 aproximadamente 75, de 40 a aproximadamente 50, en que puede compararse una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones continuas después de alinear óptimamente las dos secuencias.

[0056] El alineamiento de secuencias para comparación puede realizarse usando, por ejemplo, el programa Megalign en el paquete de software de bioinformática Lasergen (DNASTAR, Inc., Madison, WI), usando parámetros

por defecto. Este programa representa varios esquemas de alineamiento descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O. (1978) “A model of evolutionary change in proteins -Matrices for detecting distant relationships”. En Dayhoff, M.O. (ed.) “Atlas of Protein Sequence and Structure”, National Biomedical Research Foundation, Washington DC vol. 5, supl. 3, pág 345-358; Hein J. (1990) “Unified Approach to Alignment and Phylogenes” pág. 5 626-645 “Methods in Enzymology” vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5: 151-153; Myers, E.W. y Muller W. (1988) CABIOS 4: 11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor.

11: 105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4: 406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R. (1973) “Numerical Taxonomy -the Principles and Practice of Numerical Taxonomy”, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. y Lipman, D.J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80: 726-730.

[0057] Como alternativa, el alineamiento de secuencias para comparación puede realizarse por el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981) Add. APL. Math 2: 482, mediante el algoritmo de identidad de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante los procedimientos de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, mediante puestas en práctica informatizadas de estos

15 algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.

[0058] Son un ejemplo de algoritmos que son adecuados para determinar la identidad de secuencia y similitud de secuencia porcentuales los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y col. (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 y Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 pueden usarse, por ejemplo, con los parámetros descritos en la presente memoria, para determinar la identidad de secuencia porcentual de los polinucleótidos y polipéptidos de la descripción. El software para efectuar los análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information. En un ejemplo ilustrativo, pueden calcularse las puntuaciones acumuladas usando, para secuencias nucleotídicas, los parámetros

25 M (puntuación de recompensa por un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N (puntuación de penalización por residuos no coincidentes; siempre <0). Para secuencias aminoacídicas, puede usarse una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de las coincidencias de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulada cae una cantidad X desde su valor máximo conseguido; la puntuación acumulada llega a 0 o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias nucleotídicas) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11 y una previsión (E) de 10, y los alineamientos de matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) (B) de 50, previsión (E) de 10, M=5, N=-4 y comparación de ambas hebras.

35 [0059] Preferiblemente, el “porcentaje de identidad de secuencia” se determina comparando dos secuencias alineadas óptimamente en una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en el que la porción de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (concretamente huecos) de un 20 % o menos, habitualmente de 5 a 15 % o de 10 a 12 %, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones ni deleciones) para alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en que aparecen las bases de ácido nucleico o residuos aminoacídicos idénticos en ambas secuencias, proporcionando el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la secuencia de referencia (concretamente, el tamaño de ventana) y multiplicando los resultados por 100, proporcionando el

45 porcentaje de identidad de secuencia.

[0060] Por lo tanto, como se observa anteriormente, la presente descripción engloba secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas que tienen una identidad sustancial con las secuencias dadas a conocer en la presente memoria, por ejemplo, aquéllas que comprenden al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % o más identidad de secuencia en comparación con una secuencia polinucleotídica o polipeptídica de esta descripción usando los procedimientos descritos en la presente memoria (por ejemplo, análisis BLAST usando parámetros estándares, como se describe a continuación). Un especialista en esta materia reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la correspondiente identidad de las proteínas codificadas por dos secuencias nucleotídicas teniendo en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, la disposición

55 del marco de lectura y similares. Además, un especialista en la materia entendería que los polipéptidos de fusión de la presente descripción pueden comprender al menos 2, al menos 3 o al menos 4 o más porciones o fragmentos antigénicos/inmunogénicos de un polipéptido que comprende al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % o más identidad de secuencia con un polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania que es capaz de proporcionar protección frente a, por ejemplo, en un ensayo in vivo como se describe en la presente memoria, o en serodiagnóstico de, especies de Leishmania tales como L. donovani, L. major y/o L. infantum.

[0061] En otro aspecto de la descripción, se proporcionan polipéptidos de fusión que comprenden al menos una porción inmunogénica de un polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania y comprenden adicionalmente un copartícipe de fusión heterólogo, así como polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos de 65 fusión. Por ejemplo, en una realización, un polipéptido de fusión comprende una o más porciones o fragmentos inmunogénicos de un polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania y una o más secuencias inmunogénicas

adicionales de Leishmania, que se unen mediante un ligamiento peptídico en una sola cadena aminoacídica. En otra realización, un polipéptido de fusión puede comprender múltiples epítopos antigénicos de Leishmania, enel queal menos uno de los epítopos es de un polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania. Como se usa en la presente memoria, un “epítopo” es una porción de antígeno que reacciona con muestras de sangre de individuos

5 infectados por Leishmania (concretamente, un epítopo se une específicamente a uno o más anticuerpos y/o linfocitos T presentes en dichas muestras de sangre).

[0062] En otra realización, un polipéptido de fusión puede comprender múltiples epítopos antigénicos de Leishmania en los que al menos uno de los epítopos es de un polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania y al menos un copartícipe de fusión heterólogo comprende una secuencia que ayuda a proporcionar epítopos de linfocitos T auxiliares (un copartícipe de fusión inmunológico), preferiblemente epítopos de linfocitos T auxiliares reconocidos por seres humanos, o que ayuda a expresar la proteína (un potenciador de la expresión) a rendimientos mayores que la proteína recombinante nativa. Ciertos copartícipes de fusión preferidos incluyen tanto copartícipes de fusión inmunológicos como potenciadores de la expresión. Pueden seleccionarse otros copartícipes de fusión 15 para aumentar la solubilidad de la proteína o para posibilitar que la proteína se oriente a los compartimentos intracelulares deseados. Otros copartícipes de fusión adicionales incluyen marcadores de afinidad tales como V5, 6XHIS, MYC, FLAG y GST, que facilitan la purificación de la proteína. Se entendería por un especialista en la materia que esas secuencias no relacionadas pueden, pero no necesariamente, estar presentes en un polipéptido de fusión usado de acuerdo con la presente descripción. En una realización particular, un copartícipe de fusión inmunológico comprende una secuencia derivada de la proteína D, una proteína de superficie de la bacteria gramnegativa Haemophilus influenza B (documento WO 91/18926). Por ejemplo, un derivado de proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína (por ejemplo, los primeros 100-110 aminoácidos Nterminales), y un derivado de proteína D puede estar lipidado. En ciertas realizaciones, se incluyen los primeros 109 residuos de un copartícipe de fusión de lipoproteína D en el extremo N para proporcionar al polipéptido epítopos de

25 linfocitos T exógenos adicionales y para aumentar el nivel de expresión en E. coli (funcionando por tanto como potenciador de la expresión). La cola lipídica asegura una presentación óptima del antígeno ante células presentadoras de antígeno. Otros copartícipes de fusión ilustrativos incluyen la proteína no estructural del virus de la gripe, NS1 (hemaglutinina). Típicamente, se usan los 81 aminoácidos N-terminales, aunque pueden usarse también diferentes fragmentos que incluyen epítopos de linfocitos T auxiliares.

[0063] En otra realización particular, un copartícipe de fusión inmunológico comprende una secuencia aminoacídica derivada de la proteína conocida como LYTA, o una porción de la misma (preferiblemente, una porción C-terminal). LYTA deriva de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gene 43: 265-292 (1986)). LYTA es una autolisina que degrada

35 específicamente ciertos enlaces del esqueleto de peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad por colina o algunos análogos de colina tales como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en el extremo amino (véase Biotechnology 10: 795-798 (1992)). En una realización particular, puede incorporarse una porción repetida de LYTA a una proteína de fusión. Se encuentra una porción repetida en la región C-terminal partiendo del residuo 178. Una porción repetida más particular incorpora los residuos 188-305.

[0064] Las secuencias de fusión pueden unirse directamente (concretamente sin aminoácidos intermedios) o pueden unirse mediante una secuencia de ligamiento (por ejemplo, Gly-Cys-Gly) que no reduce significativamente

45 las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos componentes. Los polipéptidos que forman la proteína de fusión están ligados típicamente de extremo C a extremo N, aunque pueden estar también ligados de extremo C a extremo C, de extremo N a extremo N o de extremo N a extremo C. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden. Los polipéptidos de fusión o proteínas de fusión pueden incluir también variantes modificadas conservativamente, variantes polimórficas, alelos, mutantes, subsecuencias, homólogos interespecie y fragmentos inmunogénicos de antígenos que constituyen la proteína de fusión.

[0065] Los polipéptidos de fusión pueden prepararse en general usando técnicas estándares, incluyendo tecnología recombinante, conjugación química y similares. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican los componentes polipeptídicos de una fusión pueden ensamblarse separadamente y ligarse en un vector de expresión

55 apropiado. El extremo 3’ de la secuencia de ADN que codifica un componente polipeptídico está ligado, con o sin ligamiento peptídico, al extremo 5’ de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente polipeptídico, de modo que los marcos de lectura de las secuencias estén en fase. Esto permite la traducción en un solo polipéptido de fusión que retiene, o en algunos casos supera, la actividad biológica de los polipéptidos componentes.

[0066] Puede emplearse una secuencia de ligamiento peptídica para separar los componentes de fusión una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundaria y/o terciaria deseadas. Dicha secuencia de ligamiento peptídico puede incorporarse al polipéptido de fusión usando técnicas estándares bien conocidas en la materia. Las secuencias de ligamiento peptídico adecuadas pueden elegirse, por ejemplo, basándose en uno o más de los siguientes factores: (1) su capacidad de adoptar una conformación 65 extendida flexible; (2) su incapacidad de adoptar una estructura secundaria que podría interaccionar con epítopos funcionales en el primer y segundo polipéptidos y (3) la falta de residuos hidrófobos o cargados que podrían

reaccionar con los epítopos funcionales polipeptídicos. Ciertas secuencias de ligamiento peptídico preferidas contienen residuos de Gly, Asn y Ser. Pueden usarse también en la secuencia de ligamiento otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala. Las secuencias aminoacídicas que pueden emplearse útilmente como ligamientos incluyen aquellas dadas a conocer en Maratea y col., Gene 40: 39-46, 1985; Murphy y col., Proc. Natl. Acad. Sci.

5 USA 83: 8258-8262, 1986; patente de EE. UU. nº 4.935.233 y patente de EE. UU. nº 4.751.180. La secuencia de ligamiento puede ser generalmente de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Las secuencias de ligamiento no son necesarias cuando el primer y segundo polipéptidos tienen regiones aminoacídicas N-terminales no esenciales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y evitar la interferencia estérica.

[0067] Las secuencias de ADN ligadas están ligadas operativamente a elementos reguladores transcripcionales o traduccionales adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresión de ADN están localizados solo en 5’ de la secuencia de ADN que codifica los primeros polipéptidos. De forma similar, los codones de terminación necesarios para terminar la traducción y las señales de terminación de la transcripción están solo presentes en 3’ de la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.

15 [0068] Además de la expresión del polipéptido de fusión recombinante, pueden generarse polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania, porciones y variantes inmunogénicas de los mismos por medios sintéticos

o recombinantes. Pueden generarse polipéptidos sintéticos que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos, y generalmente menos de aproximadamente 50 aminoácidos, usando técnicas bien conocidas por los especialistas en la materia. Por ejemplo, dichos polipéptidos pueden sintetizarse usando cualquiera de las técnicas en fase sólida comercialmente disponibles, tales como el procedimiento de síntesis en fase sólida de Merrifield, en que se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena aminoacídica creciente (Merrifield, J. Am. Chem. Soc.

85: 2149-2146, 1963). Los equipos para la síntesis automatizada de polipéptidos están comercialmente disponibles de suministradores tales como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA, y pueden manipularse

25 según las instrucciones del fabricante. Por tanto, por ejemplo, pueden sintetizarse antígenos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania, o porciones de los mismos, mediante este procedimiento.

[0069] Los polipéptidos recombinantes que contienen porciones y/o variantes de un polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB nativo pueden prepararse fácilmente a partir de una secuencia de ADN que codifica el antígeno, usando técnicas bien conocidas y establecidas. En realizaciones particulares, puede prepararse fácilmente un polipéptido de fusión que comprende al menos 2 porciones o fragmentos inmunogénicos/antigénicos de antígenos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania a partir de una secuencia de ADN que codifica los antígenos fusionados clonados. Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas de hospedador/vector adecuados que secretan proteína recombinante a los medios de cultivo pueden concentrarse en primer lugar usando un filtro comercialmente disponible. Después de la

35 concentración, puede aplicarse el concentrado a una matriz de purificación adecuada tal como una matriz de afinidad, una matriz de cromatografía de exclusión por tamaño o una resina de intercambio iónico.

[0070] Como alternativa, puede emplearse cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos por los especialistas en la materia para expresar los polipéptidos recombinantes de la descripción. La expresión puede conseguirse en cualquier célula hospedadora apropiada que se haya transformado o transfectado con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica un polipéptido recombinante. Preferiblemente, las células hospedadoras son E. coli, levadura, una línea celular de insecto (tal como Spodoptera o Trichoplusia) o una línea celular de mamífero incluyendo (pero sin limitación) CHO, COS, HEK-293T y NS-1. Las secuencias de ADN expresadas de esta manera pueden codificar proteínas de origen natural y proteínas de fusión que comprenden

45 antígenos de Leishmania tales como KMP11, SMT, A2 y/o CPB, porciones de las mismas y repeticiones u otras variantes de dichas proteínas. Los polipéptidos de fusión expresados de esta descripción se aíslan generalmente en forma sustancialmente pura. Preferiblemente, los polipéptidos de fusión se aíslan hasta una pureza de al menos un 80 % en peso, más preferiblemente hasta una pureza de al menos un 95 % en peso y lo más preferiblemente hasta una pureza de al menos un 99 % en peso. En general, dicha purificación puede conseguirse usando, por ejemplo, las técnicas estándares de fraccionamiento con sulfato de amonio, electroforesis en PAGE-SDS y cromatografía de afinidad.

[0071] Los polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania y polinucleótidos de la descripción pueden prepararse o aislarse usando cualquiera de una variedad de procedimientos y usando cualquiera de una variedad de

55 especies de Leishmania incluyendo, pero sin limitación, L. donovani, L. chagasi, L. infantum, L. major, L. amazonensis, L. braziliensis, L. panamensis, L. mexicana, L. tropica y L. guyanensis. Dichas especies están disponibles, por ejemplo, en la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD.

[0072] Independientemente del procedimiento de fabricación, los polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB o polipéptidos de fusión producidos como se describe anteriormente son preferiblemente inmunogénicos. En otras palabras, los polipéptidos (y porciones inmunogénicas de los mismos) son capaces de desencadenar una respuesta inmunitaria en cultivos de células de nódulo linfático y/o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de individuos infectados actual o anteriormente por Leishmania. Más específicamente, los antígenos, y porciones inmunogénicas de los mismos, tienen la capacidad de inducir la proliferación de linfocitos T y/o de 65 desencadenar una respuesta de citocina predominantemente de tipo Th1 (por ejemplo, producción de IL-2, IFN-γ y/o TNF-α por linfocitos T y/o linfocitos NK y/o la producción de IL-12 por monocitos, macrófagos y/o linfocitos B) en

células aisladas de individuos infectados actual o anteriormente por Leishmania. Un individuo infectado por Leishmania puede estar aquejado por una forma de leishmaniosis (tal como subclínica, cutánea, mucosa o visceral activa) o puede ser asintomático. Dichos individuos pueden identificarse usando procedimientos conocidos por los especialistas en la materia. Los individuos con leishmaniosis pueden identificarse basándose en signos clínicos

5 asociados, por ejemplo, a al menos uno de los siguientes: aislamiento del parásito de lesiones, prueba cutánea positiva con lisado de Leishmania o prueba serodiagnóstica positiva. Los individuos asintomáticos son individuos infectados que no tienen signos ni síntomas de la enfermedad. Dichos individuos pueden identificarse, por ejemplo, basándose en una prueba serológica positiva y/o prueba cutánea con lisado de Leishmania.

10 [0073] El término "PBMC," que hace referencia a una preparación de células nucleadas consistente principalmente en linfocitos y monocitos que están presentes en sangre periférica, engloba tanto mezclas de células como preparaciones de uno o más tipos de célula purificados. Las PBMC pueden aislarse mediante procedimientos conocidos por los especialistas en la materia. Por ejemplo, las PBMC pueden aislarse mediante centrifugación de densidad, por ejemplo, mediante Ficoll™ (Winthrop Laboratories, Nueva York). Los cultivos de nódulo linfático

15 pueden prepararse generalmente inmunizando ratones BALB/c (por ejemplo, en la almohadilla plantar trasera) con promastigotes de Leishmania emulsionados en coadyuvante completo de Freünd. Los nódulos linfáticos de drenaje pueden extraerse después de la inmunización y purificarse los linfocitos T en una columna de Ig anti-ratón para retirar los linfocitos B, seguido de paso a través de una columna Sephadex G10 para retirar los macrófagos. De forma similar, pueden aislarse las células de nódulo linfático de un ser humano después de biopsia o extirpación

20 quirúrgica de un nódulo linfático.

[0074] Puede evaluarse la capacidad de un polipéptido de fusión de la invención de inducir una respuesta en PBMC o cultivos de células de nódulo linfático, por ejemplo, poniendo en contacto las células con el polipéptido y midiendo la respuesta adecuada. En general, la cantidad de polipéptido que es suficiente para la evaluación de 25 aproximadamente 2 x 105 células oscila de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 100 µg o de 100 ng a aproximadamente 50 µg, y es preferiblemente de aproximadamente 1 µg a 10 µg. La incubación del polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de fusión) con células se efectúa típicamente a 37 ºC durante aproximadamente 1-3 días. Después de la incubación con polipéptido, se ensaya en las células la respuesta apropiada. Si la respuesta es una respuesta proliferativa, puede emplearse cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas por los

30 especialistas en la materia. Por ejemplo, las células pueden exponerse a un pulso de timidina radiactiva y medirse la incorporación del marcador al ADN celular. En general, un polipéptido que da como resultado un aumento de al menos tres veces de la proliferación por encima del fondo (concretamente, la proliferación observada para células cultivadas sin polipéptido) se considera que es capaz de inducir la proliferación.

35 [0075] Como alternativa, la respuesta para medir puede ser la secreción de una o más citocinas (tales como interferón γ (IFN-γ), interleucina 4 (IL-4), interleucina 12 (p70 y/o p40), interleucina 2 (IL-2) y/o factor de necrosis tumoral α (TNF-α)) o el cambio en el nivel de ARNm que codifica una o más citocinas específicas. Por ejemplo, la secreción de interferón γ, interleucina 2, factor de necrosis tumoral α y/o interleucina 12 es indicativa de una respuesta Th1, que contribuye al efecto protector frente a Leishmania. Los ensayos de cualquiera de las citocinas

40 anteriores pueden efectuarse generalmente usando procedimientos conocidos por los especialistas en la materia, tales como un ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA). Los anticuerpos adecuados para uso en dichos ensayos pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes tales como Chemicon, Temucula, CA y PharMingen, San Diego, CA, y pueden usarse generalmente según las instrucciones del fabricante. El nivel de ARNm que codifica una o más citocinas específicas puede evaluarse, por ejemplo, mediante amplificación por reacción en cadena de la

45 polimerasa (PCR). En general, un polipéptido que es capaz de inducir, en una preparación de aproximadamente 1-3 x 105 células, la producción de 30 pg/ml de IL-12, IL-4, IFN-γ, TNF-α o p40 de IL-12, o de 10 pg/ml de p70 de IL-12 p70, se considera capaz de estimular la producción de una citocina.

COMPOSICIONES POLINUCLEOTÍDICAS

50 [0076] La presente descripción proporciona también polinucleótidos aislados, particularmente aquellos que codifican los polipéptidos de fusión de la invención, así como composiciones que comprenden dichos polinucleótidos. Como se usan en la presente memoria, los términos “ADN” y “polinucleótido” y “ácido nucleico” hacen referencia a una molécula de ADN que se ha aislado exenta de ADN genómico total a partir de una especie

55 particular. Por lo tanto, un segmento de ADN que codifica un polipéptido hace referencia a un segmento de ADN que contiene una o más secuencias de codificación pero está sustancialmente aislado, o purificado, del ADN genómico total de la especie de la que se obtiene el segmento de ADN. Se incluye en los términos “segmento de ADN” y “polinucleótido” los segmentos de ADN y fragmentos menores de dichos segmentos, y también vectores recombinantes incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagémidos, fagos, virus y similares.

60 [0077] Como se entenderá por los especialistas en la materia, las secuencias polinucleotídicas de esta invención pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extragenómicas y codificadas por plásmido y segmentos génicos modificados por ingeniería genética menores que expresan, o pueden adaptarse para expresar, proteínas, polipéptidos de fusión, péptidos y similares. Dichos segmentos pueden ser aislados naturalmente,

65 recombinantes o modificados sintéticamente por la mano del hombre.

[0078] Como se reconocerá por el especialista en la materia, los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificantes o anticodificantes) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Cualquier polinucleótido puede modificarse adicionalmente para aumentar la estabilidad in vivo. Las posibles modificaciones incluyen, pero sin limitación, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5’ y/o 3’, el uso

5 de fosforotioato o 2’O-metilo en lugar de ligamientos fosfodiesterasa en el esqueleto y/o la inclusión de bases no tradicionales tales como inosina, queosina y wibutosina, así como formas modificadas con acetilo, metilo, tio y otros de adenina, citidina, guanina, timina y uridina. Pueden estar presentes secuencias codificantes o no codificantes adicionales, pero no necesariamente, en un polinucleótido de la presente invención y el polinucleótido puede, pero no necesariamente, estar ligado a otras moléculas y/o materiales de soporte.

10 [0079] Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (concretamente, una secuencia endógena que codifica un antígeno de Leishmania o una porción del mismo) o pueden comprender una variante o equivalente funcional biológico o antigénico de dicha secuencia. En realizaciones particulares, los polinucleótidos pueden codificar dos o más porciones, fragmentos o variantes antigénicos/inmunogénicos derivados de los

15 antígenos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania. En ciertas realizaciones, los polinucleótidos que codifican polipéptidos de fusión de la presente descripción comprenden dos o más secuencias de antígeno de Leishmania como se indica en las SEQ ID NO: 11-20 y 29-32 o un fragmento de las mismas que codifica una porción inmunogénica. En un aspecto relacionado, se proporcionan polinucleótidos como se exhiben en las SEQ ID NO: 22

o 24 que codifican polipéptidos de fusión particulares de la presente invención.

20 [0080] Las variantes polinucleotídicas pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, como se describe adicionalmente a continuación, preferiblemente de tal modo que la inmunogenicidad del polipéptido modificado no se reduzca respecto a la proteína nativa. El efecto sobre la inmunogenicidad del polipéptido codificado puede valorarse en general como se describe en la presente memoria.

25 [0081] Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las variantes de la descripción incluyen polinucleótidos de cisteína modificada en que los codones que codifican cisteína se reemplazan por codones que codifican otros aminoácidos incapaces de formar enlaces disulfuro intracatenarios o intercatenarios. En realizaciones más específicas, algunos o todos los codones de reemplazo codifican serina debido a la similitud espacial de la cadena

30 lateral de serina con la cadena lateral de cisteína en el polipéptido resultante. En otra realización específica, algunos

o todos los codones de reemplazo codifican alanina. Son bien conocidos procedimientos ilustrativos de reemplazo de cisteína y otros codones en un polinucleótido (por ejemplo, patente de EE. UU. nº 4.816.566 y Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (15): 8530, 2000).

35 [0082] El término “variantes” engloba también genes homólogos de origen xenogénico.

[0083] En realizaciones adicionales, los polinucleótidos aislados de la presente descripción comprenden diversas longitudes de tramos contiguos de secuencia idénticos o complementarios de dos o más KMP11, SMT, A2 y/o CPB, tales como aquellas secuencias dadas a conocer en la presente memoria. Por ejemplo, se proporcionan

40 polinucleótidos por esta descripción que comprenden al menos aproximadamente 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 o 1000 o más nucleótidos contiguos de dos o más de las secuencias dadas a conocer en la presente memoria, así como todas las longitudes intermedias entre medias. Se entenderá fácilmente que “longitudes intermedias”, en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores citados, tal como 16, 17, 18, 19, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluyendo todos

45 los enteros de 200-500; 500-1.000 y similares.

[0084] Los polinucleótidos de la presente invención, o fragmentos de los mismos, independientemente de la longitud de la secuencia codificante misma, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzima de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, otros

50 segmentos de codificación y similares, de tal modo que su longitud global puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que puede emplearse un fragmento polinucleotídico de casi cualquier longitud, estando preferiblemente limitada la longitud total por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido.

55 [0085] Además, se apreciará por los especialistas en la materia que, como resultado de la degeneración del código genético, existen muchas secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido como se describe en la presente memoria. Algunos de estos polinucleótidos portan una homología mínima con la secuencia nucleotídica de cualquier gen nativo. No obstante, se contemplan específicamente por la presente invención polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codón, por ejemplo, polinucleótidos que están optimizados para selección

60 de codón humana y/o de primate. Adicionalmente, los alelos de los genes que comprenden las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en la presente memoria están dentro del alcance de la presente descripción. Los alelos son genes endógenos que se alteran como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y proteína resultantes pueden, pero no necesariamente, tener una estructura o función alterada. Los alelos pueden identificarse usando técnicas estándares (tales como

65 hibridación, amplificación y/o comparación de secuencia de base de datos).

[0086] Pueden prepararse, manipularse y/o expresarse polinucleótidos de Leishmania y fusiones de los mismos usando cualquiera de una variedad de técnicas bien establecidas conocidas y disponibles en la materia. En realizaciones particulares, las fusiones comprenden dos o más secuencias polinucleotídicas que codifican antígenos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania.

5 [0087] Por ejemplo, pueden usarse secuencias polinucleotídicas o fragmentos de las mismas que codifican polipéptidos de la descripción, o proteínas de fusión o equivalentes funcionales de los mismos, en moléculas de ADN recombinante para dirigir la expresión de un polipéptido en células hospedadoras apropiadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, pueden producirse otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia aminoacídica o una funcionalmente equivalente y estas secuencias pueden usarse para clonar y expresar un polipéptido dado de la presente descripción.

[0088] Como se entenderá por los especialistas en la materia, puede ser ventajoso en algunos casos producir secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido de fusión que posee codones de origen no natural. Por

15 ejemplo, pueden seleccionarse los codones preferidos por un hospedador procariótico o eucariótico particular para aumentar el índice de expresión de proteína o producir un transcrito de ARN recombinante que tiene propiedades deseables, tales como una semivida que es mayor que la de un transcrito generado a partir de la secuencia de origen natural.

[0089] Además, las secuencias polinucleotídicas de la presente invención pueden modificarse por ingeniería genética usando procedimientos generalmente conocidos en la materia para alterar las secuencias que codifican un polipéptido de fusión por una variedad de razones, incluyendo pero sin limitación, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento, expresión y/o inmunogenicidad del producto génico.

25 [0090] Para expresar un polipéptido de fusión deseado que comprende dos o más fragmentos o porciones antigénicos/inmunogénicos de polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB, puede insertarse una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido de fusión, o un equivalente funcional, en un vector de expresión adecuado, concretamente un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Pueden usarse procedimientos que son bien conocidos por los especialistas en la materia para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican un polipéptido de interés y elementos de control transcripcional y traduccional apropiados. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen en Sambrook y col., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual” (2001) y Ausubel y col., “Current Protocols in Molecular Biology” (enero de 2008, edición actualizada).

35 [0091] Son conocidos una variedad de sistemas de vector de expresión/hospedador y pueden utilizarse para contener y expresar secuencias polinucleotídicas. Estos incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, plásmido o cósmido; levadura (tal como Saccharomyces o Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión víricos (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transformadas con vectores de expresión víricos (por ejemplo, virus de mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico de tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322) o sistemas de células animales.

45 [0092] Los “elementos de control” o “secuencias reguladoras” presentes en un vector de expresión son aquellas regiones no traducidas del vector: potenciadores, promotores, las regiones no traducidas 5’ y 3’, que interaccionan con las proteínas celulares del hospedador para llevar a cabo la transcripción y traducción. Dichos elementos pueden variar en su potencia y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y hospedador utilizado, puede usarse cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como el promotor lacZ híbrido del fagémido PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) o el plásmido PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.) y similares. En sistemas de células de mamíferos, se prefieren generalmente promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Si es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de la secuencia que codifica un polipéptido, pueden usarse ventajosamente vectores

55 basados en SV40 o EBV con un marcador seleccionable apropiado.

[0093] En sistemas bacterianos, puede seleccionarse una serie de vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para el polipéptido expresado. Por ejemplo, cuando se requieren grandes cantidades, pueden usarse vectores que dirigen un alto nivel de expresión de las proteínas de fusión, que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero sin limitación, los vectores de clonación y expresión multifuncional de E. coli tales como PBLUESCRIPT (Stratagene), en que la secuencia que codifica el polipéptido de interés puede ligarse en el vector en fase con secuencias de la Met aminoterminal y los 7 residuos posteriores de β-galactosidasa, de modo que se produce una proteína híbrida; vectores pIN (Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503 5509 (1989)) y similares. Los vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) pueden usarse también para expresar polipéptidos extraños

65 como proteínas de fusión con glutation S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción en perlas de glutation-agarosa seguida

de elución en presencia de glutation libre. Las proteínas preparadas en dichos sistemas pueden diseñarse para incluir heparina, trombina o sitios de escisión de proteasa factor XA, de modo que el polipéptido de interés clonado pueda liberarse del resto de GST a voluntad.

5 [0094] En la levadura Saccharomyces cerevisiae, pueden usarse una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como factor α, alcohol oxidasa y PGH. Para revisiones, véanse Ausubel y col. (supra) y Grant y col., Methods Enzymol. 153: 516-544 (1987).

[0095] En los casos en que se usan vectores de expresión vegetales, la expresión de las secuencias que codifican polipéptidos puede activarse por cualquiera de una serie de promotores. Por ejemplo, pueden usarse promotores víricos tales como los promotores 35S y 19S de CaMV solos o en combinación con la secuencia líder ω de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6: 307-311 (1987)). Como alternativa, pueden usarse promotores vegetales tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi y col., EMBO J. 3: 1671-1680 (1984); Broglie y col., Science 224: 838-843 (1984) y Winter y col., Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105 (1991)).

15 Estos constructos pueden introducirse en células vegetales mediante transformación de ADN directa o transfección mediada por patógeno. Dichas técnicas se describen en una serie de revisiones generalmente disponibles (véase, por ejemplo, Hobbs en McGraw Hill, “Yearbook of Science and Technology”, pág. 191-196 (1992)).

[0096] Puede usarse también un sistema de insecto para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en uno de dichos sistemas, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican el polipéptido pueden clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y disponerse bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción exitosa de la secuencia que codifica el polipéptido inactivará el gen de polihedrina y producirá virus recombinante que carece de proteína de cubierta. Los

25 virus recombinantes pueden usarse entonces para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en que puede expresarse el polipéptido de interés (Engelhard y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 3224-3227 (1994)).

[0097] En células hospedadoras de mamífero, están generalmente disponibles una serie de sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en casos en que se usa un adenovirus como vector de expresión, las secuencias que codifican un polipéptido de la presente descripción pueden ligarse con un complejo de transcripción/traducción de adenovirus consistente en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma vírico puede usarse para obtener un virus viable que es capaz de expresar el polipéptido en células hospedadoras infectadas (Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 3655

35 3659 (1984)). Además, pueden usarse potenciadores de la transcripción, tales como potenciador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para aumentar la expresión en células hospedadoras de mamífero.

[0098] Pueden usarse también señales de inicio específicas para conseguir una traducción más eficaz de las secuencias que codifican un polipéptido de fusión de interés. Dichas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. En casos en que se insertan las secuencias que codifican el polipéptido, su codón de inicio y secuencias en dirección 5’ en el vector de expresión apropiado, pueden no requerirse señales de control transcripcional o traduccional adicionales. Sin embargo, en casos en que se inserta solo la secuencia de codificación, o una porción de la misma, deberían proporcionarse señales de control traduccional exógenas, incluyendo el codón de inicio ATG. Además, el codón de inicio debería estar en el marco de lectura correcto para

45 asegurar la traducción del inserto completo. Los elementos traduccionales exógenos y codones de inicio pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores que sean apropiados para el sistema celular particular que se usa, tales como los descritos en la bibliografía (Scharf y col., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)).

[0099] Además, puede elegirse una cepa de célula hospedadora por su capacidad de modular la expresión de las secuencias insertadas o de procesar la proteína de fusión expresada de la forma deseada. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero sin limitación, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. Puede usarse también el procesamiento postraduccional que escinde una forma “prepro” de la proteína para facilitar una inserción, plegamiento y/o función correctos. Pueden elegirse células hospedadoras

55 diferentes tales como CHO, HeLa, MDCK, HEK293 y W138, que tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades postraduccionales, para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña.

[0100] Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere generalmente una expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan establemente un polinucleótido de fusión de la presente descripción pueden transformarse usando vectores de expresión que pueden contener orígenes de replicación víricos y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo

o un vector separado. Después de la introducción del vector, las células pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiar a medio selectivo. El fin del marcador seleccionable es conferir resistencia

65 para selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que expresan exitosamente las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células transformadas establemente pueden hacerse proliferar

usando técnicas de cultivo de tejido apropiadas para el tipo celular.

[0101] Puede usarse cualquier serie de sistemas de selección para recuperar líneas celulares transformadas. Estos incluyen, pero sin limitación, los genes de timidina cinasa (Wigler y col., Cell 11: 223-232 (1977)) y adenina 5 fosforilrribosiltransferasa (Lowy y col., Cell 22: 817-823 (1990)) de herpesvirus simplex, que pueden emplearse en células tk-o aprt-, respectivamente. También pueden usarse antimetabolitos, antibióticos o resistencia a herbicida como base para la selección; por ejemplo, dhfr que confiere resistencia a metotrexato (Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77: 3567-70 (1980)); npt, que confiere resistencia a aminoglucósidos, neomicina y G-418 (Colbere-Garapin y col., J. Mol. Biol. 150: 1-14 (1981)); y als o pat, que confieren resistencia a clorosulfurón y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murry, supra). Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 8047-51 (1988)). El uso de marcadores visibles ha aumentado su popularidad con marcadores tales como antocianinas, β-glucuronidasa y su sustrato GUS y luciferasa y su sustrato luciferina, siendo ampliamente usados no solo para identificar transformantes, sino también

15 para cuantificar la cantidad de expresión de proteína transitoria o estable atribuible a un sistema de vector específico (Rhodes y col., Methods Mol. Biol. 5: 121-131 (1995)).

[0102] Son conocidos en la materia una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de productos codificados por polinucleótidos, usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos del producto. Los ejemplos incluyen ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se describen estos y otros ensayos, entre otros lugares, en Hampton y col., “Serological Methods, a Laboratory Manual” (1990) y Maddox y col., J. Exp. Med. 158: 1211-1216 (1983).

[0103] Son conocidos una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación por los especialistas en

25 la materia y pueden usarse en diversos ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir hibridación marcada o sondas de PCR para detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos incluyen oligomarcaje, traslado de mella, marcaje terminal o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. Como alternativa, las secuencias, o cualquier porción de las mismas, pueden clonarse en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores son conocidos en la materia, están comercialmente disponibles y pueden usarse para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3, o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos pueden realizarse usando una variedad de kits comercialmente disponibles. Las moléculas indicadoras o marcadores adecuados que pueden usarse incluyen radionucleidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.

35 [0104] Las células hospedadoras transformadas con una secuencia polinucleotídica de interés pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante puede secretarse o contenerse intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o vector usado. Como se entenderá por los especialistas en la materia, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos de la invención pueden diseñarse para contener secuencias señal que dirigen la secreción del polipéptido codificado a través de una membrana celular procariótica o eucariótica. Pueden usarse otras construcciones recombinantes para unir secuencias que codifican un polipéptido de interés con una secuencia nucleotídica que codifica un dominio polipeptídico que facilitará la purificación de proteínas solubles. Además de procedimientos de producción recombinante, los polipéptidos de fusión de la invención, y fragmentos de los mismos,

45 pueden producirse mediante síntesis peptídica directa usando técnicas en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc.

85: 2149-2154 (1963)). La síntesis de proteína puede efectuarse usando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada puede conseguirse, por ejemplo, el sintetizador peptídico 431A de Applied Biosystems (Perkin Elmer). Como alternativa, pueden sintetizarse químicamente diversos fragmentos, por ejemplo, dos o más fragmentos antigénicos/inmunogénicos de antígenos KMP11, SMT, A2 y/o CBP de Leishmania separadamente y combinarse usando procedimientos químicos, produciendo la molécula completa.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y VACUNA

[0105] En ciertos aspectos, los polipéptidos, polinucleótidos, porciones, variantes, polipéptidos de fusión, etc.,

55 como se describen en la presente memoria, se incorporan a composiciones farmacéutica o vacunas. Las composiciones farmacéuticas comprenden generalmente uno o más polipéptidos, polinucleótidos, porciones, variantes, polipéptidos de fusión, etc., como se describen en la presente memoria, en combinación con un portador fisiológicamente aceptable. Las vacunas, a las que se hace referencia también como composiciones inmunogénicas, comprenden generalmente uno o más de los polipéptidos, polinucleótidos, porciones, variantes, proteínas de fusión, etc., como se describen en la presente memoria, en combinación con un inmunoestimulante tal como un coadyuvante. En realizaciones particulares, las composiciones farmacéuticas comprenden polipéptidos de fusión que contienen adicionalmente al menos 2, al menos 3 o al menos 4 o más antígenos polipeptídicos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania que son capaces de proporcionar protección, por ejemplo en un ensayo in vivo como se describe en la presente memoria, frente a especies de Leishmania tales como L. donovani, L. major y/o L. infantum.

65 [0106] Un inmunoestimulante puede ser cualquier sustancia que potencie o fomente una respuesta

inmunitaria (mediada por anticuerpo y/o célula) ante un antígeno exógeno. Los ejemplos de inmunoestimulantes incluyen coadyuvantes, microesferas biodegradables (por ejemplo, ácido poli(láctico-glicólico) y liposomas en los que se incorpora el compuesto (véase, por ejemplo, Fullerton, patente de EE. UU. nº 4.235.877). La preparación de vacuna se describe en general, por ejemplo, en Powell & Newman, eds., “Vaccine Design (the subunit and adjuvant

5 approach)” (1995).

[0107] Puede emplearse cualquiera de una variedad de inmunoestimulantes en las vacunas de esta descripción. Por ejemplo, puede incluirse un coadyuvante. Muchos coadyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger al antígeno del catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulante de las respuestas inmunitarias tal como lípido A (natural o sintético), especies de Bordatella pertussis o Mycobacterium o proteínas derivadas de Mycobacterium. Están comercialmente disponibles coadyuvantes adecuados como, por ejemplo, coadyuvante incompleto y coadyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich.); coadyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2 y derivados del mismo (GlaxoSmithKline Beecham, Filadelfia, Pa.); CWS, TDM, LeIF, sales de aluminio tales como gel de hidróxido de

15 aluminio (alúmina) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o cinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforil lípido A y Quil A. Pueden usarse también como coadyuvantes citocinas tales como GM-CSF o interleucina 2, 7 o 12.

[0108] Ciertas realizaciones de la presente descripción contemplan vacunas y composiciones farmacéuticas que incluyen uno o más agonistas de receptor de tipo Toll (agonista de TLR). En realizaciones más específicas, por ejemplo, las composiciones de la invención incluyen agonistas de receptor de tipo Toll tales como agonistas de TLR7 y agonistas de TLR7/8. En ciertas realizaciones, el agonista de TLR es capaz de suministrar una señal biológica al interaccionar con al menos un TLR que se selecciona de TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7,

25 TLR-8 y TLR-9.

[0109] Los receptores de tipo Toll (TLR) incluyen receptores transmembrana de superficie celular del sistema inmunitario innato que confieren la capacidad de reconocimiento en fase temprana a células hospedadoras para una variedad de estructuras moleculares microbianas conservadas tales como pueden estar presentes en o sobre un gran número de patógenos infecciosos (por ejemplo, Armant y col., 2002 Genome Biol. 3(8): revisiones 3011.13011.6; Fearon y col., 1996 Science 272: 50; Medzhitov y col., 1997 Curr. Opin. Immunol. 9:4; Luster 2002 Curr. Opin. Immunol. 14: 129; Lien y col. 2003 Nat. Immunol.: 1162; Medzhitov, 2001 Nat. Rev. Immunol. 1: 135; Takeda y col., 2003 Ann. Rev. Immunol. 21: 335; Takeda y col. 2005 Int. Immunol. 17: 1; Kaisho y col., 2004 Microbes Infect.

6: 1388; Datta y col., 2003 J. Immunol. 170: 4102).

35 [0110] La inducción de la transducción de señal mediada por LTR para fomentar el inicio de respuestas inmunitarias a través del sistema inmunitario innato puede efectuarse mediante agonistas de TLR, que interactúan con TLR de superficie celular o TLR citoplasmático. Por ejemplo, el lipopolisacárido (LPS) puede ser un agonista de TLR a través de TLR2 o TLR4 (Tsan y col., 2004 J. Leuk. Biol. 76: 514; Tsan y col., 2004 Am. J. Physiol. Cell Phsiol.

286: C739; Lin y col., 2005 Shock 24: 206); la poli(inosina-citidina) (polil:C) puede ser agonista de TLR a través de TLR3 (Salem y col., 2006 Vaccine 24:5119); las secuencias de CpG (oligodesoxinucleótidos que contienen motivos dinucleotídicos de citosina-guanosina no metilados "CpG", por ejemplo, CpG 7909, Cooper y col., 2005 AIDS 19: 1473; CpG 10101 Bayes y col. Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 27: 193; Vollmer y col. Expert Opinion on Biological Therapy 5: 673; Vollmer y col., 2004 Antimicrob. Agents Chemother. 48: 2314; Deng y col., 2004 J. 45 Immunol. 173: 5148) pueden ser agonistas de TLR a través de TLR9 (Andaloussi y col., 2006 Glia 54: 526; Chen y col., 2006 J. Immunol. 177: 2373); los peptidoglucanos pueden ser agonistas de TLR2 y/o TLR6 (Soboll y col., 2006 Biol. Reprod. 75: 131; Nakao y col., 2005 J. Immunol. 174: 1566); el 3M003 (hidrato de 4-amino-2-(etoximetil)-α,αdimetil-6,7,8,9-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-etanol, PM 318 Da de 3M Pharmaceuticals, St. Paul, MN, que es también una fuente de los compuestos relacionados 3M001 y 3M002; Gorden y col., 2005 J. Immunol. 174: 1259) puede ser un agonista de TLR7 (Johansen 2005 Clin. Exp. Allerg. 35: 1591) y/o un agonista de TLR8 (Johansen 2005); la flagelina puede ser un agonista de TLR5 (Feuillet y col., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103: 12487) y los antígenos de hepatitis C pueden actuar como agonistas de TLR a través de TLR7 y/o TLR9 (Lee y col., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103: 1828; Horsmans y col., 2005 Hepatol. 42: 724). Son conocidos otros agonistas de TLR (por ejemplo, Schirmbeck y col., 2003 J. Immunol. 171: 5198) y pueden usarse según ciertas de las realizaciones

55 descritas actualmente.

[0111] Por ejemplo, y a modo de antecedente (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. nº 6.544.518), los oligonucleótidos inmunoestimulantes que contienen dinucleótidos de CpG no metilados ("CpG") son conocidos por ser coadyuvantes cuando se administran tanto por vía sistémica como mucosa (documentos WO 96/02555, EP 468520, Davis y col., J. Immunol., 1998. 160(2): 870-876; McCluskie y Davis, J. Immunol., 1998, 161(9): 4463-6). CpG es una abreviatura de motivos de dinucleótido de citosina-guanosina presentes en el ADN. El papel fundamental del motivo CG en inmunoestimulación se dilucidó por Krieg, Nature 374, p546 1995. El análisis detallado ha mostrado que el motivo CG tiene que estar en cierto contexto de secuencia, y que dichas secuencias son comunes en ADN bacteriano, pero raras en ADN de vertebrado. La secuencia inmunoestimulante es a menudo: 65 purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina; en la que el motivo dinucleótido CG no está metilado, pero son conocidas otras secuencias de CpG no metiladas que son inmunoestimulantes y pueden usarse en ciertas realizaciones de la

presente invención. Cuando CpG se formula en vacunas, puede administrarse en solución libre junto con antígeno libre (documento WO 96/02555; McCluskie y Davis, supra) o conjugado covalentemente con un antígeno (publicación PCT nº WO 98/16247), o formulado con un portador tal como hidróxido de aluminio (por ejemplo, Davis y col. supra, Brazolot-Millan y col., Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8).

5 [0112] Otros oligonucleótidos ilustrativos para uso en composiciones de la presente invención contendrán a menudo dos o más motivos de dinucleótido CpG separados por al menos 3, más preferiblemente al menos 6 o más nucleótidos. Los oligonucleótidos de la presente invención son típicamente desoxinucleótidos. En una realización, el internucleótido en el oligonucleótido es fosforoditioato, o más preferiblemente, un enlace fosforotioato, aunque fosfodiéter y otros enlaces internucleotídicos están dentro del alcance de la invención, incluyendo oligonucleótidos con ligamientos internucleotídicos mixtos. Se describen procedimientos para producir oligonucleótidos de fosforotioato o fosforoditioato en las patentes de EE. UU. nº 5.666.153, 5.278.302 y WO95/26204.

[0113] Otros ejemplos de oligonucleótidos tienen secuencias que se dan a conocer en las siguientes

15 publicaciones; para ciertas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria, las secuencias contienen preferiblemente los ligamientos internucleotídicos de fosforotioato modificado:

CPG 7909: Cooper y col., "CPG 7909 adjuvant improves hepatitis B virus vaccine seroprotection in antiretroviral treated HIV-infected adults." AIDS, 23 de sep. de 2005; 19(14): 1473-9.

CpG 10101: Bayes y col., "Gateways to clinical trials." Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. abril de 2005; 27(3): 193

219. Vollmer J., "Progress in drug development of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9" Expert Opinion on Biological Therapy. Mayo de 2005; 5(5): 673-682

25 [0114] Los oligonucleótidos CpG alternativos pueden comprender variantes de las secuencias preferidas descritas en las publicaciones anteriormente citadas que difieren en que tienen sustituciones, inserciones, deleciones y/o adiciones de secuencia nucleotídica sin consecuencias en las mismas. Los oligonucleótidos CpG utilizados en ciertas realizaciones de la presente invención pueden sintetizarse mediante cualquier procedimiento conocido en la materia (por ejemplo, documento EP 468520). De forma conveniente, dichos oligonucleótidos pueden sintetizarse utilizando un sintetizador automático. Los oligonucleótidos son típicamente desoxinucleótidos. En una realización preferida, el enlace internucleotídico en el oligonucleótido es un enlace fosforoditioato, o más preferiblemente fosforotioato, aunque los fosfodiésteres están también dentro del alcance de las realizaciones actualmente contempladas. Se contemplan también oligonucleótidos que comprenden diferentes ligamientos internucleotídicos, por ejemplo, fosforotioatos-fosfodiésteres mixtos. Pueden usarse también otros enlaces

35 internucleotídicos que estabilizan el oligonucleótido.

[0115] En ciertas realizaciones más específicas, el agonista de TLR se selecciona de lipopolisacárido, peptidoglicano, polil:C, CpG, 3M003, flagelina, homólogo de Leishmania de factor de alargamiento e iniciación ribosómico 4a eucariótico (LeIF) y al menos un antígeno de hepatitis C.

[0116] Aún otros coadyuvantes ilustrativos incluyen imiquimod, gardiquimod y resiquimod (todos disponibles en Invivogen) y compuestos relacionados, que son conocidos por actuar como agonistas de TLR7/8. Se proporciona un compendio de los coadyuvantes que pueden ser útiles en vacunas por Vogel y col., Pharm Biotechnol. 6: 141 (1995)).

45 [0117] Las composiciones de la invención pueden emplear también sistemas coadyuvantes diseñados para inducir una respuesta inmunitaria predominantemente de tipo Th1. Los altos niveles de citocinas de tipo Th1 (por ejemplo, IFN-γ, TNF-α., IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias mediadas por célula ante un antígeno administrado. En contraposición, los altos niveles de citocinas de tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales. Después de la aplicación de una vacuna que comprende un polipéptido de fusión que comprende adicionalmente al menos 2, al menos 3 o al menos 4 o más antígenos polipeptidicos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania, como se proporcionan en la presente memoria, un paciente soportará una respuesta inmunitaria que incluye respuestas de tipo Th1 y Th2. En una realización preferida, en que la respuesta es predominantemente de tipo Th1, el nivel de citocinas de tipo Th1

55 aumentará en mayor medida que el nivel de citocinas de tipo Th2. Los niveles de estas citocinas pueden valorarse fácilmente usando ensayos estándares. Para una revisión de las familias de citocinas, véase Mossman y Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173 (1989).

[0118] Ciertos coadyuvantes para uso en el desencadenamiento de una respuesta de tipo predominantemente Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil-lípido A, preferiblemente monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL™), junto con una sal de aluminio (patentes de EE. UU. nº 4.436.727, 4.877.611, 4.866.034 y 4.912.094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en que el dinucleótido CpG no está metilado) inducen también una respuesta predominantemente Th1. Dichos oligonucleótidos son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/02555, WO 99/33488 y las patentes de EE. UU. nº 6.008.200 y

65 5.856.462. Se describen también secuencias de ADN inmunoestimulantes, por ejemplo, por Sato y col., Science

273: 352 (1996). Otro coadyuvante ilustrativo comprende una saponina, tal como Quil A, o derivados de la misma

incluyendo QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, Mass.); escina; digitonina o saponinas de Gypsophila o Chenopodium quinoa. Otras formulaciones ilustrativas incluyen más de una saponina en las combinaciones coadyuvantes de la presente descripción, por ejemplo, combinaciones de al menos dos del siguiente grupo que comprende QS21, QS7, Quil A, β-escina o digitonina.

[0119] En una realización particular, el sistema coadyuvante incluye la combinación de un monofosforil-lípido A y un derivado de saponina, tal como la combinación de QS21 y coadyuvante 3D-MPL™, como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en que el QS21 se apaga con colesterol, como se describe en el documento WO 96/33739. Otras formulaciones comprenden una emulsión de aceite en agua y

10 tocoferol. Se describe otra formulación coadyuvante que emplea QS21, coadyuvante 3D-MPL™ y tocoferol en una emulsión de aceite en agua en el documento WO 95/17210.

[0120] En ciertas realizaciones preferidas, el coadyuvante usado en la presente descripción es un coadyuvante glucopiranosil-lípido A (GLA), como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. nº

15 20080131466.

[0121] Por ejemplo, en una realización, el coadyuvante GLA usado en el contexto de la presente descripción tiene la siguiente estructura:

en la que: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11-C20 y R2 y R4 son alquilo C12-C20.

[0122] En una realización más específica, el GLA tiene la fórmula exhibida anteriormente, en la que R1, R3, R5 25 y R6 son alquilo C11-14 y R2 y R4 son alquilo C12-15.

[0123] En una realización más específica, el GLA tiene la fórmula exhibida anteriormente, en la que R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11 y R2 y R4 son alquilo C13.

30 [0124] Otro sistema coadyuvante potenciado implica la combinación de un oligonucleótido que contiene CpG y un derivado de saponina como se da a conocer en el documento WO 00/09159.

[0125] Otros coadyuvantes ilustrativos incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, Calif., Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), la serie de coadyuvantes SBAS (por ejemplo, SBAS-2, AS2’,

35 AS2," SBAS-4 o SBAS6, disponibles en SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox, RC-529 (Corixa, Hamilton, Mont.) y otros 4-fosfatos de aminoalquilglucosaminida (AGP), tales como aquellos descritos en las solicitudes de patente de EE. UU. pendientes de nº de serie 08/853.826 y 09/074.720, y coadyuvantes de polioxietilenéter tales como aquellos descritos en el documento WO 99/52549A1.

40 [0126] La vacuna y composiciones farmacéuticas de la descripción pueden formularse usando cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos. En ciertas realizaciones, la vacuna o composiciones farmacéuticas se preparan como emulsiones estables (por ejemplo, emulsiones de aceite en agua) o como disoluciones acuosas.

[0127] Las composiciones de la invención pueden comprender también, o como alternativa, linfocitos T

45 específicos del polipéptido de fusión que comprende al menos 2 porciones o fragmentos inmunogénicos/antigénicos de antígenos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania o variantes de los mismos, descritos en la presente memoria. Dichas células pueden prepararse generalmente in vitro o ex vivo, usando procedimientos estándares. Por ejemplo, los linfocitos T pueden aislarse de médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica de un paciente. Como alternativa, los linfocitos T pueden derivarse de líneas o cultivos celulares humanos, de

50 mamíferos no humanos, relacionados o no relacionados.

[0128] Los linfocitos T pueden estimularse con un polipéptido de fusión que comprende al menos 2 porciones

o fragmentos inmunogénicos/antigénicos de antígenos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania o variantes de los mismos, un polinucleótido que codifica dicho polipéptido de fusión y/o una célula presentadora de antígeno (APC) que expresa dicho polipéptido de fusión. Dicha estimulación se efectúa en condiciones y durante un tiempo

5 suficiente para permitir la generación de linfocitos T que son específicos del polipéptido. En ciertas realizaciones, el polipéptido o polinucleótido está presente en un vehículo de suministro tal como una microesfera, para facilitar la generación de linfocitos T específicos.

[0129] Los linfocitos T se consideran específicos de un polipéptido de fusión que comprende al menos 2 porciones o fragmentos inmunogénicos/antigénicos de antígenos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania si los linfocitos T proliferan específicamente, secretan citocinas o matan células diana recubiertas con el polipéptido de fusión o que expresan un gen que codifica el polipéptido de fusión. La especificidad de linfocitos T puede evaluarse usando cualquiera de una variedad de técnicas estándares. Por ejemplo, en un ensayo de liberación de cromo o ensayo de proliferación, un índice de estimulación de un aumento de más de 2 veces de la lisis y/o proliferación, en

15 comparación con controles negativos, indica especificidad de linfocitos T. Dichos ensayos pueden efectuarse, por ejemplo, como se describe en Chen y col., Cancer Res. 54: 1065-1070 (1994)). Como alternativa, la detección de la proliferación de linfocitos T puede lograrse mediante una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, la proliferación de linfocitos T puede detectarse midiendo el índice aumentado de síntesis de ADN (por ejemplo, mediante marcaje por pulsos de cultivos de linfocitos T con timidina tritiada y midiendo la cantidad de timidina tritiada incorporada al ADN). El contacto con un polipéptido de la descripción (100 ng/ml-100 µg/ml, preferiblemente 200 ng/ml-25 µg/ml) durante 3-7 días debería dar como resultado un aumento de al menos 2 veces de la proliferación de linfocitos T. El contacto como se describe anteriormente durante 2-3 horas debería dar como resultado la activación de los linfocitos T, medida usando ensayos de citocina estándares en que un aumento de 2 veces del nivel de liberación de citocina (por ejemplo, TNF o IFN-γ) es indicativo de la activación de linfocitos T (véase Coligan y col.,

25 “Current Protocols in Immunology”, vol. 1 (1998)). Los linfocitos T que se han activado en respuesta a un polipéptido, polinucleótido o APC que expresa polipéptido pueden ser CD4+ y/o CD8+. Los linfocitos T específicos de proteína pueden propagarse usando técnicas estándares. En las realizaciones preferidas, los linfocitos T derivan de un paciente, un donante relacionado o un donante no relacionado y se administran al paciente después de estimulación y propagación.

[0130] En las composiciones de la invención, la formulación de excipientes y soluciones portadoras farmacéuticamente aceptables es bien conocida por los especialistas en la materia, así como el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en la presente memoria en una variedad de regímenes de tratamiento incluyendo, por ejemplo, administración y

35 formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal, intradérmica, subcutánea e intramuscular.

[0131] En ciertas aplicaciones, las composiciones dadas a conocer en la presente memoria pueden suministrarse mediante administración oral a un sujeto. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un portador comestible asimilable, o pueden encerrarse en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos o pueden incorporarse directamente al alimento de la dieta.

[0132] En ciertas circunstancias, será deseable suministrar las composiciones dadas a conocer en la presente memoria por vía parenteral, intravenosa, intramuscular o incluso intraperitoneal, como se describe por ejemplo en la patente de EE. UU. nº 5.543.158, la patente de EE. UU. nº 5.641.515 y la patente de EE. UU. nº 5.399.363.

45 [0133] Las disoluciones de compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua adecuadamente mezclados con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones pueden prepararse también en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

[0134] Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles (patente de EE. UU. nº 5.466.468).

55 [0135] En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede facilitarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir

65 agentes isotónicos, por ejemplo azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por

ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

[0136] Para administración parenteral en disolución acuosa, por ejemplo, la disolución debería tamponarse adecuadamente si es necesario y volverse isotónico en primer lugar el diluyente líquido con suficiente disolución

5 salina o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, será conocido un medio acuoso estéril que puede emplearse por los especialistas en la materia a la vista de la presente divulgación. Por ejemplo, puede disolverse una dosificación en 1 ml de disolución isotónica de NaCl y añadirse a 1.000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo,“Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 15ª edición, pág. 1035-1038 y 1570-1580). Aparecerá cierta variación en la dosificación necesariamente dependiendo de la condición del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para administración humana, las preparaciones deberían satisfacer los estándares de esterilidad, pirogenicidad y seguridad general y pureza requeridos por la FDA Office of Biologics standards.

15 [0137] Las disoluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos a la cantidad requerida en el disolvente apropiado con los diversos otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados a un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son técnicas de secado a vacío y liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una disolución esterilizada por filtración anteriormente.

25 [0138] Las composiciones dadas a conocer en la presente memoria pueden formularse en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden derivar también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las disoluciones se administrarán de manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz para el tratamiento de leishmaniosis. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como disoluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco y similares.

35 [0139] Como se usa en la presente memoria, “portador” incluye todos y cada uno de disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, tampones, disoluciones portadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido por un especialista en la materia. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. Pueden incorporarse también ingredientes activos suplementarios a las composiciones.

[0140] La frase “farmacéuticamente aceptable” hace referencia a entidades moleculares y composiciones que

45 no producen una reacción alérgica o similar indeseada cuando se administran a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como ingrediente activo es bien conocida por el especialista en la materia. Típicamente, dichas composiciones se preparan como inyectables, tanto como disoluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación puede emulsionarse también.

[0141] En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente descripción que comprenden un polipéptido de fusión con al menos 2 porciones o fragmentos inmunogénicos/antigénicos de antígenos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania o variantes de los mismos pueden suministrarse mediante pulverizadores intranasales, inhalación y/u otros vehículos de suministro en aerosol. Se han descrito procedimientos para suministrar genes,

55 polinucleótidos y composiciones peptídicas directamente en los pulmones mediante pulverizadores nasales en aerosol, por ejemplo, en la patente de EE. UU. nº 5.756.353 y la patente de EE. UU. nº 5.804.212.

[0142] Igualmente, el suministro de fármacos usando resinas de micropartículas intranasales (Takenaga y col., 1998) y compuestos de lisofosfatidilglicerol (patente de EE. UU. nº 5.725.871) es también bien conocido en la tecnología farmacéutica. Igualmente, se describe el suministro de fármaco transmucosa en forma de matriz de soporte de politetrafluoroetileno en la patente de EE. UU. nº 5.780.045.

[0143] En ciertas realizaciones, el suministro puede ocurrir mediante el uso liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas y similares, para la introducción de composiciones que

65 comprenden un polipéptido de fusión como se describe en la presente memoria en células hospedadoras adecuadas. En particular, las composiciones de la presente invención pueden formularse para suministro

encapsuladas en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, una nanopartícula o similar. La formulación y uso de dichos vehículos de suministro pueden llevarse a cabo usando técnicas conocidas y convencionales.

5 [0144] Una composición farmacéutica o inmunogénica puede contener, como alternativa, un inmunoestimulante y una molécula de ADN que codifica uno o más de los polipéptidos o polipéptidos de fusión que comprenden dos o más polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania o porciones o variantes inmunogénicas de los mismos como se describen anteriormente, de tal modo que se genere el polipéptido deseado in situ. En dichas composiciones, el ADN que codifica la proteína de fusión puede estar presente en cualquiera de una variedad de sistemas de suministro conocidos por los especialistas en la materia, incluyendo sistemas de expresión de ácido nucleico, sistemas de expresión bacterianos y víricos. Los sistemas de expresión de ácido nucleico apropiados contienen las secuencias de ADN necesarias para expresión en el paciente (tales como un promotor y una señal de terminación adecuados). Los sistemas de suministro bacterianos implican la administración de una bacteria (tal como bacilo de Calmette-Guerin) que expresa una porción inmunogénica del polipéptido sobre

15 su superficie celular. En una realización particular, el ADN puede introducirse usando un sistema de expresión vírica (por ejemplo, Vaccinia u otro poxvirus, retrovirus o adenovirus), lo que puede implicar el uso de un virus competente de replicación no patogénico (defectivo). Las técnicas para incorporar ADN a dichos sistemas de expresión son bien conocidas por los especialistas en la materia. El ADN puede estar también “desnudo”, como se describe por ejemplo en Ulmer y col., Science 259: 1745-1749 (1993) y se revisa por Cohen, Science 259: 1691-1692 (1993). La captación de ADN desnudo puede aumentarse recubriendo con el ADN perlas biodegradables, que se transportan eficazmente a las células.

[0145] Las composiciones farmacéuticas y vacunas de la descripción que comprenden dos o más polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania o porciones, fragmentos o variantes inmunogénicos/antigénicos de los 25 mismos, o polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos, porciones, fragmentos o variantes, pueden usarse, por ejemplo, para inducir inmunidad protectora frente a especies de Leishmania tales como L. donovani, L. major y/o L. infantum en un paciente tal como un ser humano o un perro, para prevenir la leishmaniosis o reducir su gravedad. Las composiciones y vacunas pueden usarse también para estimular una respuesta inmunitaria, que puede ser celular y/o humoral, en un paciente, para tratar un individuo ya infectado. En una realización, para pacientes infectados por Leishmania, las repuestas inmunitarias generadas incluyen una respuesta inmunitaria Th1 preferencial (concretamente, una respuesta caracterizada por la producción de las citocinas interleucina 1, interleucina 2, interleucina 12 y/o interferón γ, así como factor de necrosis tumoral α). En otra realización, para pacientes no infectados, la respuesta inmunitaria implica la producción de interleucina 12 y/o interleucina 2, o la estimulación de linfocitos T γδ. En cualquier categoría de paciente, la respuesta estimulada puede incluir la

35 producción de IL-12. Dichas respuestas pueden desencadenarse también en muestras biológicas de PBMC o componentes de las mismas derivados de individuos infectados por Leishmania o no infectados. Como se observa anteriormente, los ensayos para cualquiera de las citocinas anteriores, así como otras citocinas conocidas, pueden efectuarse generalmente usando procedimientos conocidos por los especialistas en la materia, tales como ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA).

[0146] Las dosis y procedimientos de administración de polipéptido de fusión apropiados con estos fines pueden determinarse fácilmente por un especialista en la materia usando el conocimiento disponible en la materia y/o técnicas rutinarias. Las vías y frecuencia de administración, así como la dosificación, para los aspectos anteriores de la presente invención pueden variar de individuo a individuo y pueden ser semejantes a aquellas que 45 se usan actualmente en inmunización contra otras infecciones, incluyendo infecciones protozoarias, víricas y bacterianas. Por ejemplo, en una realización, se administran entre 1 y 12 dosis de composición que tiene un polipéptido de fusión que comprende dos o más polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania o porciones, fragmentos o variantes inmunogénicos/antigénicos de los mismos, durante un periodo de 1 año. Pueden darse vacunaciones de recuerdo periódicamente después de ello según se necesite o desee. Por supuesto, pueden ser apropiados protocolos alternativos para pacientes individuales. En una realización particular, es una dosis adecuada una cantidad de polipéptido de fusión o ADN que codifica dicho péptido tal que, cuando se administra como se describe anteriormente, es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria en un paciente inmunizado suficiente para proteger al paciente de la leishmaniosis causada por especies de Leishmania tales como L. donovani, L. major y/o L. infantum durante al menos 1-2 años. En general, la cantidad de polipéptido de fusión presente en una dosis (o

55 producida in situ por el ADN en una dosis) oscila de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 1 mg por kg de hospedador, típicamente de aproximadamente 10 µg a aproximadamente 100 µg. Los tamaños de dosis adecuados variarán con el tamaño del paciente, pero oscilarán típicamente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 ml.

PROCEDIMIENTOS Y KITS DE DIAGNÓSTICO

[0147] En otro aspecto, esta descripción proporciona compuestos y procedimientos para detectar leishmaniosis en individuos y suministros de sangre. En realizaciones particulares, el individuo es un mamífero. En realizaciones más particulares, el mamífero es un ser humano o canino.

65 [0148] Los polipéptidos de fusión y polinucleótidos de la presente invención son también útiles como reactivos de diagnóstico para detectar y/o monitorizar infección por Leishmania en un paciente. Por ejemplo, las

composiciones, polipéptidos de fusión y polinucleótidos de la invención pueden usarse en ensayos in vitro e in vivo para detectar anticuerpos humorales o inmunidad mediada por célula contra Leishmania para el diagnóstico de infección, la monitorización de la progresión de la enfermedad o la evaluación del ensayo de curación. En realizaciones particulares, los polipéptidos de fusión y polinucleótidos son diagnósticos útiles para serodiagnóstico y 5 ensayo de sangre completa en pacientes que tienen leishmaniosis causada por especies de Leishmania tales como

L. donovani, L. major y/o L. infantum.

[0149] En un aspecto, los procedimientos y kits de diagnóstico emplean preferiblemente un polipéptido de fusión que comprende múltiples copias de fragmentos polipeptídicos, repeticiones de fragmentos polipeptídicos o fragmentos polipeptídicos multiméricos, incluyendo fragmentos antigénicos/inmunogénicos tales como los polipéptidos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania, que comprenden al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fragmentos contiguos en cualquier orden, e incluyendo todas las longitudes de una composición polipeptídica exhibida en la presente memoria, o aquellos codificados por una secuencia polinucleotídica exhibida en la presente memoria. En otro aspecto, los polipéptidos de fusión de la presente descripción pueden comprender dos

15 o más fragmentos de antígeno de Leishmania como se indican en las SEQ ID NO: 1-10 y 25-28. En una realización más particular, el polipéptido de fusión comprende la secuencia aminoacídica exhibida en las SEQ ID NO: 21 o 23.

[0150] En otra realización, los procedimientos y kits de diagnóstico emplean preferiblemente un polipéptido de fusión que comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 porciones o fragmentos inmunogénicos/antigénicos de antígenos KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania, variantes o similares, opcionalmente en combinación con uno o más de otros antígenos de Leishmania como se describen en la presente memoria, u obtenibles en la materia. En ciertas realizaciones, se preferirá usar múltiples antígenos de Leishmania como se describen en la presente memoria, por ejemplo, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, etc., en un procedimiento de diagnóstico de la descripción. Los antígenos pueden usarse

25 esencialmente en cualquier formato de ensayo deseado, por ejemplo, como antígenos individuales ensayados separadamente, como antígenos múltiples ensayados simultáneamente (por ejemplo, un polipéptido de fusión tal como KSA o KSAC), como antígenos inmovilizados sobre un soporte sólido tal como una matriz, o similar.

[0151] En una realización, se proporcionan kits de diagnóstico para detectar infección por Leishmania en una muestra biológica que comprenden (a) un polipéptido de fusión que comprende al menos 2 porciones o fragmentos inmunogénicos/antigénicos de polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania o variante del mismo descritos en la presente memoria y (b) un reactivo de detección.

[0152] En otra realización, se proporcionan kits de diagnóstico para detectar infección por Leishmania en una

35 muestra biológica que comprenden (a) al menos 2 anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que son específicos de un polipéptido de fusión que comprende al menos 2 porciones o fragmentos inmunogénicos/antigénicos de polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania o variante de los mismos descritos en la presente memoria y (b) un reactivo de detección.

[0153] En otra realización, se proporcionan procedimientos para detectar la presencia de infección por Leishmania en una muestra biológica que comprenden (a) poner en contacto una muestra biológica con un polipéptido de fusión que comprende al menos 2 porciones o fragmentos inmunogénicos/antigénicos de polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania o variante de los mismos descritos en la presente memoria y (b) detectar en la muestra biológica la presencia de anticuerpos que se unen al polipéptido de fusión.

45 [0154] En otra realización, se proporcionan procedimientos para detectar la presencia de infección por Leishmania en una muestra biológica que comprenden (a) poner en contacto una muestra biológica con al menos 2 anticuerpos monoclonales que se unen a un polipéptido de fusión que comprende al menos 2 porciones o fragmentos inmunogénicos/antigénicos de polipéptido KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania o variante de los mismos descritos en la presente memoria y (b) detectar en la muestra biológica la presencia de proteínas de Leishmania que se unen al anticuerpo monoclonal.

[0155] Un especialista en la materia reconocería que los procedimientos y kits descritos en la presente memoria pueden usarse para detectar todos los tipos de leishmaniosis, dependiendo de la combinación particular de

55 porciones inmunogénicas de antígenos de Leishmania presente en el polipéptido de fusión.

[0156] Existen una variedad de formatos de ensayo conocidos por los especialistas en la materia para usar un polipéptido de fusión para detectar anticuerpos en una muestra. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, “Antibodies. A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. En una realización preferida, el ensay implica el uso de un polipéptido de fusión inmovilizado sobre un soporte sólido para unirse a y retirar el anticuerpo de la muestra. El anticuerpo unido puede detectarse entonces usando un reactivo de detección que se une al complejo de anticuerpo/péptido y contiene un grupo indicador detectable. Los reactivos de detección adecuados incluyen, por ejemplo, anticuerpos que se unen al complejo de anticuerpo/polipéptido y polipéptido libre marcado con un grupo indicador (por ejemplo, en ensayo semicompetitivo). Los grupos indicadores adecuados incluyen, por ejemplo, 65 marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, radioisótopos, marcadores quimioluminiscentes, marcadores electroquimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes, polímeros, partículas poliméricas, partículas metálicas,

haptenos y tintes. Como alternativa, puede utilizarse un ensayo competitivo en que un anticuerpo se une a un polipéptido de fusión de la presente invención marcado con un grupo indicador y se deja unir al polipéptido de fusión inmovilizado después de la incubación del polipéptido de fusión con la muestra. La extensión en que los componentes de la muestra inhiben la unión del anticuerpo marcado al polipéptido de fusión es indicativa de la

5 reactividad de la muestra con el polipéptido de fusión inmovilizado.

[0157] El soporte sólido puede ser cualquier material conocido por los especialistas en la materia con el que pueda enlazarse el polipéptido de fusión. Por ejemplo, el soporte puede ser un pocillo de ensayo en una placa de microvaloración o membrana de nitrocelulosa u otra adecuada. Como alternativa, el soporte puede ser una perla o disco, tal como vidrio, fibra de vidrio, látex o un material plástico tal como poliestireno o poli(cloruro de vinilo). El soporte puede ser también una partícula magnética o un sensor de fibra óptica, tal como aquellos dados a conocer, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.º 5.359.681.

[0158] El polipéptido de fusión puede unirse al soporte sólido usando una variedad de técnicas conocidas por

15 los especialistas en la materia, que se describen ampliamente en la bibliografía de patentes y científica. En el contexto de la presente invención, el término “unido” hace referencia tanto a asociación no covalente, tal como adsorción, como a una enlace covalente (que puede ser un ligamiento directo entre el antígeno y los grupos funcionales sobre el soporte o puede ser un ligamiento mediante un agente de reticulación). Se prefiere la unión por adsorción a un pocillo en una placa de microvaloración o una membrana. En dichos casos, la adsorción puede conseguirse poniendo en contacto el polipéptido, en un tampón adecuado, con el soporte sólido durante una cantidad de tiempo adecuada. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero es típicamente entre aproximadamente 1 hora y 1 día. En general, poner en contacto un pocillo de una placa de microvaloración de plástico (tal como poliestireno o poli(cloruro de vinilo)) con una cantidad de polipéptido de fusión que oscila de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 1 µg, y preferiblemente aproximadamente 100 ng, es suficiente para

25 unir una cantidad adecuada de antígeno. La nitrocelulosa unirá aproximadamente 100 µg de proteína por cm3.

[0159] El enlace covalente del polipéptido de fusión con un soporte sólido puede conseguirse generalmente haciendo reaccionar en primer lugar el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionará tanto con el soporte como con el grupo funcional, tal como un grupo hidroxilo o amino, sobre el polipéptido de fusión. Por ejemplo, el polipéptido de fusión puede unirse a un soporte que tiene un recubrimiento polimérico apropiado usando benzoquinona o mediante condensación de un grupo aldehído sobre el soporte con una amina y un hidrógeno activo en el polipéptido (véase, por ejemplo, “Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook” (1991) en A12-A13).

[0160] En ciertas realizaciones, el ensayo es un ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA). Este

35 ensayo puede efectuarse poniendo en contacto en primer lugar un polipéptido de fusión de la presente invención que se ha inmovilizado sobre un soporte sólido, comúnmente el pocillo de una placa de microvaloración, con la muestra, de tal modo que los anticuerpos contra los antígenos de Leishmania del polipéptido de fusión en la muestra se dejan unir al polipéptido de fusión inmovilizado. Se retira entonces la muestra no unida del polipéptido de fusión inmovilizado y se añade un reactivo de detección capaz de unirse al complejo anticuerpo-polipéptido inmovilizado. Se determina entonces la cantidad de reactivo de detección que permanece unida al soporte sólido usando un procedimiento apropiado para el reactivo de detección específico.

[0161] Una vez se inmoviliza el polipéptido de fusión sobre el soporte, típicamente se bloquean el resto de sitios de unión de proteína sobre el soporte. Puede emplearse cualquier agente de bloqueo adecuado conocido por

45 los especialistas en la materia, tal como seroalbúmina bovina (BSA) o Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). El polipéptido inmovilizado se incuba entonces con la muestra y se deja unir el anticuerpo (si está presente en la muestra) al antígeno. La muestra puede diluirse con un diluyente adecuado, tal como disolución salina tamponada con fosfato (PBS), antes de la incubación. En general, es un tiempo de contacto apropiado (concretamente tiempo de incubación) aquel periodo de tiempo que es suficiente para permitir la detección de la presencia de anticuerpo en una muestra infectada por Leishmania. Preferiblemente, el tiempo de contacto es suficiente para conseguir un nivel de unión que es al menos un 95 % del conseguido en el equilibrio entre anticuerpo unido y no unido. Los especialistas en la materia reconocerán que el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio puede determinarse fácilmente ensayando el nivel de unión que aparece durante un periodo de tiempo. A temperatura ambiente, es generalmente suficiente un tiempo de incubación de aproximadamente 30 minutos.

55 [0162] La muestra no unida puede retirarse entonces por lavado del soporte sólido con un tampón apropiado, tal como PBS que contiene un 0,1 % de Tween 20™. Puede añadirse entonces reactivo de detección al soporte sólido. Es un reactivo de detección apropiado cualquier compuesto que se una al complejo de anticuerpo-polipéptido inmovilizado y que pueda detectarse mediante cualquiera de una variedad de medios conocidos por los especialistas en la materia. Preferiblemente, el reactivo de detección contiene un agente de unión (tal como, por ejemplo, proteína A, proteína G, inmunoglobulina, lectina o antígeno libre) conjugado con un grupo indicador. Los grupos indicadores preferidos incluyen enzimas (tales como peroxidasa de rábano picante), sustratos, cofactores, inhibidores, tintes, radionucleidos, grupos luminiscentes, grupos fluorescentes, oro coloidal y biotina. La conjugación del agente de unión con el grupo indicador puede conseguirse usando procedimientos estándares conocidos por los especialistas

65 en la materia. Los agentes de unión comunes pueden adquirirse también conjugados con una variedad de grupos indicadores de muchas fuentes (por ejemplo, Zymed Laboratories, San Francisco, Calif. y Pierce, Rockford, III.).

[0163] Se incuba entonces el reactivo de detección con el complejo de anticuerpo-polipéptido inmovilizado durante una cantidad de tiempo suficiente para detectar el anticuerpo unido. Puede determinarse generalmente la cantidad de tiempo apropiada a partir de las instrucciones del fabricante o ensayando el nivel de unión que aparece

5 durante un periodo de tiempo. Se retira entonces el reactivo de detección no unido y se detecta el reactivo de detección unido usando el grupo indicador. El procedimiento empleado para detectar el grupo indicador depende de la naturaleza del grupo indicador. Para grupos radiactivos, son generalmente apropiados el recuento por centelleo o procedimientos autorradiográficos. Pueden usarse procedimientos espectroscópicos para detectar tintes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina puede detectarse usando avidina acoplada a un grupo indicador diferente (comúnmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Los grupos indicadores enzimáticos pueden detectarse generalmente mediante la adición de sustrato (generalmente durante un periodo de tiempo específico), seguido de análisis espectroscópico u otro de los productos de reacción.

[0164] Para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos anti-Leishmania en la muestra, se compara

15 generalmente la señal detectada del grupo indicador que permanece unido al soporte sólido con una señal que corresponde a un valor de corte predeterminado. En una realización, el valor de corte es preferiblemente la señal media promedio obtenida cuando se incuba el polipéptido inmovilizado con muestras de un paciente no infectado. En general, una muestra que genere una señal que está tres desviaciones estándar por encima del valor de corte predeterminado se considera positiva (concretamente, reactiva con el polipéptido). En una realización alternativa, se determina el valor de corte usando una curva operativa de receptor, según el procedimiento de Sackett y col., “Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine”, pág. 106-7 (Little Brown and Co., 1985). Brevemente, en esta realización, puede determinarse el valor de corte a partir de una gráfica de pares de índices de verdaderos positivos (concretamente sensibilidad) e índices de falsos positivos (100 % de especificidad) que corresponden a cada valor de corte posible para el resultado del ensayo de diagnóstico. El valor de corte en la gráfica que está más

25 cercano a la esquina superior izquierda (concretamente, el valor que encierra el mayor área) es el valor de corte más exacto, y una muestra que genere una señal que es mayor que el valor de corte determinado mediante este procedimiento puede considerarse positiva. Como alternativa, el valor de corte puede desplazarse a la izquierda a lo largo de la gráfica para minimizar el índice de falsos positivos, o a la derecha para minimizar el índice de falsos negativos.

[0165] En una realización relacionada, el ensayo se efectúa en un formato de prueba de flujo continuo o de tira, en el que el antígeno se inmoviliza sobre una membrana tal como nitrocelulosa. En la prueba de flujo continuo, los anticuerpos en la muestra se unen al polipéptido inmovilizado a medida que la muestra pasa a través de la membrana. Se une entonces un reactivo de detección (por ejemplo, proteína A-oro coloidal) al complejo de 35 anticuerpo-polipéptido a medida que la disolución que contiene el reactivo de detección fluye a través de la membrana. La detección del reactivo de detección unido puede efectuarse entonces como se describe anteriormente. En el formato de prueba de tira, se sumerge un extremo de la membrana a la que está unida el polipéptido en una disolución que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo de la membrana a través de una región que contiene reactivo de detección y a la zona de polipéptido de fusión inmovilizado. La concentración del reactivo de detección en el polipéptido de fusión indica la presencia de anticuerpos de Leishmania en la muestra. Típicamente, la concentración de reactivo de detección en ese sitio genera un patrón, tal como una línea, que puede leerse visualmente. La ausencia de dicho patrón indica un resultado negativo. En general, se selecciona la cantidad de polipéptido de fusión inmovilizado sobre la membrana para generar un patrón visualmente discernible cuando la muestra biológica contiene un nivel de anticuerpos que sería suficiente para generar una señal positiva en un ELISA,

45 como se discute anteriormente. Preferiblemente, la cantidad de polipéptido de fusión inmovilizado sobre la membrana oscila de aproximadamente 25 ng a aproximadamente 1 µg, y más preferiblemente de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 500 ng. Dichas pruebas pueden efectuarse típicamente con una cantidad muy pequeña (por ejemplo, una gota) de suero o sangre del paciente.

[0166] Por supuesto, existen numerosos otros protocolos de ensayo que son adecuados para uso con los polipéptidos de fusión de la presente invención. Las descripciones anteriores pretenden ser solo ejemplares.

[0167] En un aspecto de la descripción, los ensayos discutidos anteriormente pueden usarse para detectar específicamente leishmaniosis visceral. En este aspecto, los anticuerpos en la muestra pueden detectarse usando 55 un polipéptido de fusión de la presente descripción, por ejemplo, que comprende una secuencia aminoacídica de dos o más fragmentos o epítopos antigénicos/inmunogénicos del antígeno KMP11, SMT, A2 y/o CPB de Leishmania. En una realización más particular, los anticuerpos en la muestra pueden detectarse usando un polipéptido de fusión que comprende la secuencia aminoacídica de dos o más fragmentos inmunogénicos o epítopos como se exhiben en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-10 y 25-28. En otro aspecto, los anticuerpos en la muestra pueden detectarse usando un polipéptido de fusión que comprende la secuencia aminoacídica exhibida en las SEQ ID NO: 21 y 23. Preferiblemente, los antígenos de Leishmania se inmovilizan por adsorción en un soporte sólido tal como un pocillo de una placa de microvaloración o una membrana como se describe anteriormente, en cantidades aproximadamente similares de tal modo que la cantidad total de polipéptido de fusión en contacto con el soporte oscile de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 100 µg. El resto de las etapas del ensayo pueden efectuarse 65 generalmente como se describe anteriormente. Resultará fácilmente evidente para los especialistas en la materia, combinando polipéptidos descritos en la presente memoria con otros polipéptidos que pueden detectar leishmaniosis

cutánea y mucosa, que los polipéptidos dados a conocer en la presente memoria pueden usarse en procedimientos que detectan todos los tipos de leishmaniosis.

[0168] En otro aspecto de esta descripción, los polipéptidos de fusión inmovilizados pueden usarse para

5 purificar anticuerpos que se unen a los mismos. Dichos anticuerpos pueden prepararse mediante cualquiera de una variedad de técnicas conocidas por los especialistas en la materia. Véase, por ejemplo, Harlow y Land, “Antibodies. A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. En una de dichas técnicas, se inyecta inicialmente un inmunógeno que comprende un polipéptido de fusión de la presente invención en cualquiera de una amplia variedad de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas y cabras). En esta etapa, el polipéptido

10 puede servir como inmunógeno sin modificación. Como alternativa, particularmente para polipéptidos relativamente cortos, puede desencadenarse una respuesta inmunitaria superior si el polipéptido se une a una proteína portadora, tal como seroalbúmina bovina o hemocianina de lapa bocallave. El inmunógeno se inyecta en el hospedador animal preferiblemente según un programa predeterminado que incorpora una o más inmunizaciones de recuerdo, y se extrae sangre periódicamente a los animales. Los anticuerpos policlonales específicos de los polipéptidos pueden

15 purificarse entonces a partir de dichos antisueros, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad usando el polipéptido acoplado con un soporte sólido adecuado.

[0169] Los anticuerpos monoclonales específicos del polipéptido de fusión antigénico de interés pueden

prepararse, por ejemplo, usando la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976, y mejoras de la

20 misma. Brevemente, estos procedimientos implican la preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tienen la especificidad deseada (concretamente, reactividad con el polipéptido de interés). Dichas líneas celulares pueden producirse, por ejemplo, a partir de células de bazo obtenidas a partir de un animal inmunizado como se describe anteriormente. Las células de bazo se inmortalizan entonces, por ejemplo, mediante fusión con un copartícipe de fusión de célula de mieloma, preferiblemente uno que sea singénico con el animal

25 inmunizado. Pueden emplearse una variedad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células de bazo y células de mieloma pueden combinarse con un detergente no iónico durante unos pocos minutos y sembrarse entonces a baja densidad sobre un medio selectivo que soporta el crecimiento de células híbridas, pero no de células de mieloma. Una técnica de selección preferida usa la selección con HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, habitualmente de aproximadamente 1 a 2 semanas, se observan colonias de híbridos. Se

30 seleccionan colonias individuales y se ensaya la actividad de unión frente al polipéptido. Se prefieren los hibridomas que tienen alta reactividad y especificidad.

[0170] Pueden aislarse anticuerpos monoclonales a partir de los sobrenadantes de colonias de hibridoma en

crecimiento. En este proceso, pueden emplearse diversas técnicas para potenciar el rendimiento, tales como

35 inyección de la línea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado adecuado, tal como un ratón. Los anticuerpos monoclonales pueden recogerse entonces del fluido ascítico o la sangre. Pueden retirarse los contaminantes de los anticuerpos mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción. Pueden usarse uno o más polipéptidos en el proceso de purificación, por ejemplo, en una etapa de cromatografía de afinidad.

40 [0171] Pueden usarse anticuerpos monoespecíficos que se unen a un polipéptido de fusión que comprende dos o más porciones inmunogénicas de antígenos K26, K39 y/o K9 de Leishmania, por ejemplo, para detectar infección por Leishmania en una muestra biológica usando uno de una variedad de inmunoensayos, que puede ser directo o competitivo. Brevemente, en un formato de ensayo directo, puede inmovilizarse un anticuerpo

45 monoespecífico sobre un soporte sólido (como se describe anteriormente) y ponerse en contacto con la muestra para ensayar. Después de retirar la muestra no unida, puede añadirse un segundo anticuerpo monoespecífico, que se ha marcado con un grupo indicador, y usarse para detectar el antígeno unido. En un ensayo competitivo ejemplar, la muestra puede combinarse con el anticuerpo monoclonal o policlonal, que se ha marcado con un grupo indicador adecuado. Puede combinarse entonces la mezcla de muestra y anticuerpo con antígeno polipeptídico inmovilizado

50 sobre un soporte sólido adecuado. Se deja unirse el anticuerpo que no se ha unido a antígeno en la muestra con antígeno inmovilizado y se retira el resto de la muestra y anticuerpo. El nivel de anticuerpo unido al soporte sólido está inversamente relacionado con el nivel de antígeno en la muestra. Por tanto, un menor nivel de anticuerpo unido al soporte solido indica la presencia de Leishmania en la muestra. Resultarán evidentes otros formatos para usar anticuerpos monoespecíficos para detectar Leishmania en una muestra para los especialistas en la materia, y los

55 formatos anteriores se proporcionan únicamente con fines ejemplares.

[0172]

Las diversas realizaciones descritas anteriormente pueden combinarse, proporcionando realizaciones

adicionales.

60

[0173] Pueden modificarse aspectos de las realizaciones, si es necesario emplear conceptos de diversas

patentes, solicitudes y publicaciones para proporcionar aún más realizaciones.

EJEMPLOS 65 EJEMPLO 1

LOS RATONES INMUNIZADOS CON KSA O KSAC ESTÁN PROTEGIDOS FRENTE A INFECCIÓN POR L. INFANTUM

[0174] Se mantuvieron ratones C57BL/6 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) en condiciones exentas

5 de patógeno específico. Los ratones eran de 8 a 12 semanas de edad al comienzo de los experimentos. Se cultivaron promastigotes de L. infantum (MHOM/BR/82/BA-2) a 25 ºC en MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 0,5X disolución de aminoácidos esenciales MEM (Invitrogen), aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Invitrogen), piruvato de sodio 1 mM, HEPES 25 mM, glucosa 8,3 mM, bicarbonato de sodio 26 mM, ácido para-aminobenzoico 1 µg/ml, gentamicina 50 µg/ml, suero fetal bovino termoinactivado al 10 % y hemina 6 µg/ml. Se

10 usaron promastigotes en fase logarítmica tardía o estacionaria para infecciones o preparaciones de Ag.

[0175] Se inmunizaron grupos de 5 ratones. Se inmunizó el primer grupo con disolución salina como control negativo. Se inmunizó el segundo grupo con 10 µg de SMT (por ejemplo, SEQ ID NO:4) más 20 µg de MPL®-SE (GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensant, Bélgica) en un volumen de 0,1 ml. Se inmunizó el tercer grupo con 10 µg

15 del polipéptido de fusión KSA (por ejemplo, SEQ ID NO:21) que contiene KMP11, SMT y A2 más 20 µg de MPL-SE® en un volumen de 0,1 ml. Se inmunizó el cuarto grupo con 10 µg del polipéptido de fusión KSAC (por ejemplo, SEQ ID NO:23) que contiene KMP11, SMT, A2 y CBP más 20 µg de MPL-SE® en un volumen de 0,1 ml.

[0176] Se procuraron tres inyecciones subcutáneas (s.c.) en la base de la cola a intervalos de 3 semanas. Se

20 infectaron los ratones 3 semanas después de la terminación del protocolo de inmunización. Como exposición, se suspendieron 5 x 106 promastigotes de L. infantum en 100 µl de disolución salina tamponada con fosfato y se inyectaron por vía intravenosa en la vena de cola del ratón.

[0177] A las 4 semanas después de la exposición, se sacrificaron los ratones para recoger los hígados para

25 determinar el número de parásitos en estos tejidos mediante ensayo de dilución limitante. Se homogeneizaron los tejidos con trituradores de vidrio y se diluyeron en serie dos veces las suspensiones con HOMEM completo en microplacas de 96 pocillos con agar con sangre NNN. Se examinó en cada pocillo la presencia de parásitos 10 días después de sembrar, y se calcularon los números de parásitos en los tejidos originales basándose en el factor de dilución del último pocillo positivo (Figura 1).

30 [0178] Los resultados de este experimento demostraron que los ratones inmunizados con polipéptidos de fusión KSA o KSAC estaban significativamente protegidos frente a infección por L. infantum.

EJEMPLO 2

35 LOS RATONES INMUNIZADOS CON KSA O KSAC ESTÁN PROTEGIDOS FRENTE A INFECCIÓN POR L. DONOVANI

[0179] Se mantuvieron ratones BALB/c (Charles River Laboratories) en condiciones exentas de patógeno

40 específico. Los ratones eran de 8 a 12 semanas de edad al comienzo de los experimentos. Se cultivaron promastigotes de L. donovani a 25 ºC en medio 199 suplementado con suero fetal bovino termoinactivado al 20 %, 100 U de penicilina por ml, 100 µg de estreptomocina por ml, L-glutamina 2 mM, adenina 0,1 mM, HEPES 40 mM, 0,25 mg de hemina por ml y 0,31 mg de 6-biotina por ml. Se usaron promastigotes en fase logarítmica tardía o estacionaria para infecciones o preparaciones de Ag.

45 [0180] Se inmunizaron grupos de 5 ratones. Se inmunizó el primer grupo con disolución salina como control negativo. Se inmunizó el segundo grupo con 10 µg del polipéptido de fusión KSA (por ejemplo, SEQ ID NO: 21) que contiene KMP11, SMT y A2 más 20 µg de MPL-SE® en un volumen de 0,1 ml. Se inmunizó el tercer grupo con 10 µg del polipéptido de fusión KSAC (por ejemplo, SEQ ID NO: 23) que contiene KMP11, SMT, A2 y CBP más 20 µg

50 de MPL-SE® en un volumen de 0,1 ml.

[0181] Se procuraron tres inyecciones subcutáneas (s.c.) en la base de la cola a intervalos de 3 semanas. Se infectaron los ratones 3 semanas después de la terminación del protocolo de inmunización. Como exposición, se suspendieron 1 x 107 promastigotes de L. donovani en 100 ml de disolución salina tamponada con fosfato y se

55 inyectaron por vía intravenosa a la vena de cola del ratón.

[0182] A las 4 semanas después de la exposición, se sacrificaron los ratones para recoger los hígados para determinar el número de parásitos en estos tejidos mediante ensayo de dilución limitante. Se homogeneizaron los tejidos con trituradores de vidrio y se diluyeron en serie las suspensiones dos veces con medio 199 completo en

60 microplacas de 96 pocillos con agar con sangre NNN. Se examinó en cada pocillo la presencia de parásitos 10 días después de sembrar, y se calcularon los números de parásitos en los tejidos originales basándose en el factor de dilución del último pocillo positivo (Figura 2).

[0183] Los resultados de este experimento demostraron que los ratones inmunizados con polipéptidos de 65 fusión KSA o KSAC estaban significativamente protegidos frente a infección con L. donovani.

EJEMPLO 3

LOS RATONES INMUNIZADOS CON KSAC ESTÁN PROTEGIDOS FRENTE A INFECCIÓN POR L. MAJOR

5 [0184] Se mantuvieron ratones BALB/c (Charles River Laboratories) en condiciones exentas de patógeno específico. Los ratones eran de 8 a 12 semanas de edad al comienzo de los experimentos. Se cultivaron promastigotes de L. major (MHOM/IL/80/Friedlin) a 25 ºC en medio 199 suplementado con suero bovino fetal termoinactivado al 20 %, 100 U de penicilina por ml, 100 µg de estreptomicina por ml, L-glutamina 2 mM, adenina 0,1 mM, HEPES 40 mM, 0,25 mg de hemina por ml y 0,31 mg de 6-biotina por ml. Se usaron promastigotes en fase logarítmica tardía o estacionaria para infecciones o preparaciones de Ag.

[0185] Se inmunizaron grupos de 5 ratones. Se inmunizó el primer grupo con disolución salina como control negativo. Se inmunizó el segundo grupo con 10 µg del polipéptido de fusión KSAC (por ejemplo, SEQ ID NO: 23) que contiene KMP11, SMT, A2 y CBP más 20 µg de MPL-SE® en un volumen de 0,1 ml.

15 [0186] Como exposición, se suspendieron 2.000 promastigotes de L. major en 10 µl de disolución salina tamponada con fosfato y se inyectaron por vía intradérmica a ambas orejas izquierda y derecha. Se infectaron los ratones 3 semanas después de la terminación del protocolo de inmunización.

[0187] Se monitorizó la progresión de la infección cada semana durante 8 semanas midiendo el diámetro de la induración de la lesión de oreja con un calibre métrico (Figura 3A).

[0188] A las 8 semanas después de la exposición, se recogió tejido de oreja para determinar el número de parásitos mediante ensayo de dilución limitante. Se homogeneizó el tejido con trituradores y se diluyeron en serie las

25 suspensiones dos veces con medio 199 completo en microplacas de 96 pocillos con agar con sangre NNN. Se examinó en cada pocillo la presencia de parásitos 10 días después de sembrar, y se calcularon los números de parásitos en los tejidos originales basándose en el factor de dilución del ultimo pocillo positivo (Figura 3B).

[0189] Los resultados de este experimento demostraron que los ratones inmunizados con polipéptidos de fusión KSAC estaban significativamente protegidos frente a infección con L. major.

EJEMPLO 4

INMUNIZACIÓN CON KSAC DE CANINOS

35 [0190] Se vacunan perros con leishmaniosis visceral por vía subcutánea con KSAC (SEQ ID NO: 21) + coadyuvante semanalmente durante 6 semanas. Se administra KSAC a una dosis de 25 µg y se administra el coadyuvante MPL-SE (un agonista de TLR-4) a una dosis de 25 µg. En algunos estudios, se administra el agonista de TLR-9 CgG 2395 (500 µg) en lugar, o además, de MPL-SE. Después de una pausa de dos meses, se administran por vía subcutánea 3 vacunas adicionales a intervalos semanales. Los perros inscritos en el estudio tienen puntuaciones clínicas de 4 a 7 de 16 posibles, siendo un número alto indicativo de una enfermedad más grave. Se monitoriza la carga parasitaria en médula ósea, bazo, nódulos linfáticos y piel. Se monitorizan las respuestas inmunitarias a la vacuna en sangre.

45 LISTADO DE SECUENCIAS

[0191]

<110> Infectious Disease Research Institute Goto, Yasuyuki Reed, Steven G.

<120> VACUNAS DE POLIPROTEÍNA RECOMBINANTE PARA EL TRATAMIENTO Y DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSIS

<130> 480239.407PC 55

<140> PCT

<141>

<160> 38

<170> FastSEQ for Windows versión 4.0

<210> 1

<211> 92 65 <212> PRT

<213> Leishmania infantum

<400> 1

<210> 2

<211> 92

<212> PRT

<213> Leishmania donovani 10

<400> 2

15 <210> 3

<211> 92

<212> PRT

<213> Leishmania major

20 <400> 3

<210> 4 25 <211> 353

<212> PRT

<213> Leishmania infantum

<400> 4

<210> 5

<211> 353 5 <212> PRT

<213> Leishmania donovani

<400> 5

<210> 6

<211> 353 5 <212> PRT

<213> Leishmania major

<400> 6

<210> 7

<211> 236 5 <212> PRT

<213> Leishmania infantum

<400> 7

<210> 8

<211> 443 5 <212> PRT

<213> Leishmania infantum

<400> 8

<210> 9

<211> 443 5 <212> PRT

<213> Leishmania donovani

<400> 9

<210> 10

<211> 443 5 <212> PRT

<213> Leishmania major

<400> 10

<210> 11

<211> 279

5 <212> ADN <213>Leishmania infantum

<400> 11

<210> 12

<211> 279

<212> ADN 15 <213> Leishmania donovani

<400> 12

<210> 13

<211> 279 5 <212>ADN

<213> Leishmania major

<400> 13

<210> 14

<211> 1062

<212>ADN 15 <213> Leishmania infantum

<400> 14

<210> 15

<211> 1062

<212>ADN

<213> Leishmania donovani 25

<400> 15

<210> 16

<211> 1062 5 <212> ADN

<213> Leishmania major

<400> 16

<210> 17

<211> 711

<212> ADN 15 <213> Leishmania infantum

<400> 17

<210> 18

<211> 1332

5 <212>ADN <213>Leishmania infantum

<400> 18

<210> 19

<211> 1332

<212> ADN 15 <213> Leishmania donovani

<400> 19

<210> 20

<211> 1332 5 <212>ADN

<213> Leishmania major

<400> 20

<210> 21

<211> 660

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia aminoacídica de un polipéptido de fusión KSA

<400> 21

<210> 22

<211> 1989 5 <212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión KSA

<400> 22

<210> 23

<211> 978 5 <212>PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia aminoacídica de un polipéptido de fusión KSAC 10

<400> 23

<210> 24

<211> 2937 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión KSAC

<400> 24

<210> 25

<211> 92 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia aminoacídica de una porción inmunogénica de un polipéptido KMP11

<400> 25

<210> 26

<211> 352 5 <212>PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>Secuencia aminoacídica de una porción inmunogénica de un polipéptido SMP 10

<400> 26

<210> 27

<211> 210 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia aminoacídica de una porción inmunogénica de un polipéptido A2 10

<400> 27

15 <210> 28

<211> 316

<212>PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Secuencia aminoacídica de una porción inmunogénica de un polipéptido CBP

<400> 28

<210> 29

<211> 276 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido KMP11 10

<400> 29

15 <210> 30

<211> 1056

<212>ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido SMP

<400> 30

<210> 31

<211> 629 5 <212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido A2 10

<400> 31

15 <210> 32

<211> 948

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido CBP

<400> 32

<210> 33

<211> 1003 5 <212>PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia aminoacídica del polipéptido de fusión KSAC 10

<400> 33

<210> 34

<211> 3021 5 <212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión KSAC 10

<400> 34

<210> 35

<211> 660 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia aminoacídica de un polipéptido de fusión KSA (sin Cys) 10

<400> 35

<210> 36

<211> 1990 5 <212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia nucleotídica de KSA (sin Cys) clonada en NdeI/EcoRI en pET29

<400> 36

<210> 37

<211> 978 10 <212>PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia aminoacídica de la poliproteína de fusión KSAC original (sin Cys) 15

<400> 37

<210> 38

<211> 2946 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia nucleotídica de KSAC original (sin Cys) clonado en NdeI/HindIII en pET29

<400> 38

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polipéptido de fusión que comprende una porción inmunogénica de al menos cuatro antígenos de Leishmania, en el que los antígenos de Leishmania son KMP11, SMT, A2 y CPB, en el que el polipéptido de fusión comprende una secuencia aminoacídica exhibida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 23, 33 o 37, o una secuencia que tiene al menos un 97 % de identidad con la misma; y en el que el polipéptido de fusión es capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora para prevenir la leishmaniosis o reducir la gravedad de la leishmaniosis en un mamífero.

2. 2.

   El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, en el que el polipéptido de fusión comprende una secuencia aminoacídica exhibida en la SEQ ID NO: 37, o una secuencia que tiene al menos un 97 % de identidad con la misma.

3. 3.

   El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, en el que el polipéptido de fusión comprende una secuencia aminoacídica exhibida en la SEQ ID NO: 33, o una secuencia que tiene al menos un 97 % de identidad con la misma.

4. 4.

   El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, en el que el polipéptido de fusión comprende una secuencia aminoacídica exhibida en la SEQ ID NO: 23, o una secuencia que tiene al menos un 97 % de identidad con la misma.

5. 5.

   El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, en el que el polipéptido de fusión comprende una secuencia aminoacídica exhibida en la SEQ ID NO: 23.

6. 6.

   El polipéptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la leishmaniosis está causada por infección por L. major, L. infantum y/o L. donovani.

7. 7.

   Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de fusión de la reivindicación 1.

8. 8.

   Una composición que comprende al menos un componente seleccionado del grupo consistente en un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un polinucleótido según la reivindicación 7, en combinación con al menos un inmunoestimulante.

9. 9.

   La composición según la reivindicación 8, en la que el inmunoestimulante se selecciona del grupo consistente en un oligonucleótido que contiene CpG, lípido A sintético, MPL™, 30-MPL™, saponinas, miméticos de saponina, AGP, agonistas de receptores de tipo Toll o una combinación de los mismos.

10. 10.

    La composición según la reivindicación 8, en la que el inmunoestimulante se selecciona del grupo consistente en un agonista de TLR4, un agonista de TLR7/8 y un agonista de TLR9.

11. 11.

    La composición según la reivindicación 8, en la que el inmunoestimulante se selecciona del grupo consistente en GLA, oligonucleótido que contiene CpG, imiquimod, gardiquimod y resiquimod.

12. 12.

    La composición según la reivindicación 8 para uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria frente a leishmaniosis en un mamífero.

13. 13.

    La composición según la reivindicación 8 para uso en la inducción de inmunidad protectora frente a leishmaniosis en un mamífero.

14. 14.

    La composición según la reivindicación 8 para uso en la inducción de inmunidad protectora frente a leishmaniosis en un canino, en la que el inmunoestimulante es GLA y en la que la composición se formula como una emulsión de aceite en agua estable.

15. 15.

    La composición para uso según la reivindicación 14, en la que la composición comprende adicionalmente al menos un componente seleccionado de un agonista de TLR7/8 y un agonista de TLR9.

16. 16.

    La composición para uso según la reivindicación 15, en la que el agonista de TLR7/8 se selecciona del grupo consistente en imiquimod, gardiquimod y resiquimod, y el agonista de TLR9 es un oligonucleótido que contiene CpG.

17. 17.

    La composición para uso según la reivindicación 14, en la que la composición comprende un polipéptido de fusión KSAC que tiene una secuencia aminoacídica exhibida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 23, 33o 37.

18. 18.

    La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, en la que la leishmaniosis está causada por infección por L. major, L. infantum y/o L donovani.

19. 19.

    Un procedimiento para detectar infección por Leishmania en una muestra biológica, que comprende: a) poner en contacto una muestra biológica con un polipéptido de fusión de la reivindicación 1; y b) detectar en la muestra biológica la presencia de anticuerpos que se unen al polipéptido de fusión, detectando así

    infección por Leishmania en una muestra biológica.

20. 20.

    El procedimiento de la reivindicación 19, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo consistente en sueros, sangre y saliva.

21. 21.

    El procedimiento de la reivindicación 19, en el que el polipéptido de fusión comprende una secuencia aminoacídica exhibida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 23, 33 o 37.

22. 22.

    El procedimiento de la reivindicación 19, en el que el polipéptido de fusión está unido a un soporte sólido.

23. 23.

    Un kit de diagnóstico para detectar infección por Leishmania en una muestra biológica, que comprende:

    a) un polipéptido de fusión de la reivindicación 1; y b) un reactivo de detección.