ES2894138T3

ES2894138T3 - Composiciones de vacuna novedosas que comprenden oligonucleótidos inmunoestimulantes

Info

Publication number: ES2894138T3
Application number: ES19173426T
Authority: ES
Inventors: Paul Joseph Dominowski; Sharath K Rai; Laurel Mary Sly; Corey Patrick Cook; Duncan Mwangi; Dennis L Foss; Richard Lee Krebs
Original assignee: Zoetis Services LLC
Current assignee: Zoetis Services LLC
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2014-05-12
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2034-05-12
Also published as: DK3542819T3; AU2014265649A1; CN108079290A; HK1219426A1; HRP20211452T1; EP3542819B1; MX2015015758A; WO2014186291A1; ZA201507774B; LT3542819T; AU2017232231A1; JP6505084B2; SI3542819T1; ES2742325T3; CA3027289A1; CA2911938C; NZ713360A; MX367268B; JP2016518446A; RU2015146752A

Abstract

Una composición de vacuna que comprende un componente antigénico del herpesvirus equino (HVE) y un componente coadyuvante, en la que el componente antigénico comprende un antígeno del HVE-1 y el componente coadyuvante comprende un oligonucleótido CpG de clase P y aceite SP; y en la que el aceite SP está presente en la cantidad del 2-20 % v/v y el aceite SP comprende copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno aproximadamente al 2,5 % p/v, escualano aproximadamente al 5 % p/v y monooleato de polioxietilensorbitán aproximadamente al 0,2 % p/v.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de vacuna novedosas que comprenden oligonucleótidos inmunoestimulantes

Campo de la invención

Esta invención se refiere a coadyuvantes novedosos para potenciar la respuesta inmunitaria a las vacunas contra el virus equino del caballo.

Antecedentes de la invención

El herpesvirus equino es uno de los principales patógenos de los équidos, responsable de enfermedades neurológicas y aborto inducidos por virus, tal como la paresia, infecciones respiratorias de vías altas y enfermedad del potro neonato (EPN). La EPN es el resultado de la infección transplacentaria de los fetos a punto de nacer, que nacen débiles, con enfermedades respiratorias graves y algunos con ictericia debido a la infección hepática por el EHV-1 (forma siglada de equine herpes virus-1, herpesvirus equino 1). Estos animales suelen morir a los pocos días de nacer. El virus de la rinoneumonitis equina (EHV-4) es la principal causa de la enfermedad aguda de las vías respiratorias ("rinoneumonitis") e infecta a la mayoría de los caballos durante sus dos primeros años de vida. La rinoneumonitis se caracteriza por fiebre, anorexia y una profusa rinorrea serosa que posteriormente se vuelve mucopurulenta. En raras ocasiones, la infección por el EHV4 provoca el aborto en las yeguas preñadas. Además, el EHV1 y el EHV4 establecen infecciones persistentes y latentes de por vida. Cuando se reactivan, los virus provocan una enfermedad recurrente, que trae aparejada excreción de virus y la transmisión a otros animales.

El control de la infección por herpesvirus equino y sus enfermedades sigue siendo inadecuado, en particular contra los abortos mediados por el EHV1, la paresia y la enfermedad del potro neonato, resultante de la infección transplacentaria del feto a punto de nacer. Aunque se dispone de vacunas inactivadas y vivas modificadas, ninguna de ellas parece bloquear suficientemente la infección ni impedir el establecimiento de latencia por virus de tipo silvestre. Por lo tanto, hay una gran necesidad de vacunas seguras con una protección mejorada contra las infecciones de campo de estos virus, en particular contra las infecciones provocadas por el EHV1.

R. Paillot y col., The Open Veterinary Science Journal, vol. 2, n.° 1, 1 de enero de 2008, páginas 68-91, desvelan muchas vacunas para el EHV (pág. 79 en adelante). Bode y col. (Expert Review of Vaccines 2011; 10(4) 499-511) discuten el potencial de distintos tipos de CpG como coadyuvantes. Bode no se pronuncia sobre el uso de aceite de SP y EHV. Wattrang y col. desvelan los efectos de distintas clases de CpG sobre los interferones de tipo I (IFN), IFN-y, factor de necrosis tumoral-a (TNF-o) y factor de crecimiento y transformación-p (TGFP), y sobre la proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) equina. Davis y col. (documento WO2011/148356) desvelan una combinación de oligonucleótidos CpG y colesterol. Debelak y col. (documento WO2008/068638) desvelan oligonucleótidos CpG de clase P con la base 5' sustituida por análogos lipófilos, pero no menciona el EHV o el aceite SP.

Se han descrito numerosos tratamientos, pero ninguno es totalmente satisfactorio debido a la toxicidad del tratamiento mismo o a la tendencia a la recaída del animal.

Por consiguiente, son necesarias nuevas formulaciones de vacuna para proteger a animales domésticos frente a infecciones por EHV.

Sumario de la invención

La presente invención se enfrenta a los inconvenientes de la técnica anterior proporcionando, en un aspecto, una composición de vacuna que comprende un componente antigénico de herpesvirus equino (EHV) en el que el componente antigénico comprende un antígeno del EHV-1 y un componente coadyuvante, en la que el componente coadyuvante comprende un oligonucleótido inmunoestimulante CpG de clase P y aceite SP, en el que el aceite SP comprende el 2-20 % v/v de la composición de vacuna. El aceite SP comprende copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno aproximadamente al 2,5 % p/v, escualano aproximadamente al 5 % p/v y monooleato ^{de polioxietilensorbitán aproximadamente al}0,2 ^{% p/v.}

En un conjunto de realizaciones, el oligonucleótido inmunoestimulante de clase P, que puede estar modificado y/o estabilizado, está presente en una cantidad de 20-500 |jg por dosis, por ejemplo, de 100-250 |jg por dosis.

En otra realización, el aceite SP comprende aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 10 % de la composición de vacuna.

En ciertas realizaciones de la invención, la formulación de vacuna es no liposómica.

Descripción detallada de realizaciones seleccionadas

Las siguientes definiciones no limitantes se proporcionan para una mejor comprensión de la invención:

"Aproximadamente" o "alrededor de", cuando se usa con relación a una variable numérica mensurable, hace referencia al valor indicado de la variable y a todos los valores de la variable que están dentro del error experimental del valor indicado (por ejemplo, dentro del intervalo de confianza del 95 % para la media) o dentro del 10 % del valor indicado, el que sea mayor, a menos que se use "aproximadamente" con referencia a intervalos de tiempo en semanas, donde "aproximadamente 3 semanas" es de 17 a 25 días y de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 semanas es de 10 a 40 días.

"Coadyuvante" significa cualquier sustancia que aumente la respuesta inmunitaria humoral o celular ante un antígeno. Los coadyuvantes se usan generalmente para lograr dos objetivos: para retardar la liberación de antígenos desde el sitio de inyección y para la estimulación del sistema inmunitario.

"Anticuerpo" hace referencia a una molécula de inmunoglobulina que puede unirse a un antígeno específico como resultado de una respuesta inmunitaria ante ese antígeno. Las inmunoglobulinas son proteínas séricas compuestas por cadenas polipeptídicas "ligeras" y "pesadas" que tienen regiones "constantes" y "variables" y que se dividen en clases (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) basándose en la composición de las regiones constantes.

"Antígeno" o "inmunógeno" hace referencia a cualquier sustancia que estimule una respuesta inmunitaria. El término incluye bacterias, virus o parásitos muertos, inactivados, atenuados o vivos modificados. El término antígeno incluye también polinucleótidos, polipéptidos, proteínas recombinantes, péptidos sintéticos, extracto de proteína, células (incluyendo células tumorales), tejidos, polisacáridos o lípidos o fragmentos de los mismos, individualmente o en cualquier combinación de los mismos. El término antígeno incluye también anticuerpos tales como anticuerpos antiidiotípicos o fragmentos de los mismos, y mimotopos peptídicos sintéticos que pueden imitar un antígeno o determinante antigénico (epítopo).

"Bacterina" significa una suspensión de una o más bacterias muertas que puede usarse como componente de una vacuna o composición inmunogénica.

"Tampón" significa un sistema químico que evita el cambio de concentración de otra sustancia química, por ejemplo, los sistemas donantes y aceptores de protones sirven como tampones que evitan cambios acusados de la concentración del ion de hidrógeno (pH). Es un ejemplo adicional de tampón una solución que contiene una mezcla de un ácido débil y su sal (base conjugada) o una base débil y su sal (ácido conjugado).

"Respuesta inmunitaria celular" o "respuesta inmunitaria mediada por células" es aquella mediada por linfocitos T u otros leucocitos o ambos, e incluye la producción de citocinas, quimiocinas y moléculas similares producidas por linfocitos T activados, leucocitos o ambos.

"Que consiste esencialmente", como se aplica a formulaciones de coadyuvantes, hace referencia a una formulación que no contiene agentes coadyuvantes ni inmunomoduladores adicionales no indicados en cantidades a las que dicho agente ejerce efectos coadyuvantes o inmunomoduladores mensurables.

"Dosis" hace referencia a una vacuna o composición inmunogénica administrada a un sujeto. Una "primera dosis" o "vacuna de sensibilización" hace referencia a la dosis de dicha composición administrada el día 0. Una "segunda dosis" o una "tercera dosis" o una "dosis anual" hace referencia a una cantidad de dicha composición administrada posteriormente a la primera dosis, que puede ser o no la misma vacuna o composición inmunogénica que la primera dosis.

"Respuesta inmunitaria humoral" hace referencia a aquella mediada por anticuerpos.

"Respuesta inmunitaria" en un sujeto hace referencia al desarrollo de una respuesta inmunitaria humoral, una respuesta inmunitaria celular, o una respuesta inmunitaria humoral y celular ante un antígeno. Las respuestas inmunitarias pueden determinarse habitualmente usando inmunoensayos y ensayos de neutralización estándares que son conocidos en la materia.

"Cantidad inmunológicamente protectora" o "cantidad inmunológicamente eficaz" o "cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria" de un antígeno es una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunogénica en el receptor. La respuesta inmunogénica puede ser suficiente con fines de diagnóstico u otro ensayo, o puede ser adecuada para prevenir signos o síntomas de enfermedad, incluyendo efectos adversos para la salud o complicaciones de los mismos, causados por infección por un agente patológico. Pueden inducirse tanto inmunidad humoral como inmunidad mediada por células o ambas. La respuesta inmunogénica de un animal ante una composición inmunogénica puede evaluarse, por ejemplo, indirectamente mediante la medida de títulos de anticuerpo o mediante ensayos de proliferación de linfocitos, o directamente mediante la monitorización de los signos y síntomas después de la exposición a la cepa de tipo silvestre, mientras que la inmunidad protectora conferida por una vacuna puede evaluarse midiendo, por ejemplo, la reducción de los signos clínicos tales como mortalidad, morbilidad, valor de temperatura, estado físico global y salud global y desempeño del sujeto. La respuesta inmunitaria puede comprender, sin limitación, la inducción de inmunidad celular y/o humoral.

"Inmunogénico" significa provocar una respuesta inmunitaria o antigénica. Por tanto, una composición inmunogénica sería cualquier composición que induzca una respuesta inmunitaria.

"Molécula inmunoestimulante" hace referencia a una molécula que genera una respuesta inmunitaria.

"Lípidos" hace referencia a cualquiera del grupo de compuestos orgánicos, incluyendo grasas, aceites, ceras, esteroles y triglicéridos, que son insolubles en agua, pero solubles en disolventes orgánicos no polares, son aceitosos al tacto y, junto con carbohidratos y proteínas, constituyen el material estructural principal de las células vivas.

"Farmacéuticamente aceptable" hace referencia a sustancias que están dentro del ámbito del criterio médico común adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de los sujetos sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares indebidas, correspondientemente con una relación beneficio/riesgo razonable, y eficaces para su uso pretendido.

"Reactogenicidad" hace referencia a los efectos secundarios desencadenados en un sujeto en respuesta a la administración de un coadyuvante, un inmunógeno o una composición de vacuna. Puede aparecer en el sitio de administración y se valora habitualmente en términos de desarrollo de una serie de síntomas. Estos síntomas pueden incluir inflamación, rojez y abscesos. Se valora también en términos de aparición, duración y gravedad. Una reacción "baja" implicaría, por ejemplo, hinchazón que es solo detectable por palpación y no a simple vista, o sería de corta duración. Una reacción más grave sería, por ejemplo, aquella que es visible a simple vista o de mayor duración.

"Temperatura ambiente" significa una temperatura de 18 a 25 °C.

"Saponina" hace referencia a un grupo de glucósidos tensioactivos de origen vegetal compuestos por una región hidrófila (habitualmente de varias cadenas de azúcar) en asociación con una región hidrófoba de estructura esteroide o triterpenoide.

"Esteroides" hace referencia a cualquiera de un grupo de compuestos orgánicos que pertenecen a la clase bioquímica de lípidos, que son fácilmente solubles en disolventes orgánicos y ligeramente hidrosolubles. Los esteroides comprenden un sistema de cuatro anillos fusionados de tres anillos de ciclohexano (seis carbonos) fusionados más un cuarto anillo de ciclopentano (cinco carbonos).

"Esteroles" hace referencia a compuestos en animales que son producidos biológicamente a partir de precursores terpenoides. Comprenden una estructura de anillo esteroide que tiene un grupo hidroxilo (OH) habitualmente enlazado al carbono 3. La cadena hidrocarbonada del sustituyente de ácido graso varía en longitud, habitualmente de 16 a 20 átomos de carbono, y puede ser saturada o insaturada. Los esteroles contienen comúnmente uno o más dobles enlaces en la estructura de anillo y también una variedad de sustituyentes enlazados con los anillos. Los esteroles y sus ésteres de ácido graso son esencialmente no hidrosolubles.

"Sujeto" hace referencia a cualquier animal para el que se desee la administración de una composición coadyuvante. Incluye mamíferos y no mamíferos, incluyendo primates, ganado, animales de compañía, animales de ensayo de laboratorio, animales salvajes cautivos, aves (incluyendo en huevo), reptiles y peces. Por tanto, este término incluye, pero sin limitación, monos, seres humanos, cerdos, bóvidos, ovejas, cabras, equinos, ratones, ratas, conejillos de Indias, hámsteres, conejos, felinos, cánidos, pollos, pavos, patos, otras aves de corral, ranas y lagartos.

"Cantidad terapéuticamente eficaz" hace referencia a una cantidad de antígeno o vacuna que induciría una respuesta inmunitaria en un sujeto que recibe el antígeno o vacuna que es adecuado para prevenir o reducir los signos o síntomas de enfermedad, incluyendo efectos adversos para la salud o complicaciones de los mismos, causados por la infección por un patógeno tal como un virus o una bacteria. Puede inducirse tanto inmunidad humoral como inmunidad mediada por células, o ambas. La respuesta inmunogénica de un animal ante una vacuna puede evaluarse, por ejemplo, indirectamente mediante la medida de los títulos de anticuerpo o mediante ensayos de proliferación de linfocitos, o directamente monitorizando los signos y síntomas después de exposición a la cepa de tipo silvestre. La inmunidad protectora conferida por una vacuna puede evaluarse midiendo, por ejemplo, la reducción de los signos clínicos tales como mortalidad, morbilidad, valor de temperatura, estado físico global y salud global y desempeño del sujeto. La cantidad de una vacuna que es terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo del coadyuvante particular usado, el antígeno particular usado o la afección del sujeto, y puede ser determinada por un especialista en la materia.

"Tratar" hace referencia a prevenir un trastorno, afección o enfermedad al que se aplica dicho término, o a prevenir o reducir uno o más síntomas de dicho trastorno, afección o enfermedad.

"Tratamiento" hace referencia al acto de "tratar" como se define anteriormente.

"Triterpenoides" hace referencia a una clase amplia y diversa de moléculas orgánicas de origen natural derivadas de 6 ^{unidades de isopreno de 5 carbonos (2-metil-1,3-butadieno), que pueden ensamblarse y modificarse de miles de}maneras. La mayoría son estructuras policíclicas que difieren entre sí en los grupos funcionales y en sus esqueletos de carbono básicos. Estas moléculas pueden encontrarse en todas las clases de seres vivos.

"Vacuna" hace referencia a una composición que incluye un antígeno, como se define en el presente documento. La administración de la vacuna a un sujeto da como resultado una respuesta inmunitaria, generalmente contra una o más enfermedades específicas. La cantidad de una vacuna que es terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo del antígeno particular usado, o de la afección del sujeto, y puede ser determinada por un especialista en la materia.

Como se observa anteriormente, la presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende un componente de antígeno que es un antígeno del EHV-1 y un componente coadyuvante, en la que el componente coadyuvante comprende (o, en un conjunto distinto de realizaciones, consiste esencialmente en, o, en aún otro conjunto distinto de realizaciones, consiste en) un oligonucleótido inmunoestimulante de clase P y un aceite SP, ^{comprendiendo dicho aceite el}2-20 ^{% v/v de la composición de vacuna.}

En un conjunto de realizaciones, las composiciones de vacuna de la presente invención son no liposómicas, el antígeno se dispersaría o disolvería generalmente en la fase acuosa y no estaría recubierto por liposomas ni estructuras similares.

Antígenos

Son adecuados para la presente invención diferentes antígenos derivados del EHV. Los antígenos pueden incluir, sin limitación, organismos completos (inactivados, atenuados y vivos modificados), nucleótidos, polinucleótidos, péptidos, polipéptidos, proteínas recombinantes, péptidos sintéticos, extracto de proteína, polisacáridos, carbohidratos, ácidos grasos, ácido teicoico, peptidoglicanos, lípidos o glucolípidos, individualmente o en cualquier combinación de los mismos.

Las cepas víricas vivas, vivas modificadas y atenuadas que no provocan enfermedad en un sujeto se han aislado en forma no virulenta o se han atenuado utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica, incluido el pasaje en serie en una línea celular adecuada o la exposición a la luz ultravioleta o a un mutágeno químico. Las cepas víricas inactivadas o muertas son las que se han inactivado por procedimientos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo el tratamiento con formalina, betapropriolactona (BPL), etilenimina binaria (EIB), radiación esterilizante, calor u otros procedimientos similares.

La cantidad de antígeno usada para inducir una respuesta inmunitaria variará considerablemente dependiendo del antígeno usado, del sujeto y del nivel de respuesta deseado, y puede ser determinada por un especialista en la materia. En el caso de las vacunas que contienen EHV vivo modificado o atenuado, una cantidad terapéuticamente eficaz del ^{antígeno varía generalmente de aproximadamente}10^{2 dosis infecciosa en cultivo de tejidos (DICT)50 a aproximadamente}10^{10 DICT50, inclusive. Para muchos de tales virus, una dosis terapéuticamente eficaz está generalmente en el intervalo de aproximadamente}10^{2 DICT50 a aproximadamente}10^{8 DICT50, inclusive. En algunas realizaciones, los intervalos de las dosis terapéuticas eficaces son de aproximadamente}10^{3 DICT50 a aproximadamente}10^{6 DICT50, inclusive. En algunas otras realizaciones, los intervalos de las dosis terapéuticas eficaces son de aproximadamente}10^{4 DICT50 a aproximadamente}10^{5 DICT50, inclusive.}

Para las vacunas que contienen EHV inactivado, una cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno es generalmente ^{al menos de aproximadamente}100 ^{unidades relativas por dosis, y a menudo está en el intervalo de aproximadamente}1.000 a aproximadamente 4.500 unidades relativas por dosis, inclusive. En otras realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno está en un intervalo de aproximadamente 250 a aproximadamente 4.000 unidades relativas por dosis, inclusive, de aproximadamente 500 a aproximadamente 3.000 unidades relativas por dosis, inclusive, de aproximadamente 750 a aproximadamente 2.000 unidades relativas por dosis, inclusive, o de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 1.500 unidades relativas por dosis, inclusive.

Una cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno en vacunas que contienen virus inactivados puede medirse también en términos de potencia relativa (PR) por ml. Una cantidad terapéuticamente eficaz está a menudo en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 PR por ml, inclusive. En otras realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno está en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 PR por ml, inclusive, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 PR por ml, inclusive, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 PR por ml, inclusive, de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 PR por ml, inclusive, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 PR por ml, inclusive.

Las variedades más comunes del EHV son el EHV-1 y el EHV-4. El EHV está compuesto por una nucleocápside icosaédrica que contiene el genoma vírico, rodeada por una envoltura amorfa, que contiene once glucoproteínas (gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gK, gL, gM y gN). Véase Paillot y col., Open Vet Sc J, 2008; 2: 68-91.

Los ejemplos no limitantes adecuados de antígenos del EHV incluyen virus completos (inactivados, atenuados y modificados vivos), extractos de proteínas, proteínas de la envoltura y secuencias de ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas, así como antígenos en subunidades recombinantes o antígenos vectorizados.

Saponinas y CpG

Las saponinas triterpenoides pueden proceder de muchas fuentes, tanto derivadas de plantas como equivalentes sintéticos incluyendo, pero sin limitación, Quillaja saponaria, tomatina, extractos de ginseng, hongos y un glucósido alcaloide estructuralmente similar a las saponinas esteroideas. Por tanto, los triterpenoides incluyen saponinas, escualeno y lanosterol. Se usan generalmente a una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 |jg por dosis. Se usan también a una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 4.000 jg por dosis, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3.000 jg por dosis, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2.000 jg por dosis y de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000 jg por dosis. Se usan también a una cantidad de aproximadamente 5 a aproximadamente 750 |jg por dosis, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 |jg por dosis, de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 jg por dosis, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 jg por dosis, de aproximadamente 15 a aproximadamente 100 jg por dosis y a una cantidad de aproximadamente 30 a aproximadamente 75 jg por dosis. Si se usa una saponina, las composiciones coadyuvantes contienen generalmente una fracción de saponina inmunológicamente activa de la corteza de Quillaja saponaria. La saponina puede ser, por ejemplo, Quil A u otra preparación de saponina purificada o parcialmente purificada, que puede obtenerse comercialmente. Por ejemplo, Quill A se vende en los EE.UU. por E.M Sergeant Company. QS-7, QS-17, QS-18 y QS-21 pueden obtenerse en Antigenics Company, Massachusetts, EE.UU. Por tanto, los extractos de saponina pueden usarse como mezclas o componentes individuales purificados tales como QS-7, QS-17, QS-18 y ^{q S-}21^{. En una realización, Quil A es al menos un 85 % puro. Quil A es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %,}95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % puro. Los oligonucleótidos CpG son una clase recientemente descrita de agentes farmacoterapéuticos que se caracterizan por la presencia de un dinucleótido CG no metilado en contextos de secuencia de base específicos (motivo CpG). (Hansel TT, Barnes PJ (eds): "New Drugs for Asthma, Allergy and COPD". Prog. Respir. Res. Basilea, Karger, 2001, vol 31, pág 229-232, incorporado en el presente documento por referencia). Estos motivos CpG no se observan en ADN eucariótico, en el que los dinucleótidos CG se suprimen y, cuando están presentes, habitualmente están metilados, pero están presentes en ADN bacteriano al que confieren propiedades imunoestimulantes.

Los coadyuvantes de la presente invención utilizan el denominado oligonucleótido inmunoestimulante de clase P, más preferentemente oligonucleótidos inmunoestimulantes de clase P modificados. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes de clase P son oligonucleótidos CpG caracterizados por la presencia de palíndromos, generalmente de 6-20 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos de clase P tienen la capacidad de autoensamblarse espontáneamente en concatémeros, in vitro y/o in vivo. Estos oligonucleótidos son, en sentido estricto, monocatenarios, pero la presencia de palíndromos permite la formación de concatémeros o posiblemente estructuras de tallo y bucle. La longitud global de los oligonucleótidos inmunoestimulantes de clase P está entre 19 y 100 nucleótidos, por ejemplo, 19-30 nucleótidos, 30-40 nucleótidos, 40-50 nucleótidos, 50-60 nucleótidos, 60-70 nucleótidos, 70-80 nucleótidos, 80-90 nucleótidos y 90-100 nucleótidos.

En un aspecto de la invención, el oligonucleótido inmunoestimulante contiene un dominio de activación 5' TLR y al ^{menos dos regiones palindrómicas, siendo una región palindrómica la región palindrómica 5' de al menos}6 ^{nucleótidos de longitud y conectada con la región palindrómica 3' de al menos}8 ^{nucleótidos de longitud directamente o a través}de un espaciador.

Los oligonucleótidos inmunoestimulantes de clase P pueden modificarse según técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, la modificación J hace referencia a nucleótidos modificados con yodo. La modificación E hace referencia a un nucleótido o nucleótidos modificados con etilo. Por tanto, los oligonucleótidos inmunoestimulantes de clase P con modificación E son oligonucleótidos inmunoestimulantes de clase P en los que al menos un nucleótido ^{(preferentemente nucleótido 5') está etilado. Modificaciones adicionales incluyen el enlazamiento de}6-nitrobencimidazol, la O-metilación, la modificación con propinil-dU, la modificación con inosina y el enlazamiento 2-bromovinilo (preferentemente con uridina).

Los oligonucleótidos inmunoestimulantes de clase P pueden contener también un ligamiento internucleotídico modificado incluyendo, sin limitaciones, ligamientos fosfodiéster y ligamientos fosforotioato. Los oligonucleótidos de la presente invención pueden sintetizarse u obtenerse de fuentes comerciales.

Los oligonucleótidos de clase P y oligonucleótidos de clase P modificados se dan a conocer adicionalmente en la solicitud PCT publicada n.° WO2008/068638, publicada el 12 de junio de 2008. Se proporcionan a continuación ejemplos adecuados no limitantes de oligonucleótidos inmunoestimulantes de clase P modificados ("*" hace referencia a un enlace fosforotioato y "_" hace referencia a un enlace fosfodiéster).

SEQ ID NO: 1 5' T*C-G*T*C-G*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3'

SEQ ID NO: 2 5' T*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'

SEQ ID NO: 3 5' t *C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'

SEQ ID NO: 4 5' JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'

SEQ ID NO: 5 5' JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C* G*T 3'

^{SEQ ID NO:}6 5' JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C* G*T 3'

SEQ ID NO: 7 5' EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'

^{SEQ ID NO:}8 5' JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C* G*T 3'

SEQ ID NO: 9 5' JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C* G*T 3'

SEQ ID NO: 10 5' T*C G*T*C G*A*C G*A*T*C G*G*C*G*C G*C*G*C*C*G 3'.

La cantidad de oligonucleótido inmunoestimulante de clase P para su uso en las composiciones coadyuvantes depende de la naturaleza del oligonucleótido inmunoestimulante de clase P usado y de la especie pretendida. Sin embargo, se usan generalmente en una cantidad de aproximadamente 20 a aproximadamente 500 jg por ml. Se usan también en una cantidad de aproximadamente 25 jg a aproximadamente 400 mg por ml, de aproximadamente 40 a aproximadamente 250 jg por ml, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 jg por ml o de aproximadamente 100 ^{g por ml a aproximadamente}200 ^{jg por ml.}

Esteróles

Los esteróles incluyen p-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. Estos esteróles son bien conocidos en la materia y pueden adquirirse comercialmente. Por ejemplo, el colesterol se da a conocer en "Merck Index", 12a ed., pág. 369. La cantidad de esteroles adecuada para su uso en las composiciones coadyuvantes depende de la naturaleza del esterol usado. Sin embargo, se usan generalmente en cantidades de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 |jg por ml. Se usan también en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 4.000 jg por ml, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3.000 jg por ml, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2.000 jg por ml, y de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000 jg por ml. Se usan también en una cantidad de aproximadamente 5 a aproximadamente 750 jg por ml, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 jg por ml, de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 jg por ml, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 jg por ml, de aproximadamente 15 a aproximadamente 100 jg por ml y de aproximadamente 30 a aproximadamente 75 jg por ml.

La preparación de las composiciones que contienen la saponina y el esterol según el Ejemplo 1 a continuación está dentro de las habilidades ordinarias en la materia. Brevemente, se prepara una mezcla acuosa, comprendiendo dicha mezcla el antígeno, el oligonucleótido inmunomodulador de clase P y la saponina. Se añade entonces gradualmente (o gota a gota) el esterol a esa mezcla.

Fase oleosa

La componente coadyuvante de la presente invención comprende un aceite SP en una cantidad de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 % v/vde la composición de vacuna, por ejemplo, de aproximadamente 3 a aproximadamente 15%, de aproximadamente 5 a aproximadamente 15%, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15%, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 %, etc. La fase oleosa comprende aceite SP de aproximadamente el 2 a aproximadamente el 20 % v/v y opcionalmente comprende uno o más emulsionantes. En una alternativa, la fase oleosa comprende dos emulsionantes, uno de los cuales es liposoluble y el otro es hidrosoluble.

También se desvelan en el presente documento múltiples aceites y combinaciones de los mismos. Estos aceites incluyen aceites animales, aceites vegetales, así como aceites no metabolizables. Son ejemplos de aceites vegetales el aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de coco y aceite de oliva. Es un ejemplo de aceites animales el escualano. Los ejemplos de aceites no metabolizables incluyen aceite mineral ligero, aceites saturados de cadena lineal o ramificada, escualano y similares.

El aceite es aceite SP, que comprende un copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno (disponible en BASF, Mt. Olive, NJ), escualano (disponible en Kodak, Rochester, NY) y monooleato de polioxietilensorbitán (TWEEN®80, disponible en Sigma Chemical, St. Louis, MO). El escualano se usa a alrededor del 5 % (p/v), el copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno se usa a alrededor del 2,5 % (p/v), el monooleato de polioxietilensorbitán (TWEEN®-^{80) se usa a alrededor del}0,2 ^{% (p/v) preparados en un diluyente farmacéuticamente aceptable de cualquiera de}tampón, agua, solución salina normal o medio de crecimiento de cultivo celular.

Los emulsionantes adecuados para su uso en las presentes emulsiones incluyen emulsionantes biológicamente compatibles naturales y tensioactivos sintéticos no naturales. Los emulsionantes biológicamente compatibles incluyen compuestos fosfolipídicos o una mezcla de fosfolípidos. Son fosfolípidos preferidos las fosfatidilcolinas (lecitina) tales como lecitina de soja o de huevo. La lecitina puede obtenerse como una mezcla de fosfatidas y triglicéridos mediante el lavado con agua de aceites vegetales brutos, y separación y secado de las gomas hidratadas resultantes. Puede obtenerse un producto refinado fraccionando la mezcla en fosfolípidos insolubles en acetona y los glucolípidos que permanecen después de la retirada de los triglicéridos y el aceite vegetal mediante lavado con acetona. Como alternativa, puede obtenerse lecitina de diversas fuentes comerciales. Otros fosfolípidos adecuados incluyen fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, cardiolipina y fosfatidiletanolamina. Los fosfolípidos pueden aislarse de fuentes naturales o sintetizarse convencionalmente.

Como alternativa, los emulsionantes usados en el presente documento no incluyen lecitina, o usan lecitina en una cantidad que no es inmunológicamente eficaz.

Los emulsionantes sintéticos no naturales adecuados para su uso en las formulaciones coadyuvantes de la presente invención incluyen tensioactivos no iónicos basados en sorbitán, por ejemplo, tensioactivos de sorbitán sustituidos con ácido graso (comercialmente disponibles con el nombre SPAN® o ARLACEL®), ésteres de ácido graso de sorbitol polietoxilado (TWEEN®), ésteres de polietilenglicol de ácidos grasos de fuentes tales como aceite de ricino (EMULFOR®); ácido graso polietoxilado (por ejemplo, ácido esteárico disponible con el nombre SIMULSOL M-53), polímero de isooctilfenol/formaldehído polietoxilado (TYLOXAPOL®), polioxietilenéteres de alcoholes grasos (BRIJ®); polioxietilenonilfeniléteres (TRITON® N), polioxietilenisooctilfeniléteres (TRITON® X). Son tensioactivos sintéticos preferidos los tensioactivos disponibles con el nombre SPAN® y TWEEN®, tales como TWEEN-80 (monooleato de polioxietilen-(20)-sorbitán) y SPAN-80 (monooleato de sorbitán).

Hablando en general, el emulsionante o emulsionantes pueden estar presentes en la composición de vacuna en una cantidad de 0,01 a 10 % en volumen, preferentemente de 0,1 a 5 %, más preferentemente de 1 a 3 %.

La preparación de las composiciones de vacuna que comprenden el aceite SP es directa y conlleva mezclar la fase acuosa que comprende el antígeno, el oligonucleótido inmunoestimulante de clase P y, opcionalmente, un emulsionante hidrosoluble, con el aceite SP y, opcionalmente, un emulsionante liposoluble. La mezcla resultante se emulsiona.

Otros componentes de las composiciones pueden incluir excipientes farmacéuticamente aceptables tales como portadores, disolventes y diluyentes, agentes isotónicos, agentes de tamponación, estabilizadores, conservantes, agentes vasoconstrictores, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos y similares. Los portadores, disolventes y diluyentes típicos incluyen agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol, aceite y similares. Agentes isotónicos representativos incluyen cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol, lactosa y similares. Los estabilizadores útiles incluyen gelatina, albúmina y similares.

Como se usa en el presente documento, "un portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, coadyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardantes de la adsorción y similares. El portador o portadores deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros componentes de las composiciones y no nocivos para el sujeto. Típicamente, los portadores serán estériles y exentos de pirógenos y seleccionados basándose en el modo de administración en que se usarán. Es bien conocido por los especialistas en la materia que las formulaciones preferidas para el portador farmacéuticamente aceptable que comprende las composiciones son aquellos portadores farmacéuticos aprobados en los reglamentos aplicables promulgados por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (EE.UU.) o la Administración de alimentos y medicamentos de EE.UU. o la agencia estatal equivalente en un país distinto de EE.UU. Por lo tanto, el portador farmacéuticamente aceptado para producción comercial de las composiciones es un portador que ya se ha aprobado o será aprobado por la agencia estatal apropiada de EE.UU. o de un país extranjero.

Las composiciones pueden incluir opcionalmente diluyentes líquidos, semisólidos o sólidos farmacéuticamente aceptables compatibles (es decir, estériles o no tóxicos) que sirven como vehículos, excipientes o medios farmacéuticos. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizadores incluyen albúmina entre otros.

Las composiciones pueden contener también antibióticos o conservantes incluyendo, por ejemplo, gentamicina, mertiolato o clorocresol. Las diversas clases de antibióticos o conservantes de las que se selecciona son bien conocidas para el especialista en la materia.

Administración y uso de las composiciones

Los tamaños de dosis de las composiciones oscilan típicamente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 ml inclusive, dependiendo del sujeto y del antígeno. Por ejemplo, para un cánido o un felino, se usa típicamente una dosis de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1 ml, mientras que en animales más grandes se usa típicamente una dosis de aproximadamente 1-5 ml. Sin embargo, estos coadyuvantes pueden formularse también en microdosis, pudiendo usarse dosis de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 pl.

Las vías de administración para las composiciones coadyuvantes incluyen, sin limitaciones, subcutánea, intramuscular, parenteral, oral, buconasal, intranasal, intratraqueal, tópica, etc. Puede usarse cualquier dispositivo adecuado para administrar las composiciones, incluyendo jeringuillas, goteros, dispositivos de inyección sin aguja, parches y similares. La vía y dispositivo seleccionados para el uso dependerán de la composición del coadyuvante, del antígeno y del sujeto, y estos son bien conocidos por el especialista en la materia.

La invención se describirá adicionalmente con los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo

Ejemplo 1 : Antígeno del EHV

Animales

Los equinos macho y hembra cruzados sanos, de 11 a 12 meses de edad, se dividieron en grupos de tratamiento que contenían 5 caballos por grupo. Los caballos se mantuvieron en instalaciones al aire libre durante la fase de vacunación. Dado que en los primeros años de vida casi todos los caballos están expuestos al EHV, los caballos no son realmente animales que no han estado expuestos anteriormente al patógeno. Los títulos de SN se utilizan para seleccionar animales que tienen títulos bajos; sin embargo, la exposición previa puede afectar la interpretación de los resultados de la prueba. En este estudio se utilizó como antígeno el EHV-1 muerto convencional.

El diseño experimental se proporciona en la Tabla 4.

Tabla 4: Diseño ex erimental del estudio de antí eno de EHV en caballos

Los resultados se resumen en las tablas a continuación.

Tabla 5: Resultados del índice de estimulación por ELISPot de PBMC para el estudio de antígeno de EHV en caballos

Tabla 6: Resultados de CFM por ELISpot de PBMC/106 PBMC para el estudio del antígeno del EHV en caballos

Tabla 7: Resultados de títulos de anticuerpos neutralizantes en suero para el estudio de antígeno de EHV en caballos

Tabla 8: Tabla sumario de los resultados de la reactividad después de la segunda vacunación para el estudio de antí enos del EHV en caballos^día 29

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de vacuna que comprende un componente antigénico del herpesvirus equino (HVE) y un componente coadyuvante, en la que el componente antigénico comprende un antígeno de1HVE-1 y el componente coadyuvante comprende un oligonucleótido CpG de clase P y aceite SP; y en la que el aceite SP está presente en la cantidad del 2-20 % v/v y el aceite SP comprende copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno aproximadamente al 2,5% p/v, escualano aproximadamente al 5 % p/v y monooleato de polioxietilensorbitán ^{aproximadamente al}0,2 ^{% p/v.}

2. Una composición de vacuna de la reivindicación 1, en la que el coadyuvante consiste esencialmente en el oligonucleótido CpG de clase P y aceite SP.

3. La composición de vacuna de la reivindicación 1 o 2, que es una composición no liposómica.

4. La composición de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el aceite SP está presente en la cantidad del 5-10 % v/v de la composición de vacuna.

5. La composición de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el aceite SP está presente en la ^{cantidad del}10 ^{% v/v de la composición.}

6^{. La composición de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que dicho oligonucleótido CpG de}clase P está presente en la cantidad de 20-500 pg/ml.

^{7. La composición de vacuna de la reivindicación}6^{, en la que dicho oligonucleótido CpG de clase P está presente en}la cantidad de 100-250 pg/ml.

8^{. La composición de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicho oligonucleótido CpG de}clase P está modificado.

^{9. La composición de vacuna de la reivindicación}8^{, en la que dicho oligonucleótido CpG de clase P modificado tiene}modificación JU o modificación E.

10. La composición de vacuna de la reivindicación 9, en la que dicho oligonucleótido CpG de clase P modificado es la ^{SEQ NO: 7, SEQ ID NO:}8 ^{o SEQ ID NO: 9.}