ES2938847T3 - Composiciones para la inducción de la respuesta inmunitaria - Google Patents

Abstract

La invención proporciona una composición sustancialmente libre de antígenos para la inducción de la respuesta inmunitaria innata en un ave o un mamífero, comprendiendo la composición una saponina, un esterol, una amina cuaternaria y un polímero poliacrílico para el mamífero o el ave. También se proporcionan métodos para usar la composición. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones para la inducción de la respuesta inmunitaria

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a composiciones que contienen inmunomoduladores para inducir una respuesta inespecífica a una infección.

ANTECEDENTES

Cuando el cuerpo presenta respuestas inmunitarias a un desafío infeccioso o inmunológico, se establece una distinción entre la respuesta inmunitaria innata (inmunidad innata) y la respuesta inmunitaria adquirida (inmunidad adaptativa específica de antígeno).

El sistema inmunitario innato es un sistema de defensa general altamente eficaz y evolucionado. Los elementos de la inmunidad innata siempre están presentes en niveles bajos y se activan muy rápidamente cuando se estimulan. La estimulación puede incluir la interacción de moléculas de señalización bacterianas con receptores de reconocimiento de patrones en la superficie de las células del organismo u otros mecanismos de enfermedad. Todos los días, los animales están expuestos a microorganismos potencialmente patógenos a través de los alimentos y el agua, el aire y las superficies que tocan. El sistema inmunitario innato actúa para evitar que estos patógenos potenciales causen enfermedades. El sistema inmunitario innato difiere de la llamada inmunidad adaptativa (que incluye anticuerpos y linfocitos B y T específicos de antígeno) porque siempre está presente, es eficaz de inmediato y relativamente inespecífico para cualquier patógeno dado. El sistema inmunitario adaptativo requiere la amplificación de elementos de reconocimiento específicos, por lo que tarda de días a semanas en responder. Incluso cuando la inmunidad adaptativa está preestimulada por la vacunación, puede tardar tres días o más en respondera un patógeno, mientras que la inmunidad innata está disponible de forma inmediata o rápida (en cuestión de horas). Se sabe que la inmunidad innata implica una serie de funciones efectoras, como las células fagocíticas, el complemento, etc., pero en general no se comprende del todo.

En consecuencia, surgen situaciones en las que la activación de la respuesta inmunitaria innata es muy deseable. Por ejemplo, en el campo de la medicina veterinaria, es particularmente útil activar el sistema inmunitario innato cuando un animal ha sido o está a punto de ser sometido a un cambio de entorno, como, por ejemplo, durante o inmediatamente después del transporte, o en un entorno en el que los animales individuales están muy próximos, por lo que la propagación del patógeno es potencialmente rápida.

El documento US2009/324641 divulga la medición de la inmunidad mediada por células de composiciones que contienen antígeno en un modelo de mamífero. Prigeon et al., Vet Immunol. E Immunopathol. 1, 2). 179-190 (2012) divulga composiciones adyuvadas con una combinación de Quil A, colesterol, DDA, CARBOPOL y N-(2-Desoxi-2-L-leucilamino-b-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida y el uso de estas composiciones en peces.

Pridgeon et al (Veterinary Immunology and Immunopathology, vol. 145, no. 1-2, 2012, divulga QCDCR (Quil A, colesterol, bromuro de dimetil dioctadecil amonio, Carbopol, glicolípido R1005) formulado con oligodesoxinucleótido (ODN) CpG, es decir, ODN 2007, para conferir protección en la tilapia del Nilo contra la infección por Streptococcus iniae.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier materia que quede fuera del ámbito de las reivindicaciones se proporciona únicamente a título informativo.

Las referencias a procedimientos de tratamiento en esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

La presente invención proporciona composiciones para la activación del sistema inmunitario innato. La invención proporciona una composición que comprende una saponina, un esterol, una amina cuaternaria, y un polímero poliacrílico para su uso en la inducción de una respuesta inmune en un mamífero o ave, donde dicha saponina es una saponina triterpenoide, dicho esterol se selecciona del grupo que consiste en p-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol, y la amina cuaternaria comprende cuatro cadenas alquílicas, dos de las cuales son alquilos C¹⁰-C²⁰ y las dos restantes son alquilos C¹-C⁴, y en la que además dicha composición está libre de antígeno o la cantidad de antígeno en dicha composición no es detectable mediante un ensayo serológico. En ciertas realizaciones, la composición consiste esencialmente, o está formada por la saponina, el esterol, la amina cuaternaria y el polímero poliacrílico, y opcionalmente, al menos uno de un glicolípido y un oligonucleótido inmunoestimulador, para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un mamífero o un ave. En determinadas realizaciones, la composición no contiene antígenos.

Se divulga pero no se reivindica en el presente documento un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria en un animal, que comprende administrar a dicho animal una composición sustancialmente libre de antígenos que comprende una saponina, el esterol, la amina cuaternaria y el polímero poliacrílico, en el que dicho animal se selecciona del grupo que consiste en mamíferos y aves. La composición puede estar libre de antígenos.

En ciertos aspectos, las composiciones citadas anteriormente comprenden además un glicolípido, un oligonucleótido inmunoestimulador o tanto el glicolípido como el oligonucleótido inmunoestimulador.

En las realizaciones aplicables a cada uno de los aspectos expuestos anteriormente, la saponina está presente en una cantidad de entre 1 |jg y 5.000 |jg por dosis (preferentemente, entre 10 y 50 jg por dosis), el esterol está presente en una cantidad de entre 1 jg y 5000 jg por dosis (preferentemente, entre 10 y 50 jg por dosis), el compuesto de amina cuaternaria está presente en una cantidad de 1 jg a 5.000 jg por dosis (preferentemente, entre 1 y 30 jg por dosis), y el polímero poliacrílico está presente en una cantidad de 0,0001 % v/v a 75 % v/v.0001 % v/v a 75 % v/v por dosis (preferentemente, entre 0,01 y 0,1 % v/v por dosis), Si el glicolípido está presente, su cantidad suele estar entre 0,01 mg y 10 mg por dosis (preferentemente, entre 1 mg y 2 mg por dosis). Si el oligonucleótido inmunoestimulador está presente, su cantidad suele oscilar entre 20 jg y 500 jg por ml (preferentemente 100 jg por ml a 200 jg por ml).

Las composiciones de la presente invención pueden utilizarse para desencadenar una respuesta inmunitaria protectora frente a un desafío de múltiples organismos tales como virus, bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. En determinadas realizaciones, las composiciones de la presente invención se utilizan para desencadenar una respuesta inmunitaria protectora frente a bacterias Gram-negativas como la Bordetella bronchiseptica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 ilustra el efecto del adyuvante QCDCRT sobre los niveles de ARNm de IFN alfa, MX-1 y OAS.

La Figura 2 ilustra los efectos del adyuvante QCDCRT sobre la excreción viral en el modelo de desafío al VHB-1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES SELECCIONADAS

Para ayudar a una persona con conocimientos normales en la materia a comprender la presente invención, se proporcionan las siguientes definiciones.

"Alrededor de" o "Aproximadamente", cuando se utiliza en relación con una variable numérica mensurable, se refiere al valor indicado de la variable y a todos los valores de la variable que están dentro del error experimental del valor indicado (por ejemplo, dentro del intervalo de confianza del 95 % para la media) o dentro del 10 % del valor indicado, lo que sea mayor.

"Alquilo" se refiere a las fracciones de hidrocarburos saturados, tanto rectos como ramificados.

"Amina" se refiere a un compuesto químico derivado del amoníaco mediante la sustitución de grupos hidrocarburo por uno o más átomos de hidrógeno. por "amina cuaternaria" se entiende un compuesto a base de amonio con cuatro grupos hidrocarburo.

"Antígeno" se refiere a cualquier sustancia que estimula una respuesta inmunitaria específica. El término incluye bacterias, virus o parásitos vivos muertos, inactivados, atenuados o modificados. El término antígeno también incluye polinucleótidos, polipéptidos, proteínas recombinantes, péptidos sintéticos, extracto de proteínas, células (incluidas células tumorales), tejidos, polisacáridos o lípidos, o fragmentos de los mismos, individualmente o en cualquier combinación de los mismos. El término "antígeno" también se refiere a los anticuerpos, como los anticuerpos antiidiotipo o sus fragmentos, y a los mimotopos peptídicos sintéticos que pueden imitar un antígeno o un determinante antigénico (epítopo).

"Que consiste esencialmente" aplicado a formulaciones adyuvantes se refiere a una formulación que no contiene agentes adyuvantes o inmunomoduladores adicionales no mencionados en las cantidades en las que dichos agentes ejercen efectos adyuvantes o inmunomoduladores mensurables.

"Dosis" se refiere a una unidad de composición administrada a un sujeto, y puede ser una unidad de masa o una unidad de volumen.

"Molécula inmunoestimuladora" se refiere a una molécula que genera una respuesta inmunitaria.

La "administración parenteral" se refiere a la introducción de una sustancia, como una vacuna, en el cuerpo de un sujeto a través o por medio de una vía que no incluye el tracto digestivo. La administración parenteral incluye la administración subcutánea, intramuscular, transcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intraocular e intravenosa.

El término "farmacéuticamente aceptable", se refiere a las sustancias que son, dentro del ámbito del buen juicio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de los sujetos, sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica, y similares, proporcionales a una relación razonable entre beneficio y riesgo, y eficaces para su uso previsto.

Por "saponina" se entiende un grupo de glucósidos con actividad de superficie de origen vegetal compuestos por una región hidrofílica (normalmente varias cadenas de azúcares) en asociación con una región hidrófoba de estructura esteroide o triterpenoide.

"Esteroides" se refiere a cualquiera de un grupo de compuestos orgánicos pertenecientes a la clase bioquímica de los lípidos, que comprenden un sistema de cuatro anillos fusionados de tres anillos fusionados de ciclohexano (seis carbonos) más un cuarto anillo de ciclopentano (cinco carbonos). Los esteroides suelen ser muy solubles en disolventes inorgánicos y poco solubles en agua.

"Esteroles" se refiere a los compuestos de los animales que se producen biológicamente a partir de precursores terpenoides. Constan de una estructura de anillo esteroide, con un grupo hidroxilo (OH), normalmente unido al carbono-3. La cadena de hidrocarburos del sustituyente ácido graso varía en longitud, normalmente de 16 a 20 átomos de carbono, y puede ser saturada o insaturada. Los esteroles suelen contener uno o más dobles enlaces en la estructura del anillo y también diversos sustituyentes unidos a los anillos. Los esteroles y sus ésteres de ácidos grasos son esencialmente insolubles en agua.

"Composición sustancialmente libre de antígeno" se refiere a una composición en la que la cantidad de antígeno es insuficiente para generar una respuesta inmunitaria específica protectora o para detener la reproducción y/o expulsión exitosa (por ejemplo, excreción viral) del patógeno contra el que el antígeno genera la respuesta inmunitaria específica. En algunas realizaciones, la cantidad de antígeno en la composición sustancialmente libre de antígeno no es detectable mediante un ensayo serológico como, por ejemplo, ELISA.

"Triterpeniodos" se refiere a una clase grande y diversa de moléculas orgánicas naturales, derivadas de seis unidades de isopreno (2-metil-1,3-butadieno) de cinco carbonos. La mayoría de los triterpenoides son estructuras multicíclicas que difieren entre sí en los grupos funcionales y en sus esqueletos básicos de carbono.

Los inventores han descubierto que las composiciones aquí descritas que contienen una saponina, un esterol, un compuesto de amonio cuaternario, un polímero poliacrílico y, opcionalmente, uno o ambos de un glicolípido y/o un oligonucleótido inmunoestimulador son capaces de desencadenar una respuesta inmunitaria protectora en animales de sangre caliente (mamíferos y aves) en ausencia de un antígeno.

Aunque los animales de sangre caliente, es decir, los mamíferos y las aves, son capaces de montar tanto una respuesta inmune innata como una respuesta inmune adaptativa de acción más lenta, dependen principalmente de sus mecanismos inmunes adaptativos altamente desarrollados. En comparación, los invertebrados carecen de mecanismos inmunitarios adaptativos, por lo que dependen por completo de mecanismos inmunitarios innatos. Los vertebrados de sangre fría, como los peces, incluyen mecanismos de respuesta inmunitaria tanto innata como adaptativa. Sin embargo, en comparación con los vertebrados de sangre caliente, la respuesta inmunitaria adaptativa de los vertebrados de sangre fría está relativamente poco desarrollada, mientras que la respuesta inmunitaria innata de los vertebrados de sangre fría está relativamente muy desarrollada. Así pues, los vertebrados de sangre fría suelen depender más de los mecanismos inmunitarios innatos que de los adaptativos, en comparación con los animales de sangre caliente. Debido a las diferencias en el desarrollo relativo y la dependencia del sistema inmunitario innato en invertebrados y vertebrados de sangre fría, en comparación con los animales de sangre caliente, los resultados y hallazgos relativos a los respectivos sistemas inmunitarios innatos de invertebrados y vertebrados de sangre fría no pueden aplicarse de forma predecible a los sistemas inmunitarios innatos de los vertebrados de sangre caliente. En particular, un hallazgo de que un compuesto o composición puede estimular el sistema inmunitario innato de invertebrados o vertebrados de sangre fría no es un predictor razonable de que el compuesto o composición sería útil para la estimulación del sistema inmunitario innato de un mamífero de sangre caliente.

El sistema inmunitario innato es un sistema de defensa general de despliegue rápido y gran eficacia que puede ofrecer protección contra agentes patógenos. Por lo tanto, es deseable identificar compuestos y composiciones que estimulen o mejoren el sistema de respuesta inmunitaria innata en vertebrados de sangre caliente. Los inventores han descubierto sorprendentemente que las composiciones aquí descritas que contienen una saponina, un esterol, un compuesto de amonio cuaternario, un polímero poliacrílico y, opcionalmente, uno o ambos de un glicolípido y/u oligonucleótido inmunoestimulador, (denominados QCDC, QCDCR, QCDCT y QCDCRT, respectivamente) activan eficazmente el sistema inmunitario innato de los animales de sangre caliente y pueden utilizarse como inmunomoduladores, es decir, independientemente del antígeno, para mejorar la respuesta inmunitaria a un desafío en animales de sangre caliente (por ejemplo, mamíferos y aves). El hallazgo de que las composiciones QCDC, QCDCR, QCDCT y QCDCRT aquí descritas son lo suficientemente potentes como para activar eficazmente el sistema inmunitario innato menos versátil de los animales de sangre caliente fue sorprendente e inesperado.

Por lo tanto, una composición como la descrita aquí puede mejorar una respuesta inmunitaria en un mamífero o un ave, la composición como la descrita anteriormente que comprende un esterol, una saponina, una amina cuaternaria, un polímero poliacrílico, como, por ejemplo, CARBOPOL®. Esta composición de cuatro componentes se denomina QCDC. La composición QCDC también puede contener un glicolípido (R), un oligonucleótido inmunoestimulador (T), o ambos.

Los esteróles comparten un núcleo químico común, que es una estructura de anillo[s] esteroide[s], con un grupo hidroxilo (OH), normalmente unido al carbono-3. La cadena de hidrocarburos del sustituyente ácido graso varía en longitud, normalmente de 16 a 20 átomos de carbono, y puede ser saturada o insaturada. Los esteroles suelen contener uno o más dobles enlaces en la estructura del anillo y también diversos sustituyentes unidos a los anillos. Los esteroles y sus correspondientes ésteres de ácidos grasos son esencialmente insolubles en agua. En vista de estas similitudes químicas, es probable que los esteroles que comparten este núcleo químico tengan propiedades similares cuando se utilicen en las composiciones vacunales de la presente invención. Los esteroles son bien conocidos en la técnica y pueden adquirirse comercialmente. Por ejemplo, el colesterol se describe en el Merck Index, 12a edición, p. 369. Entre los esteroles adecuados se encuentran el p-sitosterol, el estigmasterol, el ergosterol, el ergocalciferol y el colesterol.

Los esteroles se utilizan generalmente en una cantidad de 1 |jg a 5.000 |jg por dosis. También se utilizan en una cantidad de 1 jg a 4.000 jg por dosis, 1 jg a 3.000 jg por dosis, 1 jg a 2.000 jg por dosis, y 1 jg a 1.000 jg por dosis, También se utilizan en una cantidad de 5 jg a 750 jg por dosis, 5 jg a 500 jg por dosis, 5 jg a 200 jg por dosis, 5 jg a 100 jg por dosis, 15 jg a 100 jg por dosis, y 15 jg a 30 jg por dosis,

Entre las saponinas adecuadas se incluyen las saponinas triterpenoides. Estos triterpenoides son un grupo de glucósidos con actividad de superficie de origen vegetal y comparten un núcleo químico común compuesto por una región hidrofílica (normalmente varias cadenas de azúcares) en asociación con una región hidrófoba de estructura esteroide o triterpenoide. Debido a estas similitudes, es probable que las saponinas que comparten este núcleo químico tengan propiedades adyuvantes similares. Los triterpenoides adecuados para su uso en las composiciones adyuvantes pueden proceder de muchas fuentes, ya sean derivados de plantas o equivalentes sintéticos, incluyendo Quillaja saponaria, tomatina, extractos de ginseng, hongos y un glucósido alcaloide estructuralmente similar a las saponinas esteroideas. Así, los triterpenoides adecuados para su uso en las composiciones adyuvantes incluyen saponinas, escualeno y lanosterol. En otras realizaciones, la saponina puede ser, por ejemplo, Quil A u otra preparación de saponina purificada o parcialmente purificada, que puede obtenerse comercialmente. Así, los extractos de saponina pueden utilizarse como mezclas o componentes individuales purificados, como QS-7, QS-17, QS-18 y QS-21. En una realización, el Quil A tiene una pureza mínima del 85 %. En determinadas realizaciones, el Quil A tiene una pureza mínima del 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

Una saponina puede estar presente en las composiciones de la presente invención en una cantidad de 1 jg a 5.000 jg por dosis. También se utilizan en una cantidad de 1 jg a 4.000 jg por dosis, de 1 jg a 3.000 jg por dosis, de 1 jg a 2.000 jg por dosis y de 1 jg a 1.000 jg por dosis. También se utilizan en una cantidad de 5 jg a 750 jg por dosis, de 5 jg a 500 jg por dosis, de 5 jg a 200 jg por dosis, de 5 jg a 100 jg por dosis, de 15 jg a 100 jg por dosis y en una cantidad de 15 jg a 30 jg por dosis.

Los compuestos de amina cuaternaria son compuestos a base de amonio con cuatro grupos de hidrocarburo. Dichos grupos de hidrocarburos se limitan generalmente a grupos alquilo o arilo. En ciertas realizaciones, los compuestos de amina cuaternaria están formados por cuatro cadenas alquílicas, dos de las cuales son alquilos C¹⁰-C²⁰ y las dos restantes son alquilos C¹-C⁴. En una serie de realizaciones, la amina cuaternaria es didecildimetilamonio (DDA). Alternativamente, puede utilizarse avridina.

Una amina cuaternaria puede estar presente en las composiciones de la presente invención en una cantidad de 1 jg a 5.000 jg por dosis. También se utilizan en una cantidad de 1 jg a 4.000 jg por dosis, de 1 jg a 3.000 jg por dosis, de 1 jg a 2.000 jg por dosis y de 1 jg a 1.000 jg por dosis. También se utilizan en una cantidad de 5 jg a 750 jg por dosis, de 5 jg a 500 jg por dosis, de 5 jg a 200 jg por dosis, de 5 jg a 100 jg por dosis, de 15 jg a 100 jg por dosis y en una cantidad de 15 jg a 30 jg por dosis. Como ejemplo específico, las composiciones adyuvantes que contienen DDA pueden prepararse simplemente mezclando una solución de antígeno con una solución recién preparada de DDA.

Se dispone comercialmente de múltiples polímeros poliacrílicos adecuados para su uso en la presente invención. En ciertas realizaciones, el polímero poliacrílico incluye ácido poliacrílico, que está disponible comercialmente bajo el nombre comercial CARBOPOL®. Estos polímeros tienen un peso medio equivalente de 76. Se producen a partir de partículas primarias de polímero de entre 0,2 y 6,0 micrones de diámetro medio. Los polímerosCARBOPOL® se hinchan en agua hasta 1000 veces su volumen original y diez veces su diámetro original para formar un gel cuando se exponen a un entorno de pH superior al pKa del grupo carboxilato. A un pH superior al pKa del grupo carboxilato, los grupos carboxilato se ionizan dando lugar a una repulsión entre las cargas negativas, lo que contribuye al hinchamiento del polímero.

Un polímero poliacrílico puede estar presente en las composiciones de la invención instantánea en la cantidad de 0,0001 % volumen a volumen (v/v) a 75 % v/v. En ciertas realizaciones, se utiliza en una cantidad de 0,001 % v/v a 50 % v/v, de 0,005 % v/v a 25 % v/v, de 0,01 % v/v a 10 % v/v, de 0,05 % v/v a 2 % v/v, En otra realización, se utiliza en una cantidad de 0,02 v/v a 0,1 % v/v,

Los glicolípidos adecuados son generalmente aquellos que activan la respuesta Th2. Ejemplos de glicolípidos incluyen compuestos abarcados por la Fórmula I y que se describen generalmente en la Publicación US 20070196384 (Ramasamy et al.).

En la estructura de la Fórmula I, R1 es hidrógeno, o un radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; X es -CH²-, -O- o -NH-; R2 es hidrógeno, o un radical alquilo saturado o insaturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; R3, R4, y R5 son independientemente hidrógeno, -SO⁴²-, -PO⁴²-, -COC^1-10 alquilo;R6 es L-alanilo, L-alfaaminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo, L-hidroxiprolilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L-lisilo, L-metionilo, L-ornitinilo, L-fenilalani, L-prolilo, L-serilo, L-treonilo, L-tirosilo, L-triptofanilo, y L-valilo o sus isómeros D.

En ciertas realizaciones, el glicolípido adecuado es N-(2-Desoxi-2-L-leucilamino-b-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida o una sal del mismo. En ciertas realizaciones, la sal es una sal de acetato.

El glicolípido puede estar presente en las composiciones de la presente invención en una cantidad de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 10 mg por dosis. Alternativamente, se utilizan en una cantidad de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 7,5 mg por dosis, de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 1 mg por dosis, de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 2,5 mg por dosis, y de 1 mg a aproximadamente 2 mg por dosis.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores también pueden utilizarse en ciertas realizaciones de esta invención, en combinación con QCDC o QCDCR. Generalmente, los oligonucleótidos inmunoestimuladores contienen al menos un motivo CG, y a veces se denominan nucleótidos CpG. Los oligonucleótidos CpG se caracterizan por la presencia de un dinucleótido CG no metilado en contextos específicos de secuencias de bases (motivo CpG). (Hansel TT, Barnes PJ (eds): New Drugs for Asthma, Allergy and COPD. Prog Respir Res. Basilea, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232,). Los motivos CpG están presentes en el ADN bacteriano, al que confieren propiedades inmunoestimuladoras. Los motivos CpG no suelen encontrarse en el ADN eucariota, en el que los dinucleótidos CG están suprimidos y, cuando están presentes, suelen estar metilados.

Los adyuvantes de la presente invención pueden incluir un oligonucleótido inmunoestimulador de clase P, incluyendo, por ejemplo, un oligonucleótido inmunoestimulador de clase P modificado. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P son oligonucleótidos CpG caracterizados por la presencia de palíndromos, generalmente de 6-20 nucleótidos de longitud. La presencia de estos palíndromos permite la posible formación de concámeros o estructuras de tallo y bucle. La longitud total de los oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P suele estar comprendida entre 19 y 100 nucleótidos, por ejemplo, 19-30 nucleótidos, 30-40 nucleótidos, 40-50 nucleótidos, 50-60 nucleótidos, 60-70 nucleótidos, 70-80 nucleótidos, 80-90 nucleótidos, 90-100 nucleótidos.

El oligonucleótido inmunoestimulador descrito en el presente documento puede contener un dominio de activación TLR 5' y al menos dos regiones palindrómicas, siendo una región palindrómica 5' de al menos 6 nucleótidos de longitud y conectada a una región palindrómica 3' de al menos 8 nucleótidos de longitud directamente o a través de un espaciador.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P pueden modificarse según técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la modificación J se refiere a nucleótidos modificados con yodo. La modificación E se refiere a nucleótidos modificados con etilo. Así, los oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P modificados con E son oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P, en los que al menos un nucleótido (preferentemente el nucleótido 5') está etilado. Las modificaciones adicionales incluyen la unión de 6-nitro-benzimidazol, O-metilación, modificación con proinil-dU, modificación con inosina, unión de 2-bromovinilo (preferentemente a uridina).

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P también pueden contener un enlace internucleotídico modificado que incluye enlaces fosfodiéster y enlaces fosforotioato. Los oligonucleótidos pueden sintetizarse u obtenerse de fuentes comerciales.

Ejemplos de oligonucleótidos de clase P y oligonucleótidos de clase P modificados se divulgan en la solicitud PCT publicada no. WO2008/068638publicada el 12 de junio de 2008. A continuación se proporcionan ejemplos adecuados de oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P modificados (En SEQ ID NOs 1-10, "*" se refiere a un enlace fosforotioato y "-" se refiere a un enlace fosfodiéster; en las SEQ ID NOs 11-13 todos los enlaces son enlaces fosfodiéster).

SEQ ID NO..: 15 'T*C-G*T*C-G*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G3'

SEQ ID NO..: 25' T*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G3'

SEQ ID NO..: 35' T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T3'

SEQ ID NO..: 45' JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G3'

SEQ ID NO..: 55' JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T3'

SEQ ID NO..: 65' JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T3'

SEQ ID NO..: 75' EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G3'

SEQ ID NO..: 85' JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T3'

SEQ ID NO..: 95' JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T3'

SEQ ID NO..: 105' T*C-G*T*C-G*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G3'

SEQ ID NO..: 115'-UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU-3'

SEQ ID NO..: 125'-UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU-3'

SEQ ID NO..: 135'-AAACGCUCAGCCAAAGCAG-3'.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P se utilizan generalmente en las composiciones adyuvantes aquí descritas en una cantidad de 20 |jg a 500 |jg por ml. También se utilizan en una cantidad de 25 |jg a 400 mg por ml, 40 jg a 250 jg por ml, 50 jg a 200 jg por ml, 100 jg por ml a 200 jg por ml.

Los procedimientos de fabricación de las composiciones aquí descritas se describen en, por ejemplo, la publicación US 20090324641 (Dominowski et al, publicada el 31 de diciembre de 2009). Brevemente, los compuestos de la composición pueden mezclarse entre sí, preferentemente, añadiendo en último lugar el polímero poliacrílico. Las composiciones pueden microfluidizarse antes de añadir el polímero poliacrílico.

Las composiciones aquí descritas generalmente no requieren ningún portador específico, y pueden formularse en un tampón acuoso u otro tampón farmacéuticamente aceptable. Las composiciones adyuvantes pueden fabricarse en diversas formas dependiendo de la vía de administración, los requisitos de almacenamiento y similares. Por ejemplo, las composiciones inmunogénicas pueden ser preparadas en forma de soluciones o dispersiones acuosas estériles adecuadas para uso inyectable, o ser preparadas en formas liofilizadas utilizando técnicas de liofilización. Las composiciones liofilizadas pueden reconstituirse antes de su uso en una solución estabilizadora, por ejemplo, solución salina o HEPES. De este modo, las composiciones adyuvantes pueden utilizarse como una forma de dosificación sólida, semisólida o líquida.

Puede utilizarse solución salina tamponada con fosfato (PBS) como medio tampón acuoso; el pH del tampón puede ser neutro o ligeramente alcalino o ligeramente ácido. En consecuencia, el pH puede estar en un intervalo de pH 6 a 8. Un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,3 es común. La concentración del tampón puede estar comprendida entre 10 y 50 mM de PO⁴ y entre 10 y 150 mM de PO⁴. En un ejemplo, se utiliza 0,063 % de PBS. El pH puede ajustarse con NaOH o HCI según sea necesario. Las concentraciones típicas incluyen de 1N a 10N de HCI y de 1N a 10N de NaOH.

Las composiciones pueden homogeneizarse o microfluidizarse. Las composiciones se someten a un proceso de mezcla primaria, normalmente pasando una o más veces por uno o más homogeneizadores. Para ello puede utilizarse cualquier homogeneizador disponible en el mercado, por ejemplo, el emulsionador Ross (Hauppauge, N.Y.), el homogeneizador Gaulin (Everett, Mass.) o el Microfluidics (Newton, Mass.).

En ciertos procesos, se añade una saponina a un tampón apropiado. A continuación, se añade lentamente un esterol a la solución de saponina, seguido de la adición lenta de un compuesto de amonio cuaternario. Si están presentes, también se añaden el glicolípido y/o el oligonucleótido inmunoestimulador. La composición resultante se homogeneiza y, a continuación, se microfluidiza. Tras la microfluidización, se añade un polímero a la composición microfluidizada. En función de los componentes utilizados, el orden de estas etapas puede alterarse para optimizar la preparación de las composiciones.

En un proceso, las composiciones se homogeneizan durante tres minutos a 10.000 rpm. La microfluidización puede lograrse mediante el uso de un microfluidizador comercial, como el modelo número 11OY disponible en Microfluidics, (Newton, Mass.); Gaulin Modelo 30CD (Gaulin, Inc., Everett, Mass.); y Rainnie Minilab Tipo 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, Wis.). Estos microfluidizadores funcionan forzando el paso de fluidos a través de pequeñas aberturas a alta presión, de forma que dos corrientes de fluidos interactúan a altas velocidades en una cámara de interacción para formar composiciones con gotas de tamaño submicrónico. En una realización, las formulaciones se microfluidizan haciéndolas pasar a través de una cámara de dimensión límite de 200 micrones a 68,95±3,445 Mpa.

Los tamaños de dosis de las composiciones oscilan típicamente entre aproximadamente 0,05 ml y aproximadamente 5 ml, inclusive, dependiendo del sujeto y del antígeno. Por ejemplo, para un canino o felino, se suele utilizar una dosis de aproximadamente 1 ml, mientras que en bovinos se suele utilizar una dosis de aproximadamente 2-5 ml. Sin embargo, estos adyuvantes también pueden formularse en microdosis, en las que pueden utilizarse dosis de unos 100 |jl, por ejemplo, para su administración a pollos.

Las vías de administración de las composiciones adyuvantes incluyen parenteral, oral, oronasal, intranasal, intratraqueal, tópica e in ova. Se puede utilizar cualquier dispositivo adecuado para administrar las composiciones, incluyendo jeringas, goteros, dispositivos de inyección sin aguja, parches y similares. La vía y el dispositivo seleccionados para su uso dependerán de los ingredientes de la composición y del tamaño del animal.

Diferentes mamíferos y aves son adecuados para el tratamiento con las composiciones de la presente invención. Estos animales incluyen perros, gatos, caballos, ovejas, bovinos, cerdos, gansos, pollos, patos, etc.

Un aspecto ventajoso de la presente invención es que la composición puede administrarse al mamífero o ave sujeto cuando el sistema inmunitario del animal está debilitado, cuando el animal se encuentra en un entorno de alto estrés o existe un alto potencial de exposición a patógenos. Por ejemplo, los animales pueden ser tratados inmediatamente antes o durante el transporte, o inmediatamente después del transporte cuando están en cuarentena. A veces, los antígenos adecuados no son fáciles de conseguir, o incluso son desconocidos.

Si se sabe que una enfermedad se presenta en un inicio rápido, la activación del sistema inmunitario innato es particularmente importante. Además, esta invención puede utilizarse en animales alojados en entornos hacinados, por ejemplo, granjas de pollos.

La enfermedad puede ser causada por clases tan amplias de patógenos como virus, bacterias Gram-positivas y bacterias Gram-negativas.

Los virus incluyen herpesvirus aviar, herpesvirus bovino, herpesvirus canino, herpesvirus equino, virus de la rinotraqueitis viral felina, virus de la enfermedad de Marek, herpesvirus ovino, herpesvirus porcino, virus de la pseudorabia, Paramixovirus aviar, Virus respiratorio sincitial bovino, Virus del moquillo canino, Virus de la parainfluenza canina, Adenovirus canino, Parvovirus canino, Virus de la parainfluenza bovina 3, Parainfluenza ovina 3, Virus de la peste bovina, Virus de la enfermedad de las fronteras, virus de la diarrea vírica bovina (VDVB), VDVB tipo I, VDVB tipo II, virus de la peste porcina clásica, virus de la leucosis aviar, virus de la inmunodeficiencia bovina, virus de la leucemia bovina, tuberculosis bovina, Virus de la anemia infecciosa equina, Virus de la inmunodeficiencia felina, Virus de la leucemia felina (FeLV), Virus de la enfermedad de Newcastle, Virus de la neumonía progresiva ovina, Virus del adenocarcinoma pulmonar ovino, Coronavirus canino (CCV), CCV pantropico, Coronavirus respiratorio canino, coronavirus bovino, calicivirus felino, coronavirus entérico felino, virus de la peritonitis infecciosa felina, virus de la diarrea epidémica porcina, virus de la encefalomiletitis hemaglutinante porcina, Parvovirus porcino, Circovirus porcino (PCV) tipo I, PCV tipo II, Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS), Virus de la gastroenteritis transmisible, Coronavirus del pavo, Virus de la fiebre efímera bovina, Rabia, Rotovirus, Virus de la estomatitis vesicular, lentivirus, influenza aviar, rinovirus, virus de la influenza equina, virus de la influenza porcina, virus de la influenza canina, virus de la influenza felina, virus de la influenza humana, virus de la encefalitis equina oriental (EEE), virus de la encefalitis equina venezolana, virus del Nilo Occidental, virus de la encefalitis equina occidental, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del papiloma humano, virus de la varicela zoster, virus de la hepatitis B, rinovirus y virus del sarampión.

Las bacterias Gram-positivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano, que es superficial a la membrana celular. Ejemplos de bacterias Gram-positivas son las bacterias estreptocócicas y estafilocócicas. Ejemplos específicos incluyen bacterias de los géneros Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Listeria, Nocardia, Propionibacterium, Rhodococcus, Staphylococcus, Streptococcus y Viridans. Algunas especies ejemplares son S. agalactiae, S. pyogenes, S. pneumoniae, S. aureus, S. equi, C. tetani, C. botulinum, C. perfringes, C. difficile, Bacillus anthacis, Listeria monocytogenes.

A diferencia de las bacterias Gram-positivas, las bacterias Gram-negativas carecen de dicha capa de peptidoglicano. La capacidad patógena de las bacterias gramnegativas suele estar asociada a determinados componentes de la envoltura de las células gramnegativas, en particular, la capa de lipopolisacáridos (también conocida como LPS o capa de endotoxinas). Ejemplos específicos incluyen bacterias de los géneros Acinetobacter, Bordetella, Brachyspira, Burkholderia, Brucella, Cardiobacterium, Citrobacter, Coxiella, Enterobacter, Escherichia, Fusobacterium, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Legionella, Moxarella, Morganella, Neisseria, Proteus, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Serratia, Spirochaeta, Vibrio. Algunas especies ejemplares son Bordetella bronchiseptica, Brucella canis, Brucells suis, Burkhodlderio mallei, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens y Enterobacter cloacae.

Los parásitos incluyen Anaplasma, Fasciola hepatica, Coccidia, Eimeria spp., Neospora caninum, Toxoplasma gondii, Giardia, Dirofilaria (gusanos del corazón), Ancylostoma (anquilostomas), Trypanosoma spp, Leishmania spp., Trichomonas spp., Cryptosporidium parvum, Babesia, Schistosoma, Taenia, Strongyloides, Ascaris, Trichinella, Sarcocystis, Hammondia e Isopsora, y sus combinaciones. También se contemplan los parásitos externos como las garrapatas, incluidas las especies Ixodes, Rhipicephalus, Dermacentor, Amblyomma, Boophilus, Hyalomma y Haemaphysalis, y sus combinaciones.

Los hongos patógenos incluyen Candida, Microsporum, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Pneumocystis, Stachybotrys.

Los siguientes ejemplos se presentan como realizaciones ilustrativas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: QCDC protege frente al desafío con B. Bronchiseptica

Cincuenta ratones Swiss Outbred CF-1 se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos de 15 ratones cada uno y un grupo de 20 ratones. Quince ratones, de aproximadamente 18-20g, fueron vacunados con una formulación adyuvante QAC (Quil A y Colesterol (50ug/50ug por dosis) en AMPHIGEN® (que es una emulsión de aceite de lecitina), o una formulación acuosa QC^d C (Quil A/Colesterol/DDA/CARBOPOL®; 20ug/20ug/10ug/0,05 %). Cada ratón recibió dos inyecciones de 0,2 ml, con dos semanas de intervalo, por vía intraperitoneal. Se asignaron 20 ratones como controles no vacunados. Dos semanas después de la segunda inyección, los tres grupos de ratones fueron desafiados por vía intraperitoneal con la cepa B133 de Bordetello bronchiseptica.

El cultivo de desafío se preparó de la siguiente manera: brevemente, el organismo de desafío se cultivó a 35-37°C en placas de agar sangre triptosa durante aproximadamente 24 horas. Las placas se lavaron con una solución salina de peptona y el cultivo se ajustó a aproximadamente un 75 % de transmisión a 600 nm. Cada ratón recibió aproximadamente 8 X107 unidades formadoras de colonias de Bordetella bronchiseptica cepa B133 por vía intraperitoneal. El número de ratones supervivientes se calculó siete días después del desafío.

Los resultados de supervivencia se presentan en la Tabla 1

Tabla 1.

Estos resultados sugieren que el tratamiento con QCDC sin un antígeno específico es suficiente para generar una respuesta protectora contra bacterias Gram-negativas en el modelo B Bronchiseptica.

Ejemplo 2: QCDCRT disminuye el título viral en el desafío con BHV-1 (Herpesvirus bovino 1) en terneros ingenuos.

Se accedió al efecto de la formulación QCDCRT (descrita a continuación) sobre la activación del sistema inmunitario innato utilizando el desafío con BHV-1 en terneros ingenuos. Se inscribieron animales (diez por grupo) que no habían recibido previamente vacunas que contuvieran fracciones del VHB. Se examinaron los posibles animales de prueba y sólo se seleccionaron los que presentaban títulos de neutralización sérica del VHB inferiores a 1:2.

Los animales fueron aclimatados durante aproximadamente 5-7 días antes del desafío. Durante el periodo de aclimatación, los animales fueron alimentados con una ración total mixta peletizada sin antibióticos. Se suministró agua ad libitum. Antes de la llegada, los animales recibieron DECTOMAX®y DRAXXIN® según la etiqueta.

Los tratamientos se resumen en la tabla 2 siguiente.

Tabla 2.

Los tratamientos se administraron por vía subcutánea en un volumen de 2 ml el día cero. El desafío con VHB-1 se administró por vía intranasal (2 ml por fosa nasal, 4 ml por animal) doce horas después de la vacunación. Antes de la vacunación y en el momento del desafío, se recogieron muestras de sangre e hisopos nasales. Se recogieron hisopos nasales adicionales diariamente hasta el día 14, y se tomó una muestra de sangre adicional el día 14.

Las cantidades de ARNm de IFN-alfa, MX-1 y OAS se determinaron mediante qPCR. Los resultados se muestran en la Figura 1.

Los niveles de IFN-alfa no se elevaron significativamente 12 horas después del tratamiento. Sin embargo, los niveles de ARNm de MX-1 y OAS mostraron una elevación en los grupos T02, T03 y T04, siendo T02 y T03 los más eficaces. Dado que MX-1 y OAS se encuentran en la corriente descendente del IFN alfa, es posible que los niveles de ARNm del IFN alfa se hayan elevado en un momento anterior.

La cronología de la excreción viral se ilustra en la Fig. 2. Se observaron diferencias entre el grupo de control (T01) y los grupos de tratamiento (T02-T04) entre los días 3 y 5. En el grupo T01 (control negativo) el día 4, la excreción alcanzó un pico de aproximadamente 4x107 unidades, mientras que en los grupos de tratamiento se situó entre 1 y 1,5 x107 unidades. En el día 5, las diferencias entre el grupo de control y el de tratamiento desaparecieron y, en el día 9, no había diferencias significativas en el porcentaje de excreción viral. Todos los grupos presentaban signos clínicos de la enfermedad.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una saponina, un esterol, una amina cuaternaria y un polímero poliacrílico para uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un mamífero o ave, en la que dicha saponina es una saponina triterpenoide, dicho esterol se selecciona del grupo que consiste en p-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol, y la amina cuaternaria comprende cuatro cadenas alquílicas, dos de las cuales son alquilos C¹⁰-C²⁰ y las dos restantes son alquilos C¹-C⁴, y en la que además dicha composición está libre de antígeno o la cantidad de antígeno en dicha composición no es detectable mediante un ensayo serológico.

2. La composición para el uso de la reivindicación 1, en la que dicha saponina es una saponina triterpenoide de Quillaja saponaria, dicho esterol es colesterol, y dicha amina cuaternaria es didecildimetilamonio (DDA).

3. La composición para el uso de la reivindicación 2, en la que dicha saponina triterpenoide es Quil A o una fracción purificada de la misma.

4. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la saponina está presente en una cantidad de 1 |jg a 5.000 |jg por dosis, el esterol está presente en una cantidad de 1 |jg a 5.000 |jg por dosis, la amina cuaternaria está presente en una cantidad de 1 jig a 5.000 jig por dosis, y el polímero poliacrílico está presente en una cantidad de 0,0001 % en volumen a volumen (v/v) a 75 % v/v.

5. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la composición consiste esencialmente en la saponina, el esterol, la amina cuaternaria y el polímero poliacrílico, y opcionalmente un glicolípido.

6. La composición para el uso de la reivindicación 5, en la que el glicolípido es N-(2-Desoxi-2-L-leucilamino-b-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida o una sal del mismo.

7. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6, en la que dicha composición no contiene un oligonucleótido inmunoestimulador.

8. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en la que la composición consiste esencialmente en el glicolípido, la saponina, el esterol, la amina cuaternaria y el polímero poliacrílico.

9. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la composición comprende además un oligonucleótido inmunoestimulador, caracterizado por la presencia de al menos un motivo CpG.

10. La composición para uso de la reivindicación 9, en la que la composición consiste esencialmente en el oligonucleótido inmunoestimulador, la saponina, el esterol, la amina cuaternaria y el polímero poliacrílico, y opcionalmente el glicolípido.

11. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, en la que el oligonucleótido inmunoestimulador está presente a una concentración de 20 jig a 500 jig por ml.

12. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que dicha respuesta inmunitaria es una respuesta inmunoprotectora a una infección.

13. La composición para uso de la reivindicación 12, en la que la infección es una infección viral o una infección bacteriana.

14. La composición para uso de la reivindicación 13, en la que la infección bacteriana es causada por bacterias Gramnegativas.

15. La composición para uso de la reivindicación 14, en la que dicha bacteria Gram-negativa es Bordetella Bronchiseptica.