CN105899199A - 诱导免疫应答的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了基本上不含抗原的组合物，用于在鸟类或哺乳动物中诱导先天免疫应答，所述组合物包含皂苷、固醇、季胺和聚丙烯酸聚合物，给予鸟类或哺乳动物。还提供了使用该组合物的方法。

Description

诱导免疫应答的组合物
发明领域
本发明涉及使用免疫调节剂诱导对感染的非特异性应答的方法。
发明背景
当身体对某种感染性或免疫性攻击表现出免疫应答时，先天免疫应答(先天免疫)与获得性免疫应答(抗原特异的适应性免疫)之间的区别也展现出来。
先天免疫系统是一种效率和进化程度很高的通用防御系统。先天免疫中元素的存在水平总是很低，而当受到刺激时则非常迅速地被激活。所述刺激可包括细菌性信号分子与机体细胞表面上的模式识别受体的相互作用或其他疾病机制。每天，动物都通过食物和水、空气及所接触的表面暴露于潜在的病原性微生物。先天免疫系统起到防止这些潜在病原体引起疾病的作用。先天免疫系统与称为适应性免疫(其包括抗体及抗原特异性B-和T-淋巴细胞)有差异，因为前者是一直存在的，即刻起效并且对任意给定的病原体都是相对非特异的。适应性免疫系统要求特异识别元素的扩增并因此需要数天到数周以发生应答。甚至在通过疫苗接种对适应性免疫进行预刺激后，其也需要三天或更长时间对病原体产生应答，而先天免疫会立即或迅速(数小时内)产生效果。已知先天免疫包括多种效应子功能，包括吞噬细胞、补体等等，但通常对其的理解并不完全。
由此，出现了一些非常需要先天免疫应答的激活的情况。例如，在兽医领域，当动物已经或将要经历环境改变时，例如在运输中或紧接着运输后，或者在个体动物之间紧密靠近从而病原体扩散可能很迅速的环境中，激活先天免疫系统尤其有用。
发明概述
本发明提供用于激活先天免疫系统的方法和组合物。在特定方面，本发明提供了基本上上不含抗原的组合物，其包含(或在特定实施方式中基本上含有或由如下组成)皂苷、类固醇、季胺和聚丙烯酸聚合物，以及任选地至少一种糖脂和免疫刺激性寡核苷酸，用于在哺乳动物或鸟类中诱导免疫应答。在特定实施方式中，所述组合物不含抗原。
在特定方面，本发明提供了在动物中诱导免疫应答的方法，包括向所述动物施用基本上不含抗原的组合物，所述组合物包含皂苷、类固醇、季胺和聚丙烯酸聚合物，其中所述动物选自哺乳动物和鸟类。在一些实施方式中，所述组合物不含抗原。
在特定方面，上文提到的组合物进一步包含糖脂、免疫刺激性寡核苷酸或糖脂及免疫刺激性寡核苷酸二者。
在适用于以上陈述的各个方面的实施方式中，皂苷存在量为约1μg至约5,000μg每剂量(优选地为约10μg至约50μg每剂量)，类固醇存在量为约1μg至约5,000μg每剂量(优选地为约10μg至约50μg每剂量)，季胺化合物存在量为约1μg至约5,000μg每剂量(优选地为约1μg至约30μg)每剂量，并且聚丙烯酸聚合物存在量为0.0001％v/v至约75％v/v(优选地为约0.01％v/v至约0.1％v/v每剂量)。如果存在糖脂，其量通常为约0.01mg至约10mg每剂量(优选地为约1mg至约2mg每剂量)。如果存在免疫刺激性寡核苷酸，其量通常为20μg至约500μg每ml(优选地为约100μg每ml至约200μg每ml)。
本发明的组合物可用于触发对多种生物体如病毒、革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的攻击产生保护性免疫应答。在特定实施方式中，本发明的组合物用于触发针对革兰氏阴性细菌如支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)的保护性免疫应答。
附图简述
图1显示了QCDCRT佐剂对IFNα、MX-1和OAS mRNA水平的效应。
图2阐述了QCDCRT佐剂对BHV－1攻击模型中病毒脱落的效应。
选定实施方式的详述
为了辅助本领域普通技术人员理解本发明，提供以下非限制性定义。
当与可测量的数字变量结合使用时，“大约”或“近似”指代变量的指定值以及指定值实验误差范围内的所有变量值(例如在平均值的95％置信区间内)或在指定值的10％内的值，选二者中较大的范围。
“烷基”指代直链和分支的饱和烃部分。
“胺”指代衍生自铵的化学化合物，其中烃基取代了一个或多个氢原子。“季胺”指代基于铵的具有四个烃基的化合物。
“抗原”指代刺激特异免疫应答的任何物质。该术语包括杀灭的、灭活的、减弱的或修饰的活的细菌、病毒或寄生虫。术语抗原还包括多核苷酸、多肽、重组蛋白质、合成肽、蛋白质提取物、细胞(包括肿瘤细胞)、组织、多糖、或脂质，或其片段，单独地或其任意组合。术语抗原还包括抗体，如抗-独特型抗体或其片段，并可指代可模拟抗原或抗原决定簇(表位)的合成的肽模拟位。
应用于佐剂制剂，“基本上包含”指代该制剂不含未提到的另外的佐剂或免疫调制试剂，其以该试剂发挥可测量到的佐剂或免疫调制效应的量。
“剂量”指代施于受试者的组合物的单位，可以为质量单位或体积单位。
“免疫刺激性分子”指代产生免疫应答的分子。
“肠道外施用”指代通过或经由不包括消化道的途径向受试者体内引入某种物质，如疫苗。
“药学可接受”指代在良好医学评价范围内的，适用于接触受试者组织，而不引起过度的毒性、辐射、过敏应答等的物质，具有相应合理的收益风险比，并可有效地用于其预期用途。
“皂苷”指代一类植物来源的表面活性糖苷，由亲水区域(通常为数个糖链)结合类固醇或三萜结构的疏水区域组成。
“类固醇”指代任何类型的属于生物化学脂质类型的有机化合物，其包含四融合环系统，其中有三个融合的环己烷(六碳)环加上第四环戊烷(五碳)环。类固醇通常在无机溶剂中可溶性高，微溶于水。
“固醇”指代动物内由萜类前体生物学产生的化合物。其包含类固醇环结构，具有羟基(OH)基团，通常附着至碳-3。脂肪酸置换物的烃链长度可变，通常为16至20个碳原子，可以为饱和或不饱和的。固醇一般在环结构中含有一个或多个双键，也含有多种附着至环的置换物。固醇及其脂肪酸酯基本上不溶于水。
“基本上不含抗原的组合物”指代这样的组合物，其中抗原的量不足以产生保护性特异免疫应答或阻止通过抗原产生的特异免疫应答所针对的病原体的成功繁殖和/或排除(例如病毒脱落)。在一些实施方式中，基本上不含抗原组合物中抗原的量无法由血清学测定法如ELISA检测到。
“三萜”指代一大类种类多样的天然产生的有机分子，衍生自六个五碳的异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)单元。多数三萜是多环结构，相互之间差异在于功能基团和其基本碳骨架。
如本文所描述的，本发明人惊奇地发现包含皂苷、固醇、季胺化合物、聚丙烯酸聚合物以及任选地糖脂和/或免疫刺激性寡核苷酸中的一种或两者的组合物能够在无抗原的情况下在温血动物(哺乳动物和鸟类)中触发保护性免疫应答。
尽管温血动物即哺乳动物和鸟类能够产生先天免疫应答及作用慢的适应性免疫应答，但其主要依赖于高度进化的适应性免疫机制。无脊椎动物相比之下缺乏适应性免疫机制，因此完全依赖于先天免疫应答机制。冷血脊椎动物例如鱼类包括先天和适应性免疫应答机制二者。而相比于温血脊椎动物，冷血脊椎动物的适应性免疫应答相对不发达，冷血脊椎动物的先天免疫应答的发达度相对较高。由此，冷血脊椎动物相对于温血脊椎动物通常更多依赖于先天免疫机制而非适应性免疫机制。因为无脊椎动物和冷血脊椎动物相比于温血动物在先天免疫系统的相对发达程度以及对先天免疫系统的依赖性上有差异，所以关于无脊椎动物和冷血脊椎动物各自先天免疫系统的结果和发现不能预期应用于温血脊椎动物的先天免疫系统。具体而言，发现化合物或组合物可刺激无脊椎动物或冷血脊椎动物的先天免疫系统不能合理地预测该化合物或组合物可用于刺激温血哺乳动物的先天免疫系。
先天免疫系统是一种迅速部署、高度有效的通用防御系统，可提供对病原性试剂的保护。因此，需要鉴别出刺激或提高温血脊椎动物的先天免疫应答系统的化合物和组合物。如本文所描述的，发明人惊奇地发现包含皂苷、固醇、季胺化合物、聚丙烯酸聚合物以及任选地糖脂和/或免疫刺激性寡核苷酸中的一种或两者的组合物(分别称为QCDC、QCDCR、QCDCT和QCDCRT)有效地激活温血脊椎动物的先天免疫应答系统并可被用作免疫调节剂，即不依赖于抗原在温血动物(例如哺乳动物和鸟类)中改善对攻击的免疫应答。发现本文所述的QCDC、QCDCR、QCDCT和QCDCRT组合物可足够有效地激活温血动物中不那么灵活多变的先天免疫系统是令人惊讶和意外的。
因此，在特定实施方式中，本发明提供了组合物，用于改善哺乳动物或鸟类的免疫应答，该组合物包含固醇、皂苷、季胺，聚丙烯酸聚合物，例如，该四组分组合物被称为QCDC。所述QCDC组合物还可以含有糖脂(R)、免疫刺激性性寡核苷酸(T)，或者两者。
固醇类共享一个共同的化学核心，这是一种类固醇环结构，具有羟基(OH)基团，通常附着至碳-3。所述脂肪酸取代基的烃链的长度编号通常从16到20个碳原子，并且可以是饱和的或不饱和的。这些固醇共同在环结构中含有一个或多个双键并且含有多种附着至环的取代基。固醇和它们相应的脂肪酸酯基本上不溶于水。鉴于这些化学相似性，这些共享此化学核心的固醇很可能在用于本发明的疫苗组合物时将具有类似的性质。固醇是本领域公知的，并且可以商购买到。例如胆固醇公开于Merck Index第12版，p369。合适固醇包括但不限于，β谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化醇，以及胆固醇。
固醇的通常以约1μg至约5,000μg每剂量的量使用。它们还以约1μg至约4,000μg每剂量、约1μg至约3,000μg每剂量、约1μg至约2,000μg每剂量、约1μg至约1,000μg每剂量的量使用。它们还以约5μg至约750μg每剂量、约5μg至约500μg每剂量、约5μg至约200μg每剂量、约5μg至约100μg每剂量、约15μg至约100μg每剂量、约15μg至约30μg每剂量的量使用。
合适的皂苷包括三萜皂苷。这些三萜类化合物为一类植物来源的表面活性糖苷，共享亲水区域(通常为数个糖链)结合类固醇或三萜结构的疏水区域组成的共同化学核心。由于这些相似性，这些共享此化学核心的皂苷很可能有类似的佐剂特性。适合用于佐剂组合物中的三萜类化合物可来自许多来源，可以是植物来源或合成的等价物，包括但不限于，皂皮树、番茄素、人参提取物、蘑菇和结构上类似于类固醇皂苷的生物碱糖苷。因此，适用于佐剂组合物中的三萜类化合物包括皂苷、角鲨烯，和羊毛甾醇。在另一组实施方案中，皂素可为例如，Quil A或者另一种纯化的或部分纯化的皂苷制备物，其可以商购获得。因此，皂角苷提取物可以以例如QS-7、QS-17、QS-18和QS-21的混合物或纯化的单个组分形式使用。在一个实施方式中，Quil A为至少85％纯。在某些实施方案中，所述的Quil A为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯。
在本发明的组合物中，皂苷以约1μg至约5,000μg每剂量的量存在。它们还以约1μg至约4,000μg每剂量、约1μg至约3,000μg每剂量、约1μg至约2,000μg每剂量以及约1μg至约1,000μg每剂量的量使用。它们还以约5μg至约750μg每剂量、5μg至约500μg每剂量、约5μg至约200μg每剂量、约5μg至约100μg每剂量、约15μg至约100μg每剂量以及约15μg至约30μg每剂量的量使用。
季胺化合物是具有四个烃基的基于铵的化合物。这类烃基通常被限制为烷基或芳基。在特定实施方式中，季胺化合物由四条烷基链构成，其中两个是C10-C20烷基，其余两个是C1-C4烷基。在一组实施方式中，季胺是二癸基二甲基胺(DDA)。在某些实施方案中，可以使用阿夫立定(avridine)。
在本发明的组合物中，季胺以约1μg至约5,000μg每剂量的量存在。它们还以约1μg至约4,000μg每剂量、约1μg至约3,000μg每剂量、约1μg至约2,000μg每剂量以及约1μg至约1,000μg每剂量的量使用。它们还以约5μg至约750μg每剂量、5μg至约500μg每剂量、约5μg至约200μg每剂量、约5μg至约100μg每剂量、约15μg至约100μg每剂量以及约15μg至约30μg每剂量的量使用。作为一个具体的实例，含有DDA佐剂组合物可通过简单地混合抗原溶液与新鲜制备的DDA溶液而制备。
多种适用于本发明途的聚丙烯酸聚合物是可商购的。在某些实施方式中，聚丙烯酸聚合物包括聚丙烯酸，它以商品名市售。这些聚合物具有平均当量重量为76。它们由平均直径约0.2至6.0微米的初级聚合物颗粒产生。聚合物在水中溶胀至高达1000倍于其原始体积，10倍于其原始直径，当暴露于pH环境大于羧酸基团的pKa时会形成凝胶。在pH高于羧酸基团的pKa时，所述羧酸基团离子化导致负电荷之间的排斥，有助于聚合物的膨胀。
在本发明的组合物中，聚丙烯酸聚合物以体积比(v/v)约0.0001％至约75％v/v的量存在。在某些实施方式中，它以约0.001％v/v至约50％v/v、约0.005％v/v至约25％v/v、约0.01％v/v至约10％v/v、约0.05％v/v至约2％v/v的量使用。在另一个实施方式中，它以约0.02％v/v至约0.1％v/v的量使用。
合适的糖脂通常是激活Th2应答的那些。糖脂的例子包括但不限于，由式I涵盖的以及其他在美国出版号20070196384一般描述的(Ramasamy等人)化合物。
在式I的结构中，R1是氢，或具有多至20个碳原子的饱和烷基；X是-CH2-、-O-或-NH-；R2是氢，或者具有多至20个碳原子的饱和或不饱和的烷基；R3、R4和R5独立地为氢、-SO4 2-，-PO4 2-，-COC1-10烷基；R6是L-丙氨酰、L-α-氨基丁酰、L-精氨酰、L-天冬氨酰、L-天冬酰、L-半胱氨酰、L-谷氨酰、L-甘氨酰、L-组氨酰、L-羟基脯氨酰、L-异亮氨酰，L-亮氨酰、L-赖氨酰、L-甲硫氨酰、L-鸟氨酰、L-苯丙氨酰、L-脯氨酰、L-丝氨酰、L-苏氨酰、L-酪氨酰、L-色氨酰和L-缬氨酰或它们的D-异构体。
在某些实施方式中，合适的糖脂是N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰胺-b-D-吡喃葡糖基)-N-十八烷基月桂酰胺或其盐。在某些实施方式中，该盐是乙酸盐。
在某些实施方式中，在本发明的组合物中，糖脂以约0.01mg至约10mg每剂量的量存在。在某些实施方式中，它们以约0.05mg至约7.5mg每剂量、约0.05mg至约1mg每剂量、约0.5mg至约2.5mg每剂量的量以及约1mg至约2mg每剂量的量使用。
在本发明的某些实施方式中也可使用免疫刺激性寡核苷酸，与QCDC或QCDCR组合。一般地，免疫刺激性寡核苷酸含有至少一个CG基序，并且有时被称为CpG核苷酸。CpG寡核苷酸特征在于在特定的碱基序列中存在未甲基化的CG二核苷酸(CpG基序)。(HanselTT，Barnes PJ(eds):New Drugs for Asthma,Allergy and COPD.ProgRespir Res.Basel,Karger,2001,vol 31,pp 229-232,其并入本文作为参考)。CpG基序存在于细菌DNA中，它们赋予细菌DNA免疫刺激性质。CpG基序通常不在真核生物DNA中发现，其中的CG二核苷酸被抑制，如果存在则通常是甲基化的。
本发明的佐剂可以包括所谓的P-类免疫刺激性寡核苷酸，包括例如，修饰的P-类免疫刺激性寡核苷酸。P-类免疫刺激性寡核苷酸是这样的CpG寡核苷酸，其特征在于存在回文序列，一般长度为6-20个核苷酸。这种回文的存在使得多联体或茎环结构的形成成为可能。P-类免疫刺激性寡核苷酸的总长度通常介于19和100个核苷酸，例如19-30个核苷酸、30-40个核苷酸、40-50个核苷酸、50-60个核苷酸、60-70个核苷酸、70-80个核苷酸、80-90个核苷酸、90-100个核苷酸。
在本发明的某些方面，免疫刺激性寡核苷酸包含5’TLR活化域和至少两个回文区域，一个回文区域是长度为至少6个核苷酸的5’回文区并且直接或通过间隔子连接到长度为至少8个核苷酸的一个3’回文区域。
P-类免疫刺激性寡核苷酸可以根据本领域已知的技术进行修饰。例如，J修饰是指碘修饰的核苷酸。E修饰是指乙基修饰的核苷酸。因此，E修饰的P-类免疫刺激性寡核苷酸是这样的P类免疫刺激性寡核苷酸，其中至少一个核苷酸(优选5'核苷酸)被乙基化。另外的修饰包括6-硝基苯并咪唑的附着、O-甲基化、proynyl-dU的修饰、肌苷修饰、2-溴乙烯基附着(优选附着于尿苷)。
P类免疫刺激性寡核苷酸还可以包含修饰的核苷酸间键，包括但不限于，磷酸二酯键和硫代磷酸酯键。寡核苷酸可合成或从商业来源获得。
P-类寡核苷酸和修饰的P-类寡核苷酸的实例公开于PCT申请号WO2008/068638，公布于2008年06月12日。修饰的P-类免疫刺激性寡核苷酸的合适的非限制性实例提供于下文(在SEQ ID NO 1-10中，“*”是指硫代磷酸酯键，“-”是指磷酸二酯键；在SEQ ID NO 11-13中所有键都是磷酸二酯键)。
SEQ ID NO:1
5'T*C-G*T*C-G*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO:2
5'T*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO:3
5'T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'
SEQ ID NO:4
5'JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO:5
5'JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'
SEQ ID NO:6
5'JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'
SEQ ID NO:7
5'EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO:8
5'JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G**C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 3'
SEQ ID NO:9
5'JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 3'
SEQ ID NO:10
5'T*C-G*T*C-G*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO:11 5'-UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU-3'
SEQ ID NO:12 5'-UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU-3'
SEQ ID NO:13 5'-AAACGCUCAGCCAAAGCAG-3'。
P-类免疫刺激性寡核苷酸通常在本文所述的佐剂组合物中以约20μg至约500μg每ml的量使用。它们还以约25μg至约400mg每ml、约40μg至约250μg每ml、约50μg至约200μg每ml、约100μg至约200μg每ml的量使用。
制备本文所述组合物的方法在例如美国公开号20090324641(Dominowski等人，公布于2009年12月31日)中描述。简单地说，该组合物的化合物可混合在一起，优选地，聚丙烯酸聚合物最后加入。组合物可以在加入聚丙烯酸聚合物之前进行微流化。
本文所描述的组合物一般不要求任何特定的载体，并可以在水性或其它药学可接受的缓冲液中配制。佐剂组合物可以根据施用途径，存储要求等制成各种形式。例如，它们可以制成无菌水性溶液或分散剂的形式，适于注射使用，或使用冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥技术制成冻干形式。冻干组合物可在使用前于稳定的溶液中重构，例如，盐水或HEPES。因此，该佐剂组合物可以以固体，半固体或液体剂型使用。
磷酸盐缓冲盐水(PBS)可以用作含水性缓冲介质；缓冲液的pH值可以是中性或微碱性或微酸性。因此，该pH在pH 6至8的范围内。pH为约7.0至约7.3是常见的。缓冲液强度可以是10至50mM PO4之间及介于10至150mM PO4之间。在一个实例中，使用0.063％的PBS。pH可以根据需要使用NaOH或HCl进行调整。典型的浓度包括1N至10N HCl和1N至10N的NaOH。
组合物可均质化或微流化。组合物进行初级共混工艺处理，典型地一次或多次通过一个或多个均化器。任何市售均化器都可以用于此目的，例如，Ross乳化器(Hauppauge，NY)、Gaulin均化器(Everett，Mass)，或Microfluidics(Newton，Mass)。
在某些实施方式中，将皂苷加入到合适的缓冲液中。而后将固醇缓慢加入到皂苷溶液中，随后缓慢加入季胺化合物。如果存在糖脂和/或免疫刺激性寡核苷酸，还要加入它们。对得到的组合物进行均质化，然后微流化。微流化后，将聚合物添加到微流化组合物。根据使用的成分，这些步骤的顺序可以被改变，以优化组合物的制备。
在一个实施方式中，组合物在10,000rpm下均质化3分钟。可以通过使用商业微流器实现微流化，如来自Microfluidics的型号11OY(Newton，Mass)；Gaulin的型号30CD(Gaulin公司，Everett，Mass)；和Rainnie Minilab 8.30H型(Miro Atomizer Food and Dairy，Inc.,Hudson，Wis)。这些微流化器的运行原理是在高压下驱使流体穿过小孔，使得两种流体流在相互作用小室中高速相互作用，以形成具有亚微米大小的液滴的组合物。在一个实施方式中，所述制剂在10,000±500psi下穿过200微米限制尺寸的小室而实现微流化。
组合物的剂量的大小通常为约0.05mL至约5mL，包括端点至，并且取决于受试者和抗原。例如，对于犬或猫，通常使用约1mL的剂量，而对于牛则一般使用约2-5mL的剂量。然而，这些佐剂也可以配制在微剂量中，其中可以使用约100μL的剂量，例如，施用至鸡。
用于佐剂组合物的施用途径包括肠道外、口服、口鼻、鼻内、气管内、局部及卵内。任何适合的装置可用于施用所述组合物，包括注射器、滴管、无针注射装置、贴片等。选择使用的途径和装置将取决于组合物的成分和动物的大小。
不同的哺乳动物和鸟类适于通过本发明的方法的治疗。所述动物包括但不限于，狗、猫、马、绵羊、牛、猪、鹅、鸡、鸭等。
本发明的一个优势方面在于，可以在动物免疫系统减弱时，动物处于高应激环境中，或有高的接触病原体可能时，施用于受试哺乳动物或鸟类。例如，动物可以在被隔离时，在运输前、运输过程中即刻处理，或运输后立即治疗。有时，合适的抗原不容易得到，甚至是未知的。
如果目前已知某种疾病自身起效快，则先天免疫系统的活化特别重要。此外，本发明可用于圈养在拥挤环境中的动物，如在养鸡农场。
疾病可以由如此广泛类别的病原体引起，如病毒，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
病毒包括，但不限于，禽疱疹病毒(Avian herpesvirus)、牛疱疹病毒(Bovine herpesviruses)、犬疱疹病毒(Canine herpesviruses)、马疱疹病毒(Equine herpesviruses)、猫病毒性的鼻气管炎病毒(Felineviral rhinotracheitis virus)、马立克氏病病毒(Marek's disease virus)、羊疱疹病毒(Ovine herpesviruses)、猪疱疹病毒(Porcineherpesviruses)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)、禽副粘病毒(Avianparamyxoviruses)、牛呼吸道合胞病毒(Bovine respiratory syncytialvirus)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus)、犬副流感病毒(Canineparainfluenza virus)、犬腺病毒(canine adenovirus)、犬细小病毒(canine parvovirus)、3型牛副流感病毒(Bovine Parainfluenza virus3)、3型羊副流感病毒(Ovine parainfluenza 3)、牛瘟病毒(Rinderpestvirus)、博德病病毒(Border disease virus)、牛病毒性腹泻病毒(Bovineviral diarrhea virus)(BVDV)、I型BVDV、II型BVDV、经典猪瘟病毒(Classical swine fever virus)、禽白血病病毒(Avian Leukosisvirus)、牛免疫缺陷病毒(Bovine immunodeficiency virus)、牛白血病病毒(Bovine leukemia virus)、牛结核病(Bovine tuberculosis)、马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus)、猫免疫缺陷病毒(Feline immunodeficiency virus)、猫白血病病毒(FeLV)(Felineleukemia virus)、新城疫病毒(Newcastle Disease virus)、绵羊进行性肺炎病毒(Ovine progressive pneumonia virus)、羊肺腺癌病毒(Ovinepulmonary adenocarcinoma virus)、犬冠状病毒(CCV)(Caninecoronavirus)、泛嗜性CCV(pantropic CCV)、犬呼吸道冠状病毒(Canine respiratory coronavirus)、牛冠状病毒(Bovine coronavirus)、猫杯状病毒(Feline Calicivirus)、猫肠冠状病毒(Feline entericcoronavirus)、猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitisvirus)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)、猪血凝脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyletitis virus)、猪细小病毒(Porcine parvovirus)、I型猪圆环病毒(PCV)(PorcineCircovirus(PCV)Type I)、II型PCV、猪生殖与呼吸综合征(PRRS)病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome(PRRS)Virus)、传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus)、土耳其冠状病毒(Turkey coronavirus)、牛流行热病毒(Bovine ephemeral fevervirus)、狂犬病(Rabies)、轮状病毒(Rotovirus)、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)、慢病毒(lentivirus)、禽流感病毒(Avianinfluenza)、鼻病毒(Rhinoviruses)、马流感病毒(Equine influenzavirus)、猪流感病毒(Swine influenza virus)、犬流感病毒(Canineinfluenza virus)、猫流感病毒(Feline influenza virus)、人流感病毒(Human influenza virus)、东方马脑炎病毒(EEE)(Eastern Equineencephalitis virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equineencephalitis virus)、西尼罗河病毒(West Nile virus)、西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus)、人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus)、人乳头状瘤病毒(human papilloma virus)、水痘带状疱疹病毒(varicella zoster virus)、B型肝炎病毒(hepatitis Bvirus)、鼻病毒(rhinovirus)及麻疹病毒(measles virus)。
革兰氏阳性菌有厚厚的肽聚糖层，在细胞膜表面上。革兰氏阳性菌的非限制性实例是链球菌和葡萄球菌。具体的实例包括但不限于来自以下属的细菌：放线菌属(Actinomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、利斯特氏菌属(Listeria)、诺卡氏菌属(Nocardia)、丙酸菌属(Propionibacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和草绿色链球菌属(Viridans)。示例性物种包括但不限于，无乳链球菌(S.agalactiae)、化脓性链球菌(S.pyogenes)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、马链球菌(S.equi)、破伤风梭菌(C.tetani)、肉毒梭菌(C.botulinum)、产气夹膜梭菌(C.perfringes)、艰难梭菌(C.difficile)、炭疽杆菌(Bacillus anthacis)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)。
相较于革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌缺乏这种肽聚糖层。革兰氏阴性细菌的致病能力常常与革兰氏阴性细胞包膜的某些组分相关，特别是脂多糖层(也称为LPS或内毒素层)。具体的实例包括但不限于来自以下属的细菌：不动杆菌属(Acinetobacter)、博德特氏菌属(Bordetella)、短螺旋菌属(Brachyspira)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、布鲁氏菌属(Brucella)、心肝菌属(Cardiobacterium)、枸橼酸杆菌属(Citrobacter)、贝氏肠杆菌属(Coxiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、梭杆菌属(Fusobacterium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、幽门螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、Moxarella、摩根氏菌属(Morganella)、淋球菌属(Neisseria)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、螺旋体属(Spirochaeta)、弧菌属(Vibrio)。示例性物种包括但不限于，支气管炎败血性博德特氏菌(BordetellaBronchiseptica)、犬布氏杆菌(Brucella canis)、猪布鲁氏菌(Brucellssuis)、鼻疽菌(Burkhodlderia mallei)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、以及阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。
寄生虫包括但不限于，无形体属(Anaplasma)、肝片吸虫(肝吸虫)(Fasciola hepatica)、球虫属(Coccidia)、艾美球虫属(Eimeriaspp)、犬新孢子虫(Neospora caninum)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、贾第虫属(Giardia)、恶丝虫属(丝虫)(Dirofilaria)、钩虫属(钩虫)(Ancylostoma)、锥虫属物种(Trypanosoma spp.)、利什曼原虫属物种(Leishmania spp.)、毛滴虫属物种(Trichomonas spp.)、隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、巴贝斯虫属(Babesia)、血吸虫属(Schistosoma)、绦虫属(Taenia)、圆线虫属(Strongyloides)、旋毛虫属(Ascaris)、蛔虫属(Trichinella)、肉孢子虫属(Sarcocystis)、哈蒙德虫属(Hammondia)和Isopsora，及其组合。还包括的是外寄生虫，包括但不限于蜱，包括硬蜱属(Ixodes)、扇头蜱属(Rhipicephalus)、革蜱属(Dermacentor)、花蜱属(Amblyomma)、牛蜱属(Boophilus)、璃眼蜱属(Hyalomma)、和血蜱属(Haemaphysalis)物种，及其组合。
真菌病原体包括白色念珠菌属(Candida)、小孢子菌属(Microsporum)、黑曲霉属(Aspergillus)、隐球菌属(Cryptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、肺囊虫属(Pneumocystis)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)。
下文的实施例表示为示例性实施例，但不应该被视为限制本发明的范围。许多变化，变型，修改，和其它本发明的用途和应用对本领域熟练技术人员将是显而易见的。
实施例
实施例1：QCDC对支气管炎败血性博德特氏菌攻击的保护
将50只Swiss远交CF-1小鼠随机分为两组每组15只小鼠及一组20只小鼠。15只小鼠，约18-20g，用溶于(其是卵磷脂油乳剂)的QAC(Quil A与胆固醇(50μg/50μg每剂量)、或水性QCDC(Quil A/胆固醇/DDA/为20μg/20μg/10μg/0.05％)佐剂制剂进行接种。每只小鼠由腹膜内途径接受两次注射，每次0.2毫升，间隔两周。所述20只小鼠被指定为未接种对照。在第二次注射后两周，用支气管炎败血性博德特氏菌菌株B133对所有三个小鼠组进行腹膜内攻击。
如下制备攻击培养物：简言之，将攻击生物体在胰蛋白血琼脂平板上于35-37℃培养约24小时。将平板用蛋白胨盐水溶液洗涤，将培养物调节至600nm处透光率约75％。每只小鼠由腹膜内途径接受约8×107个菌落形成单位的支气管炎败血性博德特氏菌菌株B133。在攻击后7天确认存活小鼠的数目。
表1中提供存活结果
处理(N) 存活数目 攻击后7天存活％
QAC(15) 1 6.7
QCDC(15) 10 66.7
未接种的(20) 4 20.0
这些结果表明使用不含特异抗原的QCDC的处理足以产生针对支气管炎败血性博德特氏菌模型中革兰氏阴性细菌的保护性应答。
实施例2：QCDCRT降低BHV-1(牛疱疹病毒1)在初始牛犊中攻击的病毒滴度。
用BHV-1在牛犊中攻击来评估制剂QCDCRT(描述于下文)对先天免疫系统的激活的影响。选用以前未接受包含BHV部分的疫苗的动物(每组10只)。筛选可能符合条件的试验动物，只选择那些具有BHV血清中和滴度小于1：2的动物。
在攻击前约5-7天使动物适应环境。在驯化期间，给动物饲喂无抗菌素自由全混合沉淀配给。水可随意提供。到达前，动物依据标签接受和
处理情况归纳于下文表2。
表2
在第0天皮下施用2ml体积。接种后十二小时鼻内施用进行BHV-1攻击(每个鼻孔2ml，每只动物4mL)。接种前及攻击时，收集血样和鼻拭子样品。此外，每日收集另外的鼻拭子直至第14天，第14天取另外的血液样品。
通过qPCR测定的IFN-α，MX-1和OAS mRNA的量。所得结果总结于图1。
处理后12小时，IFN-α水平没有显著升高。然而，MX-1和OASmRNA的水平在组T02、T03和T04中升高，其中T02和T03是最有效的。由于MX-1和OAS是IFNα的下游，则可能是IFNα的mRNA水平已在较早的时间点升高。
病毒脱落的时间线显示于图2。观察第3-5天在对照组(T01)和处理组(T02-T04)之间的差异。在第4天的组T01(阴性对照)中，脱落达到峰值约4x107单位，而在处理组中，为约1-1.5×107单位。截止第5天，在对照组和处理组之间的差异消失，到第9天，病毒脱落的百分无无显著差异。所有组显示出疾病的临床症状。
所有引用的出版物在此通过引用整体并入本文。
虽然前面的说明书教导了本发明的原理，并提供用于说明的目的的实施例，但本领域技术人员要理解的是通过阅读本公开内容可做出形式和细节上的多种改变，而不脱离本发明的真正范围。

Claims (20)

1.在哺乳动物或鸟类中诱导免疫应答的方法，包括向哺乳动物或鸟类施用基本上不含抗原的组合物，其包括皂苷、固醇、季胺和聚丙烯酸聚合物。
2.权利要求1的方法，其中所述皂苷是三萜皂苷，所述固醇为胆固醇，所述季胺是DDA。
3.权利要求2的方法，其中所述三萜皂苷是Quil A或其经纯化的部分。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中皂苷以1μg至约5,000μg每剂量的量存在，固醇以1μg至约5,000μg每剂量的量存在，季胺以1μg至约5,000μg每剂量的量存在，以及聚丙烯酸聚合物以0.0001％体积/体积(v/v)至约75％v/v的量存在。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述组合物基本上由皂苷、固醇、季胺和聚丙烯酸聚合物组成。
6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述组合物进一步包含糖脂。
7.权利要求6的方法，其中所述糖脂是N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基-b-D-吡喃葡糖基)-N-十八烷基月桂酰胺或其盐。
8.权利要求6和7中任一项的方法，其中所述组合物不含免疫刺激性寡核苷酸。
9.权利要求6-8中任一项的方法，其中所述组合物基本上由糖脂、皂苷、固醇、季胺和聚丙烯酸聚合物的构成。
10.权利要求6-9中任一项的方法，其中所述糖脂以0.01mg至约10mg每剂量的量存在。
11.如权利要求1-4、6或7中任一项的方法，其中所述组合物还包括免疫刺激性寡核苷酸。
12.权利要求11的方法，其中组合物基本上由所述免疫刺激性寡核苷酸、皂苷、固醇、季胺和聚丙烯酸聚合物构成。
13.权利要求11的方法，其中组合物基本上由免疫刺激性寡核苷酸、糖脂、皂苷、固醇、季胺和聚丙烯酸聚合物构成。
14.权利要求11-13中任一项的方法，其中免疫刺激性寡核苷酸以20μg至约500μg每ml的浓度存在。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述免疫应答是对感染的免疫保护性应答。
16.权利要求15的方法，其中感染是病毒感染。
17.权利要求15的方法，其中感染是细菌感染。
18.权利要求17的方法，其中细菌感染是由革兰氏阴性细菌引起的。
19.权利要求18的方法，其中所述革兰氏阴性细菌是支气管炎败血性博德特氏菌。
20.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述组合物不含抗原。
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