NL7904021A - Gecombineerd vaccin en werkwijze voor het bereiden van dit gecombineerd vaccin tegen door adeno achtige virussen veroorzaakte eiproduktiedalingen en door reo virus veroorzaakte ziekteverschijnselen. - Google Patents

Description

N5D-2305 #

V

X

ï ' ' f t j < i t i i ? s ’ Gist-Brocades 2f.V· te Delft·

Gecombineerd vaccin en werkwijze voor het bereiden van dit gecombineerd vaccin tegen door adeno achtige virussen veroorzaakte ei-produktiedalingen en door reo virus veroorzaakte ziekteverschijnselen·

Door Aanvrager worden als uitvinders genoemd:

Peter Apontoweil» Johannes Anthonius Gerardus lok en Manfred Μ·

Krasselt,

De uitvinding heeft betrekking op een gecombineerd vaccin tegen infectieziekte·:bij pluimvee en meer in het bijzonder tegen door adeno achtige virussen (verder te noemen ALV) veroorzaakte eiproduktiedalingen en door aviaire reo virus veroorzaakte ziekte-5 verschijnselen bij pluimvee, alsmede op de bereiding van dit gecom- . bineerde vaccin en de toepassing ervan.

Het is bekend dat reo virussen verschillende ziekteverschijnselen kunnen veroorzaken bij pluimvee, zoals arthritis/teno-synovitis, mycocarditis, hepatitis, hydropericardium, alsmede stoor-10 nissen aan het spijsverteringskanaal en/of ademhalingswegen.

In Avian Pathology, 6, 271-284, 1977 wordt bijvoorbeeld een overzicht gegeven van verschillende pathogene microorganismen, die op zichzelf of in combinatie de virale arthritis/tenosynovitis 790 4 0 21 Λ s Ί j zouden kunnen veroorzaken, zoals Staphylococcus, Salmonella, ' j | Pasteurella, Brysipelotrix, Mycobacterium avium, Bacterium arthro- ! ! pyogenes, Escherichia venezuelensis, Streptobacillis monoliformis, I Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae en reo virussen, 5 j zoals bijvoorbeeld het reo virus isolaat S 1133, het j L/z 671 virus, het SAM-1 virus, waarbij reo virussen als de voor- - naamste ziekteverwekker worden beschouwd. Geconstateerd wordt dat • virale arthritis/tenosynovitis en andere ziekteverschijnselen t,g*v, j reo virus infectie, een belangrijke rol speelt als oorzaak van aan-10 | zienlijke economische verliezen in de pluimveehouderij in vele delen ' van de wereld, [ ! 3ovendien wordt een methode voorgesteld om een bescherming | tegen virale arthritis te bewerkstelligen door vaccinatie gedurende ! - de groeiperiode en de daaropvolgende overdracht van maternale anti- i 15 ; lichamen aan het nageslacht d.a.v. vaccinatie met reo virus vaccins.

Experimenteel werd in dit verband gevonden dat imraunisa-! tie van fokdieren alleen het nageslacht van de eerste generatie · ; beschermde, doch niet. dat van de tweede generatie* : Bekend was ook.uit bijvoorbeeld Avian Pathology no, 3, 7, 20 : 407-419, dat er een synergistische relatie zou bestaan tussen

! I

M» synoviae en reo virus, hoewel niet overtuigend aangetoond, bij het experimenteel veroorzaken van eerder gevonden ziekteverschijnselen in kippen, zoals ontsteking van het synovial membraan,de pees schede in het bijzonder in het tarsometatarsale gebied en myocarditis, 25 Ook blijkt uit eerder publicaties, bijvoorbeeld die in

Neth.J.Vet.Sci., vol. 3, no. 1 (l970) blz. 5-10, dat reo virussen zoals bijvoorbeeld het L/Z 671 reo virus, voornamelijk vertantwoor-delijk worden gehouden voor synovitis verschijnselen bij slacht-kuikenouderdieren.

30 Ook bijvoorbeeld uit Poultry Digest, februari 1978, blz.

102, blijkt dat reo virus groeiremming en diarrhee bij slachtkui-kens kan veroorzaken en dat orale infectie met darm suspensies bij kippen groeiremming tot gevolg kan hebben. Hoewel in eieren voortgekweekt virusmateriaal na orale toediening geen groeiremming 35 maar vel "pasting" tot gevolg had, veroorzaakte intraperitoneale -injectie van in eieren voortgekweekt virus wel groeiremming. De 790 4021 - 2 - % τι '

ι I

• waargenomen ziekteverschijnselen worden in verband gebracht met ’ een noodzakelijk schijnende combinatie van infectueuze agentia· | Anderzijds blijkt uit meer recente publicaties dat de ! oorzaak van rachitis achtige verschijnselen primair kan worden 5 gezocht in het optreden van toxische stoffen, gevormd door schimmels zoals Fusarium noniliforme Sheldon· ' Bijvoorbeeld uit Zbl.Vet.Med.B, 25» 29-44 (1978) is bekend dat gedurende de laatste jaren in verschillende landen recentelijk ' waargenomen rachitis verschijnselen bij slachtkuikens primair f 10 i lijken te worden veroorzaakt door toxische stoffen, gevormd door de hiervoor genoemde schimmel, welke in staat is gebleken zich in de gebruikelijke pluimveevoeders uit nog latent aanwezige sporen te ontwikkelen, bij voorkeur onder de enigszins vochtige omstandigheden van de herfst- en de winterperiode· 15 Hoewel in voorgaande jaren t.o·v. die waarin de gepubli ceerde verschijnselen zich voordeden, de waargenomen rachitis verschijnselen nog aanmerkelijk konden worden bestreden door een therapie met vitaminen, leidde dezelfde therapie t*b«v· de later gevon-! den ziekte verschijnselen niet meer of veel minder tot verbetering· 20 Geprobeerd werd daarom, het later gesignaleerde ziekte- « beeld door toediening van speciaal in dit verband gekozen voeders te reproduceren en door toediening van vitaminen en/of mineralen te beïnvloeden en diepgaander te onderzoeken, waarbij door toepassing van daartoe geschikte werkwijzen het optreden van ziekten ver-25 oorzaakt door parasieten of t.o.v. pluimvee pathogene microorganis- men zoals reo virussen, Mycoplasma gallisepticum en Mycoplasma synoviae alsmede andere bacteriesoorten, zoveel mogelijk werd uitgesloten»

Geconcludeerd wordt.dat, mede gezien de in voorgaande 30 jaren gevonden aanwijsbare schadelijke eigenschappen van de in het bijzonder van F· moniliforme afkomstige stofwisselingsprodukten, er geen twijfel meer aan kan bestaan dat er tussen het voorkomen van fusariën in voeders en de bij mestkuikens gesignaleerde ziektebeelden een oorzakelijk verband moet bestaan, zonder dat een nauwkeurige en 35 afdoende identificatie van de eigenlijke daarvoor verantwoordelijke —metabolieten heeft plaatsgevonden* 790 40 21 “ 3 "

A

-- : 1

Uit bijvoorbeeld Feedstuffs, May 8, 1978, biz. 95 en 96, J

blijkt dat de werkelijke hoofdoorzaak van deza rachitis verschijnse-; len in feite nog steeds niet is gevonden.

i

Het is ook bekend uit bijvoorbeeld Avian Pathology 6,279, 5 dat in het verleden pogingen werden ondernomen om d.m.v. vaccinatie met reo virus vaccins virale arthritis/tenosynovitis bij pluimvee tegen te gaan. Het lag voor een deskundige o.g.v# de hiervoor besproken ' literatuur tot nu toe beslist niet voor de hand om reo virus vaccins in te zetten t.b.v· 10 ! een bestrijding van rachitis achtige verschijnselen of osteoperose c.q* femur degeneratie, welke zich de laatste jaren steeds veelvuldi-I ger en in alle werelddelen doen gelden als een probleem waarvoor een _effectieve en efficiënte oplossing steeds dringender wordt.

In Avian Pathology, 5,, 261-272 (1976) wordt reeds verband 1 5 : verondersteld tussen de aanwezigheid van adeno achtige virussen : en een deel van de, in de laatste jaren in toenemende mate geconsta- : teerde plotseling sterke dalingen in de ei produktie en/of een toenemende produktie van zacht schalige en/of van schaalloze eieren : van vooral slachtkuikenmoederdieren en kippen van halfzware leg-20 1 rassen; deze dalingen worden in de vakliteratuur soms aangeduid als "egg drop syndrome"· Ook in Avian Pathology, jS, 405-413 (1977) wordt een gevonden relatie beschreven tussen de ontwikkeling van ' anti-lichamen t.o.v. een heamagglutinerend virus, aangeduide als 127 virus, en deze hiervoor beschreven economisch zeer schadelijke, 25 verschijnselen, terwijl in Avian Pathology 7» 35-47, 1978 de eerder vermoede relatie tussen het voorkomen van een adeno achtig virus en de hiervoor beschreven plotselinge produktiedaling wordt bevestigd; | tevens worden een aantal karakteristieke eigenschappen van het ver-; antwoordelijke virustype beschreven, bijvoorbeeld de karakteristieke 30 agglutinatie van kippen erythrocyten en het niet geneutraliseerd kunnen worden door antisera van de bekende adeno virus typen.

! In het Luxemburgse octrooischrift no. 79154 wordt beschre- : ven een werkwijze ter bereiding van een vaccin tegen het "egg drop syndrome'* door uit te gaan van een AL virus, dat gekarakteriseerd 35 wordt door middel van een specifieke haemagglutinatie- en antisera i-reaktie, In de beschrijving resp. de voorbeelden wordt dit virus , 790 4 0 21 _4_ I ’ -

j aangeduid met EDS-76 en BC-14* I

j Dit vaccin wordt bereid door het voortkveken van het nieuwe virus in celcultures en bijvoorkeur in een aviaire cel-; cultuur, zoals bijvoorbeeld kippen embryo fibroblasten en embryonaire 5 | lever- of niercellen of in geembryoneerde eendeneieren* : Zovel uit Avian Pathology, 5, (ΐ97β) biz· 262, tweede ; alinea, als uit bijvoorbeeld blz. 406 van Avian Pathology, (1977) ‘ en blz* 1, regels 7-11 van het Luxemburgs octrooi 79154, blijkt ; duidelijk, dat een daling in eiproduktie kan worden veroorzaakt 1 0 ! door Nevcastle-ziekte-, infectieuze bronchitis-, aviaire en cefa- lomyelitis-, vogel pokken virus en combinaties ervan*

Het zal in dit verband duidelijk zijn dat pluimvee uit praktische overwegingen dikwijls gelijktijdig of kort op elkaar gevaccineerd wordt met twee of meer vaccins tegen de eerder genoemde 15 voorkomende virus ziekte en dat pluimvee bijvoorkeur gelijktijdig wordt gevaccineerd waarbij de tot nu toe gebruikelijke methode ontstond uit te mengen ter plaatse van standaard volumina van voor gebruik gereed zijnde afzonderlijke vaccins en het toedienen van de ter plaatse samengestelde vaccin dosis die derhalve meestal uit een 20 nagenoeg dubbel volume bestond ten opzichte van die van de afzonder- - lijk toe te passen vaccin* Bovendien is hierbij een exacte menging niet of moeilijk te garanderen en kunnen problemen als gevolg van —verontreiniging met vreemde smetstoffen ontstaan*

Gezocht werd daarom naar een verbeterd combinatie vaccin 25 zowel afdoende tegen de adeno achtige virussen veroorzaakte eiproduktiedalmgen als tegen de door reo virussen veroorzaakte ziekteverschijnselen zoals rachitisachtige verschijnselen,osteoperose c*q* femur deoeneratie zou beschermen.

Verrassender wijze werd nu gevonden dat de op steeds op 30 grote schaal voorkomende afwijkingen aan het beenderstelsel van pluimvee, zoals rachitis achtige verschijnselen, osteoperose c*q* femur degeneratie bij pluimvee, en meer in het bijzonder bij slacht- kuikens, vaak gepaard gaande met groeiremmingen en diarrhee, kunnen worden bestreden door vaccinatie van de slachtkuikenmoederdieren en 35 hun nakomelingen met behulp van geïnactiveerde,van bepaalde aviaire reo virussen afgeleide vaccins* Heer in het bijzonder werd gevonden dat combinaties van rachitis achtige verschijnselen, osteoperose c*q* femur degeneratie en eiproduktiedalingen bijzonder effectief kunnen 790 40 21 " 5 ~ Μ t vorden bestreden door vaccinatie van slachtkuikenmoederdieren en { hun nakomelingen met behulp van gecombineerde geinactiveerde van ! bepaalde aviaire reo virussen en adeno achtige virussen afgeleide ' vaccins.

5 Volgens een ander kenmerk van de uitvinding werd een werk wijze gevonden voor de bereiding van een gecombineerd vaccin, waarbij een geinactiveerde ALV vloeistof wordt gecombineerd met een geinactiveerde reo virus vloeistof.

Het zal zuidelijk zijn dat de uitvinding mede betrekking 10 heeft op geinactiveerde combinatie vaccins afgeleid van ten minste een geinactiveerde ALV vloeistof en tenminste van een geinactiveerde reo virus vloeistof en eveneens van vaccins afgeleid van meer dan deze twee genoemde virussoorten· 3ij het uitvoeren van de werkwijze 1 5 · volgens de uitvinding wordt een geïnactiveerd ALV bevattende vloei- ! stof bereid volgens op zichzelf bekende wijze .bijvoorbeeld door het ! gewenste virus voort te kweken in bevruchte eendeneieren of op j . een celcultuur van eendencellen, het gevormde virus te verzamelen | in een suspensie van voor deze vaccinsoort gebruikelijke titer en te i 20 j inactiveren, het virus te suspenderen in een geschikte bufferoplossing j en te homogeniseren, en te mengen met een geinactiveerde virus vloei-j stof afgeleid van een reo virus ,die bijvoorbeeld is bereid door voort-J kweken van een geschikt reo virus in een bevrucht kippeei of in een I SPP kippeembryofibroblast celcultuur, het gekweekte virus te ver-25 ' zamelen in een suspensie van een geschikte titer en te inactiveren, te suspenderen in een geschikte bufferoplossing en al of niet te homogeniseren.

Voor de bereiding van de geinactiveerde ALV vloeistof wordt 1 bijvoorkeur uitgegaan van een gepassageerde virusstam 127 die werd 30 I gedeponeerd bij de Collection d’Institut Pasteur, Parijs onder no.

' 1.090, hoewel ook andere, qua antigeniciteit verwante, eiproduktie-daling veroorzakende ALV typen met succes toegepast kunnen worden.

De reo virus bevattende uitgangsvloeistof wordt bijvoorkeur bereid uitgaande van een L/z 671 virus dat -in een bevrucht 35 kippeei of in een SPF kippe embryofibroblast celcultuur wordt voort gekweekt. Dit L/z 671 virus is gedeponeerd bij de Collection d»In--stitut Pasteur, Parijs onder no. 1.092.

790 4 0 21 . 6 £ I ------ " “* ' ‘ —— j De ALV bevattende uitgangsvloeistof vordt bijvoorkeur bereid door voortkweken van een adeno achtig virus in eendeneieren of op een celcultuur van eendenembryofibroblasten^bijvoorbeeld in : een ntonolaag rolfles cultuur of een cultuur van cellen gehecht in 5 vaste inerte dragers· - Daartoe worden de uitgangscellen gesuspendeerd in een cultuur medium, bestaande tenminste uit 75-95 delen Eagle medium met al of niet 5-15 delen kalverserum, , een waterige natriumbicarbonaat oplossing van 2-4% en 1-5 10 · delen van een oplossing of suspensie van een of meer antibiotica zoals penicilline G, streptomycine en natamycine. Als de celcultuur bijna gesloten is, wordt de cultuurvloeistof afgescheiden en vindt infectie met de virussuspensie plaats, incubatie gedurende 0,5-2 uur bij 37eC t*b#v* de aanhechting van het virus en toevoegen van onder- 15 houdsmedium dat bestaat uit Eagle* s medium met 2-10% halver serum ,4-6¾ tryotosefosfaat bouillon (30g/l)j en de hiervoor genoemde additieven· Het oogsten van het virus bevattende medium en cellen gebeurt 0,5-2 dagen na verschijnen van het CPE.

20 De celcultuur wordt geïnfecteerd met een ALV suspensie van • een activiteit van > 30 x 10δ TCID 50/rolcultuurfles. Opgemerkt t dient te worden in dit verband dat de toepassing van celsuspensie-cuitures van de hiervoorbesproken werkwijze niet geschikt bleek.

Volgens een geschikte uitvoeringsvorm· van de werkwijze ter 25 bereiding van een geschikte reo virus bevattende vloeistof, wordt het virus voortgekweekt in een SPF1 kippe embryofibroblastencultuur, bijvoorbeeld in een monolaag rolfles cultuur of een cultuur van cellen gehecht op vaste inerte dragers en bij voorkeur een monolaag rol-flescultuur, of in voorbebroede kippeëieren vrij van afveerstoffen 30 _ tegen aviaire reo virussen·

Bij voorkeur wordt een celcultuur gebruikt, verkregen door suspendering van de uitgangscellen in een cultuurmedium, bestaande tenminste uit 75-95 delen Eagle medium met al of niet 5-1 5 delen kalverserum, een waterige natriumbicarbonaat oplossing van 2-4% en 35 1-5 delen van een oplossing of suspensie van een of meer antibiotica zoals penicilline G, streptomycine en natamycine, en afscheiden van _de cultuurvloeistof als de celcultuur monolaag bijna is gesloten· 790 40 21 c ----- : ” ' i

De antibiotica oplossing bevat bijv· 2-3 x 104 eenheden penicilline, j 20-30 mg streptomycine en 0,4-0,8 mg natamycine per ml»

Na infectie met de virussuspensie wordt 0,5-3 uur bij 37°C gelncubeerd t.b.v· de aanhechting van het virus en wordt onder- 5 houdsmedium toegevoegd dat bestaat uit Eagle's onderhoudsmedium met 4-6 delen kalverserum, 3-6 delen tryptose fosfaat bouillon ( 30 g/l) en de hiervoor genoemde additieven, en het virus bevattende -medium en cellen worden geoogst na 0,5-3 dagen na het verschijnen van het CPE.

10 De celcultuur wordt bij voorkeur geïnfecteerd met een reo ; 6 δ virus suspensie van een activiteit van 2x10 - 10 TCID 50 /rolcul- tuurfles en bij voorkeur ^ 30 x 10^ TCID 50 / rolcul tuur fles·

Het inactiveren van de uitgangsvirus vloeistof kan met de gebruikelijke inactivatoren geschieden zoals bijvoorbeeld m.b.v· 15 β-propiolacton, al of niet in combinatie met een stabilisator, of formaldehyde. Bijvoorbeeld kan β-propiolacton worden toegevoegd in een concentratie van 0,05 tot 0,25 gev.% (berekend op gewicht van de waterfase) 'aan de gebufferde virus bevattende vloeistof en deze vloeistof hierna gedurende 1-2 uur en bij voorkeur gedurende 90 minu-20 ten worden gelncubeerd bij ongeveer 37°C· Hierna worden de virus ! vloeistoffen zonodig gehomogeniseerd op de gebruikelijke wijze· Aan j de waterfase kan hierna eventueel ook een conserveringsmiddel worden ! toegevoegd, zoals bijvoorbeeld thiomersal of formaline in buffer· i Voor de bereiding van de gecombineerde vaccins wordt ’ 25 J 50 tot 200 ml van een ALV bevattende vloeistof geïnactiveerd, al of ' niet gehomogeniseerd en samen met 1 50 - 300 ml van een reo virus bevat- i tende vloeistof, die vooraf is geïnactiveerd en al of niet gehomoge-: niseerd toegevoegd aan 500-700 ml van een oliefase van de hiervoor ! genoemde samenstelling.

30 j De volume verhouding tussen de ALV bevattende vloeistof : en de reo virus bevattende vloeistof kan variëren van 4:3 tot 1;6 en i ! bijvoorkeur ongeveer 1:3· 1 De volume verhouding tussen de waterfase gevormd door de . beide virusvloeistoffen en de oliefase kan variëren van 1:1 tot 3:7 35 1 en ligt bijvoorkeur ongeveer bij 7:13· I- Gevonden werd dat de waterfase onder krachtig roeren en/of 790 40 21 _ 8 ” ! : 1 homogeniseren aan de oliefase moet vorden toegevoegd ter verkrijging van de gewenste, stabiele en dunvloeibare eindemulsie·

De oliefase bevat 2-20 gew*% (berekend op gewicht oliefase) j emulgator en bijvoorkeur 2-15 gew«% Arlacel A^, Arlacel®30 of 5 ; Span^ 8o en 0,2-4% Tween*3 80· De componenten van de oliefase vorden bijvoorkeur afzonderlijk tot minstens 110°C in een autoclaaf verhit ; of als mengsel steriel gefiltreerd·

Voor het verkrijgen van geschikte combinatie vaccins met * de gewenste gunstige eigenschappen dient te vorden uitgegaan van I . 2 10 ; een ALV vloeistof met een aktiviteit van tenminste 10 KA eenheden 3 en bijvoorkeur 10 HA eenheden en van een reo virus vloeistof met een titer van 10^ - 10^ ΞΙΰ^φ/πύ. en bijvoorkeur > TOS,0BID^0/ml.

De aldus bereide vaccins vorden toegediend aan slacht-kuiken moederdierenbi jvoorkeur van 10 tot 20 weken oud, voordat 15 zij aan de leg komen·

Het zal duidelijk zijn dat de, bij toepassing van de combinatievaccins vgl» de uitvinding, optredende immunologische respons jlie voor ieder der virus componenten minstens van dezelfde grootte orde werd gevonden te zijn als die veroorzaakt door de 20 afzonderlijke virusvaccins,op geen enkele wijze door een deskundige kon worden voorzien of voorspeld, omdat deze immunologische response van het,combinatievaccin t*o#v» een of beide afzonderlijke mono-vaccins i*v*m* een aantal zeker vooraf niet uit te sluiten ongewenste wisselwerkingen tussen de virusvloeistofcomponenten onder-25 ling of met een der toegepaste hulpchemicalien, zouden kunnen teruglopen tot een onaanvaardbaar niveau· Bijvoorbeeld zou kunnen vorden verwacht dat toegepast 3-propiolacton langer inactiverend werkzaam zou blijven in verband met een minder snelle afbraak in het mengsel* 30 De toepassing van het gecombineerde vaccin vgl* de uit vinding heeft als voordeel dat een kleiner volume per keer, met als gevolg minder plaatselijke irritaties, en een kleinere hoeveelheid lichaamsvreemde chemicaliën behoeft te worden toegediend ofwel minder afzonderlijke vaccinaties nodig zijn, terwijl bovendien de 35 eerdergenoemde problemen met betrekking tot menging en het optreden -van vreemde smetstoffen worden vermeden* 790 4 0 2 1 - 9 - « ✓ " 1 " ' ! " i

De uitvinding wordt toegelicht aan de hand van de volgende! voorbeelden·

Voorbeeld 1

Bereiding gecombineerd ALV . ./reo virus vaccin.

5 a) Kweek Adeno achtig virus (gepassageerde 127 stam)

Uit 12/13 dagen bebroede eendeneieren worden in (Bellco) rolcultuurflessen celculturen aangelegd van EBF in Eagle medium dat 10¾ kalverserura medium, Of 22 gew·* NaHCO^ en 2 vol· % anti-biotica-oplossing bestaande uit penicilline G» streptomycine en 10 natamycine·

Het medium wordt afgezogen als de celculturen bijna gesloten zijn. De culturen worden dan geënt met de gepassageerde 127 virussuspensief 1 uur geïncubeerd bij 37°C en daarna wordt Eagle onderhoudsmedium waarin 5¾ kalverserum, 4 vol·¾ tryptose fosfaat 15 bouillon (30g/l), 0t22 gew.* NaHC03 en 2 vol.* van eerdergenoemde anti biotica oplossing opnieuw toegevoegd·

Het ALV bevattende medium met de cellen wordt geoogst 1 dag na verschijnen van een CPE en de cellen bijna loslaten van de glaswand. De virussuspensie wordt ingevroren bij -20°C of lager 20 en bewaard voor vaccin productie· Van deze suspensie worden de HA— titer en de TCID^ bepaald· b) Kweek reo virus (stam L/Z 671) I Uit 10 dagen bebroede kippeëieren worden in (Bellco) rolcultuurflessen celculturen aangelegd van KEF in Eagle medium met 10* kalver- { 25 : serum, dat 0,22 gew·* NaHC03 en 2 vol·* .antibiotica-oplossing,bevat- ; tend penicilline G, streptomycine en natamycine.

j Het medium wordt afgezogen als de celculturen (monolayers) | bijna gesloten zijn· De culturen worden dan g'eënt met L/z 671 virussuspensie en daarna aangevuld met Eagle onderhoudsmedium, waarin 30 4 vol.* kalverserum, 4 vol·* tryptose fosfaat bouillon (30g/l), 0,22 gew·* NaHC03 en 3 vol.* van eerder genoemde antibiotica oplossing.

Het reo virus bevattende medium met de cellen wordt geoogst : 1 dag na verschijnen van een CFE.

35 _ De virussuspensie wordt ingevroren bij -20eC of lagere j 790 40 21 -io- f temperatuur en bewaard voor vaccin productie· Van deze suspensie j wordt een TCID^q bepaald· ! c) Behandeling virussuspensie·

De ingevroren virussuspensies worden ontdooid en in een waterbad ge— 5 ; inactiveerd met 0,05-0,25¾ β-propiolacton gedurende 90 minuten bij 37eC# De suspensies worden overnacht bewaard bij +4°C· De inactive-ring wordt gecontroleerd door de vorming na te gaan van CPE op 3EF o£ ISF en aansluitend de uitvoering van een haemabsorptietest· Boven-: dien worden voorbebroede SPF kippeëieren met het geïnactiveerde vi-10 | rusmateriaal gelncubeerd en aansluitend gecontroleerd·

De virussuspensies worden gehomogeniseerd met een Ultra Turrax homogenisator» Eventueel wordt de suspensie verdund met P3S +· 0,3¾ formaline, afhankelijk van TCID^ van de reo virus suspensie en HA—titer van adeno virus suspensie· Reo virus suspensie en adeno— 15 virussuspensie worden daarna gemengd in de verhouding 6:4 en gebruikt voor de emulsieberaiding* d) Bereiding emulsie·

De virussuspensies worden gemengd met de oliefase in de verhouding 6,5 delen olie /3,5 delen virusvloeistof en geëmulgeerd,zodat de 20 deeltjesgrootte van de waterfase ca· 0,05-0,5μ bedraagt, bijv· door • i injecteren van de virussuspensie in de oliefase onder gelijktijdig homogeniseren met een Ultra Turrax homogenisator of d.m.v· het doorleiden van het uitgangsmengsel door een colloid molen·

De gebruikte oliefase heeft de volgende samenstelling: 25 Harcol^ 52 (witte paraffinische Ssso olie) 93,δ vol.%

Arlacel®A of Arlacel® 30 of Spai^ 80 (mannide mono- oleaat) 6,0 volr%

Tweeri^ 80 (polyoxyethylene 20 sorbitan monoöleaat) 0,4 vol»%

De componenten van de oliefase worden afzonderlijk bij 30 110°C geautoclaveerd, of als mengsel steriel gefiltreerd·

Verkregen werd een stabiele emulsie, getest door: 1) direct na eraulgering druppels emulsie op een wateroppervlak te pipetteren waarbij de druppels niet verspreiden maar intact blijven.

2) 4 weken laten staan bij 37ÖC, waarbij zich geen waterfase af- 35 scheidt*

Het verkregen vaccin wordt gebruikt in een dosering van —0^-5 ml per dier -intramusculair-in -bor-s-t of—pootspieren -of -subcutaaa- 790 4021 _ / in de ziek* Vanaf 8 dagen na de enting zijn haemagglutinatie remmende ALV-antistoffen aantoonbaar. Vanaf 10 dagen van de enting zijn i precipiterende reo virus antistoffen aantoonbaar.

Voorbeeld 2 5 Bereiding gecombineerd ALV/reo virus vaccin* a) Kweek Adeno achtig virus (gepassageerde 127 stam) 9 dagen bebroede eendeneieren worden geënt met de gepassageerde 127 virusstam. Na 7 dagen incuberen bij 37eC wordt de AAV (amnion allantois vloeistof) geoogst. Het AAV bevat dan ongeveer 1024 HA een-10 j heden. De virussuspensie wordt vervolgens ingevroren bij -20°C en beswaard voor vaccin productie.

| b) Kweek reo virus (stam L/Z 671) | 10 dagen bebroede SPF eieren worden geënt met LZ 671 zaaivirus. Na I 76 uren incuberen bij 37°C wordt de AAV (amnion allantoische vloei-

C C

15 ' stof) geoogst. Het AAV bevat dan ca. 10 * EID5Q/ml. De virussuspen sie wordt ingevroren bij -20eC of lagere temperaturen en bewaard voor vaccin productie, c) Behandeling virussuspensie

De ingevroren virussuspensies worden ontdooid en geïnactiveerd met 20 I formaline. (0,3%). De suspensies worden overnacht bewaard bij +4°C. De ! inactivering wordt gecontroleerd door de vorming na te gaan van CPE

; of KEF of controle van geëmbryoneerde SPF kippeëieren na inoculatie | 1 met het geïnactiveerde virusmateriaal.

i De virussuspensies worden gehomogeniseerd met een Ultra

25 ! Turrax homogenisator. Eventueel wordt de, suspensie verdund met PBS

| +0,3% formaline, afhankelijk van TCID^0 of EID^. j De virussuspensies van ALV en reo virus worden daarna ! gemengd in de verhouding 1:4 en gebruikt voor emulsie bereiding, j d) Bereiding emulsie- 30 1 De virussuspensies worden gemengd met de oliefase in de verhouding ! 6,5 delen olie /3,5 delen virusvloeistof en geëmulgeerd zodat de deeltjesgrootte van de waterfase ca. 0,05-0,5p bedraagt. Het emulgeren kan bijv. worden uitgevoerd rn.b.v, een Ultra Turrax homogenisator of d.m.v. doorleiden van het uitgangsmengsel door een colloid 3 5 -molen.

790 4 0 2 1 ~12“

De gebruikte oliefase heeft de volgende samenstelling: Marcol^ 52 (vitte paraffinische Ssso olie) 91»63» ; Arlacel Ji^f'Arlace^^ 80 of Spaxi^O (mannide monoöleaat) 6f0?* ' Tveen^O (polyoxyethyleen 20 sorbitan monoöleaat) 2»4% 5 De componenten van de oliefase worden afzonderlijk bij 110®C geautoclaveerd of het mengsel steriel gefiltreerd.

i i 790 4 0 21 -13 -

Claims (2)

1· Gecombineerd geïnactiveerd vaccin tegen tenminste door adeno achtig virus veroorzaakte eiproduktie dalingen en door reo virus veroorzaakte rachitis achtige verschijnselen, osteoperose c*q* 5 femur degeneratie* 2* Gecombineerd geïnactiveerd vaccin vgl* konklusie 1, met het kenmerk, dat dit is afgeleid van tenminste een adeno achtig virus bevattende vloeistof, verkregen door het voortkweken van een gepassageerde virusstam 127* 10 3* Gecombineerd geïnactiveerd vaccin vgl* konklusie 1, met het kenmerk, dat dit is afgeleid van tenminste een reo virus bevat-; tende vloeistof, verkregen door het voortkveken van het L/z 671 ί— virus* j 4* Gecombineerd geïnactiveerd vaccin vgl* konklusies 1-3, met het 15 i kenmerk, dat dit een oliefase bevatjdie als essentiele bestand delen tenminste een der componenten gekozen uit de groep be- , ί j staande uit lichte minerale oliën (FDA kwaliteit),* plantaardige j oliën en naftenische minerale oliën, en een of meer geschikte ' emulgatoren i.v.v. van alkylene oxide en/of van hexahydrische 20. alcoholen en/of van hogere natuurlijke vetzuren (c 0-C2j) af9e“ , leide, niet ionogene oppervlakte actieve stoffen, zoals esters en ester-ethers, bevat* 5* Gecombineerd geïnactiveerd vaccin vgl* de konklusies 1-4, met het kenmerk dat de volumeverhouding tussen de adenoachtige virus 25 bevattende vloeistof en de reo virus bevattende vloeistof kan variëren van 4:3 tot 1:6 en bijvoork.eur ongeveer 1:3* 6* Gecombineerd geïnactiveerd vaccin vgl* de konklusies 1-5, met het kenmerk dat de volumeverhouding tussen de waterige fase gevormd door de beide virusvloeistoffen en de oliefase kan variëren van 30 1:1 tot 3:7 en bijvoorkeur ligt bij 7:13* 7* Gecombineerd geïnactiveerd vaccin volgens de konklusies 1-6, met het kenmerk dat de oliefase bevat 2-20 gew*% emulgator en bijvoorkeur 2-1 5 gew*% Arlacel^. of Arlace^&O of Span 8(i®en 0,2-4% Tween 35 8* Werkwijze voor de bereiding van een gecombineerd geïnactiveerd vaccin tegen door adeno achtig virus veroorzaakte eiproduktie 790 4 0 2 1 - 14- « V dalingen en door reo virus veroorzaakte rachitisachtige verschijnselen, osteoperose c*q* femur degeneratie, vaarbij een ! i reo virus bevattende vloeistof vordt geinactiveerd.al of niet gehomogeniseerd en samen met een adeno achtig virus bevattende 5 vloeistof*die vooraf is geïnactiveerd en al of niet gehomoge niseerd, toegevoegd aan een oliefase, die als essentiele bestanddelen tenminste een der componenten gekozen uit de groep bestaande uit lichte.minerale oliën (PDA kwaliteit), plantaardige oliën en naftenische minerale oliën, en een of meer geschikte 10 emulgatoren i.v.v* van alkylene oxide en/of hexahydrische alcoholen en/of hogere natuurlijke vetzuren ( ) afgeleide, niet ionogene oppervlakte actieve stoffen, zoals esters en ester-ethers, bevat, vaarbij aan de waterfase al of niet een conserveringsmiddel kan zijn toegevoegd* 9. werkwijze vgl. konklusie 3, met het kenmerk dat als inactivator voor beide virusvloeistoffen β-propiolacton (al of niet in combinatie met een stabilisator) of formaldehyde wordt gebruikt* 10* Werkwijze vgl* konklusie 9, met het kenmerk, dat β-propiolacton wordt toegepast in een concentratie van 0,05-0,25 gev.2 of 20 formaldehyde in een concentratie van 0,02 tot 0,5 g^sw*^ (here- kend op het gewicht van de waterfase)·

11. Werkwijze vgl* konklusie 9 en 10, met het kenmerk dat 1-2 uren wordt geincubeerd bij 37°0* 12* Werkwijze vgl* konklusie 8, met het kenmerk dat wordt uitgegaan 5 5 7 5 25 van een reo virus vloeistof met een titer van 10 * -10 1 13* Werkwijze vgl* konklusie 8, met het kenmerk dat van een adeno ... . „2 achtig virus vloeistof met een aktiviteit van tenminste 10 HA eenheden wordt ui toegaan. 790 4 0 21 -is-