DE69333730T2

DE69333730T2 - Impfstoff, der acemannan als adjuvans enthält

Info

Publication number: DE69333730T2
Application number: DE69333730T
Authority: DE
Inventors: M. Robert NORDGREN
Original assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Priority date: 1992-01-17
Filing date: 1993-01-15
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2013-01-16
Also published as: ATE285791T1; WO1993014195A1; EP0626008A1; DE69333730D1; AU3478393A; JP3723205B2; IL104382A0; DK0626008T3; EP0626008A4; ZA93216B; EP0626008B1; ES2236685T3; JPH07506565A

Description

Hintergrund der Erfindung
Ein Ansatz zur Kontrolle der Ausbreitung von Viruserkrankungen ist die Verabreichung von modifizierten Lebendviren als Impfstoffe. Solche Impfstoffe können jedoch nicht zu 100% wirksam sein. Der Zusatz eines Adjuvans zu einem Impfstoff verstärkt die Immunogenität des Impfstoffs und verstärkt dadurch seine Schutzkapazität.
Marek's Disease bereitet der Geflügelindustrie ernsthafte Sorgen. Die Infektion mit dem Marek-Virus kann eine tödliche lymphoproliferative Erkrankung verursachen und zu signifikanten Verlusten der wesentlichen Produktionsparameter führen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Unverwertbarkeit durch Leukose. Andere Produktionskennzahlen einschließlich Sterblichkeit, Futterumsatz und Gesamtkosten pro Küken können auch durch schwere Ausbrüche der Krankheit beeinflusst werden. Es wurde versucht, die Krankheit zu kontrollieren, indem modifizierte Lebendvirus-Impfstoffe, in erster Linie ein modifiziertes Lebend-Putenherpesvirus(Marek-Virus Serotyp III)-Impfstoff, verwendet wurden. Obwohl die Impfung mit Putenherpesvirus (HVT) als hoch effektiv bei der Prävention der Marek's Disease angesehen wird, tritt weiterhin Verlust bei Unverwertbarkeit auf niedrigem Niveau durch Feldexposition, Immunsuppression und die offenkundige Erkrankung durch eine Exposition mit sehr virulenter Marek's Disease (vvMD) auf. Die Kontrolle der sehr virulenten Marek's Disease wurde mit den bivalenten Marek-Virus Serotyp-II- und III-Impfstoffen versucht. Die Verwendung der Impfstoffe geht jedoch mit einem Anstieg der lymphoiden Leukose in bestimmten Vogelzüchtungen einher (Bacon et al., 1989).
Aduvans enthaltende Impfstoffe mit verbesserter Schutzkapazität würden dabei helfen, die Verluste zu eliminieren, die weiterhin trotz der Verwendung der gegenwärtig existierenden Marek's-Disease-Impfstoffe auftreten und wären daher von großem Wert für die Geflügelindustrie.
Das Blatt der Pflanze Aloe barbadensis (Aloe vera) enthält große Mengen eines β-(1,4)-verknüpften, acetylierten Mannans, bekannt als Acemannan, ein wasserlösliches Polymer von etwa einer Million kDa. Die Herstellung von Acemannan wird in den U.S.-Patenten Nr. 4,735,935 (5. April, 1988), 4,851,224 (25. Juli, 1989), 4,971,890 (17. April, 1990), 4,957,907 (18. September, 1990), 4,959,214 (25. September, 1990) und 4,966,892 (30. Oktober, 1990) offenbart. Die Verwendung von Acemannan als ein Adjuvans zur Verbesserung der Schutzkapazität eines Impfstoffs wurde zuvor nicht beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Puten-Herpesvirus-Impfstoff, enthaltend ein Acemannan-Adjuvans, einen modifizierten Lebendvirus-Impfstoff, enthaltend ein Acemannan-Adjuvans, und einen modifizierten Lebendvirus-Impfstoff, enthaltend ein komplexes Kohlenhydrat-Adjuvans, bereit.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt einen Puten-Herpesvirus-Impfstoff bereit, der pro Dosis eine wirksame immunisierende Menge eines modifizierten Lebend-Putenherpesvirus, ein Acemannan in einer zur Verstärkung der Immunogenität des Putenherpesvirus wirksamen Menge und einen geeigneten Träger umfasst. Diese Erfindung stellt auch einen Impfstoff bereit, der pro Dosis eine wirksame immunisierende Menge eines modifizierten Lebendvirus, ein Acemannan in einer zur Verstärkung der Immunogenität des modifizierten Lebendvirus wirksamen Menge und einen geeigneten Träger umfasst. Diese Erfindung stellt weiterhin einen Impfstoff bereit, der pro Dosis eine wirksame immunisierende Menge eines modifizierten Lebendvirus, ein komplexes Kohlenhydrat in einer zur Verstärkung der Immunogenität des modifizierten Lebendvirus wirksamen Menge und einen geeigneten Träger umfasst, wobei das komplexe Kohlenhydrat aus Mannan, Glucan und Lävan ausgewählt ist. Ein Verfahren zur Immunisierung eines Kükens gegen Marek's Disease und Verfahren zur Immunisierung eines Tieres gegen virale Erkrankungen werden auch durch diese Erfindung bereitgestellt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung stellt einen Putenherpesvirus-Impfstoff bereit, der pro Dosis eine wirksame immunisierende Menge eines modifizierten Lebend-Putenherpesvirus (HVT), ein Acemannan in einer zur Verstärkung der Immunogenität des Putenherpesvirus wirksamen Menge und einen geeigneten Träger umfasst. Zum Zwecke der Erfindung ist eine „wirksame immunisierende Menge" eines modifizierten Lebend-Putenherpesvirus eine beliebige Menge des modifizierten Lebend-Putenherpesvirus, die wirksam ist, eine Immunität auf ein Geflügel zu übertragen. In der Praxis dieser Erfindung ist die „wirksame immunisierende Menge" des modifizierten Lebend-Putenherpesvirus wünschenswert eine Menge, die größer als 1000 Plaque-bildende Einheiten („plaque forming units") ist. Vorzugsweise ist die wirksame immunisierende Menge des modifizierten Lebend-Putenherpesvirus eine Menge, die größer als 3000 Plaque-bildende Einheiten ist.
Es ist wohlbekannt, dass das Putenherpesvirus ein Zell-assoziiertes Virus ist. Entsprechend kann der HVT-Impfstoff dieser Erfindung eine wirksame immunisierende Menge des modifizierten Lebend-Putenherpesvirus in mit Putenherpesvirus infizierten Zellen sein. Wünschenswerterweise ist die wirksame immunisierende Menge des modifizierten Lebend-Putenherpesvirus die Menge, die in etwa 20.000 HVT-infizierten Zellen vorhanden ist. Typischerweise werden mit Putenherpesvirus infizierte Zellen in einem Kulturmedium, das zur Erhaltung der Zellen in einem lebensfähigen Zustand geeignet ist, suspendiert.
Zum Zwecke dieser Erfindung kann das „modifizierte Lebend-Putenherpesvirus" ein beliebiges avirulentes oder attenuiertes Putenherpesvirus sein, das in der Lage ist, eine Immunantwort in einem mit dem Virus geimpften Tier hervorzurufen, zum Beispiel das avirulente Puten-Herpesvirus des Stamms FC126, erhältlich von der American Type Culture Collection (ATCC Zugangs-Nr. VR 584B).
Wie oben festgestellt wurde, umfasst der erfindungsgemäße Puten-Herpesvirus-Impfstoff „ein Acemannan". Wie im U.S.-Patent Nr. 4,851,224 offenbart wird, ist Acemannan eine polydispergierte Polysaccharid-Verbindung mit mindestens 73% Acemannan-Polymeren mit einem Molekulargewicht von mehr als 100.000 Dalton. Das U.S.-Patent Nr. 4,957,907 offenbart, dass Acemannan-Polymere aus β(1→4)-verknüpften Mannosyl-Einheiten besteht und dass die Acetylgruppen mit dem Polymer durch ein Sauerstoffatom verbunden sind, wobei der Grad der Acetylierung etwa 0,8 Acetylgruppen/Monomer beträgt, wie es durch das alkalische Hydroxamat-Verfahren von Hestrin (J. Biol. Chem., 180: 240 (1949)) bestimmt wurde. Weiterhin wird eine Analyse der Verknüpfung der neutralen Zucker offenbart, die anzeigt, dass verknüpft mit dem Polymer, wahrscheinlich durch eine α-(2→6)-Verknüpfung, ein D-Galactopyranoserest im Verhältnis von eins zu etwa allen 70 Zuckern angefügt ist. Das Verhältnis von Mannose zu Galactose von 20 : 1 zeigt an, dass auch die Galactose-Einheiten, vorrangig durch β(1→4)-glycosidische Bindungen, verknüpft sind. Die chemische Struktur eines Acemannan-Polymers, wie sie im U.S.-Patent Nr. 4,957,907 offenbart wird, ist wie folgt:
Das Acemannan kann ein Extrakt aus dem Blatt der Pflanze Aloe barbadenis sein. Der Begriff „Acemannan" wie er hier gebraucht wird, umfasst jedoch nicht nur diesen Extrakt, sondern Acemannan aus einem beliebigen Verfahren, einschließlich chemischer Synthese oder Herstellung in der Gewebekultur.
In der Praxis dieser Erfindung ist die „wirksame Menge" an Acemannan typischerweise eine Menge, die größer als etwa 50 Mikrogramm ist, wünschenswerter eine Menge von etwa 50 Mikrogramm bis etwa 1000 Mikrogramm. Noch wünschenswerter ist die wirksame Menge an Acemannan eine Menge von etwa 50 Mikrogramm bis etwa 150 Mikrogramm. In der vorliegenden bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist die wirksame Menge des Acemannan eine Menge von etwa 100 Mikrogramm.
Geeignete Träger für einen Impfstoff gemäß der Praxis dieser Erfindung können ein beliebiger aus einer Anzahl wässriger Puffer sein, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Derzeit bevorzugte wässrige Puffer sind Phosphatpuffer, z. B. die in den folgenden Beispielen beschriebenen Phosphatpuffer.
Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Immunisierung eines Kükens gegen Marek's Disease bereit, das die Verabreichung einer Dosis des erfindungsgemäßen Putenherpesvirus-Impfstoffs an das ein Tag alte Huhn umfasst. Es wird derzeit bevorzugt, dass der Impfstoff durch subkutane Injektion oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht wird.
Diese Erfindung stellt weiterhin einen Impfstoff bereit, der pro Dosis eine wirksame immunisierende Menge eines modifizierten Lebendvirus, ein Acemannan in einer zur Verstärkung der Immunogenität des modifizierten Lebendvirus wirksamen Menge und einen geeigneten Träger umfasst. Zum Zwecke dieser Erfindung ist eine „wirksame immunisierende Menge" eines modifizierten Lebendvirus eine beliebige Menge des modifizierten Lebendvirus, die in der Lage ist, eine Immunität auf ein Tier zu übertragen. Verfahren zur Bestimmung einer wirksamen immunisierenden Menge eines modifizierten Lebendvirus sind dem Fachmann wohlbekannt oder sie können leicht ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden. In der Praxis dieser Erfindung ist die wirksame immunisierende Menge des modifizierten Lebendvirus typischerweise eine Menge, die größer als 1.000 Plaque-bildende Einheiten ist. Für den Zweck dieser Erfindung kann das „modifizierte Lebendvirus" ein beliebiges avirulentes oder attenuiertes Virus sein, das in der Lage ist, eine Immunantwort in einem mit dem Virus geimpften Tier zu induzieren.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung kann das modifizierte Lebendvirus ein modifiziertes Lebend-Vogelvirus sein. Geeignete Vogelviren umfassen modifizierte Lebend-Marek-Viren, wie Putenherpesvirus Stamm FC126, oder Marek-Virus Serotyp I, z. B. Stamm R2-23 oder Stamm CVI-988, oder ein Marek-Virus Serotyp II, z. B. Stamm 301-B1. Geeignete Viren umfassen auch modifizierte Lebend-Newcastle-Disease-Viren, z. B. Newcastle-Disease-Virus Stamm B1B1 oder den LaSota-Stamm. Geeignete Vogelviren umfassen weiterhin modifizierte Lebend-Infectious-Bursal-Disease-Viren, z. B. Infectious-Bursal-Disease-Virus Lukert-Stamm (Bursin-2) oder den 2512-Stamm. Geeignete Vogelviren umfassen noch weiter modifizierte Lebend-Infectious-Bronchitis-Viren, z. B. Infectious-Bronchitis-Virus der Stämme Mass., Conn. oder Ark.. Geeignete Vogelviren umfassen noch weiter modifizierte Lebend-Vogel-Reoviren, z. B. Vogel-Reovirus Stamm 1133.
In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung kann das modifizierte Lebendvirus ein modifiziertes Lebend-Schweinevirus sein, z. B. ein modifiziertes Lebend-Pseudowut-Virus, Lebend-Coronavirus oder Lebend-Parvovirus.
In noch einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung kann das modifizierte Lebendvirus ein modifiziertes Lebend-Katzenvirus sein, z. B. ein modifiziertes Lebend-Katzen-Leukämievirus, -Katzen-T-Zell-Leukämievirus oder -Katzen-Immundefektvirus.
In noch einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung kann das modifizierte Lebendvirus ein modifiziertes Lebend-Hundevirus sein, z. B. ein modifiziertes Lebend-Hunde-Coronavirus, Lebend-Hunde-Parvovirus oder Lebend-Hunde-Staupe-Virus.
Wie vorstehend festgestellt wurde, umfasst der Impfstoff dieser Erfindung „ein Acemannan". Das Acemannan kann ein Extrakt aus dem Blatt der Pflanze Aloe barbadensis sein. Der Begriff „Acemannan", wie er hier gebraucht wird, umfasst jedoch nicht nur diesen Extrakt, sondern Acemannan aus einem beliebigen Verfahren, einschließlich chemische Synthese oder Herstellung aus Gewebekultur. In solchen Impfstoffen ist die wirksame Menge des Acemannan typischerweise eine Menge, die größer als 50 Mikrogramm ist, wünschenswert eine Menge von etwa 50 Mikrogramm bis etwa 1.000 Mikrogramm.
Diese Erfindung stellt auch einen solchen Impfstoff bereit, der weiterhin einen zweiten modifizierten Lebendvirus umfasst. Das erste modifizierte Lebendvirus und das zweite modifizierte Lebendvirus können modifizierte Lebend-Vogelviren sein. In einer Ausführungsform dieser Erfindung kann das erste modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Puten-Herpesvirus sein und das zweite modifizierte Lebend-Vogelvirus kann ein modifiziertes Lebend-Marek-Virus Serotyp I, -Marek-Virus Serotyp II, -Newcastle-Disease-Virus, -Infectious-Bronchitis-Virus, -Infectious-Bursal-Disease-Virus oder -Vogel-Reovirus sein. In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung kann das erste modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Marek-Virus Serotyp I sein und das zweite modifizierte Lebend-Vogelvirus kann ein modifiziertes Lebend-Marek-Virus Serotyp II, -Newcastle-Disease-Virus, -Infectious-Bronchitis-Virus, -Infectious-Bursal-Disease-Virus oder -Vogel-Reovirus sein. In noch einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung kann das erste modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Newcastle-Disease-Virus sein und das zweite modifizierte Lebend-Vogelvirus kann ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bronchitis-Virus, -Infectious-Bursal-Disease-Virus oder -Vogel-Reovirus sein. In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung kann das erste modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bronchitis-Virus sein und das zweite modifizierte Lebend-Vogelvirus kann ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bursal-Disease-Virus oder -Vogel-Reovirus sein. In noch einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung kann das erste modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bronchitis-Virus sein und das zweite modifizierte Lebend-Vogelvirus kann ein modifiziertes Lebend-Vogel-Reovirus sein.
Das erste modifizierte Lebendvirus und das zweite modifizierte Lebendvirus kann auch ein modifiziertes Lebend-Schweinevirus, ein modifiziertes Lebend-Katzenvirus oder ein modifiziertes Lebend-Hundevirus sein.
Diese Erfindung stellt weiterhin einen solchen Impfstoff bereit der weiterhin ein drittes modifiziertes Lebendvirus umfasst.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Immunisierung eines Tieres gegen eine virale Erkrankung bereit, welches die Verabreichung einer Dosis des erfindungsgemäßen Impfstoffs an das Tier umfasst. Das Tier kann ein ein Tag altes Geflügel sein, d. h. ein ein Tag altes Küken, eine ein Tag alte Pute, Ente oder Wachtel. Das Tier kann auch ein Schwein sein. Das Tier kann weiterhin eine Katze sein. Das Tier kann noch weiter ein Hund sein. Das geeignete Alter, bei dem der Impfstoff dem Tier verabreicht werden soll, und die Intervalle bei denen, wenn nötig, Auffrischungsimpfstoff verabreicht werden soll, ist dem Fachmann wohlbekannt oder kann leicht ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden. Der Impfstoff kann oral, durch Augentropfen, durch subkutane Injektion oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden.
Diese Erfindung stellt einen Impfstoff bereit, der pro Dosis eine wirksame immunisierende Menge eines modifizierten Lebendvirus, eine Menge eines komplexen Kohlenhydrats, die wirksam zur Verstärkung der Immunogenität des modifizierten Lebendvirus ist, und einen geeigneten Träger umfasst. Zum Zwecke dieser Erfindung ist eine „wirksame immunisierende Menge" eines modifizierten Lebendvirus eine beliebige Menge des modifizierten Lebendvirus, die wirksam ist, um Immunität auf ein Tier zu übertragen. Verfahren zur Bestimmung einer wirksamen immunisierenden Menge eines modifizierten Lebendvirus sind dem Fachmann wohlbekannt oder können durch Routineexperimente leicht bestimmt werden. In der Praxis dieser Erfindung ist die wirksame immunisierende Menge eines modifizierten Lebendvirus typischerweise größer als 1.000 Plaque-bildende Einheiten. Das modifizierte Lebendvirus kann ein beliebiges avirulentes oder attenuiertes Virus sein, das in der Lage ist, eine Immunantwort in einem mit dem Virus geimpften Tier hervorzurufen. In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist das modifizierte Lebendvirus ein modifiziertes Lebend-Vogelvirus, z. B. modifiziertes Lebend-Putenherpesvirus.
Wie vorstehend festgestellt wurde, umfasst der erfindungsgemäße Impfstoff ein komplexes Kohlenhydrat. Verfahren zur Bestimmung einer „wirksamen Menge" eines komplexen Kohlenhydrats sind dem Fachmann wohlbekannt oder können durch Routineexperimente leicht bestimmt werden. Typischerweise ist die wirksame Menge des komplexen Kohlenhydrats eine Menge, die größer als 50 Mikrogramm ist, wünschenswert eine Menge von etwa 50 Mikrogramm bis etwa 1.000 Mikrogramm. In einer Ausführungsform dieser Erfindung kann das komplexe Kohlenhydrat ein Mannan, z. B. ein β-(1→4)-verknüpftes Mannan sein. Vorzugsweise ist das β-(1→4)-verknüpfte Mannan ein Acemannan. In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung kann das komplexe Kohlenhydrat ein Glucan sein, z. B. ein β-(1→3)-verknüpftes Glucan. Ein in der Praxis dieser Erfindung nützliches β-(1→3)-verknüpftes Glucan kann ein Lentinan sein. Glucane sind Polysaccharidverbindungen mit Polymeren aus Glucoseeinheiten. In noch einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung ist das komplexe Kohlenhydrat ein Lävan, z. B. ein β-(2→6)-verknüpftes Lävan. Ein β-(2→6)-verknüpftes Lävan, das in der Praxis dieser Erfindung nützlich ist, kann ein Lävan aus Aerobacter levanicum sein.
Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Immunisierung eines Tieres gegen virale Erkrankung bereit, das die Verabreichung einer Dosis des erfindungsgemäßen Impfstoffs an das Tier umfasst. Das Tier kann ein Geflügel sein, z. B. ein Huhn, eine Pute, Ente oder Wachtel.
In der Praxis dieser Erfindung kann die wirksame Menge des Acemannan nach einer Zeitspanne nach der vorangegangenen Verabreichung dem Tier wiederverabreicht werden. Geeignete Zeitspannen zwischen den Verabreichungen von Acemanan sind dem Fachmann wohlbekannt oder können leicht ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden.
Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele besser verstanden werden. Jedoch wird der Fachmann erkennen, dass die spezifischen angeführten Beispiele nur zur Veranschaulichung der Erfindung dienen, die in den nachfolgenden Ansprüchen vollständiger beschrieben wird.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung eines Puten-Herpesvirus-Impfstoffs
Puten-Herpesvirus (HVT) wurde von der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 als elfte Passage in Entenembryo-Fibroblasten erhalten. Das FC#126 Puten-Herpesvirus (derzeit verfügbar als ATCC-Zugangs-Nr. VR 584B) kann der Stamm sein, der verwendet wird, um den Marek's-Disease-Impfstoff herzustellen. Der Impfstoff enthält Zellkulturmaterial, enthaltend 100% HVT und Stabilisator.
Jede Virus-Stammkultur ("X") wird durch die charakteristische cytopathogene Wirkung (CPE) in Fibroblastenzellen aus Hühnerembryonen (CEF) identifiziert, die Haufen aus abgerundeten, lichtbrechenden und zerstörten Zellen enthalten. Die Stammkultur ("X") wird spezifisch durch einen Agar-Geldiffusionstest oder durch die spezifische direkte Reaktion der infizierten Zellen mit Fluorescein-verknüpftem anti-Puten-Herpesvirus-Serum identifiziert.
Das Puten-Herpesvirus ist avirulent.
Jede Charge der für die Herstellung der Virus-Stammkultur ("X") verwendeten CEF-Zellen wurde in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.26(a) (2), 113.26(a) (3), 113.30 und 113.51(c) geprüft. Die Stammkultur wurde in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.300 und 113.330 und spezifisch in Übereinstimmung mit 113.27, 113.28, 113.31, 113.34 und 113.37 geprüft. Die Stammkultur wurde in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.330 auf Sicherheit geprüft.
Die Stammkultur ("X") ist eine Suspension von lebenden mit Puten-Herpesvirus (HVT) infizierten Fibroblasten aus Hühnerembryonen (CEF). Die Suspension ist gefroren und wird in Ampullen bei –100°C oder kälter in der Dampfphase des flüssigen Stickstoffs oder in flüssigem Stickstoff gelagert.
Die Stammkultur ist die 16te Passage und wird als Passage "X" bezeichnet. Die Passage der Stammkultur ist im Bereich zwischen den 16ten und 19ten Passagen in der Zellkultur. Das Impfstoffvirus liegt im Bereich zwischen den 17ten und 20ten Passagen. Es folgt der schematische Zeitplan der Passage der Stammkultur:
SCHEMATISCHER ZEITPLAN DER PASSAGE DER VIRUSKULTUR
Alle Mediumkomponenten tierischen Ursprungs, die nicht durch Autoklavieren sterilisiert sind, werden spezifisch in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.53 auf Kontaminanten geprüft. Das Kulturmedium für Zellkulturen ist sowohl für die Stamm- als auch für die Produktionskultur identisch. Das Wachstumsmedium ist Eagle's Minimum Essential Medium mit Earle's Salzen und L-Glutamin.
Das Wachstumsmedium wird mit 5% Tryptosephosphatbrühe und 1% bis 5% fötalem Kälberserum ergänzt. Das Serum kann für 30 Minuten bei 56°C hitzebehandelt werden. Das Serum wird steril von Herstellern in Handel erhalten und erfüllt die Anforderungen von 9 C. F. R. 113.53. Das Serum kann durch Filtration, durch Gamma-Bestrahlung oder durch Behandlung mit beta-Propiolacton sterilisiert werden. Mit beta-Propiolacton sterilisiertes Serum wird auf Bakterien und Pilze in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.26, auf Mycoplasmen in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.28 und auf zusätzliche Viren in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.53(c) getestet. Mit gamma-Bestrahlung sterilisiertes Serum wird vor der gamma-Bestrahlung auf Bakterien und Pilze in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.26, auf Mycoplasmen in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.28 und auf zusätzliche Viren in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.53 getestet und für frei von diesen befunden. Serum kann von JRH Biosciences, 13804 West 107te Straße, Lenexa, Kansas 66215, oder von Metrix Company, 4400 Chavenelle Road, Dubuque, Iowa 52001-9673, bezogen werden.
Das Serum kann als Nährstoffzusatz in biologischen Wachstumssystemen verwendet werden und wird bei 7°C oder kälter für nicht mehr als ein Jahr nach Erhalt vom Hersteller gelagert.
Die in Zellkulturen verwendeten Hühnerembryonen sind neun bis elf Tage alt. Die Embryonen werden aus Eiern entnommen, die aus spezifischen Pathogen-freien (SPF) Scharen entnommen werden. Hühnereier zur Herstellung von Lebendvirus-Impfstoffen werden aus Scharen entnommen, die spezifisch auf die folgenden Agenzien geprüft und für frei davon befunden wurden: Vogel-Adenovirus (AAV), Vogel-Encephalomyelitis-Virus (AEV), Vogel-Leukose-Virus (ALV) oder Rous-Sarcoma-Antikörper A und B (RSV-RAV₁ und RSV-RAV₂), Gefügel-Pockenvirus (FPV), Infectious-Bronchitis-Virus (IBV) vom Typ Connecticut, Infectious-Bronchitis-Virus (IBV) vom Typ Massachusetts, Infectious-Laryngotracheitis-Virus (ILV), Newcastle-Disease-Virus (NDV), Mycoplasma gallisepticum (MG), Salmonella pullorum – Typhoid, Vogel-Influenzavirus – Typ A, Reovirus und Infectious-Bursal-Disease-Virus (IBDV).
Einhundert Prozent der Vögel wird im Alter zwischen 12 und 20 Wochen Blut entnommen. Blutproben werden auf die vorstehend erwähnten Krankheiten geprüft, außer auf Vogel-Encephalomyelitis-Virus (AEV). AEV-Tests können durchgeführt werden, nachdem die Schar in Produktion ist, jedoch bevor die Eier zur Impfstoff-Herstellung verwendet werden, wobei 50 Embryonen pro Test verwendet werden.
Die Überwachung wird erreicht, indem nicht weniger als 5% der Schar in etwa monatlichen Zeitabständen getestet werden. Die Testung kann durch die folgenden Labors durchgeführt werden: Solvay Animal Health Inc., Charles City, Iowa; SPAFAS Inc., Norwich, Connecticut; ISA Laboratories, Ithaca, New York; HY-Vac Laboratory Eggs Company, Gowrie, Iowa; State Laboratory of Minnesota, Minneapolis, Minnesota; State Laboratory of Ohio, Columbus, Ohio und Lasher Associates, Inc., Millsboro, Delaware.
Zellsuspensionen werden unter Verwendung von SPF-Eiern mit neun bis zwölf Tage alten Embryonen von Gallus gallus, Phosphate-Buffered-Saline (mit Phosphat gepufferte pysiologische Salzlösung, PBS), sterilem Trypsin und Minimum Essential Medium (MEM) oder Media 199 Wachstumsmedium gemäß dem nachstehenden Verfahren hergestellt. Medium #199 ist ein für den Fachmann leicht erhältliches Standard-Wachstumsmedium.
Die Eier werden mit einer Alkohol-Jodlösung desinfiziert. Wenn sie trocken sind; werden die Eier unter eine Laminar-Luftstromkammer gelegt und die Schale wird mit einer sterilen Pinzette aufgebrochen. Die Embryonen werden aseptisch aus ihren Membranen entfernt und in sterilen Petrischalen zusammengeführt. Die Köpfe werden mit modifizierten, sterilen, chirurgischen Scheren entfernt. Die Rümpfe und die Köpfe werden zusammengeführt, in sterile Behälter verteilt und dann mit PBS ohne enthaltene Antibiotika gewaschen. Die gewaschenen Embryonen werden dann in Trypsinierungsflaschen für eine letzte Waschung mit PBS überführt. Nach der letzten Waschung wird nicht mehr als 0,4% Trypsin in Antibiotika enthaltendem PBS zu den Flaschen gegeben. Die Suspension wird mit einem Magnetrührer gerührt, um die Zellen weiter zu dispergieren.
Die Zellen werden für kumulative Zeitspannen von nicht mehr als 100 Minuten aus den Embryorümpfen und für kumulative Zeitspannen von nicht mehr als 40 Minuten aus den Embryoköpfen extrahiert. Die Zellen aus diesen Extraktionen werden bei nicht weniger als 250 × g für zehn Minuten in Ein-Liter-Zentrifugenbehälter, enthaltend nicht mehr als 5% fötales Rinderserum (FBS), zentrifugiert. Der Überstand wird abgegossen und die Zellen werden in Wachstumsmedium bei einem maximalen Verhältnis von Zellen zu Medium von etwa 1 : 5 suspendiert. Die entstehenden Suspensionen werden in einem gemeinsamen Behälter zusammengeführt und werden mit einem Magnetrührer gerührt. Nach gründlichem Mischen wird die Zellzahl bestimmt. Repräsentative Proben werden nach dem ersten Waschen der Embryorümpfe und -köpfe in PBS gesammelt und gemäß 9 C. F. R. 113.30 und 9 C. F. R. 113.51 geprüft. CEF-Zellen werden verwendet, um das Viruswachstum bei der Herstellung des Impfstoffs oder in den Testsystemen für die Prüfung des Virus zu unterstützen.
Die Zellen werden im vorstehend beschriebenen Wachstumsmedium bei einer Endkonzentration von etwa 0,5 bis 5,0 × 10⁶ Zellen pro ml dispergiert. Die Zellen werden mit 85 ml auf 500 ml Medium pro Flasche in sterile Rollerflaschen eingebracht und bei 37°C ± 2°C für 20 bis 72 Stunden bebrütet. Die Zellen können mit frischem Medium nachgefüttert werden, wenn sie länger als 48 Stunden gehalten werden. Flaschen, die kontaminiert sind, atypische einlagige Zellschichten oder einen atypischen pH-Wert haben, werden verworfen.
Die Zellkulturen werden in Rollerflaschen in der Größe in einem Bereich von etwa 2.000 ml bis 9.000 ml vermehrt. Die Flaschen sind entweder ein Weichglas, ein Typ-I-Borosilikatglas oder sterile kommerzielle Plastikflaschen. Die Glasflaschen werden für mindestens fünf Minuten bei nicht weniger als 132°C ± 2°C, für mindestens 15 Minuten bei nicht weniger als 121°C ± 2°C Dampf-sterilisiert oder werden mit trockener Hitze für mindestens eine Stunde bei nicht weniger als 160°C + 2°C sterilisiert. Die Flaschen werden innerhalb von zwei Wochen nach der Sterilisierung gebraucht oder werden erneut sterilisiert. Die Flaschen werden mit einer Schraubkappe mit Gummirand oder mit einer einem Gummistopfen dicht verschlossen. Die Stopfen und/oder Schraubdeckel werden sterilisiert.
Die Stammkultur ("X") wird in Ampullen bei –100°C oder kälter in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff gelagert oder es werden lebende mit Puten-Herpesvirus (HVT) infizierte Zellen in flüssigem Stickstoff gelagert.
Die Herstellung von Zellsuspensionen zur Aussaat und Beimpfung erfordert es zunächst, dass Lagerkulturen aus dem flüssigen Stickstoff entnommen werden und schnell aufgetaut werden. Die Viruskulturen werden aseptisch aus den aufgetauten Ampullen entnommen und zu nicht weniger als 500 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro ml zur Inokulation auf einlagigen Zellschichten von Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) in Rollerflaschen verdünnt.
Darauf folgende Viruskultur-Ernten werden durch Entfernen der Zellen aus den Rollerflaschen mit 0,05% bis 0,25% Trypsin erreicht.
Trypsinlösungen werden wie folgt hergestellt: Lösung Nr. 1

Trypsin 1 : 250, Zellkulturqualität 250,0 Gramm

Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), ausreichende Menge (q. s.) 10.000,0 ml

Das Trypsin wird mit einer kleinen Menge warmer Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) angerührt. Warme PBS wird zu 25% des Endvolumens gegeben. Die Lösung wird bei einer mäßigen Geschwindigkeit gerührt, um Schaumbildung zu vermeiden. Das verbleibende Volumen wird mit zusätzlicher PBS aufgefüllt und die Lösung wird gut gemischt. Lösung Nr. 2

Trypsin 1 : 250, (10X) im Handel erhältliche, zubereitete Lösung, mit β-Propiolacton behandelt (BPL-behandelt)	2.000,0 ml
Natriumchlorid, U.S.P.	320,0 Gramm
Kaliumchlorid, U.S.P.	16,0 Gramm
Dextrosehydrat	80,0 Gramm
Natriumbicarbonat	28,0 Gramm
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	20,0 Gramm
Deionisiertes Super Q H₂O ... ausreichende Menge (q. s.)	10.000,0 ml

Jeder Trockenbestandteil wird getrennt mit deionisiertem Wasser gemischt und erwärmt. Die Lösungen werden dann vereinigt und die Trypsin- und Ethylendiamintetraessigsäure(EDTA)-Lösungen werden hinzugefügt. Die Lösung wird bei einer mäßigen Geschwindigkeitsrate gerührt bis sie gut gemischt ist.
Die Trypsinlösungen 1 und 2 können durch abschließende Filtration durch einen sterilen 0,2 Mikronfilter sterilisiert werden. Die sterilisierte Lösung wird filtriert und in sterile Glasflaschen aus Typ-I-Borosilikat im Maß von 25 ml bis 500 ml pro Flasche verteilt. Die Flaschen werden mit Schraubkappen mit Gummirand verschlossen. Die in dieser Weise sterilisierten Lösungen werden auf Bakterien und Pilze in Übereinstimung mit 9 C. F. R. 113.26; auf Mycoplasmen in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.28 und auf Pathogene durch Inokulation in Hühnerembryonen in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.37 geprüft. Jede Charge des Trypsinpulvers wird auf Schweine-Parvovirus in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.53(d) geprüft. Trypsinlösungen können auch unter Verwendung von β-Propiolacton sterilisiert werden. Schraubkappen-Erlenmeyerflaschen von einer Größe des vierfachen Volumens des zu behandelnden Materials werden verwendet. Eine Salzlösung, z. B. Dulbecco's Balanced Salt Solution, Mg⁺⁺- und Ca⁺⁺-frei, enthaltend 2,5% Trypsin, wird angefertigt. β-Propiolacton wird durch kräftiges Schütteln in die Lösung eingebracht und zu einer Konzentration von 10% mit eiskaltem destilliertem Wasser unter einer Schutzkammer unter Verwendung einer Pipettierhilfe und Schutzkleidung verdünnt. Das verdünnte BPL wird zum Trypsin in einem Anteil von 1 ml zu 99 ml kaltem zu behandelnden Trypsin zugegeben, so dass eine Endverdünnung von 0,1% BPL entsteht. Das BPL-Trypsin wird langsam über Nacht in einem begehbaren Kühlschrank gerührt und wird regelmäßig geprüft, um ein Schäumen zu verhindern, welches das Virus über dem Inaktivator halten könnte. Das behandelte Material kann 10-fach verdünnt werden, um eine 0,25% Trypsinlösung zur unmittelbaren Verwendung herzustellen oder das Konzentrat kann filtriert und gefroren zur späteren Verdünnung und Verwendung gelagert werden. Die mit β-Propiolacton sterilisierten Lösungen werden auf Bakterien und Pilze in Übereinstimung mit 9 C. F. R. 113.26, auf Mycoplasmen in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.28 und auf Pathogene durch Inokulation in Hühnerembryonen in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.37 geprüft. In dieser Weise sterilisierte Lösungen werden auf Schweine-Parvovirus in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. oder mit einem vom Hersteller erstellten Protokoll geprüft.
Lösung Nr. 3 ist eine kommerziell hergestellte 1 : 250 (10X) Trypsinlösung, die von Gibco Laboratories, 3175 Staley Road, Grand Island, New York 14072 bezogen werden kann. Das Trypsin erfüllt die Anforderungen von 9 C. F. R. 113.53. Lösung Nr. 4 ist eine kommerziell hergestellte 1 : 250, mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (10X) behandelte, gamma-bestrahlte Lösung, die von Sigma Chemical Company, Postfach 14508, St. Louis, Missouri 63178, bezogen werden kann. Gamma-bestrahlte Trypsinlösungen werden auf Bakterien und Pilze in Übereinstimmung mit U.S.P. XXI, auf Mycoplasmen durch das Barile-Verfahren und auf Schweine-Parvovirus in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.53 geprüft. Lösung Nr. 5 ist eine kommerziell hergestellte 1 : 250 (10X), mit BPL behandelte Trypsinlösung, die von JRH-Biosciences, 13804 West 107th Street, Lenexa, Kansas 66215, bezogen werden kann.
Die Trypsinkonzentrate (Lösungen 1, 3 und Nr. 4) werden auf die geeignete Konzentration mit steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt und für die Dispersion von Zellkulturen verwendet. Das Trypsinkonzentrat (Lösung Nr. 2) wird auf die geeignete Konzentration mit Super Q H₂O verdünnt und für die Dispersion von Zellkulturen verwendet. Das Trypsinkonzentrat (Lösung Nr. 5) wird für die Herstellung von Lösung Nr. 2 verwendet. Die verschiedenen Trypsinkonzentrate werden bei –20°C oder kälter für nicht mehr als 12 Monate gelagert.
Fötales Kälberserum kann zu den geernteten Zellen zugegeben werden, um das Trypsin vor der Zentrifugation zu inaktivieren. Die geernteten Zellen werden für 10 bis 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird abgegossen und die Zellen werden in einem Verhältnis Volumen : Volumen im Bereich von 1 : 40 bis 1 : 80 dicht gepackter Zellen zu PBS resuspendiert. Die Phosphat-gepufferte Salzlösung wird mit 4% fötalem Kälberserum und Antibiotika ergänzt.
Die Viruskulturlösung wird aseptisch auf einlagigen CEF-Zellschichten in einem Verhältnis von zwei bis drei ml pro Rollerflasche inokuliert. Das Volumen der Viruskultur wird durch Passage der infizierten Zellen im Bereich von 1 : 5 bis 1 : 30 erhöht. Die Inokulation von Viruskultur und Produktionsmedium ist identisch. Die inokulierten einlagigen Zellschichten können mit zusätzlichen primären CEF, wenn verfügbar, wie folgt ergänzt werden: die primären CEF-Zellen werden wie vorstehend beschrieben hergestellt; die primären CEF-Zellen werden dann als Konzentrat zu den mit Puten-Herpesvirus (HVT) inokulierten Rollerflaschen in einer Menge von 0,5 bis 5,0 × 10⁸ Zellen pro Flasche, abhängig von der Zahl der verfügbaren Zellen, zugegeben und das Zellkonzentrat wird 18 bis 24 Stunden nach der Inokulation zugegeben. Das Zellkonzentrat wird in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.30 und auf zusätzliche Agenzien in Übereinstimmung mit 9 C. F. R. 113.51 geprüft.
Die mit Puten-Herpesvirus infizierten einlagigen Schichten aus CEF-Zellen werden bei 37°C ± 2°C für 24 bis 72 Stunden inkubiert. Charakteristische cytopathogene Wirkungen (CPE), bestimmt durch Erfahrung und Beobachtung, müssen in 80% oder mehr der Zellen vor der Ernte offensichtlich sein. Alle Behälter, die keine charakteristische CPE zeigen, und solche mit bakterieller Kontamination oder atypischen einlagigen Zellschichten werden verworfen.
Die Flaschen werden zufällig ausgewählt und mikroskopisch auf charakteristische CPE und Zeichen von Kontamination untersucht. Die minimale bis maximale Zeitspanne, die von der Zeit der Inokulation bis zur Ernte vergeht, liegt bei 24 bis 72 Stunden. Vorzugsweise wird die Ernte 48 Stunden nach der Inokulation durchgeführt.
Nach der Zentrifugation der Zellsuspensionen wird die überstehende Kulturflüssigkeit verworfen und die Zellen werden von der Glasoberfläche mit 0,5% bis 0,25% Trypsin abgelöst. Die Zellen aus den Rollerflaschen werden dann in Ein-Liter-Zentrifugenbecher vereinigt. Fötales Kälberserum kann zu den Zellen zugegeben werden, um das Trypsin zu inaktivieren. Die vereinigten Zellen werden bei nicht weniger 250 × g für nicht weniger als fünf bis fünfzehn Minuten zentrifugiert. Nachdem die überstehende Trypsinlösung verworfen wurde, werden die dicht gepackten Zellen in sterilem Minimal Essential Medium oder Medium #199 mit Earle's-Buffered-Saline-Solution (BSS) und 15% fötalem Kälberserum resuspendiert. Das Volumen dieser Suspension ist 40% bis 80% des Endvolumens des Impfstoffs. Nur einlagige Zellschichten, die eine charakteristische CPE zeigen, und frei von jeglichen Hinweisen auf Kontamination sind, wie abnormale Zellen, abnormaler pH, Trübung, Geruch und Schimmel, werden geerntet. Alle Materialien, die nicht zur Impfstoffherstellung verwendet werden, werden in Übereinstimmung mit dem Veterinary Services Memorandum Nr. 800.56 entsorgt.

Die mit HVT infizierten Zellen werden durch kontrolliertes Einfrieren in folgendem Medium in einem lebenden Zustand gehalten:

Bestandteile	pro zehn Liter
1. Minimal Essential Medium oder Medium #199 mit Earle's BSS mit 10% Glutamin	7.400 bis 7.480 ml
2. Tryptose-Phosphat-Brühe (TPB)	500 ml
3. NaHCO₃ (10%), Reagenzgrad	20 bis 100 ml
4. Fötales Kälberserum	1.500 ml
5. Dimethylsulfoxid (DMSO)	500 ml

Medium #199 ist ein Standardmedium, das für Fachleute leicht erhältlich ist. Das Medium wird zur Verwendung innerhalb von 72 Stunden hergestellt. Das Dimethylsulfoxid wird bei 121 ± 3°C für fünfzehn Minuten sterilisiert.
Das Produkt ist dadurch standardisiert, dass zuerst die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von nicht weniger als 1 × 10⁷ Zellen pro ml, bestimmt durch ein Standardverfahren der Zellzählung wie durch ein Hämocytometer oder durch einen elektrischen Partikelzähler, eingestellt wird. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird unter Verwendung von Lebendfärbungen, z. B. Trypan-Blau oder Erythrosin B bestimmt.

Eine Serie wird aufgebaut, indem die suspendierten Zellen zuerst durch steriles flusenfreies Gewebe oder ein steriles Edelstahlsieb gegeben werden. Während die Zellsuspension mechanisch bewegt wird, wird ein Gemisch aus Einfriermedium langsam zugegeben, um die beschriebene Zellkonzentration in der Charge zu erhalten. Die Zellsuspension wird ununterbrochen bei gekühlten Temperaturen belassen. Ein Beispiel für den Aufbau einer Serie basierend auf einer 20.000 ml-Charge ist wie folgt:

1) HVT-infizierte Zellen	2 × 10¹¹
2) Minimum Essential Medium (Eagle's) oder Medium #199 mit L-Glutamin	14.800 ml bis 14960 ml
3) Tryptosephosphatbrühe	1.000 ml
4) NaHCO₃, 10%, Reagenzqualität	40 ml bis 200 ml
5) Fötales Kälberserum	3.000 ml
6) Dimethylsulfoxid (DMSO)	1.000 ml
GESAMTVOLUMEN	20.000 ml ± 3%

Das durchschnittliche Serienvolumen ist etwa 20.000 ml. Das maximale Volumen einer Serie liegt bei 40.000 ml.
Das Füllvolumen ist 2,0 ± 0,2 ml pro 500- bis 3.000-Dosen-Ampulle und 1,0 ± 0,1 ml pro 500-Dosen-Ampulle. Der Impfstoff wird in zwei-Milliliter Typ-I-Borosilikat-Glasampullen, die vorgekerbt und sterilisiert wurden, verteilt. Acemannan-Adjuvans wird in 20 oder 50 ml Typ-I-Borosilikatflaschen unter Verwendung von 20 mm Gummi- oder Butylstopfen abgefüllt.
Das Verdünnungsmittel wird in Übereinstimmung mit dem Veterinary Services Memorandum Nr. 800.74 hergestellt, geprüft und verkauft. Ein Ein-Liter-Ansatz Verdünnungssmittel setzt sich zusammen aus:

NZ-Amin 14,00 g

Saccharose, Lebensmittelqualität 50,00 g

K₂HPO₄·3H₂O (dibasisches Kaliumphosphat) 1,48 g

Phenolrot, A. C. S. 0,01 g

Deionisiertes Wasser 1.000,00 ml
Die vorstehend aufgeführten Bestandteile werden in einem kleinen Volumen deionisierten Wassers durch Rühren aufgelöst. Das Gemisch wird mit deionisiertem Wasser zu einem Endvolumen verdünnt, nachdem die Bestandteile in Lösung gegangen sind und der pH-Wert mit NaOH oder HCl auf 7,1 oder 7,3 eingestellt wurde. Die durchschnittliche Größe des Verdünnungsmittelansatzes liegt zwischen 1.000.000 ml und 2.400.000 ml. Der maximale Ansatz ist 3.000.000 ml. Es werden dem Lösungsmittel keine Konservierungsmittel zugesetzt.
Der Impfstoff wird unter ständiger Bewegung aseptisch in sterile Glasampullen gefüllt, die zum Versiegeln zugeschmolzen und zur Lagerung in Rohre überführt werden. Das Befüllen und Versiegeln wird von einer automatischen Abfüllmaschine übernommen und bei 10°C ± 5°C ausgeführt. Die Impfstoffampullen werden durch Kühlung bei einer konstanten Rate von etwa 1°C pro Minute in einer kontrollierten Gefrierkammer eingefroren. Die Ampullen werden etwa bei –100°C oder kälter in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff oder in flüssigem Stickstoff gelagert.
Jede Impfstoffdosis im endgültigen Gefäß enthält nicht weniger 20.000 Zellen, die, wie vorstehend beschrieben, gezählt wurden. Die Impfstoffbehälter werden während Transport und Lagerung in flüssigem Stickstoff gehalten, während das Adjuvans während Transport und Lagerung bei Raumtemperatur gehalten wird.
Jede Zellcharge wird in Übereinstimmung mit 9 CFR 113.30 auf Salmonella und in Übereinstimmung mit 9 CFR 113.51 auf zusätzliche Agenzien geprüft. Die endgültigen Probengefäße des Impfstoffs und des Adjuvans werden in Übereinstimmung mit 9 CFR 113.28 auf Mycoplasma, in Übereinstimmung mit 9 CFR 113.27 auf Bakterien und Pilze, in Übereinstimmung mit 9 CFR 113.34 auf hämagglutinierende Viren und in Übereinstimmung mit 9 CFR 113.37 auf zusätzliche Agenzien geprüft. Die Masse oder die endgültigen Probengefäße des Impfstoffs werden in Übereinstimmung mit 9 CFR 113.31 auf lymphoide Leukose des Vogels geprüft.
Endgültige Probengefäße werden in Übereinstimmung mit 9 CFR 113.330 auf Sicherheit geprüft.
Der Impfstoff wird in Übereinstimmung mit 9 CFR 113.330 und mit dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren titriert. Die Stammkultur ("X") wurde am 17. Januar 1986 hergestellt und die Prüfung der 4. Passage ("X + 4") der Virus-Stammkultur wurde am 10. Juli 1986 abgeschlossen. Der Impfstoff wird aus dieser vierten Passage hergestellt. Der Impfstofftiter bei Freigabe soll nicht weniger als 3.000 Plaque-bildende Einheiten (PFU) pro Vogeldosis betragen. Der Impfstofftiter soll während der Zeit bis zum Verfallsdatum nicht weniger als 1.000 Plaque-bildende Einheiten pro Vogeldosis betragen.
Die Feuchtigkeit des Adjuvans, bestimmt in Übereinstimmung mit 9 CFR 113.29, soll 5% nicht übersteigen.
Der Impfstoff wird in zwei-ml-Ampullen verpackt, fünf Ampullen pro Rohr und ein Rohr pro Packung. Das Adjuvans wird in 20- oder 50-ml-Flaschen verpackt mit 5 Flaschen pro Packung. Acemannan (Carrisyn^TM) wird von Carrington Laboratories, Irving, Texas geliefert. Einhundert Mikrogramm Acemannan werden mit jeder Impfstoffdosis und Verdünnungsmittel geliefert. Das Acemannan wird als steriles Pulver oder lyophilisiert in sterilen Stopfengefäßen vertrieben. Das gelieferte Acemannan genügt den Spezifikationen der Carrington Laboratories laut „Bulk Carrisyn Certificate of Analysis" (Analysenzertifikat für den Wirkstoff Carrisyn) zur Identifizierung, für den Prozentanteil an Polimannoacetat, die Anthrachinonkonzentration und das Molekulargewicht. Das Acemannan wird vor der Impfung mit Verdünnungsmittel rekonstituiert (vgl. vorstehend). Ein Merkblatt und steriles Verdünnungsmittel werden bereitgestellt. Repräsentative Proben von Impfstoff und Adjuvans werden nach dem Einfrieren für die Qualitätssicherungsprüfung genommen.
Das Verfallsdatums des Impfstoffs soll 22 Monate ab dem Datum des Beginns der Wirksamkeitsprüfung in Übereinstimmung mit 9 CFR 114.13 nicht überschreiten.
Der Impfstoff soll für die Impfung von einen Tag alten Küken zur Vorbeugung vor Marek's Disease verwendet werden. Zwanzig mg Acemannan werden in 200 ml des vorstehend beschriebenen Verdünnungsmittels suspendiert und zwei ml aufgetauter Impfstoff werden dazugegeben, um 1.000 Vogeldosen des Impfstoffs herzustellen. Eine 0,2 ml-Impfstoffdosis wird pro Vogel verabreicht. Der Impfstoff wird subkutan oder intramuskulär verabreicht.
Die in diesen Studien verwendeten Vögel waren allesamt Leghorn-Hühner, die negativ für mütterliche Antikörper und frei von spezifischen Pathogenen (SPF) waren. Die Vögel wurden bei einem Alter von einem Tag geimpft und dann in getrennten Unterdruck-Plexiglasbrutschränken vom Typ Horsfall gehalten, gefüttert und getränkt ad libitum, mit einem Minimum von 200 cm² Bodenfläche für jeden Vogel während der Testphase.
Beispiel 2
Antwort von mit HVT/Acemannan geimpften Hühnchen auf die Exposition mit Marek-Virus RB1B, verabreicht einen, zwei, drei oder vier Tage nach der Impfung
Der verwendete Puten-Herpesvirus-Impfstoff wurde auf eine theoretische Dosis von 3500 PFU pro 0,2-ml-Dosis im vorstehend beschriebenen Phosphatpuffer verdünnt. Acemannan wurde von Carrington Laboratories, Irving, TX, als gamma-bestrahltes steriles Pulver bezogen. Acemannan wurde mit dem Phosphatpuffer-Verdünnungsmittel vor der Zugabe des Virus auf einer Basis von 100 μg pro 0,2-ml-Dosisstufe vermischt. Das Kontrollverdünnungsmittel war Phosphatpuffer ohne andere Zusätze.
Eine Exposition mit Marek-Virus RB1B wurde in einer theoretischen Dosis von 700 PFU pro Vogel durch eine intraperitoneale Injektion verabreicht. RB1B, eine typische sehr virulente Marek's-Disease-Exposition, wurde von Dr. Witter im East Lansing Regional Poultry Research Laboratory erhalten und in primären Kulturen von Hühner-Nierenzellen vermehrt.
Die Vögel wurden in folgende Gruppen aus 30 aufgeteilt und in getrennten Isolatoren untergebracht: HVT-Exposition am Tag 1, 2, 3 & 4 nach der Impfung, HVT- und Acemannan-Exposition 1, 2, 3 & 4 Tage nach der Impfung, Exposition mit Acemannan in Phosphatpuffer-Verdünnungsmittel 1, 2, 3 & 4 Tage nach der Impfung und nicht geimpft, mit Kontrollverdünnungsmittel 1, 2, 3 & 4 Tage nach der Impfung in den anderen Gruppen exponiert.
Am geeigneten Tag nach der Behandlung, wurden den Impflingen 750 Plaquebildende Einheiten des RB1B-Virus intraperitoneal injiziert und eine Bandmarkierung am Flügel mit fortlaufenden Zahlen und einfarbigen Bändern angebracht. Nach der letzten Exposition wurden alle Vögel aus allen Expositionszeiträumen und Impfgruppen zufällig gemischt und in Isolatoren gehalten, um einen konstanten Hintergrundreiz beizubehalten.
Die Vögel wurden auf Anzeichen eines Traumas nach der Virusexposition beobachtet und im Falle des Todes obduziert. Alle Gruppen wurden für den Rest der 48 Tage dauernden Testphase beobachtet, obduziert und auf Läsionen, die pathognomonisch für vvMD (sehr virulente Marek's Disease Exposition) sind, untersucht. Die Sterblichkeit durch vvMD und Vögel mit Läsionen durch vvMD wurden aufsummiert und im Verhältnis zur Gesamtzahl der Fälle in den nicht geimpften Vögeln betrachtet, um den Schutzindex der Behandlung zu bestimmen. Immunität gegen Marek's Disease wird als Schutzindex (PI) berichtet, wobei das Ergebnis jeder Gruppe zum Infektivitätsniveau der Kontrolle verglichen wird. Schutzindex = (% positive Kontrollen) – (% positive Impflinge)/(% positive Kontrollen) × 100.
Die in Tabelle 1 (vgl. nachstehend) dargestellten Ergebnisse zeigen an, dass die in einem so jungen Alter verabreichte Exposition mit 100% Betroffenen von allen nicht Geimpften sehr schwer verlief. Die Daten zeigen auch an, dass der Zusatz des Acemannan zum HVT eine signifikante Wirkung auf den Impfstoff hatte, wobei die Gruppen, die am Tag 2, 3 und 4 nach der Impfung exponiert wurden, signifikant besser abschnitten als die Gruppen nur mit HVT. Die Ergebnisse in Tabelle 2 (vgl. nachstehend) zeigen an, dass die mit HVT/Acemannan behandelten Vögel Tabelle 1 WIRKUNG DES TAGES DER EXPOSITION AUF DEN TAG DES ALTERS DER GEIMPFTEN KÜKEN

NonVac: nicht geimpft;
Acm: Acemannan.
Unspezifische Sterblichkeit: bezieht sich auf tote Vögel ohne erkennbare Läsionen.

Diese Daten legen nahe, dass der Zusatz von Acemannan zum HVT-Impfstoff bei der Dosisstufe 3.500 PFU und 100 μg pro Vogel, einen signifikant verbesserten Schutz für Küken boten, die am Tag 2, 3 oder 4 nach der Impfung exponiert wurden.
Ebenfalls von Interesse ist der Unterschied bei der unspezifischen Sterblichkeit zwischen den verschiedenen Impfgruppen. Während keine signifikanten Unterschiede zwischen den Impfgruppen auftreten, gibt es einen klaren Unterschied beim Prozentsatz unspezifischer Sterblichkeit zwischen den Geimpften und den nicht Geimpften. Der experimentelle Aufbau erfordert die Beurteilung des Impfstoffs durch Beobachtung der Verminderung der Bruttotumorentwicklung. Es kann sein, dass die Geimpften teilweise gegen ungehinderte Tumorentwicklung geschützt sind, aber mit der Verabreichung dieses bestimmten Impfstoffes sind sie in anderer Art beeinträchtigt. Wenn dies der Fall ist, zeigt die Durchsicht der Daten, dass weniger Sterblichkeit in der HVT/Acemannan-Gruppe auftrat, was nahe legt, dass die offensichtliche adjuvante Wirkung dieselbe bleibt oder sich erhöht.
Beispiel 3
Wirkung von Acemannan auf frühe, virulente Exposition nach HVT-Imgfung
Einen Tag alte Vögel wurden in Gruppen aufgeteilt und es wurden entweder null, 250 oder 1000 PFU des modifizierten Lebend-HVT und entweder null oder 100 Mikrogramm (μg) Acemannan (vgl. Tabelle 3, nachstehend) verabreicht.
Expositionsviren waren entweder die RB1B- oder JMV-Stämme des Marek-Virus. RB1B, ein typischer sehr virulenter Marek-Expositionsvirus wurde von Dr. Witter beim East Lansing Regional Poultry Research Laboratory erhalten und in 0,2 ml intraperitonealen Dosen enthaltend 400 PFU pro Expositionsdosis verabreicht. Die Exposition fand entweder fünf oder einundzwanzig Tage nach der Impfung statt. Die Vögel wurden auf Zeichen von Paralyse beobachtet und die Sterblichkeiten wurden über einen Zeitraum von 48 bis 60 Tagen nach der Infektion beurteilt. Am Ende der Beobachtung wurden alle Vögel eingeschläfert und obduziert, um Zeichen von Bruttotumorentwicklung aufzuzeichnen, insbesondere in Herz, Leber, Niere, Milz und Hoden oder Ovarien. Der transplantierbare Tumor JMV wurde von Dr. Sevoian, University of Massachusetts erhalten und wurde intraperitoneal in einen Tag alte Spenderküken gleichzeitig mit der Impfung der Testtiere injiziert. Fünf Tage nach der Infektion wurden die JMV-Küken eingeschläfert und Lebern und Milzen wurden gesammelt, in sterilem RPMI zerkleinert und dann in einem Tenbrock^®-Gewebehomogenisator mazeriert. Das entstandene Homogenisat wurde dann 3 : 1 in frischem RPMI verdünnt und 0,2 ml wurden den Küken intraperitoneal injiziert. Die Küken wurde 21 Tage lang beobachtet, wobei die Sterblichkeit aufgezeichnet wurde.
Die in Tabelle 3 gezeigten Daten legen nahe, dass der Zusatz von Acemannan zum HVT-Impfstoff die Schutzkapazität des Impfstoffs verbessert, da alle Gruppen, die Acemannan erhielten, einen niedrigeren Prozentsatz von Vögeln der Gruppe aufwiesen, die von der Krankheit betroffen waren, und einen höheren Schutzindex hatten, als die entsprechenden Gruppen, die keinen Acemannan-enthaltenden Impfstoff erhielten. Der Schutzindex vergleicht das Abschneiden jeder experimentellen Gruppe zum Infektivitätsniveau der Kontrolle. Tabelle 3 IMPFUNG VON EINEN TAG ALTEN KÜKEN MIT MODIFIZIERTEM LEBENDPUTENHERPESVIRUS UND ACEMANNAN UND EXPOSITION MIT SEHR VIRULENTEM MAREK-VIRUS A. Experimenteller Aufbau
B. Ergebnisse

Acm: Acemannan.

Beispiel 4
Wirkung von Acemannan auf frühe virulente Exposition nach HVT-Imgfung
Einen Tag alte Vögel wurden in Gruppen aufgeteilt und es wurden entweder null, 625, 1250 oder 3750 PFU des modifizierten Lebend-HVT-Virus und entweder null oder 100 Mikrogramm Acemannan (vgl. Tabelle 4, nachstehend) verabreicht. Die Exposition fand mit dem RB1B-Stamm des Marek-Virus fünf Tage nach der Impfung statt, wie im Beispiel 3 beschrieben (vgl. vorstehend).
Die in Tabelle 4 gezeigten Daten legen nahe, dass der Zusatz von Acemannan zum HVT-Impfstoff die Schutzkapazität des Impfstoffs verbessert. Alle Gruppen, die Acemannan-enthaltenden Impfstoff erhielten, hatten weniger tote Vögel unter den Gruppenmitgliedern, einen niedrigeren Prozentsatz an Vögeln, die von der Krankheit betroffen waren, und einen höheren Schutzindex als die entsprechenden Gruppen, die keinen Acemannan-enthaltenden Impfstoff erhielten. Tabelle 4 IMPFUNG VON EINEN TAG ALTEN KÜKEN MIT MODIFIZIERTEM LEBENDPUTENHERPESVIRUS UND ACEMANNAN UND EXPOSITION MIT SEHR VIRULENTEM MAREK-VIRUS A. Experimenteller Aufbau
B. Ergebnisse

Acm: Acemannan.

Beispiel 5
Wirkung von Acemannan auf frühe, virulente Exposition nach HVT-Impfung
Einen Tag alte Vögel wurden in Gruppen aufgeteilt und es wurden entweder null, 330 oder 1000 PFU des modifizierten Lebend-HVT-Virus und entweder null, ein, 100 oder 1000 Mikrogramm Acemannan (vgl. Tabelle 5, nachstehend) verabreicht. Die Exposition fand fünf Tage nach der Impfung, wie im Beispiel 3 beschrieben (vgl. vorstehend), statt.
Die in Tabelle 5 gezeigten Daten legen nahe, dass der Zusatz von Acemannan zum HVT-Impfstoff die Schutzqualität des Impfstoffs verbessert. Die Gruppen, die Acemannan erhielten, hatten weniger Tote unter den Gruppenmitgliedern, einen niedrigeren Prozentsatz an Vögeln in der Gruppe, die von der Krankheit betroffen waren, und einen höheren Schutzindex als die entsprechenden Gruppen, die keinen Acemannan-enthaltenden Impfstoff erhielten. Tabelle 5 IMPFUNG VON EINEN TAG ALTEN KÜKEN MIT MODIFIZIERTEM LEBENDPUTENHERPESVIRUS UND ACEMANNAN UND EXPOSITION MIT SEHR VIRULENTEM MAREK-VIRUS A. Experimenteller Aufbau
B. Ergebnisse

Acm: Acemannan.

Beispiel 6
Wirkung von Acemannan auf frühe, virulente Exposition nach HVT-Impfung
Einen Tag alte Vögel wurden in Gruppen aufgeteilt und es wurden entweder null oder 360 PFU des modifizierten Lebend-HVT-Virus und entweder null oder 100 Mikrogramm Acemannan (vgl. Tabelle 6, nachstehend) verabreicht. Die Exposition fand fünf Tage nach der Impfung, wie im Beispiel 3 beschrieben (vgl. vorstehend), statt.
Die in Tabelle 6 gezeigten Daten legen nahe, dass der Zusatz von Acemannan zum HVT-Impfstoff die Schutzkapazität des Impfstoffs verbessert. Die Gruppe, die Acemannan enthaltenden Impfstoff erhielt, hatte weniger Tote unter den Gruppenmitgliedern, einen niedrigeren Prozentsatz an Vögeln in der Gruppe, die von der Krankheit betroffen waren, und einen höheren Schutzindex als die entsprechenden Gruppen, die keinen Acemannan enthaltenden Impfstoff erhielten. Tabelle 6 IMPFUNG VON EINEN TAG ALTEN KÜKEN MIT MODIFIZIERTEM LEBENDPUTENHERPESVIRUS UND ACEMANNAN UND EXPOSITION MIT SEHR VIRULENTEM MAREK-VIRUS A. Experimenteller Aufbau
B. Ergebnisse

Acm: Acemannan.

Beispiel 7
Tabelle 7 (vgl. nachstehend) fasst die in den Beispielen 3–6 gezeigten Daten zusammen. Die Ergebnisse aus den verschiedenen Tests werden zusammengenommen und gemeinsame Expositions-/Impfgruppen werden gepaart. Diese Paare wurden mit dem Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed-Rank-Test auf Signifikanz untersucht. Alle Paarungen zeigen, dass in Gruppen, deren Mitglieder einen Acemannan enthaltenden Impfstoff erhielten, die Vögel im Vergleich zu Vögeln, die zu Gruppen gehörten, die keinen Acemannan-enthaltenden Impfstoff erhielten, eine verbesserte Antwort auf die Exposition mit Marek-Virus zeigten. Tabelle 7 WILCOXON-MATCHED-PAIR-SIGNED-RANK-TEST; HO: FÜHRT ACEMANNAN BEI DOSEN VON 100 MIKROGRAMM ODER EINEM MILLIGRAMM PRO VOGEL ZU EINEM VERBESSERTEN VERHALTEN VON HVT, WENN MAN ES UNABHÄNGIG VON IMPFSTOFFDOSIS UND EXPOSITION BETRACHTET
N = 11/12
× N/Paar = 41
Probengröße = 493
P > = 0,01 für einen zweiseitigen Test
P > = 0,05 für einen einseitigen Test
Die Daten legen nahe, dass der Zusatz von Acemannan zum HVT-Impfstoff die Fähigkeit des Wirtsvogels, auf eine nachfolgende Exposition zu antworten, positiv beeinflussen kann. Dies ist besonders signifikant, wenn ein HVT-Impfprotokoll durch eine niedrige Zahl Plaque-bildender Einheiten oder eine frühe Exposition belastet wird.
Beispiel 8
Herstellung von Newcastle-Disease-Virus- und Infectious-Bronchitis-Virus-Impfstoffen
Newcastle-Disease-Virus (NDV) Stamm B1B1, Hühnerembryo Passage (CEP) 7, fünfte Passage ("X + 5") aus der Stammkultur, Infectious-Bronchitis Virus (IBV) Massachusetts(Mass.)-Stamm, erhalten von Intervet, und Putenherpesvirus F126(MDVac) wurden in den Experimenten zur Testung der Wirkung von Acemannan auf NDV- und IBV-Impfung verwendet.
Die Herstellung des Sprühimpfstoffs wird wie folgt durchgeführt:
Beispiel 9
Exposition mit Newcastle-Disease-Virus und Infectious-Bronchitis-Virus
Newcastle-Disease-Virus, Stamm GB Texas p22, und Infectious-Bronchitis-Virus, Stamm M41, erhalten vom National Veterinary Services Laboratory (NVSL), Ames, Iowa, wurden verwendet, um geimpfte und nicht-geimpfte Vögel zu exponieren.
Beispiel 10
Wirkung von Acemannan auf eine Kombination von Newcastle-Disease-Virus und Infectious-Bronchitis-Virus, verabreicht als Lebendimpfstoff bei einem Alter von einem Tag
Zweihundert einen Tag alte Küken wurden gleichmäßig auf folgende Gruppen verteilt:
Für Gruppe 2 wurde MDVac als eine subkutane Dosis von 0,2 ml Volumen verabreicht, hergestellt durch Verdünnung einer Ampulle Zellen in 200 ml des vorstehend beschriebenen Phosphatpuffer-Verdünnungsmittels. Für Gruppe 3 wurde pulvriges Acemann (ACM) in sterilem Puffer suspendiert, so dass eine subkutane Injektion von 0,2 ml zu einer Dosis von 100-μg/Vogel führte. In Gruppe 4, die sowohl Marek's-Disease-Impfstoff als auch Acemannan erhielt, wurde die Marek's-Disease-Impfstoffkomponente in 2-facher Konzentration suspendiert und 1 : 1 mit einer 2-fachen Suspension von Acemannan in sterilem Puffer gemischt. Wenn 0,2 ml subkutan verabreicht wurden, führte dies theoretisch zu derselben Acemannan-Dosis/Vogel wie in Gruppe 3 plus dieselbe MDVac-Dosis/Vogel wie in Gruppe 2. NDV und IBV wurden gruppenweise als Sprühanwendung verabreicht, so dass die Vögel eine theoretische Dosis von 2,0log₁₀ EID₅₀ IBV plus 4,2log₁₀ TCID₅₀ NDV erhielten. Alle Impfungen wurden im Alter von einem Tag gegeben und die Vögel wurden dann gruppenweise bis zur Virusexposition getrennt untergebracht.
Die Vögel wurden 21 Tage nach der Impfung entweder mit virulentem NDV- oder IBV-Expositionsstamm exponiert. Insgesamt 10 Vögel pro Behandlungsgruppe wurden in jedem der vier Plexiglas-Isolatoren untergebracht und zwei der Isolatoren wurden mit NDV und zwei mit IBV exponiert. Dies führte dazu, dass zwanzig Vögel pro Behandlungsgruppe intramuskulär mit einer theoretischen Dosis von 4log₁₀ TCID₅₀/Vogel von NDV, GB, Texas, und zwanzig Vögel pro Behandlungsgruppe intraokular mit M41 mit einer theoretischen Dosis von 4log₁₀ EID₅₀/Vogel exponiert wurden. Zehn Vögel in jeder Behandlungsgruppe wurden vor der Exposition nicht geimpft. Die Ergebnisse der NDV-Exposition wurden als Sterblichkeit für vierzehn Tage nach der Exposition aufgezeichnet. Die IBV-Exposition wurde durch Reisolierung des Virus wie in 9 C. F. R. 113.162(c) (3) bestimmt.
Die Ergebnisse der NDV-Exposition werden in Tabelle 8 dargestellt. Gruppe 4 hatte den höchsten Schutz-Prozentsatz, gefolgt von Gruppe 3. Nicht geimpfte Kontrollen waren signifikant betroffen, wobei kein Vogel den Beobachtungszeitraum von vierzehn Tagen nach der Exposition überlebte.
Die Ergebnisse der IBV-Exposition werden ebenfalls in Tabelle 8 gezeigt. Wieder hatten die mit Acemannan behandelten Gruppen im Vergleich zu den nicht mit Acemannan behandelten Gruppen einen leicht höheren Schutz-Prozentsatz. Nicht geimpfte Kontrollen waren signifikant (100%) betroffen. Tabelle 8 Ergebnisse der NDV- und IBV-Exposition

# Exposition: Anzahl mit Viruskontakt.
ACM: Acemannan,
MDV: MDVac (Marek's-Disease-Impfstoff).

Beispiel 11
Wirkung von Acemannan auf eine Kombination von Newcastle-Disease-Virus und Infectious-Bronchitis-Virus, verabreicht als Lebendimpfstoff bei einem Alter von einem Tag
Etwa 420 einen Tag alte Küken wurden in folgende Gruppen unterteilt (Acm = Acemannan):
Die subkutane Verabreichung bestand aus derselben Komponentendosis wie in Beispiel 10 (vgl. vorstehend) beschrieben. Die Vögel wurden zu Identifikationszwecken mit Bändern versehen und Gruppe 1 wurde in Isolation gehalten. Die verbleibenden beiden Gruppen wurden in je acht Untergruppen parallel behandelter Tiere von 15 Vögeln unterteilt und eine Untergruppe parallel behandelter Tiere von 20 Vögeln. Für die Sprühimpfung mit NDV + IBV wurde eine Untergruppe von jeder der Gruppen in die Sprühkammer gesetzt und der Impfstoff unter Verwendung derselben Komponentendosis pro Vogel, wie in Beispiel 10 beschrieben, verabreicht. Die Vögel wurden wieder getrennt und gruppenweise bis 21 Tage nach der Impfung isoliert, woraufhin den Untergruppen mit 20 Vögeln aus jeder Gruppe für die Serumnahme Blut abgenommen wurde. Vier der verbleibenden Untergruppen aus jeder Gruppe wurden mit NDV GB Texas und vier mit IBV M41, wie vorstehend beschrieben, in Kontakt gebracht. Nach Abschluss jeder Exposition wurden die Vögel so aufgeteilt, dass eine Untergruppe aus jeder der drei ursprünglichen Impfgruppen in jedem der vier Isolatoren vertreten war und die Exposition mit jedem Agens wurde, wie vorstehend beschrieben, festgestellt.
Die Ergebnisse der NDV-Exposition werden pro Untergruppe in Tabelle 9 und die Gesamtergebnisse pro Gruppe in Tabelle 10 (vgl. nachstehend) dargestellt. In drei von vier Untergruppen, zeigte die mit Acemannan behandelte Gruppe (Gruppe 3) einen höheren Schutz-Prozentsatz als die nicht behandelte Gruppe (Gruppe 2). In der vierten Untergruppe waren die beiden gleich. Der gesamte Schutz-Prozentsatz der Gruppe war 20% höher für die mit Acemannan behandelte Gruppe als für die unbehandelte Gruppe. Alle nicht geimpften Kontrollvögel (Gruppe 1) starben während des 14-tägigen Beobachtungszeitraums.
Die Ergebnisse der IBV-Exposition werden auch in den Tabellen 9 und 10 angegeben. Nur zwei der vier Untergruppen wurden geprüft. Für einen Satz der Untergruppen schnitt die mit Acemannan behandelte Gruppe besser ab, als ihr unbehandeltes Pendant; für den anderen Satz der Untergruppen war dies jedoch nicht der Fall. Von 27 nicht geimpften geprüften Kontrollvögeln war nur einer nicht betroffen. Tabelle 9 Ergebnisse der NDV- und IBV-Exposition, dargestellt pro Untergruppe parallel behandelter Tiere

n. t.: nicht geprüft.
ACM: Acemannan,
MDV: MDVac (Marek's-Disease-Impfstoff).

# Exposition: Anzahl der Tiere mit Viruskontakt.
ACM: Acemannan,
MDV: MDVac ((Marek's-Disease-Impfstoff).

Die Ergebnisse der Serologie werden in Tabelle 11 angegeben (vgl. nachstehend). Für NDV hatten 57% der mit Acemannan behandelten Vögel einen ELISA-Profil-Rang größer 4, während in den unbehandelten Impflingen nur halb so viele (23,5%) einen ELISA-Profil-Rang größer 4 hatten. Für IBV wurde eine sehr geringe serologische Antwort in jeder der Gruppen beobachtet. Tabelle 11 Serologische Ergebnisse für NDV und IBV

Acm: Acemannan

Beispiel 12
Die Ergebnisse der NDV-Exposition aus beiden Experimentserien mit NDV-Impfung zeigen, dass es eine Erhöhung des Schutzes in den mit Acemannan behandelten Gruppen gibt. Der einzige Fall, in dem diese Erhöhung nicht beobachtet wurde, trat in Untergruppe 4 aus Beispiel 11 auf, wo beide Impfgruppen einen gleichwertigen Schutz hatten. Es gibt eine inhärente Variabilität bei der Effizienz der Impfung, wenn man die Sprühkammer verwendet. Aus diesem Grunde impften wir jede Untergruppe zu getrennten Gelegenheiten, so dass jede mit Acemannan behandelte oder nicht behandelte Vergleichsgruppe einer identischen Menge NDV/IBV-Impfstoffs ausgesetzt wurde. Der Trend, den wir in den Untergruppen sehen, ist, dass während die Impfung wirksamer wird (vgl. Gruppe 3), die Unterschiede zwischen den mit Acemannan behandelten und unbehandelten Gruppe geringer werden.
Die Ergebnisse der IBV-Exposition waren variabel. In Beispiel 10 schien es eine Erhöhung des Schutzes in den mit Acemannan behandelten Gruppen zu geben, während dies in Beispiel 11 nicht der Fall war. Es kann sein, dass die Variabilität, die der Beurteilung des Schutzes bei Exposition durch Virus-Reisolierung inhärent ist, höher ist als bei Beurteilung der Mortalität.
Die Ergebnisse der ELISA-Serologie in Beispiel 11 legen nahe, dass es eine erhöhte Antikörper-Antwort auf die NDV-Fraktion des Sprühimpfstoffs gibt, wenn die Vögel mit Acemannan behandelt wurden, was möglicherweise zur beobachteten Erhöhung des Schutzes beiträgt. Die ELISA-Ergebnisse für IBV waren allgemein zu niedrig, um von Nutzen zu sein.
Die Behandlung mit Acemannan bei einem Alter von einem Tag rief serologische und schützende Antworten auf die NDV-B1B1-Komponente des durch Sprühen verabreichten Kombinationsimpfstoffs hervor, verglichen zur nicht mit Acemannan behandelten Kontrollgruppe.
Die Behandlung mit Acemannan bei einem Alter von einem Tag hatte wenig oder keinen Effekt auf die serologischen oder schützenden Antworten, die durch die IBV-Mass.-Komponente des durch Sprühen verabreichten Impfstoffs hervorgerufen werden.
Beispiel 13
Interferenzprüfung von Bursin-2 und Zell-assoziierten HVT-Impfstoffen in einen Tag alten SPF-Küken, mit oder ohne Zusatz von Acemannan
Herstellung von Infectious-Bursal-Disease-Virus-Impfstoff
Infectious-Bursal-Disease-Virus (IBDV) Bursin-2, Freigabetiter 10^4,7 TCID₅₀ pro Vogeldosis und Puten-Herpesvirus FC126, Freigabetiter 9.415 Plaque-bildende Einheiten pro Vogeldosis in Phosphatpuffer-Verdünnungsmittel (vorstehend beschrieben), wurden verwendet. Bursin-2 wurde von Phil Lukert, Unversität Georgia, erhalten.
Der resuspendierte HVT-Impfstoff wurde für zwei Stunden vor der Titration bei gekühlten Temperaturen gehalten. Die Titration der Plaque-bildenden Einheiten wurde auf einlagigen Zellschichten sekundärer Hühner-Embryo-Fibroblasten (CEF) durchgeführt. Infectious-Bursal-Disease-Virus wurde auf primären CEF titriert.
Impf-Stammlösungsmaterialien wurden wie folgt hergestellt:
Stammlösung A. Ein Gefäß mit HVT wurde aufgetaut und in 100 Millilitern (ml) Phosphatpuffer verdünnt.
Stammlösung B. Ein Gefäß mit Bursin-2-Serie wurde unter Verwendung von Phosphatpuffer auf 50 ml rekonstituiert.
Stammlösung C. Eine Lösung mit 2,0 Milligramm Acemannan pro ml wurde unter Verwendung von Phosphatpuffer hergestellt, um das Acemannanpulver zu rehydratisieren.
Stammlösung D. Fünfundzwanzig ml Stammlösung B plus 25 ml Phosphatpuffer.
Stammlösung E. Fünfundzwanzig ml Stammlösung B plus 25 ml Stammlösung C.
Einen Tag alte SPF-Leghorn-Küken wurden subkutan in den Nacken mit Kombinationen von Stammlösungen geimpft, wie nachstehend aufgeführt. Alle Impfungen waren in einem Volumen von 0,2 ml.
Impfgruppe 1. Nur HVT. Zwanzig ml der Stammlösung A wurden vor der Injektion mit zusätzlichen 20 ml des Phosphatpuffers vermischt und Dosen von 0,2 ml wurden zwanzig Küken verabreicht.
Impfgruppe 2. Bursin-2 und HVT. Zwanzig ml Stammlösung A wurden mit 20 ml Stammlösung D vermischt und Dosen von 0,2 ml wurden dann vierzig Küken verabreicht.
Impfgruppe 3. Nur Bursin-2. Zwanzig ml der Stammlösung D wurden vor der Injektion einer Gruppe von zwanzig Küken mit Dosen von 0,2 ml mit zusätzlichen 20 ml des Phosphatpuffers vermischt.
Impfgruppe 4. Bursin-2-Acemann. Zwanzig ml der Stammlösung E wurden mit zusätzlichen 20 ml des Phosphatpuffers kombiniert und Dosen von 0,2 ml wurden dann zwanzig Küken verabreicht.
Impfgruppe 5. Bursin-2-HVT-Acemann. Zwanzig ml der Stammlösung A und 20 ml der Stammlösung E wurden kombiniert und wurden dann vierzig Küken verabreicht.
Die in diesen Studien verwendeten Vögel waren weiße SPF-Leghorns, im Alter von einem Tag geimpft. Vierzig Küken aus derselben Schlüpfung wurden zur Verwendung als Kontrollen für die Exposition in Plexiglas-Isolierungseinheiten gehalten.
Bursal-Disease-Expositionsvirus wurde durch das National Veterinary Services Laboratory, Ames, Iowa, bereitgestellt. Das Virus wurde 1 : 5 in Tryptosephosphatbrühe verdünnt, um 10^1,4 EID₅₀ Vogeldosen per Augentropfen zu erhalten. Das Marek-Expositionsvirus war der Stamm RB1B/17 T55, Passage CP1, TCP3, CP1, TCP4. Das Material hatte einen Titer von 2,8 × 10^4,0 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro 0,2 Milliliter. Das Virus wurde in Phosphatpuffer verdünnt, so dass 1000 PFU pro Vogel-Expositionsdosis enthalten sind.
Fünf Tage nach der Impfung wurden 20 Kontrollen, Impfgruppe 1 und 20 Vögel jeweils aus Impfgruppe 2 und 5 intraperitoneal (IP) mit dem RB1B-Isolat des Marek-Virus exponiert. Vierzehn Tage nach der Impfung wurden 10 Vögeln aus den Impfgruppen 2, 3, 4, 5 und den Kontrollen ohne Exposition zur Bestimmung der Serumneutralisations(SN)-Titer nach dem IBDV-beta-Verfahren Blut entnommen. Je zwanzig Küken von den Gruppen 2, 3, 4, 5 und den Kontrollen wurden daraufhin mittels Augentropfen dem NVSL-IBDV-Virus exponiert. Die Vögel mit IBDV-Exposition wurden elf Tage später geopfert, gewogen und ihre Bunsen entfernt und gewogen, um das Gewichtsverhältnis Bursa zu Körper für die Beurteilung einer klinischen Bursa-Atrophie zu bestimmen. Alle mit MDV exponierten Vögel, die bis zum Tag 48 der Studie starben, wurden obduziert und klinische Läsionen wurden registriert. Die Überlebenden wurden am Tag 48 geopfert und es wurden ebenfalls die Läsionen registriert.
Die Titer der zirkulierenden Antikörper gegen IBDV wurden mit dem SN-Test ausgewertet.
Die Immunität gegen Marek's Disease wird als Schutzindex (PI) berichtet, wobei das Abschneiden jeder Gruppe zum Infektivitätsniveau der Kontrollen verglichen wird. Schutzindex = (((% Positivkontrollen) – (% positive Impflinge))/(% Positivkontrollen)) × 100.
Der Schutz vor Bursal Disease wird als Prozentsatz der immunen Vögel basierend auf der Atrophie der Bursa berichtet. Dies wird unter Verwendung eines bursalen Index beurteilt (BI = (Bursagewicht/Körpergewicht) × 100). Ein Wert größer als oder gleich 2,5 wird als geschützt angesehen.
Die Ergebnisse der Beurteilung der klinischen Läsionen bei Obduktion auf Marek's Disease werden in Tabelle 12 (vgl. nachstehend) als Schutzindizes aufgeführt. Die Kontrollgruppe, die per Definition einen PI von 0 hat, war zu 94 Prozent positiv für klinische Läsionen. Die Vögel, denen HVT, HVT plus Bursin-2 oder die Kombination aus HVT-Bursin-2 und Acemannan verabreicht wurden, waren zu 83, 89 bzw. 95 Prozent frei von klinischen Läsionen. Diese Zahlen lassen sich zu Schutzindizes von 82, 88 und 95 extrapolieren. Tabelle 12 Marek's Disease Schutzindizes

Behandlung Schutzindex

CA HVT 82

CA HVT-Bursin-2 88

CA HVT-Bursin-2-Acemannan 95

Kontrollen 0

CA: zellassoziiert.

Die Ergebnisse der Bursal Disease werden in Tabelle 13 als Verhältnis Bursa- zu Körpergewicht dargestellt, mit dem Prozentsatz der klinisch immunen Vögel in jeder Gruppe in Klammern aufgeführt. Für jeden geprüften Impfstoff trat eine numerische Erhöhung des Schutzes mit dem Zusatz von Acemannan auf. Die Vögel, denen nur Bursin-2 gegeben wurde, waren zu 85 Prozent geschützt, im Vergleich zu 100 Prozent Immunität mit dem Zusatz von 100 Mikrogramm Acemannan pro Vogeldosis. Mit der Bursin-2-HVT-Kombination hatte die Gruppe mit Acemannanzusatz einen Vorteil von 100 Prozent gegenüber 79 Prozent klinischen Schutzes. Tabelle 13 Bursal Disease Verhältnis Bursa- zu Körpergewicht

B.-/K.-Gew.: Bursa-/Körpergewicht;
B2: Bursin-2.

Bursaindex(Verhältnis Bursa- zu Körpergewicht)-Durchschnittswerte = eine Standardabweichung des Mittels für jede Impfgruppe waren 3,9 ± 1,5, 4,9 ± 1,6, 4,0 ± 1,6 und 5,0 ± 1,5 für die Gruppen Bursin-2, Bursin-2-Acemannan, Bursin-2-HVT bzw. Bursin-2-HVT-Acemannan. Eine Student's-T-Test-Analyse mit unabhängigen Proben der individuellen Verhältnisse Bursagewicht-zu-Körpergewicht (vgl. Tabelle 14, nachstehend) zeigt, dass die Gruppen, die nur Bursin-2 repräsentieren, nicht signifikant unterschiedlich sind; jedoch zeigt der Vergleich bei Bursin-2-HVT, dass die Acemannan-Gruppe beim 95%-Konfidenzniveau signifikant besser war. Tabelle 14 Individuelle Verhältnisse von Bursa- zu Körpergewicht

K: Kontrollen.

Die Ergebnisse der Serologie werden in Tabelle 15 (siehe nachstehend) gezeigt. Die SN-Titer folgten keinem Muster in Korrelation mit dem Schutz vor der klinischen Erkrankung. Die bursalen SN-Titer waren bei Bursin-2-HVT-Acemannan am größten (GMT von 69) und in Vögeln, denen die Kombination ohne Acemannan gegeben wurde, am niedrigsten (GMT von 30). Für Hühner, denen der monovalente Impfstoff IBDV gegeben wurde, hatte die Gruppe ohne Acemannan einen GMT von 56 im Vergleich zu 35 mit dem Zusatz. Die Kontrollen waren alle ≥ 2. Tabelle 15 Bursa-Serologie

Behandlung SN

Bursin-2 56

Bursin-2-ACM 35

Bursin-2-HVT 30

Bursin-2-HVT-ACM 69

Kontrollen ≤ 2
Bei der Immunität wurde zwischen Bursin-2 und zellassoziierten HVT-Impfstoffen keine Interferenz gesehen, wenn beide in einer vollen Felddosis verabreicht wurden.
Der Zusatz von Acemannan zum monovalenten Bursin-2-Impfstoff und der Kombination mit HVT führte zu einem numerischen Wirksamkeitsvorteil für die monovalente Behandlung, enthaltend Acemannan, und für das HVT im Kombinationsimpfstoff. Das Bursin-2 in der Kombination war signifikant besser mit Acemannan (95 Prozent Konfidenz) als ohne.
Beispiel 15
Impfungs-/Expositions-Studie an Ferkeln mit und ohne Acemannan
Einhundertsiebzig (170) säugende, eine Woche alte Ferkel wurden von Jensen Brothers Inc., Thornton, IA, erworben. Alle wurden in Rostbodengehegen in drei Räumen mit nicht mehr als zwanzig Ferkeln pro Gehege gehalten.
Einhundertzwanzig (120) CF1 16–22 Gramm weiße Mäuse wurden von Harlan Sprague Dawley erworben. Alle Mäuse wurden in Gruppen von acht Mäusen pro Käfig gehalten.
Es gab zehn Tiere pro Gruppe, jedoch wegen der Anzahl an Ferkeln, die zum Abschluss der Studie gebraucht werden, wurden Untergruppen von 5 Schweinen aus um eine Woche versetzten Würfen ausgewählt. Innerhalb einer Untergruppe wurden die Schweine zufällig einer Impf- oder Kontrollgruppe zugeordnet. Die Impfstoffe wurden mit und ohne Acemannan zu 5 mg/Dosis vermischt. Zusätzlich wurde Acemannan als Immunstimulans vor der Impfung in einer Gruppe von 10 Schweinen, die mit einem Alter von einem Tag ausgewählt wurden, untersucht. Die unterschiedlichen Impf- und Kontrollgruppen werden in Tabelle 1 aufgeführt. Die Schweine wurden in einem Alter von einer Woche und erneut im Alter von 3 Wochen geimpft. Die erste Impfung war eine 2,0 ml Dosis Bacterin, die intramuskulär in den Hals zwischen Schulter und Ohr gegeben wurde. Die zweite Impfung wurde in ähnlicher Weise in die gegenüberliegende Seite des Halses gegeben.
Tabelle 16 EXPERIMENTELLE GRUPPEN UND IMPFSTOFFZUSAMMENSETZUNG^a
Eine Woche nach der zweiten Impfung wurden die Schweine mit einem Gemisch aus 1 : 10 PromAce : Vetalar [Ketamin], etwa 1,0 ml/10 lb Körpergewicht sediert. Als die Schweine ruhiggestellt waren, wurden 2 ml/Nüster der Expositionssuspension per intranasale Intubation verabreicht. Die Schweine wurden zwischenzeitlich beobachtet, bis sie sich von der Sedierung erholt hatten.
Zweihundert Milliliter einer X + 6-Passage von P. multocida Typ D (PMD), Stamm P1683-T3, wurden in zehn Litern Difco Bitek Fermentationsbrühe (BT) geimpft. Die Kultur wurde bis zu einer optischen Dichte (OD_660nm) von 1,45 fermentiert, welche 4,3 × 10⁹ CFU/ml enthielt. Die Kultur wurde durch Zugabe von 20,0 ml Formaldehyd, Rühren bei 37°C für eine Stunde, dann bei 4°C für fünf Tage, inaktiviert. Die inaktivierte Kultur wurde mit einem Amicon DC-10, 100.000-Dalton(Molekulargewicht)-Ausschluss-Hohlfaserfilter 5,3-fach konzentriert. Die Zusammensetzung der Bacterine wird in Tabelle 16 (vgl. vorstehend) dargestellt. Kurz gesagt wurde die PMD-Konzentration bei 5, 10 und 30 × 10⁸ CFU/Dosis in Multikomponenten-Impfstoffen ohne Acemannan variiert, während die anderen Komponenten konstant gehalten wurden. Dieselben Konzentrationen von PMD wurden in den Einzelkomponenten-„Referenz"-Impfstoffen verwendet. Zusätzlich wurden ähnliche Gruppen von Impfstoffen mit Acemannan bei 5 mg/Dosis hergestellt.
Die Inaktivierung wurde durch Inkubation von einem ml jeder der vierzehn Bacterine sowohl in Thioglycollat als auch in tryptischer Sojabrühe bei 25°C und 37°C für vierzehn Tage beurteilt, bevor sie als inaktiv angesehen wurden.
Die Sicherheit der Bacterine wurde durch subkutane Impfung von acht Mäusen mit 0,5 ml subkutan einer bestimmten Bacterin-Zubereitung untersucht. Die Mäuse wurden auf injektionsbedingte Nebenwirkungen untersucht. Eine X-Passage des PMD-Stamms P1683-T3 wurde in zwei Flaschen, enthaltend 75,0 ml BT-Brühe, geimpft. Die Kulturen wurden bei 37°C für 4,5 Stunden inkubiert, während sie bei 125 Umdrehungen pro Minute geschüttelt wurden. Bei einer OD_660nm von 1,65 wurde die Kultur 1 : 4 in BT-Brühe verdünnt und bis zur Verwendung auf Eis gekühlt. Eine Lebendzellzählung zeigte, dass die Expositionslösung 4,5 × 10⁹ und 5,6 × 10⁹ CFU für die beiden Parallelproben enthielt.
Den Ferkeln wurde aus der Vena cava anterior zu folgenden Zeiten Blut entnommen: erste Impfung (V1), zweite Impfung (V2), Exposition (C + 0) und Obduktion (C + 21). In allen Fällen wurde das Blut entnommen, bevor jegliche Lösungen von Bacterin, Sedativ, Expositionslösung oder Einschläferungsmittel verabreicht wurden. Die Blutproben wurden bei 2500 × g für 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Serum wurde gesammelt, für 30 Minuten bei 56°C hitzeinaktiviert und bei –20°C bis zur Testung gelagert.
Enzyme-Linked-Immunosorbant-Assays (ELISA) wurden mit allen Serumproben durchgeführt, um die Antikörperantwort auf die antigenen Komponenten der Bacterine zu beurteilen und um den Nachweis einer Interferenz zwischen den Komponenten zu erleichtern.
Die Schweine wurden auf Nebenwirkungen der Impfung und anschließend auf virusbedingte klinische Zeichen beobachtet. Wegen der Anzahl der Impfgruppen und der Schweine pro Stall, wurden spezifische Zeichen für ein bestimmtes Schwein nicht aufgezeichnet. Die Schweine, die während der 3-wöchigen Beobachtungsphase starben, wurden obduziert und die Spezifität der Todesursache beurteilt. Schweine, die durch nicht-virusbedingte Ursachen starben, wurden aus der weiteren Beurteilung ausgeschlossen. Überlebende Schweine wurden drei Wochen nach der Exposition mit einer Überdosis Pentabarbitol eingeschläfert und obduziert.
Bei der Obduktion wurden die Lungenläsionen und Reaktionen an der Stelle der Impfung aufgezeichnet und in einem Punktesystem bewertet. Die Schnauzen wurden von den Nüstern bis zu den Augenhöhlen entfernt, markiert und später mit einer Bandsäge in Schnitte von einem halben Inch auf der Höhe des zweiten Backenzahns gesägt. Die Schnitte wurden mit einer angelegten Millimeterskala photographiert und anschließend 5 × 7 Inch-Farbphotographien von den Negativen gedruckt.
Alle Punkte-Systeme werden in Tabelle 17 (vgl. nachstehend) dargestellt. Der Schweregrad der Atrophie der Turbinaten wurde morphometrisch aus den 5 × 7 Photos beurteilt. Das morphometrische Protokoll ist dasjenige, das von Collins et al. beschrieben wird (Turbinate perimeter ratio as an indicator of conchal atrophy for diagnosis of atrophic rhinitis in pigs. Am. J. Vet. Res., 50 (3), 1989: 421–424). Die durchschnittlichen Turbinaten-Flächenverhältnisse (TAR) und die durchschnittlichen Turbinaten-Umfangverhältnisse (TPR) der Behandlungsgruppen wurden auf signifikante Unterschiede durch Varianzanalyse analysiert. Tabelle 17 Punktesysteme A. Lungen-Punktesystem: Zählung aller Lungenlappen (4 Pkte./Lappen, 24 Pkte. insgesamt)

1. Teilweiser Zusammenschluss von Lappen (+1)

2. Vollständiger Zusammenschluss von Lappen (+1)

3. Abszess (+1)

4. Fibrinöse Pleuritis (+1)
B. Reaktion an der Impfstelle: (zwei Stellen)

1. nichts bis milde fibrinöse Streifen – 0 Punkte
2. klein (< 1 cm) – 1 Punkt
3. bis zu 1 cm × 3 cm – 2 Punkte
4. > 1 cm × 3 cm – 3 Punkte
5. großer Abszess mit Eiter – 4 Punkte

Alle hergestellten Bacterine waren sicher, wie durch Inokulation von Mäusen nach den 9 C. F. R.-Richtlinien für Sicherheit gezeigt wurde. Bacterine, die Acemannan enthielten, waren mit einer gemischten Kultur von Organismen kontaminiert. Die Impfstoffe schienen jedoch hinsichtlich der Impfstämme inaktiv zu sein.
Die Tabellen 18 und 19 (vgl. nachstehend) fassen die klinischen und pathologischen Bruttoergebnisse der Exposition für die verschiedenen Gruppen zusammen. Die Lungenläsionen waren in allen Gruppen mild. Gleichermaßen war die Sterblichkeitsrate gering. Die Reaktionen an den Impfstellen waren im Allgemeinen mild, aber die schwersten Reaktionen traten tendenziell in Impfstoffen mit der größten Biomasse auf. Unter diesen waren die Läsionen am schwersten, wenn Acemannan vorhanden war. Einige von der Impfung mit Acemannan enthaltenden Impfstoffen stammende Abszesse waren 5 bis 10 cm im Durchmesser.
Tabelle 18 STERBLICHKEIT UND BRUTTO-OBDUKTIONSLÄSIONEN, DIE VON IMPFUNG UND EXPOSITION MIT PASTEURELLA MULTOCIDA TYP D STAMMEN
Tabelle 19 STERBLICHKEIT UND BRUTTO-OBDUKTIONSLÄSIONEN, DIE VON IMPFUNG UND EXPOSITION MIT PASTEURELLA MULTOCIDA TYP D STAMMEN; ACEMANNAN WAR IM IMPFSTOFF ZU 5 MG PRO DOSIS VORHANDEN
Die durchschnittlichen Turbinaten-Umfangverhältnisse (TPR) und Turbinaten-Flächenverhältnisse (TAR) werden in den Tabellen 20 und 21 (vgl. nachstehend) dargestellt. Das TPR für nicht geimpfte Schweine ohne Exposition war signifikant (P ≥ 0,05) größer als alle anderen Gruppen, ausgenommen die neonatale Acemannan-Gruppe (P = 0,1) ein einem einseitigen T-Test. Drei Impfstoffe (Gruppen PMD-1, PMD-2 und 3-Way + D-2) vermittelten einen signifikanten Schutz gegen den Exposition mit toxigenen Lebend-PMD. Man beachte, dass sowohl PMD-2A als auch 3-Wege + D-2A ebenfalls einen signifikanten Schutz vermittelten, jedoch schien die Gegenwart von Acemannan in diesen Produkten keinen zusätzlichen Vorteil hinsichtlich TPR zu bringen. Die TAR der nicht geimpften Schweine ohne Exposition waren signifikant größer, als die aller anderen Gruppen. Nur die PMD-1- und PMD-1A-Impfstoffe vermittelten einen signifikanten Schutz gegen Exposition mit PMD, wie durch die TAR festgestellt wurden. Wieder schien der Zusatz von Acemannan nicht von Vorteil bezüglich der TAR zu sein.
Tabelle 20 MORPHOMETRISCHE BEURTEILUNG DER TURBINATENLÄSIONEN IN DEN KOMBINIERTEN UNTERGRUPPEN
Die Werte sind der Durchschnitt + (Standardabweichung) der Turbinatenflächenverhältnisse (TAR) und der Turbinatenumfangverhältnisse (TPR), wie sie durch digitalisierte Verfolgung der Turbinaten- und Nasenhöhle aus 5 × 7-Photographien der Schnauzenschnitte durch den zweiten vorderen Backenzahn beurteilt werden.
Tabelle 21 MORPHOMETRISCHE BEURTEILUNG DER TURBINATENLÄSIONEN IN DEN KOMBINIERTEN UNTERGRUPPEN DER SCHWEINE, DIE MIT ACEMANNAN ENTHALTENDEN IMPFSTOFFEN GEIMPFT WURDEN
Die Werte sind der Durchschnitt +/– (Standardabweichung) der Turbinatenflächenverhältnisse (TAR) und der Turbinatenumfangverhältnisse (TPR), wie sie durch digitalisierte Verfolgung der Turbinaten- und Nasenhöhle aus 5 × 7-Photographien der Schnauzenschnitte durch den zweiten vorderen Backenzahn beurteilt werden.
ELISA-Tests wurden durchgeführt, um die IgG-Antikörper-Antwort auf jede der Komponenten-Organismen im vollständigen Kombinationsbacterin auf alle Fraktionen des Bacterin-Toxoids nachzuweisen. Die in Tabelle 22 (vgl. nachstehend) dargestellten Daten zeigten keine Interferenz durch Komponenten von B. bronchiseptica, P. multocida und E. rhusiopathiae auf die Antwort auf PMD im Kombinationsbacterin. Obwohl die beiden niedrigeren Dosen des monovalenten PMD-Impfstoffs einen signifikanten Schutz gegen atrophische Rhinitis (Ozaena) vermittelten, war die Antikörper-Antwort gegen diese beiden Impfstoffe schwach, sogar nach der Exposition im Falle des PMD-1-Impfstoffs. Die Antikörperantwort der drei Kombinationsbacterine war durchgängig höher als von irgendeinem anderen in Tabelle 22 (vgl. nachstehend) erwähnten Impfstoff.
Tabelle 22 SEROLOGISCHE ANTWORT (IGG) AUF PASTEURELLA MULTOCIDA, TYP D (PMD) IN SCHWEINEN, DIE MIT PMD ENTHALTENDEN BACTERINEN GEIMPFT WURDEN
Der Vergleich wurde zu Bacterinen ohne PMD und zu Serum von nicht geimpften Schweinen angestellt, um die Interferenz zwischen anderen Komponentenorganismen und dem PMD zu beurteilen. Die Seren wurden zum Zeitpunkt der ersten Impfung (V1), zum Zeitpunkt der zweiten Impfung (V2), zum Zeitpunkt der Exposition (C + 0) und zum Zeitpunkt der Obduktion (C + 21) gesammelt. Die Antwort wurde durch ELISA-Tests mit einem PMD-Antigen aus ultrabeschallten ganzen Zellen, gebunden an die Testnäpfe, gemessen.
Wie Tabelle 23 (vgl. nachstehend) anzeigt, kann es eine Interferenz durch PMD mit PMA bei den beiden höheren Konzentrationen des PMD in den Kombinationsbacterinen gegeben haben. Dies kann jedoch abnormal sein, da die Antwort auf PMA in dem 3-Wege + D + Tox-Impfstoff, der dieselbe Konzentration an PMD wie 3-Wege + D-2 hat, der Antwort auf den 3-Wege-Impfstoff ähnlich war. Die Antwort auf Bordetella und Erysipelothrix war in allen Impfstoffen gut, ohne offensichtliche Interferenz.
Tabelle 23 SEROLOGISCHE ANTWORT (IGG) AUF PASTEURELLA MULTOCIDA, TYP A (PMA), BORDETELLA BRONCHISEPTICA (BB) UND ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE (E. RHU) IN SCHWEINEN, DIE MIT BACTERINEN GEIMPFT WURDEN, DIE DIESE KOMPONENTEN ENTHIELTEN
Vergleich zu Bacterinen mit PMD und zu Serum von nicht geimpften Schweinen zur Beurteilung der Interferenz durch PMD mit diesen anderen Komponentenorganismen. Die Seren wurden zum Zeitpunkt der ersten Impfung (V1), zum Zeitpunkt der zweiten Impfung (V2), zum Zeitpunkt der Exposition (C + 2) und zum Zeitpunkt der Obduktion (C + 21) gesammelt. Die Antwort wurde durch ELISA-Tests mit geeignetem Antigen aus mit Ultraschall behandelten ganzen Zellen, gebunden an die Testnäpfe, gemessen.
Beispiel 16
Impfungs-/Expositions-Studie an Ferkeln mit und ohne Acemannan
Eine minimale Schutzdosis an PMD, wie geprüft, waren 5 × 10⁸ CFU, wie durch die Verminderung der Läsionen der Ozaena bestimmt wurde. Sowohl TAR- als auch TPR-Werte unterstützten diesen Rückschluss. Eine Dosis von 1 × 10⁹ war ebenfalls schützend, wie durch das TPR angezeigt wurde. Es gab keine deutliche Wirkung der Impfung und der Exposition auf die Lungenläsionen. Diese Beobachtungen unterstützen stark die Dosis von 5 × 10⁹ CFU im Referenzbacterin und 1 × 10⁹ CFU in der Kombination.
Keine Interferenz mit Pasteurella Typ D durch Bordetella, Erysipelothrix und der Typ-A-Pasteurella spiegelte sich in der serologischen Antwort auf PMD wider. Der Mangel an Signifikanz auf dem 0,05-Niveau für TPR oder TAR im Kombinationsbacterin mit 5 × 10⁸ PMD legt jedoch einen milden Grad von Interferenz nahe. Die hohe Dosis (3 × 10⁹ CFU) von PMD hemmte offensichtlich die schützende Antwort. Dies ist ein Phänomen, das wir auch schon vorher gesehen haben. Die Ursache dieser Interferenz bei hohen Dosen ist unsicher, die Ergebnisse erfordern jedoch Vorsicht beim Zusatz von übermäßig viel (viel mehr als 1 × 10⁹ CFU) PMD in Produktionsserien. Der Zusatz von Acemannan zu den Bacterinen war nicht notwendig, um eine schützende Antwort hervorzurufen. Tatsächlich war der offensichtliche Beitrag dieser Charge von Acemannan zu den Reaktionen an den Impfstellen als Gegenanzeige für ihre Verwendung ausreichend.
Ein Vorteil des verwendeten Acemannan schien in den Gruppen aufzutreten, denen 3 Dosen im Alter von 1, 3 und 5 Tagen gegeben wurden, gefolgt von Impfung mit dem Kombinationsbacterin im Alter von 7 und 21 Tagen. Diese Gruppe wurde gegen die folgende Exposition mit PMD in einem Ausmaß geschützt, dass das TPR nicht nur im Vergleich zu nicht geimpften Schweinen mit Exposition signifikant verbessert war, sondern auch die einzige Gruppe war, deren TPR nicht signifikant unterschiedlich zum TPR der Kontrollgruppen ohne Exposition war. Diese Beobachtung legt nahe, dass eine nicht-spezifische Stimulierung oder ein „Priming" durch Acemannan im Neugeborenen hervorgerufen werden kann.
Obwohl die Bacterin-Toxoide allesamt den Maus-Sicherheitstest bestanden hatten, wurde bei manchen gefunden, dass sie eine niedrige Kontaminationsrate enthielten. Acemannan wurde zu den Bacterin-Toxoiden als nicht sterilisiertes Pulver gegeben und trug stark zu der in diesen Produkten gefundenen Kontamination bei. Die Formalinkonzentration wurde bei allen Produkten zwischen 0,15 und 0,17% festgestellt, was innerhalb der annehmbaren Grenzen ist. Wenn Acemannan in der endgültigen Zubereitung enthalten sein sollte, müsste eine längere Inaktivierungszeit in das Protokoll aufgenommen werden.
Im Allgemeinen waren die Beurteilung der klinischen Zeichen und die subjektive Beurteilung oder Bewertung der Lungen- und Schnauzenläsionen nach einem Punktesystem keine nützlichen Kriterien, um den Schutz durch Impfung mit PMD zu bestimmen. Die hauptsächliche Läsion der PMD-Infektion ist die atrophische Rhinitis. Daher ist es nicht überraschend, dass Lungenläsionen nicht als wesentliche Komponente der Krankheit in dieser Studie beitrugen. Die Schnauzen nach Schwere der atrophischen Rhinitis auszuwerten ist subjektiv und liefert diskontinuierliche Daten. Die Anwendung von Morphometrie bei der Beurteilung der Schnauzenläsionen liefert objektive Daten, die nutzbringend durch parametrische statistische Verfahren analysiert werden können, wie es in dieser Studie gemacht wurde.
Diskussion
Die in den vorstehenden Beispielen dargestellten Daten legen nahe, dass der Zusatz von Acemannan zu einem Impfstoff die Immunogenität des Virus erhöht. Während der Mechanismus, durch den dieses geschieht, noch nicht sicher ist, schlägt ein Modell die Beteiligung von Makrophagen vor. Alle Makrophagen sind dafür bekannt, Oberflächen-Mannoserezeptoren zu tragen, die bei der unspezifischen Antwort auf Bakterien und Pilze, deren Oberflächen oft reich an Mannose sind (Largent et al., 1984), hilfreich sein würden. Es wird angenommen, dass Makrophagen nach der Impfung eine Rolle beim Transport und bei der Replikation von Virus im Wirt spielen. Der Zusatz von Acemannan zum Impfstoff kann die Transformation der Makrophagen im ruhenden Zustand zum aktivierten Zustand unterstützen, wodurch Prozessierung und Transport des Virus effizienter ermöglicht wird. Dies würde vermutlich zu einer wirksameren Antwort auf die Exposition nach der Impfung führen, insbesondere im Fall einer frühen oder anderweitig gravierenden Exposition.
Die vorstehend präsentierten Daten weisen darauf hin, dass ein Bacterin mit einer Kombination aus Bordetella, Erysipelothris und Pasteurella Typ A wirksam bei der Verleihung eines Schutzes gegen Krankheit ist. Die Daten legen weiterhin nahe, dass parenteral gegebenes Acemannan die Wirksamkeit eines nachfolgend verabreichten Impfstoffs verstärkt.
Literaturnachweis

1. Bacon, L. D. et al. Augmentation of retrovirus-induced lymphoid leukosis by Marek's Disease in White Leghorn Chickens. J. Virol. 63: 504–512 (1989).
2. Largent, B. L. et al. Carbohydrate-specific adhesion of alveolar macrophages to mannose-derived surfaces. J. Biol. Chem. 259: 1764–1769 (1984).

Claims

Impfstoff, umfassend eine wirksame immunisierende Menge eines modifizierten Lebendvirus, ein komplexes Kohlenhydrat in einer Menge, die wirksam ist, um die Immunogenität des modifizierten Lebendvirus zu verstärken, und einen geeigneten Träger, wobei das komplexe Kohlenhydrat ausgewählt ist aus Mannan, Glucan und Lävan.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das modifizierte Lebendvirus ein modifiziertes Lebend-Vogelvirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 2, wobei das modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Putenherpesvirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 3, wobei das modifizierte Lebend-Putenherpesvirus der Stamm FC126 (ATCC Nr. VR 584B) ist.
Impfstoff nach Anspruch 3 oder 4, wobei die wirksame immunisierende Menge des modifizierten Lebend-Putenherpesvirus in von Putenherpesvirus infizierten Zellen vorhanden ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die wirksame immunisierende Menge des modifizierten Lebend-Putenherpesvirus die Menge ist, welche in etwa 20.000 Puten-Herpesvirus-infizierten Zellen vorhanden ist.
Impfstoff nach Anspruch 2, wobei das modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Marek-Virus, ein modifiziertes Lebend-Newcastle-Disease-Virus, ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bursal-Disease-Virus, ein modifiziertes Lebend-Infectious Bronchitis Virus oder ein modifiziertes Lebend-Vogel-Reovirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das modifizierte Lebendvirus ein modifiziertes Lebend-Schweinevirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 8, wobei das modifizierte Lebend-Schweinevirus ein modifiziertes Lebend-Pseudowut-Virus, ein modifiziertes Lebend-Coronavirus oder ein modifiziertes Lebend-Parvovirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das modifizierte Lebendvirus ein modifiziertes Lebend-Katzenvirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 10, wobei das modifizierte Lebend-Katzenvirus ein modifiziertes Lebend-Katzenleukämievirus, ein modifiziertes Lebend-Katzen-T-Zell-Leukämievirus oder ein modifiziertes Lebend-Katzen-Immundefektvirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das modifizierte Lebendvirus ein modifiziertes Lebend-Hundevirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 12, wobei das modifizierte Lebend-Hundevirus ein modifiziertes Lebend-Coronavirus, ein modifiziertes Lebend-Parvovirus oder ein modifiziertes Lebend-Staupe-Virus ist.
Impfstoff nach Anspruch 1, weiterhin umfassend ein zweites modifiziertes Lebendvirus.
Impfstoff nach Anspruch 14, wobei die ersten und zweiten modifizierten Lebend-Viren modifizierte Lebend-Vogelviren sind.
Impfstoff nach Anspruch 15, wobei das erste modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Putenherpesvirus ist und das zweite modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Marek-Virus Serotyp I oder ein modifiziertes Lebend-Marek-Virus Serotyp II oder ein modifiziertes Lebend-Newcastle-Disease-Virus, oder ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bursal-Disease-Virus oder ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bronchitis-Virus oder ein modifiziertes Lebend-Vogel-Reovirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 15, wobei das erste modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Marek-Virus Serotyp I und das zweite modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Marek-Virus Serotyp II oder ein modifiziertes Lebend-Newcastle-Disease-Virus oder ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bursal-Disease-Virus oder ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bronchitis-Virus oder ein modifiziertes Lebend-Vogel-Reovirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 15, wobei das erste modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Marek-Virus Serotyp II und das zweite modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Newcastle-Disease-Virus oder ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bursal-Disease-Virus oder ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bronchitis-Virus oder ein modifiziertes Lebend-Vogel-Reovirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 15, wobei das erste modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Newcastle-Disease-Virus und das zweite modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bursal-Disease-Virus oder ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bronchitis-Virus oder ein modifiziertes Lebend-Vogel-Reovirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 15, wobei das erste modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bursal-Disease-Virus und das zweite modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bronchitis-Virus oder ein modifiziertes Lebend-Vogel Reovirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 15, wobei das erste modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Infectious-Bronchitis-Virus und das zweite modifizierte Lebend-Vogelvirus ein modifiziertes Lebend-Vogel-Reovirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 14, wobei die ersten und zweiten modifizierten Lebend-Viren modifizierte Lebend-Schweineviren sind.
Impfstoff nach Anspruch 14, wobei die ersten und zweiten modifizierten Lebend-Viren modifizierte Lebend-Katzenviren sind.
Impfstoff nach Anspruch 14, wobei die ersten und zweiten modifizierten Lebend-Viren modifizierte Lebend-Hundeviren sind.
Impfstoff nach Anspruch 14, weiterhin umfassend ein drittes modifiziertes Lebendvirus.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei die wirksame immunisierende Menge des modifizierten Lebendvirus eine Menge von größer als etwa 1.000 Plaque-bildende Einheiten („plaque forming units") ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 6, 14 bis 20 und 25 bis 26, wobei die wirksame immunisierende Menge des modifizierten Lebend-Putenherpesvirus eine Menge größer als etwa 3.000 Plaque-bildende Einheiten („plaque forming units") ist.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das Mannan ein β(1 → 4) verknüpftes Mannan ist.
Impfstoff nach Anspruch 28, wobei das β(1 → 4) verknüpfte Mannan ein Acemannan ist.
Impfstoff nach Anspruch 29, wobei das Acemannan ein Extrakt aus dem Blatt der Aloe barbadensis-Pflanze ist.
Impfstoff nach Anspruch 29 oder 30, wobei der wirksame Teil des Acemannan eine Menge größer als etwa 50 Mikrogramm ist.
Impfstoff nach Anspruch 31, wobei die wirksame Menge des Acemannan eine Menge von etwa 50 Mikrogramm bis etwa 1000 Mikrogramm, vorzugsweise eine Menge von etwa 50 Mikrogramm bis etwa 150 Mikrogramm und besonders bevorzugt eine Menge von etwa 100 Mikrogramm ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 32, wobei der geeignete Träger einen wässrigen Puffer umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 33, wobei der wässrige Puffer einen Phosphatpuffer umfasst.
Verwendung eines modifizierten Lebendvirus, eines komplexen Kohlenhydrats und eines geeigneten Trägers für die Herstellung eines Impfstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 34 zur Immunisierung eines Tiers gegen Viruskrankheiten.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei das Tier ein Tag altes Geflügel, ein Schwein, eine Katze oder ein Hund ist.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei das ein Tag alte Geflügel ein ein Tag altes Küken, eine ein Tag alte Pute, Ente oder Wachtel ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 35 bis 37, wobei die Immunisierung intramuskuläre Injektion, subkutane Injektion, orale Verabreichung oder Verabreichung durch Augentropfen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei das Tier ein Huhn und die Krankheit Marek's Disease ist.