JPH07506565A - アジュバントとしてのアセマンナンを含有するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の名称〕 アジュバントとしてのアセマンナンを含有するワクチン〔本発明の背景〕 ウィルス性疾患の蔓延を制御する１つのアプローチとしては、生きたウィルスを 改変し、ワクチンとして投与することがある。アジュバントをウィルスに適用し 、ワクチンの免疫原性を高め、これによってその防御能力を増加する。

マレク病は、家禽産業において重要である。マレク病ウィルスでの感染は、致命 的なリンパ球増殖性障害を起こし、白血症による廃棄を含む主な生産因子（但し 、これだけに制限されない。）に有意な損失を引き起こす。ひな当たりの死亡率 、供給の変化（ｆｅｅｄ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）　、全コストを含んだ生産性 の他の指針は、病気の過酷な発生によっても影響を受けうる。病気のコントロー ルは、生きたウィルスを改変したワクチン、主として、七面鳥の改変された生き たヘルペスウィルスワクチン（マレク病つィルス七ロタイブ■）を用いて試され てきた。七面鳥のヘルペスウィルス（ＨＶＴ）でワクチン接種することは、マレ ク病を防止するのに非常に効果があると考えれらているが、若干の損失が、フィ ールドへのウィルス攻撃による低レベルの廃棄、免疫抑制、及び非常に感染力の 高いマレク病（ｖｖＭＤ）のウィルス攻撃による明確な症状に見い出され続ける 。非常に感染力の高いマレク病の制御は、二価のマレク病つィルス七ロタイブ■ 及び■ワクチンで試みられている。しかし、これらのワクチンの使用は、鳥の特 定の種でリンパ球性白血病の増加を伴う　（Ｂａｃｏｎら、１９８９）。

改善された防御能力を有するアジュバントを含有するワクチンは、現在存在して いるマレク病ワクチンが使用されているにもかかわらず起こり続けている損失を 除去する助けになるり、従って家禽産業において非常に価値がある。

アロエバルバデンシス（八ｒｏｅ　ｂａｒｂａｄｅｎｓｉｓ）植物（アロエベラ （Ａａｒｏｅ　ｖｅｒａ））の葉は、アセマンナン（ａｃｅｍａｎ−ｎａｎ）と して知られるβ−（１，４）結合したアセチル化マンナン（約１００万ｋＤａの 水溶性ポリマー）を大量に含有している。アセマンナンの製造は、米国特許第４ ，７３５゜９３５（８月５日、１９８８年）、４，８５１，２２４　（７月２５ 日、１９８９年）、、４，９１７，８９０　（８月１７日、１９９０年）、４， ９５７，９０７（９月１８日、１９９０年）、４，９５９，２１４　（９月２５ 日、１９９０年）、及び４，９６６．８９２　（１０月３０日、１９９０年）に 開示されている。ワクチンの防御能力を改善するためにアジュバン）・どしてア セマンナンを使用することは、以前には開示されていない。

本発明は、アセマンナンをアジュバントとして含有する七面鳥のヘルペスウィル スワクチン、アセマンナンアジュバントを含有する改変された生きたウィルスワ クチン、及び複合炭水化物アジュバントを含有する改変された生きたウィルスワ クチンを提供する。また、本発明は、細菌性抗原及びアセマンナンアジュバント を含有した細菌ワクチンを提供する。

〔発明の概要〕

本発明は、七面鳥のヘルペスウィルスワクチンであって、投与量光たり、効果的 に免疫する量の七面鳥の改変された生きたヘルペスウィルス、該七面鳥のヘルペ スウィルスの免疫原性を高めるのに効果的な量のアセマンナン、及び適切な担体 を含有するワクチンを提供する。本発明はまた、投与量光たり、効果的に免疫す る量の改変された生きたウィルス、該改変された生きたウィルスの免疫原性を高 めるのに効果的な量のアセマンナン、及び適切な担体を含有するワクチンを提供 する。本発明は、更に投与量光たり、改変された生きたウィルス、該改変された 生きたウィルスの免疫原性を高めるのに効果的な量の複合炭水化物、及び適切な 担体を含有するワクチンを提供する。マレク病に対してひなを免疫化する方法、 及びウィルス性疾患に対して動物を免疫する方法も本発明によって提供される。

本発明は、投与量光たり、効果的に免疫する量の細菌性抗原、該細菌性抗原の免 疫原性を高めるのに効果的な量のアセマンナン、及び適切な担体を含有する細菌 性ワクチンを提供する。更に、本発明の細菌性ワクチンを、適切な年齢で動物に 投与することを具備した細菌性疾患に対して動物を免疫する方法を提供する。本 発明は、更に、細菌性疾患に対して動物を免疫する方法であって、適切な担体中 の細菌性抗原、及び適切な担体中の細菌性抗原の免疫原性を高めるのに効果的な 量のアセマンナンを動物に投与することを具備した方法を提供する。

〔本発明の詳細な説明〕

本発明は、七面鳥のヘルペスウィルスワクチンであって、投与量光たり、免疫化 するのに効果的な量の七面鳥の改変された生きたヘルペスウィルス（ＨＶＴ）　 、該七面鳥のヘルペスウィルスの免疫原性を高めるのに効果的な量のアセマンナ ン、及び適切な担体を含有するものを提供する。本発明の目的において、七面鳥 の改変された生きたヘルペスウィルス「効果的に免疫する量」とは、家禽を免疫 するのに効果的な、七面鳥の改変された生きたヘルペスウィルスの任意の量であ る。本発明の実施において、七面鳥の改変された生きたへＪレベスウイルスの「 効果的に免疫する量」は、望ましく！ｉ約１０００プラーク形成単位よりも多い 量である。好ましく１よ、七面鳥の改変された生きたヘルペスウィルスを効果的 に免疫する量は、約３０００プラーク形成単位よりも多Ｉ７）量である。

七面鳥のヘルペスウィルスが、細胞共生ウィルスであることは周知である。従っ て、本発明のＨＶＴワクチン番よ、七面鳥感染細胞のヘルペスウィルスのうち、 効果的に免疫する量の改変された生きたヘルペスウィルスを含有しうる。望まし くは、効果的に免疫する量の七面鳥の改変された生きｔニヘルベスウイルスは、 約２０，ＯＯＯＨＶＴ感染細胞に存在する量である。典型的゛には、七面鳥感染 細胞のヘルペスウィルスは、種々の段階で細胞を維持するのに適切な細胞培養培 地）こ懸濁される。

本発明の目的として、［七面鳥の改変された生きたウィルスＪは、七面鳥のヘル ペスウィルスを任意に無毒化、若しくは減毒化したものでありうる。これは、例 えば無毒化した七面鳥のヘルペスウィルス系ＦＣ１２６（アメリカンタイプカル チャーコレクション（ＡＴＣＣアクセツションＮｃｉＶＲ５８４Ｂ）より入手可 能である。）の様なウィルスでワクチン接種された動物において免疫応答を誘導 しうるものである。

上述したように、本発明の七面鳥のヘルペスウィルスワクチンはアセマンナンを 含有する。米国特許第４，８５１，２２４に開示されているように、アセマンナ ンは、多分散性の多糖化合物であり、１００，０００ダルトンよりも大きし）分 子量を有するアセマンナンポリマーを少なくとも７３％含んでいるものである。

米国特許第４，９５７，９０７には、アセマンナンが、β（１→４）結合したマ ンノシルユニットからなること、及びアセチル基が、酸素原子を介してポリマー に結合され、該アセチル化の度合いが、はぼ０．８アセチル基／モノマーである こと（これは、Ｈｅｓｔｒｉｎのアルカリ性ヒドロキサメート法によって決定さ れた（Ｊ．　Ｂｉｏ．　Ｃｈｅｗ。

１、８０：　２４０　（１９４９））が開示されている。更に、中性糖結合分析 が開示されており、該分析により、おそらくａ（２→６）結合を介してＤ−ガラ クトピラノース残基が、はぼ７０個の糖ごとに１個の割合でポリマーに結合され て１／）ることが示される。このガラクトースに対するマンノースの比が２０： １であることは、ガラクトースユニットもお互Ｉ／１に、主にβ（ｌ−４）グリ コシド結合で結合していることを示してし）る。アセマンナンポリマーの化学構 造は、米国特許第４，９５７。

９０７に開示されており、以下のようなものである。

０Ａｃ ｄｅｎｓｉｓ）植物の葉から抽出されうる。しがし、ここで使用される「アセマ ンナン」の語は、この抽出物だけでなく、化学合成又は組織培養生産を含んだ任 意の方法によって誘導されるアセマンナンも包含する。

本発明の実施において、「効果的な量の」アセマンナンとは、典型的には、約５ ０マイクログラムよりも多い量、望ましくは約５０マイクログラムから約１００ ０マイクログラムの量である。より望ましくは、アセマンナンの効果的な量は、 約５０マイクログラムから約１５０マイクログラムの量である。現在の本発明の 好ましい態様において、アセマンナンの効果的な量は、約１００マイクログラム の量である。

本発明の実施に従ったワクチンに対する適切な担体は、当業者に周知の多数の何 れの水性バッファーであっても良い。

現在、好ましい水性バッファーは、例えば以下の例で開示されるホスフェートバ ッファーのようなホスフェートバッファーである。

本発明はまた、マレク病に対してひなを免疫する方法であって、本発明の七面鳥 のヘルペスウィルスワクチンの投与量を１日齢のひなに投与することを具備した 方法を提供する。

現在のところ、ワクチンは皮下注射若しくは筋肉内注射で投与されることが好ま しい。

本発明は、更に、投与量当たり、効果的に免疫する量の改変された生きたウィル ス、該改変された生きたウィルスの免疫原性を高めるのに効果的な量のアセマン ナン、及び適切な担体を含有するワクチンを提供する。本発明の目的として、改 変された生きたウィルスの「効果的に免疫する量」は、動物を免疫するのに効果 的な改変された生きたウィルスの任意の量である。改変された生きたウィルスを 効果的に免疫する量を決定する方法は、当業者に周知であり、過度の実験をする ことなく容易に決定しうる。本発明の実施において、改変された生きたウィルス の効果的な量は、典型的には、１，０００プラ一ク形成単位よりも多い量である 。本発明の目的において、　「改変された生きたウィルス」は、無毒化、若しく は減毒化された任意のウィルスであって、該ウィルスでワクチン接種されたどう ぶつに免疫応答を誘導しうるものでありうる。

本発明の一態様において、改変された生きたウィルスは、改変された生きた鳥類 ウィルスである。適切な鳥類ウィルスには、改変された生きたマレク病ウィルス 、例えば七面鳥のヘルペスウィルス系ＦＣｌ２６；又はマレク病つィルス七ロタ イブＩ　（例えば、３０１−Ｂｌ系）が含まれる。適切なウィルスには、改変さ れた生きたのニューカッスル病ウィルス、例えばニューカッスル病ウィルス系Ｂ ＩＢＩ又はＬａ５ｏｔａ系も含まれる。適切な鳥類ウィルスには、更に改変され た生きた感染性嚢包性疾患ウィルス（Ｂｕｒｓａｌ　ｄｉｓｅｒｓｅ　ｖｉｒｕ ｓ）、例えば感染性の嚢包性疾患ウィルスＬｕｋｅ　ｒ　を系（Ｂｕｒ−ｓｉｎ ｅ　２）又は２５１２系が含まれる。適切な鳥類ウィルスには、更に、改変され た生きた感染性の気管支炎ウィルス、例えば感染性の気管支炎ウィルスのＭａｓ ｓ、、Ｃｏｎｎ、。

又はＡｒｋ、系がある。適切な鳥類ウィルスには、更に、改変された生きた鳥類 レオウィルス、例えば鳥類レオウィルス系（Ａｖｉａｎ　Ｒｅｏｖｉｒｕｓ　５ ｔｒａｉｎ）　１１３３が含まれる。

本発明の他の態様において、改変された生きたウィルスは、改変された生きた豚 のウィルス、例えば改変された生きた仮性狂犬病ウィルス、コロナウィルス、又 はパルボウイルスでありうる。

本発明の他の態様において、改変された生きたウィルスは、改変された生きた猫 のウィルス、例えば、改変された生きた猫白血病ウィルス、猫Ｔ−細胞白血病ウ イルス、又は猫免疫不全ウィルスでありうる。

本発明の他の態様では、改変された生きたウィルスは、改変された生きた大ウィ ルス、例えば、改変された生きた犬コロナウィルス、パルボウイルス又はジステ ンパーウィルスでありうる。

上述したように、本発明のワクチンは、「アセマンナン」を含有する。アセマン ナンは、アロエバルバデンシス（Ａｌｏｅ　ｂａｒｂａｄｅｎｓｉｓ）植物の葉 から抽出されうる。しかし、ここで使用される「アセマンナン」の語は、この抽 出物だけでなく、化学合成又は組織培養生産を含んだ任意の方法によって誘導さ れるアセマンナンも包含する。このようなワクチンでは、効果的な量のアセマン ナンは典型的には、約５０マイクログラムよりも多い量、望ましくは約５０マイ クログラムから約１，０００マイクログラムの量である。

本発明は、第二の改変された生きたウィルスを更に含有するこのようなワクチン を提供する。第一の改変された生きたウィルス及び第二の改変された生きたウィ ルスは、改善された生きた鳥類ウィルスでありうる。本発明の１つの態様では、 第一の改変された生きた鳥類ウィルスは、改変された七面鳥のヘルペスウィルス であり、第二の改変された生きた鳥類ウィルスは、改変された生きたマレク病つ ィルス七ロタイブ■、マレク病つィルス七ロタイブ■、ニューカッスル病ウィル ス、感染性気管支炎ウィルス、感染性嚢包性疾患ウィルス又は鳥類レオウィルス でありうる。本発明の他の態様では、第一の改変された生きた鳥類ウィルスは、 改変された生きたマレク病つィルス七ロタイブＩであり、第二の改変された生き た鳥類ウィルスは、改変された生きたマレク病つイルスセトタイブ■、ニューカ ッスル病ウィルス、感染性気管支炎ウィルス、感染性嚢包性疾患ウィルス又は鳥 類レオウィルスでありうる。

本発明の他の態様では、第一の改変された生きた鳥類ウィルスは、改変された生 きたニューカッスル病ウィルスであり、第二の改変された生きた鳥類ウィルスは 、感染性気管支炎ウィルス、感染性嚢包性疾患ウィルス又は鳥類レオウィルスで ありうる。本発明の他の態様では、第一の改変された生きた鳥類ウィルスは、改 変された生きた感染性気管支炎ウィルスであり、第二の改変された生きた鳥類ウ ィルスは、感染性嚢包性疾患ウィルス又は鳥類レオウィルスでありうる。本発明 の他の態様では、第一の改変された生きた鳥類ウィルスは、感染性嚢包性疾患ウ ィルスであり、第二の改変された生きた鳥類ウィルスは、鳥類レオウィルスであ りうる。

第一の改変された生きたウィルス及び第二の改変された生きたウィルスは改変さ れた生きた豚ウィルス、改変された生きた猫ウィルス又は改変された生きた大ウ ィルスでもありうる。

本発明は、更に第三の改変された生きたウィルスを更に含有するこのようなワク チンを更に提供する。

本発明は、ウィルス性疾患に対して、動物を免疫する方法であって、該動物に本 発明のワクチンの投与量を投与することを具備した方法を提供する。該動物は、 １日齢の家禽、例えば１日齢の鶏、七面鳥、アヒル又はうずらでありうる。該動 物はまた、豚でありうる。該動物は、更に猫でありうる。

該動物は、更に犬でありうる。動物にワクチンを投与するのに適切な年齢、及び 必要であれば、ブースターワクチンを投与するための間隔は、当業者に周知であ るか、又は過度の実験をせずに容易に決定しうる。該ワクチンは、経口的、点眼 によって、皮下注射によって、又は筋肉内注射によって投与されうる。

本発明は、投与量当たり、効果的に免疫する量の改変された生きたウィルス、該 改変された生きたウィルスの免疫原性を高めるのに効果的な量の複合炭水化物、 及び適切な担体を含有するワクチンを提供する。本発明の目的において、改変さ れた生きたウィルスの「効果的に免疫する量」は、動物を、免疫するのに効果的 な改変された生きたウィルスの任意の量である。改変された生きたウィルスを効 果的に免疫する量を決定するための方法は、当業者に周知であるか、又は決まり きった実験で容易に決定することができる。本発明の実施において、改変された 生きたウィルスを効果的に免疫する量は、典型的には、１．．０００プラ一ク形 成単位よりも多い量である。該改変された生きたウィルスは、ウィルスが接種さ れた動物で、免疫応答を誘導しうる任意の無毒化、若しくは減毒化したものであ る。本発明の１つの態様では、該改変された生きたウィルスは、改変された生き た鳥類ウィルス、例えば七面鳥の改変された生きたヘルペスウィルスである。

先に述べたように、本発明のワクチンは、複合炭水化物を含有する。複合炭水化 物の「効果的な量」を決定するための方法は、当業者に周知であるか、又は決ま りきった実験で容易に決定することができる。典型的には、複合炭水化物の効果 的な量は、約５０マイクログラムより多い量、望ましくは約５０マイクログラム から約１，０００マイクログラムの量である。本発明の１つの態様では、複合炭 水化物は、マンナン、例えばβ−（１−４）結合したマンナンでありうる。好ま しくは、該β−（１−４）結合したマンナンはアセマンナンである。本発明の他 の態様では、該複合炭水化物はグルカン、例えばβ−（１−３）結合したグルカ ンでありうる。本発明の実施に有効なβ−（１−３）結合したグルカンは、レン チナン（ＩｅｎＬｉｎａｎ）でありうる。グルカンはグルコース単位からなるポ リマーでできた多糖化合物である。本発明の他の態様では、該複合炭水化物はレ バン、例えばβ−（２→６）−結合したルビーン（ｌｖｅａｎ）である。本発明 の実施に有用なβ−（２−６）−結合したレバンは、アエロバクテルレバニカム （Ａｃｒｏｂａｃｔｅｒ　ｌｅｖａｎｉｃｕｍ）からのレノくンである。

本発明はまた、ウィルス性疾患に対して動物を免疫する方法であって、投与量の 本発明のワクチンを動物に投与することを具備した方法を提供する。該動物は家 禽、例えば鶏、七面鳥、アヒル又はうずらでありうる。

本発明は、更に、投与量当たり、効果的に免疫する量の細菌性抗原、該細菌性抗 原の免疫原性を高めるのに効果的な量のアセマンナン、及び適切な担体を含有す る細菌性ワクチンを提供する。本発明の目的において、細菌性抗原を「効果的に 免疫する量」は、動物を免疫するのに効果的な細菌性抗原の任意の量である。こ こで用いられる「細菌性抗原」という語は、細菌性サブユニット、改変された生 きた細菌又は不活性化された細菌が包含される。

ここで用いられる「細菌性サブユニット」という語には、１以上の細菌性抗原決 定基が包含される。本発明の実施では、細菌性サブユニットを効果的に免疫する 量は、典型的には、約１０マイクログラムより多い量であり、望ましくは、約１ ０マイクログラムから１０，０００マイクログラムの量である。更に望ましくは 、細菌性サブユニットを効果的に免疫する量は、約１０マイクログラムから１． ．０００マイクログラムである。

ここで使用される「改変された生きた細菌」という用語は、無毒化若しくは減毒 化された細菌を包含するが、これらに制限されない。本発明の実施において、該 改変された生きた細菌を効果的に免疫する量は、典型的には、約１０７コロニー 形成単位（ｃｆｕｓ）よりも多い量であり、望ましくは約１０７ｃ　ｆ　ｕ　ｓ から約１０］２ｃｆｕｓの量である。より望ましくは、該改変された生きた細菌 を効果的に免疫する量は、約１．０７ｃｆｕｓから約１０１０ｃｆｕｓの量であ る。

ここで用いられる「不活性化された細菌」の語は、クローニングを開始する能力 を失った不活性な細菌を意味する。この能力の消失は、細菌内で起こる化学基の 修復不可能な変換又は化学結合の開裂のような化学的な出来事の結果である。

これらの出来事を十分な回数経験した細菌が不活性化される。

細菌を不活性化する方法、例えば光照射若しくは熱処理は、同業者に周知である か、又は過度の実験をすることなく容易に決定される。本発明の実施において、 該不活性化された細菌を効果的に免疫する量は、典型的には、約ｌＯ７コロニー 形成単位（ｃｆｕｓ）よりも多い量であり、望ましくは約１０７ｃ　ｆ　ｕ　ｓ から約１０１２ｃｆｕｓの量である。より望ましくは、該不活性化された細菌を 効果的に免疫する量は、約１０７ｃｆｕｓから約１０１０ｃｆｕｓの量である。

本発明の１つの態様において、細菌性抗原は、豚細菌性抗５ｔｒｅ　Ｌｏｃｏｃ ｃｕｓ　５ｕｉｓ又はＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｌｉ抗原である。

本発明の他の態様では、該細菌性抗原は、及第動物の細菌性抗原、例えばＰａ５ ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌ　ｔｉｃａ、　Ｈａｅｍｏ−使用されるＥ反扁 動物」という語は、ウシ、羊、及びヤギを包含するが、これらに限定されない。

本発明の他の態様では、該細菌性抗原は、ウマの細菌性抗原、例えばＢｏｒｒｅ ｌ　ｉａ上述したように、本発明の細菌性ワクチンは、アセマンナンを含有する 。アセマンナンは、アロエバルバデンシス（Ａｌｏｅ　ｂａｒｂａｄｅｎｓｉｓ ）植物の葉から抽出されうる。しかし、ここで使用される「アセマンナン」の語 は、この抽出物だけでなく、化学合成又は組織培養生産を含んだ任意の方法によ って誘導されるアセマンナンも包含する。本発明の実施では、効果的な量のアセ マンナンは典型的には、約１００マイクログラムよりも多い量、望ましくは約１ ００マイクログラムから約ｉ、ｏｏｏマイクログラムの量である。より望ましく は、効果的な量のアセマンナンは、約３００マイクログラムから約７００マイク ログラムである。更に望ましくは、効果的な量のアセマンナンは約５００マイク ログラムである。

細菌性ワクチンの適切な担体は、同業者に周知である。細菌性ワクチンの適切な 担体は、多数の食塩水溶液のなかの任意の１つである。現在のところ、アジュバ ント活性を有する水溶性の化合物、例えば水酸化アルミニウム、並びに少量の防 腐剤及び着色剤を含有した食塩水が好ましい。

本発明は、細菌性疾患に対して動物を免疫する方法であって、本発明の細菌性ワ クチンの投与量を動物に投与することを具備した方法を提供する。本発明の実施 において、該動物はブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ又はウマでありうる。細菌性ワク チンを動物に投与するための適切な年齢、及び必要であれば、ブースター投与量 を投与する間隔は、当業者に周知であるか、又は決まりきった実験で容易に決定 しうる。細菌性ワクチンは、皮下若しくは筋肉的注射によって投与されうる。

本発明はまた、細菌性疾患に対して動物を免疫する方法であって、適切な担体中 の、効果的に免疫する量の細菌性抗原、及び適切な担体中の、細菌性抗原の免疫 原性を高めるのに有効な量のアセマンナンを動物に投与することを具備した方法 を提供する。

本発明の実施において、効果的な量のアセマンナンは、すでになされた投与の後 、間隔をおいて動物に再投与されうる。

アセマンナンの投与の間の適切な間隔は、当業者に周知であり、過度の実験をせ ずに容易に決定しうる。

細菌性抗原に対する適切な担体は、当業者に周知である。

現在のところ、好ましい担体は、食塩水溶液、例えば水溶性アジュバント化合物 、並びに少量の防腐剤及び着色剤を含有する食塩水である。アセマンナンに対す る適切な担体は、当業者に周知である。現在のところ、上記の食塩水、及びホス フェートバッファー、例えば以下の例で説明するホスフェートバッファーが好ま しい。

本発明は以下の例によってよりよく理解されるであろう。

しかし、当業者は、詳述された独特の例が、以後の請求の範囲でより完全に説明 される本発明を例示するのみであることを容易に認識することができるだろう。

実施例 七面鳥のヘルペスウィルス（ＨＶＴ）を、アヒル胎児の繊維芽細胞の１２継代物 として、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）　、１２３０１ 　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２から得た。七面鳥のＦＣ＃ １２６ヘルペスウイルス（現在のところ、ＡＴＣＣアクセツションＮａＶＲ５８ ４Ｂとして入手可能である。）は、マレク病ワクチンを調製するのに使用しうる 系統である。ワクチンには、１００％ＨＶＴ及び安定化剤を含有した細胞培養物 質が含まれる。

各々のマスターシード（Ｍａｓｔｅｒ　５ｅｅｄ）　（”Ｘ”）ウィルスを、丸 い細胞、屈折した細胞、若しくは破壊された細胞を含有した鶏の胎児繊維芽細胞 の特徴的な細胞変性効果（ＣＰＥ）によって同定した。マスターシード（パＸ” ）は、寒天ゲル分散試験、又はフルオレセインに接合した七面鳥の抗ヘルペスウ イルス血清を用いた感染細胞の特徴的な直接反応によって特異的に同定された。

該七面鳥のヘルペスウィルスは無毒性である。

マスターシードウィルス（°′Ｘ”）の調製に使用されたＣＥＦ細胞の各々のバ ッチを、９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３，２６（ａ）（２）、１１３．２６　（ａ）（３ ）、１１３．３０及び１１３．１５　（ｃ）　に従って試験した。該マスターシ ードを、９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３，３００及び１１３．３３０、並びに特に、１１ ３．．２７．１１３．２８．１１３．３１，１１３゜３４及び１１３．３７に従 って試験した。該マスターシードは９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３，３３０に従った試験 で安全であった。

該マスターシード（°′Ｘ”）は、種々の七面鳥ヘルペスウィルス（ＨＶＴ）に 感染した鶏胎児性繊維芽細胞（ＣＥＦ）の懸濁液である。該懸濁液を凍結し、− １００℃、又は液体窒素の蒸気層若しくは液体窒素中においてより低温でアンプ ル中に保存した。

該マスタシードは第１６継代であり、”Ｘ”継代のように表した。該シードの継 代範囲は、細胞培養で第１６から１９代である。ワクチンウィルスの範囲は、第 １７から２０代である。以下は、シードの継代の系統的なスケジュールである。

シード継代の系統的スケジュール アメリカンカルチャーコレクシ ロックビル、ＭＤ　２０８５７ 受領光　第１１継代　（ＦＣ＃１２６系）（”　Ｘ”＋　１　”）　第１７継代 （”Ｘ’“＋２″）　第１８継代 （”Ｘ”＋３”）　第１９継代 圧熱滅菌によって無菌にされなかった動物由来の全培地成分を、９Ｃ，Ｆ、Ｒ， １１３，５３に従って、特に不純物を試験した。細胞培養のための培養培地は、 シードと生産培地の両方の増殖に対して同一である。増殖培地は、Ｅａ　ｒ　Ｉ 　ｅの塩及びＬ−グルタミンを有するＥａｇ　Ｉ　ｅの最小培地（Ｅａｇｌｅ’ ｓ　Ｍｉ旧ｍｕｍ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）である。

増殖培地は、５％トリプシンホスフェートブロス及び１％から５％胎児仔牛血清 を付加された。該血清は、５６℃で３０分熱処理された。該血清は商業的な生産 者から無菌で得られ、９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３，５３の要求に合致していた。該血 清は、濾過によって、ガンマ−線照射によって、又はβ−プロピオラクトンで処 理することによって無菌にされうる。

β−プロピオラクトンで無菌にされた血清は、９Ｃ，Ｆ、Ｒ。

１１３．２６に従って細菌及び菌類に対して、９Ｃ，Ｆ、Ｒ。

１１３．２８に従ってマイコプラズマに対して、更に９Ｃ。

Ｆ、Ｒ，１１３，５３（Ｃ）に従って外来ウィルスに対して試験された。ガンマ 線照射された血清は、９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３，２６に従って細菌及び菌類に対し て、９Ｃ，Ｆ、Ｒ。

１１３．２８に従ってマイコプラズマに対して、更に９Ｃ。

Ｆ、Ｒ，１１３，５３に従って外来ウィルスに対して、ガンマ線照射の前に試験 され、これらを含まないことが見いだされた。血清は、ＪＲＨＢｉｏｓｃ　１ｅ ｎｃｅ、１３８０４ｗｅｓｔ　１０７ｔｈ　５ｔｒｅｅｔ、Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａ ｎｓａｓ　６６２１５．又はＭａｔｒｉｘ　Ｃｏｍｐａｎｙ、４４００　Ｃｈａ ｖｅｎｅｌｌｅ　Ｒｏａｄ、Ｄｏｂｕｑｕｅ、Ｉｏｗａ　５２００１−９６７３ から入手しうる。

この血清は、生物学的増殖系における栄養補足剤として使用され得、生産者から 受け取った後１年以下の間７℃若しくはより低温で保存された。

細胞培養に使用されたひな胎芽は９から１０日齢あった。

該胎芽を、特別な病原体を含まない（ＳＰＦ）群から確保された卵から取った。

生きたウィルスワクチンを生産するための鶏の卵を、以下の因子（ａｇｅｎ　ｔ 　）に対して特に試験し、以下の因子を含まない群から確保した。該因子は、鳥 類アデノウィルス（ＡＡＶ）；鳥類脳を髄炎ウィルス（ＡＥＶ）；鳥類白血症ウ ィルス（ＡＬＶ）又は鶏肉腫抗体Ａ及びＢ（Ｒ３Ｖ−ＲＡＶ　及びＲ５Ｖ−ＲＡ Ｖ２）；鶏痘ウィルス（ＦＰ］ ■）；感染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）、コネチカットタイブ；感染性気管支 炎ウィルス、マサチューセラツタイブ；感染性喉頭気管炎ウィルス（ＩＬＶ）； ニューカッスル病ウィルス（ＮＤ■）；肚！」膜上弘　■上目」上Ω二」（ＭＧ ）　；、ＳａＩｍｏｎｅ　ｌ　ｌａ　（２２土１　ｏｒｕｍ−チフス様；鳥類イ ンフルエンザウィルスータイプＡ；レオウィルス；及び感染性嚢包性疾居、ウィ ルス（ＩＢＤＶ）である。

１００パーセントの鳥を１２から２０週齢の間に採血した。

血液サンプルを、鳥類脳を髄炎ウィルス（ＡＥＶ）以外の上記疾患に対して試験 した。ＡＥＶ試験は、該集団が卵を生める状態になった後であるが、卵がワクチ ン製造に使用される前に試験光たり５０の胎芽を用いて行われた。

モニターリングは、はぼ−ケ月の間隔で該集団のちょうど５％程を試験すること によって達成された。試験は、以下の研究所で行われた。：　５ｏｌｖａｙ　Ａ ｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｉｎｃ、。

Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｃ１ｔｙ、Ｉｏｗａ；　５ＰＡＦＡＳ、Ｉｎｃ、、Ｎｏｒｗｉ ｃｈ。

ＣｏｎｎｅＬｉｃｕｔ；　ｒｓＡ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　ＩＬｈａｃａ 、ＮｅｗＹｏｒｋ；　ＨＹ−Ｖａｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｅｇｇｓ　Ｃｏｍ ｐａｎｙ、Ｇｏｗｒｉｅ。

１ｏｗａ；　５ｔａｔｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｒ　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ。

Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ；　５ｔａＬｅ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　ｏｆＯｈｉｏ、Ｃｏ１ｕｒｎｂｕｓ、０ｈｉｏ；　及びＬａ５ｈｅｒ　 Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ。

Ｉｎｃ、、　Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ、Ｄｅｌａｗａｒｅ。

細胞懸濁液を、９から１２日の胚を含有するＧａ１ｌｕｓ■ｆｌｕｓのＳＰＦ卵 、リン酸緩衝食塩水（ＦＢ、Ｓ）無菌のトリプシン、及び最小培地（ＭＥＭ）若 しくは以下の手順に従ったメディア＃１９９増殖培地を用いて調製した。培地＃ １９９は、当業者に容易に利用しうる標準増殖培地である。

卵はアルコール−ヨウ素溶液で殺菌された。乾燥する場合には、該卵を薄層のフ ローフード下に置き、殻を無菌の鉗子で砕いた。胎芽をこれらの膜から無菌で除 去し、無菌のベトリ皿に貯めた。頭を、改良した無菌の外科用のはさみで除去し た。胴及び頭を貯め、無菌の容器に振り分け、次いで抗生物質を全く含まないＰ ＢＳで洗浄した。次に洗浄した胎芽を、ＰＢＳで最後の洗浄をするためにトリプ シン化したフラスコに移した。最後の洗浄をした後、抗生物質を含む０．４％以 下のトリプシンＰＢＳ溶液をフラスコに加えた。この懸濁液を磁気撹拌機で撹拌 し、更に細胞を分散した。

該細胞を、胎芽の胴からは１００分間以内の累積周期で、また胎芽の頭からは４ ０分以内の累積周期で抽出した。これらの抽出物から得た細胞を、５％以下の胎 児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有する１リツトルの遠心管中において２５０Ｘｇ以上 で１０分間遠心した。上清をデカントし、最大で細胞対培地の比がほぼｌ：５で ある増殖培地に細胞を懸濁した。得られた懸濁物を一般的な容器に貯め、磁気撹 拌機で撹拌した。

完全に混合した後、細胞数を測定した。ＰＢＳ中において胎芽の胴及び頭を最初 に洗浄した後、表示したサンプルを集め、９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３，３０及び９Ｃ ，Ｆ、Ｒ，１１３，５１に従って試験した。ＣＥＦ細胞を、ワクチンの生産にお いて、又はウィルスをアッセイするための試験系において、ウィルスの増殖を補 助するために使用した。

細胞を、１−当たり約０．５からｓ、ｏｘｉｏ６細胞の最終濃度で、上記増殖培 地に分散した。該細胞を無菌のローラーボトル（ボトル化たり８５　ｍｌから５ ００　ｒａｔ、の培地）に移植し、３７℃±２℃で２０から７２時間培養した。

４８時間より長く保持する場合は、細胞に新鮮な培地を供給した。汚染されたボ トルは、非典型的な単層、若しくは非典型的なｐＨを有しており、廃棄された。

細胞培養は、約２，０００ｍ１！から９，０００−のサイズのローラーボトルで 増殖された。該ボトルは、軟質ガラス、タイブエのボロシリケートガラス、又は 、無菌の市販のプラスデックボトルの何れかである。ガラスボトルは、１３２℃ ±２℃以上で最低５分間、１２１’ｃ±２℃以上で最低１５分間蒸気殺菌をする か、１６０℃±２℃以上で最低１時間乾燥加熱殺菌する。該ボトルを、殺菌後２ 週間以内に使用するか又は再殺菌した。該ボトルをゴムで被覆したスクリューキ ャップ又はゴム栓で密封した。栓及び／又はスクリューキャップは殺菌された。

マスターシード（”Ｘ゛°）は、七面鳥の生存しうるヘルペスウィルス（ＨＶＴ ）に感染した細胞としてアンプル中で−１ＯＯ℃若しくは液体窒素の蒸気層にお いてより低温で保存するか、又は液体窒素中で保存した。

播種若１．＜は接種のための細胞懸濁物の調製には、まずストックしたシード培 養物を液体窒素から取り出し、迅速に解凍することが必要になる。シード培養物 を、解凍されたアンプルから無菌状態で取り出し、ローターボトル中の鶏胎芽繊 維芽細胞（ＣＥＦ）単層物に接種するために、５００プラ一ク形成単位（ｐｆｕ ’ｓ）以上に希釈した。

引き続きシードを、０．０５％から０．２５％トリプシンを用いてローターボト ルから細胞を除去することによって採取した。トリプシン溶液は以下のようにし て調製した。

溶液Ｎａｌニ トリプシン［２５０、Ｔ、Ｃ，グレード　２５０．　Ｏり゛ラムリン酸緩衝食塩 水（ＰＢＳ） 十分な品質（ｑ、ｓ、　）　１０．ＯＯＯ，Ｍトリプシンを少量の温リン酸緩衝 食塩水（ＰＢＳ）でスラリーにした。温ＰＢＳを２５％の最終容積まで加えた。

この溶液を泡立たないように穏和な速度で撹拌した。残りの容積を追加のＰＢＳ で補い、この溶液をよく混合した。

溶液Ｎａ２ニ トリプシンｌ：２５０、　（ＩＯＸ）市販品として調製された溶液・・β−プロ ピオラクトン処理（ＢＰＬ−処理）されたもの　２，０００．０ｍｇ塩化ナトリ ウム、Ｕ、Ｓ、Ｐ、　３２０．０り゛ラム塩化カリウム、Ｕ、Ｓ、Ｐ、　１６． ０り°ラムデキストロース水和物　８０，０り゛ラム重炭酸ナトリウム　２８． ０り゛ラム エチレンジアミン四酢ＷＲ（ＥＤＴ　Ａ）　２０．０り’　ラム脱イオン化スー パーＱＨ２０ 十分な品質（ｑ、ｓ、　）　１０．ＯＯＯ，Ｏｍｔ乾燥した各々の成分を脱イオ ン化水で別々に混合し、暖めた。次に、この溶液を合わせトリプシンとエチレン ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液を加えた。この溶液を、よく混合されるまで穏 和な速度で撹拌した。

トリプシン溶液ｌ及び２を無菌の０．２ミクロンのフィルターを通して最終的に 濾過することによって滅菌した。この無菌溶液を濾過し、ボトル化たり２５ｍｅ から５００　ｍｌの割合で無菌のタイプ■ボロシリケートガラスに分配した。こ のボトルをゴムで被覆したスクリューキャップで密封した。この方法で無菌にさ れた溶液は、９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３，２６に従って細菌及び菌類に対して、９Ｃ ，Ｆ、Ｒ，１１３，２８に従ってマイコプラズマに対して、９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１ ３゜３７に従って鶏胎芽接種によって病原体に対して試験された。

トリプシン粉末の各ロットは９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３，５３（ｄ）に従ってブタパ ルボウイルスに対して試験された。トリプシン溶液はまた、β−プロピオラクト ンを用いて滅菌された。

処理される物質の容積の４倍のサイズの、スクリューキャップで蓋をしたエルシ ンマイヤーフラスコを使用した。塩溶液、例えば、ダルベツコの平衡塩類溶液（ Ｍｇ　及びＣａ　を含まない）で２．５％のトリプシンを含有するものを調製し た。β−プロピオラクトンを、プロピペッタ−及び保護膜を用いる保護フード下 で激しく振蓋しながらこの溶液に加え、水冷した蒸留水で１０％の濃度に希釈し た。この希釈されたＢＰＬを、処理される冷トリプシンの１−から９９−の割合 でトリプシンに加え、最終濃度を０．１％ＢＰＬにした。このＢＰＬ−１−リブ シンを、ウオーク−イン式の冷凍庫で一晩ゆっくり撹拌し、失活物（ｉｎａｃｔ ｉｖａｎｔ）上にウィルスを保持しうる泡立ちを防ぐためにときどきチェックし た。処理した材料は、１０倍に希釈し、すぐに使用するために０．２５％のトリ プシン溶液を調製するか、該濃縮物を濾過し、後に希釈及び使用するために凍結 して保存した。β−プロピオラクトンで滅菌した溶液は、９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３ ，２６に従って細菌及び菌類に対して、９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３，２８に従ってマ イコプラズマに対して、９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３，３７に従って鶏胎芽接種によっ て病原体に対して試験された。

この方法で滅菌された溶液は、９Ｃ，Ｆ、Ｒ，若しくは生産者によって示されて いるプロトコルに従って、ブタバルボウイルスに対して試験された。

溶液Ｎｏ３は、商業的に製造されたトリプシン１　：２５０（ＩＯＸ）溶液であ り、これは、Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

３１７５５ｔａｌｅｙ　Ｒｏａｄ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ　１４０７２から得ることができる。トリプシンは、９Ｃ，Ｆ、Ｒ，ｌ　 ］３．５３の要求にあっている。溶液ＮＧ４は、商業的に製造されたｌ：２５０ −エチレンジアミン西酢酸（ＥＤＴＡ）（１０×）で処理され、ガンマ線照射さ れた溶液であり、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｏ５ｔ　０ ｆｆｉｃｅ　Ｂｏｘ　１４５０８．　ＳＬ。

Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　６３１７８から得ることができる。ガンマ線照 射されたトリプシン溶液は、Ｕ、Ｓ、Ｐ、ＸＸＩに従つて細菌及び菌類に対して 、Ｂａｒｉｌｅ法でマイコプラズマに対して、更に９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１’１３．５ ３に従ってブタノ（ルポウイルスに対して試験された。溶液Ｎａ５は、商業的に 製造されたトリプシン１　：　２５０　（ｌ　０Ｘ）ＢＰＬ処理された溶液であ り、ＪＲＩＩ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１３８０４　Ｗｅｓｔ　１０７ｔｈＳ ｔｒｅＣ！ｔ、Ｉ−ｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ　６６２１５から入手可能である 。

トリプシン濃縮物（溶液ｌ、３及びＮ０４）を、無菌のリン酸緩衝食塩水（ＰＢ Ｓ）で適切な濃度に希釈し、細胞培養物を分散するために使用した。トリプシン 濃縮物（溶液Ｎ０２）を、スーパーＱＨ２０で適切な濃度に希釈し、細胞培養物 を分散するために使用した。トリプシン濃縮物（溶液Ｎ０５）を溶液Ｎｏ２の調 製に使用した。種々のトリプシン濃縮物を一２０℃又はそれより低ｌ鼠で１２力 月以内の期間保存した。

胎児性仔牛血清を採集した細胞に加え、遠心する前にトリプシンを不活性化した 。採集した細胞を１０から２０分遠心した。上清をデカントし、該細胞を、ＰＢ Ｓに対する充填細胞の容積：容積比で１：４０から１：８０の範囲で再懸濁した 。リン酸緩衝食塩水に４％の胎児性仔牛血清及び抗生物質を追加した。

シードウィルス懸濁物を、ＣＥＦ単層上にローラーボトル当たり２から３Ｉ１１ ／の割合で無菌状態で接種した。シードウィルスの容積を感染細胞を継代するこ とによってに５から１：３０の範囲に拡大した。接種された単層物に、利用でき る場合には以下のようにして追加の１次ＣＥＦを追加した。

１次ＣＥＦ細胞を上述のようにして調製した。次し）でこの１次ＣＥＦ細胞を、 利用した細胞の数に依存してボトル当たり０．５から５．ＯＸ］、０８細胞の割 合で、七面鳥のヘルペスウィルス　（ＨＶＴ）を接種したローターボトルに濃縮 物として加え、この細胞濃縮物を１８から２４時間の後接種時に加えた。この細 胞濃縮物を、９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３，３０に従って３３１ｍｏｎ　ｃ　ｌ　ｌａ に対して、及び９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３，５１に従って外来因子（Ａｄｖｅｎｔｉ ｔｉｏｕｓ　ａｇｅｎｔ）に対して試験した。

七面鳥のヘルペスウィルスに感染したＣＥＦ単層物は、３７℃±２℃で２４から ７２時間培養した。採集の前に、経験及び観測によって決定される特徴的な細胞 変性効果が、８０％以上の細胞に表れていなければならない。特徴的な細胞変性 効果を示さない全ての容器、及び細菌で汚染されたか若しくは非典型的な細胞単 層を有するものは廃棄された。

ボトルはランダムに選択され、特徴的なＣＰＥ及び不純物の形跡を顕微鏡的に検 査した。接種の時から採集までに経過した最小と最大の時間は、２４時間から７ ２時間である。収穫は４８時間の後接種でなされることが好ましい。

細胞懸濁液を遠心した後、上清培養液を捨て、細胞を、０゜０５％から０．２５ ％のトリプシンでガラス表面から引きはがした。次に、細胞をローターボトルか ら１リツトルの遠心容器に貯めた。胎児性仔ウシ血清をこの細胞に加えトリプシ ンを不活性化した。貯めた細胞を２５０Ｘｇ以上で、５から１５分以上遠心した 。上清のトリプシン溶液を捨てた後、充填細胞を、無菌の最小培地若しくはＥａ ｒｌｅの平衡塩類溶液（ＢＳＳ）及び１５％の胎児性仔ウシ血清を含有する培地 ＃１９９に再懸濁した。この懸濁物の容積は、ワクチンの採集容積の４０から８ ０％である。特徴的なＣＰＥを示し、及び異常細胞、ｐＨ１濁り、におい及びモ ールドのような汚染の何れの指標も含まない単層物が採集されるべきである。ワ クチン生産に使用されなかった全ての材料はＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃ ｅｓ　Ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ　Ｎｏ、　８００．５６に従って処理された。

ＨＶＴ−感染細胞は、以下の媒体中で凍結を制御することによって種々の状態に 維持された。

産性　１０リツトル当たり １、最小培地若しくは１０％グルタミンを有し、ＥａｒｌｅのＢＳＳを有する培 地＃１９９　７．４００から７，４８０ｍｔ２、トリプトースホスフェートブロ ス（Ｂｒｏｔｈ）（Ｔ　Ｂ　Ｐ　）　５００ｍ５ ４　、　胎児性仔つ’／血清’　１．５００ｍ１５、ジメチルスルホキシド（Ｄ Ｍ　Ｓ　Ｏ）　５００ｍ／培地＃１９９は当分野の実務家にとって容易に利用で きる標準培地である。この培地は、使用のために７２時間以内に調製される。ジ メチルスルホキシドは、１２１±３℃で１５分間滅菌された。

生成物は、まず細胞懸濁液の細胞を、ｌ　ｍｌ当たりｌＸｌＯ７細胞以上の最終 濃度に調節することによって標準化した。

この濃度は、血球計算板又は電気粒子計測器の様な標準の細胞計測法によ・りて 測定された。細胞の生存力は、生体染色、例えばトリパンブルー若しくはエリト ロシンＢを用Ｉ／）ることによって評価した。

系列（ｓｅｒｉａｌ）は懸濁された細胞を無菌の綿毛を含まないガーゼ、又は無 菌のステンレス鋼スクリーンを通して集めた。細胞懸濁物を機械的に撹拌しなが ら、凍結した培地の混合物をゆっくり加え、先に述べた細胞濃度のノ（ツチにし た。

この細胞懸濁物をいつでも冷凍温度で保存した。２０，０００−のバッチを基に して、系列を集めた例は以下のようであった。

１）ＨＶＴ感染細胞　２Ｘ１０１１ ２）最小培地（１ミａｒｌｅ’ｓ）若しくはＬ−グルタミンを有する培地＃１９ ９　１４，８００から１４．９６０ｍ／３）トリプトースホスフェートブロス（ Ｂｒｏｔｈ）　１，０ＯＯｔｎｔ４　）　ＮａＨＣＯ３１０％、試薬グレード（ ｒｅａｇｅｎｔ　ｇｒａｄｅ）　４０から２００ｍ１５）胎児性仔ウシ血清　３ ，０００ｍ＄６）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　−ム０００　ｍｌ全容積 　２０．０■ｄ±３％ 平均系列容積は、約２０，０ＯＯｒｎｔである。系列の最大容積は４０．ＯＯＯ ｍｊである。

充填の容積は、５００から３，０００の投与量アンブル当たり２．０±Ｑ、２ｍ ｇであり、５００の投与量アンブル当たり１．０±Ｏ，１ｒｎｅである。ワクチ ンは、２−のタイプエボロシリケートガラスアンプルに分配され、前もって言己 録し、滅菌した。アセマンナンアジュバントを、２０　ｍｌのゴム又１よブチル ストッパーを用いて２０から５０ｍ１のタイプＩボロシリケートボトルに分配し た。

希釈物を製造し、試験し、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　Ｍｅ゛＋ ｎｏｒａｎｄｕｍ　Ｎｏ、８００．７４に従って販売した。１リツトルのバッチ の希釈物は以下の組成を有する。

ＮＺアミン　１４．００ｇ 蔗糖（食品グレード）　ｓｏ、　ＯＯｇＫ　１（Ｐｏ　、３１１０　（リン酸カ リウム　ニ塩基性）　１．４８ｇフェノールレッド、Ａ、Ｃ，Ｓ、　０．０１ｇ 脱イオン化水　１．０００．０Ｍ 上に示した成分を小容積の脱イオン化水に撹拌しながら分散した。該成分が溶液 状態になり、ｐＨをＮａＯＨ又はＨＣｌで７．１から７．３に調製した後、この 混合物を脱イオン化水で最終容積に希釈した。希釈物の平均バッチサイズは、１ ．０００，０００ｍ（から２，４００，０００ｍ／であり、最大のバッチは３， ０００，０００ｒｎｔであった。防腐剤は全く希釈物に加えなかった。

一定の撹拌下でワクチンを、無菌のガラスアンプルに無菌の状態で詰め、該アン プルを炎で密封し、保存するための少包（ｃａｎｅｓ）に置いた。充填と密封は 自動充填機でなされ、この操作は１０℃±５℃で行われた。ワクチンのアンプル を、制御された冷却チャンバー中で１分光たり約１℃の一定速度で冷却すること によって凍結した。アンプルを、約−１００℃又は液体窒素の蒸気層若しくは液 体窒素中でより低温で保存した。

最終容器中のワクチンの各々の供給量には、２０，０００以上の細胞が含有され 、これは上記のように計測した。ワクチンの容器は、出荷及び保存の間液体窒素 中に保持され、一方、アジュバントは出荷及び保存の間室温に維持された。

細胞の各々のバッチを、９ＣＦＲ１１３，３０に従ってＳａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　 Ｉａに対して、更に９ＣＦＲ１１３，５１に従って外来因子に対して試験した。

最終容器のワクチンサンプル及びアジュバントを、９ＣＦＲ１１３，２８に従っ てマイコプラズマに対して、９ＣＦＲ１１３，２７に従って細菌及び菌類に対し て、９ＣＦＲ１１３，３４に従って血球凝集性ウィルスに対して、及び９ＣＦＲ １１３，３７に従って外来因子に対して試験した。バルク及び最終容器のワクチ ンサンプルを、９ＣＦＲ１１３，３１に従って鳥類リンパ球様白血病に対して試 験した。

最終容器のサンプルは、９ＣＦＲ１１３４，３３０に従って安全性について試験 した。

ワクチンを９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３，３３０に従って、また当業者に一般的に知ら れた方法によって力価測定した。マスターシード（”Ｘ”）を１９８６年１月１ ７日に製造し、マスターシードから第４継代（Ｘ＋４″）の試験を１９８６年７ 月１０日に完了した。ワクチンをこの第４継代物から製造した。出荷時のワクチ ンの力価は、１羽の投与量当たり３゜０００プラ一ク形成単位（ｐｆｕ’ｓ）以 上であるべきである。

アジュバントの湿気は９ＣＦＲ１１３，２９に従って測定し、５％を越えるべき ではない。

ワクチンを２　ｍｌのアンプルに詰め、ｌ小包（ｃａｎｅ）当たり５つのアンプ ル、ｌパッケージ当たりｌ小包を詰めた。アジュバントは、２０若しくは５０− のボトルに詰め、ｌパッケージ当たり５ボトルを詰めた。アセマンナン（キャリ シン（Ｃａｒｒｉｓｙｎ）（登録商［））はＣａｒｒｉｎｇｔｏｎＬａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ、Ｉｒｂｉｎｇ、Ｔｅｘａｓから供給された０１００マイクログラ ムのアセマンナンに各々のワクチンの投与量及び希釈剤を追加した。アセマンナ ンを無菌の粉末として分配するか、無菌の栓をしたバイアル中で凍結乾燥した。

供給されたアセマンナンは、同定、ポリマンノアセテート分率、アントラキノン の濃度、及び分子量について［バルクキャリシンの分析証明書（Ｂｕｌｋ　Ｃａ ｒｒｉｓｙｎ　Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ　ｏｆＡｎａｌｙｓｉｓ）　Ｊ　に対す るＣａｒｒｉｎｇｔｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの仕様書に合っていた。ア セマンナンは、ワクチン接種の前に希釈剤（上記参照）で再構成された。ワクチ ン及びアジュバントの再構成サンプルを品質を保証するために凍結した後に集め た。

ワクチンの期限の満了日は、９ＣＦＲ１１４，１３に従った有効性試験の開始日 から２２力月を越えるべきではない。

ワクチンは、マレク病を防ぐために日齢のひなのワクチン接種に使用されうる。

２０ＩｒＩｇのアセマンナンを２００−の上記希釈剤に懸濁し、２ｍｌの解凍し たワクチンをこれに加え、１．０００羽の投与量のワクチンを生産した。１回に ０．２ｍｅ投与量のワクチンを１別当たりに投与しうる。ワクチンは、経皮的若 しくは筋肉内的に投与された。

これらの研究に使用された鳥は、すべて母方の抗体に陰性の特異的な病原体のな い（Ｓ　Ｐ　Ｆ）レグホンであった。鳥を１日齢でワクチン接種し、試験の期間 中、各々の鳥に対して最低２００ｃＪの床面積を有するようにして、分離した除 圧のホースホールタイプ（）Ｉｏｒｓｆａｌｌ・ｔｙｐｅ）プレキシガラス培養 容器に収容し、餌を与え、任意に給水した。

旦主 ワクチン接種後ｌ、２．３若しくは４日に投与されたマレク病ウィルスＲＢＩＢ のウィルス攻撃ｃｈａ１１ｃｎｅ　に対するＨＶＴ／アセマンナン接種ひなの応 答使用される七面鳥ヘルペスウィルスのワクチンを０．２ｒｎｅ投与量当たり３ ５００ｐｆｕ’　ｓの理論投与量で上記のリン酸バッファー中に希釈した。アセ マンナンをＣａｒｒｉｎｇｔｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｒｖｉｎｇ　Ｔ Ｘ　からガンマ線照射した無菌の粉末として入手した。アセマンナンを、０．２ が投与量レベル化たり１１００ｕで、ウィルスの添加前にリン酸バッファー希釈 剤と混合した。対照の希釈剤は、他に何も加えないリン酸バッファーである。

マレク病つィルスＲＢＩＢウィルス攻撃用のウィルスは、烏１別当たり７００ｐ ｆｕ’　ｓの理論量で、腹腔内注射で投与された。ＲＢＩＢ、即ち典型的な非常 に毒性のマレク病のウィルス攻撃は、Ｅａｓｔ　Ｌａｎｓｉｎｇ　Ｒｅｇｉｏｎ ａｌ　ＰｏｕｌｔｒｙＲｅ５ｅａｒｃｈ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＤｒ、Ｗｉｌ ｔｅｒから得、１次びな腎細胞培養で増殖させた。

鳥を、以下のような３０のグループに分＆ｊ、独立したアイソレーターに収容し た。各グループは、ワクチン接種後、１．２．３及び４日にＨＶＴで攻撃された もの；ワクチン接種後、１．２．３及び４日にＨＶＴ及びアセマンナンで攻撃さ れたもの；ワクチン接種後、Ｊ、２．３及び４日にリン酸バッファー希釈剤中の アセマンナンで攻撃されたもの；及びワクチン接種せず、他のグループのワクチ ン接種後、１．２．３及び４日に希釈剤対照物で攻撃したものである。

処理後、適切な日に、ワクチン接種を受けたものに７５０プラ一ク形成単位のＲ ＢＩＢを皮下注射し、羽根に連続番号をふった単色の帯を縛り付けた。最後のウ ィルス攻撃を行った後、各々のウィルス攻撃期間及びワクチン接種したグループ からの鳥を全部ランダムに混ぜ、一定のバックグラウンドのウィルス攻撃を維持 するためにアイソレーター中に置いた。

ウィルス攻撃後の烏の外傷の徴を観測し、死亡した場合には記録した（ｐｏｓｔ ｅｄ）。全グループを４８日の試験期間の残こりの間に観測し、更にｖｖＤＭ（ 非常に毒性のマレク病ウィルス攻撃（ｖｅｒｙ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　Ｍａｒｅｋ ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｃｈａｌ　ｌｅｎｇｅ））に対する病徴的な外傷を記録し 及び試験した。

ｖ　ｖ　ＤＭによる斃死率、及びｖｖＤＭによる外傷をもった烏を合計し、治療 の防御指針を決定するためにワクチン接種しなかった烏との全発病率の関係を考 察した。マレク病の免疫は、各々のグループの成績が対照の感染力レベルと比較 された防御指針として示されている。防御指針＝（陽性な対照％）−（陽性のワ クチン接種されたもの％）／（陽性な対照％））×１００ 表１　（以下参照）に与えられた結果は、この早い齢で烏に投与されたウィルス 攻撃が過酷であり、ワクチン接種されていないもの全てが、１００％影響される ことを示している。

このデータはまた、ＨＶＴへのアセマンナンの添加がワクチンに十分効果的であ り、ワクチン接種後２．３及び４日でのウィルス攻撃グループが、ＨＶＴ単独の グループよりも十分によい成績であることを示している。表２　（以下参照）の 結果は、烏がウィルス攻撃された日に関係なく、ＨＶＴ／アセマンナン処置した 烏が全体的によりよい成績であることを示している。

表１ 日齢でワクチン接種されたひなのウィルス攻撃臼の影響ウィルスグループ非特異 的腫瘍を伴 グループ攻撃の１：１中の番号な幣死率った死亡　ＪｌｉｒｔｌＩ　Ｐ、１．　 ＊ＮｏｎＶａｃ　１日目　１０　０　５　５　０．００八ｃｍ　１日目　２０　 ４　６　７　１８．７５１１ＶＴ　１日目　２０　５　９　５　６．６７ｔ（Ｖ Ｔ／Ａｃｔｎ　１日目　２０　３　８　６　１７．６５ＮｏｎＶａｃ　２日目　 １０　０　７　３　０．００Ａｃｍ　２　Ｂ目　２０　６　５　５　２８．５７ ＨＶＴ　２日目　２０　３　５　７　２９．４１ｉ１ＶＴ／Ａｃｍ　２日目　２ ０　５　２　３　６６．６７ＮｏｎＶａｃ　３［Ｊ目　１０　２　６　２　０． ００八ｃｍ　３０目　２０　５　４　６　３３．３３１１ＶＴ　３日目　２０　 １　３　３　６８．４３ＨＶＴ／Ａｃｍ　３日目　２０　０　１　２　８５．０ ＯＮｏｎＶａｃ　４日目　１０　１　４　５　０．００Ａｃｍ　４日目　２０　 ３　６　５　３５．２９＋１ＶＴ　４日目　２０　４　３　２　６８．７５ｔ（ ＶＴ／Ａｃｍ　４日目　２０　２　０　１　９４．４４＊Ｐ、１．＝防御指針； ワクチン接種されず、ウィルス攻撃された烏の％、ワクチン接種されウィルス攻 撃された烏の％より少ない、ワクチン接種されずウィルス攻撃された烏の％によ って分けられた。ＮｏｎＶａｃ　＝ワクチン接種されていない＋　Ａｃｍ−アセ マンナン。非特異的幣死率は観測されうる外傷を全く有さす死亡した烏をいう。

表２ ウィルス攻撃の日付に関係のない蓄積防御データ撃された烏の％、ワクチン接種 されウィルス攻撃された鳥の％より少ない、ワクチン接種されずウィルス攻撃さ れた鳥の％によって分けられた。ＮｏｎＶａｃ”ワクチン接種されてし）ない； Ａｃｍ−アセマンナン。非特異的幣死率は観測されうる外傷を全く有さず死亡し た烏をいう。

これらのデータは、烏１羽の投与量レベル化たり３，５００ｐｆｕ及び１００μ ｇで、ＨＶＴワクチンへアセマンナンを添加することによって、ワクチン接種後 の２．３及び４日でウィルス攻撃されたひなに対して防御が十分に改善されたこ とを示唆している。

更に興味のあることは、種々のワクチン接種グループ間１こ非特異的幣死率に差 があることである。ワクチン接種グループ間で顕著な差は生じなかったが、ワク チン接種したものとワクチン接種しなかったものの間の非特異的幣死率のノ（− センテージに明らかな差があった。実験計画は、著しν）腫瘍の減少を観測する ことによってワクチンを評価するために必・要である。これは、ワクチン接種し たものに対して明かな腫瘍の発達を部分的に防御することでありうるが、この特 別なワクチンではウィルス攻撃が他の方法に影響される。そのような場合は、デ ータの再検討によって、ＨＶＴ／アセマンナングループのの幣死率が低いことが 示され、アセマンナンの明かなアジュバント効果が同じであるか若しくは増加し たままであることが示唆される。

例３ ＨＶＴワクチン接種後の初期の悪性のウィルス攻撃に関するアセマンナンの影響 日齢の烏をグループに分け、ゼロ、２５０若しくは１０００ｐｆｕｓの改変され た生きたＨＶＴ及びゼロ若しくは１００マイクログラム（μｇ）のアセマンナン （以下の表３参照）を投与した。

ウィルス攻撃用のウィルスはマレク病ウィルスのＲＢＩＢ又はＪＭＶであった。

、ＲＢＩＢ、即ち典型的な非常に悪性のマレク病のウィルス攻撃物は、Ｅａｓｔ 　Ｌａｎｓｉｎｇ　ＲｅｇｉｏｎａｌＰｏｕｌｔｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙの叶、Ｗｉ　Ｌｔｅｒから得、ウィルス攻撃されるウィルスの 投与量当たり４００ｐｆｕ”Ｓを含有する０、２ｒｎｔの腹腔内投与量で投与さ れた。ウィルス攻撃は、ワクチン接種後５若しくは２１日であった。鳥を麻痺の 徴候でモニターし、幣死率を感染の後４８から６０日の間評価した。観測の終了 時点で、全ての鳥を安楽死させ、必要事項を記入しくｐｏｓｔｅｄ＞　、顕著な 腫瘍の発達の徴候、特に心臓、肝臓、腎臓、膵臓、及び皐丸若しくは卵巣での徴 候を記録した。ＪＭＶ移植可能腫瘍は、叶、　５ｅｖｏｉａｎ。

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手し、試験動 物のワクチン接種と同時にドナーである日齢のひなに腹腔内注射した。感染の後 ５日目に、ＪＭＶのひなを安楽死させ、肝臓と牌緘を集め、無菌のＲＰＭＩ中で 細かく切り刻み、次いでＴｅｎｂｒｏｃｋＲ紹織ホモジナイザー中で細かく砕い た。

次に、得られたホモジネートを新鮮なＲＰＭＩに３：１で希釈し、０．２−をひ なに腹腔内注射した。該ひなを、幣死率が記録されている間の２１日間観察した 。表３に示されたデータから、ＨＶＴワクチンにアセマンナンを加えると、ワク チンの保護能力が改善されることが示唆された。これは、アセマンナンを投与し たグループは全て、アセマンナンを含有していないワクチンを投与された対応す るグループが有しているよりも、疾患の影響を受けた鳥の数のパーセンテージが 低く、高い防御指針を示していることに基づいている。防御指針は、各々の実験 グループの成績を対照の感染性レベルと比較した。

表３ 七面鳥の改変された生きたヘルペスウィルス及びアセマンナン及び非常に悪性の マレク病ウィルス攻撃を用いた１日齢の鶏のワクチン接種 ２　２５０　０　ＲＢＩＢ（５）　１５３　２５０　１００　ＲＢＩＢ（５）　 １５４　１０００　０　ＲＢＩＢ（５）　１５５　１０００　１００　ＲＢＩＢ （５）　１５６　０　０　ＲＢＩＢ（２１）　２０ ７　２５０　０　ＲＢＩＢ　（２１）　２０８　２５０　１００　ＲＢＩＢ（２ １）　２０９　１０００　０　ＲＢＩＢ（２１）　２０１０　１０００　１００ 　ＲＢＩＢ　（２１）　２０＊Ｐ、Ｉ、＝防御指針；ワクチン接種されず、ウィ ルス攻撃された鳥の％、ワクチン接種されウィルス攻撃された鳥の％より少ない 、ワクチン接種されずウィルス攻撃された鳥の％によって分けられた。Ａｃｍ” ＝アセマンナン。

例４ ＨＶＴワクチン接種後の早期の悪性ワクチン　撃に関するアセマンナンの影響 日齢の烏をグループに分け、ゼロ、６２５．１２５０若しくは３７５０ｐｆｕｓ の改変された生きたＨＶＴウィルス及びゼロ若しくは１００マイクログラムのア セマンナン（以下の表４を参照）を投与した。ワクチン攻撃は、例３（上記参照 ）で示したように、ワクチン接種後５日目にマレク病ウィルスのＲＢＩＢ系で行 った。

表４に示されたデータから、ＨＶＴワクチンにアセマンナンを加えると、ワクチ ンの保護能力が改善されることが示唆された。アセマンナンを含有するワクチン を投与したグループは全て、アセマンナンを含有するワクチンを投与しなかった 対応するグループよりも、鳥の死亡数が少なくなり、疾患に影響される鳥の数の パーセンテージが低くなり、保護指数が高くなった。

表４ 七面鳥の改変された生きたヘルペスウィルス及びアセマンナン及び非常に悪性の マレク病ウィルス攻撃を用いた１日齢の鶏のワクチン接種 ２　６２５’　ＯＲＢＩＢ（５）　２９３　６２５　１００　ＲＢＩＢ（５）　 ３０４　１２５０　０　ＲＢＩＢ（５）　３゜５　１２５０　１００　ＲＢＩＢ （５）　３４６　３７５０　０　ＲＢＩＢ（５）　３０７　３７５０　１００　 ＲＢＩＢ（５）　３５Ｂ、結果 市　Ｐ、１．＝防御指針；ワクチン接種されず、ウィルス攻撃された烏の％、ワ クチン接種されウィルス攻撃された鳥の％より少ない、ワクチン接種されずウィ ルス攻撃された鳥の％によって分けられた。Ａｃ＋ｍ＝アセマンナン。

例５ 日齢の鳥をグループに分け、ゼロ、３３０若しくは１０００ｐｆｕｓの改変され た生きたＨＶＴウィルス及びゼロ、１．１００若しくは１０００マイクログラム のアセマンナン（以下の表５を参照）を投与した。ワクチン攻撃は、例３　（上 記参照）で示したように、ワクチン接種後５臼目に行った。

表４に示されたデータから、ＨＶＴワクチンにアセマンナンを加えると、ワクチ ンの保護能力が改善されることが示唆された。アセマンナンを投与したグループ は、アセマンナンを含有するワクチンを投与しなかった対応するグループよりも 、死亡数が少なくなり、疾患に影響される鳥の数のパーセンテージが低くなり、 保護指数が高くなった。

表５ 七面鳥の改変された生きたヘルペスウィルス及びアセマンナン及び非常に悪性の マレク病ウィルス攻撃を用いた１日齢の鶏のワクチン接種 ２　３３０　０　ＲＢＩＢ（５）　２１３　３３０　１　ＲＢＩＢ（５）　２１ ４　３３０　１００　ＲＢＩＢ（５）　２１５　３３０　１０００　ＲＢＩＢ（ ５）　２１６　１０００　０　ＲＢＩＢ（５）　２１７　１０００　１　ＲＢＩ Ｂ（５）　２１８　１Ｏｆ）０　１００　ＲＢＩＢ（５）　２０９　１０００　 １０００　ＲＢＩＢ（５）　２０Ｂ、結果 ２　６　７　６２　３４ａ ４　４　４　３８　６０ｂ ５　３　５　３８　６０ｂ ＊Ｐ、１．＝防御指剣；ワクチン接種されず、ウィルス攻撃された烏の％、ワク チン接種されウィルス攻撃された鳥の％より少ない、ワクチン接種されずウィル ス攻撃された鳥の％によって分けられた。ａ、　ｂ　＝Ｆｉｓｈｅｒの精密試験 （Ｆｉｓｈｅｒ’　ｓ　Ｅｘａｃｔ　ｔｅｓｔ）によって評価されたワクチン接 種グループ間の十分な差を示す。Ａｃｍ＝アセマンナン。

例６ 日齢の鳥をグループに分け、ゼ若しくは３６０ｐｆ　ｕｓの改変された生きたＨ ＶＴウィルス及びゼロ若しくは１００マイクログラムのアセマンナン（以下の表 ６を参照）を投与した。ワクチン攻撃は、例３　（上記参照）で示したように、 ワクチン接種後５日目に行った。

表６に示されたデータから、ＨＶＴワクチンにアセマンナンを加えると、ワクチ ンの保護能力が改善されることが示唆された。アセマンナンを含有するワクチン 投与したグループは、アセマンナンを含有するワクチンを投与しなかった対応す るグループよりも、死亡数が少なくなり、疾患に影響される烏の数のパーセンテ ージが低くなり、保護指数が高くなった。

表６ 七面鳥の改変された生きたヘルペスウィルス及びアセマンナン及び非常に悪性の マレク病ウィルス攻撃を用いた１日齢の鶏のワクチン接種 ２　３６０　０　ＪＭＶ（５）　２０ ３　３６０　０　ＪＭＶ（５）　２０ ４　３６０　０　ＪＭＶ（５）　２０ ５　３６０　１００　ＪＭＶ（５）　２０２　１１　５５　４２ａ ＊Ｐ、１．＝防御指釧；ワクチン接種されず、ウィルス攻撃された烏の％、ワク チン接種されウィルス攻撃された鳥の％より少ない、ワクチン接種されずつ・イ ルス攻撃された鳥の％によって分けられた。ａ、　ｂ＝Ｆｉｓｈｅｒの精密試験 （Ｆｉｓｈｅｒ’　ｓ　Ｅｘａｃｔ　ｔｅｓｔ）によって評価されたワクチン接 種グループ間の十分な差を示す。Ａｃｍ＝アセマンナン。

且り 表７（以下参照）には、例３がら６に示されたデータがまとめられている。種々 の試験で得られた結果をバッチ処理し、共通のワクチン攻撃／ワクチングループ を対にした。これらの対は、Ｗ　ｉ　Ｉ　ｃｏｘｏｎの対応対符号ランク試験（ Ｗｉｌｃｏｘｏｎｍａｔｃｈｅｄ−ｐａｉｒｓ　ｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋ　ｔｅ ｓｔ）によって有意性を評価した。全ての対は、メンバーがアセマンナン含有ワ クチンを投与されたグループでは、鳥が、アセマンナン含有ワクチンを投与され なかったグループに属する鳥に比べてマレク病のウィルス攻撃に対して改善され た応答をすることを示した。

表７ Ｗｉ　Ｉｃｏｘｏｎの対応対符号ランク試験（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ　ｍａｔｃｈｅ ｄ−ｐａｉｒｓ　ｓｉｇｎｅｃｌｒ、ａｎｋ　ｔｅｓｔ）　：ＨＯ：烏１別当た り１００マイクログラム若しくは１ミリグラムの投与量でのアセマンナンの投与 は、ワクチン投与量及びワクチン攻撃から独立に考察された場合に、ＨＶＴの成 績を改善した。

２　４６　５９　１３　６　＋ ３　４９　８２　３３　１０　＋ ４３４　６０　２６　７．５／８．５　＋５　３４　６０　２６　７．５／８． ５　＋７　７５　８４　９１．５／２．５　＋８５３７７２４６／７　十 ９　５３　６２　９　１．５／２．５　＋１０　４１　５３　１２　３．５／４ ．５　＋１．１　４１　５３　１２　３．５／４．５　＋サンプルサイズ＝４９ ３ Ｐ＞＝両側検定に対して０．ＯＩ Ｐ＞＝片側検定に対して０．０５ このデータは、ＨＶＴワクチンにアセマンナンを加えると、宿主の烏の能力に正 に影響し、引き続きのワクチン攻撃に応答しうろことを示唆している。これは、 ＨＶＴワクチン接種プロトコルが低いプラーク形成単位数又は早期のワクチン攻 撃によって侵襲される場合に特に有意である。

旦旦 ニューカッスル病ウィルス　び感染性　管　炎ウィルスワクチンの製造 ニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）　系Ｂ　ＩＢ　１、即ちマスターシードか ら第５継代（”Ｘ＋５”）のひな胎芽性継代物（ＣＥＰ）７、Ｉｎ　Ｌｅ　ｒｖ ｅ　ｔから得られる感染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）マサチューセッツ（Ｍａ ｓｓ、）　、及び七面鳥のヘルペスウィルスＦ　Ｃ１２６（ＭＤＶａ　ｃ）を、 ＮＤＶ及びＩＢＶワクチン接種におけるアセマンナンの効果を試験する実験に使 用した。

スプレーワクチンの調製を以下のようにして行った。

ＮＤＶ　ＢＩＢＩ、　ＩＢＶ　Ｍａｓｓ、系ＣＥＰ７　（Ｘ＋５） １：１５８０Ｇ、：希釈された　１：６３００４：希釈さ３０ｍｅに再構成した もの　れ３０　ｍｌに再構成したもの ３６　ｍｌ　＋　３６　ｍ１ ７２　ａ／の全容積 ８６．４ｍｌの全容積に十分な量 収量　２．０１０ｇｔ□　ＥＩＤ５ｏＩＢＶ１０．３ｍｇ投与量４．２　ｌｏｇ 、ｏＥＩＤ５ｏＮＤ’／１０．３−投与量エアロゾルスプレーによって投与した 。

旦ｌ ニューカッスル病ウィルス及び感　性気管支炎ウィルスでのウィルス攻撃 Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ（ＮＶＳＬ）　Ａｌｌ１ｅｓ、Ｉｏｗａから入手したニューカッスル病つ ィルス系ＧＢテキサスｐ２２及び感染性気管支炎ウィルス系Ｍ４１をワクチン接 種した烏及びワクチン接種しない鳥を、ウィルス攻撃するために使用した。

生きた日齢ワクチンとして投与されるニューカッスル病つィルス及び感染性気管 支炎ウィルスにおけるアセマンナンの効果 ２００日齢のひなを以下のグループに均等に分配した。

グループ　処置　＃ｂｄｓ ｌ　ワクチン接種しないもの　５゜ ２　ＭＤＶａｃ／ＮＤＶ＋ＩＢＶ　５０３　ＡＣＭ／ＮＤＶ＋ＩＢＶ　５０ ４　ＭＤＶａｃ＋ＡＣＭ／ＮＤＶ＋ＩＢＶ　５０グループ２に対して、ＭＤＶａ ｃを、２００　ｔｎｅの上記ポスフェートバッファー希釈剤に１つのアンプルの 細胞を希釈することによって調製された０、２−容積の皮下投与量として投与し た。グループ３に対しては、粉末化したアセマンナン（ＡＣＭ）　を無ｍのバッ ファーに懸濁し、これによって０゜２　ｍｌの皮下注射剤を１００μｇ／鳥投与 量で得た。マレク病ワクチンとアセマンナンの両方を投与するグループ４では、 マレク病のワクチン成分を２×の濃度に懸濁し、無菌のバッファーの２×アセマ ンナン懸濁液とｌ：１で混合した。０゜２ｍ／が皮下投与される場合、これは、 理論的にグループ３と同じアセマンナン投与量／鳥と、グループ２と同じＭ　Ｄ 　Ｖ　ａＣ投与量／鳥をプラスしたものになる。ＮＤＶ及びＩＢＶは、スプレー 塗布でグループに投与され、これによって、鳥に、２．０１ｏｇ１ｏＥＩＤ５ｏ ＩＢＶと、４　、　２１　ｏ　ｇ　１ｏＴ　ＣＩＤ５ｏＮＤＶをプラスしたもの の理論投与量が投与された。

全ワクチン接種は日齢で行われ、次いで鳥を、ウィルス攻撃されるまでグループ に分離して収容した。

ワクチン接種後２１日に悪性のＮＤＶ若しくはＩＢＶウィルス攻撃系で烏をウィ ルス攻撃した。処置グループ化たりトータルで１０羽の鳥を４つのプレキシガラ スのアイソレーターの各々に置き、アイソレーターの内の２つをＮＤＶでウィル ス攻撃し、２つをＩＢＶでウィルス攻撃した。これにより、４１ｏｇ１ｏＴＣ■ Ｄ５ｏ／鳥のＮＤＶ　ＧＢ　テキサスの理論投与量で処置グループ化たり２０羽 の烏が筋肉内的にウィルス攻撃され、Ｍ４１の４１　ｏ　ｇ　ｔｏ　Ｅ　Ｉ　Ｄ ｓｏ／鳥の理論投与量で処置グループ化たり２０羽の鳥が眼内的にウィルス攻撃 されたことになる。各々の処置グループの内、１０羽の鳥はウィルス攻撃する前 にワクチン接種をしなかった。ＮＤＶウィルス攻撃の結果をウィルス攻撃後４０ 日間の幣死率として記録した。ＩＢＶウィルス攻撃は、９Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１３゜ １６２　（ｃ）　（３）に開示されたように、ウィルスの再分離によって評価し た。

ＮＤＶウィルス攻撃の結果を表８に示した。グループ４が最も高いパーセントの 防御を示し、次にグループ３が続いた。

ワクチン接種されない対照は有意に冒され、ワクチン攻撃後の１４日間の評価期 間に鳥が生き延びることはなかった。

ＩＢＶワクチン攻撃の結果も表８に与えられている。再度アセマンナン処置され たグループは、アセマンナン処置されなかった鳥に比べて僅かに高いパーセンテ ージの防御を示した。ワクチン接種されなかった対照は、有意に（１００％）冒 された。

表８ ＮＤＶ及びＩＢＶウィルス攻撃の結果 （２）ＭＤＶ／ＮＤＶｎＢＶ　７／２０　６５　４／２０　８０（３）ＡＣＭ／ ＮＤＶ＋ＩＢＶ　３／２０　８５　０／２０　１００＃Ｃｈａ１１．＝ウィルス 攻撃された数。ＡＣＭ＝アセマンナン；　ＭＤＶ＝ｌＪＤＶａｃ　（マレク病ワ クチン） 例１１ 生きた日齢ワクチンとして投与されるニューカッスル病ウィルス及び感染性気管 支炎ウィルスにおけるアセマンナンの立米 約４２０日齢のひなを以下のグループに分配した（ＡｃｍＩ　ＭＤＶａｃ　１４ ０ ２　ＭＤＶａ　ｃ／ＮＤＶ＋　ＩＢＶ　１４０３　ＭＤＶａｃ＋ＡＣＭ／ＮＤＶ ＋ＩＢＶ　１４０皮下投与は、例１０（上記参照）で開示された同様の成分投与 量より成る。鳥に識別の目的で帯を結び、グループ１をアイソレーションに置い た。残りの２つのグループをそれぞれ１５羽ごとの８つのレプリケート（ｒｅｐ ｌ　１ｃａｔｅ）及び２０羽の１つのレプリケートに分配した。ＮＤＶ−１−４ ＢＶのスプレーワクチン接種のために、各々のグループから１のレプリケートを 、スプレーチャンバーに置き、例１Ｏで開示したのと同様に、１別当たりの成分 投与量を用いてワクチン投与した。ワクチン接種後２１日月まで鳥をグループに 再度隔離し、分離した。各々のグループからの２０羽の鳥のレプリケートから、 血清の収集のために血を取った。各々のグループの残りのレプリケートの内、上 述のように４つをＮＤＶ　ＧＢ　テキサスでウィルス攻撃し、４つをＩＢＶ　Ｍ ４１でウィルス攻撃した。各々のウィルス攻撃が完了したときに、３っのもとの ワクチン接種グループの各々の１つのレプリケートが、４つのアイソレーターの 各々に現れるように鳥を配分し、上述したように各々の作用薬に対するウィルス 攻撃を評価した。

ＮＤＶウィルス攻撃の結果は、表９中のレプリケートによって、及び表１０（以 下参照）中のグループ全体によって表される。４つのレプリケートの内３つでア セマンナン処置したグループ（グループ３）が、未処理のグループ（グループ２ ）よりも高いパーセンテージの防御を示した。第４のレプリケートでは、２つが 等しかった。アセマンナン処理したグル・−ブのグループ全体の防御率は、未処 理のグループよりも２０％高かった。ワクチン接種されなかった対照の烏（グル ープ１）は全て１４日間の観察期間中に死亡した。

ＩＢＶウィルス攻撃の結果もまた、表９及び１０に与えられている。４つのレプ リケートのうち２つのみを試験した。

１組のレプリケートに対して、アセマンナン処置したグループはその未処置の片 方よりも能力が優れていたが、他の組のレプリケートではそうではなかった。試 験された２７のワクチン接種されない対照の烏のうち、わずか１羽のみが冒され なかった。

表９ レプリケートによって表されたＮＤＶ及びＩＢＶウィルス攻撃の結果 （１）ＭＤＶ　１５／１５　０　１．３／１．４　７（２）ＭＤＶ／ＮＤＶ＋Ｉ ＢＶ　４／１５　７３　３／１３　７７（１）ＭＤＶ　１５／１５　０　１３／ １３　０（２）ＭＤＶ／ＮＤＶ＋ＩＢＶ　５／１５　６７　３／１５　８０（１ ）ＭＤＶ　１５／１５　０　ｎ、　ｔ、　ｎ、　ｔ。

（２）ＭＤＶ／ＮＤＶ＋ＩＢＶ　１／１５　９３　ｎ、　ｔ、　ｎ、　ｔ。

（１）ＭＤＶ　１５／１５　０　ｎ、　ｔ、　ｎ、　ｔ。

（２）ＭＤＶ／？ＪＤＩ／＋ＩＢＶ　４／１５　７３　ｎ、　ｔ、ｎ、　ｔ。

表１０ グループ全体によって表されたＮＤＶ及びＩＢＶウィルス攻撃の結果 （１）ＭＤＶ　６０／６０　０ （２）ＭＤＶ／ＮＤＶ＋ｌＢＶ　１４／６（１７７（１）ＭＤＶ　２６／２７　 ４ （２）ＭＤＶ／１ＪＤＶ＋ＩＢＶ　６／２８　７９＃Ｃｈａ１１．＝ウィルス攻 撃された数。ＡＣＭ＝アセマンナン：　ＭＤＶ＝ＭＤＶａｃ　（マレク病ワクチ ン） 血清学的結果は表１１　（以下参照）に与えられている。ＮＤＶに対しては、試 験されたアセマンナン処置した鳥の５７％が、４より大きいＥＬ　Ｉ　ＳＡプロ フィールのランクを有しており、一方、ワクチン接種処理されないものでは、そ の数の半分（２３，５％）のみが、４より大きいＥＬＩＳＡプロフィールのラン クを有していた。ＩＢＶに対しては、非常に小さな血清学的応答がそれぞれのグ ループで見られた。

表１１ ＮＤＶ及びＩＢＶの血清学的結果 Ａｃｍ＝アセマンナン 例１２ ＮＤＶワクチン接種を含む両組の実験から得られるＮＤＶウィルス攻撃の結果は 、アセマンナン処置したグループにおいて防御が増加していることを示している 。この増加が観測されないのは、例１１のレプリケート４のみであり、この場合 は、両ワクチン接種されたグループは等しい防御を示した。

スプレーキャビネットを使用した場合には、ワクチン接種の効果に関して本来的 に可変性が存在する。この理由として考えられることは、我々は、分離した際に 各々のレブリヶー）・グループをワクチン接種し、その結果各々のアセマンナン 処置した比較物と処置しなかった比較物が、ＮＤＶ／ＩＢＶワクチンに同様に曝 されたことである。我々がレプリケートで見た傾向は、ワクチン接種がより効果 的になる（グループ３参照）につれて、アセマンナン処置したグループと処置し なかったグループとの間の差がより小さくなることである。

ＩＢＶウィルス攻撃の結果は可変性である。例ＪＯにおいて、アセマンナン処置 したグループにおいて防御が増加し、たようであるが、これは例１１の場合は増 加しなかった。これは、ウィルスの再分離によってウィルス攻撃の防御を評価す ることが、幣死率によるよりも本来的により可変性があるということでありうる 。

例１１におけるＥＬＩＳＡの血清学的結果は、鳥をアセマンナンで処置した場合 に、スプレーワクチンのＮＤＶフラクションに応答する抗体が増加し、可能性と して、防御の増加が観測されたことに寄与していることを示唆している。ＩＢＶ に対するＥＬＩＳＡの結果は、一般に非常に低く何れにも使用し得ない。

日齢でのアセマンナンを用いた処置で導き出されることは、スプレー投与された 組合せワクチンのＮＤＶ　ＢＩＢＩ成分に対する血清学的及び防御的応答が、ア セマンナンで処置されなかった対照グループに比較して増加しているということ である。

日齢でのアセマンナンを用いた処置は、スプレー投与されたワクチンのＩＢＶ　 Ｍａｓｓ、成分によって誘導される血清学的及び防御的応答に関して、僅かな効 果しか有しないか、全く効果がなかった。

例１３ アセマンナンの添加を行゛か、又は行わない条件で、日齢ＳＰＦ鶏におけるＢｕ ｒｓｉｎｅ２　び細胞関連ＨＶＴワクチンの妨害試験 感染性　包　疾患ウィルスワクチンの　製ホスフェートバッファー希釈剤（上述 したもの）中の感染性嚢包性疾患ウィルス＜Ｉ　ＢＤＶ）　Ｂｕｒｓｉｎｅ２　 （放出力価（ｒｅｌｅａｓｅ　ｔｉｔｅｒ）　：鳥１羽の投与量化たり１０４・ ７　ＴＣＩＤ５ｏ）及び七面鳥のヘルペスウィルスＦＣｌ２６（放出力価：烏１ 羽の投与量化たり９，４１５プラ一ク形成単位）を使用した。Ｂｕｒｓ　ｉｎｅ 　２は、Ｐｈ１ｌ　Ｌｕｋｅｒｔ、Ｌｌｎｉｖｅｒ−ｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｇｅｏｒ ｇｉａから人手した。

再懸濁したＨＶＴワクチンを力価測定の前に２時間冷凍温度に保持した。プラー ク形成単位の力価測定を２次胎芽繊維芽細胞（ＣＥＦ）単層で行った。感染性嚢 包性疾患ウィルスを一次ＣＥＦで力価測定した。

ワクチン接種用の保存物を以下のようにして調製した。

ストックＡ、ＨＶＴのバイアル１個を解凍し、１００ミリリツトル（ωｉ）のホ スフェートバッファに希釈した。

ストックＢ　、Ｂｕｒｓ　ｉｎｅ　２系のバイアル１個をホスフェートバッファ を用いて５０１ＩＩｇに再構成した。

ストックＣ，１ｍｌのアセマンナン溶液光たり２．０ミリグラムが、アセマンナ ン粉末を再水和するためのホスフェートバッファーを用いて調製された。

ストックＤ、　２５＋ｎｔのストックＢと２５ｍｔのリン酸バッファーとをプラ スした。

ストックＥ、２５ｍｔのストックＢ及び２５−のストックＣ６ １日齢のＳＰＦレグホンのひなに、以下に示したようなストック溶液の組合せて 頚部の首筋に皮下的にワクチン接種した。ワクチン接種は全て０．２ｍｌの容積 であった。

ワクチン接種グループｌ、ＨＶＴのみ 注射の前に２０ｍｅのストックＡを２０ｒｎｔの追加のホスフェートバッファー と混合し、次に０．２ｍｌ投与量を２０羽のひなに投与した。

ワクチングループ２　、　Ｂｕｒｓ　ｉｎｅ　２及びＨＶＴ２０＋ｎｅのストッ クＡを２０ｆｆｌ／のストックＤと混合し、次にＱ、２ｍ／投与量を４０羽のひ なに投与した。

ワクチングループ３．　Ｂｕｒｓｉｎｅ２のみ２０−のストックＤを、０．２ｍ ｅの投与量で２０羽のひなのグループに注射する前に追加の２０−ホスフェ−ト ノ（ツファーと混合した。

ワクチングループ４　、　Ｂｕｒｓ　ｉｎｅ　２−アセマンナン２０−のストッ クＥを追加の２０　ｔｎｅホスフェートバッファーと混合し、次いでＱ、２ｎ＋ ／、の投与量で２０羽のひなに投与した。

２０＋ｎｅのストックＡと２０ｒｎｅのストックＥを混合し、次【こ４０羽のひ なに投与した。

これらの試験で使用された鳥は、１日齢でワクチン接種されたＳＰＦホワイトレ グホンであった。同じ醇化で得られた４０羽のひなを、ウィルス攻撃の対照とし てプレキシガラス分離ユニットに収容した。

嚢包性疾患のウィルス攻撃用ウィルスを、ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒ ｙ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ａｍｅｓ、Ｉｏｗａから人手し た。該ウィルスをトリプトースホスフェートブロスに］：５で希釈し、１０’・ ４ＥＩＤ５ｏの鳥点眼用供給物（ｄｏｓｅ）を得た。マレク病つィルス攻撃用ウ ィルスはＲＢＩＢ／１７Ｔ５５系（ＣＰＩ、ＴＣＰ３．ＣＰＩ、ＴＣＰ４継代） であった。これらの材料は、０．２ミリリツトル当たり２．８Ｘ１０’・０プラ 一ク形成単位（ｐ　ｆ　ｕ　ｓ）の力価を有していた。該ウィルスを、鳥１羽の ウィルス攻撃用の投与量化たり１０００ｐｆｕｓを含有するようにホスフェート バッファーに希釈した。

ワクチン接種の後５日目に、２０羽の対照、ワクチングループ１、並びにワクチ ングループ２及び５から各々得た２０羽の烏を、マレク病ウィルスのＲＢＩＢＩ 分離物を用いて腹腔内的（ＩＰ）にウィルス攻撃した。ワクチン接種後１４日月 に１０羽の鳥が、血清中和（ＳＮ）力価をＩＢＤＶベータ法で測定するためにワ クチングループ２．３．４．５及びウィルス攻撃しなかった対照から採血された 。グループ２．３．４．５及び対照から得た各々２０羽の鶏を引き続きＮＶＳ　 ＬＩＢＤＶウィルスで点眼によってウィルス攻撃した。ＩＢＤＶでウィルス攻撃 された烏を１１日後に殺し、重さを量り、これらの嚢包を除去し、臨床的な嚢包 の萎縮の値として体重に対する嚢包の重さの割合をめるために重さを量った。試 験の４８日目までに死んだＭＤＶウィルス攻撃された烏は、全て検死を行い、臨 床的障害を記録した。生き残ったものは、４８日目に殺し、障害を記録した。

ＩＢＤＶに対する循環抗体力価をＳＮ試験で評価した。

マレク病免疫を防御指針（ＰＩ）として記録し、各々のグループの成績を対照の 感染性レベルと比較した。防御指針＝（（（陽性の対照％）−（陽性のワクチン 接種体％））／（陽性の対ｕｔ４））Ｘ１０００ 嚢包性疾患の防御は、嚢包の萎縮を基にして免疫された鳥のパーセンテージとし て記録した。これは、嚢包性指針（ｂｕｒｓａｌ　１ｎｄｅｘ）　（Ｂ　Ｉ　＝ （嚢包の重量／体重）Ｘ１００）を用いて判断された。２．５よりも大きいか又 は等しい値で防御されたものとした。

マレク病に対する死亡後（ｐｏｓｔ　ｍａｒｔｅｎ）の臨床的障害の評価結果を 、防御指針として表１２（以下参照）に示した。

対照グループ（これをゼロのＰＩと定義した。）は臨床的障害に対して９４％陽 性であった。ＨＶＴ、ＨＶＴプラスＢｕｒｓｉｎｃ２、又はＨＶＴ−Ｂｕｒｓｉ ｎｅ２−アセマンナン混合物を投与された烏は、それぞれ８３．８９．９５パー セント臨床的障害を受けなかった。これらの指標は８２．８８．９５の防御指針 に補性された。

表１２ マレク病防御指針 置皿　防御指針 ＣＡ　ＨＶＴ　８２ ＣＡ　ＨＶＴ”−Ｂｕｒｓｉｎｅ２　８８ＣＡ　ＨＶＴ−Ｂｕｒｓｉｎｅ−アセ マンナン　９５嚢包性疾患の結果は、括弧で示された各々のグループにおいて臨 床的に免疫された鳥のパーセンテージで、体重に対する嚢包の比として表１３に 示されている。試験された各々のワクチンに対して、アセマンナンを添加すると 防御の数値の増加があった。Ｂｕｒｓｉｎｅ２のみを投与された鳥は、鳥１羽の 投与量当たり１００マイクログラムのアセマンナンを添加すると１００パーセン トの免疫に比較して８５％防御された。

Ｂｕｒｓｉｎｅ２−ＨＶＴの組み合わせで、アセマンナンを添加したグループは 、７９％の臨床的防御の有利さに対して１００パーセントを保持した。

表１３ 嚢包性疾患の嚢包対体重比 処置　ｌＡ比−月り証）工」エ　へ°−セント免疫Ｂｕｒｓ　１ｎｅ２　３．９ ±１．５　８５Ｂｕｒｓｉｎｅ２・アセマンナン　４，９±１．６　１００Ｂｕ ｒｓ　ｉｒ＋ｅ２−ＨＶＴ　４．Ｏ±１．６　７９Ｂ２１（ＶｔＴ七マンナン　 ５．０＝４＝１．５　１００嚢包性指針（嚢包対体重比）の平均値士各々のワク チン接種グループの平均の一標準偏差（ｏｎｅ　５ｔａｎｄａｒｄ　ｄｉｖｉａ ｔ−１Ｏｎ）は、Ｂｕｒｓｉｎｅ２、Ｂｕｒｓｉｎｅ２゛アセマンナン、Ｂｕｒ ｓ　ｉ　ｎｅ２−　ＨＶ　Ｔ、及びＢｕｒｓｉｎｅ２−　ＨＶ　Ｔ−アセマンナ ンに対してそれぞれ３．９±１．５．４．９±１．６．４゜Ｏ±１．６及び５． ０±１．５であった。独立のサンプルの個々の嚢包対体重比（以下の表１４参照 ）の５ｔｕｄｅｎｔのＴ−検定分析は、Ｂｕｒｓｉｎｅ２のみに相当するグルー プには有為な差がないことを表しているが、Ｂｕｒｓｉｎｅ２−　ＨＶ　Ｔの比 較は、アセマンナングループが９５パーセントの信頼性レベルで有意性において よりよいことを示している。

表１４ 個々の嚢包対体重比 Ｂｕｒｓｉｎｅ　２＋　Ｂｕｒｓｉｎｅ　２ａ＋　Ｂ−２＋ｔｌＶＴａ＋２．９ 　５．５　２．２　６．０　１．６３．１　４．３　５．５　８．２　０．５４ ．５　４．０　４．６　４．６　０．８４．７　４．８　５．６　４．７　１． ４２．０　３．６　５．１　３．２　１．１５．３　８．４　２．９　４．５　 ０．６３．６　６．２　５．０　５．２　１．４２．７　４．４　３．８　４． ４　１．０４、１　６．１　４．３　１．２ ４．３　１．７　４．１　１．０ ６、３　５．３ 平均±ＳＤ ３．９±　４．９±　４，０±　５．０±　１．１±１、５　１．６　１．６　 １．５０．３ａ　これらのグループは有意に差があった。Ｔ　＝２．０７５９９ ８゜Ｃ＝対照。

血清学的な結果は、表１５（以下参照）に示されている。

ＳＮ力価は臨床的障害からの防御と何れの相互関係パターンにも従わなかった。

嚢包性ＳＮ力価は、Ｂｕｒｓｉｎｅ２−　ＨＶ　Ｔ−アセマンナンで最も大きく （６９のＧＭＴ）　、アセマンナンを用いない組み合わせを投与された鳥で最も 低かった（３０のＧＭＴ）。１価のＩＢＤＶを投与された鶏では、アセマンナン を用いないグループは、添加をした場合の３５に比べて５６のＧＭＴを有してい た。対照は全て≧２であった。

表１５ 嚢包性血清学 Ａｌ　Σ０ Ｂｕｒｓｉｎｅ　２　５６ Ｂｕｒｓｉｎｅ　２−ＡＣＭ　３５ Ｂｕｒｓｉｎｅ　２’ＨｖＴ　３０ Ｂｕｒｓｉｎｅ　２−出／Ｔ−ＡＣＭ　６９ａ＝算術平均ブローフィールランク ｂ＝幾何平均中和力価 Ｂｕｒｓｉｎｅ２及び細胞関連ＨＶＴワクチンが全フィールド投与量で投与され た場合、免疫の妨害は、Ｂｕｒｓｉｎｅ２及び細胞関連ＨＶＴワクチン間で全く 観測されなかった。

−価のＢｕｒｓｔ（ｉｎｅ　２ワクチン及びＨＶＴとの組み合わせへのアセマン ナンの添加は、アセマンナンを含有する一価の処置に対して、及び組み合わせワ クチンにおけるＨＶＴに対して有利な数知的効果を生じる。組み合わせのＢｕｒ ｓｉｎｅ２は、アセマンナンを用いない場合よりもアセマンナンを用いた方が（ ９５パーセントの信頼性で）より有意性においてよかった。

アセマンナンを使用若しくは使用しない場合の子豚のワクチン接種／ウィルス攻 撃試験 １７０匹の乳のみの１週齢子豚をＪｅｎｓｅｎ　ＢｒｏＬｈｅｒｓＩｎｃ、、Ｔ ｈｏｒｎｔｏｎ、ＩＡから購入した。これらは全て、小割り板で３部屋に仕切っ たフロア−パンに、ｌパン当たり２０匹の子豚を含むように収容した。

’　１６〜２２グラムの１２０匹のＣＦＩの白色マウスをＨａｒｌａｎ　Ｓｐｒ ａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙから購入した。マウスは、ボックス当たり８匹のマウス のグループで収容した。

グループ当たり１０匹の動物がいるが、試験を完了するのに多数の豚が必要であ るので、各々の５匹の豚のレプリケートセットを生まれてから、１週間別にして 選択した。レジリケードの内、豚をワクチン接種又は対照グループとしてランダ ムに割り当てた。ワクチンをアセマンナンに５　ｒａｇ／投与量で混合するか、 又は混合しなかった。更にアセマンナンを、１日齢の時に選択された１０匹の豚 のグループに関して、ワクチン接種前の免疫刺激剤として評価した。異なったワ クチン及び対照グループを表１にリストした。豚を１週齢でワクチン接種し、再 度３週齢でワクチン接種した。最初のワクチン接種は、肩と耳の間の首の部分に 、０．２ｍｌ投与量の細菌ワクチンとして筋肉内的に行われた。２回目のワクチ ン接種は反対側の首に同様に行われた。

表１６ 実験グループ及びワクチン組成物８ ＰＭＤ−１８，７不使用 ＰＭＤ−２９，０不使用 ＰＭＤ−３９，５不使用 ３一種＋Ｄ−１ｄ　８．７　不使用 ３一種子〇−２９，Ｑ　不使用 ３一種＋Ｄ−３９，５不使用 ＰＭＤ−ＩＡ　８．７　５ｍｇ ＰＭＤ−２Ａ　９．０　５ｍｇ ＰＭＤ−３Ａ　９．５　５ｍｇ ３一種＋０４Ａ　’　８．７　５ｍｇ ３一種＋Ｄ−２Ａ　９．０　５ｍｇ ３一種＋Ｄ−３Ａ　９．５　５ｍｇ ３一種＋Ｄ＋Ｔｏｘｅ９．０　不使用 ３一種　不使用　不使用 新生児アセマンナンｆ　不使用　５ｍｇ、３Ｘ（３・種＋Ｄ−２）　９．０　不 使用 ワクチン接種 されずウィルス　不使用　不使用 攻撃したものｇ 攻撃されなかだものｈ ａ　細菌ワクチンはすべて以下の成分を含有している。

ａ、水酸化アルミニウム（アルハイドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）’　８５ ’）０．７５％　（ＡＩ□０３として） ｂ、ホルムアルデヒド　０．２％ 残り Ｃ０食塩水　Ｑ、Ｓ、０．２ｍｌ投与量までｂ　ＰＭＤ＝バスツレラムルトシダ （Ｐａｓｔｅｕｒｅｌ！ａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）　、　タイ７°Ｄ０リストさ れた価は投与量当たりＬＯｇｌｏの濃度（ＣＦＵ）である。

Ｃアセマンナンは、アロエベラ（Ａｌｏｅ　ｖｅｒａ）植物から抽出されたアセ チル化マンノースポリマーである。これを乾燥した粉末として、存置 ｅＰＭＤ−２のブロスに存在する量のトキソイドを与えるために、（標準製剤中 に既に存在する任意のトキソイド活性に加えて）ＰＭＤ培養の、不活性化され、 濃縮されたブロス上清（ｓｕｐｅｒｎａｔｅ）を加えた。

ｆ　−腹の１０匹の豚に、１．３、及び５日齢でアセマンナンの食塩水懸濁物（ ５ｍｇｓ／投与景−１ｒｎｅ）を与えた。３一種＋２−Ｄ細菌ワクチンを１及び ３週齢で、レプリケート２の他の豚に対するように他の注射はされなかった。ウ ィルス攻撃された豚をワクチン接種され、ウィルス攻撃された豚と混合した。

ｈ　ワクチン接種されず、ウィルス攻撃されなかった豚は、他の豚のウィルス攻 撃後に、他の豚から分離しておいた。模擬ウィルス攻撃は全くされなかった。

２回目のワクチン接種後１週間に、豚を、ｌ：１０のＰｒｏｍＡｃｅ　：　Ｖｅ ｔａｌａｒ　［ケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ）　］混合物、約１．０ｍ／／１０ 　ｌｂ体重で鎮静させた。豚が静かになったとき、２ｍｌ／鼻孔量のウィルス攻 撃用懸濁液を鼻孔内挿管法で投与した。豚を、鎮静から回復するまで断続的に観 察した。

２００　ｍｌのＸ＋６継代のＰ、ｍｕｌｔｏｃｉｄａタイプＤ　（ＰＭＤ）　、 Ｐ１６８３−Ｔ３系を、１０リツトルのＤｉｆｃ。

Ｂｉｔｅｋ　ＦｅｒｍｅｎｔａＬｉｏｎ　ブロス（ＢＴ）に接種した。培養物を １．４５の光学密度（ＯＤ）（これは４．３Ｘ１０６０ｎｍ ”ＣＦＵ／ｍｅを含有する。）まで発酵させた。該培養物を、２０．０−のホル ムアルデヒドを加え、３７℃で１時間撹拌し、次いで４℃で５日間撹拌して不活 性化した。不活性化された培養物を、Ａｍ１ｃｏｎ　ＤＣ−１０の１００，００ ０ダルトン（分子量）を除去する中空繊維フィルターで５．３倍に濃縮した。

細菌ワクチンの成分を表１６（上記参照）に与えた。要するに、アセマンナンを 用いない多成分ワクチンでは、ＰＭＤ濃縮物を５．１０、及び３０ＸＩＯ８ＣＦ Ｕ／投与量で変化させたが、他の成分は一定に保った。同じ濃度のＰＭＤを、単 成分［参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）　Ｊワクチンに使用した。加えて、同様のワ クチングループを５１ＴＩｇ／投与量でアセマンナンを用いて調製した。

チオグリコレート及びトリブチツクソイ（ｔｒｙｐｔｉｃ　５ｏｙ）の両方のブ ロス中において、不活性化を考慮する前１４日間２５℃及び３７℃で、１　ｍｌ の１４の細菌ワクチンの各々を培養することによって不活性化を評価した。

細菌ワクチンの安全性を、８匹のマウスに０．５ｍ／の与えられた細菌ワクチン 製剤を皮下的に接種することによって評価した。マウスを、注射に起因する逆効 果に対して評価した。

Ｘ継代（７）ＰＭＤ系Ｐ１６８３−７３を、７５．０ｍ／（７）ＢＴブロスを含 有する２つのフラスコに接種した。培養物を、１分光たり１２５周期で振盪しな がら４．５時間３７℃で培養した。１．６５の０Ｄ６６ｏｎｌｌ、で、培養物を ＢＴブロスにｌ：４で希釈し、使用するまで凍らせるように冷却した。生存し° Ｃいた細胞数によって、ウィルス攻撃物が、２つのレプリケートに対して４．５ Ｘ１０９及び５．６Ｘ１０９ＣＦＵを含有することが示された。

前面の静脈から以下の時に子豚の血液を取った：これは、１回目のワクチン接種 時（Ｖｌ）、２回目のワクチン接種時（■２）、ウィルス攻撃時（Ｃ＋Ｏ）、検 死時（Ｃ＋２１）である。全ての場合に、血液は、任意の細菌ワクチン、鎮静剤 、ウィルス攻撃剤（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）　、又は安楽死のための溶液が投与さ れる前に採取された。血液サンプルを、４℃で２０分間２５０　ｃｘ　ｇで遠心 した。血清を集め、５６℃で３０分間熱で不活性化し、試験するまで一２０℃で 保存した。

酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬｌ、ＳＡ）を全ての血清サンプルで行い、細菌ワ クチンの抗原成分に対する抗体応答を評価し、成分間の妨害を検出する手助けと した。

豚をワクチン接種の逆効果に対して、及び引き続きのウィルス攻撃に起因する臨 床症状に対して観測した。ワクチン接種グループ及び種化たりの豚が多数いるの で、与えられた豚の特別な徴候は記録されなかった。３週間の観測期間に死んだ 豚を検死し、死の特徴を評価した。ウィルス攻撃に起因しない原因で死亡した豚 は、更なる評価から除外した。生き残った豚を、ウィルス攻撃後玉週間で、過剰 投与量のナトリウムベンタバルビトールで安楽死させ検死した。

検死の時に、肺の障害及びワクチン接種部位の反応を記録し、点数化（ｓｃｏｒ ｅｄ）　した。鼻づらを鼻孔から眼窩まで除去し、ラベルし、後に第二小臼歯と 同じ高さで、二分−の一インチの切片に帯鋸でひいた。切片をミリメートルスケ ールに並んで写真に撮り、引き続き５×フインチのカラー写真をネガからプリン トした。

点数システムは、全て表１７（以下参照）に与えられている。甲介骨の萎縮の激 しさを、５×７のプリントがら形態測定的に評価した。形態測定プロトコルは、 Ｃｏ１１ｉｎｓら（豚の萎縮性鼻炎の診断のための外耳の萎縮の指針としての甲 介骨の周辺の長さの比（Ｔｕｒｂｉｎａｔｅ　Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ　ｒａｔｉｏ 　ａｓａｎ　１ｎｄｉｃａｔｏｒ　ｏ（ｃｏｎｃｈａｌ　ａｔｒｏｐｈｙ　（ｏ ｒ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓｏ（ａｔｒｏｐｈｉｃ　ｒｈｉｎｉｔｉｓ　ｉｎ　ｐｉ ｇｓ、）　、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅｔ。

Ｒｃｓ、　、匹（３）、１９８９：　４２Ｌ４２４）によって開示されているも のである。処置グループの平均の甲介骨領域の比（ＴＡＲ）及び甲介骨周辺の長 さの平均（ＴＰＲ）の有為な差を分析の変化によって分析した。

表１７ 評価系 Ａ、肺点数システム：全葉（ｉｏｂｅ）を評価した（４　ｐ　ｔ　ｓ／全葉；全 部で２４ｐｔｓ） １、　葉の部分的優集群（＋１） ２、　葉の全優集群　（＋１） ３、　膿瘍　（＋１） ４、ｍ維性肋膜炎　（＋１） Ｂ、ワクチン接種部位の反応：　（２つの部位）１、　軽い繊維性の筋と関係の ないもの一〇ポイント２、　小さなもの（＜１ｃｍ）　−１ポイント３　、　ｌ 　ｃ＋ｎ　Ｘ　３　ａｎまで一２ポイント４、　＞ＩＱｌｌＸ３ＣＩ１１−３ポ イント５、　膿を伴う膿瘍−４ポイント 調製された細菌ワクチンは、安全性に関する９Ｃ，Ｆ、Ｒ。

ガイダンスに従ってマウスを接種することによって示されるような安全性であっ た。アセマンナンを含有した細菌ワクチンは微生物の混合培養物で汚染された。

しかしこのワクチンは、ワクチン系に関して不活性であるようである。

表１８及び１９（以下参照）に、異なったグループに対するウィルス攻撃の臨床 的及び全病理学的結果をまとめた。肺の障害は全グループで穏和であった。同様 に、死亡率は低かった。ワクチン接種部位の反応は一般的に穏やかであるが、最 も激しい反応は最も大きなバイオマスを用いたワクチンで起こる傾向があった。

これらのうち、アセマンナンが存在する場合でも、障害は最も激しかった。アセ マンナンを含有するワクチンでの注射から得られる幾つかの膿瘍は、直径で５か ら１０（Ｊであった。

表１８ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　１ｌＩｕｌｔｏｃｉｄａ、タイプＤによるワクチン接 種ＰＮＤ４　０．００　０．４４１０．００　１／９ＰＭＤ−２０，０００，０ ０１０，２２０／１０ＰＭＤ−３１，２００，７０１０，８００／１０３一種＋ Ｄ−１０，５０１，２０／１．００　０／１０３一種＋Ｄ・２　０．００　０． ５６／１．３３　１／１０３一種＋Ｄ・３　０．００　１．７５／２．００　２ ／１０３一種＋Ｄ＋Ｔｏｘ　０．２２　０．２２／１．００　１／１０計種　２ ．６７　１．００／１．１１　１／１０ワクチ′接種せずライ′い攻撃　０．５ ６　、−／−−−２７１１されたもの −ブが組み合わされた。アセマンナングループは表１９（以下参照）にある。

ｂ　肺障害の評価方法は、表１７にある。最大点数は２４．０である。

価は、グループの豚の数の平均である。

Ｃワクチン反応の評価方法は、表１７に示しである。最大数値は部位当たり４． ０である。価は１回目／２回目のワクチン接種部位の平均である。

ｄ　比は、グループの数について、ウィルス攻撃後に死んだ数を表す。

表１９ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、タイプＤによるワクチン接種及 びウィルス攻撃で得られた斃死率及び検死による全障害；アセマンナンが投与量 当たり５ｍｇワクチン中に存在した。

ＬｌＺ惺≦び　乳」声しユ」臘廊ト　胆憩μＰＮＤ−ＩＡ　Ｏ，０００，１３１ ０，０００／１０ＰＭＤ−２Ａ　１．３０　０．３０１０．２０　２／１０四Ｄ ・３八　１．３３　０．２２１０．８９　１／１０３一種＋Ｄ−ＩＡ　１．２２ 　０．３３１０．１１　１／１０３一種＋Ｄ−２Ａ　Ｏ，４０１，４０１０，４ ００／１０３・種子〇−３Ａ　１．６３　２．３８／２．６３　２／１０新生児 アセマンナンｅＯ，００１，４４／１．６７　１／１０計種＋Ｄ・２ ライ、い攻、□も、）０．５６　−−−／−−−２／１１ウイ）い攻撃さゎなヵ 、９たたもの　０．１１　°−，／−−−１／１０ａ　ワクチングループは表１ ６に示しである。２つのレプリケートグループが組み合わされた。Ｎｏｎ・Ｖａ ｃＣ，”ワクチン接種されず。

ｂ　肺障害の評価方法は、表１７にある。最大点数は部位当たり２４゜０である 。価は、グループの豚の数の平均である。

Ｃワクチン反応の評価方法は、表１７に示しである。最大数値は部位ｄ　比は、 グループの数について、ウィルス攻撃後に死んだ数を表す。

平均甲介骨周辺長さくＴＰＲ）及び甲介骨領域比（Ｔ　Ａ　Ｒ）を表２０及び２ １　（以下参照）に示した。ワクチン接種されず、ウィルス攻撃されなかった豚 のＴＰＲは、１−試行Ｔ試験（ｏｎｅ・ｔａｉｌｅｄ　Ｔ−ｔｅｓｔ）で新生児 アセマンナングループ（Ｐ＝０．１）以外の他のグループより有意に（Ｐ≧０． ０５）大きかった。３つのワクチン（グループＰＭＤ−１，ＰＭＤ−２、及び３ 一種＋Ｄ−２）は、生きた、毒素原性ＰＭＤでのウィルス攻撃に対して有意な防 御を与えた。ＰＭＤ−２Ａ及び３一種＋Ｄ−２Ａの両方も有意な防御を示したが 、これらの生成物中にアセマンナンが存在してもＴＰＨに関して何れの追加の利 益も与えていないようであることに注意しなければならない。ワクチン接種され ず、ウィルス攻撃されない豚のＴＡＲは他の全てのグループよりも有意に大きか った。ＰＭＤ−１及びＰＭＤ−ＩＡワクチンのみが、ＰＭＤウィルス攻撃に対す るＴＡＲで説明したような有為な防御を示した。再度のアセマンナンの添加はＴ ＡＲに関して利益があるようには思われない。

表２０ 組み合わせレプリケートにおける甲介骨障害の形態測定的評価ＰＮＤ−１９０， ４２６（０，０８３）Ｃｌ、０９６　（０，２６８）’ＰＭＩ）２　９　０．３ ９６　（０，１０７）　１．１０９　（０，２０１）ｃＰＭＤ−３９０，３１９ （０，０９４）　０．８５７　（０，２９２）３一種＋Ｄ−１１００，４０３（ ０，１０８）　１．００４　（０，２９２）３一種＋Ｄ−２９０−４０９（０， １０９）　１．０５６　（０，２４５）Ｃ計種＋Ｄ・３　８　０．３５９　（０ ，０７２）　０．９０３　（０，２３２）３一種＋Ｄ＋Ｔｏｘ　９　０．３７９ 　（０，０８７）　０．９５１　（０，１７７）３一種９　０．３６７　（０， ０８４）　１．０００　（０，１８３）’７９４−　＞接種１ず”　９　０．３ ４７　（０，０９９）　０．８５６　（０，２８２）ルス攻撃されたもの 価は、第２臼歯からの鼻づら部分の５×７写真で得られる甲介骨及び鼻腔のデジ タル化されたトレースによって評価された、中介骨領域（ＴＡＲ）及び甲介骨周 辺長さくＴＰＲ）比の平均＋（標準偏差）である。

ａ　ワクチングループは表１に示されているようなものである。２つのレプリケ ートグループを組み合わせた。

ｂ　ウィルス攻撃後３週間生き残った豚の数。

Ｃこれらの価は、ワクチン接種されず、ウィルス攻撃された豚に対する同じ列の 価より有為によかった（Ｐ≦０゜０５；１試行Ｔ試験）。

ｄ　これらの価は、同じ列の他の何れの価よりも有意によかった。

表２１ アセマンナンを含有するワクチンでワクチン接種された豚の組み合わせレプリケ ートにおける甲骸骨障害の形態測定的評価ＰＮＤ・ＩＡ　８　０．４１２　（０ ，０３８）ｃｌ、０７５　（０，１４１）ＣＰＭＩ）２Ａ　１０　０．３４６　 （０，１０７）　１．０１１　（０，３０１）ＰＭＤ−３Ａ　９　０．２５４　 （０，０３３）　０．７２７　（０，１２６）３一種＋Ｄ−ＩＡ　９　０．３９ ４　（０，０７４）　１．００２　（０，２８１，）３一種＋Ｄ−２Ａ　１０　 ０．４１０　（０，０９９）　１．１１２　（０，２３３）３一種＋Ｄ−３Ａ　 ８　０．２７０　（０，０７０）　０．５６６　（０，２８８）新生児 ７Ｚｆ−：／４Ｉ種１ず”　９　０．３４７　（０，０９９）　０．８５６　（ ０，２８２）ルス攻撃されたもの ワクチン接種せずライ ルス攻繋されなかった　９　０．５５５　（０，１００）ｅｌ、３６９　（０， １６７）ｅたもの 価は、第２臼歯からの鼻づら部分の５×７写真で得られる甲介骨及び鼻腔のデジ タル化されたトレースによって評価された、中介骨領域（ＴＡＲ）及び甲介骨周 辺長さくＴＰＲ）比の平均＋（標準偏差）である。

ａ　ワクチングループは表１６に示されているようなものである。２つのレプリ ケートグループを組み合わせた。アセマンナンは、存在する場合には、投与量当 たり５■の濃度であった。新生児アセマンナングループに、１．３、及び５日齢 で、５■を懸濁液として与え、次いで３一種−Ｄ−２ワクチンを用い７及び２１ １日齢ワクチン接種した。

ｂ　ウィルス攻撃後３０週間生き残った豚の数。

Ｃこれらの価は、ワクチン接種されず、ウィルス攻撃された豚に対する同じ列の 価より有為によかった（Ｐ≦０．０５；１試行Ｔ試験）゛。

ｄ　これらの価は、ワクチン接種されず、ウィルス攻撃されなかったグループの 価よりも有意に差があった。

細菌ワクチン−トキソイドの全フラクションに関する細菌ワクチンの全組み合わ せにおいて、微生物成分の各々に対するＩｇＧ抗体応答を検出するためにＥＬＩ ＳＡ試験を行った。

データを表２２　（以下参照）に示した。このデータは、細菌ワクチン中のＰＭ Ｄ応答に関して、旦９敗！ｕ１目」匹ｉｃａ、Ｐ、ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、及び凪 　牡！■匹工」二匹成分によって妨害されないことを示している。１価のＰＭＤ ワクチンはより低い２回の投与量で、萎縮性鼻炎に対して有為な防御を示すが、 これらの２つのワクチンに対する抗体応答は、Ｐ　Ｍ　Ｄ　−１ワクチンの場合 にウィルス攻撃をした後でも弱い。細菌ワクチンの３つの組み合わせの抗体応答 は、表２２（以下参照）に記載された他の何れのワクチンよりも一貫して高かっ た。

表２２ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、タイプＤ　（ＰＭＤ）を含有す る細菌ワクチンでワクチン接種された豚をこお番するＰＭＤ）こ対する血清学的 応答 二ムＬヒび　１ＬｖＬ　Ω１　二Ｌ ＰＮＤ−１０，８９２０，７２７０，７５１０，７０１ＰＭＤ−２０，９６９０ ，８０６０，７４４０，９２０ＰＭＤ・３　０．８１８　０．７５８　０．６９ ６　１．０８８３一種＋Ｄ−１０，９７７０，７１７Ｌ３０５　１．１４３３・ 種＋Ｄ−２０，８４５０，７２１１，０３９１，０２２３一種子〇−３０，６６ ９０，８１９１，０２９１，１１７３一種＋Ｄ＋Ｔｏｘ　１．０７２　０．７６ ２　０．９３４　０．９２７３一種　０．９０６　０．７７６　０．８９４　１ ．０１０ワクチ′接種せずライ　０．８３５　０．６１２　０．６９７　１．． ０２５ルス攻撃されたもの レプリケートグループを組み合わせた。

表２３　（以下参照）に示されるように、細菌ウィルスの組み合わせで２つのよ り高濃度のＰＭＤＨこおり）でＰＭＡを用ν）たＰＭＤによる妨害があった。し 力）し、これＩよ、３一種＋Ｄ−２と同じＰＭＤの濃度を有する３一種＋Ｄ＋Ｔ ｏｘワクチンにおいて、ＰＭＡ応答が、３一種ワクチンに対する応答と同じであ るから、例外的であるだろう。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ及び工Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ ｔｈｒｉｘの応答は、全てのワクチンで良好であり、妨害はないようであった。

表２３ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、タイプＡ　（ＰＭＡ）　Ｂｒｏ ｄｅｔｅｌｌａに対する血清学的応答（ＩＧＧ） 二ニーじグー１県　ヱ上　ヱＬ　Ω１止　Ω土左工ＰＮＤ・Ｉ ＰＭＡ　Ｏ，６７５０，６６９１，２４５１，２７７ＢＢ　Ｏ，９８２０，６５ ０１，３５３１，６８４Ｅ、ｒｈｕ　１’、０１２　０．８４７　１．３１７　 １．２７０３一種＋Ｄ−１ ＰＭＡ　Ｏ，５８１０，６５０１，１７１１，０６７ＢＢ　Ｏ，８９９０，６２ ６１，２８２１，７６６Ｅ、　ｒｈｕ　Ｏ，８８７０，８８３１，２６２１，２ ７４３・種＋Ｄ−２ ＰＭＡ　０．５５６　０．７５６　０．６６５　１．１２３ＢＢ　Ｏ，６６７０ ，７３０１，３６２１，６８６Ｅ、　ｒｈｕ　０１８６０　０．７７４　１．． ３２７　１．３１７３・種子〇−３ ＰＭＡ　０．４３９　０．６６８　０．６３４　１．１９４ＢＢ　Ｏ，７２３０ ，７８５１，５７６１，７９４Ｅ、　ｒｈｕ　Ｏ，９９１０，６５１１２５５Ｌ ２１８３一種＋Ｄ＋Ｔｏｘ ＰＭＡ　０．６７５　０．７５８　１．１７９　０．９０４ＢＢ　１．、０４２ 　０．９００　１．６０８　１．７２６Ｅ、ｒｈｕ　Ｏ，７２６０，７９３１， １３８１，０１５計種 ＰＭＡ　０．７７５　０．６６４　０．９５７　１．５８９ＢＢ　Ｏ，９９２０ ，８８３１，７０２１，９６２Ｅ、ｒｈｕ　１．２１１　０．８９０　１．１１ ２　１．０４０ワクチン接種せずライ ルス攻撃されなかった たもの ＰＭＡ　Ｏ，４６００，５４６０，７５９１，２５３ＢＢ　Ｏ，９２１０，６３ ７０，７７８０，６６８Ｅ、　ｒｈｕ　Ｏ，８６００，５４７０，３９６０，２ １７ＰＭＤを用いた細菌ワクチン、及びワクチン接種されなかった豚からの血清 とを比較し、これらの他の微生物成分を用いたＰＭＤによる妨害を評価した。血 清を、１回目のワクチン接種の時（ｖｌ）、第２回目のワクチン接種の時（Ｖ２ ）及び検死の時（Ｃ＋２１）に採取した。試験ウェルにコートされた、細胞を全 て超音波で分解した適切な抗原でＥＬＩＳＡ試験することによって応答を測定し た。

ａ　ワクチングループは表１にリストされているものである。２つのレプリケー トグループを紹み合わせた。

例１６ アセマンナンを　用若しくは使用しない子豚のワクチン種／ウィルス　撃試験 試験されたＰＭＤの最小防御投与量は、萎縮性鼻炎の障害の減少によって決定さ れた５Ｘ１０８ＣＦＵであった。ＴＡＲ及びＴＰＲの両方の価は、この結果を支 持している。■×１０９の投与量もＴＰＲで示されるように防御的であった。

ワクチン接種又はウィルス攻撃の直接の効果は、肺障害には全くなかった。これ らの観測によって、関連の細菌ワクチンにおいて５Ｘ１０８ＣＦＵ、及び組み合 わせにおいてｌＸｌ０９ＣＦＵの投与量が支持される。

Ｂｒｏｄｅｔｅｌｌａ、　Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘｌ及びタイプＡＰａｓ 　ｔｅ　−ｕｒｅｌｌａによるＰａ５ｔｅｕｒｅｌｌａタイプＤとの妨害は、Ｐ ＭＤに対する血清学的応答に反映される。しかし、５Ｘ　Ｉ　Ｏ８ＰＭＤを用い た細菌ワクチンの組み合わせにおいてＴＰＲ又はＴＡＲに対する０、０５レベル での有為さが失われており、これは、穏和な程度の妨害があることを示唆してい る。ＰＭＤの高投与！　（３Ｘ　Ｉ　０９ＣＦＵ）では、明らかに防御応答を阻 害している。これは、我々が以前に同じように見た現象である。高投与量での妨 害の原因はよくわからないが、この結果から、製品系（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　 ５ｅｒｉａｌｓ）に過剰のＰＭＤ（ｌＸｌ０９ＣＦＵよりも多い量）を加えるに は注意が必要である。細菌ワクチンにアセマンナンを添加することは、防御応答 を誘導するにのには必要でない。実際に、ワクチン接種部位の反応に対するアセ マンナンのこのバッチの明確な寄与は、その使用に対して禁忌を示すのに十分で あった。

使用されるアセマンナンの利益は、ｌ、３、及び５日齢で３回の投与量で与えら れ、次いで７及び２１１日齢細菌ワクチンの組み合わせをワクチン接種されたグ ループで生じると思われる。そのグループは、引き続きのＰＭＤウィルス攻撃に 対して保護されており、その程度は、ＴＰＲが、ワクチン接種されずにウィルス 攻撃された豚に関して有意に改良されるばかりでなく、ＴＰＲが、ウィルス攻撃 されなかった対照グループのＴＰＲと有為な差がないグループのみにもおよぶ。

この観測によって、非特異的な刺激、及びブライミングがアセマンナンによって 新生児に誘導されることが示唆される。

細菌ワクチン−トキソイドは、すべてマウスの安全性試験に合格したが、幾つか のものは低レベルの不純物を含んでいることが見いだされた。アセマンナンは、 無菌化されない紛゛　末として細菌ワクチン−トキソイドに添加され、これらの 製品に見いだされる不純物に強く寄与する。全ての製品のホルマリン濃度は０． １５から０．１７％の間（これは許容しうる限度内にある。）であることが見い だされた。アセマンナンが最終生成物に含まれうる場合は、プロトコールにより 長い不活性化時間を必要とする。

一般に、臨床的な徴候の評価並びに肺障害及び鼻の障害の主観的な評価は、ＰＭ Ｄでのワクチン接種による防御を測定するための有用な基準にはならない。ＰＭ Ｄ感染の主要な障害は、萎縮性鼻炎である。従って、肺障害がこの試験の疾患の 主要な構成要素に寄与しないことは、驚くにはあたらない。

萎縮性鼻炎の激しさに対して鼻づら（Ｓｎｏｕｔｓ）を点数化することは、主観 的であり、不連続なデータを与える。鼻づらの障害を評価する場合に形態測定を 適用することは、この試験でなされたような母数的な統計方法によって有用に分 析されうる客観的なデータを与える。

ディスカッジョン 上記の例で示されたデータは、ワクチンへのアセマンナンの添加が、ウィルスの 免疫原性を高めることを示唆している。

これが起こるメカニズムは、まだ明確ではないが、１つの提唱しうるモデルは、 マクロファージに関連する。マクロファージは全て、マンノースレセプターを表 面に有しており、表面がマンノースに富んでいる細菌や菌類に対して該レセプタ ーが非特異的な応答を補助することは公知である（Ｌａ　１・ｇｅｎ　Ｌら１９ ８４年）。マクロファージは、ワクチン接種を受けた宿主中のウィルスの転写及 び複製に役割を演じていると信じられている。ワクチンへのアセマンナンの添加 は、休息状態のマクロファージを活性化した状態に変換する手助けをし、これに よって、ウィルスのより効果的な加工及び輸送が可能となる。これによって、ワ クチン接種後、特に初期の場合、又は別の激しいウィルス攻撃（ｖｉｒｕｓ　Ｃ ｈａｌｌｅｎｇｅ）の場合に、ウィルス攻撃により効き目のある応答をするよう になるだろう。

上記のデータは、Ｂｒｏｄｅｔｅｌｌａ、　Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉ）　、 及びＰａ５ｔｅｕｒｅｌｌａタイプＡを組み合わせた細菌ワクチンが、疾患を防 御するのに効果があることを示唆している。このデータから、更に、非経口的に 与えられるアセマンナンが、引き続き投与されたワクチンの効き目が促進される ことが示唆１、　Ｂａｃｏｎ、Ｌ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ 　ｏｆ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄＩｙｍｐｈｏｉｄｅ　Ｉｅｕｋ ｏｓｉｓ　ｂｙ　Ｍａｒｅｋ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎ　ＷｈｉＬｅ　Ｌｅｇ ｈｏｒｎＣｈｉｃｋｅｎｓ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ　６３：　５０４−５１２　（ １９８９）。

２、　Ｌａｇｅｎｔ、　Ｂ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ −３ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｏｆａｌｖｅｏｌａｒ　ｍａｃｒｏｐ ｈａｇｅｓ　ｔｏ　ｍａｎｎｏｓｅｏｄｅｒｉｖｅｄ　５ｕｒｆａｃｅｓ、　Ｊ 、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５９：　１７６４−１７６９　（１９８４）。

フロントベージの続き Ｃｌ２Ｎ　１５１０９ ／／ＧＯＩＮ　３３１５６９　Ｊ　７０５５−２ＪＩ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．七面鳥のヘルペスウイルスワクチンであって、単位投与量当たり、効果的に 免疫する量の、七面鳥の改変された生きたヘルペスウイルス、七面鳥のヘルペス ウイルスの免疫原性を高めるのに効果的な量のアセマンナン及び適切な担体を含 有するもの。 ２．請求の範囲第１項に記載のワクチンであって、該効果的に免疫する量の、七 面鳥の改変された生きたヘルペスウイルスが約１，０００プラーク形成単位より も多い量であるワクチン。 ３．請求の範囲第２項に記載のワクチンであって、該効果的に免疫する量の、七 面鳥の改変された生きたヘルペスウイルスが約３，０００プラーク形成単位より も多い量であるワクチン。 ４．請求の範囲第１項に記載のワクチンであって、該効果的に免疫する量の、七 面鳥の改変された生きたヘルペスウイルスが七面鳥のヘルペスウイルスに感染し た細胞に存在するワクチン。 ５．請求の範囲第４項に記載のワクチンであって、七面鳥の改変された生きたヘ ルペスウイルスの該効果的に免疫する量が、約２０，０００の、七面鳥ヘルペス ウイルスに感染した細胞に存在する量であるワクチン。 ６．請求の範囲第１項に記載のワクチンであって、該七面鳥の改変された生きた ヘルペスウイルスがＦＣ１２６系であるワクチン。 ７．請求の範囲第１項に記載のワクチンであって、該アセマンナンが、アロエ　 バルバデンシス（Ａｌｏｅ　ｂａｒｂａｄｅｎｓｉｓ）の植物の葉から抽出され るワクチン。 ８．請求の範囲第１項に記載のワクチンであって、該効果的な量のアセマンナン が約５０マイクログラムより多い量であるワクチン。 ９．請求の範囲第８項に記載のワクチンであって、該効果的な量のアセマンナン が約５０マイクログラムから約１０００マイクログラムの量であるワクチン。 １０．請求の範囲第９項に記載のワクチンであって、該効果的な量のアセマンナ ンが約５０マイクログラムから約１５０マイクログラムの量であるワクチン。 １１．請求の範囲第１０項に記載のワクチンであって、該効果的な量のアセマン ナンが約１００マイクログラムの量であるワクチン。 １２．請求の範囲第１項に記載のワクチンであって、該適切な担体が水性バッフ ァーを包含するワクチン。 １３．請求の範囲第１２項に記載のワクチンであって、該水性バッファーがホス フェートバッファーを包含するワクチン。 １４．マレク病に対してひなを免疫する方法であって、請求の範囲第１項に記載 のワクチンの投与量を１日齢でひなに投与することを具備した方法。 １５．請求の範囲第１４項に記載の方法であって、該投与が皮下注射を包含する 方法。 １６．請求の範囲第１４項に記載の方法であって、該投与が筋肉内注射を包含す る方法。 １７．単位投与量当たり、効果的に免疫する量の改変された生きたウイルス、該 改変された生きたウイルスの免疫原性を高めるのに効果的な量のアセマンナン及 び適切な担体を含有するワクチン。 １８．請求の範囲第１７項に記載のワクチンであって、該効果的に免疫する量の 改変された生きたウイルスが約１，０００プラーク形成単位よりも大きい量であ るワクチン。 １９．請求の範囲第１７項に記載のワクチンであって、該改変された生きたウイ ルスが、改変された生きた鳥類ウイルスであるワクチン。 ２０．請求の範囲第１９項に記載のワクチンであって、該改変された生きた鳥類 ウイルスが、改変された生きたマレク病ウイルス、改変された生きたニューカッ スル病ウイルス、改変された生きた感染性嚢包性疾患ウイルス、改変された生き た感染性気管支炎ウイルス、又は改変された生きた鳥類レオウイルスであるワク チン。 ２１．請求の範囲第１７項に記載のワクチンであって、該改変された生きたワク チンが、改変された豚ウイルスであるワクチン。 ２２．請求の範囲第２１項に記載のワクチンであって、該改変された生きた豚ウ イルスが、改変された生きた仮性狂犬病ウイルス、改変された生きたコロナウイ ルス又は改変された生きたバルボウイルスであるワクチン。 ２３．請求の範囲第１７項に記載のワクチンであって、該改変された生きたウイ ルスが、改変された生きた猫ウイルスであるワクチン。 ２４．請求の範囲第２３項に記載のワクチンであって、該改変された生きた猫ウ イルスが、改変された生きた猫白血病ウイルス、改変された生きた猫Ｔ−細胞白 血病ウイルス、又は改変された生きた猫免疫不全ウイルスであるワクチン。 ２５．請求の範囲第１７項に記載のワクチンであって、該改変された生きたウイ ルスが、改変された生きた犬ウイルスであるワクチン。 ２６．請求の範囲第２５項に記載のワクチンであって、該改変された生きた犬ウ イルスが、改変された生きたコロナウイルス、改変された生きたバルボウイルス 又は改変された生きたジステンバーウイルスであるワクチン。 ２７．請求の範囲第１７項に記載のワクチンであって、該アセマンナンが、アロ エ　バルバデンシス（Ａｌｏｅｂａｒｂａｄｅｎｓｉｓ）の植物の葉から抽出さ れるワクチン。 ２８．請求の範囲第１７項に記載のワクチンであって、該効果的な量のアセマン ナンが約５０マイクログラムより多い量であるワクチン。 ２９．請求の範囲第２８項に記載のワクチンであって、該効果的な量のアセマン ナンが約５０マイクログラムから約１，０００マイクログラムの量であるワクチ ン。 ３０．請求の範囲第１７項に記載のワクチンであって、該適切な担体が水性バッ ファーを包含するワクチン。 ３１．請求の範囲第３０項に記載のワクチンであって、該水性バッファーがホス フェートバッファーを包含するワクチン。 ３２．請求の範囲第１７項に記載のワクチンであって、第２の改変された生きた ウイルスを更に含有するワクチン。 ３３．請求の範囲第３２項に記載のワクチンであって、該第１及び第２の改変さ れた生きたウイルスが、改変された生きた鳥類ウイルスであるワクチン。 ３４．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、七面鳥の改変された生きたヘルペスウイルスであり、第２の 改変された生きた鳥類ウイルスが、改変された生きたマレク病ウイルスセロタイ プＩであるワクチン。 ３５．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、七面鳥の改変された生きたヘルペスウイルスであり、第２の 改変された生きた鳥類ウイルスが、改変された生きたマレク病ウイルスセロタイ プＩＩであるワクチン。 ３６．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、七面鳥の改変された生きたヘルペスウイルスであり、第２の 改変された生きた鳥類ウイルスが、改変された生きたニューカッスル病ウイルで あるワクチン。 ３７．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、七面鳥の改変された生きたヘルペスウイルスであり、第２の 改変された生きた鳥類ウイルスが、改変された生きた感染性嚢包性疾患ウイルス であるワクチン。 ３８．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、七面鳥の改変された生きたヘルペスウイルスであり、第２の 改変された生きた鳥類ウイルスが、改変された生きた感染性気管支炎ウイルスで あるワクチン。 ３９．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、七面鳥の改変された生きたヘルペスウイルスであり、第２の 改変された生きた鳥類ウイルスが、改変された生きた鳥類レオウイルスであるワ クチン。 ４０．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、マレク病ウイルスセロタイプＩであり、第２の改変された生 きた鳥類ウイルスが、改変された生きたマレク病ウイルスセロタイプＩＩである ワクチン。 ４１．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、マレク病ウイルスセロタイプＩであり、第２の改変された生 きた鳥類ウイルスが、改変された生きたニューカッスル病ウイルであるワクチン 。 ４２．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、マレク病ウイルスセロタイプＩであり、第２の改変された生 きた鳥類ウイルスが、改変された生きた感染性嚢包性疾患ウイルスであるワクチ ン。 ４３．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、マレク病ウイルスセロタイプＩであり、第２の改変された生 きた鳥類ウイルスが、改変された生きた感染性気管支炎ウイルスであるワクチン 。 ４４．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、マレク病ウイルスセロタイプＩであり、第２の改変された生 きた鳥類ウイルスが、改変された生きた鳥類レオウイルスであるワクチン。 ４５．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、マレク病ウイルスセロタイプＩＩであり、第２の改変された 生きた鳥類ウイルスが、改変された生きたニューカッスル病ウイルであるワクチ ン。 ４６．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、マレク病ウイルスセロタイプＩＩであり、第２の改変された 生きた鳥類ウイルスが、改変された生きた感染性嚢包性疾患ウイルスであるワク チン。 ４７，請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、マレク病ウイルスセロタイプＩＩであり、第２の改変された 生きた鳥類ウイルスが、改変された生きた感染性気管支炎ウイルスであるワクチ ン。 ４８．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、マレク病ウイルスセロタイプＩＩであり、第２の改変された 生きた鳥類ウイルスが、改変された生きた感染性気管支炎ウイルスであるワクチ ン。 ４９．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、マレク病ウイルスセロタイプＩＩであり、第２の改変された 生きた鳥類ウイルスが、改変された生きた鳥類レオウイルスであるワクチン。 ５０．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、ニューカフスル病ウイルスであり、第２の改変された生きた 鳥類ウイルスが、改変された生きた感染性嚢包性疾患ウイルスであるワクチン。 ５１．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、ニューカッスル病ウイルスであり、第２の改変された生きた 鳥類ウイルスが、改変された生きた感染性気管支炎ウイルスであるワクチン。 ５２．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、ニューカッスル病ウイルスであり、第２の改変された生きた 鳥類ウイルスが、改変された生きた鳥類レオウイルスであるワクチン。 ５３．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、感染性嚢包性疾患ウイルスであり、第２の改変された生きた 鳥類ウイルスが、改変された生きた感染性気管支炎ウイルスであるワクチン。 ５４．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、感染性嚢包性疾患ウイルスであり、第２の改変された生きた 鳥類ウイルスが、改変された生きた鳥類レオウイルスであるワクチン。 ５５．請求の範囲第３３項に記載のワクチンであって、該第１の改変された生き た鳥類ウイルスが、感染性気管支炎ウイルスであり、第２の改変された生きた鳥 類ウイルスが、改変された生きた鳥類レオウイルスであるワクチン。 ５６．請求の範囲第３２項に記載のワクチンであって、第１及び第２の改変され た生きたウイルスが、改変された生きた豚ウイルスであるワクチン。 ５７．請求の範囲第３２項に記載のワクチンであって、第１及び第２の改変され た生きたウイルスが、改変された生きた猫ウイルスであるワクチン。 ５８．請求の範囲第３２項に記載のワクチンであって、第１及び第２の改変され た生きたウイルスが、改変された生きた犬ウイルスであるワクチン。 ５９．請求の範囲第３２項に記載のワクチンであって、第三の改変された生きた ウイルスを更に含有するワクチン。 ６０．ウイルス性疾患に対して動物を免疫する方法であって、請求の範囲第１７ 項に記載のワクチンの投与量を動物に投与することを具備した方法。 ６１．請求の範囲第６０項に記載の方法であって、該動物が日齢の家禽である方 法。 ６２．請求の範囲第６１項に記載の方法であって、該日齢の家禽が、日齢の鶏、 七面鳥、アヒル又はうずらである方法。 ６３．請求の範囲第６０項に記載の方法であって、該動物が、豚、猫又は犬であ る方法。 ６４．請求の範囲第６０項に記載の方法であって、該投与が、筋肉内注射、皮下 注射、経口投与又は点眼による投与を具備する方法。 ６５．効果的に免疫する量の改変された生きたウイルス、該改変された生きたウ イルスの免疫原性を高めるのに効果的な量の複合炭水化物及び適切な担体を含有 するワクチン。 ６６．請求の範囲第６５項に記載のワクチンであって、該効果的に免疫する量の 改変された生きたウイルスが、約１，０００プラーク形成単位よりも多い量であ るワクチン。 ６７．請求の範囲第６５項に記載のワクチンであって、該改変された生きたウイ ルスが、改変された生きた鳥類ウイルスであるワクチン。 ６８．請求の範囲第６７項に記載のワクチンであって、該改変された生きた鳥類 ウイルスが、改変された生きた七面鳥のヘルペスウイルスであるワクチン。 ６９．請求の範囲第６５項に記載のワクチンであって、該複合炭水化物がマンナ ンであるワクチン。 ７０．請求の範囲第６９項に記載のワクチンであって、該マンナンが、β（１→ ４）結合したマンナンであるワクチン。 ７１．請求項７０に記載のワクチンであって、該β（１→４）結合したマンナン がアセマンナンであるワクチン。 ７２．請求の範囲第６５項に記載のワクチンであって、該複合炭水化物がグルカ ンであるワクチン。 ７３．請求の範囲第６５項に記載のワクチンであって、該複合炭化水素がレバン であるワクチン。 ７４．請求の範囲第６５項に記載のワクチンであって、該担体が水性バッファー を含有するワクチン。 ７５．請求の範囲第７４項に記載のワクチンであって、害す異性バッファーがホ スフェートバッファーを包含するワクチン。 ７６．ウイルス性疾患に対して動物を免疫する方法であって、請求の範囲第６５ 項に記載のワクチンの投与量を動物に投与することを具備した方法。