BR0010612B1 - Vacinas - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINAS". A presente invenção refere-se a novas composições adjuvantes para uso em vacinas. Em particular, as composições adjuvantes da presente invenção compreendem uma combinação de saponina e um oligonucleotí- deo imunoestimulador, a referida combinação opcionalmente compreenden- do as composições adjuvantes da presente invenção e pelo menos um antí- geno. São ainda fornecidos métodos de preparação das composições adju- vantes e vacinas da presente invenção e seu uso como medicamentos. Adi- cionalmente, a presente invenção fornece métodos de tratar um indivíduo suscetível a ou sofrendo de uma doença pela administração parenteral ou mucosal das vacinas da presente invenção.

Os oligonucleotídeos imunoestimuladores contêm dinucleotí- deos CpG não metilados ("CpG") e são conhecidos na técnica como sendo adjuvantes quando administrados por ambas as rotinas sistêmica e mucosal (WO n° 96/02555, EP n° 468520, Davis e outros, J. Immunol, 1998,160 (2); 870 - 876; mcCIuskie and Davis, J. Immunol., 1998,161(9): 4463-6). CpG é uma abreviação para motifs de dinucleotídeo de citosina-guanosina pre- sentes em DNA. Historicamente, foi observado que a fração de DNA de BCG podería exercer um efeito anti-tumor. Em outros estudos, oligonucleo- tídeos sintéticos derivados de sequências de gene de BCG foram mostrados serem capazes de induzir efeitos imunoestimuladores (ambos in vitro e in vivo ). Os autores destes estudos concluíram que certas seqüências, inclu- indo um motif CG central, realizaram esta atividade. O papel central do motif CG em imunoestimulação foi por último elucidado em uma publicação por Krieg, Nature 374, p546 1995. Análise detalhada tem mostrado que o motif CG deve ser em um certo contexto de sequência, e que tais seqüências são comuns em DNA bacteriano, porém são raros em DNA de vertebrado. A se- qüência imunoestimuladora é frequentemente : Purina, Purina, C, G, pirimi- dina, pirimidina; onde o motif CG de dinucleotídeo não é metilado, porém outras seqüências CpG não metiladas são sabidas serem imunoestimulado- ras e podem ser empregadas na presente invenção .

Em certas combinações dos seis nucleotídeos uma seqüência palindrômica está presente. Diversos destes motifs, ou como repetições de um motif ou uma combinação de motifs diferentes, podem estar presente no mesmo oligonucleotídeo. A presença de uma ou mais destas seqüências imunoestimuladoras contendo oligonucleotídeos pode ativar vários sub- grupos imunes, incluindo células exterminadoras naturais (que produzem o interferon γ e têm atividade citolítica) e macrófagos (Wooldrige e outros Vol. 89 (n° 8), 1977). Embora outras seqüências contendo CpG não metilada não tendo esta seqüência de consenso tenham sido atualmente demonstra- das serem imunomoduladoras.

CpG quando formulada em vacinas, é geralmente administrada em solução livre junto com o antígeno livre (WO n° 96/02555; McCIusKie e Davis, supra) ou covalentemente conjugado a um antígeno (Publicação PCT n° WO 98/16247), ou formulada com um portador tal como hidróxido de alumínio (antígeno de superfície de Hepatite) Davis e outros, supra ; Brazo- lot-Millan e outros, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 1998,95(26), 15553-8).

Saponinas são ensinadas em : Lacaille-Dubois, M e Wagner H. (1996. Uma revisão das atividades biológicas e farmacológicas de saponi- nas. Phytomedicine vol 2 pp 363 - 386). As saponinas são glicosídeos este- róides ou triterpeno amplamente distribuídos nos reinos de planta e animal marino. As saponinas são conhecidos para formarem soluções coloidais em água que espumam em agitação, e para precipitação de colesterol. Quando as saponinas estão próximas de membranas de células elas criam estrutu- ras tipo poro na membrana que causam a membrana romper-se. A hemólise de eritrócitos é um exemplo deste fenômeno, que é uma propriedade de certas, porém não todas, saponinas.

As saponinas são conhecidas como adjuvantes em vacinas para administração sistêmica. A atividade adjuvante e hemolítica de saponinas individuais tem sido extensivamente estudada na técnica (Lacaille - Dubois e Wagner, supra). Por exemplo, Quil A (derivada da casca da árvore da América do Sul Quillaja Saponaria Molina), e frações desta, são descritas na U.S. n° 5.057.540 e "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Ver. TherDrug CarrierSyst, 1996,12 (1 - 2): 1 - 55; e EP n° 0.362.279 B1 .

As estruturas particuladas, denominadas Immune Stimulating Complexes (ISCOMS), compreendendo frações de Quil A hemolíticas e têm sido empregadas na fabricação de vacinas (Morein, B., EP n° 0.109.942 B1). Estas estruturas têm sido reportadas terem atividade adjuvante (EP n° 0.109.942 B1;WOn° 96/11711). A saponina hemolítica QS21 e QS17 (frações purificadas de HPLC de Quil A) têm sido descritas como adjuvantes sistêmicos potentes, e o método de sua produção é divulgado na Patente dos Estados Unidos n° 5.057.540 e EP n° 0.362.279 B1. Também descrito nestas referências é o uso de QS7 (uma fração não hemolítica de Quil-A) que atua como adjuvante potente para vacinas sistêmicas. O uso de QS21 é ainda descrito em Kensil e outros. (1991. J. Immunology, vol. 146, 431 a 437). As combinações de QS21 e polisorbato ou ciclodextrina são também conhecidas (WO n° 99/10008). Os sistemas adjuvantes particulados compreendem frações de Quil A, tal como QS21 e QS7 são descritos em WO n° 96/33739 e WO n° 96/11711.

Outras saponinas que têm sido empregadas em estudos de va- cinação sistêmica incluem aquelas derivadas de outras espécies de planta, tal como Gypsophila e Saponaria (Bomford e outros, Vaccine, 10(9): 572 - 577,1992).

As saponinas são também sabidas serem empregadas em estu- dos de vacina aplicada mucosalmente, que tem sido apresentadas com va- riável sucesso na indução de respostas imunes. A saponina Quil-A foi previ- amente mostrada não ter nenhum efeito na indução de uma resposta imune quando o antígeno é administrado intranasalmente (Gizurarson e outros, 1994. Vaccine Research 3, 23 - 29). Embora, outros autores tenham empre- gado este adjuvante com sucesso (Maharaj e outros, Can. J. Microbiol, 1986, 32(5) : 414 - 20; Chavali e Campbell, Immunobiology, 174(3) ; 347 - 59). ISCOMs compreendendo a saponina Quil A tem sido empregada em formulações de vacina intragástrica e intranasal e exibiu atividade adjuvante (Mel Mowat e outros, 1991, Immunology, 72, 317 - 322; Mel Mowat e Dona- chie, Immunology Today, 12,383 - 385). QS21, a fração não tóxica de Quil A, tem sido descrita como um adjuvante oral ou intranasal (Sumino e outros, J. Virol., 1998, 72(6): 4931 - 9; WO n° 98/56415). O uso de outras saponinas em estudos de vacinação intranasal tem sido descrito. Por exemplo, as saponinas Chenopodium quinoa tem sido empregada em ambas as vacinas intranasal e intragástrica (Estrada e ou- tros, Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 1998,21(3): 225 - 36). A presente invenção refere-se à surpreendente descoberta de que oligonucleotídeos imunoestimuladores (CpG) e combinações de sapo- nina são adjuvantes extremamente potentes. Portanto, é fornecido uma composição adjuvante compreendendo uma combinação de saponina e um oligonucleotídeo imunoestimulador. Preferivelmente, os adjuvantes da pre- sente invenção podem ainda compreender um portador. Em uma forma preferida da presente invenção a saponina e oligonucleotídeos nas compo- sições de vacina e adjuvantes atuam sinérgicamente na indução de anticor- po específica de antígeno e são potentes na indução de respostas imunes convencionalmente associadas com o sistema imune tipo Th1. Portanto, as combinações adjuvantes não são apenas adequadas para imunoprofilaxia de doenças, porém também surpreendentemente para imunoterapia de do- enças tais como infecções persistentes virais, bacterianas ou parasíticas, e também distúrbios crônicos tais como câncer.

Os oligonucleotídeos preferidos para uso em adjuvantes ou va- cinas da presente invenção preferivelmente contêm dois ou mais motífs de CpG dinucleotídeos separados por pelo menos três, mais preferivelmente pelo menos seis ou mais nucleotídeos. Os oligonucleotídeos da presente invenção são tipicamente deoxinucleotídeos. Em uma modalidade preferida o internucleotídeo no oligonucleotídeo é fosforoditioato, ou mais preferivel- mente uma ligação de fosforotioato, embora o fosfodiéster e outras ligações de internucleotídeo incluem-se no escopo da invenção incluindo oligonucle- otídeos com ligações de internucleotídeo misto. Métodos para produzir oli- gonucleotídeos de fosforotioato ou fosforoditioato são descritos na U.S. n° 5.666.153, U.S. n° 5.278.302 e WO n° 95/26204.

Exemplos de oligonucleotfdeos preferidos têm as seguintes se- qüências. As seqüências preferivelmente contêm ligações de internucleotí- deo modificado por fosforotioato. OLIGO 1(SEQ ID NO:l): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEQ ID NO:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) OLIGO 3(SEQ ID NO:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4 (SEQ JD NO:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) OLIGO 5 (SEQ JD NO:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) Os oligonucleotídeos CpG alternativos podem compreender as seqüências preferidas acima nas quais eles têm deleções inconsequenciais ou adições a elas.

Os oligonucleotídeos CpG utilizados na presente invenção po- dem ser sintetizados por qualquer método conhecido na técnica (por exem- plo, EP n° 468520). Convenientemente, tais oligonucleotídeos podem ser sintetizados utilizando-se um sintetizador automatizado.

Os oligonucleotídeos utilizados na presente invenção são tipi- camente deoxinucleotídeos. Em uma modalidade preferida a ligação de in- ternucleotídeo no oligonucleotídeo é fosforoditioato, ou mais preferivelmente ligação de fosforotioato, embora os fosfodiésteres se incluam no escopo da presente invenção. O oligonucleotídeo compreendendo diferentes ligações de internucleotídeo são contemplados, por exemplo, fosfodiésteres de fosfo- rotioato. Outras ligações de internucleotídeo que estabilizam o oligonucleo- tídeo podem ser empregadas.

As saponinas que podem ser empregadas nas combinações adjuvantes da presente invenção incluem aquelas derivadas da casca de Quillaja Saponaria Molina, denominada Ouil A, e as frações desta, descrita na U.S. n° 5.057.540 e "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit.

Ver. Ther Drug Carrier Sist, 1996,12 (1 - 2): 1 - 55; e EP n° 0 362 279 B1.

As frações particularmente preferidas de Quil A são GS21, GS7 e QS17. A β-Escin é outra saponina hemolítica preferida para uso nas composições adjuvantes da presente invenção. A Escin é descrita no índice Merck (12a. Edição : registro 3737) como uma mistura de saponinas ocor- rendo na semente da árvore da castanha da índia, Lat; Aesculus hippocas- tanum. Seu isolamento é descrito por cromatografia e purificação (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)), e por resinas de permuta de íon (Er- bring e outros, U. S. n° 3.238.190). Frações de escin, α e β, têm sido purifi- cadas e mostradas serem biologicamente ativas (Yoshikawa M, e outros. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Aug; 44(8) : 1454 - 1464)). β-escin é tam- bém conhecida como aescin.

Outra saponina hemolítica preferida para uso na presente in- venção é a Digitonin. A digitonin é descrita no índice Merck (12a. Edição, registro 3204) como uma saponina, sendo derivada das sementes de Digita- lis purpurea e purificada de acordo com o procedimento descrito por Gisvold e outros, J. Am. Pharm. Assoe., 1934, 23, 664; e Rubenstroth-Bauer, Physi- ol. Chem., 1955, 301, 621. Seu uso é descrito como sendo um reagente clí- nico para determinação de colesterol.

As combinações adjuvantes da presente invenção podem ainda compreender um portador, tal que a saponina ou CpG, ou ambos, podem ser associados com uma entidade prtadora ártociçada para realçar a adju- vanticidade. da combinação. As vacinas sistêmicas particularmente preferi- das, por exemplo, compreendem uma molécula portadora. A CpG empregada nas combinações adjuvantes da presente invenção podem ser em solução livre ou podem ser complexadas para por- tadores particulados tais como sais minerais (por exemplo, porém não res- tritos a, sais de cálcio ou alumínio), lipossomas, ISCOMs, emulsões (óleo em água, água em óleo, água em óleo em água), polímeros (tais como, po- rém não restritos a polilático, poliglicólico, polifosfazina, poliaminoácido, al- ginato, quitosana) ou micropartículas. Os portadores preferivelmente referi- dos são catiônicos. As vacinas da presente invenção ainda compreendem um antígeno que pode ser associado com o complexo portador de CpG, ou não podem ser associados com o complexo portador CPG . Neste caso, o antígeno pode ser suspensão livre ou associada com um portador separado.

As saponinas fazendo parte da presente invenção podem ser separadas na forma de micelas, ou podem estar na forma de grandes es- truturas ordenadas tais como ISCOMs (EP 0 109 942 B1) ou lipossomas (WO n° 96/33739) quando formuladas com colesterol e lipídeo, ou na forma de uma emulsão de óleo em água (WO n° 95/17210). As saponinas podem preferivelmente ser associadas com um sal metálico, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio (WO n° 98/15287). Alternativamente a sa- ponina pode ser associada com um portador particulado tal como quitosana. A saponina pode também ser em um estado seco tal como um pó. As for- mulações finais na forma quando elas são administradas à superfície muco- sal da vacina são preferivelmente hemolítica em natura. A saponina pode ou não pode ser associada fisicamente com o antígeno ou através de ligação direta ou por co-interação com a mesma molécula portadora particulada (GB 9822712,7; WO 98/16247). O CpG e saponina nos adjuvantes ou vacinas da presente invenção podem eles mesmos serem separados ou associados.

Por exemplo, a CpG e saponina podem ser em suspensão livre ou podem ser associadas por meio de um portador, mais preferivelmente um portador particulado tal como hidróxido de alumínio ou por uma lipossoma catiônica ou ISCOM.

Uma combinação adjuvante preferida de acordo com a presente invenção é composta de um ou mais oligonucleotídeos contendo pelo me- nos 3, preferivelmente pelo menos 6 nucleotídeos entre dois motifs CG ad- jacentes, juntamente com GS21 e um portador particulado selecionado do grupo compreendendo uma emulsão de óleo em água ou DO. Mais preferi- velmente, a combinação adjuvante compreende CpG 2006 (SEG ID NO: 4), ou CpG 1758 (SEQ ID NO:2) ou CpG 1826 (SEG ID NO) misturada com GS21 e um portador particulado selecionado do grupo compreendendo uma emulsão de óleo em água ou DO. Consequentemente, vacinas particular- mente preferidas, por exemplo, compreende tais combinações adjuvantes e um antígeno. A vacina preferida da presente invenção é empregada para gerar respostas imunes sistêmicas após administração em um indivíduo através da rotina sistêmica.

As combinações adjuvantes da presente invenção podem ser empregadas como ambos adjuvantes mucosais ou sistêmicos. Em uma for- ma particular da invenção é fornecido uma vacina sistêmica para ser admi- nistrada através da rotina sistêmica ou parenteral tal como administração intramuscular, intradérmica, subcutânea, intraperitoneal ou intravenosa.

Uma rotina de administração preferida é por meio da rotina transdérmica, por exemplo por emplastros para pele.

As preparações de vacinas sistêmicas da presente invenção podem ser empregadas para proteger ou tratar um mamífero suscetível a, ou sofrendo de doença, por meio de administração da referida vacina por administração intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intravenosa ou subcutânea. Métodos de administração sistêmica das prepa- rações de vacina podem incluir seringas ou agulhas convencionais, ou dis- positivos designados para a liberação balística de vacinas sólidas (WO

99/27961), ou dispositivo de jato líquido por pressão sem agulha (US

4.596.556; US 5.993.412), ou emplastros transdérmicos (WO 97/48440; WO 98/28037). A presente invenção pode também ser empregada para realçar a imunogenicidade dos antígenos aplicados à pele (liberação transdérmica ou transcutânea WO 98/20734; WO 98/28037). A presente invenção portanto fornece um dispositivo de liberação para administração sistêmica, pré- enchido com a vacina ou composições adjuvantes da presente invenção.

Conseqüentemente é fornecido um método para induzir uma resposta imune em um indivíduo, compreendendo a administração de uma vacina compre- endendo um antígeno e oligonucleotídeo imunoestimulatório, uma saponina e um portador ao indivíduo, onde a vacina é administrada por meio da rotina parenteral ou sistêmica. Métodos preferidos de indução da resposta imune compreende a administração de uma vacina compreendendo um oligonu- cleotídeo de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 com uma saponina derivada de QuilA, tal como QS21 e um portador, tal como uma emulsão de óleo em água, um colesterol contendo lipossoma ou alume.

Alternativamente, as preparações de vacina da presente inven- ção podem ser empregadas para proteger ou tratar um mamífero suscetível a, ou sofrendo de doença, por meio de administração da referida vacina através de uma rotina mucosal, tal como a rotina oral/alimentar ou nasal.

Rotinas mucosais alternativas são intra vaginal e intra-retal. A rotina de ad- ministração mucosal preferida é por meio da rota nasal, denominada vaci- nação intranasal. Métodos de vacinação intranasal são bem conhecidos na técnica, incluindo a administração de uma gotícula, vaporização ou forma em pó seco da vacina na nasofaringe do indivíduo a ser imunisado, Formu- lações de vacinas nebulizadas ou aerolizadas também formam parte desta invenção. Formulações entéricas tal como cápsulas e grânulos gastro- resistentes para administração oral, supositórios para administração retal ou vaginal também formam parte desta invenção.

As combinações adjuvantes da presente invenção, representam uma classe de adjuvantes mucosais adequados para a aplicação em huma- nos para substituir vacinação sistêmica por vacinação mucosal. Em uma forma preferida da presente invenção saponinas puras tal como Quil A ou derivados destes, incluindo QS21; Escin; Digitonina; ou Gypsophila ou sa- poninas Chenopodium quinoa em combinação com oligonucleotídeos imunoestimulatórios podem ser empregadas como adjuvantes para a admi- nistração mucosal de antígenos para obter uma resposta imune sistêmica.

As combinações adjuvantes da presente são empregadas nas formulações de vacinas, cujas vacinas podem ser administradas por meio da rotina sistêmica ou mucosal. Preferivelmente, quando as vacinas são em- pregadas para a administração mucosal a combinação adjuvante compre- ende uma saponina hemolítica.

Para a administração mucosal preferivelmente a composição da invenção compreende uma saponina hemolítica. A saponina hemolítica ou preparação de saponina, no significado desta invenção deve ser determina- da com referência ao seguinte ensaio. 1. O sangue fresco de cobaia é lavado com salina tamponada de fosfato (PBS) 3 vezes em uma centríguga de mesa. Após re-suspensão para o vo- lume original o sangue é também diluído 10 vezes em PBS. 2. 50 μΙ_ desta suspensão de sangue é adicionada em 800 μΙ de PBS con- tendo diluições de duas vezes de tensoativo ou saponina. 3. Após 8 horas a hemólise é estimada visualmente ou avaliando-se a den- sidade ótica do sobrenadante. A presença de um sobrenadante vermelho, que absorve luz em 570 nm indica a presença de hemólise. 4. Os resultados são expressos como a concentração da primerira diluição de saponina na qual a hemólise não mais ocorre.

Para o propósito desta invenção a preparação adjuvante de sa- ponina é hemolítica se ela lisa os eritrócitos em uma concentração de me- nos do que 0,1 %. Como significado de referência, amostras substancial- mente puras de QuilA, QS21, QS7, Digitonina e β-escin são todas saponi- nas hemolíticas como definidas neste ensaio. Dentro da variabilidade expe- rimental inerente de um tal ensaio biológico, as saponinas da presente in- venção preferivelmente tem uma atividade hemolítica, de aproximadamente entre 0,5 a 0,00001 %, mais preferivelmente entre 0,005 % a 0,00001 % e mais preferivelmente entre 0,001 % a 0,0004 %. Idealmente, referidas sapo- ninas devem ter uma atividade hemolítica similar (isto é dentro de uma dife- rença de dez vezes) à aquela da QS21.

As vacinas da presente invenção pode também ser administrada por meio da rotina oral. Em tais casos, o excipiente farmaceuticamente aceitável pode também incluir tampões alcalinos ou cápsulas entéricas ou microgrânulos. As vacinas da presente invenção podem também ser admi- nistradas pela rotina vaginal. Em tais casos, os excipientes farmaceutica- mente aceitáveis podem também ser incluir emulsificadores, polímeros tal como CARBOPOL® e outros estabilizadores conhecidos de cremes vaginais e supositórios. Em tais casos os excipientes podem também incluir ceras e polímeros conhecidos na técnica para a formação de supositórios retais.

Preparações de mais do que uma saponina nas combinações adjuvantes da presente invenção estão também fazendo parte da presente invenção. Por exemplo combinações de pelo menos dois dos seguintes gru- pos compreendendo QS21, QS7, Quil A, β-escin ou digitonina. Adicional- mente, as composições da presente invenção podem compreender combi- nações de mais do que um oligonucleotídeo imunoestimulatório.

Em uma modalidade similar da presente invenção as combina- ções CpG/saponina para ambas administrações sistêmicas e mucosais po- dem ser também combinadas com outros adjuvantes incluindo Lipídio A de Monofosforila e seu derivado não tóxico lipídeo A de monofosforila 3-de-O- acilado. Alternativamente as formulações de saponina podem ser combina- das com veículos de vacina compostos de quitosana ou outros polímeros policatiônicos, polilactídeo e partículas de polilactídeo-co-glicolídeo, matriz de polímero com base em glicosamina de poli-N-acetila, partículas com- postos de polissacarídeos ou polissacarídeos quimicamente modificados, lipossomas e partículas com base em lipídios, partículas compostas de mo- noésteres de glicerol, etc. As saponinas podem ser formuladas na presença de colesterol para formar estruturas particuladas tal como lipossomas ou ISCOMs. Além disso, as saponinas podem ser formuladas juntamente com éster ou éter de polioxietileno, em ou uma solução ou sulpensão não parti- culada ou em uma estrutura particulada tal como uma lipossoma paucila- melar ou ISCOM. As saponinas podem também ser formuladas com excipi- entes tal como CarbopolR para aumentar a viscosidade ou pode ser formu- lada em uma forma em pó seco com um excipiente em pó tal como lactose.

Lipídio A de monofosforila de 3-De-O-acetilado é um adjuvante bem conhecido fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Pode ser prepa- rado pelos métodos ensinados em GB 2122204B. Uma forma preferida de lipídio A de monofosforila de 3-De-O-acetilado é na forma de uma emulsão tendo um tamanho de partícula de menos do que 0,2 μητι em diâmetro (EP 0 689 454 B1). Adjuvantes particularmente preferidos são combinações de 3D-MPL e QS21 (EP 0 671 948 B1), emulsões de óleo em água compreen- dendo 3D-MPL e QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414) ou 3D-MPL formula- dos com outros portadores (EP 0 689 454 B1).

Preferivelmente as formulações de vacinas da presente inven- ção contém um antígeno ou composição antigênica capaz de extrair uma resposta imune contra um patógeno humano, cujo antígeno ou composição antigênica é derivada de HIV-1, (tal como tat, nef, gp 120 ou gp 160), viro- ses de herpes humana, tal como gD ou derivados destes ou proteína Imme- diate Early tal como ICP27 de HSV1 ou HSV2, citomegalovirus ((esp Huma- no) (tal com gB ou derivados destes), Rotavirus (incluindo viroses atenua- das vivas), vírus Epstein Barr (tal como gp 350 ou derivados destes), Vírus da Varicela Zoster (tal como gpl, II e IE63), ou de um vírus da hepatite tal como vírus da hepatite B (por exemplo antígeno de Superfície da Hepatite B ou um derivado deste) vírus da hepatite A, vírus da hepatite C e vírus da hepatite E, ou de outros patógenos virais, tal como paramixoviroses, vírus Respiratório Sincicial (tal como proteínas F e G ou derivados destas), vírus parainfluenza, vírus do sarampo, vírus da cachumba, viroses de papiloma humano (por exemplo HPV6, 11, 16, 18,..), flaviviroses (por exemplo Vírus da Febre Amarela, Vírus da Dengue, vírus da encefalite transmitida pelo carrapato, Vírus da Encefalite Japonesa) ou vírus da Influenza (vírus inati- vado ou totalmente vivo, vírus influenza split, desenvolvidos em ovos ou células MDCK ou virossomas ilesos da gripe (como descrito por R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915 a 920) ou proteínas purificadas ou recombinantes destas, tal como proteínas HA, NP, NA ou M ou combinações destas), ou derivado de patógenos bacterianos tal como Neisseria spp, incluindo N. go- norrhea e N. meningitidis (por exemplo polissacarídeos capsulares e conju- gados destes, proteínas de ligação de transferrina,, proteínas de ligação de lactoferrina, PilC, adesinas); S. pyogenes (por exemplo proteínas M ou fragmentos destes), protease C5 A, ácidos lipoteicóicos), S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp, incluindo catarrhalis, também conhecido como Branhamella catarrhalis (por exemplo invasinas e adesinas de peso molecular alto e baixo); Bordetella spp, incluindo B. pertussis (por exemplo toxina de pertactina ou coqueluche ou derivados destas, hemaglutinina fila- mentosa, ciclase adenilada, fímbria), B. parapertussis e B. bronchiseptica;

Mycobacterium spp., incluindo M. tuberculosis (por exemplo ESAT6, Antíge- no 85A, -B ou -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, incluindo L pneumophila; Escherichia spp, in- cluindo enterotoxic E. coli (por exemplo fatores de colonização, toxina lábil ao aquecimento ou derivados destes, toxina estável ao aquecimento ou de- rivados destes) enterohemorrágico E. coli, enteropatogênico E. coli (por exemplo toxina tipo toxina Shiga ou derivados destes); Vibrio spp, incluindo Vibrio spp, incluindo V. cholera (por exemplo toxina cholera ou derivados destes); Shigella spp, incluindo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersi- nia spp, incluindo Y. enterocolítica (por exemplo uma proteína Yop), Y. pes- tis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluindo C. jejuni (por exemplo toxinas, adesinas e invasinas) e C. coli; Salmonella spp, incluindo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp, incluindo L. monocytogenes; Helicobacter spp, incluindo H. pylori (por exemplo urease, catalase, toxina de vacuolização); Pseudomonas spp, incluindo P. aerugino- sa; Staphylococcus spp., incluindo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., incluindo E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., incluindo C. tetania (por exemplo toxina de tétano e derivado deste), C.botulinum (por exemplo toxina botulinum e derivado desta), C. diffícile (por exemplo toxinas A e B de clostridium e derivados destas); Bacillus spp., incluindo B. anthracis (por exemplo toxina botulinum e derivados destas); Corynebacterium spp., in- cluindo C. diphtheriae (por exemplo toxina de difteria e derivados destas);

Borrelia spp., incluindo B. burgdorferi (por exemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garínii (por exemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por exemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por exemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., incluindo £ equi e o agente do Human Granulocytic Ehrlichiosis; Rickettsia spp, incluindo R. rickettsii;

Chlamydia spp., incluindo C. trachomayis (por exemplo MOMP, proteínas de ligação de heparina), C. pneumoniae (por exemplo MOMP, proteínas de li- gação de heparina), C. psittaci; Leptospira spp., incluindo L. interrogans;

Treponema spp., incluindo T. pallidum (por exemplo as proteínas de mem- brana externa rara), T. denticola, T. hyodysenteriae; ou derivados de para- sitas tal como Plasmodium spp., incluindo P. falciparum; Toxoplasma spp., incluindo T. gondii (por exemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., in- cluindo £ histolytica; Babesia spp., incluindo b. microti; Trípanosoma spp., incluindo T. cruzi; Giardia spp., incluindo G. lamblia; Leshmania spp., incluindo L major; Pneumocystis spp., incluindo P. carinii; Trichomonas spp., incluindo T. vaginalis; Schisostoma spp., incluindo S. mansoni ou deri- vado de leveduratal como Candida spp., C. albicans; Cryptococcus spp., incluindo C. neofarms.

Outros antígenos específicos preferidos para M. tubercuosis são por exemplo Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb30-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 e hTCC1 (WO 99/51748). Proteínas para M. tuberculosis também incluem proteínas de fusão e variantes destes onde em pelo menos dois, preferivelmente três polipeptídeos de M. tuberculosis são fundidos em uma proteína maior. Fusões preferidas incluem Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV- MTI, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748).

Antígenos mais preferidos para Clamídias incluem por exemplo a Proteína de Peso Molecular Elevado (HWMP) (WO 99/17741), ORF3 (EP 366 412) e proteínas de membranas putativas (Pmps). Outros antígenos de Clamídias da formulação de vacina podem ser selecionados do grupo des- crito em wo 99/28475.

Vacinas bacterianas preferidas compreendem antígenos deriva- dos de Streptococcus spp, incluindo S. pneumoniae ( por exemplo polissa- carídeos capsulares e conjugados destes, PsaA, PspA, estreptolisina, pro- teínas de ligação de colina) e a Pneumolisina de antígeno de proteína (Bio- chem Biophys Acta, 1989, 67,1007; Rubins e outros, Pathogenesis Microbi- al, 25, 233 a 342), e derivados detoxificados mutantes destes (WO 90/06951; WO 99/03884). Outras vacinas bacterianas preferidas compreen- dem antígenos derivados de Haemophilus spp., incluindo H. influenzae type B (por exemplo PRP e conjugados destes), non typeable H. influenzae, por exemplo OMP26, adesinas de peso molecular elevado, P5, P6, proteína D e lipoproteína D e fímbria derivados de peptídeos (US 5.843.464) ou variantes de cópias múltiplas ou proteínas de fusão destas.

Derivados de antígeno de superfície de Hepatite A são bem co- nhecidos na técnica e incluem, entre outros, aqueles antígenos PreS1, PreS2 S mencionados descritos nos Pedidos de Aplicação Européia EP-A- 414 374; EP-A-0304 578 e EP 198-474. Em um aspecto preferido a formula- ção da vacina compreende o antígeno HIV-1, gp120, especialmente quando expressado em células CHO. Em uma outra modalidade, a formulação da vacina da invenção compreende gD2t como acima definido.

Em uma modalidade preferida da presente invenção vacinas contendo o adjuvante reivindicado compreende um derivado de antígeno do Papilomavírus Humano (HPV) considerado ser responsável pelas verrugas genitais (HPV 6 ou HPV 11 e outros) e viroses HPV responsáveis pelo cân- cer cervical (HPV 16, HPV 18 e outros).

Formas particularmente preferidas de vacinas terapêuticas ou profiláticas para verruga genital compreendem partículas L1 ou capsômeros e proteínas de fusão compreendendo um ou mais antígenos selecionados de proteínas E6 HPV 6 e HPV 11, E7, L1 e L2.

As formas mais preferidas de proteína de fusão são: L2E7 como divulgada em WO 96/26277, e proteína D (1/3)-E7 divulgada em GB 9717953.3 (PCT/EP98/05285).

Uma vacina para infecção cervical HPV ou câncer, para profila- xia ou trapêutica, preferida, pode compreender antígenos HPV 16 ou 18.

Por exemplo, monômeros de antígenos L1 ou L2, ou apresentados junta- mente com uma partícula tipo vírus (VLP) ou a proteína sozinha L1 apre- sentada sozinha em uma estrutura VLP ou dee capsômero. Tais antígenos, partículas tipo vírus e capsômeros são por si conhecidas. Observe por exemplo WO 94/00152, WO 94/20137, WO 94/05792 e WO 93/02184.

Proteínas primitivas adicionais podem ser incluí das sozinhas ou como proteínas de fusão tal como E7, E2 ou preferivelmente E5 por exem- plo, modalidades particularmente preferidas desta incluem uma VLP com- preendendo proteínas de fusão L1E7 (WO 96/11272).

Os antígenos HPV 16 particularmente preferidos compreendem as proteínas primitidas E6 e E7 em fusão com um portador de proteína D para formar as fusòes de Proteína D - E6 ou E7 de HPV 16, ou combina- ções destas; ou combinações de E6 ou E7 com L2 (WO 96 /26277).

Alternativamente aos HPV 16 ou 18 as proteínas primitivas E6 e E7 podem ser apresentadas em uma molécula única, preferivelmente uma fusão de Proteína D-E6/E7. Tal vacina pode opcionalmente conter qualquer uma ou ambas proteínas E6 e E7 de HPV 18, preferivelmente na forma de uma Proteína D-E6 ou proteína de fusão de Proteína D - E7 ou proteína de fusão de Proteína D E6/E7. A vacina da presente invenção pode adicionalmente compreen- der antígenos de outras cepas HPV, preferivelmente de cepas HPV 31 ou 33.

As vacinas da presente invenção também comreendem antíge- nos derivados de parasitas que causa a Malária. Por exemplo, antígenos preferidos de Plasmodia falciparum incluem RTS,S e TRAP. RTS é uma proteína híbrida compreendendo substancialmente toda a porção terminal C da proteína circumsporozoite (CS) de P. falciparum ligada por meio de qua- tro aminoácidos da porção preS2 de antígeno de superfície de Hepatite B ao antígeno de superfície (S) de vírus da hepatite B. Sua estrutura completa é divulgada no Pedido de Patente Internacional n° PCT/EP92/02591, publica- do sob o Número WO 93/10152 reivindicando prioridade do Pedido de Pa- tente UK n° 9124390.7. Quando expressada em levedura RTS é produzida com uma partícula de lipoproteína e quando é co-expressada com o antíge- no S de HBV produz uma partícula misturada conhecida como RTS,S. Antí- genos TRAP são descritos no Pedido de Patente Internacional n° PCT/GB89/00895, publicado sob WO 90/01496. Uma modalidade preferida da presente invenção é uma vacina de Malária onde a preparação antigêni- ca compreende uma combinação dos antígenos RTS,S e TRAP. Outros an- tígenos de plasmódios que são provavelmente candidatos a serem compo- nentes de uma vacina de Malaria de multi-estágio são P. faciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrin, PfEMPI, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPI, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 e seus análogos em Plasmódio spp.

As formulações podem também conter um antígeno anti-tumor e ser útil para o tratamento imunoterapêutico de cancêr. Por exemplo, a for- mulação adjuvante encontra utilidade com antígenos de rejeição de tumor tal como aqueles para cânceres de próstata, de mama, coloretal, de pulmão, pancréatico, renal ou melanoma. Antígenos exemplares incluem MAGE 1, MAGE 3 ou outros antígenos MAGE (para o tratamento de melanoma), PRAME, BAGE ou GAGE (Robbins e Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628 a 636; Van den Eynde e outros., International Jour- nal of Clinicai & Laboratory Research (apresentado em 1997); Correale e outros (1997), Journal of the National Câncer Institute 89, p 293. De fato estes antígenos são expressos em uma ampla faixa de tipos de tumor tal como melanoma, carcinoma de pulmão, sarcoma e carcinoma de bexiga.

Outros antígenos específicos de tumor são adequados para uso com os ad- juvantes da presente invenção e incluem, porém não são restritos a ganglio- sídeos específicos de tumor, antígenos específicos de Próstata (PSA) ou Her-2/neu, KSA (GA733), PAP, mamaglobina, MUC-1, antígeno carcinoem- briônico (CEA). Conseqüentemente em um aspecto da presente invenção é fornecida uma vacina compreendendo uma composição adjuvante de acor- do com a invenção e um antígeno de rejeição de tumor. É um aspecto particularmente preferido da presente invenção que as vacinas compreendam um antígeno de tumor; tais vacinas são sur- preendentemente potentes na terapia do câncer tal como cânceres de próstata, de mama, coloretal, pulmão, pancreático, renal, ovariano ou mela- noma. Conseqüentemente, as formulações podem conter antígenos associ- ados de tumor, bem como antígenos associados com mecanismos de su- porte de tumor (por exemplo angiogênese, invasão de tumor). Adicional- mente, antígenos particularmente relevantes para vacinas na terapia de câncer pode compreender antígeno de membrana específico de Próstata (PSMA), Antígeno de Célula Tronco da Próstata (PSCA), tirosianse, survivin, NY-ES01, prostase, PS108 (WO 98/50567), RAGE, LAGE, HAGE. Adicio- nalmente o referido antígeno pode ser o próprio hormônio de peptídeo tal como hormônio de liberação de hormônio de Gonadotrofina de comprimento total (GnRH, WO 95/20600), um peptídeo longo de aminoácido 10 curto, útil no tratamento de muitos cânceres ou em imunocastração. É previsível que composições da presente invenção sejam em- pregadas para formular vacinas contendo antígenos derivados de Borrelia sp. Por exemplo, antígenos podem incluir ácido nucleico, antígeno derivado de patógeno ou preparações antigênicas, proteína recombinantemente pro- duzida ou peptídeos, proteínas de função quimérica. Em particurlar o antí- geno é OspA. O OspA pode ser uma proteína totalmente madura em uma forma lipidada devido a célula hospedeira (E.Coli) denominada (Lipo-OspA) ou um derivado não lipidado. Tais derivativos não lipidados incluem a pro- teína de função NS1-OspA não lipidada que tem os primeiros 81 amino áci- dos de terminal N da proteína não estrutural (NS1) do vírus influenza, e a proteína OspA completa, e outros, MDP-OspA é uma forma não lipidada de OspA transportando 3 amino ácidos de terminal N adicionais.

As vacinas da presente invenção podem ser usadas para as profilaxias ou terapias de alergia. Tais vacinas compreenderíam alérgeno específico (por exemplo Dep p1) e antígenos não específico de alérgeno (por exemplo peptídeos derivados de IgE humano, incluindo porém não res- trito ao decapeptídeo stanworth (EP 0 477 231 B1)).

As vacinas da presente invenção podem também ser usadas para a profilaxia ou terapia de outros distúrbios crônicos que alergia, câncer ou doenças infecciosas. Tais distúrbios crônicos são doenças tais como ate- roesclerose e Alzheimer.

Os antígenos relevantes para a profilaxia e a terapia de paci- entes suscetíveis a ou sofrendo de doença neurodegenerativa de Alzheimer são, em particurlar, o fragmento de amino ácido 39 - 43 de terminal N (Αβ) da proteína precursora amiloide e fragmentos menores. Este antígeno é di- vulgado no pedido de patente internacional No. WO 99/27944 - (Athena Neurosciences). A quantidade de proteína em cada dose de vacina é seleciona- da como uma quantidade que índuz uma resposta imune protetora sem efeitos colaterais adversos, significantes em vacinas típicas. Tal quantidade variará dependendo em qual imunógeno específico é empregada e como é apresentada. Geralmente, espera-se que cada dose compreenderá 1-1000 μg de proteína, preferivelmente 1 - 500 pg, preferivelmente 1-100 pg, mais preferivelmente 1 a 50 pg. Uma quantidade ideal para uma vacina particular pode ser verificada pelos estudos padrões envolvendo observação de res- postas imune apropriadas em indivíduos vacinados. Seguindo uma vacina- ção inicial, os indivíduos podem receber uma ou várias imunizações de re- forço adequadamente espaçadas. Uma tal formulação de vacina pode ser aplicada em uma superfície mucosal de um mamífero em ou um regime de vacinação inicial ou de reforço; ou alternativamente ser sistemicamente ad- ministrada, por exemplo por meio de rotinas transdérmica, subcutânea ou intramuscular. A quantidade de CpG ou oligonucleotídeos imunostimulatórios nos adjuvantes ou vacinas da presente invenção é geralmente menor, po- rém dependendo da formulação da vacina pode ser na região de 1 - 1000 pg por dose, preferivelmente 1 - 500 pg por dose, e mais preferivelmente entre 1 a 100 pg por dose. A quantidade de saponina para uso nos adjuvantes da presente invenção pode ser na região de 1 - 1000 pg pose, preferivelmente 1 - 500 pg por dose, mais preferivelmente 1 - 250 pg por dose, e mais preferivel- mente entre 1 a 100 pg por dose. A relação de CpG : saponina (w/w) será portanto na faixa de 1 :1000 para 1000 :1, e tipicamente será na faixa de 1 : 100 para 100 : 1, e preferivelmente na faixa de 1 : 10 para 1 : 1 ou 1 : 1 para 10 :1, e mais preferivelmente 1 :1,4:1 ou 10:1.

As formulações da presente invenção podem ser usadas para ambos propósitos profilático e terapêutico, consequentemente, é fornecida para uso de uma combinação de uma saponina e uma molécula CpG na preparação de uma vacina para as profilaxias e o tratamento de infecções virais, bacteriana, parasítica, alergia, câncer e outros distúrbios não crôni- cos. Consequentemente, a presente invenção fornece para um método de tratamento um mamífero suscetível a ou sofrendo de uma doença infecciosa ou câncer, ou alergia, ou doença auto imune. Em um outro aspecto da pre- sente invenção é fornecido uma vacina ou combinação adjuvante, compre- endendo uma saponina e CpG, como aqui descrito para uso como um medi- camento. A preparação de vacina é geralmente descrita por New Trends and Developments in Vaccines, editada por Voller e outros, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. É previsto que composições da presente invenção serão usadas para formular vacinas contendo derivados de antígenos de uma larga varie- dade de fontes. Por exemplo, antígenos podem incluir ácido nucleico huma- no, bacteriano, ou viral, preparações de antígeno ou antigênico derivado de patógeno, preparações de derivados de tumores antígenos ou antigênico, antígenos derivados de hospedeiro, incluindo derivados de peptídeos de IgE, tal como decapeptídeo de liberação de histamina de IgE (conhecido como o decapeptídeo Stanworth), recombinantemente peptídeos ou proteí- nas produzidas, e proteínas de fusão quimérica. É fornecido pela presente invenção uma composição de vacina sistêmica compreendendo um antígeno, uma sapolina e um oligonugletídeo de imunostimulatório. Consequentemente, é fornecido um método de trata- mento de um indivíduo suscetível a ou sofrendo de uma doença pela admi- nistração de uma composição como substancialmente descrito aqui através da rotina sistêmica do referido indivíduo. Também fornecido é um método para prevenir um indivíduo de contrair uma doença selecionada do grupo compreendendo doenças infecciosas bacterianas e virais, doenças parasí- dicas, cânceres da próstata, da mama, colorretal, pulmão, pancreática, re- nal, ovariana ou melanona; distúrbios crônicos de não câncer, alergia, Al- zheimer, aterosclerose, compreendendo a administração de uma composi- ção como substancialmente descrita aqui através da rotina sistêmica do re- ferido indivíduo.

Alternativamente é fornecido pela presente invenção a composi- ção de vacina mucosal compreendendo um antígeno, e uma sapolina hemo- lítica. Consequentemente, é fornecido um método de tratamento de um indi- víduo suscetível a ou sofrimento de uma doença pela administração de uma composição como substancialmente aqui descrita a uma superfície mucosal do referido indivíduo.

Além disso, é descrito um método de indução de uma resposta imune específica de antígeno sistêmica em um mamífero, compreendendo administração a uma superfície mucosal do referido mamífero uma composi- ção compreendendo um antígeno e uma sapolina hemolítica. Ainda é forne- cido um método de produção de uma vacina ou adjuvante, compreendendo tomar uma saponina e tomar uma molécula CpG e misturando então com um antígeno.

Exemplos de excipientes adequados farmacêuticamente aceitá- veis para uso nas combinações da presente invenção incluem água, salina tamponada de fosfato, soluções de tampão isotômico.

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1: Títulos de IgG específico de OspA 14 dias após o reforço nasal.

Figura 2: Títulos de LA2 específico de OspA 14 dias após o reforço nasal.

Figura 3: Títulos de IgG específico da cepa da gripe de soro 14 dias após o reforço nasal.

Figura 4: Títulos de Inibição de HemAglutinação de soro específico de cepa da gripe de soro (HAI) 14 dias após o reforço nasal.

Figura 5: Títulos LA2 específico de OspA 14 em camundongos.

Figura 6: Atividade de linfoproliferação específica de gp 120 de células de baço de camundongos imunizados. A atividade específica de antígeno é expressada como SI para concentrações de antíge- nos diferentes para todos os 4 grupos experimentais.

Figura 7: Atividade CTL específica de HbsAg de células de baço de ca- mundongos imunizados. Atividade de célula efetora foi estimada examinando-se a liberação 51Cr de células P815 (círculos aber- tos) ou células P815 transfectadas por s (círculos abertos).

Figura 8: Respostas de anticorpo especifica de HbsAg em camundongos imunizados. Títulos de anticorpos específicos (expressados como EU/ml) e perfis isótipos foram avaliados empregando tes- tes ELISA. Valores de soros agrupados são mostrados na tabela e distribuições de isótipos são também descritos em um gráfico.

Figura 9: Atividade de linfoproliferação específica de gp 120 e HBS Ag de células de baço de camundongos imunizados. A atividade espe- cífica de antígeno é expressa como SI para concentrações de antígenos diferentes para todos os 4 grupos experimentais.

Figura 10: Atividade de CTL específica de gp120 e HbsAg e de células de baço de camundongos imunizados. Atividade de célula efetora foi estimada examinando-se a liberação 51Cr de células P815 de controle (símbolos abertos) ou células P815 mostrando um epí- topo HbsAg ou gp120 (símbolos fechados).

Figura 11: Respostas de anticorpo especifica de gp 120 e específica de HbsAg em camundongos imunizados. Títulos de anticorpos es- pecíficos (expressados como pg/ml) (Figura 11) e perfis de isó- tipos foram avaliados empregando testes ELISA. Valores de so- ros agrupados são mostrados na tabela e distribuições de isóti- pos são também descritos em um gráfico. A figura 11B mostra a modelo de isótipo dos anticorpos específicos de gp120.

Figura 12: Evolução do crescimento de tumor médio por grupos de 10 ani- mais em tempo prolongado. A presente invenção é ilustrada pelos, porém não restrita aos, seguintes exemplos. EXEMPLO 1 O uso de QS21 e CpG para o reforço intranasal dos anticorpos sistêmicos para Lipo-OspA

NesíeLexemplo investigamos se saponinas líticas tal como QS21 e imuno-estimulantes tal como CpG foram capazes de realçar em um as- pecto sinérgico as respostas imunológicas sistêmicas para uma vacinação de reforço intranasal de camundongos. Fêmeas de camundongos Balb/c (5 animais por grupo), da idade de 8 semanas, foram imunizadas intramuscu- larmente com lipo-OspA (1pg) formuladas sobre alume (50 pg). Após 3 me- ses, os camundongos foram reforçados intranasalmente (sob anestesia) com 10 μΙ de solução (5 μΙ pela narina, liberadas como gotas por pipeta) contendo 5 pg lipo-OspA em ou A: PBS; B:20 pg CpG 1001 (TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT, Krieg 1826); C: 5 pg QS21 (obtido por Cambridge Bio- tech, USA); D: 20 pg CpG 1001 +5 pg QS21; ou, E: por injeção intramus- cular de 1 pg lipo-OspA absorvido sobre alume (50 pg). Figuras 1 e 2 mos- tram os títulos IgG específicos OspA e títulos LA2 14 dias após o reforço nasal. Métodos: ELISA para a medição de laG de soro específico de OspA em camundon- aos: Imunoplacas Maxisorp Nunc são revestidas durante a noite a 4°C com 50 μΙ/cavidade de 1 pg/ ml de OspA diluída em PBS (nas filas B a H de placa), ou com 50 μΙ de 5 pg/ml Ig de anticamundongo de cabra purifi- cada (Boerhinger), em PBS (fila A). Sítios livres sobre as placas são blo- queados (1 hora, 37°C) usando tampão de saturação: PBS contendo 1% de BSA, 0,1% de monolaurato de sorbitan de polioxietileno (TWEEN 20), e 4% de Soro Bovino Normal (NBS). Então, diluições de 2 vezes seriais de mistu- ra de isotipo IgG, diluídas em tampão de saturação (50 μΙ por cavidade) e adicionadas como uma curva padrão (mistura de anticorpos monoclonais de camundongo, lgG1, lgG2a e lgG2b de Sigma, partindo em 200 ng/ml e colo- cadas na fila A), e amostras de soro (partindo em uma diluição de 1/100 e colocadas nas filas B a H) são incubadas por 1hora e 30 minutos em 37°C.

As placas são em seguida lavadas (3x) com tampão de lavagem (PBS, 0,1% de monolaurato de sorbitan de polioxietileno (TWEEN 20)). Então, IgG de anticamundongo de cabra biotinilado (Amersham) diluída 1/5000 em tampão de saturação é incubada (50 μΙ/cavidade) por 1hora e 30 minutos, em 37°C.

Após 3 lavagens, e subsequente adição de conjugado de estreptavidina- peroxidase rábano-picante (Amersham), placas são lavadas 5 vezes e incu- badas por 20 minutos em temperatura ambiente com 50 μΙ/cavidade de tam- pão de revelação (0,4 mg/ml de OPDA (Sigma) e 0,03% de H202 em 50mM e pH 4,5 de tampão de citrato). Revelação é interrompida por adição de 50 μΙ/cavidade de H2S04 2N. Densidades Óticas são lidas em 492 e 630 nm empregando-se imunoleitora Biorad 3550. Títulos de anticorpo são calcula- dos pelo método matemático de parâmetro 4 empregando SoftMaxPro software.

Ensaio de inibição para medição de títulos de anticorpo tipo-LA2 de soro para Iípq-OspA Títulos de anticorpo em vacinas foram estudados com respeito a sua especificidade tipo-LA2. LA2 é um anticorpo monoclonal de murino que reconhece uma epitope OspA conformacional na superfície das bactérias e tem sido demonstrado ser capaz a matar B. burgdorferi em vitro, bem como para proteger camundongos contra um desafio com espiroqueta protegida em laboratório (Schaible UE e outros. 1990. Proc Natl Acad Sei USA 87:3768-3772). Além disso, LA-2 mab tem sido mostrado combinado com anticorpos bactericidas, e estudos sobre soros humanos mostraram também uma boa correlação entre o total de títulos IgG de anti-OspA e os títulos LA- 2 (como medida por ELISA).

Imunoplacas Maxisorp Nunc são revestidas durante a noite em 4°C com 50 μΙ/cavidade de 0,5 pg/ml de lipo OspA diluído em PBS. Sítios livres sobre as placas são bloqueados (1 hora, 37°C) usando tampão de saturação: PBS contendo 1% de BSA, 0,1% de monolaurato de sorbitan de polioxietileno (TWEEN 20), e 4% de Soro Bovino Normal (NBS). Sítios livres foram bloqueados com tampão de saturação por 1 hora em 37°C com (100 μΙ/cavidade de tampão de saturação: PBS/1% de BSA/ 0,1% de Tween 20/ 4% de NBS). Diluições seriais de 2 vezes de Ab monoclonal de LA2 (mAb) partindo de 4 pg/ml foram diluídas em tampão de saturação (50 μΙ por cavi- dade) para formar uma curva padrão. Diluições de amostras de soro das vacinas (partindo de uma diluição de 1/10) foram também adicionadas e as placas incubadas por 2 horas em 37°C. As placas foram lavadas após a in- cubação incubação três vezes com PBS/ TWEEN 20 (0,1%). Conjugado de peroxidase-mAb de LA2 (1/10,000) diluído em tampão de saturação foi adi- cionado para cada cavidade (50 μΙ/cavidade) e incubado por 1 hora em 37°C. Após 5 lavagens, placas são incubadas por 20 minutos em temperatu- ra ambiente (em escuridão) com 50 μΙ/cavidade de tampão de saturação (0,4 mg/ml de OPDA e 0,03% de H202 em 50mM e pH 4,5 de tampão de ci- trato). A reação e formação de cor foi interrompida com 2N de H2S04. Den- sidades Óticas são lidas em 492 e 630 nm empregando-se imunoleitora Bio- rad 3550. Títulos de Ab tipo-LA2 são calculados pelo método matemático de parâmetro 4 empregando SoftMaxPro software. Títulos de anticorpo tipo- LA2 foram determinados por comparação com curva padrão.

RESULTADOS

CpG bem como QS21 melhorar significamente o reforço intrana- sal dos anticorpos sistêmicos para Lipo-OspA. Além disso, em seguida am- bos adjuvantes são combinados, um efeito sinérgico sobre aquelas respos- tas é claramente demonstrado, especialmente em termo de anticorpos de LA2. Respostas humorais evocadas na presença de QS21 e CpG são signi- ficamente maiores que aquelas induzidas pelo reforço parenteral. Associa- dos, estes resultados mostram claramente o potencial de formulações intra- nasais combinando uma saponina lítica e um imunoestimulante. EXEMPLO 2: Combinação Sinérgica de QS21 e CpG realçando o reforço intranasal de anticorpos sistêmicos para vírus da influenza Neste exemplo investigamos se saponinas hemolíticas tal como QS21 (ver exemplo) e imuno-estimulantes tal como CpG foram capazes de realçar em um aspecto sinérgico o reforço intranasal de anticorpos sistêmi- cos em camundongos iniciados intranasalmente com vírus da influenza todo inativado. Fêmeas de camundongos Balb/c (10 animais por grupo), da idade de 8 semanas, foram iniciadas intranasalmente com vírus da influenza todo trivalente inativado de β-propiolactona (A/Beijing/262/95; A/Johannesburg/33/94; B/Panama/45/90; 5 μg de HA / cepa) para imitar a iniciação natural de ocorrência em humanos. Após 28 dias, os camundon- gos foram reforçados intranasalmente (sob anestesia) com 20 μΙ de solução (10 μΙ pela narina, liberadas como gotas por pipeta) contendo 1,5 pg de HA / cepa de vírus da influenza todo trivalente inativado de β-propiolactona (as mesmas cepas como na imunização de iniciação) em ou A: PBS; B:50 μg CpG (TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT, Krieg 2006); C: 4,5 pg QS21 (obtido por Cambridge Biotech, USA); D: 50 pg CpG + 4,5 pg QS21; ou, E: por injeção intramuscular de 1,5 pg de HA / cepa de vírus da influenza split trivalente (as mesmas cepas como na imunização de iniciação). Antígenos da gripe foram fornecidos pela SSD GmBH manufacturer (Dresden, Alema- nha).

Figuras 3 e 4 mostram os títulos de IgG específicos da cepa da gripe em soro e títulos de Inibição de HemAglutinação (HAI) 14 dias após o reforço nasal. MÉTODOS: ELISA para a medição de títulos de laG Anti-influenza em camundonoos Imunoplacas Maxisorp Nunc são revestidas durante a noite a 4°C com 50 μΙ/cavidade de 1 pg/ ml de antígeno do vírus da influenza ileso diluídas em PBS (nas filas B a H de placa), ou com 50 μΙ de 5 pg/ml Ig de anticamundongo de cabra purificada (Boerhinger), em PBS (fila A). Sítios livres sobre as placas são bloqueados (1 hora, 37°C) usando tampão de saturação: PBS contendo 1% de BSA, 0,1% de monolaurato de sorbitan de polioxietileno (TWEEN 20), e 4% de Soro Bovino Normal (NBS). Então, di- luições de 2 vezes seriais de mistura de isotipo IgG, diluídas em tampão de saturação (50 μΙ por cavidade) e adicionadas como uma curva padrão (mis- tura de anticorpos monoclonais de camundongo, lgG1, lgG2a e lgG2b de Sigma, partindo em 200 ng/ml e colocadas na fila A), e amostras de soro (partindo em uma diluição de 1/100 e colocadas nas filas B a H) são incu- badas por 1hora e 30 minutos em 37°C. As placas são em seguida lavadas (3x) com tampão de lavagem (PBS, 0,1% de monolaurato de sorbitan de polioxietileno (TWEEN 20)). Então, IgG de anticamundongo de cabra bioti- nilado (Amersham) diluída 1/5000 em tampão de saturação é incubada (50 μΙ/cavidade) por 1 hora e 30 minutos, em 37°C. Após 3 lavagens, e subse- qüente adição de conjugado de estreptavidina-peroxidase rábano-picante (Amersham), placas são lavadas 5 vezes e incubadas por 20 minutos em temperatura ambiente com 50 μΙ/cavidade de tampão de revelação (0,4 mg/ml de OPDA (Sigma) e 0,03% de H202 em 50mM e pH 4,5 de tampão de citrato). Revelação é interrompida por adição de 50 μΙ/cavidade de H2S04 2N. Densidades Óticas são lidas em 492 e 630 nm empregando-se imuno- leitora Biorad 3550. Títulos de anticorpo são calculados pelo método mate- mático de parâmetro 4 empregando SoftMaxPro software. O vírus da influ- enza ileso usado para o revestimento (cepa A/Beijing/262/95), inativado com β-propiolactona (BPL), é fornecido por SSD GmBH manufacturer (Dresden, Alemanha).

Atividade de Inibição de HemAglutinacão (HAI) de Abs de soro específico da gripe em camundonaos Os soros (25 μΙ) são primeiro tratados por 20 minutos em tempe- ratura ambiente (RT) com 100 μΙ de tampão 0,5M de borato (oH 9) e 125 ul de caulin comercializado pela Dade Behring. Após centrifugação (30 minu- tos, 3000 RPM ou 860 g), 100 μΙ de sobrenadante ( correspondendo a uma diluição de 1/10 do soro) são tomados e incubados durante 1 hora em 4°C com 0,5% de células do sangue vermelha do sangue. O sobrenadante é coletado após centrifugação durante 10 minutos em 3200 RPM (970 g). Am- bas operações são feitas para eliminar os fatores de hemaglutinação natural contido no soro. Em seguida, 25 μΙ de soro tratado são diluídos em 25 μΙ de PBS (diluições seriais de 2 vezes iniciando em 1/20) em placas Greiner de cavidade 96. O vírus intacto inativado BPL é adicionado (25 μΙ/ cavidade) em uma concentração de 4 Unidades de Hemaglutinação (isto é, em uma diluição a qual seja 4 vezes menor do que a última provocando uma agluti- nação de células sanguíneas vermelhas) durante 30 minutos em temperatu- ra ambiente sob agitação. As células sanguíneas vermelhas de frango são em seguida adicionadas (25 μ,/cavidade) durante 1 hora em temperatura ambiente. As placas são finalmente mantidas durante a noite em 4°C antes de serem lidas. O título HAI corresponde à última diluição de soro inibindo a hemaglutinação induzida por vírus.

RESULTADOS

CdG bem como QS21 não melhora o reforço intranasal de anti- corpos IgG ou HAI para cepas da gripe. Entretanto, quando ambos adju- vantes são combinados, um efeito sinérgico sobre aquelas respostas é cla- ramente demonstrado. As respostas HAI evocadas na presença de QS21 e CpG são ainda similares àquelas induzidas pelo reforço parenteral. Esses resultados confirmam o potencial de formulações intranasais combinando uma saponina hemolítica e um imunoestimulante. Eles também mostram que diversas sequências podem ser eficientes neste contexto (Krieg 2006 no exemplo presente e Krieg 1826 nos exemplos 3 e 5). EXEMPLO 3: Combinação sinérgica de β-Escin e CpG para realçar o reforço intranasal de anticorpos sistêmicos para Lipo-OspA

Avaliamos no presente exemplo a possibilidade que uma siner- gia similar aquela observada entre QS21 e CpG deva ser obtido com outras saponinas hemolíticas (observe o exemplo) tal como β-Escin. A saponina não hemolítica, ácido glicirrízico, é também testado.

Camundongos Balb/c fêmeas (6 animais por grupo), 8 semanas de idade, foram preparados intramuscularmente com lipo-Ospa (1 pg) for- mulados sobre alume (50 pg). Após 3 meses, os camundongos foram refor- çados intranasalmente (sob anestesia) com 10 pl de solução (5 pl por nari- na, liberados como gotas por pipetas) contendo 5 pl de lipo-OspA em quais- quer dos casos A: PBS; B: 50 pg de CpG 1001 (TCC ATG AGC TTC ACG

TT, Krieg 1826); C: 5 pg de β-Escin (comprado por Sigma); D: 50 pg de CpG 1001 +5 pg de β-Escin; E: 5 pg de ácido glicirrízico (comprado por Sigma); F: 50 pg CpG 1001 +5 pg de ácido glicirrízico ou, G: por injeção intramus- cular de 1 pg de lipo-Ospaabsorvido em alume (50 pg). A figura 5 mostra os títulos OspA específico-LA2 14 dias após o reforço nasal.

MÉTODOS

Os métodos são os mesmos daqueles detalhados no Exemplo 1.

RESULTADOS β-Escin e CpG atuam sinergicamente para realçar o reforço in- tranasal de LA2 Abs sistêmico. Essa combinação evoca respostas Ab mais elevadas do que o reforço parenteral. Por outro lado, uma tal sinergia não é obtida pela combinação de CpG com ácido glicirrízico.

Estes resultados e aqueles anteriores desta patente tomados juntos mostram a capacidade de CpG e saponinas hemolíticas diferentes para respostas imune adjuvante em um modelo sinérgico. EXEMPLO 4: Estudos de imunogenicidade empregando P.falciparum RTS,S e HIV-1 gp 120 formulado com CpG e/ou DQS21 1. Resumo da Experiência Dois estudos de imunogenicidade de camundongo foram condu- zidos para avaliar o potencial aditivo ou efeitos sinérgicos de oligonucleotí- deos CpG (CpG) e QS21. Os grupos de camundongos foram imunizados com RTS,S e gp 120 formulado com CpG e QS21 sozinho ou em combina- ção. Essas combinações adjuvantes foram também testadas na presença do portador AI(OH)3 ou uma emulsão água em óleo (o/a). A imunogenicidade das formulações foi examinada após duas imunizações parenteral. Os soros foram analisados quanto a presença de anticorpos de específicos de antígenos, e para a distribuição de isotipos de anticorpo. As células do baço foram empregadas para avaliar respostas imune mediadas por células. Aquelas células foram testadas quanto a pre- sença de limfócitos citotóxicos T (CTL) e células linfoproliferativas (linfopro- liferação).

Tabela 1: Grupos de camundongos na experiência 1 Tabela 2: Grupos de camundongos na experiência 2 2. Formulação 2.1. Experiência 1 As formulações foram preparadas três dias antes de cada inje- ção. Quando necessário, RTS,S (10 μg) e go 120 (10 pg) foram absorvidos em 100 pg de AL(OH)3. Quando necessário, MPL (5 pg) foi adicionado e incubado 30 minutos antes da adição do tampão como uma mistura de 10 vezes de PBS concentrado pH 7,4 e H20 exceto para o grupo sem DQ para o qual o tampão foi P04, IMaC110/150 pH 6,8. Após 30 minutos, se necessá- rio, QS21 (5 pg) misturado com lipossomas em uma razão de peso QS21 /coIesteroI de 1/5 (referindo-se como DQ) foi adicionado à formulação Trinta minutos mais tarde, para as formulações com o oligo, 100 μ9 de CpG foi adicionado 30 minutos antes da adição de 50 pg/ml de tiomersal como preservativo.

Todas as incubações foram realizadas em temperatura ambi- ente com agitação. 2.2. Experiência 2 Processo de formulação: As formulações são realizadas simultaneamente por ambas inje- ções. O volume de injeção para um rato é 100 μΙ. Cinqüenta pg/ml de tio- mersal é adicionado como preservativo.

Grupo 1: RTS,S (10 pg) e gp 120 (10 μ9) são diluídos com H20 e PBS pH

6.8 para isotonicidade. Após 5 minutos, a formulação é absorvida em CpG 1856 (100 pg).

Grupo 2: RTS,S (10 pg) e gp 120 (10 pg) são diluídos com H20 e PBS pH 7,4 para isotonicidade. Após 30 minutos RTS,S e gp 120 são absorvidos em DQ (5 pg). Após 30 minutos de absorção, a formulação é absorvida em CpG 1856 (100 pg).

Grupo 3: RTS,S (10 pg) e gp 120 (10 pg) são diluídos com H20 e PBS pH 6.8 para isotonicidade. Após 5 minutos a formulação é absorvida em uma emulsão óleo/água. Após 5 minutos de absorção, a formulação é absorvida em QS21 (5 pg) antes da adição de CpG (100 pg). 3. Métodos imunolóaicos Nove camundongos F1(Balb/C x C57BI/6) por grupo recebe- ram nas patas traseiras 2 x 50 pl de vacina duas vezes em um intervalo de duas semanas. Duas semanas mais tarde os soros foram obtidos para ava- liar as respostas de anticorpos, e células do baço colhidas para determinar respostas imune mediadas por células.

Para análises de linfoproliferação, as células foram colhidas em quadruplicatas em placas de micro títulos de base circular de cavidade 96 em uma concentração de 2 x 106 por ml. As células foram cultivadas du- rante 72 ou 96 horas em RPMI-1640 com antibióticos glutamina e 1% (v/v) de soro de camundongo normal na presença de concentrações diferentes de RTS.S ou antígeno gp 120. As células de controle foram cultivadas sem antígeno. Então as células foram pulsadas durante a noite com 1 pICi/cavidade [3H]-timidina, colhidas e a radioatividade incorporada foi de- terminada em uma contadora beta. Os resultados são expressados como meios de contagem por minuto (com).

Para análises CTL as células foram cultivadas durante 7 dias em placas de 6 cavidades na presença de 10 pg por ml de peptídeo sintéti- co pCMI003 (IPQSLDSWWTSL) correspondendo a um epítopo de HbsAg CTL (Schirmbeck e outros, 1995) ou peptídeo pCMI007 (GIHIGPGRA- FYAARK) representando um epítopo gp 120 CTL (Casement e outros, 1995). No final do período de cultura as células efetoras foram avaliadas em duplicata para atividade citolítica específica de HbsAg em ensaios de libera- ção de [51Cr] padrão empregando células de controle e P815 s- transfectadas. A citotoxidade específica de Gp 120 foi determinada empre- gando-se células alvo P815 que foram deixadas sem tratamento ou pulsa- das durante 1 hora com peptídeo pCMI007. As liberações mínimas e máxi- mas foram determinadas com células alvo sem células efetoras e pela adi- ção de 3% (v/v) de Triton X-100, respectivamente. Os resultados são ex- pressados como % de liberação de [51 Cr] (cpm de cultura experimental - cpm de liberação espontânea / cpm de liberação máxima - cpm de liberação espontânea). A titulação e isotipagem de soros agrupados foram realizados em uma forma de ensaio de imunoabsorvente ligado por enzima padrão (ELISA) empregando placas revestidas com HbsAg. Os soros foram diluídos em PBS/BSA iniciando em 1:400. Os anticorpos secundários biotinilados específicos de Ig ou os isotipos IgGI, lgG2a e lgG2b seguido por um conju- gado de peroxidase de rábano-picante- estreptavidina foram empregados durante a detecção de anticorpos de ligação. Os títulos de ELISA foram cal- culados a partir de uma referência de SoftmaxPro e expressados em unida- des de ELISA (EU/ml). Os títulos de anticorpos específicos de Gp 120 foram determinados em um ELISA padrão empregando placas reyestidas com proteína gp 120. Os soros foram diluídos em PBS/Tween 20/BSA iniciando em 1:100. Os anticorpos secundários biotinilados específicos de Ig ou os isotipos IgGi, lgG2a e lgG2b seguidos por um conjugado de peroxidase de rábano-picante- estreptavidina foram empregados durante a detecção de anticorpos de ligação. Os títulos foram calculados em relação a um camun- dongo padrão Ig e expressos como μg/ml. 4. Resultados Experiência 1 As análises de respostas de linfoproliferação não mostraram qualquer diferença significante em reatividade a RTS,S entre os grupos. Ao contrário, os grupos 1 e 3 contendo igualmente, CpG e DQS21, mostraram respostas de limfoproliferação específica de gp 120 melhores do que os grupos contendo CpG ou DQS21 sozinho (Figura 6).

Nesta experiência somente CTL específico de HbsAg foram avaliados. Não houve nenhuma diferença pronunciada na indução de CTL entre os grupos 1 e 3 tendo recebido CpG e DQS21 em combinação e os grupos 2 e 4 imunizados com somente um dos dois componentes adjuvan- tes, ao mesmo tempo que a presença de AI(OH)3 diminuiu a atividade CTL observada para a combinação de CpG e DQS21 no grupo 1 (Figura 7). En- tretanto, estava presente uma tendência de que CpG e DQS21 fosse melhor do que DQS21 sozinho, e a combinação induziu mais CTL na presença de AI(OH3) do que CpG sozinho (Figura 7). A resposta imune humorada dos camundongos foi examinada somente para a presença de anticorpos específicos de HbsAg. Os títulos foram similares em todos os grupos exceto para o grupo 3, o qual mostrou um aumento de aproximadamente três vezes, demonstrando que, na pre- sença de AI(OH3), a combinação de DQS21 e CpG é mais imunogênico do que CpG sozinho (Figura 8). A distribuição de isotipo foi similar para os gru- po 3 e 4 contendo AI(OH)3, ao mesmo tempo que na ausência de AI(OH)3 a combinação de CpG e DQS21 induziu um isotipo tipo THi padrão mais forte do que DQS21 sozinho (Figura 8).

Experiência 2 As respostas de limfoproliteração específica de RTS,S e gp 120 foram muito similares nesta experiência. Os dados indicam que a adi- ção de DQS21 (ou sozinho ou com uma emulsão óleo/água) realçou as res- postas de limfoproliferação para ambos antígenos (Figura 9). As respostas CTL foram avaliadas empregando-se igualmente, um HbsAg e um peptídeo de epítope gp 120 CTL. Em ambos casos, CTL poderia ser detectado após a imunização do grupo 1 com CpG sozinho (Figura 10). Entretanto, a adição de DGS21 resultou em um aumento considerável em CTL para ambos antí- genos (Figura 10). A presença de uma emulsão óleo/água ou neutralizou o efeito positivo de DGS21 (gp 120) ou aumentou o fundamento do ensaio in vitro (HbsAg).

As respostas de anticorpo para HbsAg e gp 120 aumentou pela adição de DQS21 ao adjuvante CpG (Figura 11 A). Um outro aumento foi observado quando uma emulsão óleo/água foi incluída na formulação (Figura 11 A). A adição de DGS21 à CpG transferiu os perfis de isotipo gp120 em direção a um Tm bias mais pronunciado, ao mesmo tempo que o impacto nos perfis de isotipo HbsAg foi menos pronunciado nesta experiên- cia. 5. Conclusões A imunização com RTS,S e gp 120 formulada com a combina- ção de CpG e DOS21 resultou em respostas imune específica de antígeno forte. A combinação dos componentes CpG e DGS21 - realça as respostas de linfoproliferação - aumenta a atividade de CTL - aumenta títulos de anticorpos e isotipos Tm padrão quando comparados aos componentes simples. EXEMPLO 5: Potencial terapêutico de formulações CpG e/ou DGS21 no modelo de tumor TCI 1. Plano da Experiência Guatro grupos de 10 camundongos C57bl/6 receberam 10e6 (200 μΙ) de células TC1 (células de tumor expressando E7) subcutânea no dia 0 no flanco.

Os camundongos foram em seguida vacinados duas vezes no dia 14 e 21 após o desafio de tumor, com 5 pg de PD1/3E7 HPV 16 formu- lado injetado dentro da almofada do pé. O desenvolvimento de tumor foi avaliado individualmente duaz vezes em uma semana.

Grupo de camundongos: 1. Nenhuma vacina 2. PD1/3E7 + CPG (10 pg ODN 2006) 3. PD1/3E7 + DQS21 (0,5 pg) 4. PD1/3E7 + CPG + DQS21 O desenvolvimento de tumor foi monitorado avaliando-se tu- mores individuais, duas vezes em uma semana. 2. Formulações As formulações foram realizadas nos dias das injeções. O vo- lume de injeção para um camundongo foi 100 μΙ. Quando necessário, PD1/3E7 (5 μg) foi diluído com H20 e PBS pH 7,4 para isotonicidade. Após 5 minutos, se necessário, QS21 (0,5 pg) misturado com lipossomas em uma razão de peso QS21 /colesterol de 1/5 (referindo-se como DQ) foi adiciona- do à formulação. 30 minutos mais tarde, à formulação com o oligo, 10 pg de CpG (ODN 2006) foi adicionado 30 minutos antes da adição de 1 pg/ml de tiomersal como preservativo. 3. Resultados A evolução do desenvolvimento de tumor médio por grupos de 10 animais em tempo prolongado é mostrado na Figura 12. 100% dos ani- mais que receberam um desafio de tumor de células 10e6 TC1 progressi- vamente desenvolveram o crescimento de tumor. De 70 a 80% dos animais não vacinados ou dos animais vacinados com proteína E7 em DQS21 mor- reram durante o dia 35.

Duas vacinações com a proteína E7 formulada em DQS21 não tiveram quase nenhum efeito no desenvolvimento do tumor. Ao contrário, 2 vacinações, IFP (dia 14,21) com 5 μg de ProtD 1/3 E7 HPVJ6 em adluvante CPG induziram a regressão destes tumores pré-estabelecidos e protegeram camundongos da morte: 70 a 80% dos camundongos estavam ainda vivos no dia 35. A combinação dos 2 imuno-estimulantes CPG e DQS21 exibiu um ligeiro efeito benéfico sobre o CpG usado sozinho.

Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas de que trata a Resolução INPI 228 de 11/11/2009: Outras Informações: - Nome do Arquivo: p112871 8912353_1.TXT - Data de Geração do Código: 05-10-2010 - Hora de Geração do Código: 15:22:36 - Código de Controle: - Campo 1:44C8412C2D0B103E

- Campo 2:42B905689B3D4A3B

Claims (9)

1. Composição adjuvante, caracterizada pelo fato de que com- preende uma saponina e um oligonucleotídeo imunoestimulador, em que a saponina está na forma de um ISCOM, ou um lipossomo formulado com co- lesterol e lipídeo, ou uma emulsão óleo em água, e em que o oligonucleotí- deo imunoestimulador contém pelo menos duas repetições CG não metila- das sendo separadas por pelo menos 3 nucleotídeos.

2. Composição adjuvante de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizada pelo fato de que o dito oligonucleotídeo imunoestimulador com- preende uma sequência Purina, Purina, C, G, pirimidina, pirimidina.

3. Composição adjuvante de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizada pelo fato de que o oligonucleotídeo imunoestimulador é selecio- nado a partir do grupo que consiste em: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (SEQ ID NO: 1); TCT CCC AGC GTG CGC CAT (SEQ ID NO: 2); ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG (SEQ ID NO: 3) TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (SEQ ID NO:4); TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (SEQ ID NO: 5).

4. Composição adjuvante de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizada pelo fato de que o oligonucleotídeo imunoestimulador contém pelo menos duas repetições CG não metiladas sendo separadas por pelo menos 6 nucleotídeos.

5. Composição adjuvante de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a saponina é derivada de quilA.

6. Composição adjuvante de acordo com a reivindicação 5, ca- racterizada pelo fato de que o quilA é derivado de QS21.

7. Composição adjuvante de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizada pelo fato de que compreende uma saponina e um oligonucleotí- deo imunoestimulador contendo um dinucleotídeo CpG não metilado, em que a saponina está na forma de um lipossomo.

8. Composição adjuvante de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizada pelo fato de que compreende uma saponina e um oligonucleotí- deo imunoestimulador contendo um dinucleotídeo CpG não metilado, em que a saponina está na forma de uma emulsão óleo em água.

9. Uso da composição adjuvante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma vacina para a profilaxia e tratamento de infecções virais, bacteria- nas, parasíticas, alergia, câncer ou outro distúrbio crônico.