CN103596586A - 免疫原性组合物及使用所述组合物诱导体液和细胞免疫反应的方法 - Google Patents

免疫原性组合物及使用所述组合物诱导体液和细胞免疫反应的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于诱导受试者的免疫反应的改进的双重免疫策略的组合物和方法，所述免疫反应包括体液免疫反应和细胞免疫反应(均为CD4和CD8T淋巴细胞免疫反应)，从而提供了针对一种或多种抗原的完全适应性免疫反应。所述方法因而用于治疗和/或预防(即，减小发生的可能性或风险)不同疾病、障碍和病况例如癌症和感染性疾病，针对所述疾病的体液免疫反应和细胞免疫反应的诱导是非常期望的和有益的。

Description

免疫原性组合物及使用所述组合物诱导体液和细胞免疫反应的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2011年4月8日提交的美国临时申请No.61/473,660的优先权，将所述美国临时申请通过引用整体并入本申请。
关于序列表的声明
以文本格式代替纸质拷贝提供与本申请相关的序列表，该序列表据此通过引用并入说明书中。包括序列表的文本文件的名称为46441A_SeqListing.txt。该文本文件为163,840字节，创建于2012年4月6日，并且通过EFS-Web以电子形式提交。
技术领域
本公开内容总体上涉及通过用至少两种组合物免疫受试者以诱导对针免疫原的体液和细胞免疫反应来增强针对免疫原的特异性免疫反应的方法。
背景技术
宿主的免疫系统提供了用于快速和特异性增强针对病原性微生物的保护反应以及还用于促成恶性肿瘤的排斥的方法。免疫反应通常已被描述为包括体液反应，其中对于抗原是特异性的抗体由分化的B淋巴细胞产生，和细胞介导的反应，其中各种类型的T淋巴细胞通过各种机制消除抗原。例如，能够识别特异性抗原的CD4(也称为CD4+)辅助T细胞可通过释放可溶性介质例如细胞因子以招募免疫系统的额外细胞参与免疫反应来作出反应。CD8(也称为CD8+)细胞毒性T细胞还能够识别特异性抗原并且可结合和破坏或损伤具有抗原的细胞或颗粒。具体地，包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的细胞介导的免疫反应对于消除肿瘤细胞和被微生物例如病毒、细菌或寄生虫感染的细胞可以是特别重要的。
癌症包括广泛的疾病并影响世界上约1/4的个体。CTL反应是有效癌症疫苗的主要特征；有效CD4T细胞的帮助也可能在生产性CD8T细胞活化中起着关键作用，从而提供临床益处。基于自体树突细胞(DC)的疫苗Sipuleucel-T
Figure BDA0000432175190000021
最近被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于治疗转移性、去势抗性前列腺癌，尽管与该治疗相关的存活益处是适中的4.1个月，因此存在对改良的明显需要(参见，例如，Kantoff等人，New Engl.J.Med.363(5):411(2010))。基于痘病毒载体的疫苗
Figure BDA0000432175190000022
VF还在II期显示显著的存活益处(参见，例如，Kantoff等人，J.Clin.Oncol.28(7):1099(2010))。活性免疫疗法例如Sipuleucel-T和
Figure BDA0000432175190000023
VF通常比包括目前去势抗性疾病的护理标准的化学治疗方案更好地被耐受(参见，例如，Petrylak等人，N.Engl.J.Med.351(15):1513(2004)；Sylwester等人，J.Exp.Med.202(5):673(2005))。这些临床成功表明免疫反应可被用于癌症背景以提供改善的患者结果和延长的生存期。
关于微生物感染，疟疾、疟疾、结核病、HIV-AIDS和其它病毒感染例如单纯疱疹病毒(HSV)感染(全球生殖器溃疡的首要原因)继续导致全球健康问题。HSV-2流行率以令人担忧的速度在全球日益增加(参见，例如，Corey等人，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.35:435(2004))。在美国，总体HSV-2血清流行率超过20%，在发展中国家HSV-2血清流行率估计为30%至50%。除了在成人中存在HSV-2感染的巨大负担外，新生儿HSV-2感染的发病率也日益增加。即使当得到治疗时，来自HSV-2感染的新生儿脑炎具有大于15%的死亡率，在HSV-2感染的婴儿当中另有30至50%的存活病例患有神经疾病。与HSV-2流行性相伴随的是HSV-2感染显著增加了HIV-1获得和传播的风险的完全实现。来自非洲的数据显示HSV-2感染可使HIV传播的风险增至多达7倍并且多至一半的新获得的HIV病例由HSV-2感染直接引起(参见，例如，Abu-Raddad等人，PLoS ONE3(5):e2230(2008))。总体上，HIV获得的相对风险使HSV-2-感染的个体增加2倍以上。
尽管广泛地使用药物干预，但在成人和小儿群体中HSV-2的流行率继续日益增加。在感染早期以高剂量给予的抗病毒药疗法可减少HSV传播，但这阻止不了潜伏感染(参见，例如，Corey等人，Sex Transm.Dis.12:215(1985))。在最近的研究中，尽管进行了早期干预，但利用伐昔洛韦的连续抑制施用使HSV的传播减少低于50%(参见，例如，Corey等人，N.Engl.J.Med.350:11(2004))。针对抗病毒药物的替代药物例如局部杀微生物剂在临床上未得到证实。由于这些原因，许多主要权威相信接种疫苗是减小HSV-2疾病的健康影响所必需的。
存在对抗感染性疾病微生物例如人免疫缺陷病毒(HIV)和单纯疱疹病毒、疟疾、抗生素抗性细菌的疫苗(包括改进的疫苗)的需要，对于所述感染性疾病微生物，诱导强劲的体液和/或细胞介导的反应对于成功地预防和治疗感染是非常重要的。此外，存在对改善的癌症疫苗效力的相当大的潜能和需要。
发明内容
概述
本申请中提供的是免疫原性组合物、这类免疫原性组合物的制剂以及使用所述制剂和组合物诱导对于一种或多种免疫原及相关抗原是特异性的免疫反应的方法。在一个实施方案中，提供了用于诱导受试者的免疫反应的方法，所述方法包括(a)给受试者施用至少一个剂量的包含至少第一免疫原的第一免疫原性组合物，其中至少一种抗原能够诱导对于第一指定抗原是特异性的免疫反应；和(b)给受试者施用至少一个剂量的包含含有编码第一免疫原的核苷酸序列的重组表达载体的第二免疫原性组合物，从而诱导对于第一指定抗原是特异性的免疫反应。在具体实施方案中，(i)第一免疫原性组合物还包含佐剂；(ii)第二组合物还包含佐剂；或(iii)第一组合物和第二组合物的每一种还包含佐剂。在某些实施方案中，在施用第一免疫原性组合物后施用第二免疫原性组合物。在其它某些实施方案中，在施用第一免疫原性组合物之前施用第二免疫原性组合物。在其它某些实施方案中，同时施用第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物。在具体实施方案中，施用至少两个剂量的第一免疫原性组合物或施用至少两个剂量的第二免疫原性组合物。在其它实施方案中，施用(a)2个剂量；(b)3个剂量；(c)4个剂量或(d)5个剂量的第一免疫原性组合物。在另一个实施方案中，当施用两个或更多个剂量时，(a)在施用第二免疫原性组合物之前施用每一个剂量的第一免疫原性组合物；(b)在施用第二免疫原性组合物施用至少一个剂量的第一免疫原性组合物；(c)在施用第二免疫原性组合物的同时施用至少一个剂量的第一免疫原性组合物；(d)在施用第二免疫原性组合物之前施用至少一个剂量的第一免疫原性组合物，并且在施用第二免疫原性组合物之后施用任何剩下剂量的每一个剂量的第一免疫原性组合物；或(e)同时施用每一个剂量的第一组合物与第二组合物。关于这些方法和实施方案的每一个，由第一免疫原诱导的免疫反应包括对于第一指定抗原是特异性的CD4T细胞免疫反应，在某些实施方案中，由第一免疫原诱导的免疫反应包括对于第一指定抗原是特异性的CD8T细胞免疫反应；以及在其它某些实施方案中，由第一免疫原诱导的免疫反应包括对于第一指定抗原是特异性的CD4T细胞免疫反应和CD8T细胞免疫反应。
在上文和本申请中描述的方法的某些实施方案中，第一免疫原性组合物还包含第二免疫原，重组表达载体还包含编码第二免疫原的核苷酸序列，其中第二免疫原诱导对于第二指定抗原是特异性的免疫反应。在某些具体实施方案中，第一指定抗原与第二指定抗原是相同的。在其它某些具体实施方案中，第一指定抗原和第二指定抗原是不同的。在上文和本申请中描述的方法的某些其它实施方案中，重组表达载体还包含编码能够诱导对于第二指定抗原是特异性的免疫反应的第二免疫原的核苷酸序列。在某些具体实施方案中，第一指定抗原和第二指定抗原是相同的。在其它某些具体实施方案中，第一指定抗原和第二指定抗原是不同的。在关于此类方法的具体实施方案中，由第一免疫原诱导的免疫反应包括对于第一指定抗原是特异性的CD4T细胞反应。在关于此类方法的具体实施方案中，由第二免疫原诱导的免疫反应包括对于第二指定抗原是特异性的CD8T细胞反应。
在上文和本申请中描述的具体实施方案并且当一种或多种免疫原性组合物包含佐剂时，佐剂是无毒性脂质A相关佐剂。在某些具体实施方案中，无毒性脂质A相关佐剂是吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)；在更具体实施方案中，在稳定的水包油乳液中配制GLA。
在上文和本申请中描述的方法的其它实施方案中，第一指定抗原是(a)肿瘤相关抗原或(b)来自选自病毒、细菌、真菌和寄生虫的感染性微生物。在更具体实施方案中，第一指定抗原是选自肾细胞癌抗原、前列腺癌抗原、间皮瘤(mesothelioma)抗原、胰腺癌抗原、黑色素瘤抗原、乳腺癌抗原、肺癌抗原和卵巢癌抗原的肿瘤相关抗原。在更具体实施方案中，前列腺癌抗原是前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、NKX3.1或前列腺特异性膜抗原。在其它具体实施方案中，第一指定抗原来自病毒。在更具体实施方案中，病毒是单纯疱疹病毒-2(HSV-2)。在某些具体实施方案中，第一指定抗原是HSV-2UL19多肽或HSV-2gD多肽。
在上文和本申请中描述的方法的其它具体实施方案中，当诱导对于第一指定和第二指定抗原是特异性的免疫反应时，第一指定抗原和第二指定抗原的每一种是肿瘤相关抗原。在更具体的实施方案中，第一指定抗原和第二指定抗原的每一种选自肾细胞癌抗原、前列腺癌抗原、间皮瘤(mesothelioma)抗原、胰腺癌抗原、黑色素瘤抗原、乳腺癌抗原、肺癌抗原和卵巢癌抗原。在更具体的实施方案中，第一指定抗原和第二指定抗原的每一种是选自前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、NKX3.1或前列腺特异性膜抗原的前列腺癌抗原。在其它具体实施方案中，第一指定抗原和第二指定抗原的每一种是来自选自病毒、细菌、真菌和寄生虫的感染性微生物的抗原。在更具体实施方案中，感染性疾病生物是病毒，其在更具体的实施方案中是单纯疱疹病毒-2(HSV-2)。在某些实施方案中，第一指定抗原和第二指定抗原的至少一种是HSV-2UL19多肽，并且第一指定抗原和第二指定抗原的其它抗原是HSV-2gD多肽。
在上文和本申请中描述的方法的其它具体实施方案中，重组表达载体选自慢病毒载体基因组、痘病毒载体基因组、痘苗病毒载体基因组、腺病毒载体基因组、腺病毒相关病毒载体基因组、疱疹病毒载体基因组和α病毒载体基因组。在具体实施方案中，重组表达载体被整合进入载体颗粒，其在某些具体实施方案中将重组表达载体递送至抗原呈递细胞。在具体实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞。在具体实施方案中，载体颗粒是包含慢病毒载体基因组的慢病毒载体颗粒；包含痘病毒载体基因组的痘病毒载体颗粒；包含痘苗病毒载体基因组的痘苗病毒载体颗粒；包含腺病毒载体基因组的腺病毒载体颗粒；包含腺病毒相关病毒载体基因组的腺病毒相关病毒载体颗粒；包含疱疹病毒载体基因组的疱疹病毒载体颗粒；或包含α病毒载体基因组的α病毒载体颗粒。在更具体实施方案中，载体颗粒是包含慢病毒载体基因组的慢病毒载体颗粒。在更具体实施方案中，慢病毒载体颗粒还包括包含辛德比斯病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白包含相较于SEQ ID NO:1具有至少一个氨基酸变化的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的残基160不存在或为除谷氨酸外的氨基酸，并且其中E2糖蛋白不是包含辛德比斯病毒E3蛋白的融合蛋白的部分。在更具体的实施方案中，E2糖蛋白结合树突细胞特异性细胞内粘附分子-3-捕捉非整联蛋白(DC-SIGN)。
在本申请一个实施方案中还提供了制剂，在一个实施方案中，所述制剂包含(a)含有至少一种能够诱导对于第一指定抗原是特异性的免疫反应的第一免疫原的第一免疫原性组合物；和(b)包含含有编码第一免疫原的核苷酸序列的重组表达载体的第二免疫原性组合物。在具体实施方案中，由第一免疫原诱导的特异性免疫反应包括对于第一指定抗原是特异性的CD4T细胞反应。在另一个具体实施方案中，由第一免疫原诱导的特异性免疫反应包括对于第一指定抗原是特异性的CD8T细胞反应。在其它具体实施方案中，由第一免疫原诱导的免疫反应包括对于第一指定抗原是特异性的CD4T细胞免疫反应和CD8T细胞免疫反应。在上文和本申请中描述的制剂的另一个实施方案中，这类制剂被提供来用于诱导抗具有(a)第一指定抗原的肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞反应。在其它具体实施方案中，上文和本申请中描述的制剂被提供来用于诱导抗具有第一指定抗原的感染性疾病微生物的细胞毒性T淋巴细胞反应。在其它具体实施方案中，上文和本申请中描述的制剂被提供来用于减少包含多个具有肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的肿瘤的发生或复发的可能性。在另一个实施方案中，这类制剂被提供来用于预防或治疗由感染性微生物引起的感染。
提供了制剂的另外的实施方案，其中第一免疫原性组合物还包括第二免疫原，并且其中重组表达载体还包括编码第二免疫原的核苷酸序列，其中第二免疫原诱导对于第二指定抗原是特异性的免疫反应。在一个具体实施方案中，第一指定抗原和第二指定抗原是相同的。在另一个具体实施方案中，第一指定抗原和第二指定抗原是不同的。在上文和本申请中描述的制剂的其它具体实施方案中，重组表达载体还包括编码能够诱导对于第二指定抗原是特异性的免疫反应的第二免疫原的核苷酸序列。在某些具体实施方案中，第一指定抗原和第二指定抗原是相同的，在其它具体实施方案中，第一指定抗原和第二指定抗原是不同的。在这些实施方案中，由第一免疫原诱导的免疫反应包括对于第一指定抗原是特异性的CD4T细胞反应。同样地，关于制剂的这些实施方案，由第二免疫原诱导的免疫反应包括对于第二指定抗原是特异性的CD8T细胞反应。
关于上文和本申请中提供的制剂的实施方案，(a)第一免疫原性组合物还包含佐剂，(b)第二免疫原性组合物还包含佐剂；或(c)第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物各自还包含佐剂。在更具体的实施方案中，佐剂是无毒性脂质A相关佐剂。在更具体的实施方案中，佐剂是无毒性脂质A相关佐剂。在更具体的实施方案中，无毒性脂质A相关佐剂是吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)，在具体实施方案中，在稳定的水包油乳液中配制所述佐剂。
关于上文和本申请中提供的制剂的实施方案，第一指定抗原是(a)肿瘤相关抗原或(b)来自选自病毒、细菌、真菌和寄生虫的感染性微生物。在具体实施方案中，第一指定抗原是选自肾细胞癌抗原、前列腺癌抗原、间皮瘤抗原、胰腺癌抗原、黑色素瘤抗原、乳腺癌抗原、肺癌抗原和卵巢癌抗原的肿瘤相关抗原。在更具体实施方案中，前列腺癌抗原是前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、NKX3.1或前列腺特异性膜抗原。在其它具体实施方案中，第一指定抗原来自病毒。在更具体实施方案中，病毒是单纯疱疹病毒-2(HSV-2)。在另一个具体实施方案中，第一指定抗原是HSV-2UL19多肽或HSV-2gD多肽。
在上文和本申请中描述的制剂的其它实施方案中，当由制剂诱导的免疫反应包括对于第一指定抗原和第二指定抗原是特异性的免疫反应，第一指定抗原和第二指定抗原的每一种是肿瘤相关抗原。在更具体实施方案中，第一指定抗原和第二指定抗原的每一种选自肾细胞癌抗原、前列腺癌抗原、间皮瘤抗原、胰腺癌抗原、黑色素瘤抗原、乳腺癌抗原、肺癌抗原和卵巢癌抗原。在又一个更具体实施方案中，第一指定抗原和第二指定抗原的每一种是选自前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、NKX3.1和前列腺特异性膜抗原的前列腺癌抗原。在其它具体实施方案中，第一指定抗原和第二指定抗原的每一种是来自选自病毒、细菌、真菌和寄生虫的感染性微生物的抗原。在一个具体实施方案中，感染性疾病生物是病毒。在具体实施方案中，病毒是单纯疱疹病毒-2(HSV-2)。在另一个具体实施方案中，第一指定抗原和第二指定抗原的至少一种是HSV-2UL19多肽并且第一指定抗原和第二指定抗原的另一种是HSV-2gD多肽。
在上文和本申请中描述的制剂的其它实施方案中，重组表达载体选自慢病毒载体基因组、痘病毒载体基因组、痘苗病毒载体基因组、腺病毒载体基因组、腺病毒相关病毒载体基因组、疱疹病毒载体基因组和α病毒载体基因组。在一个具体实施方案中，重组表达载体被整合进入载体颗粒。在另一个具体实施方案中，载体颗粒能够将重组表达载体递送至抗原呈递细胞。在更具体的实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞。在其它具体实施方案中，载体颗粒是包含慢病毒载体基因组的慢病毒载体颗粒；包含痘病毒载体基因组的痘病毒载体颗粒；包含痘苗病毒载体基因组的痘苗病毒载体颗粒；包含腺病毒载体基因组的腺病毒载体颗粒；包含腺病毒相关病毒载体基因组的腺病毒相关病毒载体颗粒；包含疱疹病毒载体基因组的疱疹病毒载体颗粒；或包含α病毒载体基因组的α病毒载体颗粒。在更具体实施方案中，载体颗粒是包含慢病毒载体基因组的慢病毒载体颗粒。在更具体实施方案中，慢病毒载体颗粒还包含含有辛德比斯病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白包含相较于SEQ ID NO:1具有至少一个氨基酸变化的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的残基160不存在或为除谷氨酸外的氨基酸，并且其中E2糖蛋白不是包含辛德比斯病毒E3蛋白的融合蛋白的部分。在更具体的实施方案中，E2糖蛋白结合树突细胞特异性细胞内粘附分子-3-捕捉非整联蛋白(DC-SIGN)。
在上文和本申请中描述的制剂的另一个实施方案中，这类制剂被提供来用于诱导抗具有(a)第一指定抗原；(b)第二指定抗原；或(c)第一指定抗原和第二指定抗原的肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞反应。在其它具体实施方案中，上文和本申请中描述的制剂被提供用于诱导抗具有(a)第一指定抗原；(b)第二指定抗原；或(c)第一指定抗原和第二指定抗原的细胞毒性T淋巴细胞反应。在其它具体实施方案中，上文和本申请中描述的制剂被提供来用于减少包含多个具有肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的肿瘤的发生或复发的可能性。在另一个实施方案中，这类制剂被提供来用于预防或治疗由感染性微生物引起的感染。
如本申请中所用，术语“分离的”意指从其原始环境(例如，如果其是天然存在的，则是天然环境)取出的材料。例如，存在于活的动物中的天然存在的核酸或多肽不是分离的，但与一些或全部存在于天然系统中的共存材料分离的相同核酸或多肽是分离的。这样的核酸可以是载体的部分。可以为载体的部分的核酸可以仍然是分离的，因为核酸不是核酸的天然环境的部分。分离的多肽或蛋白质或其片段可以是组合物的组分，并且仍然是分离的，因为组合物不是多肽的天然环境的部分。术语“基因”意指参与产生多肽链的DNA的区段；基因包括在编码区之前和之后的区域“前导序列和非转录尾区”以及单个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。氨基酸可在本申请中按照单字母和三字母代码提及，所述代码在本领域中是共有的教科书知识，从而为本领域技术人员所熟知。本申请中所用的术语“融合多肽”还可与“融合蛋白”互换使用，并且除非明确地另有所指，否则两个术语无意表示具有可区别的性质或特征的分子。
如本申请中和所附权利要求中所用，除非上下文中明确地另有所指，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”以及“该(the)”包括复数形式。因此，例如，提及“一个/一种抗原”包括多个/多种此类抗原，提及“一个/一种细胞”或“该细胞(the cell)”包括提及一个/一种或多个/多种细胞及对于本领域技术人员来说是已知的其等同物(例如，多个/多种细胞)等等。类似地，除非明确地另有所指，否则提及“一个/和一种化合物(a compound)”和“一个/一种组合物(acomposition)”包括多个/多种此类化合物或组合物，和分别提及一个/一种或多个/多种化合物或组合物。当描述或声明方法的步骤，并且步骤被描述为以特定的顺序发生时，如果改写以声明：第二步骤在第一步骤“之后”进行(或执行)，则在第二步骤“之前”(即，在……前)进行(或执行)第一步骤的描述具有相同的含义。当提及数字或数值域时，术语“约”意指提及的数字或数值域是实验变异性内(或统计实验误差内)的近似值，从而数字或数值域可在1%与15%的所述数字或数值域之间变化。术语“包含”(和相关术语例如“含有”或“拥有”或“具有”或“包括”)无意排除在其它某些实施方案中，例如，本申请中描述的物质、组合物、方法或过程等的任意组合成的实施方案可由所述特征“组成”或“基本由所述特征组成”。
附图说明
图1描述了对于HSV-2UL19蛋白是特异性的CD4免疫反应。通过初免/加强免疫方案(d0初免/d21加强)免疫利用与5μg于稳定的水包油乳液中配制的吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)(GLA-SE)、稳定的水包油乳液(SE)或PBS(无)组合的5ug重组HSV-2UL19免疫成组的5只小鼠。在利用含有UL19T细胞表位的肽离体再刺激后测量脾CD4T细胞反应。IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平通过细胞内细胞因子染色(ICS)，随后进行荧光激活细胞分选(FACS)来进行测定。描述了每一组的细胞因子阳性CD4T细胞的百分比。
图2举例说明针对HSV-2UL19蛋白的免疫反应。GLA-SE-佐剂化的rUL19蛋白(重组蛋白(rProtein)+GLA/SE)或利用编码HSV-2多肽UL19(Lentivector)的慢病毒载体(DC-NILV)(Immune Design Corporation,Seattle,WA)免疫成组的5只小鼠。测试抗体滴度(右)，通过ICS分析脾UL19-特异性CD4和CD8T细胞的IFN-γ和TNF-α的产量(左)。加框的区域中的数字表示为IFN-γ+和TNF-α+的CD4或CD8细胞的百分比。
图3描述了在利用编码卵白蛋白(LV)的DC-NILV初次免疫，随后利用PBS、单独的GLA/SE、与SE组合的重组卵白蛋白(rP+SE)或GLA-SE-佐剂化的卵白蛋白(rP+GLA/SE)加强的小鼠中诱导的免疫反应。在加强免疫后4天从动物分离脾细胞。通过ICS分析脾卵白蛋白特异性CD8T细胞的IFN-γ和TNF-α的产量。每一个象限中的数字代表为IFN-γ+和TNF-α+的CD8细胞的百分比。
图4A和4B举例说明利用用GLA-SE配制的重组HSV-2UL19蛋白免疫的和利用编码UL19的DC-NILV免疫的动物的免疫反应。利用GLA-SE-佐剂化的rUL19蛋白(rP+GLA/SE)或PBS免疫成组的5只C57BL/6小鼠，利用GLA-SE-佐剂化的rUL19蛋白或含有编码UL19(LV)的多核苷酸的DC-NILV进行加强。在加强免疫后10天从动物分离脾细胞。在利用单次含CD4或CD8UL19表位的15聚体肽进行离体刺激后，通过ICS分析脾UL19-特异性CD4和CD8T细胞的IFN-γ、TNF-α和IL-2的产量。图4A(左)描述了每组一只代表性小鼠的细胞因子产量。图4A的右侧举例说明通过两种不同的CD8UL19表位的每一种刺激的细胞因子阳性CD8T细胞的百分比。图4B显示在来自每一个免疫的组的动物中测量的总IgG。GLA-SE佐剂化的rUL19蛋白在图4B中以“rP”表示。BLD：低于检测的水平。
图5A和5B描述了用利用佐剂GLA/SE配制的重组蛋白免疫的，随后利用佐剂化的重组蛋白和编码所述蛋白质的慢病毒载体加强的动物的免疫反应。利用GLA-SE-佐剂化的rUL19蛋白(rP+GLA/SE)或PBS免疫成组的5只C57BL/6小鼠，利用GLA-SE-佐剂化的rUL19蛋白(rP+GLA/SE)和含有编码UL19(LV)的多核苷酸的DC-NILV进行加强。在加强免疫后10天从动物分离脾细胞。在利用单次含有CD4或CD8UL19表位的15聚体肽离体刺激后，通过ICS分析脾UL19特异性CD4和CD8T细胞的IFN-γ、TNF-α和IL-2的产量。图5A(左)描述了每组一只代表性小鼠的细胞因子产量。图5A的右侧举例说明了利用两种不同的CD4UL19表位的每一种刺激的细胞因子阳性CD4T细胞的百分比和利用两种不同的CD8UL19表位的每一种刺激的细胞因子阳性CD8T细胞的百分比。
在加强后5天和加强后10天从动物获得血清，检测特异性IgG抗体。图5B显示了在来自每一个免疫的组的动物中测量的总IgG。GLA-SE佐剂化的rUL19蛋白在图5B中由“rP”表示。从左至右，4个数据集代表接受(1)PBS(初免组合物，1°)，随后利用GLA-SE佐剂化的rUL19蛋白和编码UL19(rP+LV)的DC-NILV(加强组合物，2°)(在加强后5天获得的血清)免疫的；(2)PBS(初免组合物，1°)，随后利用rP+LV(加强组合物，2°)(在加强后10天获得的血清)免疫的；(3)GLA-SE佐剂化的rUL19蛋白(rP)(初免组合物，1°)，随后利用rP+LV(加强组合物，2°)(加强后5天获得的血清)免疫的；(4)rP(初免组合物，1°)，随后用rP+LV(加强组合物，2°)(加强后10天获得的血清)免疫的动物的IgG滴度。
图6举例说明可使用本申请中描述的用于诱导特异性CD4T细胞反应、特异性CD8T细胞反应和特异性抗体反应的免疫原性组合物进行应用的几个示例性免疫方案。免疫原：目标重组或分离多肽；编码免疫原的载体；含有编码目标多肽的多核苷酸的重组表达载体。
图7显示DC-NILV产生强劲的Gag–特异性CD8T细胞反应。
图8显示GLA是在利用SIV-Gag重组蛋白免疫后产生强劲的Th1CD4T细胞所需的。
图9显示利用SIV-Gag重组蛋白+GLA-SE和表达SIV-Gag的DC-NILV的异源性初免、加强、加强接种产生CD8和CD4抗原特异性T细胞反应。
图10显示由异源性接种产生的CD8和TH1CD4T细胞反应可利用rSIV-Gag+GLA-SE来进行加强。
图11举例说明由DC-NILV产生CD8T细胞反应可利用合成的长肽+GLA-SE来进行加强。显示了SIV-Gag的氨基酸289-333(GPKEPFQSYVDRFYKSLRAEQTDAAVKNWMTQTLLIQNANPDCKL；SEQ ID NO：42)。
具体实施方式
针对疾病和病况例如感染性疾病的接种包括其中利用一种组合物(初免组合物)免疫受试者，随后利用不同的组合物(加强组合物)加强受试者的免疫的策略。然而，迄今为止双重接种策略不足以同时诱导CD4和CD8T细胞反应以及提供充足的抗许多疾病和病况的保护作用的体液免疫。
本申请中提供的是用于诱导受试者的免疫反应的改进的双重免疫策略的组合物和方法，所述免疫反应包括体液免疫反应和细胞免疫反应(均为CD4和CD8T淋巴细胞免疫反应)，从而提供针对一种或多种抗原的完全适应性免疫反应。因此，本申请中描述的组合物可被开发和配制为疫苗。描述的方法因而用于治疗和预防(即，以生物学、临床和/或统计上显著的方式减少发生或复发的可能性或风险)不同的疾病、障碍和病况例如癌症和感染性疾病，针对所述疾病的体液免疫反应和细胞免疫反应的诱导改善临床结果或是最佳益处所必需的。
本申请中提供了同时或以任一顺序相继地给有此需要的受试者施用的两种不同的免疫原性组合物。免疫原性组合物的至少一种诱导针对免疫原的特异性体液(即，抗体反应)和/或特异性CD4T细胞反应(其可包括记忆CD4T细胞反应)，并且免疫原性组合物的至少一种诱导特异性CD8T细胞反应，其可包括对于免疫原是特异性的细胞毒性T细胞(CTL)反应。在某些实施方案中，两种免疫原性组合物之一对于诱导特异性体液和/或特异性CD4T细胞反应是更有效，并且两种免疫原性组合物的另一种对于诱导特异性CD8T细胞反应可以是更有效的。
一种免疫原性组合物包含至少一种能够诱导对于指定的目标抗原是特异性的免疫反应的免疫原。该免疫原性组合物还可包括佐剂，所述佐剂增强对于免疫原和指定抗原是特异性的免疫反应，或可以是诱导所述免疫反应所需的。第二免疫原性组合物包含含有编码免疫原的核苷酸序列的重组表达载体。重组表达载体还包含至少一个有效地连接至编码免疫原的核苷酸的调控序列，从而重组表达载体能够指导免疫原的表达。在某些具体实施方案中，将重组表达载体整合进入载体颗粒(例如，病毒载体颗粒)。如本申请中进一步描述的，免疫原可以是指定抗原的免疫原性片段或可以是全长指定抗原(或其免疫原性变体)，或包含一个或多个免疫原性片段或包含全长指定抗原(或其免疫原性变体)的融合蛋白。
因此，术语“免疫原”在本申请中的任何用途是指整个组的多肽，所述多肽是：(a)全长抗原，(2)抗原的免疫原性片段，(3)全长抗原的免疫原性变体或免疫原性片段，(4)包含不同多肽的部分的其嵌合融合物以及(5)其缀合物。因此，“免疫原”表示包含(i)第一指定抗原，(ii)其免疫原性片段或(iii)能够诱导对于第一指定抗原是特异性的免疫反应的其变体的任一种的多肽。
例如，此类免疫原性变体在抗原的至少10个连续氨基酸上保持至少90%的氨基酸同一性，或在抗原(例如，包膜蛋白或肿瘤相关抗原)的至少15个连续氨基酸上保持至少85%的氨基酸同一性。作为另一个实例，此类免疫原性片段包含抗原的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、48或50个连续氨基酸。其它实例包括在抗原的至少50个连续氨基酸上，或在抗原的至少100个连续氨基酸上至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
应当理解，在本申请中的方法中，当提及包含免疫原的第一免疫原性组合物和包含编码“免疫原”的核苷酸序列的第二免疫原性组合物时，第二免疫原性组合物的编码的免疫原多肽不必具有与第一免疫原性组合物的多肽免疫原相同的氨基酸序列。因此，本申请中描述的方法和组合物涉及第一免疫原性组合物包含抗原(包膜蛋白或肿瘤相关抗原)的至少一个、二个、三个或更多个小片段，以及第二免疫原性组合物包含编码全长抗原或其更大的片段的核苷酸序列，或反之亦然。例如，第一多肽是在长度上具有约50个或更少的氨基酸的抗原的小免疫原性片段，并且第二多肽是全长抗原或在长度上具有约50个或更多的氨基酸的其更大的片段，所述片段任选地与全长抗原具有至少80%、85%、90%或95%的同一性。
在本申请中提供的其它具体实施方案中，将第二免疫原包含在任一免疫原性组合物中。第二免疫原能够诱导针对指定抗原的免疫反应，所述指定抗原可与第一免疫原诱导针对其的特异性免疫反应的指定抗原相同或不同。在另一个具体实施方案中，第一免疫原诱导特异性CD4T细胞免疫反应并且还可诱导特异性抗体反应，第二免疫原诱导至少CD8T细胞免疫反应。某些具体实施方案中，待免疫的受试者期望仅通过用重组表达载体表达第二免疫原来利用第二免疫原进行免疫。因此，包含第一免疫原(以及还可包含佐剂)的免疫原性组合物不存在第二免疫原，重组表达载体包含编码第一免疫原和编码第二免疫原的核苷酸序列。
本申请中描述的免疫原性组合物和方法可用于预防或治疗感染性疾病，特别地对于其未获得满意的疫苗或感染后治疗的感染性疾病(例如，病毒感染例如HIV和HSV-2，以及寄生虫感染例如疟疾)。在其它实施方案中，本申请中描述的免疫原性组合物和方法可用于治疗和/或减少癌症和恶性肿瘤发生的可能性。
在下文中详细地描述了免疫原性组合物、包含免疫原性组合物的制剂以及使用制剂和组合物的方法的各种实施方案。
免疫原性组合物
当用于协调免疫策略时，本申请中描述的不同免疫原性组合物用于诱导特异性的适应性免疫反应。一种免疫原性组合物包含至少一种免疫原，并且还可包含生理上适当的(即，药学上可接受的或适当的)佐剂。该第一免疫原性组合物中包含的免疫原通常是分离的免疫原，所述免疫原可从其天然环境分离或可重组地产生。为了容易参考，存在于第一免疫原性组合物中的免疫原在本申请中称为分离的/重组的免疫原。第二不同的组合物包含含有编码免疫原的核苷酸序列的重组表达载体。第二免疫原性组合物还可进一步包含佐剂。如果第一组合物和第二组合物包含佐剂，则每一种组合物中包含的佐剂可以相同或不同。
给受试者施用两种不同的组合物可诱导针对至少一种免疫原和针对各自目标抗原(在本申请中也称为指定抗原)的特异性免疫反应。特异性免疫反应包括特异性体液免疫反应(即，特异性抗体反应)和特异性细胞免疫反应(包括CD4T细胞反应和CD8T细胞反应)，每一种对于免疫原是特异性的并因而对于指定的目标抗原是特异性的反应。本申请中提及的免疫原性制剂包括这两种免疫原性组合物，所述组合物在本申请中为方便起见可称为第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物。因此，在一个实施方案中，免疫原性制剂包含(a)至少一种包含至少一种能够引发对于指定抗原是特异性的免疫反应的免疫原性组合物；和(b)至少一种包含含有编码至少一种免疫原的核苷酸序列的重组表达载体的第二免疫原性组合物。可将制剂的免疫原性组合物同时或以任一顺序相继地施用至受试者以诱导对于免疫原和对于各自的指定抗原是特异性的免疫反应。用于组合物的免疫原性组合物的每一种更详细地描述于本申请中。
每一种免疫原性组合物还可包含至少一种生理上(或药学上)可接受的或适当的赋形剂。本领域技术人员已知的用于药物组合物的任何生理上或药学上适当的赋形剂或载体(即，不干扰活性成分的活性的无毒性材料)可用于本申请中描述的免疫原性组合物。示例性赋形剂包括维持蛋白质的稳定性和完整性的稀释剂和载体。用于治疗剂的赋形剂是公知的，并且描述于例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro,第21版，Mack Pub.Co.,Easton,PA(2005))，和更详细地描述于本申请中。
免疫原可与指定抗原相同，即，免疫原包含指定抗原的示例性全长氨基酸序列，或可包括与示例性全长指定抗原共有高度百分比同一性并且保持指定抗原的功能特征，例如诱导特定免疫反应的能力的其变体。或者，免疫原可以是指定抗原的免疫原性片段。作为指定抗原的变体或片段的免疫原显示以统计上、临床上和/或生物学上显著的方式诱导受试者的免疫反应(例如，体液反应(即，B细胞反应)或细胞介导的反应(即，T细胞反应(包括细胞毒性T淋巴细胞反应))或体液和细胞介导的反应的能力。指定的目标抗原以及其指定抗原的免疫原性片段和免疫原性变体更详细地描述于本申请中。
关于包含至少一种分离的/重组的免疫原的免疫原性组合物，免疫原可以是已按照分子生物学和蛋白质分离领域中常规实施的方法在宿主细胞中重组地产生，随后从宿主细胞分离或从宿主细胞培养物分离(即，从其原始宿主细胞环境取出)的多肽或肽。当按照本申请中和本领域中描述的并且本领域技术人员熟悉的方法重组产生免疫原时，免疫原可称为重组免疫原。或者，免疫原可从天然来源例如病毒、细菌、寄生虫、真菌或肿瘤细胞分离或取出。用于从天然来源分离一种或多种免疫原和抗原的方法描述于本领域中，并且还可由本领域技术人员使用本领域中常规实施的方法和技术来容易地凭经验进行测定。
如本申请中所述，包含在第二免疫原性组合物的重组表达载体包含编码至少一种免疫原的核苷酸序列(在本申请中也称为多肽序列)。重组表达载体还包含至少一个有效地连接至编码核苷酸序列的调控序列，以便载体能够指导免疫原的表达。通过重组表达载体编码和表达的免疫原可与指定抗原相同，即，免疫原包含指定抗原的示例性全长氨基酸序列，或可包括与示例性全长指定抗原共有高百分比的同一性并且保持指定抗原的功能性特征，例如诱导特定免疫反应的能力的其变体。或者，编码的免疫原可以是指定抗原的免疫原性片段。为指定抗原的变体或片段的免疫原显示以统计学上、临床上和/或生物学上显著的方式诱导受试者的免疫反应(例如，体液反应(即，B细胞反应)或细胞介导的反应(即，T细胞反应(包括细胞毒性T淋巴细胞反应))或体液和细胞介导的反应的能力。指定的目标抗原以及指定抗原的免疫原性片段和免疫原性变体更详细地描述于本申请中。
在某些实施方案中，将重组表达载体整合进入载体颗粒(例如，病毒载体颗粒或细胞颗粒)。以使得颗粒能够被引入(即，递送至)靶细胞的方式构建包含载体的重组表达载体或载体颗粒。在某些实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞。在更具体的实施方案中，靶细胞是专职抗原呈递细胞例如树突细胞。随后在靶细胞中表达免疫原，免疫原或其片段呈现于抗原呈递细胞的表面上，并且诱导对于免疫原是特异性(从而对于各自指定抗原是特异性)的免疫反应。
在其它实施方案中，包含至少一种分离的/重组的免疫原(并且其还可包含佐剂)的免疫原性组合物还可包含至少一种另外的免疫原(即，至少2、3、4、5或更多种免疫原，其可被重述为2、3、4、5或更多种免疫原))。在某些实施方案中，免疫原性组合物可包含两种或更多种分离的/重组的免疫原(即，至少两种免疫原)，从而形成多价免疫原性组合物。在当将两种或更多种免疫原与佐剂组合的情况下，免疫原性组合物可包含单独地用佐剂配制的每一种免疫原，随后将佐剂化的免疫原组合以形成免疫原性组合物。或者，将两种或更多种免疫原与佐剂一起配制。在某些具体实施方案中，另外的免疫原(例如，第二、第三等免疫原)的每一种可诱导针对与第一免疫原相同的指定抗原的免疫反应。在其它具体实施方案中，另外的免疫原(例如，第二、第三等免疫原)的每一种可分别诱导对于不同的(例如，第二、第三等)指定抗原是特异性的免疫反应。
在某些替代性实施方案中，多价免疫原性组合物可包含细胞裂解物、细胞器或包括至少两种免疫原的细胞上清液。例如，从它们的原始环境取出的免疫原，例如从微生物获得的免疫原可与微生物部分地分离，以便两种或更多种免疫原存在于免疫原性组合物中。类似地，从肿瘤细胞获得的免疫原可与肿瘤细胞部分地分离，以便两种或更多种肿瘤相关抗原存在于免疫原性组合物中。
关于包含重组表达载体的免疫原性组合物，核苷酸序列可编码超过一种免疫原，例如至少2、3、4、5或更多种免疫原(即，2、3、4、5或更多种免疫原)。在某些具体实施方案中，额外免疫原(例如，第二、第三等免疫原)的每一种可诱导针对与第一免疫原相同的指定抗原的免疫反应。在其它具体实施方案中，另外的免疫原(例如，第二、第三等免疫原)的每一种可分别诱导对于不同的(例如，第二、第三等)指定抗原是特异性的免疫反应。
在具体实施方案中，包含至少一种分离的/重组的免疫原的一种免疫原性组合物(也称为第一免疫原性组合物)(并且所述组合物还可包含佐剂)能够诱导对于免疫原是特异性，从而对于指定抗原是特异性的CD4T细胞反应，以及还可诱导针对免疫原和指定抗原的体液反应(即，特异性抗体反应或抗原-特异性抗体反应)。包含含有编码免疫原的核苷酸序列的重组表达载体的其它免疫原性组合物(或第二免疫原性组合物)能够诱导对于免疫原是特异性的CD8T细胞反应，从而能够诱导对于指定抗原是特异性的CD8T细胞反应。如在本申请中更详细地描述的，免疫原具有一个或多个包含能够诱导对于免疫原是特异性的CD4T细胞反应和CD8T细胞反应的表位的免疫原性区域。
在其它具体实施方案中，提供了免疫原性制剂，其中包含至少一种分离的/重组的免疫原(为方便起见称为第一免疫原)的第一免疫原性组合物还可包含至少一种另外的分离的/重组的免疫原。在其它实施方案中，包含在第二不同的免疫原性组合物中的重组表达载体可编码第一免疫原和编码至少一种另外的免疫原。在其它可替代性实施方案中，第一免疫原性组合物包含至少两种分离的/重组的免疫原并且第二免疫原性组合物包含含有编码第一免疫原的核苷酸序列的表达载体和至少一种另外的免疫原。
在某些实施方案中，当期望引物对于两种或更多种免疫原是特异性的免疫反应时，至少一种免疫原能够诱导包括至少一种特定体液和/或CD4T细胞反应的免疫反应并且至少一种另外的免疫原能够诱导包括至少一种特异性CD8T细胞免疫反应的免疫反应。因此，在本申请的一个实施方案中提供了免疫原性制剂，其包含(a)含有第一分离的/重组的免疫原的免疫原性组合物(其可被称为第一免疫原性组合物)(所述组合物还可包含佐剂)和(b)包含编码和指导第一免疫原和第二免疫原的表达的重组表达载体的第二免疫原性组合物，其中至少第二免疫原能够诱导特异性CD8T细胞反应。在某些实施方案中，至少两种免疫原的每一种具有诱导针对相同指定抗原的免疫反应。或者，至少两种免疫原的每一种具有诱导对于不同抗原(为方便起见，也分别称为第一和第二指定抗原)是特异性的免疫反应的能力。
免疫原和指定抗原
用于本申请中描述的方法和用途的免疫原(其可以是包含在一种免疫原性组合物中的分离的和/或重组的免疫原和/或由包含在第二免疫原性组合物中的重组表达载体编码的)包括期望针对其诱导特定的免疫反应的任何免疫原。在某些实施方案中，免疫原包含指定的目标抗原的示例性全长氨基酸序列，或免疫原可以是各自的指定抗原的免疫原性片段。在其它某些实施方案中，免疫原可包括指定抗原的变体，所述变体与示例性全长指定抗原共有高百分比同一性并且显示与包含示例性氨基序列的指定抗原大体上相同水平的免疫原性(即，变体保持相较于示例性或野生型抗原的免疫原性达到统计学上、临床上和/或生物学上显著的程度的免疫原性的水平)。具体地，作为指定抗原的免疫原性片段或变体的免疫原以统计学上、临床上或生物学上显著的方式保持诱导受试者的体液免疫反应(即，B细胞反应导致特定抗体的表达)或细胞介导的反应(即，CD4T细胞反应和/或CD8T细胞反应，包括细胞毒性T淋巴细胞反应))或体液和细胞介导的反应的能力。指定的目标抗原及其免疫原性片段和免疫原性变体更详细地描述于本申请中。
如本申请中更详细描述的，免疫原包含至少一个能够诱导受试者的对于指定抗原是特异性的免疫反应的免疫原性区域或免疫原性表位。在一个具体实施方案中，免疫原包含一个或多个免疫原性区域以便免疫原能够诱导抗体反应、CD4T细胞反应和CD8T细胞反应的任一种或多种，其中每一个反应对于免疫原是特异性的，从而对于各自指定抗原是特异性的。因此，免疫原性区域包含至少一个诱导抗体反应、CD4T细胞反应和CD8T细胞反应的一种或多种的表位(即，一个或多个表位)。
细胞介导的免疫反应包括细胞毒性T淋巴细胞反应，所述反应可破坏或损害产生或表达免疫原或各自指定抗原的细胞(例如，肿瘤细胞、细菌细胞、病毒、寄生虫或真菌细胞)或感染性颗粒(例如，病毒颗粒)。与疾病或障碍相关的任何抗原(针对所述抗原的体液反应或细胞介导的免疫反应或两者对于免疫的受试者是有益的)可用作免疫原。
与许多疾病和障碍相关的抗原在本领域是公知的。目标抗原(即，指定抗原)先前可能已知与疾病或障碍相关，或可被本领域中已知和实施的任何方法鉴定为与疾病或障碍相关的抗原。例如，与患者所遭受的癌症类型相关的抗原可以是已知的，例如肿瘤相关抗原，或可通过本领域中实施的多种方法的任一种从肿瘤本身鉴定。在某些实施方案中，指定抗原是来源于癌细胞(例如，肿瘤细胞)的肿瘤相关抗原(在本申请中也称为肿瘤抗原)，一种或多种此类肿瘤抗原可用于癌症的免疫治疗性治疗。以非限定性实例为例，肿瘤相关抗原可来源于前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、间皮癌、卵巢癌或黑色素瘤癌。此类和另外的肿瘤相关抗原是如本申请中和本领域中所描述的。
在某些实施方案中，免疫原包括作为指定抗原和来源于肿瘤或恶性肿瘤的全长蛋白质。在其它某些实施方案中，免疫原包含一种或多种包含一个或多个来自此类蛋白质的表位的免疫原性片段。在其它实施方案中，免疫原包括包含全长指定抗原或包含来源于肿瘤细胞的指定抗原的1、2、3或更多个免疫原性片段的融合多肽。在其它实施方案中，当免疫原性组合物被制备用于诱导抗两种或更多种指定抗原的免疫反应时，融合多肽可包括两种或更多种指定抗原的每一种的全长抗原或其一个或多个免疫原性片段的任意组合。例如，融合多肽可包含获自一种肿瘤相关抗原的一个或多个免疫原性片段并且还可包含获得第二不同的肿瘤相关抗原的一个或多个免疫原性片段。除了免疫原性多肽或肽以外，融合蛋白还可包含至少一种多肽或肽，所述多肽或肽在免疫学领域有时称为载体蛋白，其增强对目标免疫原的免疫反应。
示例性肿瘤相关抗原或肿瘤细胞来源的抗原包括MAGE1,3和MAGE4(或其它MAGE抗原例如国际专利申请公布No.WO99/40188中公开的那些抗原)；PRAME；BAGE；RAGE,Lage(也称为NY ESO1)；SAGE；和HAGE(参见，例如，国际专利申请公布No.WO99/53061)或GAGE(Robbins等人，Curr.Opin.Immunol.8:628-36(1996)；Van den Eynde等人，Int.J.Clin.Lab.Res.27:81-86(1997)；Van den Eynde等人，Curr.Opin.Immunol.9:648-93(1997)；Correale等人，J.Natl.Cancer Inst.89：293(1997))。肿瘤抗原的这类非限定性实例在许多肿瘤类型例如黑色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌中表达。参见，例如，美国专利No.6,544,518。前列腺癌肿瘤相关抗原包括例如前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸盐、NKX3.1和前列腺的6跨膜上皮细胞抗原(STEAP)(Hubert等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9614523-28,1999)；也参见，例如，Reiter等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA95:1735-40,1998；Nelson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:3114-19(1999)；WO98/12302；美国专利No.5,955,306；5,840,871和5,786,148；国际专利申请公布No.WO98/20117；WO00/04149；WO98/137418)。
其它肿瘤相关抗原包括Plu-1(J.Biol.Chem.274:15633-45,1999)、HASH-1、HasH-2、Cripto(Salomon等人，Bioessays199,21:61-70；美国专利5,654,140)和Criptin(美国专利No.5,981,215)。此外，肿瘤抗原可以是用于治疗许多癌症的自身肽激素例如全长促性腺激素释放激素(GnRH,国际专利申请公布No.WO95/20600)、短的10个氨基酸长的肽。
肿瘤抗原包括来源于特征在于肿瘤相关抗原表达例如HER-2/neu表达的癌症的肿瘤抗原。目标肿瘤相关抗原包括谱系特异性肿瘤抗原例如黑色素细胞-黑素瘤谱系抗原MART-1/Melan-A、gp100、gp75、mda-7、酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白。说明性肿瘤相关抗原包括但不限于来源于如下抗原的任一种或多种或包含如下抗原的任一种或多种的肿瘤抗原：p53、Ras、c-Myc、细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶(例如，A-Raf、B-Raf和C-Raf、细胞周期蛋白质依赖激酶)、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、MART-1、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC2、磷酸肌醇酯3-激酶(PI3K)、TRK受体、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、Wilms’肿瘤抗原(WT1)、AFP、-连环蛋白/m、半胱天冬酶-8/m、CEA、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、BCR-ABL、干扰素调节因子4(IRF4)、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RAR、肿瘤相关钙信号转导蛋白1(TACSTD1)TACSTD2、受体酪氨酸激酶(例如，表皮生长因子受体(EGFR)(特别地，EGFRvIII)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR))、细胞质酪氨酸激酶(例如，src-家族、syk-ZAP70家族)、整联蛋白连接的激酶(ILK)、信号转导蛋白和转录激活子STAT3、STAT5和STAT6、缺氧诱导因子(例如，HIF-1.和HIF-2)、细胞核因子-κB(NF-B)、Notch受体(例如，Notch1-4)、c-Met、雷帕霉素的哺乳动物靶(mammalian targetsof rapamycin)(mTOR)、WNT、细胞外信号调节激酶(ERK)及其调节亚基、PMSA、PR-3、MDM2、间皮素、肾细胞癌–5T4、SM22-α、碳酸酐酶I(CAI)和IX(CAIX)(也称为G250)、STEAD、TEL/AML1、GD2、蛋白酶3、hTERT、肉瘤易位断裂点、EphA2、ML-IAP、EpCAM、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、多唾液酸、MYCN、RhoC、GD3、岩藻糖基GM1、间皮素(mesothelian)、PSCA、sLe、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、RGs5、SART3、STn、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE1、B7H3、legumain、TIE2、Page4、MAD-CT-1、FAP、MAD-CT-2、fos相关抗原1和独特型(idiotype)。
免疫原还包括包含表位区或表位肽的肿瘤抗原，所述表位区或表位肽来源于肿瘤细胞中突变的基因或来源于肿瘤细胞中相较于正常细胞以不同水平转录的基因例如端粒酶、存活素、间皮素、突变的ras、bcr/abl重排、Her2/neu、突变型或野生型p53、细胞色素P4501B1和异常表达的内含子序列例如N-乙酰葡糖氨基转移酶-V；在黑色素瘤和B细胞淋巴瘤中产生独特的独特型的免疫球蛋白的克隆性重排；包含来源于肿瘤病毒过程的表位区或表位肽的肿瘤抗原，例如人乳头状瘤病毒蛋白E6和E7；爱泼斯坦巴尔病毒蛋白LMP2；具有肿瘤选择性表达的非突变型癌胚胎蛋白质例如癌胚抗原和甲胎蛋白。也参见Boon等人，Ann.Rev.Immunol.12:337-65(1994)；Renkvist等人，Cancer Immunol.Immunother.50:3-15(2001)。
在其它实施方案中，免疫原分离自或来源于病原微生物或来自条件致病性微生物(在本申请中也称为感染性疾病微生物)，例如病毒、真菌、寄生虫和细菌。在某些实施方案中，来源于这样的微生物的免疫原包括为选择的指定抗原的全长蛋白质。在其它某些实施方案中，免疫原包括一种或多种包含一个或多个来自这样的蛋白质的表位的免疫原性片段。在其它实施方案中，免疫原包含含有来源于微生物的蛋白质的1、2或更多个免疫原性片段的融合多肽。在其它实施方案中，免疫原包括含有全长指定抗原或含有来源于微生物的指定抗原的1、2、3或更多个免疫原性片段的融合多肽。在其它实施方案中，当免疫原性组合物被制备用于诱导抗感染性疾病微生物的2或更多个指定抗原的免疫反应时，融合多肽可包含两种或更多种指定抗原的每一种的全长抗原或其一个或多个免疫原性片段的任意组合。例如，融合多肽可包含一个或多个获自一种微生物抗原(即，病毒、细菌、寄生虫或真菌抗原)的一个或多个免疫原性片段，并且还可包含获自第二不同的微生物抗原(即，第二不同的病毒、细菌、寄生虫或真菌抗原)的一个或多个免疫原性片段。除了免疫原性多肽或肽以外，融合蛋白还可包含至少一个有时在免疫学领域中称为载体蛋白的增强针对目标免疫原的免疫反应的多肽或肽。
其抗原预期为用于本申请中描述的免疫原性组合物的指定抗原和免疫原并且由本申请中描述的载体和载体颗粒编码的举例说明性病原微生物包括人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、A、B和C型流感病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、水疱性口炎病毒(VSV)、包括抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)(MRSA)的葡萄球菌属(Staphylococcus)物种和包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的链球菌属(Streptococcus)物种。如本领域技术人员可理解的，来源于这类和其它病原微生物的用作本申请中描述的免疫原的蛋白质在本领域是已知的并且此类蛋白质(及其种类)的氨基酸序列和编码所述蛋白质的核苷酸序列可在出版物和公共数据库例如GENBANK、Swiss-Prot和TrEMBL中得以鉴定。
可以为免疫原并且如本申请中所述使用的来源于人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原包括HIV病毒体结构蛋白(例如，gp120、gp41、p17、p24)、蛋白酶、逆转录酶或由tat、rev、nef、vif、vpr和vpu编码的HIV蛋白的任一种。HIV蛋白及其免疫原性片段对于本领域技术人员来说是公知的，并且可见于许多公共数据库的任何数据库(参见，例如，Vider-Shalit等人，AIDS23(11):1311-18(2009)；Watkins,Mem.Inst.Oswaldo Cruz.103(2):119-29(2008)；Gao等人，Expert Rev.Vaccines(4Suppl):S161-68(2004))。(也参见，例如，Klimstra等人，2003.J.Virol.77:12022-32；Bernard等人，Virology276:93-103(2000)；Byrnes等人，J.Virol.72：7349-56(1998)；Lieberman等人，AIDS Res Hum.Retroviruses13(5)：383-92(1997)；Menendez-Arias等人，Viral Immunol.11(4)：167-181(1998)。
预期用作本申请中描述的组合物的免疫原并且由本申请中描述的载体和载体颗粒编码的来源于单纯疱疹病毒的抗原(例如，HSV1和HSV2)包括但不限于从HSV晚期基因表达的蛋白质。后一组基因主要编码形成病毒体颗粒的蛋白质。此类蛋白质包括从其形成病毒衣壳的5种蛋白质(UL)：UL6、UL18、UL35、UL38和大衣壳蛋白UL19、UL45和UL27，其各自可用作本申请中描述的免疫原(参见，例如，McGeoch等人，Virus Res.117:90–104(2006)；Mettenleiter等人，Curr.Opin.Microbiol.9：423–29(2006))。其它预期在本申请中用作免疫原的举例说明性HSV蛋白包括ICP27(H1,H2)、糖蛋白B(gB)和糖蛋白D(gD)。HSV基因组包括至少74个基因，每一个基因编码可潜在地用作诱导T细胞反应(包括CTL反应)、B细胞反应或CTL反应和B细胞反应的免疫原的蛋白质。
人(参见，例如，Corey等人，“Genital Herpes,”Sexually Transmitted Diseases,Holmes等人，编(McGraw-Hill,New York,1999)285-312)和动物模型(参见，例如，Parr等人，J.Virol.72:2677(1998))中抗HSV-2的保护性免疫反应表明适当的HSV-2疫苗制剂是期望的和可获得的目标。在过去40年中，在美国和欧洲已进行了一系列使用失活的完整HSV制剂和利用佐剂配制的亚单位HSV蛋白的HSV疫苗人试验。虽然对于这类疫苗在一些短期研究中观察到适度的治疗效果，但来自具有更长的随访窗口的适当地受控试验的结果一直以来令人十分失望(参见，例如，Rajcani等人，Folia Microbiol.(Praha)51:67(2006))。
在欧洲，在1960年代和1970年代，利用甲醛灭活的HSV(Eli Lilly试验)或热灭活的HSV(Lupidon H试验)进行了大型临床试验。虽然报导了HSV复发的严重度和频率的改善，但仅有小亚组的这些试验采用安慰剂对照和双盲试验。此外，这类疫苗不赋予长期治疗效果。1980年代的母-胎HSV-2传播研究显示HSV-2血清阳性妇女的婴儿相对于近期获得HSV-2的妇女的婴儿具有更低的传播风险，这表明抗HSV-2糖蛋白gD和gB的中和抗体(nAb)可赋予保护作用(参见，例如，Koelle等人，Clin.Microbiol.Rev.16：96(2003))。在1990年代由美国的Glaxo-SmithKline和Chiron设计来产生抗此类HSV-2糖蛋白的nAb的试验测试了具有单独的gD或具有利用3种不同佐剂：明矾、MF-59(水包油)和单磷酰脂质A(MPL)配制的gB的重组亚单位疫苗。这类疫苗引发或加强血清阴性个体的HSV-2特异性nAb和HSV-1血清阳性个体的交叉反应性nAb(参见，例如，Burke,Rev.Infect.Dis.13Suppl11:S906-S911(1991))。然而，尽管达到目标水平的体液免疫原性，但此类疫苗在男人中未显示治疗效果并且在女人中仅显示短暂的疗效，这表明抗-HSV nAb是不足的并且成功的HSV疫苗将可能需要产生有效力的T细胞免疫(参见，例如，Corey等人，JAMA282：331(1999)；Stanberry等人，N.Engl.J.Med.347:1652(2002))。
先前进行的HSV疫苗试验表明nAb可能不足以保护人免受HSV-2感染，数据表明HSV-2特异性T细胞在减少病毒的获取、传播和再激活中起着至关重要的作用(参见，例如，Corey等人，JAMA(1999)，同上)。例如，在T细胞功能上具有缺陷的个体具有延长的更严重的HSV-2感染的发作，并且在HSV-2损伤的纵向活组织检查研究中，病毒清除与CD8T细胞的渗入相关(参见，例如，Koelle等人，J.Clin.Invest.101:1500(1998))。另外的HSV研究已显示：1型辅助T细胞(Th1)反应在动物模型中具有保护性(参见，例如，Koelle等人，J.Immunol.166:4049(2001)；Zhu等人，J.Exp.Med.204:595(2007))。HSV-2再活化的严重度和频率与HSV特异性T细胞的频度反相关，并且HSV-2特异性CTL至生殖器损伤的渗入与病毒清除相关(参见，例如，Koelle等人，J.Infect.Dis.169:956(1994)；Koelle等人，J.Clin.Invest.110:537(2002)；Koelle等人，J.Clin.Invest.(1998)，同上)。这些发现与来自牵涉粘膜HSV-2清除中CD8和Th1CD4T细胞反应的亚单位疫苗研究的数据一致(参见，例如，Posavad等人，Nat.Med.4:381(1998))。此外，在生殖器疱疹消退后在真皮表皮接合部长期检测到HSV-2-特异性CD8T细胞(参见，例如，Cattamanchi等人，Clin.VaccineImmunol.15:1638(2008))。
预期用于本申请中描述的现有免疫原性组合物和方法的某些实施方案中的来源于巨细胞病毒(CMV)的抗原包括CMV结构蛋白、在病毒复制的立即早期和早期中表达的病毒抗原、糖蛋白I和III、衣壳蛋白、外壳蛋白、低基质蛋白pp65(ppUL83)、p52(ppUL44)、E1和IE2(UL123和UL122)、来自来自UL128-UL150的基因簇的蛋白质产物(Rykman等人，J.Virol.2006Jan；80(2):710-22)、包膜糖蛋白B(gB)、gH、gN和pp150。如由本领域技术人员理解的，用作本申请中描述的免疫原的CMV蛋白可在公共数据库例如GenBank、Swiss-Prot和TrEMBL中被鉴定(参见例如，Bennekov等人，Mt.Sinai J.Med.71(2)：86–93(2004)；Loewendorf等人，J.Intern.Med.267(5):483-501(2010)；Marschall等人，Future Microbiol.4:731-42(2009))。
预期用于某些实施方案的来源于爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)的抗原包括EBV裂解蛋白gp350和gp110、在潜伏周期感染过程中产生的EBV蛋白(包括爱泼斯坦巴尔核抗原(EBNA)-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-前导蛋白(EBNA-LP)和潜伏膜蛋白(LMP)-1、LMP-2A和LMP-2B)(参见，例如，Lockey等人，Front.Biosci.13:5916–27(2008))。
预期用作本申请中描述的免疫原的来源于呼吸道合胞病毒(RSV)的抗原包括由RSV基因组编码的11种蛋白质的任一种或其免疫原性片段：NS1、NS2、N(核壳体蛋白)、M(基质蛋白)SH、G和F(病毒衣壳蛋白)、M2(第二基质蛋白)、M2-1(延伸因子)、M2-2(转录调节)、RNA聚合酶和磷蛋白P。
预期用作免疫原的来源于水疱性口炎病毒(VSV)的抗原包括由VSV基因组编码的5种主要蛋白质的任一种及其免疫原性片段：大蛋白质(L)、糖蛋白(G)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M)(参见，例如，Rieder等人，J.InterferonCytokine Res.(2009)(9):499-509；Roberts等人，Adv.Virus Res.(1999)53:301-19)。
预期用于某些实施方案的来源于流感病毒的抗原包括血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白M1和M2、NS1、NS2(NEP)、PA、PB1、PB1-F2以及PB2。参见例如，Nature437(7062)：1162–66。
作为病毒抗原的免疫原的实例还包括但不限于腺病毒多肽、甲病毒多肽、杯状病毒多肽(例如，杯状病毒衣壳抗原)、冠状病毒多肽、温热病病毒多肽、埃博拉病毒多肽、肠病毒多肽、黄病毒多肽、肝炎病毒(AE)多肽(乙型肝炎病毒核心或表面抗原、丙型肝炎病毒E1或E2糖蛋白、核心或非结构蛋白质)、疱疹病毒多肽(如本申请中论述的，包括单纯疱疹病毒或水痘带状疱疹病毒糖蛋白)、感染性腹膜炎病毒多肽、白血病病毒多肽、马尔堡病毒多肽、正粘病毒多肽、乳头状瘤病毒多肽、副流感病毒多肽(例如，血凝素和经氨酸酶多肽)、副粘病毒多肽、细小病毒多肽、瘟病毒多肽、微小RNA病毒多肽(例如，脊髓灰质炎病毒衣壳多肽)、痘病毒多肽(例如，痘苗病毒多肽)、狂犬病病毒多肽(例如，狂犬病病毒糖蛋白G)、里奥病毒多肽、逆转录病毒多肽和轮状病毒多肽。
在某些实施方案中，细胞抗原可被选择作为指定抗原，并且细菌抗原或其免疫原性片段或变体可用作免疫原。在某些实施方案中，目标细菌抗原可以是分泌的多肽。在其它某些实施方案中，可用作诱导免疫反应的免疫原的细菌抗原包括具有在细菌的外细胞表面上表达的多肽的一部分或多部分的抗原。在细胞表面上表达的多肽免疫苗原的部分对于宿主中的免疫细胞和/或抗体是可及的，因而可以是由重组表达载体编码的有用的免疫原，并且包含在含有本申请中描述的免疫原的免疫原性组合物(其还可包含佐剂)中。
预期用作免疫原的来源于葡萄球菌属物种(包括抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))的抗原包括毒性介质例如Agr系统、Sar和Sae、Arl系统、Sar同源物(Rot、MgrA、SarS、SarR、SarT、SarU、SarV、SarX、SarZ和TcaR)、Srr系统和TRAP。可用作免疫原的其它葡萄球菌属蛋白质包括Clp蛋白、HtrA、MsrR、顺乌头酸酶、CcpA、SvrA、Msa、CfvA和CfvB(参见，例如，葡萄球菌属：Molecular Genetics,2008Caister Academic Press,Ed.Jodi Lindsay)。金黄色葡萄球菌的两个物种(N315和Mu50)的基因组已进行了测序，并且是可以例如在PATRIC(PATRIC：The VBI PathoSystems Resource Integration Center,Snyder等人，Nucleic Acids Res.(2007)35：401-406)中公共获得的。如本领域技术人员可理解的，用作免疫原的葡萄球菌属蛋白质还可在其它公共数据库例如GenBank、Swiss-Prot和TrEMBL中被鉴定。
预期在本申请中描述的某些实施方案中用作免疫原的来源于肺炎链球菌的抗原包括肺炎球菌溶血素(pneumolysin)、PspA、胆碱结合蛋白A(CbpA)、NanA、NanB、SpnHL、PavA、LytA、Pht和菌毛蛋白(RrgA；RrgB；RrgC)。肺炎链球菌的免疫原性蛋白在本领域也是已知的并且预期用作免疫原(参见，例如，Zysk等人，Infect.Immun.200068(6):3740-43)。肺炎链球菌的强毒株的完整基因组序列已被测序(参见，例如，Tettelin H等人，Science(2001)293(5529):498-506)并且，如本领域技术人员所理解的，用于本申请中描述的组合物的肺炎链球菌(S.pneumoniae)蛋白还可在其它公共数据库例如GenBank、Swiss-Prot和TrEMBL中被鉴定。用于根据本公开内容的免疫原的特定目标蛋白质包括预测在肺炎双球菌的表面上表达的毒力因子(virulence factor)和蛋白质(参见，例如，Tettelin等人，同上；Frolet等人，BMC Microbiol.(2010)Jul12;10:190；Rigden等人，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.(2003)38(2):143-68；Jedrzejas,Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2001)65(2):187-207)。
可用作免疫原的细菌抗原的实例包括但不限于放线菌属(Actinomyces)多肽、芽孢杆菌属(Bacillus)多肽、拟杆菌属(Bacteroides)多肽、博德特菌属(Bordetella)多肽、巴尔通体属(Bartonella)多肽、疏螺旋体属(Borrelia)多肽(例如，博氏疏螺旋体(B.burgdorferi)OspA)、布鲁氏菌属(Brucella)多肽、弯曲杆菌属(Campylobacter)多肽、二氧化嗜纤维菌属(Capnocytophaga)多肽、衣原体属(Chlamydia)多肽、棒杆菌属(Corynebacterium)多肽、考克斯体属(Coxiella)多肽、嗜皮菌属(Dermatophilus)多肽、肠球菌属(Enterococcus)多肽、埃立克体属(Ehrlichia)多肽、埃希氏菌属(Escherichia)多肽、弗朗西斯氏菌属(Francisella)多肽、梭杆菌属(Fusobacterium)多肽、支原体属(Haemobartonella)多肽、嗜血菌属(Haemophilus)多肽(例如，乙型流感嗜血杆菌(H.influenzae type b)外膜蛋白)、螺杆菌属(Helicobacter)多肽、克雷伯氏菌属(Klebsiella)多肽、L型细菌(L-formbacteria)多肽、钩端螺旋体属(Leptospira)多肽、利斯特菌属(Listeria)多肽、分枝杆菌属(Mycobacteria)多肽、支原体属(Mycoplasma)多肽、奈瑟球菌属(Neisseria)多肽、新立克次体属(Neorickettsia)多肽、诺卡尔菌属(Nocardia)多肽、巴斯德氏菌属(Pasteurella)多肽、消化球菌属(Peptococcus)多肽、蛋白胨链球菌属(Peptostreptococcus)多肽、肺炎球菌多肽(即，肺炎链球菌(S.pneumonia)多肽)(参见本申请所述的)、变形杆菌属(Proteus)多肽、假单胞细菌属(Pseudomonas)多肽、立克次体属(Rickettsia)多肽、罗沙利马体属(Rochalimaea)多肽、沙门菌属(Salmonella)多肽、志贺菌属(Shigella)多肽、葡萄球菌属(Staphylococcus)多肽、A组链球菌属(group A streptococcus)多肽(例如，化脓性链球菌(S.pyogenes)M蛋白)、B组链球菌(group B streptococcus)(无乳链球菌(S.agalactiae))多肽、密螺旋体属(Treponema)多肽、和耶尔森氏菌属(Yersinia)多肽(例如，鼠疫耶尔森氏菌F1(Y.pestis F1)和V抗原(V antigens))。
可以为免疫原的真菌抗原的实例包括但不限于犁头霉属(Absidia)多肽、支顶孢属(Acremonium)多肽、链格孢属(Alternaria)多肽、曲霉菌属(Aspergillus)多肽、蛙粪霉菌属(Basidiobolus)多肽、双极霉属(Bipolaris)多肽、芽生菌属(Blastomyces)多肽、假丝酵母属(Candida)多肽、球孢子菌属(Coccidioides)多肽、耳霉属(Conidiobolus)多肽、隐球菌属(Cryptococcus)多肽、弯孢菌属(Curvalaria)多肽、表皮癣菌属(Epidermophyton)多肽、外小杯菌(Exophiala)多肽、地丝菌属(Geotrichum)多肽、组织胞浆菌属(Histoplasma)多肽、马杜拉分枝菌属(Madurella)多肽、马拉色霉菌属(Malassezia)多肽、小孢子菌属(Microsporum)多肽、小丛梗孢属(Moniliella)多肽、被孢霉菌(Mortierella)多肽、毛霉菌属(Mucor)多肽、拟青霉属(Paecilomyces)多肽、青霉属(Penicillium)多肽、单胞瓶霉属(Phialemonium)多肽、瓶霉菌属(Phialophora)多肽、原壁菌属(Prototheca)多肽、假霉样真菌属(Pseudallescheria)多肽、假小托菌属(Pseudomicrodochium)多肽、腐霉菌属(Pythium)多肽、鼻孢子菌属(Rhinosporidium)多肽、根霉菌属(Rhizopus)多肽、线状担子菌属(Scolecobasidium)多肽、孢子丝菌属(Sporothrix)多肽、匍柄霉属(Stemphylium)多肽、发癣菌属(Trichophyton)多肽、毛孢子菌属(Trichosporon)多肽和木丝霉属(Xylohypha)多肽。
原生动物寄生虫抗原的实例包括但不限于巴贝虫属(Babesia)多肽、肠袋虫属(Balantidium)多肽、贝诺孢子虫属(Besnoitia)多肽、隐孢子虫属(Cryptosporidium)多肽、艾美虫属(Eimeria)多肽、脑胞内原虫属(Encephalitozoon)多肽、内阿米巴属(Entamoeba)多肽、贾第虫属(Giardia)多肽、哈蒙德虫属(Hammondia)多肽、肝簇虫属(Hepatozoon)多肽、等孢子球虫属(Isospora)多肽、利什曼原虫属(Leishmania)多肽、微孢子虫(Microsporidia)多肽、新孢子虫属(Neospora)多肽、微粒子虫属(Nosema)多肽、五鞭毛滴虫属(Pentatrichomonas)多肽、疟原虫属(Plasmodium)多肽。蠕虫寄生虫抗原的实例包括但不限于棘唇线虫属(Acanthocheilonema)多肽、猫圆线虫属(Aelurostrongylus)多肽、钩虫属(Ancylostoma)多肽、管圆线虫属(Angiostrongylus)多肽、蛔虫属(Ascaris)多肽、布鲁丝虫属(Brugia)多肽、仰口线虫(Bunostomum)多肽、毛细线虫属(Capillaria)多肽、夏柏特线虫(Chabertia)多肽、古柏线虫属(Cooperia)多肽、环体线虫属(Crenosoma)多肽、网尾线虫属(Dictyocaulus)多肽、膨结线虫属(Dioctophyme)多肽、棘唇属(Dipetalonema)多肽、裂头属(Diphyllobothrium)多肽、犬复孔绦虫(Diplydium)多肽、恶丝虫属(Dirofilaria)多肽、龙线虫属(Dracunculus)多肽、蛲虫属(Enterobius)多肽、丝状虫属(Filaroides)多肽、血矛线虫属(Haemonchus)多肽、兔唇蛔线虫属(Lagochilascaris)多肽、罗阿丝虫属(Loa)多肽、曼森线虫属(Mansonella)多肽、缪勒线虫属(Muellerius)多肽、侏形吸虫属(Nanophyetus)多肽、板口线虫属(Necator)多肽、细颈线虫属(Nematodirus)多肽、结节线虫属(Oesophagostomum)多肽、盘尾丝虫属(Onchocerca)多肽、后睾属(Opisthorchis)多肽、胃线虫属(Ostertagia)多肽、副丝虫属(Parafilaria)多肽、并殖吸虫属(Paragonimus)多肽、副蛔属(Parascaris)多肽、泡翼属线虫(Physaloptera)多肽、原圆线虫属(Protostrongylus)多肽、腹腔丝虫属(Setaria)多肽、旋毛线虫属(Spirocerca)多肽、迭宫绦虫属(Spirometra)多肽、冠丝虫属(Stephanofilaria)多肽、类圆线虫属(Strongyloides)多肽、圆线虫属(Strongylus)多肽、吸吮线虫属(Thelazia)多肽、弓蛔线虫属(Toxascaris)多肽、弓蛔虫属(Toxocara)多肽、毛线虫属(Trichinella)多肽、毛圆线虫属(Trichostrongylus)多肽、鞭虫属(Trichuris)多肽、钩虫属(Uncinaria)多肽和吴策线虫属(Wuchereria)多肽(例如，恶性疟原虫环子孢子(P.falciparum circumsporozoite)(PfCSP))、子孢子表面蛋白2(PfSSP2)、肝状态抗原1的羧基末端(PfLSA1c-term)以及输出蛋白1(PfExp-1)、肺囊虫(Pneumocystis)多肽、肉孢子虫属(Sarcocystis)多肽、血吸虫属(Schistosoma)多肽、泰勒虫属(Theileria)多肽、弓形虫属(Toxoplasma)多肽和锥虫属(Trypanosoma)多肽。
外寄生虫抗原的实例包括但不限于来自如下外寄生虫的多肽(包括保护性抗原以及变应原)：蚤；蜱(ticks),包括硬蜱科(hard ticks)和软蜱科(soft ticks)；苍蝇，例如蚊(midges)、蚊子(mosquitoes)、白蛉子(sand flies)、黑蝇(black flies)、马蝇(horse flies)、角蝇(horn flies)、斑虻(deer flies)、采采蝇(tsetse flies)、螫蝇(stable flies)、引起蝇咀病的苍蝇(myiasis-causing flies)和蠓(biting gnats)；蚁(ants)；蜘蛛(spiders)、虱(lice)；螨(mites)；和椿象例如床虱(bed bugs)和猎蝽。
免疫反应包括体液反应(即，B细胞反应)或细胞介导的反应(包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应)或两者的诱导还可促成另外的生物例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、结核分枝杆菌属(Mycobacterium tuberculosis)、麻疯分枝杆菌(M.leprae)和无害利斯特菌(Listeria innocula)的吞噬或杀死。CTL免疫反应促成铜绿假单胞菌、结核分枝杆菌、麻疯分枝杆菌和无害利斯特菌的杀死(参见，例如，Oykhman等人，J.Biomed.Biotechnol.(2010：249482)；于2010年6月23日在线出版的)。因此，用于本申请中描述的免疫原性组合物并且由重组表达载体和包含所述载体的载体颗粒编码的免疫原还可来源于这类细菌。许多由细菌物种的任一种的细菌基因组编码的和由细菌表达的多肽的氨基酸序列可在本领域中和公共可获得的蛋白质序列数据库中被容易地鉴定。(也参见，例如，Stover等人，Nature406:959(2000))。
本申请中描述的免疫原可获自或来源于真菌或寄生虫。诱导免疫反应包括CTL免疫反应的示例性寄生虫包括曼森氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、溶组织阿米巴变形虫(Entameoba histolytica)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)和恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)(参见例如，Oykhman，同上)。因此，来源于或获自这类寄生虫的蛋白质抗原可用作诱导抗各自寄生虫的免疫反应的免疫原。免疫原还可获自或来源于真菌的物种，包括但不限于新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)和白色念珠菌(Candida albicans)(参见例如，Oykhman,同上)。
包含免疫原性多肽(例如，本申请中和/或本领域中描述的肿瘤相关抗原或微生物抗原的任一种)的至少一个免疫原性片段的多肽可用作免疫原并且由本申请中描述的重组表达载体编码。免疫原性片段包含至少一个T细胞表位或至少一个B细胞表位。免疫原性片段可由免疫原性多肽的至少6、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个连续氨基酸组成。免疫原性片段可包含上述连续氨基酸数目之间的任何数目的连续氨基酸，以便例如免疫原性片段为免疫原性多肽的约6-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100或更多个连续氨基酸。免疫原性片段可包含形成线性表位的充足数量的连续氨基酸和/或可包含允许片段以与片段所源自的全长多肽相同(或充分相似)的三维构象折叠(以提供非线性表位(在本领域也称为构象表位))的充足数量的连续氨基酸。用于评估免疫原性片段是否折叠成可与全长多肽相比较的构象的测定包括例如蛋白质与对于天然的或展开的表位是特异性的单克隆或多克隆抗体反应的能力、其它配体结合功能的保留以及多肽片段对利用蛋白酶的消化的敏感性或抗性(参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY(2001))。因此，例如，当特异性结合全长多肽的抗体对于片段的结合能力和结合水平与对于全长多肽的大体上相同(即，结合的水平保持与示例性或野生型全长抗原的免疫原性相比较达到在统计学上、临床上和/或生物学上充分的程度)时，多肽片段的三维构象与全长多肽充分相似。
目标多肽或其免疫原性片段的三维结构的测定可通过确定免疫原性片段是否保持如在全长多肽中发现的氨基酸的空间定位的常规方法来进行。参见，例如，Bradley等人，Science309:1868-71(2005)；Schueler-Furman等人，Science310:638(2005)；Dietz等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA103:1244(2006)；Dodson等人，Nature450:176(2007)；Qian等人，Nature450:259(2007)。还可在本领域中获得的是软件工具，例如PSORT或PSORT II和Spscan(Wisconsin SequenceAnalysis Package,Genetics Computer Group)，所述软件工具用于预测已知或据信横跨细胞膜的多肽的跨膜区段和膜拓扑学(参见，例如，Nakai等人，TrendsBiochem.Sci.24:34-36(1999))。
单独地，或与上述技术组合地，以及在给定指定的目标抗原的示例性氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可鉴定多肽抗原的潜在表位(参见，例如，Jameson和Wolf,Comput.Appl.Biosci.4:181-86(1988))。以另一个实例为例，Hopp和Woods描述了亲水性方法，所述方法基于多肽区域的亲水性与它们的抗原性之间的密切关系的经验实证(参见，例如，Hopp,Pept.Res.6:183-90(1993)；Hofmann等人，Biomed.Biochim.Acta46:855-66(1987))。计算机程序也可用于鉴定B细胞或T细胞表位。称为EPIPLOT的BASIC程序根据它们的一级结构，通过使用13个不同等级(scale)计算和标绘柔性、亲水性和抗原性特征谱来预测蛋白质中的B细胞抗原性位点(参见，例如，Menendez等人，Comput.Appl.Biosci.6:101-105(1990))，也参见，例如，Van Regenmortel,Methods：a companion to Methods in Enzymology,9：465-472(1996)；Pellequer等人，“Epitope predictions from the primary structure of proteins,”In Peptideantigens：a practical approach(编者G.B.Wisdom),第7-25页；Oxford UniversityPress,Oxford(1994)；Van Regenmortel,“Molecular dissection of protein antigens”In Structure of antigens(编者M.H.V.Van Regenmortel),第1卷,第1-27页.CRCPress,Boca Raton(1992)。
可用作免疫原的指定抗原的T细胞表位还可使用基于由Rammensee等人(Immunogenetics50：213-219(1999))；由Parker等人(同上)开发的算法的肽基序搜索程序，或通过使用方法例如由Doytchinova和Flower在Immunol.CellBiol.80(3):270-9(2002)；Blythe等人，Bioinformatics18:434-439(2002)；Guan等人，Applied Bioinformatics2:63-66(2003)；Flower等人，Applied Bioinformatics1:167-176(2002)；Mallios,Bioinformatics17：942-48(2001)；Schirle等人，J.Immunol.Meth.257:1-16(2001)中描述的那些方法来鉴定。
可在本申请中描述的组合物和方法中用作免疫原的指定微生物抗原或指定肿瘤抗原的表位区域也在本领域中进行了描述。参见例如，Lamb等人，Rev.Infect.Dis.Mar–Apr：Suppl2:s443–447(1989)；Lamb等人，EMBO J.6:1245-49(1987)；Lamb等人，Lepr.Rev.Suppl2:131-37(1986)；Mehra等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:7013-27(1986)；Horsfall等人，Immunol.Today12:211-13(1991)；Rothbard等人，Curr.Top.Microbiol.Immunol.155:143-52(1990)；Singh等人，Bioinformatics17:1236–37(2001)；DeGroot等人，Vaccine19:4385-95(2001)；DeLalla等人，J.Immunol.163:1725-29(1999)；Cochlovius等人，J.Immunol.165:4731-41(2000)；Consogno等人，Blood101:1039-44(2003)；Roberts等人，AIDS Res.Hum.Retrovir.12:593-610(1996)；Kwok等人，Trends Immunol.22:583-88(2001)；Novak等人，J.Immunol.166:6665-70(2001)。
用于鉴定表位区域的另外的方法包括Hoffmeister等人，Methods29:270-281(2003)；Maecker等人，J.Immunol.Methods255:27-40(2001)中描述的方法。用于鉴定表位的测定描述于本申请中并且对于本领域技术人员来说是已知的，包括例如Immunology,Coligan等人(编),John Wiley&Sons,New York,NY(1991)中的现有方案(Current Protocol)中描述的那些测定。
鉴定指定的目标抗原的免疫原性区域和/或表位还可由本领域技术人员凭经验和/或通过计算机分析和计算机建模，使用由本领域技术人员常规实施的方法和技术来容易地确定。经验方法包括例如合成包含特定长度的蛋白质的连续氨基酸的多肽片段，或通过使用一种或多种蛋白酶产生片段，随后使用本领域中常规实施的许多结合测定或免疫测定法的任一种来测定片段的免疫原性。用于测定抗体(多克隆抗体、单克隆抗体或其抗原结合片段)特异性结合片段的能力的示例性方法包括但不限于ELISA、放射免疫测定、免疫印迹、竞争性结合测定、荧光激活细胞分选仪分析(FACS)和表面等离子体共振。
T细胞和B细胞表位的序列可获自公共可获得的数据库。例如，包括T细胞确定的肿瘤抗原的肽数据库可在互联网上见于定期更新的由癌症免疫(Cancer Immunity)(参见cancerimmunity(dot)org/peptidedatabase/Tcellepitopes.htm)资助的肽数据中。另一个可获得的由国家过敏及传染病研究所(National Institute of Allergy andInfectious Disease)支持的数据库，其提供用于搜索B细胞和T细胞表位的工具和提供表位分析工具(参见immunoepitope(dot)org上的免疫表位数据库和分析源(Immune Epitope Database and Analysis Resource))。
在某些情况下，当抗原特异性T细胞或克隆是可获得的时，例如肿瘤-浸润淋巴细胞(TIL)、病毒特异性或细菌特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，可使用利用特定抗原制备的靶细胞将此类细胞用于筛选相关表位的存在。此类靶可使用随机肽文库或选择的合成肽文库来制备，所述靶可用于使靶细胞易于被CTL裂解。当T细胞系或克隆是可获得的时，鉴定相关表位的另一个方法将使用重组DNA法。首先制备来自对CTL易感的靶的基因或cDNA文库，随后将其转染进入非易感靶细胞。这允许鉴定和克隆编码包含CTL表位的肽的蛋白质前体的基因。本方法的第二步骤是从相关的克隆化基因制备截短的基因，以使缩小编码至少一个CTL表位的区域。如果基因不太大，该步骤是任选的。第三步骤是制备例如长度约10-20个氨基酸、重叠5-10个残基的合成肽，所述肽用于使靶对CTL敏感。当肽经显示包含相关表位时，需要时，可制备更小的肽来建立包含表位的具有最小尺寸的肽。这些表位通常(但不一定)包含在9-10个残基(对于CTL表位而言)和达到20或30个残基(对于辅助T淋巴细胞(HTL)表位而言)内。
或者，表位可通过肽的直接洗脱来确定，所述肽被特定主要组织相容性复合物(MHC)分子非特异性结合，随后对洗脱的肽进行氨基酸测序(参见，例如，Engelhard等人，Cancer J.2000May；6Suppl3:S272-80)。简而言之，使用纯化法例如HPLC分离洗脱的肽，测试单个级分的使靶易于被CTL裂解或诱导细胞因子在HTL中的分泌的增加的能力。当级分已被鉴定为包含肽时，将其经历进一步纯化和接受序列分析。肽序列还可使用串联质谱法来测定。随后利用CTL或HTL制备和测试合成肽以确证正确的序列和肽已被鉴定。
表位还可使用计算机分析例如Tsites程序(参见，例如，Rothbard和Taylor,EMBO J.7:93-100,1988；Deavin等人，Mol.Immunol.33:145-155,1996)来鉴定，所述计算机分析搜索具有引发Th反应的潜能的肽基序。具有适用于结合鼠和人I类或II类MHC的基序的CTL肽可按照BIMAS(Parker等人，J.Immunol.152:163,1994)和其它HLA肽结合预测分析来鉴定。简而言之，检查例如来自微生物组分或抗原或肿瘤细胞组分或肿瘤抗原的蛋白质序列的MHC结合基序的存在。对于每一个MHC等位基因存在的这类结合基序是通常在通常为9-10个残基长的MHC I类结合肽的位置2(或3)和9(或10)上的保守氨基酸残基。随后制备包含具有MHC结合基序的这类序列的合成肽，随后测试此类肽的结合MHC分子的能力。MHC结合测定可使用表达高数目的空(未被占据的)MHC分子的细胞(细胞结合测定)或使用纯化的MHC分子来进行。最后，随后在体外使用人淋巴细胞或在体内使用HLA转基因动物测试MHC结合肽诱导首次用于实验的个体的CTL反应的能力。使用肽致敏的靶细胞和天然加工抗原的靶例如病毒感染的细胞或肿瘤细胞测试这类CTL。为了进一步确认免疫原性，可使用HLA A2转基因小鼠模型和/或多种体外刺激测定的任一种来测试肽。
在某些实施方案中，免疫原包括指定抗原的肽物种，所述肽物种在本领域中为已知的并且可获得的各自免疫原的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸置换、插入或缺失。氨基酸的保守置换是公知的并且通常可天然地存在于多肽中，或当重组产生多肽时可被引入。氨基酸置换、缺失和添加可使用公知的和常规实施的诱变方法(参见，例如，Sambrook等人Molecular Cloning：ALaboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY2001))来引入多肽。寡核苷酸指导的定点(或区段专一性)诱变法可被用于提供具有按照期望的置换、缺失或插入改变的特定密码子的改变的多核苷酸。可用作免疫原的指定抗原的缺失或截断变体还可通过使用与期望的缺失相邻的方便的限制性内切核酸酶位点来构建。在限制性位点之后，可填充悬突，再连接DNA。或者，可使用随机诱变技术例如丙氨酸扫描诱变、易错聚合酶链式反应诱变和寡核苷酸指导的诱变来制备免疫原多肽变体(参见，例如，Sambrook等人，同上)。特定指定抗原的物种(或变体)(或其多肽片段)包括与本领域已知的示例性氨基酸序列的任一个具有至少85%、90%、95%或99%的氨基酸序列同一性的多肽免疫原。
这类多肽免疫原变体保持各自指定抗原的一个或多个生物活性或功能。具体地，作为指定抗原的变体的免疫原以统计上、临床上或生物学上显著的方式保持诱导受试者的免疫反应(例如，例如体液反应(即，B细胞反应)、细胞介导的反应(即，T细胞反应(包括细胞毒性T淋巴细胞反应))或体液和细胞介导的反应的能力。给定在本领域中常规实施的用于在多肽中引入突变、制备多肽片段、分离片段和变体以及分析所述片段和变体的许多分子生物学、蛋白质表达和蛋白质分离技术及方法，具有期望的生物活性的免疫原多肽变体和片段可被容易地制备而无需过多实验。
本领域技术人员已知的多种标准指明在肽或多肽的特定位点上被置换的氨基酸是否是保守的(或相似的)。例如，相似氨基酸或保守氨基酸置换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的置换。相似氨基酸可包括在下列分类中：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、组氨酸)；具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；具有β分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。被认为更难分类的脯氨酸与具有脂肪族侧链的氨基酸(例如，亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和丙氨酸)共有许多性质。在某些情况下，用谷氨酰胺替代谷氨酸或用天冬酰胺替代天冬氨酸的置换可被认为是相似置换，因为谷氨酰胺和天冬酰胺分别是谷氨酸和天冬氨酸的酰胺衍生物。如本领域中所理解的，两个多肽之间的“相似性”可通过将多肽的氨基酸序列和对于其的保守氨基酸置换与第二多肽的序列相比较(例如，使用GENEWORKS、Align、BLAST算法或本申请中描述的和本领域实施的其它算法)来进行测定。
如本申请中对于免疫原性片段所描述的，用于评估各个变体是否折叠成可与非变体多肽或片段相比较的构象的测定包括例如蛋白质与对于天然或展开的表位是特异性的单克隆或多克隆抗体反应的能力、配体结合功能的保留以及突变蛋白质对利用蛋白酶的消化的敏感性或抗性(参见Sambrook等人，同上)。此类变体可按照本申请中描述的方法或本领域内已知的其它方法来鉴定、表征和/或制备，所述方法由本领域技术人员常规地实施。
包含在本申请中描述的免疫原性组合物中的分离的/重组的免疫原可按照分子生物学和/或多肽纯化领域中常规实施的各种方法和技术来产生和制备。用于重组产生目标免疫原的表达载体的构建可使用本领域内已知的许多适当的分子生物学工程技术的任一种来实现，包括但不限于限制性内切核酸酶降解、连接、转化、脂质体纯化和DNA测序的标准技术，例如如Sambrook等人(1989和2001版；Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY)和Ausubel等人(Current Protocols in MolecularBiology(2003))中描述的。为了获得高效的转录和翻译，每一个重组表达构建体中的多核苷酸序列包括至少一个适当的表达控制序列(也称为调控序列)，例如有效地连接至编码免疫原的核苷酸序列的前导序列和特别地启动子序列。
通过重组技术，利用重组表达载体对宿主细胞进行遗传工程来产生免疫原、其片段或变体。可将本申请中描述的多肽和融合多肽的每一种在适当的启动子控制下于哺乳动物细胞、酵母、细菌、昆虫或其它细胞中表达。无细胞翻译系统还可被用于使用来源于DNA构建体的RNA来产生此类蛋白质。用于与原核和真核宿主一起使用的适当的克隆和表达载体例如由Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor,NewYork,(2001)进行描述。
一般而言，用于产生目标免疫原的重组表达载体包括复制起始点、允许转化宿主细胞的可选择标记(例如大肠杆菌(E.coli)的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母(S.cerevisiae)TRP1基因)和来源于高度表达的基因的启动子来指导下游结构序列的转录。启动子可来源于编码糖酵解酶例如3-磷酸甘油酸酯激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶或热激蛋白及其它的操纵子。将异源结构序列以适当的相位与翻译起始和终止序列装配在一起。
任选地，可将异源序列与编码免疫原的核苷酸序列框内插入，以提供赋予期望的特征(例如简化表达的重组产物)的纯化的肽或多肽。这样鉴定的肽包括多组氨酸标记(his标记)或
Figure BDA0000432175190000371
表位标记(DYKDDDDK,SEQ ID NO:35)、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、GST或XPRESSTM表位标记(DLYDDDDK,SEQ IDNO:41；Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)等(参见，例如，美国专利No.5,011,912；Hopp等人(Bio/Technology6:1204(1988))。亲和序列可由载体提供，例如在pBAD/His(Invitrogen)中提供的六组氨酸标记。或者，亲和序列可通过合成添加进入或工程化进入用于重组产生核酸编码序列的引物(例如，使用聚合酶链式反应)。
包含描述的重组表达构建体的宿主细胞可利用表达构建体(例如，克隆载体、穿梭载体或表达构建体)来遗传工程化(转导、转化或转染)。载体或构建体可以质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式存在。可将工程化宿主细胞培养在经改良适合于激活启动子、选择转化体或扩增编码核苷酸序列的常规营养培养基中。用于特定宿主细胞的培养条件例如温度、pH等的选择和维持对于本领域技术人员来说是显而易见的。优选地，可按照已建立的用于产生多肽的方法改造宿主细胞以使之适合于在培养中持续增殖来产生细胞系。在某些实施方案中，细胞系是永生化细胞系，其是指可在对数期生长后于培养中反复(至少10次，同时保持活力)传代的细胞系。
有用的细菌表达构建体可通过将表达载体以可操作的阅读相与适当的翻译起始和终止信号以及与功能性启动子一起插入编码期望的免疫原的结构DNA序列来构建。构建体可包括一个或多个表型可选择标记和复制起始点来确保载体构建体的维持以及，必要时，在宿主内提供扩增。用于转化的适当的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的不同种，尽管其它细菌也可用作选择的主题。可使用任何其它质粒或载体，只要它们是在宿主中是可复制的和有活力的。因此，例如，可将编码目标免疫原或指定抗原的核苷酸序列包含在多种用于表达多肽的重组表达构建体的任一种中。此类载体和构建体包括染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；来源于质粒与噬菌体DNA的组合的载体；病毒DNA，例如牛痘病毒、腺病毒、鸡痘病毒和假性狂犬病毒病毒。然而，任何其它载体可用于制备重组表达构建体，只要其在宿主中是可复制的和有活力的。
可利用多种方法将适当的DNA序列插入载体。一般而言，利用本领域已知的方法将DNA序列插入适当的限制性内切核酸酶位点。用于克隆、DNA分离、扩增和纯化、用于牵涉DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶促反应的标准技术以及各种分离技术是本领域技术人员已知和通常使用的那些技术。许多标准技术描述于例如Ausubel等人(Current Protocols inMolecular Biology(Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,2003))；Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第3版，(Cold SpringHarbor Laboratory2001))；Maniatis等人(Molecular Cloning，(Cold Spring HarborLaboratory1982))中，以及其它地方。
表达载体中编码多肽免疫原的DNA序列有效地连接至至少一个适当的表达控制序列(例如，启动子或调节启动子)以指导mRNA合成。此类表达控制序列的代表性实例包括LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp、噬菌体λPL启动子以及其它已知在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因的表达的启动子。启动子区域可选自任何期望的使用CAT(氯霉素转移酶)载体或具有可选择标记的其它载体的基因。具体的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T5、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核生物启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTR启动子和小鼠金属硫蛋白-I启动子。适当的载体和启动子的选择以及某些包含至少一个有效地连接至编码至少一个免疫原的核苷酸序列的启动子或调节启动子的重组表达构建体的制备完全在本领域技术人员的能力水平之内。
诱导型调节启动子和/或受密切调控的启动子的设计和检测在本领域是已知的并且将取决于具体的宿主细胞和表达系统(参见，例如，Guzman等人，J.Bacteriology177:4121-30(1995)；Smith等人，J.Biol.Chem.253:6931-33(1978)；Hirsh等人，Cell11:545-50(1977)中描述的大肠杆菌阿拉伯糖操纵子(Pbad或Para)；可从Stratagene(La Jolla,CA)获得的PET表达系统(参见美国专利No.4.952,496)；受tet调控的表达系统(Gossen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-51(1992)；Gossen等人，Science268:1766-69(1995))；pLP-TRE2受体载体(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)被设计来与CLONTECH’sCreatorTM克隆试剂盒一起使用)；也参见，例如，Sauer,Methods14:381-92(1998)；Furth,J.Mamm.Gland Biol.Neoplas.2:373(1997))；参见，例如，Cascio,Artif.Organs25:529(2001))。
编码免疫原的核酸序列可被克隆进入杆状病毒穿梭载体，随后将其与杆状病毒重组以产生用于感染例如Sf9宿主细胞的重组杆状病毒表达构建体(参见，例如，Baculovirus Expression Protocols,Methods in Molecular Biology第39卷,Richardson,Ed.(Human Press1995)；Piwnica-Worms,“Expression of Proteins inInsect Cells Using Baculoviral Vectors,”Short Protocols in Molecular Biology,第2版,Ausubel等人编，(John Wiley&Sons1992)中的第II部分,第16章)。
可用于分离和纯化重组免疫原的方法例如可包括从将重组免疫原分泌进入培养基的适当的宿主/载体系统获得上清液，随后使用商购可得的过滤器浓缩培养基。在浓缩后，可将浓缩物应用于单个适当的纯化基质或一系列适当的基质，例如亲和基质或离子交换树脂。可将一个或多个反相HPLC步骤用于进一步纯化重组多肽。当从其天然环境分离免疫原或指定抗原时，还可使用这类纯化法。
用于大规模产生本申请中描述的分离的/重组的免疫原的一种或多种的方法包括分批细胞培养，所述培养被监控和控制以维持适当的培养条件。免疫原的纯化可按照本申请中描述的和本领域内已知的并且与国内和外国管理机构的法律和指导方针相符的方法来进行。
佐剂和佐剂组合物
如本申请中所述，免疫原性组合物还可包含至少一种意欲增强(或改善、增进)对免疫原和其各自指定抗原的免疫反应(即，相较于在不施用佐剂下的特异性免疫反应的水平以在统计学上、生物学上或临床上显著的方式增加针对免疫原和指定抗原的特异性免疫反应的水平)的佐剂。在某些实施方案中，免疫原性组合物包含至少一种可以是分离的和/或重组的免疫原和至少一种佐剂。
在其它某些实施方案中，包含编码至少一种免疫原并且能够指导免疫原的表达的重组表达载体的免疫原性组合物还包含佐剂。在其它某些实施方案中，包含至少一种免疫原的免疫原性组合物和包含重组表达载体的免疫原性组合物均还包含佐剂。在其它实施方案中，不是将佐剂与包含重组表达载体的免疫原性组合物组合或将佐剂与该免疫原性组合物同时施用，而是在更晚的时间施用佐剂，以及通过与包含载体的免疫原性组合物不同的途径和/或不同的位置施用佐剂。当在施用包含重组表达载体的免疫原性组合物后施用佐剂时，在施用免疫原性组合物后第18小时、24小时、36小时、72小时或1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天(1周)施用佐剂。用于测定免疫反应的水平的方法和技术在本申请中进行了更详细地论述并且在本领域中被常规地实施。
可包含在免疫原性组合物和用于本申请中描述的方法中的示例性佐剂包括但不一定限于下列佐剂。可用于此类方法的佐剂包括用于增强对于免疫原和各自指定抗原是特异性的体液反应、细胞反应或体液反应和细胞反应的佐剂。细胞免疫反应包括对于免疫原和其各自指定抗原是特异性的CD4T细胞反应(其可包括记忆CD4T细胞反应)和CD8T细胞反应。细胞反应还可包括针对免疫原(或针对具有或表达免疫原的细胞或颗粒)的细胞毒性T细胞反应(CTL反应)。期望的佐剂增强对免疫原的反应而不引起可能不利地影响反应的定性形式的免疫原的构象变化。适当的佐剂包括铝盐例如明矾(硫酸铝钾)或其它含铝佐剂；无毒性脂质A相关佐剂例如，以非限定性实例为例，无毒性单磷酰脂质A(参见，例如，Tomai等人，J.Biol.Response Mod.6:99-107(1987)；Persing等人，Trends Microbiol.10:s32-s37(2002))；本申请中描述的GLA；3脱-O-酰化单磷酰脂质A(MPL)(参见，例如，英国专利申请No.GB2220211)；佐剂例如QS21和QuilA，其包含从在南美洲发现的皂皮树(Quillaja saponaria Molinatree)的树皮中分离的三萜糖苷(triterpene glycoside)或皂苷(saponin)(参见，例如，Kensil等人，于Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach(编Powelland Newman,Plenum Press,NY,1995)；美国专利No.5,057,540中)。其它适当的佐剂包括任选地与免疫刺激物例如单磷酰脂质A组合的水包油乳液(例如角鲨烯或花生油)(参见，例如，Stoute等人，N.Engl.J.Med.336,86-91(1997))。另一种适当的佐剂是CpG(参见，例如，Klinman,Int.Rev.Immunol.25(3-4):135-54(2006)；美国专利No.7,402,572；欧洲专利No.772619)。
如本申请中所述，适当的佐剂是铝盐例如氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。此类佐剂可与或可以不与其它特定免疫刺激剂例如MPL或3-DMP、QS21、多聚氨基酸或单体氨基酸例如多聚谷氨酸或多聚赖氨酸一起使用。另一种类的适当佐剂是水包油乳液制剂(在本申请中也称为稳定的水包油乳液)。可任选地将此类佐剂与其它特定免疫刺激例如胞壁酰肽(例如，N-乙酰基胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(正-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'二棕榈酰-sn--甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)、N-乙酰基葡糖胺基-N-乙酰基胞壁酰基-L-Al-D-异谷氨酰-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(DTP-DPP)theramideTM)或其它细菌细胞壁组分一起使用。水包油乳液包括(1)使用微射流机(microfluidizer)例如Model110Y微射流机(Microfluidics,Newton Mass.)配制成亚微米颗粒的含有5%角鲨烯、0.5%Tween80和0.5%Span85(任选地包含不同量的MTP-PE)的MF59(WO90/14837)；(2)包含10%角鲨烷、0.4%Tween80、5%普流尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF被微流化成亚微米乳剂或经涡旋以产生更大的颗粒尺寸乳剂，和(3)Ribi佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,MT)，包含2%角鲨烯、0.2%Tween80和一种或多种来自由单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)组成的组的细菌细胞壁组分，优选MPL+CWS(DetoxTM)。同样地如上文中所描述的，适当的佐剂还包括皂苷佐剂例如StimulonTM(QS21,Aquila,Worcester,Mass.)或从其产生的颗粒例如ISCOM(免疫刺激复合物)和ISCOMATRIX。其它佐剂包括完全弗式佐剂(CFA)(其适用于非人用途但不适合于人用途)和不完弗氏佐剂(IFA)。其它佐剂包括细胞因子例如白细胞介素(IL-1、IL-2和IL-12)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和肿瘤坏死因子(TNF)。
如本申请中所述，佐剂可以是无毒性脂质A-相关(或脂质A衍生物)佐剂。在具体实施方案中，基于其用作Toll-样受体(TLR)激动剂的能力选择佐剂。例如，用作TLR4激动剂并且可用于本申请中描述的组合物的无毒性脂质A相关佐剂被鉴定为DSLP。DSLP化合物共有这样的特征：它们包含通过将两个选自葡萄糖和氨基取代的葡萄糖的单糖基团连接在一起形成的二糖(DS)基团，其中二糖被化学地结合至磷酸(P)基团和多种脂质(L)基团。更具体地，二糖可被视为是从两个单糖单位(每一个具有6个碳)形成的。在二糖中，单糖之一将形成还原端，另一个单糖将形成非还原端。为方便起见，按照常规碳水化合物编号命名法，形成还原端的单糖的碳被指定为位于位置1、2、3、4、5和6，然而形成非还原端的单糖的对应的碳被指定为位于位置1’、2’、3’、4’、5’和6’。在DSLP中，非还原端的位置1上的碳通过醚基(-O-)或氨基(-NH-)连接至还原端的6’位置上的碳。磷酸基团优选通过非还原端的4’碳连接至二糖。脂质基团的每一个通过酰胺(-NH-C(O)-)或酯(-O-C(O)-)键连接至二糖，其中羰基连接至脂质基团。二糖具有7个可被连接至酰胺或酯基团的位置，即，非还原端的位置2’、3’和6’以及还原端的位置1、2、3和4。
脂质基团具有至少6个碳，优选至少8个碳，更优选至少10个碳，其中在每一种情况下，脂质基团具有不超过24个碳，不超过22个碳，或不超过20个碳。在一个实施方案中，脂质基团一起提供60-100个碳，优选70至90个碳。脂质基团可仅由碳和氢原子组成，即，其可以是烃基脂质基团，或其可包含一个羟基，即，其可以是羟基取代的脂质基团，或其可包含酯基团，所述酯基团反过来通过酯基团的羰基(-C(O)-)连接至烃基脂质或羟基取代的脂质基团，即酯取代的脂质。烃基脂质基团可以是饱和的或不饱和的，其中不饱和烃基脂质基团可在相邻的碳原子之间具有一个双键。
DSLP包含3或4或5或6或7个脂质基团。在一个方面，DSLP包含3至7个脂质基团，然而在另一个方面DSLP包含4-6个脂质。在一个方面，脂质基团独立地选自烃基脂质、羟基取代的脂质和酯取代的脂质。在一个方面，1、4’和6’位置被羟基取代。在一个方面，单糖单位各自是葡糖胺。DSLP可以游离酸形式或以盐形式例如铵盐形式存在。
在某些实施方案中，DSLP上的脂质通过下列方面进行描述：3’位置被–O-(CO)-CH2-CH(Ra)(-O-C(O)-Rb)取代；2’位置被–NH-(CO)-CH2-CH(Ra)(-O-C(O)-Rb)取代；3位置被–O-(CO)-CH2-CH(OH)(Ra)取代；2位置被–NH-(CO)-CH2-CH(OH)(Ra)取代；其中Ra和Rb的每一个选自癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基，其中这些术语的每一个是指饱和的烃基。在一个实施方案中，Ra是十一烷基并且Rb是十三烷基，其中该佐剂在例如美国专利申请公布2008/0131466被描述为“GLA”。其中Ra是十一烷基并且Rb是十三烷基的化合物可以以立体化学上定义的形式(如可从例如Avanti Polar Lipid以PHADTM佐剂获得)使用。
在一个方面，DSLP是称为3D-MPL的天然来源的化合物。3D-MPL佐剂可由GlaxoSmithKline Company将其作为它们的MPLTM佐剂以医药级形式商业地生产。3D-MPL已在科学和专利文献中进行了详尽描述，参见例如VaccineDesign：the subunit and adjuvant approach,Powell M.F.和Newman,M.J.编,第21章Monophosphoryl Lipid A as an adjuvant：past experiences and new directionsby Ulrich,J.T.和Myers,K.R.,Plenum Press,New York(1995)和美国专利公布No.4,912,094。
在另一个方面，DSLP佐剂可被描述为包含(i)二葡糖胺骨架，所述骨架具有通过非还原端葡糖胺的己糖胺位置1与还原端葡糖胺的己糖胺位置6之间的醚键连接至非还原端葡糖胺的还原端葡糖胺；(ii)连接至非还原端葡糖胺的己糖胺位置4的O-磷酰基；和(iii)达到6个脂肪酰基链；其中脂肪酰基链之一通过酯键连接至还原端葡糖胺的3-羟基，其中脂肪酰基链之一通过酰胺键连接至非还原端葡糖胺的2-氨基并且包含通过酯键连接至具有超过12个碳原子的烷酰基链的十四酰基链，并且其中脂肪酰基链之一通过酯键连接至非还原端葡糖胺的3-羟基并且包含通过酯键连接至具有超过12个碳原子的烷酰基链的十四酰基链。参见，例如，美国专利申请公布No.2008/0131466。
在另一个方面，佐剂可以是具有6个脂质基团的合成二糖，如美国专利申请公布2010/0310602中所描述的。
在另一个方面，DSLP佐剂通过化学式(I)进行描述，称为吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)：
Figure BDA0000432175190000441
其中部分A1和A2独立地选自氢、磷酸和磷酸盐。钠和钾是磷酸盐的示例性抗衡离子。部分R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自由C3-C23表示的具有3至23个碳的烃基。为了更加清楚，可这样解释：当部分“独立地选自”具有多个成员的特定组时，应当理解选择作为第一部分的成员绝不影响或限制被选择作为第二部分的成员的选择。与R1、R3、R5和R6连接的碳原子是不对称的，从而可以以R或S立体化学存在。在一个实施方案中，所有这些碳原子以R立体化学存在，然而在另一个实施方案中，所有这些碳原子以S立体化学存在。“烃基”是指完全由氢和碳形成的化学部分，其中碳原子的排列可以是直链或支链的、非环状或环状的，并且相邻碳原子之间的键合可能全部是单键，即，提供饱和烃基，或在任意两个相邻碳原子之间可能存在双键或三键，即提供不饱和烃基，烃基中的碳原子的数目为3至24个碳原子。烃基可以是烷基，其中代表性直链烷基包括甲基、乙基、正-丙基、正-丁基、正-戊基、正-己基等，包括十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等；然而支链烷基包括异丙基、仲-丁基、异丁基、叔-丁基、异戊基等。代表性饱和环烃基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和环烃基包括环戊烯基和环己烯基等。不饱和环烃基在相邻碳原子之间包含至少一个双键或三键(如果烃基是非环状的话，分别称为“烯基”或“炔基”，以及如果烃基是至少部分环状的话，分别称为环烯烃基(cycloalkeny)和环炔烃基(cycloalkynyl))。代表性直链和支链的烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二基-2-丁烯基等；而代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。式(I)的佐剂可通过本领域已知的合成法例如PCT国际公布No.WO2009/035528(将所述国际公布通过引用并入本申请)以及WO2009/035528中显示的出版物(也将所述出版物的每一篇通过引用并入本申请)中公开的合成法获得。某些佐剂还可商购获得。
DSLP佐剂可通过本领域已知的合成法例如PCT国际公布No.WO2009/035528(将所述国际公布通过引用并入本申请)以及WO2009/035528中标识的出版物(其中也将这些出版物的每一篇通过引用并入本申请)中公开的合成法获得。化学合成的DSLP佐剂例如式(I)的佐剂可以以大体上均一的形式制备，所述大体上均一的形式是指针对存在的DSLP分子(例如式(I)化合物)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少96%、97%、98%或99%的纯度的制剂。给定的佐剂制剂的纯度的程度的测定可由熟悉适当的分析化学方法的技术人员，例如利用气相色谱、液相色谱、质谱和/或核磁共振分析来容易地进行。获自天然来源的DSLP佐剂通常不容易以化学纯形式制备，从而合成地制备的佐剂是用于本申请中描述的组合和方法的优选佐剂。如先前所论述的，某些佐剂可商购获得。一种这样的DSLP佐剂是如Avanti Polar Lipids,Alabaster AL的目录中标识的产品编号699800，参见下文中与E10组合的E1。
在不同的实施方案中，佐剂具有式(I)的化学结构，但部分A1、A2、R1、R2、R3、R4、R5和R6选自先前提供的用于这些部分的选项的亚组，其中这些亚组下面由E1、E2等标识。
E1：A1是磷酸或磷酸盐并且A2是氢。
E2：R1、R3、R5和R6是C3-C21烷基；并且R2和R4是C5-C23烃基。
E3：R1、R3、R5和R6是C5-C17烷基；并且R2和R4是C7-C19烃基。
E4：R1、R3、R5和R6是C7-C15烷基；并且R2和R4是C9-C17烃基。
E5：R1、R3、R5和R6是C9-C13烷基；并且R2和R4是C11-C15烃基。
E6：R1、R3、R5和R6是C9-C15烷基；并且R2和R4是C11-C17烃基。
E7：R1、R3、R5和R6是C7-C13烷基；并且R2和R4是C9-C15烃基。
E8：R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；并且R2和R4是C12-C20烃基。
E9：R1、R3、R5和R6是C11烷基；并且R2和R4是C13烃基。
E10：R1、R3、R5和R6是十一烷基并且R2和R4是十三烷基。
在某些实施方案中，将E2至E10的每一项与实施方案E1组合，和/或E2至E9的烃基是烷基，优选直链烷基。可任选地用辅佐剂(各自如下文中论述的)将DSLP佐剂例如式(I)的佐剂配制成药物组合物。在这一点上，参考美国专利公布No.2008/0131466，所述专利公布为GLA佐剂提供制剂例如含水制剂(AF)和稳定的乳液制剂(SE)，其中这类制剂可用于式(I)的佐剂的任一种。在某些具体实施方案中，免疫原性组合物包含GLA，其中将GLA佐剂(参见式I)配制在稳定的水包油乳液(SE)(GLA/SE或GLA-SE)中，随后将其与至少一种免疫原组合。
任选地，如在下文中和本申请中更详细地描述的，可同时使用两种或更多种不同的佐剂，例如以非限定性实例为例，铝盐与DSLP佐剂、铝盐与QS21、DSLP佐剂与QS21，以及铝盐、QS21和MPL或GLA一起。同样地，还可使用任选地与铝盐、QS21和MPL的任一种及其全部组合相组合的不完全弗式佐剂(参见，例如，Chang等人，Advanced Drug Delivery Reviews32,173-186(1998))。
在某些实施方案中，可任选地用辅佐剂(各自如下文中论述的)，或本申请中描述的或本领域中可获得的任何其它佐剂将DSLP佐剂例如式(I)的佐剂配制成药物组合物(或佐剂组合物)。在这一点上，参考美国专利公布No.2008/0131466，所述专利公布为GLA佐剂提供制剂例如含水制剂(AF)和稳定的乳液制剂(SE)，可将所述制剂用于式(I)的佐剂的任一种。
如本申请中所提供的，可将DSLP佐剂例如式I的佐剂与在本申请中称为辅佐剂的第二佐剂组合使用。在3个示例性实施方案中，辅佐剂可以是递送系统，或其可以是免疫增强剂(immunopotentiator)，或其可以是用作递送系统和免疫增强剂的组合物(参见，例如，O’Hagan等人，Pharm.Res.21(9):1519-30(2004))。辅佐剂可以是通过Toll-样受体家族生物分子的成员起作用的免疫增强剂。例如，可选择辅佐剂的主要作用模式，如TLR4激动剂或TLR8激动剂或TLR9激动剂。或者，或在补充剂中，可选择辅佐剂的载体性质；例如，辅佐剂可以是乳剂、脂质体、微粒或明矾。
在一个实施方案中，辅佐剂是明矾，其中该术语是指铝盐，例如磷酸铝(AlPO4)和氢氧化铝(Al(OH)3)。当明矾用作辅佐剂时，明矾可以以约100至1,000μg或200至800μg或300至700μg或400至600μg的量存在于一个剂量的免疫原性组合物(或包含免疫原性组合物的制剂)中。式(1)的佐剂通常以低于明矾的量的量存在，在不同的具体实施方案中，式(1)的佐剂，基于重量，相对于明矾的重量以0.1-1%或1-5%或1-10%或1-100%的量存在。
在一个具体实施方案中，佐剂是具有足以用于疫苗或免疫原性组合物的辅助性质的乳剂。此类乳剂包括水包油乳液。弗氏不完全佐剂(IFA)是一种这样的佐剂。另一个适当的水包油乳液是MF-59TM佐剂，其包含角鲨烯、聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(也称为TweenTM80表面活性剂)和三油酸山糖醇。角鲨烯是最初获自鲨鱼肝油的天然有机化合物，尽管也可从植物来源(主要地蔬菜油)包括苋菜红种子、米糠、小麦胚和橄榄获得。其它适当的佐剂是MontanideTM佐剂(Seppic Inc.,Fairfield NJ)，包括MontanideTMISA50V，其为基于矿物油的佐剂；MontanideTMISA206；和MontanideTMIMS1312。虽然矿物油可存在于辅佐剂中，但在一个实施方案中，本申请中描述的免疫原性组合物的油组分都是可代谢的油。
可在本申请中描述的方法的实施中用作辅佐剂的免疫增强剂的实例包括：MPLTM；MDP和衍生物；寡核苷酸；双链RNA；替代性病原体-相关分子模式(PAMPS)；皂苷类；小分子免疫增强剂(SMIP)；细胞因子和趋化因子。
在一个实施方案中，辅佐剂是MPLTM佐剂，其可从GlaxoSmithKline商购获得(最初由Ribi ImmunoChem Research,Inc.Hamilton,MT开发的)。参见，例如，Ulrich和Myers,来自Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach,Powell和Newman编Plenum Press,New York(1995)的第21章。与MPLTM佐剂相关，还可适当地作为用于本申请中描述的组合物和方法的辅佐剂的是AS02TM佐剂和AS04TM佐剂。AS02TM佐剂是包含MPLTM佐剂和QS-21TM佐剂(在本申请中其它地方论述的皂苷佐剂)的水包油乳液。AS04TM佐剂包含MPLTM佐剂和明矾。MPLTM佐剂是通过用弱酸和弱碱水解处理LPS，随后纯化修饰LPS来从明尼苏达沙门菌(Salmonella minnesota)R595的脂多糖(LPS)制备的。
在另一个实施方案中，辅佐剂是皂苷，例如来源于皂皮树物种的树皮的那些皂苷，或修饰皂苷(参见，例如，美国专利No.5,057,540；5,273,965；5,352,449；5,443,829和5,560,398)。由Antigenics,Inc.Lexington,MA出售的产品QS-21TM佐剂是可与式(I)的佐剂一起使用的示例性含皂苷辅佐剂。与皂苷相关的替代性辅佐剂是佐剂的ISCOMTM家族，最初由Iscotec(Sweden)开发的和通常从来源于皂皮树的皂苷或合成类似物、胆固醇和磷脂(全都形成蜂蜗样结构)形成的。
在另一个实施方案中，辅佐剂是用作辅佐剂的细胞因子(参见，例如，Lin等人，Clin.Infect.Dis.21(6):1439-49(1995)；Taylor,Infect.Immun.63(9):3241-44(1995)；和Egilmez,Vaccine Adjuvants and Delivery Systems,John Wiley&Sons,Inc.(2007)中第14章)。在不同的实施方案中，细胞因子可以是例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(参见，例如，Change等人，Hematology9(3):207-15(2004)；Dranoff,Immunol.Rev.188:147-54(2002)；和美国专利5,679,356)；或干扰素，例如I型干扰素(例如，干扰素-α(IFN-α)或干扰素-β(IFN-β))，或II型干扰素(例如，干扰素-γ(IFN-γ)(参见，例如，Boehm等人，Ann.Rev.Immunol.15:749-95(1997)；和Theofilopoulos等人，Ann.Rev.Immunol.23:307-36(2005))；白细胞介素，具体地包括白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)(参见，例如，Nelson,J.Immunol.172(7):3983-88(2004)；白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-12(IL-12)(参见，例如，Portielje等人，Cancer Immunol.Immunother.52(3):133-44(2003)；和Trinchieri,Nat.Rev.Immunol.3(2):133-46(2003))；白细胞介素-15(Il-15)、白细胞介素-18(IL-18)；胎儿肝酪氨酸激酶3配体(Flt3L)或肿瘤坏死因子α(TNFα)。可在与疫苗抗原组合之前利用细胞因子共配制DSLP佐剂例如式(I)的佐剂，或可分别配制抗原、DSLP佐剂(例如，式(I)的佐剂)和细胞因子辅佐剂，随后将其混合。
在某些实施方案中，将包含免疫原(其可以是分离的和/或重组的)和佐剂的免疫原性组合物配制在一起。在其它某些实施方案中，当免疫原性组合物包含两种或更多种免疫原时，可单独地用每一种免疫原配制佐剂，或可将两种或更多种免疫原与佐剂一起配制，以形成单一免疫原性组合物。当意欲对受试者施用两种或更多种免疫原时和当利用佐剂单独地配制每一种免疫原时，则可将每一种组合物相组合以形成单一免疫原性组合物。
在其它某些实施方案中，包装包含免疫原的免疫原性组合物或包含编码免疫原的重组表达载体或含有载体的载体颗粒的组合物，将其在除装有佐剂的那些小瓶外的小瓶中提供。将免疫原性组合物和佐剂各自与药学上可接受的(即，生理上适合的或可接受的)赋形剂组合，所述赋形剂在本申请中进行了更详细的描述。对于每一种组合物通常包装有适当的标签，标明预期的治疗应用。佐剂和/或赋形剂的选择取决于免疫原、重组表达载体和/或载体颗粒的稳定性；施用途径；给药方案；和佐剂对于待接种的物种的效力。为了在人中施用，药学上可接受的佐剂是已被相关监管机构(pertinent regulatory body)批准的或可被所述机构批准用于人施用的佐剂。例如，如本申请中论述的和本领域中已知的，完全弗氏佐剂不适合于人施用。
对于在本申请中描述的免疫组合物和方法中的使用是有用的佐剂是对于对其施用佐剂的受试者在生理上或药学上适当的佐剂。佐剂组合物包含至少一种佐剂(即，一种或多种佐剂)和任选地，至少一种生理上或药学上适当的(或可接受的)赋形剂。本领域技术人员已知的用于药物组合物的任何生理或药学上适当的赋形剂或载体(即，不干扰活性成分的活性的无毒性材料)可用于本申请中描述的佐剂组合物。示例性赋形剂包括维持佐剂的组分的稳定性和完整性的稀释剂和载体。用于治疗用途的赋形剂是公知的并且描述于例如(雷明顿：药学技术与实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)(Gennaro,第21版Mack Pub.Co.,Easton,PA(2005))，以及更详细地描述于本申请中。
重组表达载体
在一个实施方案中，提供了包含编码至少一种诱导针对免疫原和其各自指定抗原的免疫反应的免疫原的多核苷酸序列的重组表达载体。为了获得免疫原的高效转录和翻译，每一个载体中的编码多核苷酸序列包括至少一个适当的表达控制序列(也称为表达调控序列或特征)(例如，启动子、增强子、前导序列)，其更详细地描述于本申请中，所述表达控制序列有效地连接至编码多核苷酸序列。因而提供了用于在已用重组表达载体或含有重组表达载体的载体颗粒转化、转导或转染的任何适当的宿主细胞中指导免疫原的表达或指导至少两种免疫原的共表达的这类重组表达载体。
本申请中描述的重组表达载体可编码一种或多种免疫原(即，至少一种，至少两种，至少三种免疫原等)，所述免疫原更详细地描述于本申请中。在具体实施方案中，至少1、2或3或更多种来自感染性微生物(例如，病毒、细菌、真菌或寄生虫)的免疫原可由重组表达载体编码。获自感染性疾病微生物的免疫原和指定抗原更详细地描述于本申请中。例如，免疫原可以是HSV-2蛋白例如UL19或gD，(或其免疫原性变体)或可以是HSV-2蛋白的免疫原性片段或区域。在另一个具体实施方案中，本申请中描述的重组表达载体可编码至少1、2、3或更多种肿瘤相关抗原或其免疫原性变体或片段。这类肿瘤相关抗原更详细地描述于本申请中，可以是例如来自肾细胞癌抗原、前列腺癌抗原(例如，前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、NKX3.1和前列腺特异性膜抗原)、间皮瘤抗原、胰腺癌抗原、黑色素瘤抗原、乳腺癌抗原、结直肠癌抗原、肺癌抗原、卵巢癌抗原的肿瘤相关抗原或本申请中和本领域中描述的任何癌症或肿瘤相关抗原。
重组表达载体可用于表达本申请中描述的免疫原的任一种或多种。在具体实施方案中，重组表达载体被递送至适当的细胞(例如，抗原呈递细胞，即在其细胞表面上显示肽/MHC复合物的细胞，例如树突细胞)或组织(例如淋巴组织)，所述重组表达载体将诱导期望的免疫反应(即，特定体液反应(即，B细胞反应)和/或特定细胞介导的免疫反应的诱导，所述细胞介导的免疫反应包括免疫原-特异性CD4和/或CD8T细胞反应，所述CD8T细胞反应可包括细胞毒性T细胞(CTL)反应)。重组表达载体因而还可包括例如淋巴组织-特异性转录调控元件(TRE)例如B淋巴细胞、T淋巴细胞或树突细胞特异性TRE。淋巴组织特异性TRE在本领域是已知的(参见，例如，Thompson等人，Mol.Cell.Biol.12,1043-53(1992)；Todd等人，J.Exp.Med.177,1663-74(1993)；Penix等人，J.Exp.Med.178:1483-96(1993))。
在具体实施方案中，重组表达载体是质粒DNA或粘粒DNA。含有一个或多个编码本申请中描述的免疫原的质粒DNA或粘粒DNA可使用本领域中公知的技术来容易地构建。载体基因组通常可以以质粒形式来构建，随后可将所述质粒转染进入包装或生产细胞系。质粒通常包含用于在细菌中复制质粒的序列。此类质粒在本领域是公知的。此外，包含原核生物复制起始点的载体还可包括其表达赋予可检测标记或可选择标记例如药物抗性的基因。常见细菌药物抗性产物是赋予对氨苄青霉素或四环素的抗性的产物。为了分析以确认正确的核苷酸序列被整合进入质粒，可将质粒在大肠杆菌中复制，纯化质粒，随后通过限制性内切核酸酶消化和/或利用常规方法测定其核苷酸序列来进行分析。
在其它具体实施方案中，重组表达载体是病毒载体。示例性重组表达病毒载体包括慢病毒载体基因组、痘病毒载体基因组、痘苗病毒载体基因组、腺病毒载体基因组、腺病毒相关病毒载体基因组、疱疹病毒载体基因组和α病毒载体基因组。病毒载体可以是活的、减毒的、条件复制型的或复制缺陷型的，通常为非病原性的(有缺陷的)具有复制能力的病毒载体。
例如，在具体实施方案中，当病毒载体为痘苗病毒载体基因组时，可将编码目标免疫原的多核苷酸插入牛痘病毒载体的非必需位点。此类非必需位点描述于例如Perkus等人，Virology152:285(1986)；Hruby等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:3411(1983)；Weir等人，J.Virol.46:530(1983)中。与牛痘病毒一起使用的适当的启动子包括但不限于P7.5(参见，例如，Cochran等人，J.Virol.54:30(1985)；P11(参见，例如，Bertholet等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:2096(1985))；和CAE-1(参见，例如，Patel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:9431(1988))。牛痘的高度减毒株更可被接受用于人，包括Lister、NYVAC，其包含特定的基因组缺失(参见，例如，Guerra等人，J.Virol.80:985-98(2006)；Tartaglia等人，AIDS Research and Human Retroviruses8:1445-47(1992))或MVA(参见，例如，Gheradi等人，J.Gen.Virol.86:2925-36(2005)；Mayr等人，Infection3:6-14(1975))。也参见Hu等人(J.Virol.75:10300-308(2001)，描述了亚巴样病病毒(Yaba-Like disease virus)用作用于癌症疗法的载体的用途)；美国专利No.5,698,530和6,998,252。也参见，例如，美国专利No.5,443,964。也参见美国专利No.7,247,615和7,368,116。
在某些实施方案中，腺病毒载体或腺病毒相关病毒载体可用于表达目标免疫原。已描述了用于施用载体的几种腺病毒载体系统和方法(参见，例如，Molin等人，J.Virol.72:8358-61(1998)；Narumi等人，Am J.Respir.Cell Mol.Biol.19:936-41(1998)；Mercier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:6188-93(2004)；美国专利No.6,143,290；6,596,535；6,855,317；6,936,257；7,125,717；7,378,087；7,550,296)。
逆转录病毒载体基因组可包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、亲嗜性逆转录病毒(ecotropic retroviruses)、猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus)(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些逆转录病毒载体基因组(参见，例如，Buchscher等人，J.Virol.66:2731-39(1992)；Johann等人，J.Virol.66:1635-40(1992)；Sommerfelt等人，Virology176:58-59(1990)；Wilson等人，J.Virol.63:2374-78(1989)；Miller等人，J.Virol.65:2220-24(1991)；Miller等人，Mol.Cell Biol.10:4239(1990)；Kolberg,NIH Res.4:431992；Cornetta等人，Hum.Gene Ther.2:215(1991))。
在更具体的实施方案中，重组表达病毒载体是慢病毒载体基因组。基因组可来源于许多适当的可获得的基于慢病毒基因组的载体的任一种，包括经鉴定用于人基因治疗应用的那些基于慢病毒基因组的载体(参见，例如，Pfeifer等人，Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.2:177-211(2001))。适当的慢病毒载体基因组包括基于人免疫缺陷病毒(HIV-1)、HIV-2、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和梅迪/维斯那病毒的那些慢病毒载体基因组。慢病毒的期望的特征是它们能够感染分裂和非分裂细胞，尽管靶细胞不必是分裂细胞或被刺激以进行分裂。通常地，基因组和包膜糖蛋白基于不同的病毒，以便所得的病毒载体颗粒被假型化。非常期望包括载体基因组的完全特征。安全特征包括自身灭活LTR和非整合基因组。示例性载体包含包装信号(psi)、Rev-应答元件(RRE)、剪接供体、剪接受体、中心多嘌呤管道(centralpoly-purine tract)(cPPT)和WPRE元件。在某些示例性实施方案中，病毒载体基因组包含来自慢病毒基因组例如HIV-1基因组或SIV基因组的序列。病毒基因组构建体可包含来自慢病毒的5'和3'LTR的序列，特别地可包含来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列和灭活的或自身灭活的来自慢病毒的3'LTR。LTR序列可以是来源于来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。通常地，LTR序列是HIV LTR序列。
载体基因组可包含灭活的或自身灭活的3'LTR(参见，例如，Zufferey等人，J.Virol.72：9873,1998；Miyoshi等人，J.Virol.72:8150,1998；将所述两篇文献通过引用整体并入本申请)。自身灭活的载体通常具有来自3'长末端重复(LTR)的增强子和启动子序列的缺失，所述缺失在载体整合过程中被拷贝进入5'LTR。在一种情况下，3'LTR的U3元件包含其增强子序列、TATA盒、Sp1和NF-κB位点的缺失。作为自身灭活的3'LTR的结果，在进入和逆转录后产生的原病毒将包含灭活的5'LTR。原理是通过减小动员载体基因组的风险和LTR对附近细胞启动子的影响来改善安全性。自身灭活的3'LTR可由本领域已知的任何方法来构建。
任选地，在病毒构建体中，来自慢病毒5'LTR的U3序列可用启动子序列例如异源启动子序列来替换。这可增加从包装细胞系回收的病毒的滴度。还可包含增强子序列。可使用增加病毒RNA基因组在包装细胞系中的表达的任何增强子/启动子组合。在一个实例中，使用CMV增强子/启动子序列(参见，例如，美国专利No.5,385,839和5,168,062)。
在某些实施方案中，通过构建具有整合缺陷的慢病毒载体基因组来使插入诱变的风险降至最低。可采取多种方法来产生非整合性载体基因组。这些方法使得必需将突变工程化至pol基因的整合酶组分中，以便其编码具有灭活的整合酶的蛋白质。载体基因组本身可被修饰来通过例如突变或缺失一个或两个附着位点或通过缺失或修饰产生无功能的3'LTR-近端多嘌呤管道(PPT)来阻止整合。此外，非遗传方法是可获得的；此类方法包括抑制整合酶的一个或多个功能的药物。方法不是相互排斥的，即可同时使用超过一种所述方法。例如，整合酶和附着位点可以是无功能的，或整合酶和PPT位点可以是无功能的，或附着位点和PPT位点可以是无功能的，或其全部都可以是无功能的。
整合酶参与病毒双链平端DNA的切割和将末端连接至染色体靶位点的两条链中的5'-磷酸。整合酶具有3个功能结构域：N-末端结构域，其包含锌结合基序(HHCC)；中央结构域核心，其包含催化核心和保守的DD35E基序(HIV-1中的D64、D116、E152)；和C末端结构域，其具有DNA结合性质。引入整合酶的点突变足以破坏正常功能。许多整合酶突变已被构建和表征(参见，例如，Philpott和Thrasher,Human Gene Therapy18:483,2007；Apolonia,Thesissubmitted to University College London,April2009,第82-97页；Engelman等人，J.Virol.69：2729,1995；Nightingale等人，Mol.Therapy,13：1121,2006)。编码整合酶蛋白的序列可被缺失或突变以使蛋白质失活，优选不显著削弱逆转录酶活性或细胞核靶向，从而仅阻止原病毒至靶细胞基因组内的整合。可接受的突变可减弱整合酶催化、链转移、对att位点的结合、对宿主染色体DNA的结合和其它功能。例如，HIV或SIV整合酶的残基35上单个天冬氨酸对天冬酰胺的置换完全消除病毒DNA整合。整合酶的缺失通常被限制在C末端区域。残基235-288的编码序列的缺失导致有用的无功能整合酶(参见，例如，Engelman等人，J.Virol.69:2729,1995)。作为其它实例，可产生突变例如Asp64(残基编号是针对HIV-1给出的，来自其它慢病毒或逆转录病毒的整合酶的对应残基编号可由本领域技术人员容易地确定)(例如，D64E、D64V)、Asp116(例如，D116N)、Asn120(例如，N120K)、Glu152、Gln148(例如，Q148A)、Lys156、Lys159、Trp235(例如，W235E)、Lys264(例如，K264R)、Lys266(例如，K266R)、Lys273(例如，K273R)。可构建其它突变并且测试其整合、转基因表达和任何其它期望的参数。用于这些功能的测定是公知的。突变可通过多种技术的任一种产生，包括定点诱变和核苷酸序列的化学合成。可产生一个突变，或超过一个这类突变可存在于整合酶中。例如，整合酶可在至少两个氨基酸、三个氨基酸、四个氨基酸等上具有突变。
或者，或与整合酶突变体的使用组合，还可突变U3和U5中的附着位点(att)。整合酶结合这些位点，并且3'-末端二核苷酸在载体基因组的两个末端被切割。CA二核苷酸位于凹陷的3'末端；CA是加工所需的，核苷酸的突变阻断至宿主染色体中的整合。CA二核苷酸的A对于整合是最重要的核苷酸，基因组的两个末端上的突变将产生最佳结果(参见，例如，Brown等人，J.Virol.73:9011(1999))。在一个范例中，每一个末端上的CA被改变成TG。在其它范例中，每一个末端上的CA在一个末端被改变成TG，在另一个末端被改变成GT。在其它范例中，使每一个末端上的CA缺失；在其它范例中，使CA的A在每一个末端CA上缺失。
整合还可被位于3'LTR附近的多嘌呤管道(PPT)的突变或缺失抑制(参见，例如，WO2009/076524)。PPT是可用作用于正链DNA合成的引物结合位点的约15个核苷酸的多嘌呤序列。在该情况下，PPT的突变或缺失靶向逆转录过程。不希望受特定机制束缚，通过突变或缺失PPT，线性DNA的产生彻底减少，基本上只产生1-LTR DNA环。整合需要线性双链DNA载体基因组，并且在其不存在的情况下整合基本上被消除。如本申请中所述，可通过突变或通过缺失使PPT无功能。通常地，使完整的约15nt PPT缺失，虽然在一些情况下，可产生14nt、13、nt、12nt、11nt、10nt、9nt、8nt、7nt、6nt、5nt、4nt、3nt和2nt的更短的缺失。当产生突变时，通常产生多个突变，特别地在PPT的5'一半中(参见，例如，McWilliams等人，J.Virol.77:11150,2003)，虽然前4个碱基的单突变和双突变仍然减少转录。在PPT的3'末端上产生的突变通常具有更明显的作用(参见，例如，Powell等人，J.Virol.70:5288,1996)。
可单独地或组合地使用这些不同的使载体基因组成为非整合性的方法。使用超过一个方法可用于通过冗余机制建立故障保险(fail-safe)载体。因此，可将PPT突变或缺失与att位点突变或缺失或与整合酶突变组合，或可将PPT突变或缺失与att位点突变或缺失和整合酶突变组合。类似地，可将att位点突变或缺失和整合酶突变彼此组合或与PPT突变或缺失组合。
如本申请中所述，慢病毒载体构建体包含用于在哺乳动物细胞中表达的启动子。在本申请中更详细论述的启动子包括例如人泛素蛋白C启动子(UbiC)、巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。U3区域可包含正好在上游的PPT(多嘌呤管道)序列。在某些具体实施方案中，可将至少3个不同的U3区域(在3'末端上)的任一个包含在慢病毒载体(参见SEQ IDNOS:21-23)中。构建体在U3区域中包含缺失。SIN构建体在U3中具有约130个核苷酸的缺失(参见，例如，Miyoshi等人J.Virol.72：8150,1998；Yu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：3194,1986)，所述缺失消除了TATA盒，从而消除了LTR启动子活性。构建体703和704中的缺失增加来自慢病毒载体的表达(参见，例如，Bayer等人，Mol.Therapy16：1968,2008)。此外，构建体704包含3'PPT的缺失，所述缺失减少载体的整合(参见，例如，WO2009/076524)。也参见美国专利申请12/842,609和国际专利申请公布No.WO2011/011584(国际专利申请No.PCT/US10/042870)，将这两篇文献各自通过引用整体并入本申请。
表达调控序列(Regulatory Expression Sequence)
如本申请中所述，重组表达载体包含至少一个表达调控序列。在某些实施方案中，当重组表达载体包含病毒载体基因组时，期望在特定靶细胞中表达至少一种免疫原。通常地，例如在慢病毒载体中，编码免疫原的多核苷酸序列位于5'LTR与3'LTR序列之间。此外，编码核苷酸序列优选以功能关系与以特定的方式调控免疫原表达的其它遗传或调控序列或特征(例如包括启动子或增强子的转录调控序列)有效连接。在某些情况下，有用的转录调控序列是在时间和空间上在活性方面被高度调控的序列。可用于调控编码的多肽的表达的表达控制元件在本领域是已知的，包括但不限于诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号、增强子和其它调控序列。
编码免疫原和任何其它可表达的序列的多核苷酸通常与内部启动子/增强子调控序列具有功能关系。对于慢病毒载体构建体，“内部”启动子/增强子是位于病毒载体的5'LTR与3'LTR序列之间的启动子/增强子，其有效地连接至目标编码多核苷酸序列。内部启动子/增强子可以是已知增加与其具有功能关系的基因的表达的任何启动子、增强子或启动子/增强子组合。“功能关系”和“有效连接的”意指，但不限于，序列相对于启动子和/或增强子处于正确位置和取向，以便当将启动子和/或增强子与适当的分子接触时，目标序列可表达。
内部启动子/增强子的选择基于免疫原的期望表达模式和已知的启动子/增强子的具体性质。因此，内部启动子可具有组成型活性。可使用的组成型启动子的非限定性实例包括泛素蛋白的启动子(参见，例如，美国专利No.5510474；WO98/32869)；CMV(参见，例如，Thomsen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:659,1984；美国专利No.5168062)；β-肌动蛋白(Gunning等人1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:4831-4835)；和pgk(参见，例如，Adra等人1987Gene60:65-74；Singer-Sam等人1984Gene32:409-417；和Dobson等人1982NucleicAcids Res.10:2635-2637)。
或者，启动子可以是组织特异性启动子。在一些实施方案中，启动子是靶细胞特异性启动子。例如，启动子可来自由树突细胞表达的任何产物，包括CD11c、CD103、TLR、DC-SIGN、BDCA-3、DEC-205、DCIR2、甘露糖受体、Dectin-1、Clec9A、MHC II类。此外，启动子可被选择来使得能够诱导型表达免疫原。许多用于诱导型表达的系统在本领域是已知的，包括四环素应答系统、lac操纵基因-阻遏物系统(operator-repressor system)以及响应多种环境或生理变化的启动子，包括响应热激、金属离子变化的启动子，例如金属硫蛋白启动子，响应干扰素、缺氧、类固醇变化的启动子，例如孕酮或糖皮质激素受体启动子，响应辐射的启动子，例如VEGF启动子。还可将启动子的组合用于获得每一个免疫原编码多核苷酸序列的期望的表达。本领域技术人员能够基于多核苷酸序列在目标生物或靶细胞中的期望表达模式选择启动子。
重组表达载体，包括病毒载体基因组，可包含至少一种RNA聚合酶II或III应答启动子。该启动子可有效地连接至目标多核苷酸序列，并且还可连接至终止序列。此外，可整合超过一个RNA聚合酶II或III启动子。RNA聚合酶II和III启动子对于本领域技术人员来说是公知的。适当范围的RNA聚合酶III启动子可以例如见于Paule和White,Nucleic Acids Res.,第28卷，第1283-1298页(2000)中。RNA聚合酶II或III启动子还包括任何合成或工程化DNA片段，所述片段可指导RNA聚合酶II或III转录下游RNA编码序列。此外，用作病毒载体基因组的部分的RNA聚合酶II或III(Pol II或III)启动子可以是诱导型的。可将任何适当的诱导型Pol II或III启动子与本申请中描述的方法一起使用。特别适合的Pol II或III启动子包括在Ohkawa和Taira,HumanGene Therapy,11:577-585(2000)以及Meissner等人，Nucleic Acids Res.,29:1672-1682(2001)中提供的四环素应答启动子。
内部增强子也可存在于重组表达载体，包括病毒载体基因组，以增加目标多核苷酸序列的表达。例如，可使用CMV增强子(参见，例如，Boshart等人，Cell41:521,1985)。病毒基因组例如HIV、CMV中以及哺乳动物基因组中的许多增强子已被鉴定和表征(参见，例如，公共可获得的数据库例如GenBank)。可将增强子与异源启动子组合使用。本领域技术人员能够基于期望的表达模式选择适当的增强子。
当靶向递送重组表达载体(包括病毒载体基因组)至特定靶细胞时，载体基因组通常包含被靶细胞识别并且有效地连接至目标序列、病毒组分(当载体是病毒载体时)和本申请中论述的其它序列的启动子。启动子是由核酸序列形成的表达控制元件，其允许RNA聚合酶的结合和转录发生。启动子可以是诱导型的、组成型的、短暂活性的或组织特异性的。诱导型启动子的活性通过生物或非生物因子的存在或不存在来诱导。诱导型启动子可以是遗传工程中的有用工具，因为与它们有效连接的基因的表达可在生物(其产生者)发育的某些阶段或在特定组织中打开或关闭。诱导型启动子可被分类为化学调控启动子和物理调控启动子。典型的化学调控启动子包括但不限于乙醇调控启动子(例如，醇脱氢酶I(alcA)基因启动子)、四环素调控启动子(例如，四环素应答启动子)、类固醇调控启动子(例如，基于大鼠糖皮质激素受体(GR)的启动子、基于人雌激素受体(ER)的启动子、基于蛾蜕皮激素受体的启动子和基于类固醇/类视色素/甲状腺受体超家族的启动子)、金属调控启动子(例如，基于金属硫蛋白基因的启动子)和发病机制相关性启动子(例如，基于拟南芥和玉蜀黍病原体相关性(PR)蛋白质的启动子)。典型的物理调控启动子包括但不限于温度调控启动子(例如，热激启动子)和光调控启动子(例如，大豆SSU启动子)。其它示例性启动子描述于例如可通过搜索美国专利和商标事务所数据库鉴定的专利和公开的专利申请中的其它地方。
本领域技术人员能够基于具体情况选择适当的启动子。许多不同的启动子在本领域是公知的，用于将启动子有效地连接至待表达的多核苷酸序列的方法亦如此。天然启动子序列和许多异源启动子均可用于在包装细胞和靶细胞中指导表达。通常使用异源启动子，因为相较于天然启动子，它们通常允许期望的蛋白质拥有更多的转录和更高的产率。
启动子可以例如获自病毒(例如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40))的基因组。启动子还可以是例如异源哺乳动物启动子，例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、热激启动子或通常与天然序列结合的启动子，只要这样的启动子可与靶细胞相容。在一个实施方案中，启动子是在病毒表达系统中天然存在的病毒启动子。在一些实施方案中，启动子是树突细胞特异性启动子。树突细胞特异性启动子可以例如是CD11c启动子。
转录可通过将增强子序列插入载体来增加。增强子通常是DNA的顺式作用元件，长度通常为约10至300个碱基对，其作用于启动子以增加其转录。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)和来自真核细胞病毒。实例包括在复制起始的晚期侧上的SV40增强子(碱基对100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起始的晚期侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可在抗原特异性多核苷酸序列的位置5'或3'(但优选位于启动子的位置5')上被剪接进入载体。
表达载体还可包含转录终止和稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常见于真核生物或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔3'非翻译区中，并且在本领域是公知的。
重组表达构建体(包括病毒载体基因组)还可包含额外的基因元件。可包含在构建体中的元件的类型绝不受到限制，并且可被选择来实现特定的结果。例如，可包含有利于重组表达载体或病毒基因组在靶细胞中进入细胞核的信号。这样的信号的实例是HIV-1flap信号。可包含有利于表征原病毒在靶细胞中的整合位点的另外的调控序列。例如，可将tRNA琥珀抑制因子序列包含在构建体中。还可将例如来自鸡β-珠蛋白的隔离子序列(insulator sequence)包含在病毒基因组构建体中。该元件减小因甲基化和异染色质化作用而在靶细胞中沉默整合的原病毒的可能性。此外，隔离子可使内部增强子、启动子和外源多核苷酸序列免受来自染色体上的整合位点周围的DNA的正或负位置效应影响。此外，重组构建体(包括载体基因组)可包含一个或多个被设计来增强目标基因的表达的基因元件。例如，可将旱獭肝炎病毒应答元件(WRE)置于构建体中(参见，例如，Zufferey等人1999.J.Virol.74:3668-81；Deglon等人，2000.Hum.Gene Ther.11:179-90)。
当重组表达载体是病毒载体基因组时，通常以可被转染进入包装或生产细胞系(以产生病毒载体基因组构建体)的质粒形式构建病毒载体基因组。质粒通常包含用于在细菌中复制质粒的序列。这样的质粒在本领域是公知的。此外，包括原核复制起始区的载体还可包括其表达赋予可检测或可选择标记例如药物抗性的基因。典型的细菌药物抗性产物是赋予对氨苄青霉素或四环素的抗性的那些产物。
在某些构型中，重组表达载体包含编码树突细胞(DC)成熟/刺激因子的多核苷酸序列。示例性刺激分子包括GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、IL-21、IL-23、TNFα、B7.1、B7.2、4-1BB、CD40配体(CD40L)、药物诱导型CD40(iCD40)等。这类多核苷酸通常处于一个或多个在树突细胞中指导编码序列的表达的调控元件的控制之下。在某些其它具体实施方案中，不包括指导编码免疫原和GM-CSF的核苷酸的表达并且包含所述核苷酸的重组表达载体。树突细胞的成熟促成成功的接种(参见，例如，Banchereau等人，Nat.Rev.Immunol.5:296-306(2005)；Schuler等人，Curr.Opin.Immunol.15:138-147(2003)；Figdor等人，Nat.Med.10:475-480(2004))。成熟可将DC从活跃地参与抗原捕获的细胞转化成专门进行T细胞初免的细胞。例如，CD4-辅助T细胞上的DC40L对CD40的接触是DC成熟的关键信号，导致CD8+T细胞的高效活化。这样的刺激分子也称为成熟因子或成熟刺激因子。免疫检查点代表在癌细胞中激活功能细胞免疫的重大障碍，对于T细胞上的抑制性配体(包括CTLA4和程序化死亡-1(PD-1))是特异性的拮抗性抗体是有待在临床中进行评价的靶向试剂的实例。慢性感染和癌症中的显著耐受性机制是表达高水平的PD-1的抗原特异性T细胞的功能耗尽。由于已显示通过与免疫检查点控制组合显著增强了治疗性免疫的能力，因此作为非限定性实例，本领域技术人员可理解，抑制免疫检查点的替代性方法是抑制程序化死亡(PD)配体1和2(PD-L1/L2)的表达。实现抑制的一个方法是通过表达RNA分子例如本申请中描述的那些RNA分子，所述RNA分子抑制PD-L1/L2在利用编码一个或多个相关分子的病毒载体基因组例如慢病毒载体基因组转导的DC中表达。DC的成熟或特定元件例如免疫检查点例如PD-1配体的表达可通过表面标志物例如MHC II的上调的流式细胞术分析，和通过例如通过进行本申请中描述的技术和方法表征表达的趋化因子和细胞因子来进行表征。
编码可检测产物(通常为蛋白质)的序列可被包含来允许鉴定表达期望的免疫原的细胞。例如，可将荧光标记蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)与目标多核苷酸序列(即，编码至少一种免疫原)一起整合进入重组表达构建体。在其它情况下，蛋白质可以是可通过抗体检测的，或蛋白质可以是作用于底物以产生可检测产物的酶，或可以是允许选择转染的或转导的靶细胞，例如赋予抗药性例如潮霉素抗性的蛋白质产物。常见选择基因编码蛋白质，所述蛋白质赋予对抗生素或本领域已知的其它适用于真核细胞的毒素例如新霉素、甲氨蝶呤等等的抗性，或补充营养缺陷型缺乏或从培养基供应扣留的关键营养物。可选择标记可任选地存在于分开的质粒上并且通过共转染引入。
关于本申请中描述的载体颗粒，可使用一个或多个多顺反子表达单位，所述多顺反子表达单位包括两个或更多个编码免疫原的多核苷酸序列和编码本申请中描述的包膜分子或一种或多种在包装细胞中产生期望的载体颗粒所必需的DC成熟因子的序列。多顺反子载体的使用减少了需要的核酸分子的总数，从而可避免可能的与从多个载体基因组协同表达相关的困难。在多顺反子载体的中，待表达的不同元件有效地连接至一个或多个启动子(和必要时其它表达控制元件)。在一些构型中，多顺反子载体包含编码至少一种目标免疫原(即，一种或多种)的序列、编码报道分子产物的序列和编码一种或多种载体颗粒组分的序列。在其中重组构建体包含编码免疫原的多核苷酸的某些实施方案中，构建体任选地编码DC成熟因子。在某些其它实施方案中，多顺反子载体包含编码免疫原、DC成熟因子和任选地病毒组分(当表达载体是病毒表达载体时)的每一种的多核苷酸序列。在其它实施方案中，多顺反子载体指导表达和编码至少两种或更多种免疫原。
多顺反子表达载体中待表达的每一个组分可以例如被内核糖体进入位点(IRES)元件或病毒2A元件分隔，以允许不同蛋白质从相同启动子单独表达。IRES元件和2A元件在本领域是已知的(参见，例如，美国专利No.4,937,190；de Felipe等人2004.Traffic5：616-626)。在一个实施方案中，与来自口蹄疫病毒(FMDV)、马甲型鼻炎病毒(ERAV)和刺蛾分配病毒(thosea asignavirus)(TaV)(参见，例如，Szymczak等人2004Nat.Biotechnol.22：589-594)的2A样序列连接的寡核苷酸例如费林蛋白酶切割位点序列(RAKR)(参见，例如，Fang等人2005Nat.Biotech.23：584-590)用于在多顺反子载体中分隔基因元件。特定多顺反子载体的效力可通过使用标准方案检测每一个基因的表达来容易地测试。
在具体实施方案中，病毒载体基因组包含：巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子序列；来自HIV5'LTR的R和U5序列；包装序列(ψ)；HIV-1flap信号；内部增强子；内部启动子；目标基因；旱獭肝炎病毒应答元件；tRNA琥珀抑制因子序列；其增强子序列缺失的U3元件；鸡β-珠蛋白隔离子；和3'HIV LTR的R和U5序列。在一些范例中，载体基因组包含完整的慢病毒5'LTR和自身灭活的3'LTR(参见，例如，Iwakuma等人Virology15:120,1999)。
载体基因组的构建可使用本领域已知的任何适当的基因工程技术来实现，所述技术包括但不限于限制性内切核酸酶消化、连接、转化、质粒纯化和DNA测序的标准技术，例如如Sambrook等人(1989和2001版；Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY)；Coffin等人(Retroviruses.Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.(1997))；和“RNAViruses：A Practical Approach”(Alan J.Cann编，Oxford University Press,(2000)(将每一个上述文献通过引用整体并入本申请)中描述的。
还可使用被构建来用于在哺乳动物细胞中瞬时表达的载体。瞬时表达包括使用表达载体，所述表达能够在宿主细胞中高效复制，以便宿主细胞积累许多拷贝的表达载体，从而合成高水平的由表达载体中的免疫原特异性多核苷酸编码的多肽。参见Sambrook等人，同上,第16.17-16.22页,1989。适合于多肽的表达的其它载体和方法在本领域是公知的并且可容易地被改造以适合具体情况。
通过使用本申请中提供的教导和本领域中的知识，本领域技术人员将承认，特定表达系统的效力可通过用包含编码报告蛋白质的多核苷酸序列转染包装细胞，随后使用适当的技术(例如，测量来自绿色荧光蛋白缀合物的荧光)测量表达来测试。其它适当的报道基因在本领域是公知的。
包含编码免疫原的多核苷酸序列的重组表达载体可用于产生免疫原。重组表达载体包含至少一个与编码免疫原的多核苷酸有效连接的表达调控序列例如启动子或增强子。每一种表达载体可用于转化、转导或转染适当的宿主细胞以重组产生各自的免疫原。用于产生免疫原的适当的宿主细胞包括原核细胞、酵母和高等真核细胞(例如，CHO和COS)。免疫原可各自使用蛋白质领域中已知的和常规实施的多种分离方法(例如，过滤、渗滤、色谱法(包括亲和色谱、高效液相色谱)和制备型电泳)的任一种从各自的宿主细胞或宿主细胞培养物分离。在某些实施方案中，如本申请中所述，随后可用药学上适当的赋形剂配制分离的免疫原以提供免疫原性组合物。
用于重组产生多肽的具体方法通常是公知的和常规使用的。例如，分子生物学方法由Sambrook等人(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989；也参见Sambrook等人，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory,New York，(2001))进行了描述。可如Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463(1977))和Amersham International plc测序手册中所描述的(包括对其的改进)，进行DNA测序。
载体颗粒
在另一个实施方案中，提供载体颗粒。载体颗粒包含本申请中描述的包含编码至少一种免疫原的多核苷酸序列的重组表达载体的任一种。在某些其它实施方案中，载体颗粒包含重组表达系统，所述表达系统包含一个含有编码至少一种诱导特定免疫反应的免疫原的多核苷酸序列的重组表达载体(也称为第一重组表达载体)。本申请中还提供了用于将编码至少一种免疫原(如本申请中描述的)的多核苷酸递送至靶细胞的方法。在具体实施方案中，靶细胞是作为抗原呈递细胞的免疫细胞；在更具体的实施方案中和如本申请中所描述的，靶细胞是树突细胞。此类方法包括将靶细胞与递送多核苷酸的媒介物接触(即，允许相互作用)。如本申请中所述，重组表达载体可以是编码至少两种免疫原和指导其表达的多顺反子。在具体实施方案中，如本申请中详细描述的，用于递送多核苷酸的方法包括通过给受试者施用载体颗粒(其包含含有编码免疫原的多核苷酸序列的重组表达载体)来接触细胞。载体颗粒、重组表达载体、多核苷酸和免疫原更详细地论述于本申请中。
在某些实施方案中，载体颗粒是病毒载体颗粒，在其它某些实施方案中，载体颗粒是来源于细菌例如单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙门菌属某些种(Salmonella spp.)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、大肠杆菌、志贺菌属某些种(Shigella spp.)和耶尔森氏菌属某些种(Yersinia spp.)(参见，例如，Paterson,Semin.Immunol(2010)22:183；Loessner,Expert Opin.Biol.Ther.(2004)4:157；Daudel,Expert Rev.Vaccines(2007)6:97)的颗粒。示例性病毒载体颗粒包括包含慢病毒载体基因组的慢病毒载体颗粒；包含痘病毒载体基因组的痘病毒载体颗粒；包含痘苗病毒载体基因组的痘苗病毒载体颗粒；包含腺病毒载体基因组的腺病毒载体颗粒；包含腺病毒相关病毒载体基因组的腺病毒相关病毒载体颗粒；包含疱疹病毒载体基因组(例如，单纯疱疹病毒I或II)的疱疹病毒载体颗粒；或包含α病毒载体基因组的α病毒载体颗粒。
在更具体实施方案中，载体颗粒是包含慢病毒载体基因组(在上文中对其进行了详细描述)的慢病毒载体颗粒。本申请中提供了用于靶向细胞和特别地通过使用慢病毒载体颗粒(其还可被称为病毒体、慢病毒颗粒)将编码至少一种免疫原的序列递送至DC来靶向树突细胞(DC)的方法和组合物。慢病毒载体颗粒包含来源于辛德比斯病毒E2的包膜糖蛋白变体和含有包括目标序列和任选地其它组分的基因组的重组表达构建体。糖蛋白变体显示相较于来自HR(一种参照辛德比斯病毒株)的糖蛋白减弱的对硫酸肝素的结合。包膜糖蛋白促进慢病毒载体颗粒对树突细胞的感染。如本申请中所用，“促进”感染等同于促进转导，是指包膜糖蛋白在促进或增强受体介导的假型化逆转录病毒或慢病毒颗粒至靶细胞的进入中单独地或与其它分子协同地作用的作用。
一般而言，慢病毒载体颗粒由包含一起编码产生功能载体颗粒所必需的组分的一个或多个质粒载体和/或整合的元件的细胞系产生。这类慢病毒载体颗粒通常是不能复制的，即它们仅能够进行单轮感染。最常见地，稳定地整合进入生产细胞染色体的多个质粒载体或单个表达盒被用于分隔产生慢病毒载体颗粒的不同基因组分；然而，可使用具有全部慢病毒组分的单个质粒载体。在一个范例中，利用一个或多个质粒转染包装细胞系，所述质粒包含病毒载体基因组(包括LTR，顺式作用包装序列和目标序列(即，至少一个编码一种免疫原的核苷酸序列)、至少一个编码病毒酶促和结构组分(例如，gag和pol)的质粒和至少一个编码虫媒病毒包膜糖蛋白的质粒。病毒颗粒通过细胞膜出芽，并且包含通常包括两个包含目标序列的RNA基因组的核心和靶向树突细胞的虫媒病毒包膜糖蛋白。在某些实施方案中，虫媒病毒糖蛋白是辛德比斯病毒E2糖蛋白，并且糖蛋白被工程化以具有相较于来自参照株HR的E2减弱的对硫酸肝素的结合。相较于HR E2糖蛋白序列，这通常包括至少一个氨基酸变化。同样地，E2糖蛋白可被工程化来增加针对树突细胞的靶向特异性。
不希望受理论束缚，病毒颗粒对细胞表面的结合据认为诱导胞吞作用，将病毒带入内涵体，触发膜融合，从而允许病毒核心进入细胞溶胶。对于某些利用整合慢病毒载体颗粒的实施方案，在逆转录和将产物迁移至细胞核后，病毒的基因组整合进入靶细胞基因组，从而将目标序列整合进入靶细胞的基因组。然而，为了减少插入诱变的可能性和促进指定免疫原的瞬时表达，其它实施方案利用非整合慢病毒载体颗粒(即，不整合进入靶细胞基因组的那些慢病毒载体颗粒)，但相反从附加体表达目标序列。在任一情况下，感染的DC随后表达目标序列(例如，免疫原和任选地刺激分子)。免疫原随后可被树突细胞加工并且呈递至T和B细胞，从而产生抗原特异性免疫反应。上述特定途径不是必需的，只要树突细胞能够刺激抗原特异性免疫反应即可。
可将病毒颗粒于本申请中描述的免疫原性组合物中给受试者施用，以提供预防性或治疗性效应。在感染树突细胞和表达免疫原产物后，产生针对产物的免疫反应。
树突细胞(DC)是用于启动和控制免疫反应的基本抗原呈递细胞。DC可沿两个途径发育：一个途径不依赖于单核细胞，第二途径基于单核细胞(Mo-DC)。血单核细胞，在利用GM-CSF和IL-4培养后，获得树突形态和较强的启动适应性免疫的能力(参见，例如，Bender等人，J.Immunol.Methods196(2):121(1996)；Sallusto等人，J.Exp.Med.179(4),1109(1994)，包括在人的体内(参见，例如，Dhodapkar等人，J.Clin.Invest104(2),173(1999)；Schuler-Thurner等人，J.Immunol.165(6):3492(2000))。更有效的免疫原特异性T细胞反应可通过使用载体颗粒疫苗，特别地在体内高效地将免疫原直接递送至Mo-DC而无需离体细胞操作的慢病毒载体颗粒系统来实现。人Mo-DC表达高水平的两种C型凝集素受体、甘露糖受体(MMR)和DC特异性细胞间粘附分子-3-捕捉非整联蛋白(DC-SIGN)。如在本申请中更详细地描述的，可使用经工程化以靶向DC-SIGN的重组慢病毒载体来将免疫原的表达靶向Mo-DC。
已如所描述的(参见本申请中的说明部分和美国专利申请No.12/842,609；国际专利申请公布No.WO2011/011584)修饰了由选择性结合DC-SIGN的工程化辛德比斯病毒(SIN)糖蛋白组成的DC-SIGN-靶向包膜SVGmu。慢病毒载体在单次免疫后诱导小鼠的高度功能性CD8T细胞免疫反应(参见，例如，Dai等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A(2009)；Yang等人，Nat.Biotechnol.26(3),326(2008))。该原型已通过两个主要修饰获得重大进展。本申请中描述的慢病毒载体包含基于天然SIN的糖蛋白包膜(称为SINvar1)，所述天然SIN是一种已知通过DC-SIGN受体感染真皮DC的虫媒病毒(参见，例如，Gardner等人，J.Virol.74(24),11849(2000)；Klimstra等人，J.Virol.77(22),12022(2003))，所述DC-SIGN受体经修饰阻止对遍在硫酸肝素受体的结合(参见，例如，Klimstra等人，J.Virol.72(9),7357(1998))。SINvar1包膜赋予相较于亲代SVGmu包膜增加的生产率和体内功能。载体也不能通过突变型整合酶(polD64V)的组合冗余地整合，使得其是无功能的(参见，例如，Apolonia等人，Mol.Ther.15(11),1947(2007))，并且载体骨架缺失LTR的U3区域(达到att)和3'LTR多嘌呤管道(PPT)。因此，除了失能的整合酶以外，载体骨架的组成阻止全长载体基因组转录(自身灭活突变)，从而在感染的DC中导致单个-LTR反转录的附加型dsDNA环，其不是用于染色体整合的模板(参见，例如，Bayer等人，Mol.Ther.16(12):1968(2008)；Breckpot等人，J.Virol.(2010)；Ma等人，Mol.Ther.10(1):139(2004))。约75%的亲代HIV基因组已从DC-NILV除去，包括除Rev外的所有调控和辅助蛋白质。在单次注射后，DC-NILV诱导高度强劲的肿瘤抗原特异性CD8T细胞反应。慢病毒载体接种的能力至少部分依赖于TLR3与TLR7模式识别受体的衔接(参见，例如，Beignon等人，J.Virol.(2009)；Breckpot等人，同上)。
病毒载体包膜
节肢动物媒介病毒(Arthropod-borne viruses)(虫媒病毒)是通过感染节肢动物媒介例如蚊子传播至宿主例如人、马或鸟的病毒。虫媒病毒被进一步分成亚家族的病毒，包括甲病毒和黄病毒，所述病毒具有正极性单链RNA基因组和含糖蛋白的包膜。例如，登革热病毒、黄热病毒和西尼罗病毒属于黄病毒家族，而辛德比斯病、西门利克森林病毒和委内瑞拉马脑炎病毒是甲病毒家族的成员(参见，例如，Wang等人，J.Virol.66,4992(1992))。辛德比斯病毒的包膜包括两种跨膜糖蛋白(参见，例如，Mukhopadhyay等人Nature Rev.Microbiol.3,13(2005))：E1，据认为负责整合，和E2，据认为负责细胞结合。已知辛德比斯病毒包膜糖蛋白假型化其它逆转录病毒，包括致癌逆转录病毒和慢病毒。
如本申请中所论述的，虫媒病毒包膜糖蛋白可用于假型化基于慢病毒的载体基因组。“假型化的”慢病毒是具有一种或多种由与慢病毒基因组不同的病毒编码的包膜糖蛋白的慢病毒颗粒。包膜糖蛋白可被修饰、突变或工程化，如本申请中所描述的。
辛德比斯病毒和其它甲病毒的包膜整合进入病毒颗粒膜的脂双层，并且通常包括多个拷贝的两种糖蛋白E1和E2。每一种糖蛋白具有跨膜区；E2具有约33个残基的细胞质结构域，然而E1的细胞质尾非常短(约2个残基)。E1和E2都具有附着在跨膜区中或附近的棕榈酸。E2最初被合成为前体蛋白质，所述前体蛋白质被弗林蛋白酶或其它Ca2+-依赖性丝氨酸蛋白酶切割成E2和称为E3的小糖蛋白。位于编码E2与E1的序列之间的是编码称为6K的蛋白质的序列。E3和6K是用于分别将E2和E1糖蛋白转移至膜中的信号序列。在辛德比斯病毒基因组中，辛德比斯包膜蛋白的编码区包括编码E3、E2、6K和E1的序列。如本申请中所用，虫病毒的“包膜”包括至少E2，并且还可包括E1、6K和E3。辛德比斯病毒株HR的包膜糖蛋白的示例性序列示于SEQ IDNO:17中。在某些具体的替代性实施方案中，可将E3/E2糖蛋白(其中E3序列对应于SEQ ID NO:20的残基1-65)或其变体(其中残基62-65为RSKR(SEQ IDNO：27))整合进入假型化病毒包膜。其它虫媒病毒的包膜糖蛋白的序列可见于公共可获得的数据库例如GenBank中。例如，编码登革热病毒糖蛋白的序列可见于登录号GQ252677.1(在GenBank中，除其它以外)和NCBI的病毒变异数据库(将GenBank登录号和病毒变异数据库的包膜糖蛋白序列通过引用并入本申请)中，编码委内瑞拉马脑炎病毒包膜糖蛋白的示例性序列见于登录号NP_040824.1(包膜糖蛋白的序列通过引用并入本申请)。
虽然树突细胞上针对甲病毒，特别地辛德比斯病毒的细胞受体迄今未被明确地鉴定，但一种受体似乎是DC-SIGN(参见，例如，Klimstra等人，J.Virol.77:12022,2003)。术语“附着”、“结合”、“靶向”等的使用可互换使用，并且无意表示辛德比斯病毒包膜糖蛋白与细胞组分之间的相互作用的机制。DC-SIGN(树突细胞特异性ICAM-3(细胞内粘附分子3)-捕捉非整联蛋白(也称为CD209)是能够快速结合和胞吞材料的C型凝集素样受体(参见，例如，Geijtenbeek等人Annu.Rev.Immunol.22：33-54,2004)。E2似乎通过DC-SIGN将病毒靶向树突细胞。如本申请中显示的，利用用辛德比斯病毒E2假型化的病毒载体颗粒对表达DC-SIGN的细胞的转导好于不表达DC-SIGN的同基因细胞(好至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍)。E2糖蛋白如何促进病毒感染的机制似乎牵涉DC-SIGN，可能地通过直接结合DC-SIGN或引起构象改变或一些其它机制。无论实际机制是什么，通过E2的靶向优先选择表达DC-SIGN的细胞，即树突细胞。
辛德比斯病毒似乎还通过硫酸肝素结合细胞(参见，例如，Klimstra等人，J.Virol.72：7357,1998；Burmes等人，J.Virol.72：7349,1998)。因为在大多数细胞类型的表面上发现硫酸肝素和其它细胞表面葡糖氨基聚糖，所以期望减小硫酸肝素与辛德比斯病毒包膜糖蛋白之间的相互作用。这可通减小辛德比斯病毒包膜对硫酸肝素的结合或增强辛德比斯病毒包膜对树突细胞的结合例如增加亲合力或两者来实现。作为结果，对可由其它细胞类型表达的其它分子的非特异性结合(即使包膜对于DC-SIGN是特异性的，这也可发生)减少，并且改善的特异性可用于避免不期望的副作用，例如可减小期望的免疫反应的副作用或与其它细胞类型的脱靶(off-target)转导相关的副作用。可选地或除表达DC-SIGN的细胞的相对特异性转导的有利方面外，利用辛德比斯病毒包膜E2糖蛋白假型化的病毒颗粒可提供优于利用糖蛋白例如VSV-G假型化的病毒颗粒的其它有利方面。此类有利方面的实例包括减少的补体介导的裂解和/或减少的神经元细胞靶向，这两者都被认为与VSV-G假型化病毒颗粒的施用相关。
在不同的范例中，慢病毒载体颗粒特异性结合表达DC-SIGN的细胞并且已减小或消除对硫酸肝素的结合。即，辛德比斯病毒包膜E2糖蛋白可被修饰来相对于其它细胞类型优先将病毒导向表达DC-SIGN的树突细胞。基于获自除其它研究外的结构研究和分子建模的信息，设计和产生包膜蛋白，尤其是E2和E1糖蛋白的变体序列，以便糖蛋白维持它们作为包膜蛋白的功能，但具有期望的结合特异性、亲合力或结合水平。可使用下述方法或本领域已知的其它方法产生每一种糖蛋白的候选变体序列并对其进行分析，以鉴定具有最期望的特征的包膜糖蛋白。
辛德比斯病毒E2的某些变体序列相较于SEQ ID NO:1在残基160上具有至少一个氨基酸改变。残基160被缺失或被改变成除谷氨酸外的氨基酸。改变最常见的是至少一个氨基酸的置换，但可选择地可以是一个或多个氨基酸的添加或缺失。优选地，任何额外的氨基酸在数量上是少数的并且不包含抗原性表位(例如，血凝素标记序列)，这可削弱安全性。当存在两个或更多个改变时，它们可以是相同的类型(例如，置换)或不同类型(例如，置换和缺失)。多个改变可分散在蛋白质序列中或连续位于蛋白质序列中。
例如，变体序列在SEQ ID NO:1的约残基50至约残基180的区域中包含至少一个氨基酸改变。该区域中的氨基酸参与对硫酸肝素的结合。通过减少E2的净正荷，与硫酸肝素的静电相互作用可被减小，从而导致减小的对硫酸肝素的结合。该区域中的候选带正电荷的氨基酸包括残基63、70、76、84、97、104、129、131、133、139、148、149、159上的赖氨酸和残基65、92、128、137、157、170、172上的精氨酸(参见，例如，Bear等人，Virology347：183-190,2006)(参见SEQ ID NO:1)。这些氨基酸的至少几个直接参与E2对硫酸肝素的结合。净正电荷可通过缺失赖氨酸或精氨酸或利用中性或带负电荷的氨基酸置换赖氨酸或精氨酸来减少。例如，这些赖氨酸和精氨酸的一个或多个可用谷氨酸或天冬氨酸来替代。某些实施方案具有至少一个赖氨酸70、76或159的置换。E2糖蛋白的示例性氨基酸序列示于SEQ ID NOS:3-16中。在其中E2表达为具有E3的糖蛋白的情况下，与天然E3/E2切割位点相邻的赖氨酸可被保留-即，识别序列和切割位点未被改变。或者，用不同内肽酶的识别序列替代天然内肽酶切割位点序列。
还以正面影响对树突细胞的结合的方式修饰E2的某些变体。参照HR序列的残基160上发现的谷氨酸的改变可增强对树突细胞的结合(参见，例如，Gardner等人，J.Virol.74,11849,2000)。改变，例如残基160的缺失或残基160的置换，可见于某些变体中。在特定的变体中，用不带电荷的氨基酸替换Glu，在其它变体中，用非酸性氨基酸替换Glu。通常地，用小的或脂肪族氨基酸(包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)之一替代Glu160。
其它变体包含两个或更多个氨基酸改变。通常地，在这些变体中，改变之一是Glu160，其余改变是横跨SEQ ID NO:1的约残基50至约残基180的区域中一个或多个赖氨酸和精氨酸的改变。某些变体包括Glu160至非酸性残基或缺失的改变以及利用非碱性氨基酸对赖氨酸70、赖氨酸76或赖氨酸159进行的一个或多个改变。一些特定变体包含Glu160至Gly、Lys70至Glu以及Lys159至Glu的改变；Glu160至Gly、Lys70、76和159至Glu的改变；Glu160的缺失以及Lys70和159至Glu的改变；以及Glu160的缺失和Lys70、76和159至Glu的改变。(参见，例如，SEQ ID NOS:3-16)。
在某些实施方案中，E2蛋白首先表达为与至少E3融合或与前导序列融合的多蛋白质(polyprotein)。无论前导序列是E3还是另一个序列，病毒包膜中的E2应当不含E3或其它前导序列。换句话说，E2优选不是E3/E2融合蛋白(例如，称为SVGmu的E3/E2融合蛋白)。在某些实施方案中，E2表达为E3-E2-6K-E1多蛋白质的部分。辛德比斯病毒天然地将E2表达为多蛋白质的部分，E3/E2、E2/6K和6K/E1的连接区域具有可被内肽酶识别的和切割的序列。通常地，E3/E2连接被弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样丝氨酸内肽酶在残基65与66之间切割。弗林蛋白酶具有对于被两个氨基酸分隔的成对精氨酸残基的特异性。为了维持弗林蛋白酶对E3/E2的切割，残基62-66(RSKRS；SEQ ID NO：26)应当维持间隔两个氨基酸的两个精氨酸残基和丝氨酸残基。或者，可用不同的切割序列替换E3/E2弗林蛋白酶切割序列或任何其它切割序列。识别和切割位点可合为一体的内肽酶，包括但不限于天冬氨酸内肽酶(例如，组织蛋白酶D、凝乳酶、HIV蛋白酶)、半胱氨酸内肽酶(菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、钙蛋白酶)、金属内肽酶(例如，胶原酶、嗜热菌蛋白酶)、丝氨酸内肽酶(例如，胰凝乳蛋白酶、因子IXa、因子X、凝血酶、胰蛋白酶)、链激酶。这些酶的识别和切割位点序列是公知的。
E2中的氨基酸，除已提及的那些氨基酸外，也可被改变。一般地，变体E2序列与参照E2序列可具有至少80%的氨基酸序列同一性，或其可具有至少82%、至少85%、至少87%、至少90%、至少92%、至少95%或至少98%的序列同一性。变体糖蛋白应当显示生物功能，例如促进具有包含E2的包膜的病毒颗粒对树突细胞的感染。实验已鉴定了似乎在病毒装配、对细胞表面的附着和感染的各个方面具有重要作用的包膜糖蛋白的区域。当制备变体时，下列信息可用作指导方针。E2的胞质尾区–大致残基408至415–对于病毒装配是非常重要的(参见，例如，West等人J.Virol.80：4458-4468,2006；以其整体并入)。其它区域参与形成二级结构(大致残基33-53)，和参与转运和蛋白质稳定性(大致残基86-119)(参见，例如，Navaratmarajah等人，J.Virol.363:124-147,2007；以其整体并入)。变体可保持跨膜区域(大致残基370-380)的疏水特征。变体可保留一个或两个N联糖基化位点残基NIT(残基196-198)和NFT(残基318-320)以及可保留一个或多个被棕榈酰化的位点(C-396、C416和C417)(参见，例如，Strauss等人，Microbiol.Rev.58,491-562,1994；第499-509页，通过引用整体并入本申请)。在另一方面，E2的许多区域可被改变而无有害的事件。例如，在E2中的许多不同位置上插入转座子仍导致有活力的病毒(参见，例如，Navaratmarajah，同上)。
在某些实施方案中，可将标记肽整合进入E3、6K或E1蛋白。为了一些目的，可将标记整合进入E2，但不期望将标记用于用于给人患者施用的产物中。作为短序列(例如，5-30个氨基酸)的标记肽可用于帮助检测包膜表达及其在病毒颗粒中的存在。为了检测目的，标记序列通常可通过抗体或化学药品来检测。标记的另一个用途是帮助纯化病毒颗粒。包含标记的结合伴侣的基质可用于吸附病毒。病毒的洗脱可通过利用从结合伴侣替换标记的部分的处理来实现，或当标记序列与可切割的序列连接时，利用适当的内肽酶的处理将方便地释放病毒。(参见，例如，
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目录,因子Xa蛋白酶系统)。为了病毒颗粒在动物受试者中使用的安全目的，通常期望除去标记肽。如果不去除标记，由针对标记的免疫反应可能发生。
适当的标记包括但不限于FLAG(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:35)(美国专利No.4,703,004，以其整体并入)(针对其的抗体可商购获得)、壳多糖结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、poly(His)(美国专利No.4,569,794，以其整体并入)、硫氧还蛋白、HA(血凝素)-标记等等。Poly(His)可被吸附至包含结合的金属离子例如镍或钴的亲和介质上，随后利用低pH介质洗脱。
可评估载体颗粒以测定整合进入病毒的包膜糖蛋白靶向树突细胞的特异性。例如，骨髓细胞的混合群体可从受试者获得和在体外培养。或者，可获得和使用表达或不表达DC-SIGN的同基因细胞系。可给骨髓细胞的混合群体或同基因细胞系施用重组病毒，并且可在培养细胞中测定整合进入病毒的报告基因的表达。某些实施方案可使用有限稀释分析，其中将细胞的混合群体分成部分，随后使用递减量的病毒(例如，每一部分使用1/2、1/5、1/10的病毒)分开地温育所述部分。在一些实施方案中，混合细胞群体中至少约50%或至少约60%、70%、80%或90%或至少约95%的感染细胞是表达DC-SIGN的树突细胞。在某些实施方案中，感染的树突细胞对感染的非树突细胞(或非DC-SIGN表达细胞)的比率为至少约2:1、至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约7:1、至少约8:1、至少约9:1、至少约10:1、至少约20:1、至少约30:1、至少约40:1、至少约50:1、至少约100:1、至少约200:1、至少约500:1、至少约1000:1、至少约5000:1、至少约10,000:1或更多。关于有限稀释，在输入病毒的更高稀释度(即，更少量)上通常看到更大的选择性。
假型化病毒颗粒的活性可通过多种技术的任一技术来测定。例如，测量感染效率(IU，感染单位)的优选方法是通过给细胞施用病毒颗粒，随后测量载体基因组中编码的产物的表达。可使用可被测定的任何产物。产物的一个方便类型是荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)。可使用的其它产物包括在细胞表面上表达的蛋白质(例如，通过抗体结合检测)、酶等。如果产物是抗原并且细胞是树突细胞，则可通过测定免疫反应来评估感染性/活性。此外，可能确定哺乳动物中的副作用。还可如下所述，在例如细胞培养物中测定特异性靶向树突细胞的能力。
还可制备包含本申请中描述的病毒颗粒的载体颗粒，测试其选择性和/或其促进靶细胞膜的渗入的能力。具有拥有未修饰糖蛋白的包膜的病毒颗粒可用作用于比较的对照。简而言之，使用标准感染测定，通过病毒感染表达包膜糖蛋白的受体的细胞。在指定的时间后，例如感染后48小时，可收集细胞，可通过例如流式细胞术测定被病毒感染的细胞的百分比。可通过计算被病毒感染的细胞的百分比来对选择性进行评分。类似地，可通过将被包含变体包膜的病毒感染的细胞的百分比除以被包含对应的野生型(未修饰的)包膜糖蛋白的病毒感染的百分比来定量变体包膜糖蛋白对病毒滴度的影响。特别合适的变体将具有最佳的选择性和感染滴度组合。一旦变体被选择，就可进行病毒浓度测定以确认这些病毒可被浓缩而不减弱活性。收集病毒上清液，通过超速离心进行浓缩。病毒的滴度可通过有限稀释病毒原液和感染表达包膜糖蛋白的受体的细胞，测量由病毒表达的产物的表达来测定，如上文中所描述的。
慢病毒载体颗粒至靶细胞内的进入是另一种类型的活性评估。BlaM-Vpr(β-内酰胺酶Vpr)融合蛋白已被用于评估HIV-1病毒的渗入；BlaM与辛德比斯病毒包膜糖蛋白例如E1或E2/E1融合蛋白的融合物可用于评估包膜蛋白在促进融合和至靶细胞内的渗入中的效力。可以例如通过利用一个或多个包含病毒元件、BlaM-Vpr和目标变体包膜(适当时，和亲和分子)的载体瞬时转染包装细胞来制备病毒颗粒。所得的病毒可用于感染表达靶向分子(或亲和分子)在结合的游离抑制剂(例如抗体)不存在或存在的情况下特异性结合的分子的细胞。随后用不依赖于CO2的介质洗涤细胞，用CCF2染料(AuroraBiosciences,San Diego,CA)装载细胞。于室温下温育以使切割反应完成后，用多聚甲醛固定细胞，随后利用流式细胞术和显微镜检查进行分析。蓝色细胞的存在表明病毒至细胞质的渗入；当添加阻断抗体时，预期存在更少的蓝细胞(参见，例如，Cavrois等人，Nat.Biotechnol.20:1151-54,2002)。
为了研究渗入是否依赖于低pH，以及为了鉴定具有期望的pH依赖性的包膜糖蛋白，可在感染步骤中添加改变pH的NH4Cl或其它化合物(NH4Cl将中和内涵体的酸性区室)。在NH4Cl的情况下，蓝色细胞的消失将表明病毒的渗入是低pH依赖性的。此外，为了确认活性是pH依赖性的，可将向溶酶体剂(lysosomotropic agent)例如氯化铵、氯喹、伴刀球霉素(concanamycin)、巴弗洛霉素Al、莫能星、尼日利亚菌素等添加至温育缓冲液中。这些试剂升高内涵体区室内的pH(参见，例如，Drose等人，J.Exp.Biol.200,1-8,1997)。这些试剂的抑制作用将揭示pH对于病毒融合和进入的作用。可比较显示不同致融分子(fusogenic molecule)病毒之间的不同进入动力学，并且选择最适当的用于特定应用。
基于PCR的进入测定可用于监控逆转录和测量病毒DNA合成的动力学作为病毒进入的动力学的指标(indication)。例如，将包含特定包膜蛋白分子的病毒颗粒与靶细胞例如293T细胞、DC或已被工程化来表达包膜蛋白分子的适当结合伴侣(受体)的或天然表达所述结合伴侣的任何其它细胞一起温育。立即地或在一段时间以后(以允许感染发生)，除去未结合的病毒，分析细胞等分的病毒核酸。从这些等分提取DNA，将其经历利用LTR特异性引物引发的扩增分析(通常在半定量测定中)。LTR特异性DNA产物的出现表明病毒进入的成功。
在利用病毒载体颗粒进行病毒感染后，免疫原由靶树突细胞表达。如果离体接触，随后例如通过注射将靶树突细胞转移回患者，在患者中它们与能够产生针对期望的抗原的免疫反应的免疫细胞接触。在优选实施方案中，将重组病毒注射入患者，在患者体内其原位转导靶向树突细胞。树突细胞随后表达与待治疗的疾病或障碍相关的特定抗原，并且患者能够引发针对疾病或障碍的有效免疫反应。
病毒载体基因组可包含编码超过一种免疫原的多核苷酸序列，在靶树突细胞被转导后，产生针对每一种被递送至细胞的免疫原的免疫反应。在一些实施方案中，免疫原与单个疾病或障碍相关。在其它实施方案中，免疫原与多个疾病或障碍相关。
在一些载体颗粒中，将激活和/或刺激DC的成熟的DC成熟因子与目标免疫原编码序列结合递送。在某些替代性实施方案中，通过在递送载体颗粒之前、与之同时或之后递送DC成熟因子来活化DC。可将DC成熟因子与载体颗粒的施用分开提供。
如本申请中所述，一种或多种免疫调节或DC成熟因子可由包含在载体颗粒中并且在颗粒进入或感染树突细胞后表达的一个或多个序列编码。还可将编码免疫调节因子的序列在单独的载体(与编码一种或多种免疫原的载体颗粒共转染的)中提供给包装细胞系。
本申请中描述的方法可用于受试者的过继免疫疗法。如上所述，鉴定针对其的免疫反应是所期望的免疫原。获得编码期望的免疫原的多核苷酸，将其包装进入载体颗粒。靶树突细胞获自患者，并用包含编码期望的免疫原的多核苷酸的载体颗粒进行转导。随后将树突细胞转移回患者内。
可体内注射载体颗粒(例如，本申请中描述的病毒载体颗粒)，在体内颗粒感染DC并且递送目标免疫原编码核苷酸序列。载体颗粒的量为至少3X106感染单位(IU)，可以为至少1X107IU、至少3X107IU、至少1X108IU、至少3X108IU、至少1X109IU或至少3X109IU。可以以选择地间隔，将来自受体的淋巴器官的DC用于测量表达，则例如通过观察标志物(例如GFP或萤光素酶)的表达(如果由存在于包含在载体颗粒中的重组表达载体中的多核苷酸序列共表达的话)。当载体颗粒是慢病毒载体颗粒时，核酸监控技术和逆转录酶(RT)活性的测量也可用于分析载体颗粒的生物分布。可从对抗原刺激的反应的量级和持久性测量来自载体颗粒(包括慢病毒载体颗粒)治疗的受体的外周血单核细胞、淋巴结、脾或恶性或靶病原体感染的组织的T细胞。可分析除DC外的组织细胞例如上皮细胞和淋巴样细胞的体内基因递送的特异性。
免疫反应
如本申请中所述，提供了用于诱导针对免疫原的免疫反应。参与免疫反应的免疫系统的细胞通常称为免疫细胞，包括淋巴细胞和非淋巴样细胞例如辅助细胞。淋巴细胞是特异性识别外来抗原并且对其作出反应的细胞，辅助细胞是对于某些抗原无特异性但参与免疫反应的识别期和活化期的那些细胞。例如，单核吞噬细胞(巨噬细胞)、其它白细胞(例如，粒细胞，包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)和树突细胞在免疫反应的诱导中用作辅助细胞。外来抗原对淋巴细胞的活化导致用于消除抗原的众多效应机制的诱导或引发。影响或参与效应机制的辅助细胞例如单核吞噬细胞也称为效应细胞。
淋巴细胞的主要种类包括B淋巴细胞(B细胞)、T淋巴细胞(T细胞)和天然杀伤(NK)细胞，所述细胞是大颗粒状淋巴细胞。B细胞能够产生抗体。T淋巴细胞还可细分成辅助T细胞(CD4+(在本申请中和本领域也称为CD4))和溶细胞性或细胞毒性T细胞(CD8+(在本申请中和本领域也称为CD8))。辅助细胞分泌促进T细胞和其它细胞(包括B细胞和巨噬细胞)的增殖和分化，以及招募并活化炎性白细胞的细胞因子。T细胞的另一个亚组(称为调节性T细胞或抑制性T细胞)主动地抑制免疫系统的活化并阻止病理性自身反应性，即自身免疫疾病。
本申请中描述的用于诱导免疫反应的方法用于诱导牵涉不同类型的T细胞(即，T淋巴细胞)的细胞介导的免疫反应。在细胞介导的反应中，不同类型的T淋巴细胞用于通过许多机制消除抗原。例如，能够识别特定抗原的辅助T细胞可通过释放可溶性介质例如细胞因子以招募免疫系统的另外的细胞参与免疫反应来作出反应。同样地，细胞毒性T细胞能够特异性识别抗原并且可通过结合并破坏或损害具有抗原的细胞或颗粒来作出反应。本申请中描述的用于诱导免疫反应的方法还可诱导体液反应，在本申请中和本领域也称为B细胞反应。体液反应包括产生特异性结合抗原(或免疫原)的抗体。抗体由称为浆细胞的分化的B淋巴细胞产生。
免疫反应是否被诱导以及宿主或受试者中诱导的免疫反应的类型可通过许多本申请中描述的以及本领域技术人员熟悉的公知的免疫学方法来测定。如本申请中所述，用于测定免疫反应的存在和水平的方法和技术包括例如荧光共振能量转移、荧光偏振、时间分辨荧光共振能量转移(time-resolved fluorescenceresonance energy transfer)、邻近闪烁分析(scintillation proximity assay)、报告基因测定、荧光淬灭酶底物法、生色酶底物法(chromogenic enzyme substrate)和电化学发光法(electrochemiluminescence)、免疫测定(例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定、免疫印迹、免疫组织化学等)、表面等离子体共振、基于细胞的测定例如全长报告基因的基于细胞的测定，以及功能测定(例如，测量免疫功能和免疫反应的测定)。
此类测定包括但不限于如下物质的存在和水平的体内或体外测定：可溶性抗体、可溶性介质例如细胞因子(例如，IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-6、IL-23、TNF-α和TGF-β)、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等，以及其它可溶性小肽、糖类、核苷酸和/或脂质介体。免疫测定还包括通过分析免疫系统的细胞的改变的功能或结构性质来测定细胞活化状态变化，所述改变的功能或结构性质是例如细胞增殖、改变的运动性、特定活性的诱导例如特定基因表达或溶细胞行为；细胞成熟，例如树突细胞响应刺激的成熟；Th1反应与Th2反应之间的关系的改变；由免疫系统的细胞产生的细胞分化，包括改变的表面抗原表达特征谱或细胞凋亡(程序化细胞死亡)的发生。用于进行这些和类似的测定的方法可见于例如Lefkovits(Immunology Methods Manual：TheComprehensive Sourcebook of Techniques,1998)中。也参见Current Protocols inImmunology；Weir,Handbook of Experimental Immunology,Blackwell Scientific,Boston,MA(1986)；Mishell和Shigii(编)Selected Methods in CellularImmunology,Freeman Publishing,San Francisco,CA(1979)；Green和Reed,Science281:1309(1998)以及其中引用的参考资料)。
测定特异性结合免疫原和各自的指定的目标抗原的抗体的存在和/或水平可使用本领域常规实施的几种免疫测定的任一种来测定，包括但不限于ELISA、免疫沉淀、免疫印迹、对流免疫电泳(countercurrentimmunoelectrophoresis)、放射免疫测定、斑点印迹测定、抑制或竞争测定等(参见，例如，美国专利No.4,376,110和4,486,530；Harlow等人，Antibodies：ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。还可进行免疫测定来测定特异性结合免疫原的抗体的种类和同种型。特异性结合免疫原并且可在检测已免疫的受试者的抗体特异性免疫反应的免疫测定用作对照的抗体(多克隆和/或单克隆抗体或其抗原结合片段)，通常可通过对于本领域技术人员来说是已知的多种技术的任一种来制备。参见，例如，Harlow等人，Antibodies：ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；Peterson,ILAR J.46:314-19(2005)；(Kohler等人，Nature,256:495-97(1976)；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511-19(1975)；Coligan等人(编),Current Protocols in Immunology,1:2.5.1-2.6.7(John Wiley&Sons1991)；美国专利No.4,902,614,4,543,439和4,411,993；Monoclonal Antibodies,Hybridomas：A New Dimension in BiologicalAnalyses,Plenum Press,Kennett等人(编)(1980)；Antibodies：A LaboratoryManual,Harlow和Lane(编),Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)；也参见，例如，Brand等人，Planta Med.70:986-92(2004)；Pasqualini等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:257-59(2004)。免疫原或其免疫原性片段，或具有免疫原或其免疫原性片段的细胞或颗粒可用于免疫动物以产生多克隆抗体或单克隆抗体。
细胞因子的水平可按照本申请中描述的和本领域实施的方法来测定，所述方法包括例如ELISA、ELISPOT、细胞内细胞因子染色和流式细胞术及其组合(例如，细胞内细胞因子染色和流式细胞术)。由免疫反应的抗原特异性引发或刺激引起的免疫细胞增殖和克隆扩增可通过如下进行来测定：分离淋巴细胞例如脾细胞或来自淋巴结的细胞，用抗原刺激细胞，随后例如通过氚化胸腺嘧啶的掺入或非放射性测定例如MTT测定等测量细胞因子产量、细胞增殖和/或细胞活力。本申请中描述的免疫原对Th1免疫反应与Th2免疫反应之间的平衡的作用可以例如通过测定Th1细胞因子例如IFN-、IL-12、IL-2和TNF-β以及2型细胞因子例如IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13的水平来检查。
CTL免疫反应的水平和记忆CD4T细胞反应的水平可通过本申请中描述的和本领域常规实施的许多免疫学方法的任一种来测定。可在施用本申请中描述的组合物、载体或载体颗粒的任一种之前测定CTL免疫反应的水平，随后将其用于与在提供记忆CD4T细胞帮助的组合物、载体或载体颗粒的一次或多次施用后，适当的时间点上的CTL免疫反应水平相比较。用于测定CTL活性的细胞毒性测定可使用本领域中常规实施的几种技术和方法的任一种(参见，例如，Henkart等人，“Cytotoxic T-Lymphocytes”in Fundamental Immunology,Paul(ed.)(2003Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA),第1127-50页，和其中引用的参考资料)来进行。
如本申请中所用，如果抗体以可检测水平，优选以大于或等于约104M-1，或大于或等于约105M-1，或大于或等于约106M-1，或大于或等于约107M-1或大于或等于约108M-1的亲和常数Ka与免疫原或其免疫原性片段反应，则结合伴侣或抗体被认为是“免疫特异性的”、“对于目标免疫原是特异性的”或“特异性结合”目标免疫原。抗体对于其关联抗原的亲和力通常也表达为解离常数KD，如果其以小于或等于10-4M，小于或等于约10-5M，小于或等于约10-6M，小于或等于10-7M或小于或等于10-8M的KD结合目标免疫原，则抗体特异性结合目标免疫原。
结合伴侣或抗体的亲和力可使用常规技术，例如由Scatchard等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA51:660(1949))描述的那些方法和利用表面等离子体共振技术(SPR；BIAcoreTM,Biosensor,Piscataway,NJ)来容易地测定。对于表面等离子体共振技术，将靶分子固定在固相上，随后暴露于沿流动池运行的移动相中的结合伴侣(或配体)。如果配体对固定靶的结合发生，则局部折射率改变，从而导致SPR角的改变，这可通过检测反射光的强度的变化来实时监测。可分析SPR信号的变化率来产生结合反应的缔合和解离相的表观速率常数(apparentrate constant)。这些值的比率给出表观平衡常数(亲和力)(参见，例如，Wolff等人，Cancer Res.53:2560-2565(1993))。
可从受试者获得生物样品以用于测定受试者的针对免疫原和/或各自的指定抗原的免疫反应的存在和水平，所述受试者已接受本申请中描述的免疫原性组合物(例如包含免疫原的免疫原性组合物和包含含有编码免疫原的核苷酸序列的重组表达载体的免疫原性组合物)的任一种或多种，或已接受两种免疫原性组合物，包括一种或多种包含根据本申请中描述的方法的佐剂的组合物。如本申请中所用，“生物样品”可以是血液样品(可从其制备血清或血浆)、活检样本、体液(例如，肺灌洗液、腹水、粘膜洗出液、滑液)、骨髓、淋巴结、组织外植体、器官培养物或来自受试者或生物来源的任何其它组织或细胞制剂。还可在接受任何免疫原性组合物之前，从受试者获得生物样品，所述生物样品用作用于确定基线(即，免疫前)数据的对照。
关于本申请中描述的用于测定免疫反应的所有免疫测定和方法，本领域技术人员还将容易地意识到和理解，当实施这些方法时，哪个对照可被适当地使用。反应组分的浓度、缓冲液类型、温度和足以允许反应组分相互作用的时间期限可按照本申请中描述的和本领域技术人员熟悉的方法来确定和/或调整。
诱导免疫反应的方法
本申请中提供了方法，所述方法包括施用至少两种不同的免疫原性组合物以诱导针对一种或多种抗原的适应性抗原特异性免疫反应。利用本申请中描述的免疫原性组合物双重免疫受试者导致体液免疫反应和细胞免疫反应(包括CD4T细胞反应和CD8T细胞反应)的诱导。可同时或以任一顺序相继地施用两种免疫原性组合物。因此，本申请中提供了用于诱导体液免疫反应和细胞反应的方法，所述免疫反应包括CD4T细胞反应和CD8T细胞反应(并且其可包括细胞毒性T细胞反应)，其中免疫反应的每一个反应对于免疫原是特异性的，从而对于各自的指定抗原是特异性的。这些方法包括施用包含至少一种免疫原(所述免疫原是分离的和/或重组产生的)的免疫原性组合物，和施用包含编码免疫原并且指导其表达的重组表达载体的第二免疫原性组合物。
在一个实施方案中，本申请中提供了通过施用免疫原性组合物来诱导受试者的对于一种或多种指定抗原是特异性的免疫反应的方法，所述免疫原性组合物包含至少一种能够引发针对指定抗原(所述抗原，为方便起见，在本申请中可称为第一指定抗原)的特异性免疫反应的免疫原。方法还包括同时施用或相继施用(即，在…..之前或在……之后)另一种(即，第二不同的/异源的)免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含含有编码免疫原的核苷酸序列的重组表达载体。重组表达载体还包含至少一个有效地连接至编码免疫原的核苷酸序列的调控序列，从而重组表达载体能够指导免疫原的表达。
在某些实施方案中，将根据本发明的方法施用的用于诱导免疫反应的重组表达载体整合进入载体颗粒(例如，病毒载体颗粒或细胞颗粒)。以使得颗粒能够被引入(即，递送至)靶细胞的方式构建重组表达载体或包含载体的载体颗粒。在某些实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞。在更具体的实施方案中，靶细胞是专职抗原呈递细胞例如树突细胞。免疫原(或其片段)随后在靶细胞中表达，免疫原或其片段被呈现在抗原呈递细胞的表面，并且诱导对于免疫原是特异性的，从而对于各自的指定抗原是特异性的免疫反应。
包含至少一种免疫原的免疫原性组合物(第一免疫原性组合物)还可包含至少一种佐剂，所述佐剂是药学上或生理上适合用于给需要对其施用免疫原性组合物的受试者施用。包含重组表达载体的免疫原性组合物(第二免疫原性组合物)还可包含佐剂。如果第一组合物和第二组合物都包含佐剂，则佐剂可以相同或不同。免疫原、各自的指定抗原、佐剂和重组表达载体以及载体颗粒在本申请中进行了详细地论述。
在另一个实施方案中，首先施用包含至少一种免疫原的免疫原性组合物(其还可包含佐剂)，随后将包含重组表达载体的免疫原性组合物与包含至少一种免疫原的免疫原性组合物(其还可包含佐剂)同时施用。换句话说，包含至少一种免疫原的免疫原性组合物(其还可包含佐剂)是第一或初免免疫，将包含重组表达载体的免疫原性组合物和第二剂量的包含至少一种免疫原的免疫原性组合物(其还可包含佐剂)作为加强组合物同时施用。
在其它实施方案中，提供了用于诱导免疫反应的方法，其中包含至少一种免疫原的免疫原性组合物还包含至少一种另外的免疫原(或至少第二免疫原)。在本申请中描述的方法的其它实施方案中，编码免疫原和包含在第二免疫原性组合物中的重组表达载体还编码至少一种另外的免疫原并且指导其表达。在另一个实施方案中，包含至少一种免疫原的免疫原性组合物还包含至少一种另外的免疫原，并且包含在另一种(或第二)免疫原性组合物中的重组表达载体编码至少一种另外的免疫原并且指导其表达。包含在第一和第二免疫原性组合物的每一种中的免疫原可以相同或不同。在具体实施方案中，包含在第一组合物中的和由包含在第二免疫原性组合物中的重组表达载体编码的至少一种另外的免疫原是相同的。如本申请中详细论述的，当超过一种免疫原包含在免疫原性组合物中或由重组表达载体编码时，每一种免疫原可诱导对于相同或不同的指定抗原是特异性的免疫反应。
因此，在一个具体实施方案中，提供了方法，在所述方法中，包含至少一种免疫原的免疫原性组合物(并且其还可包含佐剂)还可包含至少一种另外的免疫原(即，至少2、至少3、至少4、至少5、至6或更多种免疫原，其可被重申为2、3、4、5、6或更多种免疫原))。在某些实施方案中，包含至少2种免疫原(例如，2、3、4、5、6或更多种免疫原)的免疫原性组合物形成了多价免疫原性组合物。在当将2种或更多种免疫原与佐剂组合的情况下，免疫原性组合物可包含单独用佐剂配制的每一种免疫原，随后将佐剂化的免疫原组合以形成给受试者施用的免疫原性组合物。或者，可将2种或更多种免疫原与佐剂组合，随后配制在一起以形成免疫原性组合物。在某些具体实施方案中，每一种另外的免疫原(例如，第二、第三、第四、第五、第六免疫原等)的一种或多种可诱导针对与第一免疫原相同的指定抗原的免疫反应。在其它具体实施方案中，每一种另外的免疫原(例如，第二、第三、第四、第五免疫原等)可分别诱导对于不同的指定抗原(例如，第二、第三、第四、第五、第六等指定抗原)是特异性的免疫反应。
如上所述，在某些实施方案中，提供了方法，在所述方法中，免疫原性组合物中的重组表达载体可以是多顺反子并且包含编码至少一种另外的免疫原(即，至少2、至少3、至少4、至少5、至少6种或更多种免疫原，其可被重申为2、3、4、5、6或更多种免疫原))的核苷酸序列。重组表达载体被构建来包含所有与编码每一种免疫原的各自核苷酸序列在框内的适当的调控序列，以便每一种免疫原在已将重组表达载体引入其中的细胞中表达。在某些具体实施方案中，每一种另外的免疫原(例如，第二、第三、第四、第五、第六免疫原等)的一种或多种可诱导针对与第一免疫原相同的指定抗原的免疫反应。在其它具体实施方案中，每一种另外的免疫原(例如，第二、第三、第四、第五、第六免疫原等)可分别诱导对于不同的指定抗原(例如，第二、第三、第四、第五、第六指定抗原等)是特异性的免疫反应。
在其它具体实施方案中，提供了用于诱导免疫反应的方法，其中第一免疫原性组合物包含至少一种分离的/重组的免疫原(为方便起见，称为第一免疫原)并且还可包含至少一种另外的分离的/重组的组免疫原。在其它实施方案中，方法包括施用包含含有编码第一免疫原和编码至少一种另外的免疫原的重组表达载体的第二免疫原性组合物。在具体实施方案中，第一免疫原性组合物包含至少两种分离的/重组的免疫原，并且第二免疫原性组合物包含含有编码至少两种免疫原的核苷酸序列的重组表达载体。
当将两种或更多种免疫原被包含在含有分离的/重组的免疫原的免疫原性组合物中和/或由存在于重组表达载体中的多核苷酸序列编码时，每一种免疫原可包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包括指定的目标抗原的两个不同的免疫原性区域或表位。至少一种免疫原可包含至少一个B细胞表位，或可包含T细胞表位，或可包含包括B细胞表位和T细胞表位的氨基酸序列。第二不同的免疫原可包含对应于不同B细胞和/或T细胞表位的氨基酸序列。当将两种或更多种免疫原包含在免疫原性组合物(或由重组表达载体编码)时，至少一种免疫原包含至少一个T细胞表位区域。在更具体的实施方案中，至少一个T细胞表位区域能够诱导针对免疫原和各自的指定抗原的CD8T细胞特异性免疫反应。
在某些实施方案中，当期望诱导对于两种或更多种免疫原是特异性的免疫反应时，至少一种免疫原能够诱导包括至少一种特异性体液和/或CD4T细胞反应的免疫反应，并且至少一种另外的免疫原能够诱导包括至少一种特异性CD8T细胞免疫反应的免疫反应。因此，在一个实施方案中，本申请中提供了这样的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用(a)免疫原性组合物(其可被称为第一免疫原性组合物)，其包含第一分离的/重组的免疫原的(所述免疫原性组合物还可包含佐剂)和(b)第二免疫原性组合物，其包含编码第一免疫原和第二免疫原并且指导所述免疫原表达的重组表达载体，其中至少第二免疫原能够诱导特异性CD8T细胞反应。在某些实施方案中，至少两种免疫原的每一种具有诱导针对相同指定抗原的免疫反应的能力。或者，至少两种免疫原的每一种具有诱导对于不同的指定抗原(为方便起见，也分别称为第一和第二指定抗原等)是特异性的免疫反应的能力。
在本申请中描述的方法的具体实施方案中，给有此需要的受试者相继施用两种不同的免疫原性组合物。在一个具体实施方案中，方法包括在施用包含重组表达载体的免疫原性组合物之前施用包含至少一种分离的/重组的免疫原的免疫原性组合物(其还可包含佐剂)。换个方式来说，在某些实施方案中，该方法包括在施用包含分离的/重组的免疫原的免疫原性组合物(所述组合物还可包含佐剂)之后(即，在…..后)施用包含重组表达载体的免疫原性组合物。
在其它实施方案中，在施用包含分离的/重组的免疫原的免疫原性组合物(所述组合物还可包含佐剂)之前施用包含重组表达载体的免疫原性组合物。换个方式来说，在某些实施方案中，该方法包括在施用包含重组表达载体的免疫原性组合物后(即，在……之后)施用包含至少一种免疫原的免疫原性组合物(其还可包含佐剂)。
使用本申请中描述的双重免疫法和免疫原性组合物诱导免疫反应可通过使用多种不同的免疫方案来实现。一个免疫方案的示例性非穷举列表示于图6中。用于诱导适应性抗原特异性免疫反应的方法的这些和另外的实施方案在下文中和本申请中进行了更详细地描述。
在具体实施方案中，方法包括超过一次给受试者施用包含分离的/重组的免疫原的免疫原性组合物(为了便于引用，称为第一免疫原性组合物)和/或包含重组表达载体的免疫原性组合物(为了便于引用，称为第二免疫原性组合物)。在具体实施方案中，给受试者施用包含免疫原的免疫原性组合物(其还可包含佐剂)至少2、至少3、至少4、至少5或更多次(例如，两次(2次)、3次、4次、5次或更多次)。换种方式来说，给受试者施用多个剂量(即，2、3、4、5、6或更多个剂量)的第一免疫原性组合物。当多次(即，两次(2次)、3次、4次、5次或更多次)施用第一免疫原性组合物时，第一免疫原性组合物的每一次施用可以是相继的，并且第一组合物每一次和全部施用在第二组合物的施用之前进行。在其它具体实施方案中，在施用一个剂量的第一组合物之后和施用后续剂量的第一组合物之前施用第二组合物。例如，当给受试者2次施用第一组合物时，可在第一免疫原性组合物的第一施用(即，第一剂量)之后和在免疫原性组合物的第二施用(即，第二剂量)的施用之前施用第二组合物。在另一个具体实施方案中，例如当施用第一免疫原性组合物3次(即，施用3个剂量)时，可在第一免疫原性组合物的第一剂量之后和第二剂量之前；第二剂量之后和第三剂量之前；全部3个剂量之后施用第二组合物。在另一个具体实施方案中，例如当4次(即，施用4个剂量)施用第一免疫原性组合物时，在第一免疫原性组合物的第一剂量之后和第二剂量之前；第二剂量之后和第三剂量之前；第三剂量之后和第四剂量之前；或在全部4个剂量之后施用第二组合物。本领域技术人员可容易地理解，当施用5个或更多个剂量的第一免疫原性组合物时，可在第一免疫原性组合物的多个剂的任一个剂量之后，或在第一免疫原性组合物的全部剂量施用之后，施用第二组合物。在替代性实施方案中，施用第二免疫原性组合物一次，并且在第一免疫原性组合物的全部施用之前进行施用。
在另一个实施方案中，当多次(即，两次或更多次)施用第一免疫原性组合物时，可将一个剂量的第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的施用同时施用。例如，当给药方案包括施用2个剂量的第一免疫原性组合物时，可施用第一剂量，随后同时施用第二免疫原性组合物和第二剂量的第一免疫原性组合物。另举一例，当给药方案包括施用3个或更多个剂量的第一免疫原性组合物时，将3个剂量的至少一个与第二免疫原性组合物的施用同时施用，可在同时施用两种组合物之前，在同时施用两种组合物之后，施用其它剂量的第一免疫原性组合物，或可在同时施用两种组合物之前施用一个或多个剂量，并且在同时施用两种组合物之后施用剩余剂量的第一免疫原性组合物，这取决于期望按照特定给药方案施用的第一免疫原性组合物的剂量总数。
在某些具体实施方案中，施用第一免疫原性组合物2次，在(a)第一免疫原性组合物的第一施用之后和在第一免疫原性组合物的第二施用之前；(b)在第一免疫原性组合物的第二施用之后；(c)在第一免疫原性组合物的第一施用之前；或(d)在第一免疫原性组合物的第一或第二施用的同时，施用第二免疫原性组合物。在另一个具体实施方案中，施用第一免疫原性组合物3次，在(a)第一免疫原性组合物的第一施用之后和第一免疫原性组合物的第二施用之前；(b)在第一免疫原性组合物的第二施用之后和第一组合物的第三施用之前；(c)在第一免疫原性组合物的第三施用之后；(d)在第一免疫原性组合物的第一施用之前；或(e)在第一免疫原性组合物的第一、第二或第三施用的同时，施用第二免疫原性组合物。在另一个具体的实施方案中，施用第一免疫原性组合物4次，在(a)第一免疫原性组合物的第一施用之后和第一免疫原性组合物的第二施用之前；(b)在第一免疫原性组合物的第二施用之后和第一组合物的第三施用之前；(c)在第一免疫原性组合物的第三施用之后和第一组合物的第四施用之前；(d)在第一免疫原性组合物的第四施用之后；(e)在第一免疫原性组合物的第一施用之前；或(f)在第一免疫原性组合物的第一、第二、第三或第四施用的同时，施用第二免疫原性组合物。
在其它具体实施方案中，提供了这样的方法，在所述方法中，施用第二组合物(即，包含编码至少一种免疫原的重组表达载体的免疫原性组合物)2次，和施用第一免疫原性组合物(即，包含至少一种分离的/重组的免疫原并且还可包含佐剂的免疫原性组合物)一次、2次、3次、4次、5次或更多次。可以以任何顺序相继地施用第二组合物的两次施用(即，两个剂量)的每一次和第一免疫原性组合物的每一个施用(即，第一、第二、第三、第四或第五次给药)。在其它具体实施方案中，将第二免疫原性组合物的剂量的至少一个与第一免疫原性组合物的剂量同时施用。
如本申请中所述，在其它实施方案中，将包含分离的/重组的免疫原的免疫原性组合物(其还可包含佐剂)和包含含有编码免疫原的核苷酸序列的重组表达载体的免疫原性组合物同时施用至少一次。在一个这样的实施方案中，本申请中提供了这样的方法，所述方法包括施用(1)包含免疫原的免疫原性组合物(所述组合物还可包含佐剂)和以任一顺序相继施用，(2)第二剂量的包含免疫原的免疫原性组合物与包含编码免疫原的重组表达载体的免疫原性组合物。在一个具体实施方案中，在同时施用包含重组表达载体的免疫原性组合物和包含免疫原的免疫原性组合物(即，第二剂量的包含免疫原的免疫原性组合物)之前施用包含免疫原的免疫原性组合物。在另一个具体实施方案中，在同时施用包含重组表达载体的免疫原性组合物和包含免疫原的免疫原性组合物之后施用包含免疫原的免疫原性组合物。在更具体的实施方案中，将包含重组的/分离的免疫原的免疫原性组合物(即，第一免疫原性组合物)的每一个剂量与包含编码免疫原的重组表达载体的免疫原性组合物(即，第二免疫原性组合物)的剂量同时施用。更具体地，本申请中提供了这样的方法，在所述方法中，将第一剂量的第一免疫原性组合物与第一剂量的第二免疫原性组合物(也称为初免免疫)同时施用，随后共同施用第二剂量的第一免疫原和第二剂量的第二免疫原性组合物(也称为加强免疫)。在某些实施方案中，可通过同时施用第一和第二免疫原性组合物第三次免疫受试者。初免免疫与加强免疫之间的时间间隔在本申请中进行了更详细地论述，并且基于来自临床前和/或临床研究的结果来进行选择。
关于本申请中描述的包括相继施用免疫原性组合物的方法，剂量之间的时间间隔可由实施临床试验的领域内的技术人员来容易地确定。用于人受试者的给药方案还可通过来自临床前研究的结果和本领域的知识来告知。在某些实施方案中，免疫原性组合物的剂量的施用之间的时间间隔可以是至少1、2、3、4、5、6或7天或1、2、3、4、5、6、7或8周，或可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月，或至少1、2、3或4年。通过举例说明的方式，当在施用包含免疫原的免疫原性组合物(为方便论述，称为第一免疫原性组合物)的至少一个剂量之后施用包含重组表达载体的免疫原性组合物(为方便论述，称为第二免疫原性组合物)时，以本申请中描述的或可通过适当的临床前和临床研究测定的时间间隔之任一间隔在施用至少一个剂量的第一免疫原性组合物之后施用第二免疫原性组合物。在某些实施方案中，可用免疫原性组合物的一种或多种第三次、第四次或第五次免疫受试者。第三免疫与第二免疫之间的时间间隔可以与第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的施用之间的时间间隔相同或不同，或时间间隔可以不同。本申请中描述的相同或不同免疫原性组合物的施用之间的时间间隔与本申请中描述的任何施用方案(包括例如图6中举例说明的方案)相关。
通过按照上述方法施用本申请中描述的免疫原性组合物诱导的免疫反应包括适应性免疫反应，其包括对于存在于每一种免疫原性组合物中的每一种免疫原是特异性的，从而对于各自针对每一种免疫原的指定抗原是特异性的体液反应和细胞反应(所述免疫反应包括CD4免疫反应和CD8免疫反应)。当相继施用包含分离的/重组免疫原的免疫原性组合物(所述组合物还可包含佐剂)和包含含有编码免疫原的核苷酸序列的重组表达载体的免疫原性组合物时，至少第一施用的组合物(其也可称为初免组合物)能够诱导包括对于免疫原和各自的指定抗原是特异性的CD4T细胞反应的免疫反应。由初免组合物诱导的由免疫反应还可包括对于免疫原和各自的指定抗原是特异性的抗体反应。第二次施用的免疫原性组合物(其还可称为加强组合物)诱导包括对于免疫原和指定抗原是特异性的CD8T细胞反应的免疫反应。加强组合物的施用还可诱导或加强抗原特异性抗体反应和/或CD4T细胞特异性免疫反应。在某些具体实施方案中和如本申请中所述，包含含有编码免疫原的核苷酸序列的重组表达载体的免疫原性组合物的施用能够诱导免疫反应，所述免疫反应至少包括诱导对于免疫原和各自指定抗原是特异性的CD8T细胞免疫反应。
通过本申请中描述的免疫原性组合物的第一施用(即，第一给药)诱导的免疫反应可包括各自对于包含在免疫原性组合物中的免疫原是特异性的体液免疫反应和CD4T细胞免疫反应。第一给药可包括施用包含分离的/重组的免疫原的免疫原性组合物(其还可包含佐剂)或包含编码免疫原并且指导其表达的重组表达载体的免疫原性组合物，或第一给药可包括同时施用前述免疫原性组合物的每一种。第二免疫(即，加强免疫)包括施用此类免疫原性组合物的一种或多种并且能够诱导包括特异性CD8T细胞免疫反应的免疫反应。
在具体实施方案中，包含至少一种分离的/重组的免疫原(并且其还可包含佐剂)的免疫原性组合物(也称为第一免疫原性组合物)能够诱导免疫反应，所述免疫反应包括对于免疫原是特异性的，从而对于各自指定抗原是特异性的CD4T细胞反应，并且所述免疫反应还可包括诱导针对免疫原的体液反应(即，特异性抗体反应或抗原特异性抗体反应)。包含含有编码免疫原的核苷酸序列的重组表达载体的其它免疫原性组合物(或第二免疫原性组合物)能够至少诱导对于免疫原是特异性的CD8T细胞反应，从而能够诱导对于指定抗原是特异性的CD8T细胞反应。
因此，提供了用于诱导细胞毒性T细胞反应(CTL)的方法，包括给有此需要的受试者施用包含至少一种分离的/重组的免疫原的免疫原性组合物(所述组合物还可包含佐剂)以及相继地和/或同时施用包含含有编码免疫原的核苷酸序列的重组表达载体的免疫原性组合物。这类方法可按照本申请中描述的施用两种免疫原性组合物的步骤的任何步骤来进行，包括多个给药方案。CTL反应对于具有或呈现免疫原和/或各自的指定抗原的细胞或颗粒是特异性的。在某些具体实施方案中，例如，当免疫原是肿瘤相关抗原时，CTL反应对于表达免疫原和/或指定抗原的肿瘤细胞是特异性的。免疫原和/或指定抗原可存在于肿瘤细胞表面上，从而对于细胞毒性T细胞是可及的。本申请中详细描述的方法和组合物从而用于减小包含多个具有或表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的肿瘤的发生或复发的可能性。
在其它具体实施方案中，免疫原和指定抗原可来自感染性疾病微生物，例如病毒、细菌、寄生虫或真菌，并且CTL免疫反应分别对于表达或具有免疫原和/或指定抗原的病毒、细菌、寄生虫或真菌是特异性的。本申请中描述的方法从而用于预防或治疗由各自感染性疾病生物体引起的感染。
同样地如本申请中所述，在某些实施方案中，用于诱导CTL反应的这类方法可包括施用重组表达载体，所述载体是多顺反子并且包含编码至少一种另外的免疫原(即，至少2、至少3、至少4、至少5、至少6种或更多种免疫原，其可被重申为2、3、4、5、6或更多种免疫原))的核苷酸序列。在某些具体实施方案中，在每一种另外的免疫原(例如，第二、第三、第四、第五、第六免疫原等)表达后，每一种免疫原可诱导针对与第一免疫原相同的指定抗原的免疫反应。在其它具体实施方案中，每一种另外的免疫原(例如，第二、第三、第四、第五、第六免疫原等)可分别诱导对于不同的指定抗原(例如，第二、第三、第四、第五、第六等)是特异性的免疫反应。在其它某些实施方案中，包含至少一种分离的/重组的免疫原的免疫原性组合物可包含至少两种分离的/重组免疫原(例如，2、3、4、5、6或更多种免疫原)以形成多价免疫原性组合物。在当将两种或更多种免疫原与佐剂组合的情况下，免疫原性组合物可包含用佐剂单独配制的每一种免疫原，随后将佐剂化的免疫原组合以形成给受试者施用的免疫原性组合物。或者，可将两种或更多种免疫原与佐剂组合，随后配制在一起以形成免疫原性组合物。在某些具体实施方案中，每一种另外的免疫原(例如，第二、第三、第四、第五、第六免疫原等)可诱导针对与第一免疫原相同的指定抗原的免疫反应。在其它具体实施方案中，每一种另外的免疫原(例如，第二、第三、第四、第五免疫原等)可分别诱导对于不同的指定抗原(例如，第二、第三、第四、第五、第六等)是特异性的免疫反应。
在用于实施本申请中描述的方法和用途的更具体的实施方案中，可用免疫原配制佐剂例如无毒性脂质A相关佐剂。在其它具体实施方案中，可将佐剂例如无毒性脂质A相关佐剂与包含含有编码免疫原的核苷酸序列的重组表达载体的免疫原性组合物组合施用。在更具体实施方案中，无毒性脂质A相关佐剂是GLA。在更具体实施方案中，用SE配制GLA以形成用于本申请中描述的方法和组合物的稳定的水包油乳液(GLA/SE)。
当将佐剂包含在含有至少一种分离的/重组的免疫原的免疫原性组合物中时，通常在给受试者施用之前将佐剂与免疫原组合(即，配制在一起，混合)。在替代性实施方案中，免疫原性组合物包含至少一种免疫原并且可分开地但同时给受试者施用佐剂。当分开地同时施用包含免疫原和佐剂的免疫原性组合物时，可经由相同的途径在相同的部位施用每一种免疫原性组合物和佐剂，或可经由不同途径在相同部位施用所述免疫原性组合物和佐剂，或可通过相同或不同的施用途径在不同的部位施用所述免疫原性组合物和佐剂。在某些实施方案中，佐剂是无毒性脂质A相关佐剂例如GLA/SE。
当将佐剂包含在含有重组表达载体的免疫原性组合物时，可将佐剂与重组表达载体(或包含重组表达载体的载体颗粒)组合(即，配制在一起，与……混合)以形成免疫原性组合物。在其它实施方案中，包含重组表达载体(或包含重组表达载体的载体颗粒)的免疫原性组合物是单独的组合物，可经由相同的途径在相同部位施用所述组合物，或可经由不同的途径在相同部位施用所述组合物，或通过相同或不同的施用途径在受试者的不同部位施用所述组合物。在某些实施方案中，佐剂是无毒性脂质A相关佐剂例如GLA/SE。
在另一个具体实施方案中，本申请中描述的用于诱导特定免疫反应的免疫法包括给有此需要的受试者施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含佐剂GLA/SE和能够诱导对于指定抗原是特异性的免疫原。如本申请中所述，GLA靶向TLR4。TLR4在TLR家族当中是独特的，因为下游信号转导通过MyD88-和TRIF-依赖性途径进行。综上所述，这些途径刺激DC成熟、抗体加工/呈递、T细胞引发和细胞因子的产生(例如，IL-12、IFNα/β和TNFα)(参见，例如，Iwasaki等人，Nat.Immunol.5:987(2004))。
在某些如本申请中所述的实施方案中，将重组表达载体整合进入载体颗粒，本申请中描述的方法包括施用包含含有编码免疫原并且指导其表达的重组表达载体的免疫原性组合物。在更具体的实施方案中，载体颗粒是病毒载体颗粒，例如慢病毒载体颗粒。如本申请中所述，慢病毒载体颗粒可以是DC-NILV，一种使用修饰辛德比斯病毒包膜糖蛋白来选择性进入树突细胞(DC)的自身灭活的非整合性慢病毒载体(lentivector)。在载体进入DC后，将通过由载体编码的免疫原的活跃转录和翻译产生的抗原性肽引入MHC I类呈递途径。不希望受任何特定理论束缚，DC-NILV的使用产生强劲的CD8T细胞反应。
在一个实施方案中，将包含重组表达载体或含有重组表达载体的载体颗粒的免疫原性组合物直接给受试者施用。在其它具体实施方案中，可从将对其施用免疫原性组合物的受试者分离靶细胞，将载体颗粒离体地引入靶细胞。随后将包含载体颗粒的靶向细胞引入受试者。
在更具体的实施方案中，双重免疫法包括施用与佐剂GLA/SE组合的包含目标重组/分离的免疫原的免疫原性组合物。该方法还包括施用包含编码和表达免疫原的DC-NILV的第二免疫原性组合物。使用这类免疫原性组合物的示例性但非穷举的免疫方案示于下面的表1中。
表1：免疫方案
*DC-NILV包含编码免疫原的多核苷酸。
本申请中描述的方法用于诱导对于免疫原和其各自的指定抗原的任一种是特异性的免疫反应。如本申请中详细描述的，目标指定抗原可以是肿瘤相关抗原或来自感染性微生物(例如，病毒、细菌、真菌或寄生虫)的抗原。在某些具体实施方案中，本申请中描述的方法用于诱导对于肿瘤相关抗原是特异性的免疫反应，所述肿瘤相关抗原包括但不限于肾细胞癌抗原、前列腺癌抗原、间皮瘤抗原、胰腺癌抗原、黑色素瘤抗原、乳腺癌抗原、肺癌抗原和卵巢癌抗原；在更具体的实施方案中，目标抗原是前列腺癌抗原，例如前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、NKX3.1或前列腺特异性膜抗原。
在另一个具体实施方案中，提供了用于免疫受试者以抗病毒例如HIV、CMV、肝炎病毒、EBV、RSV、VSV、流感病毒或HSV-2或本申请中或本领域中描述的任何其它感染性病毒的组合物和方法。因此，本申请中描述的方法可用于诱导对于病毒抗原是特异性的免疫反应。在更具体的实施方案中，目标指定抗原是HSV-2蛋白例如gD和UL19。
本申请中提供的双重免疫法可用于诱导针对具有或表达至少一种指定的目标抗原的细胞、颗粒或微生物的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。在具体实施方案中，本申请中提供了用于诱导针对表达至少一种指定的目标抗原的肿瘤细胞的CTL反应的方法。在具体实施方案中，指定抗原(或其部分)存在于肿瘤细胞的外细胞表面上并且暴露于细胞外环境。本申请中描述的方法用于减少具有、表达或分泌为指定的目标抗原的肿瘤相关抗原的肿瘤(其包含多个肿瘤细胞)的发生或复发的可能性(即，以统计学上、临床上或生物学上显著的方式减小发生或复发的可能性)。
在其它具体实施方案中，本申请中描述的方法诱导针对微生物例如病毒、寄生虫、细菌或真菌细胞的CTL反应。指定抗原可以是通常由微生物分泌的微生物抗原，或可以是存在于微生物的细胞表面上，从而具有一个或多个暴露的并且可被受试者的免疫系统的分子和细胞识别、与所述分子和细胞相互作用的免疫原性区域的微生物抗原。因此，本申请中描述的包括双重免疫受试者的方法用于治疗和/或预防(即，以统计学上、临床上或生物学上显著的方式减小发生的可能性)微生物感染，在不给受试者施用本申请中描述的免疫原性组合物的情况下所述感染可恶化或可发生。
如由医学领域的技术人员所理解的，术语“治疗”和“医疗”是指受试者(即，患者，宿主，其可以是人或非人动物)的疾病、障碍或病况的医学管理(参见，例如，斯特德曼医学词典(Stedman’s Medical Dictionary))。一般而言，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗和/或预防益处的量提供本申请中详述的免疫原和任选地佐剂。由治疗性治疗和/或预防性或防治性方法产生的治疗和/或预防益处包括例如改善的临床结果，其中目标是阻止或减慢或延迟(减轻)不期望的生理变化或障碍，或阻止或延迟(减轻)这样的疾病或障碍的扩张或严重度。来自治疗受试者的有益的或期望的临床结果包括但不限于由待治疗的疾病或障碍引起的或与之相关的症状的缓和、减轻或缓解；减少的症状发生；改善的生物质量；更长的无病状态(即，减小受试者呈现症状(疾病的诊断是基于所述症状进行的)的可能性或倾向)；疾病程度的减轻；疾病的稳定(即，未恶化)状态；疾病进展的延迟或减慢；疾病状态的改善或缓和；和缓解(无论是部分还是完全)，无论是检测的还是不可检测的；和/或总存活率。“治疗”还可意指当与如果受试者不接受治疗所预期的存活率相比较延长存活率。需要本申请中描述的方法和组合物受试者包括已患有疾病或障碍的受试者以及易于患有所述疾病或障碍或处于发生所述疾病或障碍的风险中的受试者。需要预防性治疗的受试者包括将在其中预防(即，减小疾病或障碍发生或复发的可能性)疾病、病况或障碍的受试者。由本申请中描述的组合物(和包含组合物的制剂)和方法提供的临床益处可通过体外测定、临床前研究和组合物的施用预期对其有益的受试者的临床研究的设计和执行来评价。适当的临床前研究和临床研究的设计和执行可由相关领域内的技术人员来容易地进行。
可将分离的/重组的免疫原、重组表达载体和/或载体颗粒于药学上或生理上可接受的或适当的赋形剂或载体中给受试者施用。药学上接受的赋形剂是生物相容性媒介物，例如生理盐水，其更详细地描述于本申请中，适合于给人或其它非人受试者(包括非人哺乳动物受试者)施用。
关于重组表达载体的施用，治疗有效量提供能够在治疗的人或非人动物中产生医学上期望的结果(即，充足量的免疫原被表达来以统计上、生物学上和/或显著的方式诱导或增强对于免疫原是特异性的免疫反应(体液和/或细胞介导的反应，包括细胞毒性T细胞反应))。如医学领域中所公知的，用于任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的尺寸、身体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状态和将同时施用的其它药物。剂量可变化，但用于施用包含重组表达载体的载体颗粒的优选剂量足以提供约106至1012个拷贝的载体多核苷酸分子。
可以以适合于待治疗(或预防)的疾病或病况的方式(如由医学域内的技术人员确定的)施用药物组合物，包括本申请中描述的免疫原性和佐剂组合物。组合物施用的适当剂量和适当持续时间以及频率由这样的因素决定，如患者的健康状况、患者的尺寸(即，重量、质量或身体面积)、患者的疾病的类型和严重度、活性成分的具体形式和施用方法。一般而言，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗和/或预防益处(例如本申请中所描述的，包括改善的临床结果，例如更频繁的完全或部分缓解，或更长的无病存活率和/或总存活率，或症状严重度的减轻)的量提供组合物。为了预防用途，剂量应当足以阻止、延迟与疾病或障碍相关的疾病的发作，减轻疾病的严重度。按照本申请中描述的方法施用的免疫原性组合物的预防性益处可如下来测定：进行临床前研究(包括体外和体内动物研究)和临床研究，分析通过适当的统计学、生物学以及临床方法和技术(所有所述方法和技术可由本领域技术人员来容易地实施)从其获得的数据。
一般而言，存在于剂量中的或通过存在于剂量中的编码多核苷酸原位产生的免疫原(包括如本申请中描述的融合多肽)的量在约0.01μg至约1000μg/kg宿主的范围内变化。足以提供有效的疗法的最小剂量的使用通常是优选的。通常可使用适合于待治疗或预防的病况的测定来监测患者的治疗性或预防性效力，所述测定对于本领域技术人员来说是熟悉的，并且在本申请中进行了描述。当以液体形式施用时，适当的剂量大小将随患者的尺寸而变化，但对于10-60kg的受试者，通常在约1ml至约500ml(包括约0.01μg至约1000μg/kg)的范围内变化。最佳剂量通常可使用实验模型和/或临床试验来确定。最佳剂量可取决于受试者的身体质量、身体面积、体重或血液体积。如本申请中所述，适当的剂量还可取决于患者(例如，人)的状况，即疾病分期、一般健康状态以及年龄、性别和体重，以及对于医学领域的技术人员来说是熟悉的其它因素。
可配制用于任何适当的施用方式的药物组合物，所述施用方式包括例如局部、口服、经肠、经鼻(即，鼻内)、吸入、硬膜内、经直肠、经阴道、眼内、结膜下、舌下、真皮内、结节内、瘤内、经皮肤或胃肠外施用，包括皮下、经皮、静脉内、肌内、胸骨内、海绵窦内、尿道内(intrameatal)或尿道内注射或输注。施用方法更详细地描述于本申请中。
对于胃肠外施用，载体优选包括水、盐水、醇、脂肪、石蜡或缓冲剂。对于口服施用，可使用上述赋形剂或固体赋形剂或载体的任一种，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、高岭土、甘油、淀粉糊精、海藻酸钠、羧甲基纤维素、乙基纤维素、葡萄糖、蔗糖和/或碳酸镁。
包含重组/分离的免疫原的免疫原性组合物和包含重组载体构建体或载体颗粒的免疫原性组合物可被配制来用于通过提供有效剂量的免疫原的任何途径递送。此类施用方法包括口服施用或通过注射进行的递送，并且可以以液体形式存在。脂质药物组合物可包括例如下列试剂的一种或多种：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏液、等渗氯化钠、可用作溶剂或悬浮介质的不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂；抗氧化剂；螯合剂；缓冲剂和用于张力的调整的试剂例如氯化钠或葡萄糖。可将胃肠外制剂封装在由玻璃或塑料制造的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶。生理盐水的使用是优选的，可注射药物组合物优选是无菌的。
对于包含核酸例如本申请中描述的重组表达载体的药物组合物，核酸分子可存在于本领域技术人员已知的多种递送系统的任一种中，包括核酸以及细菌、病毒和哺乳动物表达系统例如，本申请中提供的载体颗粒和重组表达构建体。用于将多核苷酸(例如，DNA)整合进入此类表达系统的技术对于本领域技术人员来说是公知的。在其它某些实施方案中，通常为DNA的重组表达载体还可以是“裸露的”，如例如Ulmer等人，Science259:1745-49(1993)中描述的和由Cohen,Science259:1691-92(1993)综述的。裸露DNA的吸收可通过将DNA涂覆在生物可降解珠粒上来增加，所述珠粒被高效地转运至细胞中。
可按照本领域内描述的几种方法的任一种将核酸分子递送入细胞(参见，例如，Akhtar等人，Trends Cell Bio.2:139(1992)；Delivery Strategies for AntisenseOligonucleotide Therapeutics,编者Akhtar,1995,Maurer等人，Mol.Membr.Biol.16:129-40(1999)；Hofland和Huang,Handb.Exp.Pharmacol.137:165-92(1999)；Lee等人，ACS Symp.Ser.752:184-92(2000)；美国专利No.6,395,713；国际专利申请公布No.WO94/02595)；Selbo等人，Int.J.Cancer87:853-59(2000)；Selbo等人，Tumour Biol.23:103-12(2002)；美国专利申请公布No.2001/0007666和2003/077829)。本领域技术人员已知的此类递送方法包括但不限于脂质体内的封装、通过离子电渗法或通过掺入其它媒介物例如生物可降解聚合物；水凝胶；环糊精(参见，例如，Gonzalez等人，Bioconjug.Chem.10:1068-74(1999)；Wang等人，国际申请公布No.WO03/47518和WO03/46185)；聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和PLCA微球体(也用于肽和多肽或其它物质的递送)(参见，例如，美国专利No.6,447,796；美国专利申请公布No.2002/130430)；生物可降解纳米颗粒；和生物粘附微球体或通过蛋白质性质的载体(国际申请公布No.WO00/53722)。在另一个实施方案中，核酸分子还可利用聚乙烯亚胺及其衍生物例如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物(也参见，例如美国专利申请公布No.2003/0077829)来配制或复合。
在本申请中描述的方法的具体实施方案中，受试者是人或非人动物。需要本申请中描述的治疗的受试者可显示本申请中描述的疾病、障碍或病况的症状或后遗症(sequelae)或可处于发生所述疾病、障碍或病况的风险中。可治疗的非人动物包括哺乳动物例如非人灵长类动物(例如，猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿类动物(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、白鼬、兔)、兔形目动物、猪(例如，猪、迷你猪)、马科动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物以及其它家庭、农场和动物园动物。
本申请中提供的组合物可以以不同形式存在，例如以固体、液体、粉剂、含水或冻干形式存在。用于施用载体颗粒(包括病毒载体颗粒和细菌载体颗粒)、免疫原性组合物和重组表达载体的适当药物赋形剂和载体的实例在本领域是已知的。此类赋形剂、载体和/或添加剂可利用常规方法来配制，以及可以以适当的剂量给受试者施用。可包含在本申请中描述的组合物中的稳定剂例如脂质、核酸酶抑制剂、聚合物和螯合剂可帮助保护组合物和组合物的组分免受在体内的降解。
可将本申请中提供的载体颗粒(包括病毒载体颗粒和细菌载体颗粒)、免疫原性组合物、佐剂组合物和重组表达载体包装为试剂盒。试剂盒可任选地包括一个或多个组件例如使用说明书、装置和另外的试剂，以及组件例如试管、容器和注射器以用于实施方法。示例性试剂盒可任选地包括使用说明书，用于检测载体颗粒的装置或试剂，重组表达载体或受试者的免疫原，以及用于给受试者施用组合物的装置。
本申请中还涉及包括编码免疫原的多核苷酸的试剂盒。这样的试剂盒还可包括至少一种编码病毒包装组分的质粒和编码辛德比斯病毒E2糖蛋白变体的载体。一些试剂盒可包括至少一种编码病毒包装组分的质粒、编码辛德比斯病毒E2糖蛋白变体的载体和编码至少一种DC成熟因子的载体。
本申请中还涉及包括编码目标序列(通常编码抗原或免疫原)的病毒载体和任选地编码DC成熟因子的多核苷酸序列的试剂盒。在一些试剂盒中，试剂盒包括至少一种编码病毒包装组分的质粒和编码辛德比斯病毒E2糖蛋白变体的载体。
试剂盒还可包括说明书。说明书通常描述用于施用的方法，包括用于测定受试者的正确状态、适当剂量的量的方法和施用组合物的适当施用方法。说明书还可包括用于在治疗时间期间监控受试者的指导方针。
本申请中提供的试剂盒还可包括用于给受试者施用本申请中描述的每一种免疫原性组合物和/或用于施用佐剂组合物的装置。可将本领域中已知的用于施用药剂、免疫原性组合物和疫苗的多种装置的任一种包括在本申请中提供的试剂盒中。示例性装置包括但不限于皮下注射针、静脉内注射针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器例如点眼药器(eyedropper)。通常地，用于施用组合物的装置与试剂盒的活性组分是相容的。例如，可将无针注射装置例如高压注射装置与不被高压注射破坏的载体颗粒、多核苷酸和多肽包括在试剂盒中，但通常不包括在包括可被高压注射破坏的载体颗粒、多核苷酸和多肽的试剂盒中。
示例性实施方案
在公开内容的一些实施方案中，给有此需要的受试者施用多个免疫原性组合物。可根据不同的方面改变下列参数：免疫原性组合物的剂量数、免疫原性组合物的施用途径、受试者上用于施用免疫原性组合物的部位、免疫原性组合物中的活性成分的浓度或量以及免疫原性组合物中的免疫原和/或佐剂的数目。
除了在详述中描述的前述实施方案的任一种外，实施方案还涉及包括下列实施方案的任一种或其任意组合：
1.一种用于诱导受试者的免疫反应的方法，所述方法包括：
(a)给受试者施用第一剂量的第一免疫原性组合物，所述组合物包含：
(1)包含(i)第一指定抗原、(ii)其免疫原性片段或(iii)能够诱导对于第一指定抗原是特异性的免疫反应的其变体的任一种的第一多肽，和
(2)TLR4激动剂佐剂或无毒性脂质A相关佐剂；和
(b)给受试者施用第一剂量的包含优先将重组表达载体递送至抗原呈递细胞的载体颗粒的第二免疫原性组合物，其中所述重组表达载体包括核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含(i)第一指定抗原、(ii)其免疫原性片段或(iii)能够诱导对于第一指定抗原是特异性的免疫反应的其变体的任一种的第二多肽；
每一种以有效地诱导或增强对于第一指定抗原是特异性的免疫反应的量存在。
在实施方案1中，第一多肽可以与第二多肽相同或不同。
2.实施方案1，其中免疫原性片段的任一种保持诱导对于第一指定抗原是特异性的免疫反应的能力，并且包含例如抗原的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、48或50个连续氨基酸。
3.实施方案1，其中免疫原性变体的任一种可以例如在抗原的至少10个连续氨基酸上保持至少90%的氨基酸同一性，或在抗原的至少15个连续氨基酸上保持至少85%的氨基酸同一性。其它实例包括在抗原的至少50个连续氨基酸上，或抗原的至少100个连续氨基酸上保持至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%.98%或99%的同一性。
4.实施方案1，其中第一多肽是长度为约50个氨基酸或更少氨基酸的小免疫原性片段，并且第二多肽是全长抗原或长度为约50个氨基酸或更多氨基酸的其更大的片段，任选地与全长抗原具有至少80%、85%、90%或95%的同一性。
在实施方案1中，可在施用第一免疫原性组合物之后、之前、与之同时施用第二免疫原性组合物。
5.前述实施方案的任一个，其中在施用包含多肽免疫原的第一免疫原性组合物之后施用包含载体颗粒的第二免疫原性组合物。
6.前述实施方案的任一个，其还包括在施用第一剂量的第一和第二免疫原性组合物后，进行(a)第三免疫原性组合物的施用，或(b)第二剂量的第一免疫原性组合物的施用或(c)第二剂量的第二免疫原性组合物的施用的任一项。
7.前述实施方案的任一个，其中在先前的免疫后，(a)第一与第二施用之间的间隔和/或(b)第二与第三施用之间的间隔为2-4周，达到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、26或28天，或达到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52周，或达到1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。
8.前述实施方案的任一个，其中施用(a)两个剂量；(b)三个剂量；(c)四个剂量；或(d)五个剂量的第一免疫原性组合物。涉及前述施用的任何施用的任意组合，例如其中(a)在施用第二免疫原性组合物之前施用每一个剂量的第一免疫原性组合物；(b)在施用第二免疫原性组合物之后施用至少一个剂量的第一免疫原性组合物；(c)将至少一个剂量的第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的施用同时施用；(d)在施用第二免疫原性组合物之前施用至少一个剂量的第一免疫原性组合物并且，在施用第二免疫原性组合物后施用第一免疫原性组合物的任何剩余剂量的每一个剂量；或(e)将每一个剂量的第一组合物与第二组合物同时施用。
包括(a)包含多肽的第一免疫原性组合物和(b)包含病毒载体颗粒的第二免疫原性组合物的方案的施用导致优良的免疫反应，所述免疫反应包括强抗原特异性CD4+T细胞反应、强抗体反应和强抗原特异性CD8+T细胞反应。在该方案后，利用(c)包含多肽的第三免疫原性组合物导致更优良的结果。主反应(primary response)(即，在初免后观察到的反应)和次反应(secondaryresponse)(即，加强后观察到的反应)可根据最大反应(例如，峰高)和随后的记忆反应(例如，其中x轴为时间，y轴为CD4或CD8T细胞数目相对于细胞总数的百分比)来测量。例如，根据本公开内容，次反应(即，在施用加强后观察到的反应)在至少一个最大反应或记忆反应中大于主反应，其中“大于”意指比在初免(初免反应)后获得的对应的反应大至少或达到10%或20%或30%或40%或50%。例如，第二免疫使CD8和CD4反应增强至少25%。
9.前述实施方案的任一个，其中第一免疫原性组合物还包含另一种免疫原，所述免疫原是包含(i)第二指定抗原、(ii)其免疫原性片段或(iii)能够诱导对于第二指定抗原是特异性的免疫反应的其变体的任一种的多肽。
10.前述实施方案的任一个，其中重组表达载体(第二免疫原性组合物的)还包含编码另一种免疫原的另一种核苷酸序列，所述免疫原是包含(i)第二指定抗原、(ii)其免疫原性片段或(iii)能够诱导对于第二指定抗原是特异性的免疫反应的其变体的任一种的多肽。
11.在前述实施方案的任一个中，第一与第二指定抗原可以相同或不同。在这些实施方案中，产生针对第一和第二指定抗原的免疫反应，包括强抗原特异性CD4+T细胞反应、强抗体反应和强抗原特异性CD8+T细胞反应。作为其它实例，可施用包含用于诱导针对第三、第四或第五指定抗原的免疫反应的多肽和病毒载体的免疫原性组合物。
12.前述实施方案的任一个，其中抗原(第一、第二、第三、第四和/或第五)是(a)肿瘤相关抗原或(b)来自选自病毒、细菌、真菌和寄生虫的感染性微生物。在不同的实例中，肿瘤相关抗原是肾细胞癌抗原、前列腺癌抗原、间皮瘤抗原、胰腺癌抗原、黑色素瘤抗原、乳腺癌抗原、肺癌抗原或卵巢癌抗原；任选地前列腺癌抗原是前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、NKX3.1或前列腺特异性膜抗原。在不同的实例中，抗原是病毒抗原，任选地来自单纯疱疹病毒-2(HSV-2)。抗原可以是本申请中描述的抗原的任一种。
13.第一和第二指定抗原例如可以是来自相同肿瘤或相同病毒或其它微生物的不同抗原。或者，第一和第二指定抗原可来自不同的癌症或来自不同的病毒或微生物。
14.前述实施方案的任一个，其中可以以约0.01μg至约1000μg/kg受者的体重的范围包含第一免疫原性组合物的多肽。在不同的实施方案中，免疫原可以以约0.1μg至约100μg/kg受试者的体重的范围存在。
15.前述实施方案的任一个，其中施用的量对于诱导针对具有抗原的细胞，例如针对肿瘤细胞或针对微生物的细胞毒性T淋巴细胞反应是有效的。在前述实施方案的任一个中，施用的量对于减小包含肿瘤相关抗原的肿瘤的发生或复发的可能性是有效的。在前述实施方案的任一个中，施用的量对于减小由微生物引起的疾病的发生或严重度的可能性是有效的。此类方法可预防或治疗由感染性微生物引起的感染。
16.前述实施方案的任一个，其中TLR4激动剂佐剂或无毒性脂质A相关佐剂是单磷酰脂质A或3脱-O-酰化单磷酰脂质A(MPL)，或脂质A模拟物，或式I的GLA(如以其整体在上文中描述的)，或式(Ia)的GLA：
Figure BDA0000432175190001001
或其药学上可接受的盐，其中：R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；并且R2和R4是C12-C20烷基；在更具体的实施方案中，GLA具有上文中所示的式(Ia)，其中R1、R3、R5和R6是C11-14烷基；并且R2和R4是C12-15烷基；在其它更具体实施方案中，GLA具有上文中所示的式(Ia)，其中R1、R3、R5和R6是C11烷基；并且R2和R4和是C13烷基；
或GLA具有选自下列化学式(Ib)的结构：
Figure BDA0000432175190001002
或其药学上可接受的盐，其中L1、L2、L3、L4、L5和L6是相同的或不同的，并且独立地选自O、NH和(CH2)；L7、L8、L9和L10是相同的或不同的，并且在任何时候可以不存在或为C(=O)；Y1为酸性官能团；Y2与Y3相同或不同，并且各自独立地选自OH、SH和酸性官能团；Y4是OH或SH；R1、R3、R5和R6是相同的或不同的，并且各自独立地选自C8-C13烷基；并且R2和R4是相同的或不同的并且各自独立地选自C6-C11烷基。
17.前述实施方案的任一个，其中将另一种佐剂(除了第一免疫原性组合物的TLR4激动剂佐剂或无毒性脂质A相关佐剂以外)包含在免疫原性组合物的任一种中。
18.前述实施方案的任一个，其中在稳定的水包油乳液中配制佐剂，优选GLA。在实施方案的实例中，GLA以0.1-10μg/注射的量，以0.2-5μg/注射的量或以0.5-2.5μg/注射的量存在，其中给具有至少50Kg体重的人提供注射。
19.前述实施方案的任一个，其中优先将重组表达载体递送至抗原呈递细胞的载体颗粒是细胞、病毒载体颗粒或病毒样颗粒。
20.前述实施方案的任一个，其中抗原呈递细胞是树突细胞，优选表达DC-SIGN的树突细胞。
21.前述实施方案的任一个，其中载体颗粒优选包含慢病毒载体基因组，或可选择地痘病毒载体基因组、痘苗病毒载体基因组、腺病毒载体基因组、腺病毒相关病毒载体基因组、疱疹病毒载体基因组和α病毒载体基因组。
22.前述实施方案的任一个，其中载体颗粒是包含的慢病毒载体基因组慢病毒载体颗粒；包含痘病毒载体基因组的痘病毒载体颗粒；包含痘苗病毒载体基因组的痘苗病毒载体颗粒；包含腺病毒载体基因组的腺病毒载体颗粒；包含腺病毒相关病毒载体基因组的腺病毒相关病毒载体颗粒；包含疱疹病毒载体基因组的疱疹病毒载体颗粒；或包含α病毒载体基因组的α病毒载体颗粒。
23.前述实施方案的任一个，其中载体颗粒包含优先将载体颗粒递送至表达DC-SIGN的树突细胞的包膜蛋白，任选地作为虫媒病毒包膜蛋白或甲病毒包膜蛋白或辛德比斯病毒包膜蛋白的变体的包膜蛋白。
24.前述实施方案的任一个，其中载体颗粒是慢病毒载体颗粒，其包含慢病毒基因组和包含(用……假型化的)来自虫媒病毒的优先将载体颗粒递送至表达DC-SIGN的树突细胞的糖蛋白，优选来自甲病毒，任选地辛德比斯病毒的糖蛋白，任选地在位置160上包含突变的辛德比斯病毒E2糖蛋白。或者，载体颗粒包含甲病毒基因组和优先将载体颗粒递送至表达DC-SIGN的树突细胞的甲病毒糖蛋白。
25.前述实施方案的任一个，其中慢病毒载体颗粒包含含有辛德比斯病毒E2糖蛋白变体的包膜，所述辛德比斯病毒E2糖蛋白变体与天然辛德比斯病毒E2的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%的氨基酸同一性，和(a)包含至少一个其中残基160上的氨基酸不存在或为除谷氨酸外的氨基酸的突变，并且(b)其中E2糖蛋白不是包含辛德比斯病毒E3蛋白的融合蛋白的部分。
26.在前述实施方案的任一个中，其中载体颗粒优先将重组表达载体递送至树突细胞，任选地载体颗粒优先感染树突细胞，例如，感染的树突细胞对感染的非树突细胞(或非DC-SIGN表达细胞)的比率为至少约2:1、至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约7:1、至少约8:1、至少约9:1、至少约10:1、至少约20:1、至少约30:1、至少约40:1、至少约50:1、至少约100:1、至少约200:1、至少约500:1、至少约1000:1、至少约5000:1、至少约10,000:1或更多。
27.前述实施方案的任一个，其中任选地通过不同的施用途径在不同的部位施用两种组合物。例如，施用途径可以是胃肠外、经肠、口服、肌内、真皮内、皮下、瘤内、结节内、鼻内、经皮肤、吸入、经粘膜或局部途径。
28.前述实施方案的任一个，其中皮下或真皮内施用包含载体颗粒的第二免疫原性组合物。
29.前述实施方案的任一个，其中皮下或肌内或口服施用包含佐剂的组合物。
在实施方案的相关方面，本申请中公开了试剂盒，所述试剂盒包括前述实施方案的任一个中描述的第一免疫原性组合物，和任选地包括上述特征的任一特征。
在实施方案的其它相关方面，本申请中公开了用于(或用于制备用于……的药剂)前述方法的任何方法的第一免疫原性组合物，所述第一免疫原性组合物包含
(1)第一多肽，其包含(i)第一指定抗原、(ii)其免疫原性片段或(iii)能够诱导对于第一指定抗原是特异性的免疫反应的其变体的任一种，和
(2)TLR4激动剂佐剂或无毒性脂质A-相关佐剂，多肽和佐剂的每一种以有效地诱导或增强对于第一指定抗原是特异性的免疫反应的量存在。
在实施方案的其它相关方面，本申请中还公开了用于(或用于制备用于……的药剂)前述方法的任一个的第二免疫原性组合物，所述第二免疫原性组合物包含优先将重组表达载体递送至抗原呈递细胞的载体颗粒，其中所述重组表达载体包含编码第二多肽的核苷酸序列，所述第二多肽包含(i)第一指定抗原、(ii)其免疫原性片段或(iii)能够诱导对于第一指定抗原是特异性的免疫反应的其变体的任一种，所述载体颗粒以有效地诱导或增强对于第一指定抗原是特异性的免疫反应的量存在。
根据本公开内容，其它实施方案和用途对于本领域技术人员来说是显然易见的。下列实施例仅被提供来用作不同实施方案的举例说明，并且不应当被解释为以任何方式限定本发明。
实施例
实施例1
针对免疫原的免疫反应：
免疫原和佐剂的施用
本实施例描述了由与佐剂组合的免疫原诱导的免疫反应，所述佐剂是Toll-样受体4(TLR4)的激动剂。
材料：由传染病研究所(Infectious Disease Research Institute)(Seattle,WA)利用Avanti极性脂质(Alabaster,AL)合成GLA，并将其配制于SE中(也参见，例如，美国专利申请No.2008/0131466和2010/0310602)。将HSV-2重组UL19蛋白在杆状病毒表达系统(Paragon Bioservices,Baltimore,MD)中进行表达。示例性全长UL19多肽序列提供于SEQ ID NO:36中(参见，例如，GenBank登录号NP_044488.1)。用于这些实施例的包含UL19表位的肽的氨基酸序列参照该全长UL19多肽中的氨基酸位置。
动物护理：将小鼠关养于免疫设计研究所(Immunde Design ResearchInstitute)(IDRI)的动物研究设施(Animal Research Facility)的专用动物空间。设施遵从USDA规程并且具有来自实验室动物福利办公室(Office of LaboratoryAnimal Welfare)(OLAW)的动物福利保证。IDRI由实验室动物保健评估协会(Association for Assessment of Laboratory Animal Care)(AALAC)认证并且具有活动的机构动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)(IACUC)，其包括会诊兽医(consulting veternarian)。所有动物方案都由IDRI IACUC评审和批准。需要时通过吸入二氧化碳的受控施用和/或颈椎脱位术来无痛致死动物。这些方法与美国兽医协会的Panel on Euthanasia的建议一致。
通过初免/加强免疫方案肌内免疫成组的5只小鼠；在第0天(初免免疫)对小鼠进行初始免疫，随后在第21天(d0初免/d21加强)用5μg与5μg吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)(于稳定的水包油乳液中配制的)组合的重组HSV-2UL19蛋白(GLA-SE)、单独的稳定的水包油乳液(SE)或PBS进行加强。在加强免疫后4天，处死动物，从动物分离出脾细胞。在用UL19肽表位1(氨基酸997-1011，序列NYFSSIRQPVVQHAR(SEQ ID NO:37))或表位2(氨基酸1185-1199，序列CEFIATPVATDINYF(SEQ ID NO:38)离体再刺激后，通过利用细胞内细胞因子染色(ICS)，随后利用荧光激活细胞分选术(FACS)测定IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平来测量脾CD4T细胞反应。结果示于图1中。描述了每一组的细胞因子阳性CD4T细胞的百分比。
抗体滴度通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。血液样品获自小鼠，制备血清。将样品的系列稀释物添加至用重组UL19蛋白涂覆的96孔免疫测定板中。利用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的鼠种类特异性和同种型特异性抗体(抗-IgG、-IgG1、-IgG2a和-IgG2b)检测特异性抗-UL19抗体的存在。使用
Figure BDA0000432175190001041
TMB微孔基质(KPL,Kirkegard&Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)通过标准过氧化物酶测定来检测结合的HRP-缀合物。使用Plus板读数器(Molecular Devices,Inc.,Sunnyvale,CA)，通过在450nm读取板来定量反应。利用与GLA-SE组合的重组UL19蛋白免疫的小鼠还产生相较于单独用重组HSV-2UL19蛋白(于PBS中)免疫的小鼠极大增强的特异性抗体反应。
实施例2
针对与佐剂组合的并且当由病毒重组表达载体表达时的免疫原的免疫反应
本实施例描述了当用与佐剂组合的免疫原或利用包含编码和表达免疫原的重组表达载体的载体颗粒免疫小鼠时，诱导的免疫反应。
慢病毒载体(DC-NILV)是自身灭活的整合缺陷型慢病毒载体，其使用修饰辛德比斯病毒包膜糖蛋白来选择性进入DC(参见，例如，国际屠申请公布No.WO2011/011584)。简而言之，通过突变型融合酶(polD64V)的组合使得载体的整合能力大大下降，使得其成为无功能的(Apolonia等人，Mol.Ther.15:1947(2007))，并且载体主链缺失LTR的U3区域(达到att)和3’LTR多嘌呤管道(PPT)。因此除了失能的整合酶以外，载体主链的组成阻止了全长载体基因组的转录(自身灭活突变)，从而在感染的树突细胞中导致单-LTR逆转录的附加型dsDNA环，其不是用于染色体整合的模板(Bayer等人，Mol.Ther.16:1968(2008)；Kantor等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA106:18786-791(2009)；Epub2009Oct20；Ma等人，Mol.Ther.10:139(2004))。75%的亲代HIV基因已从DC-NILV移除，包括除Rev外的所有调控和辅助蛋白质。
用GLA-SE-佐剂化的rUL19蛋白肌内或用编码HSV-2多肽UL19的慢病毒载体(DC-NILV)(Immune Design Corporation,Seattle,WA)皮下免疫成组的5只小鼠。将重组UL19蛋白在杆状病毒表达系统(Paragon Bioservices,Baltimore,MD)中进行表达。测定抗体滴度，利用ICS(参见实施例1中的实验内容)分析脾UL19-特异性CD4和CD8T细胞的IFN-γ和TNF-α的产量。在利用UL19肽表位2(氨基酸1185-1199，(SEQ ID NO:38)(参见实施例1))离体刺激后，测量脾CD4T细胞反应。在利用UL19CD8肽表位1(氨基酸1017-1031，序列ENALTYALMAGYFKM(SEQ ID NO:39)与UL19CD8肽表位2(氨基酸1045-1059，序列HPGFGFTVVRQDRFV(SEQ ID NO:40))的组合离体再刺激后测量脾CD8T细胞反应。数据示于图2中(左侧)。
抗体血清终点滴度利用实施例1中描述的酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。血液样品获自即将处死的小鼠。测定脾抗体滴度(IgG)。数据示于图2中(右侧)。
实施例3
针对免疫原(卵白蛋白)的免疫反应：
两种免疫原性组合物的施用
本实施例描述了当首先用包含编码和表达免疫原的重组表达载体的载体颗粒，随后用与佐剂组合的免疫原免疫小鼠时诱导的免疫反应。
利用编码卵白蛋白的DC-NILV皮下免疫成组的小鼠，随后用PBS、单独的GLA/SE、与SE(rP+SE)组合的重组卵白蛋白或GLA-SE-佐剂化的卵白蛋白(rP+GLA/SE)进行肌内加强。在加强免疫后4天从动物分离脾细胞。利用ICS分析脾卵白蛋白-特异性CD8T细胞的IFN-γ和TNF-α的产量。数据示于图3中。
实施例4
针对免疫原(HSV-2uL19)的免疫反应：
两种免疫原性组合物的施用
本实施例描述当用包含含有编码和表达免疫原的重组表达载体的载体颗粒，随后用包含与佐剂组合的免疫原的免疫原性组合物，或相继用每一种免疫原性组合物免疫小鼠时诱导的免疫反应。
用rUL19蛋白+GLA-SE肌内和用编码HSV-2多肽UL19的DC-NILV皮下免疫小鼠。用GLA-SE-佐剂化的rUL19蛋白或PBS免疫成组的5只C57BL/6小鼠，用GLA-SE-佐剂化的rUL19蛋白或包含编码UL19的多核苷酸的DC-NILV进行加强。在加强免疫后10天，从动物分离脾细胞。在利用单次包含CD4或CD8UL19表位的15聚体肽离体刺激后，利用ICS分析脾UL19-特异性CD4和CD8T细胞的IFN-γ、TNF-α和IL-2的产量。每组一个代表性小鼠的点阵图(dot plot)示于图4A中。每一个点阵图上标示的数值代表为IFN-γ+和TNF-α+的CD4或CD8T细胞的百分比。
图4A(右侧)举例说明利用两种不同CD8UL19表位(UL19CD8肽表位1(氨基酸1017-1031，(SEQ ID NO:39)和UL19CD8表位肽2(氨基酸1045-1059，(SEQ ID NO:40)(参见实施例2))的每一种刺激的细胞因子阳性CD8T细胞的百分比。这些数据获自来自首先用GLA-SE-佐剂化的rUL19蛋白(初免组合物)，随后用编码UL19的DC-NILV(加强组合物)免疫的组中的动物的脾CD8细胞。
抗体中点滴度利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。血液样品获自最后一次免疫后10天的小鼠，制备血清。将样品的系列稀释物添加至用重组UL19蛋白涂覆的96孔免疫测定板中。利用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的鼠种类特异性和同种型特异性抗体(抗-IgG、-IgG1、-IgG2a和-IgG2b)检测特异性抗-UL19抗体的存在。使用TMB微孔基质(KPL,Kirkegard & PerryLaboratories,Gaithersburg,MD)通过标准过氧化物酶测定来检测结合的HRP-缀合物。使用Plus板读数器(Molecular Devices,Inc.,Sunnyvale,CA)，通过在450nm读取板来定量反应。在中点测量的每一只动物的抗体滴度示于图4B中。
出人预料并且期望地，当与未初免的对照相比较时，通过单次DC-NILV免疫产生的CD8T细胞反应在已用rUL19+GLA-SE初免的小鼠中增强至5倍。作为单剂，慢病毒载体不引发TH1CD4T细胞，然而，当其作为对蛋白质/GLA初免的辅助剂(boost)被递送时，令人惊讶地，其在加强(作为重组蛋白GLA辅助剂)TH1CD4T细胞反应上同样有效。
实施例5
针对免疫原(HSV-2uL19)的免疫反应：
两种免疫原性组合物的施用
本实施例描述了当用包含与佐剂组合的免疫原的免疫原性组合物，和用包含含有编码和表达免疫原的重组表达载体的载体颗粒的免疫原性组合物同时免疫小鼠时诱导的免疫反应。
用GLA-SE-佐剂化的rUL19蛋白或PBS肌内免疫成组的5只C57BL/6小鼠，随后用GLA-SE-佐剂化的rUL19蛋白肌内和用包含编码UL19的多核苷酸的DC-NILV皮下进行加强。在加强免疫后10天从动物分离脾细胞。在用单次包含CD4或CD8UL19表位的15聚体的肽离体刺激后，利用ICS分析脾UL19-特异性CD4和CD8T细胞的IFN-γ、TNF-α和IL-2的产量。数据示于图5中。数据表明rP+GLA/SE和基于慢病毒的疫苗的同时递送在预先存在的抗原特异性CD4T细胞库存在和不存在的情况下有效地产生CD4和CD8抗原特异性T细胞。图5A(右侧)举例说明用两种不同的CD4UL19表位(CD4肽表位1和CD4肽表位2；参见实施例1)的每一种刺激的细胞因子阳性CD4T细胞的百分比，和用两种不同的CD8UL19表位(CD8肽表位1和CD8肽表位2；参见实施例2和4)的每一种刺激的细胞阳性CD8T细胞的百分比。
在加强后5天和加强后10天从每一组中的动物获得血清，检测特异性IgG抗体。如实施例4中所述测定抗体中点滴度。每一只动物在这些中点上的特异性IgG抗体滴度示于图5B中。
实施例6
通过施用包含第一免疫原和佐剂的免疫原性组合物和施用包含重组表达载体(以表达第一免疫原和第二免疫原)的载体颗粒诱导的免疫反应
DC-NILV载体的构建：如实施例1中所述制备DC-NILV载体。在多顺反子载体中编码HSV-2蛋白gD和UL19，其中两个抗原被自身灭活的2A肽隔开(参见，例如，Szymczak等人，Nat.Biotechnol.22:589(2004)；Trichas等人，BMC.Biol.6:40(2008)；Yang等人，Gene Ther.15:1411(2008))。按照本领域内常规实施的分子生物学方法和技术构建重组表达载体来表达gD和UL19。关于慢病毒载体的构建，也参见国际专利申请公布No.WO2011/011584。
将HSV-2重组蛋白UL19和gD各自在杆状病毒表达系统(ParagonBioservices,Baltimore,MD)中进行表达。制备包含利用GLA/SE配制的gD、利用GLA/SE配制的UL19以及利用GLA/SE配制在一起的gD和UL19的免疫原性组合物。
如下面表1中所示免疫成组的5只小鼠。在初免免疫后28天施用第一加强。在第一加强后28天免疫成组的接受第二加强的小鼠。
表2：免疫方案
Figure BDA0000432175190001081
除当在第12天分析免疫反应时仅接受1次免疫的小鼠外，在最后一次免疫后第4天，分析免疫反应(抗体、CD4T细胞和CD8T细胞)。血液样品采自每一只小鼠，从动物取出脾。通过Guava EasyCyteTMPlus(Millipore,Billerica,MA)测定细胞总数。利用流式细胞术测定每一个样品中的CD8和CD4T细胞以及它们的记忆表型(central v.effector)的总体频率。基本上如所描述的(Liu等人，Nature457(7225):87(2009)；Seder等人，Nat.Rev.Immunol.8:247(2008))，还进行ICS来分析抗原特异性T细胞反应和测定在利用含有已知T细胞表位的15聚体肽离体刺激脾细胞后，产生IFN-γ、IL-2和TNF-α的T细胞的存在。利用ELISA测定针对gD的特异性抗体反应。
保护研究：初始免疫(初免免疫)(第0天)成组的10只小鼠，28天后(第28天)进行加强免疫。某些组的小鼠在第一加强后28天(第56天)接受第二加强。通过获自先前研究的结果确定用于初免、第一和第二加强的每一种的免疫原性组合物。第二加强后4天(第60天)，用至少50X LD50的HSV-2攻击小鼠。在免疫的每一天(即，第0天、第28天和第56天)从每一只动物收集血液。在攻击后第1、3和5天获取阴道拭子。在攻击后第14天，从存活的动物获取阴道拭子，随后从动物收集血液和脾。终点包括存活和病毒滴度的减小(通过实时HSV-2DNA PCR测定的，灵敏性达1-10个拷贝)。如上所述测定对于gD和UL19是特异性的抗原特异性抗体反应、CD4T细胞反应和CD8T细胞反应。
实施例7
初免/加强方案诱导强劲的针对SIV-Gag的功能性CD8T细胞反应
本实施例描述了当用包含编码和表达免疫原的重组表达载体的载体颗粒初次免疫(初免)小鼠，然后用编码和表达免疫原的重组表达载体随后免疫(加强)时诱导的免疫反应。
通过初免、初免/加强(d0/d28)免疫方案，用编码SIV-Gag的DC-NILV以超过25倍的剂量范围皮下免疫成组的C57BL/6小鼠(4只/组)一次。在初免后12天或加强后5天分析脾SIV-Gag-特异性CD8T细胞的表位特异性功能反应，如通过利用已知的CD8T细胞最小表位肽AL11(SIV GAG的氨基酸312-322；AAVKNWMTQTL；SEQ ID NO：43)或KV9(SIV GAG的氨基酸76-84；=KSLYNTVCV；SEQ ID NO：44)离体刺激后IFN-γ、TNF-α和IL-2的产量测量的(通过细胞内细胞因子染色(ICS)测定)。
数据示于图7中，并且显示初免和初免/加强方案，其中两个免疫都是病毒载体，都产生剂量依赖性的强劲的针对优势AL11表位和次优势KV9表位的功能性Gag–特异性CD8T细胞反应。初免/加强方案还使观察到的对两种表位的反应增强至少约2倍。
实施例8
免疫原和佐剂的施用诱导TH1CD4T细胞反应
本实施例描述了由与佐剂(GLA)组合的SIV免疫原诱导的免疫反应。
通过初免/加强免疫方案(d0初免/d21加强)，利用5μg的重组SIV-Gag蛋白+5μg的GLA-SE、单独的SE或PBS肌内免疫C57BL/6小鼠(4/组)。在加强后第5天，利用ICS测量脾CD4T细胞反应的IFN-γ、TNF-α和IL-2(利用含SIV-Gag CD4T细胞表位的肽DD13(SIV-GAG的氨基酸299-311；DRFYKSLRAEQTD；SEQ ID NO：45)离体刺激后产生的)。
结果示于图8中，并且表明GLA型佐剂是在利用SIV-Gag重组蛋白免疫后强劲的Th1CD4T细胞反应所需的。
实施例9
相同媒介物多剂量接种方案与异源多剂量接种方案的比较以及初免/加强接种的顺序的比较
本实施例描述了通过异源初免、加强、加强接种，利用SIV-Gag重组蛋白+GLA-SE和表达SIV-Gag的DC-NILV诱导的免疫反应。
在如所显示的免疫方案中，用rSIV-Gag+GLA-SE肌内和/或用编码SIV-Gag的DC-NILV皮下免疫C57BL/6小鼠(4只/组)。使用CD8T细胞最小表位肽AL11、KV9或CD4(DD13)加强后25天，分析抗原特异性CD4和CD8T细胞，利用ICS分析IFN-γ、TNF-α和IL-2的产量。结果示于图9中，并且表明利用SIV-Gag重组蛋白+GLA-SE和表达SIV-Gag的DC-NILV的异源的初免/加强/加强接种产生CD8和CD4抗原特异性T细胞反应。
数据显示利用重组蛋白质和GLA型佐剂的3次免疫导致非常强劲的CD4T细胞反应，但不强劲的CD8T细胞反应。类似地，利用慢病毒载体的3次免疫导致非常强劲的明显倾向于优势AL11表位的CD8T细胞反应，但无强劲的CD4T细胞反应。相反地，异源方案出人意料地导致强CD8和强CD4T细胞反应。对于优势和次优势表位都观察到显著的且平衡的CD8T细胞反应。还未预料到的是，其中第一(初免)免疫是具有GLA的蛋白并且随后的免疫(加强)是病毒载体的方案导致相较于其中初免是病毒载体并且加强是蛋白质的方案更优的CD8T细胞反应。值得注意地，利用蛋白质的初免和利用病毒载体的加强导致针对次优势表位KV9的CD8T细胞反应的显著更大的增强。这是意料之外的，因为改变通过接种引发的固有免疫显性分层(intrinsicimmunodominance hierarchy)是非常困难的。针对次优势表位的反应对于免疫反应的多样性是非常重要的并且可导致疫苗在整个群体中的优良效力。
实施例10
第二加强增强由异源接种产生的CD8和TH1CD4T细胞反应
本实施例描述了通过利用rSIV-Gag和GLA-SE加强的异源接种诱导的免疫反应。
在如图10中显示的免疫方案中，利用rSIV-Gag+GLA-SE肌内免疫C57BL/6小鼠(4只/组)，随后用编码SIV-Gag的DC-NILV进行加强。免疫间隔21天。使用CD8(AL11或KV9或CD4(DD13)T细胞表位肽加强后25天分析抗原特异性CD4和CD8T细胞，利用ICS分析IFN-γ、TNF-α和IL-2的产量。
结果示于图10中，并且表明通过异源接种产生的CD8和TH1CD4T细胞反应可通过利用蛋白质和GLA型佐剂的第三免疫(第二加强)来增强。三剂量接种方案产生相较于两剂量接种后的各自反应，CD8和CD4抗原特异性T细胞反应的进一步增强。
实施例11
由DC-NILV产生的CD8T细胞反应可利用合成的长肽和佐剂来加强
本实施例描述了利用合成的长肽(SLP)和GLA-SE加强的由编码SIV-Gag的DC-NILV诱导的免疫反应。
按照图11中显示的免疫方案，利用编码SIV-Gag的DC-NILV和/或包含SIV-Gag氨基酸289-333(SEQ ID NO.42)(AL11表位在图11中以粗体字体标示)的SLP+GLA-SE通过初免/加强免疫方案(d0初免/d21加强)免疫C57BL/6小鼠(4只/组)。在使用CD8(AL11)T细胞表位肽加强后25天分析抗原特异性CD8T细胞，利用ICS分析IFN-γ、TNF-α和IL-2的产量。
结果示于图11中，并且表明当在第一和第二免疫中使用不同的免疫原变体(例如全长免疫原对片段)，本发明的方法是有功能的。在利用具有编码全长免疫原的多核苷酸的慢病毒病毒载体的第一免疫(初免)后，利用小的45个氨基酸的免疫原片段的第二免疫(加强)相较于利用相同慢病毒载体的加强产生增强的CD8T细胞反应。
将上述不同的实施方案组合以提供其它实施方案。本说明书中提及的和/或申请数据单(Application Data Sheet)中所列的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物通过引用整体并入本申请。必要时改变实施方案的方面以应用不同的专利、申请和出版物的概念来提供其它实施方案。
可根据上述说明对实施方案进行这些和其它改变。一般而言，在下列权利要求中，使用的术语不应当被解释为限定对说明书和权利要求中公开的特定实施方案的要求，但应当被解释为包括所有可能的实施方案连同此类要求所授予的等同物的完全范围。因此，权利要求不受公开内容限制。
Figure IDA0000432175240000031
Figure IDA0000432175240000041
Figure IDA0000432175240000051
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Claims (84)

1.一种用于诱导受试者的免疫反应的方法，所述方法包括(a)给所述受试者施用至少一个剂量的包含至少第一免疫原的第一免疫原性组合物，其中所述至少一种免疫原能够诱导对于第一指定抗原是特异性的免疫反应；和(b)给所述受试者施用至少一个剂量的包含含有编码所述第一免疫原的核苷酸序列的重组表达载体的第二免疫原性组合物，
从而诱导对于所述第一指定抗原是特异性的免疫反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一免疫原是第一多肽，并且所述核苷酸序列编码与所述第一多肽不同的第二多肽。
3.根据权利要求1所述的方法，其中(i)所述第一免疫原性组合物还包含佐剂；(ii)所述第二组合物还包含佐剂；或(iii)所述第一组合物和所述第二组合物的每一种还包含佐剂。
4.根据权利要求1或权利要求3所述的方法，其中在施用所述第一免疫原性组合物之后施用所述第二免疫原性组合物。
5.根据权利要求1或权利要求3所述的方法，其中在施用所述第一免疫原性组合物之前施用所述第二免疫原性组合物。
6.根据权利要求1或权利要求3所述的方法，其中共同施用所述第一免疫原性组合物和所述第二免疫原性组合物。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中施用至少两个剂量的所述第一免疫原性组合物或其中施用至少两个剂量的所述第二免疫原性组合物。
8.根据权利要求1或权利要求3所述的方法，其中施用(a)两个剂量；(b)三个剂量；(c)四个剂量；或(d)五个剂量的第一免疫原性组合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中(a)在施用所述第二免疫原性组合物之前施用每一个剂量的所述第一免疫原性组合物；(b)在施用所述第二免疫原性组合物之后施用至少一个剂量的第一免疫原性组合物；(c)将至少一个剂量的所述第一免疫原性组合物与所述第二免疫原性组合物的施用同时施用；(d)在施用所述第二免疫原性组合物之前施用至少一个剂量的所述第一免疫原性组合物并且在施用所述第二免疫原性组合物之后施用任何剩余剂量的每一个剂量的所述第一免疫原性组合物；或(e)将每一个剂量的所述第一组合物与所述第二组合物同时施用。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中由所述第一免疫原诱导的免疫反应包括对于所述第一指定抗原是特异性的CD4T细胞免疫反应。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中由所述第一免疫原诱导的免疫反应包括对于所述第一指定抗原是特异性的CD8T细胞免疫反应。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述第一免疫原性组合物还包含第二免疫原，并且其中所述重组表达载体还包含编码第二免疫原的核苷酸序列，其中所述第二免疫原诱导对于第二指定抗原是特异性的免疫反应。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一指定抗原与所述第二指定抗原相同。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一指定抗原与所述第二指定抗原不同。
15.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述重组表达载体还包含编码能够诱导对于第二指定抗原是特异性的免疫反应的第二免疫原的核苷酸序列。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一指定抗原和所述第二指定抗原相同。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一指定抗原和所述第二指定抗原不同。
18.根据权利要求12-17中任一项所述的方法，其中通过所述第一免疫原诱导的免疫反应包括对于所述第一指定抗原是特异性的CD4T细胞反应。
19.根据权利要求12-17中任一项所述的方法，其中由所述第二免疫原诱导的免疫反应包括对于所述第二指定抗原是特异性的CD8T细胞免疫反应。
20.根据权利要求中3-19中任一项所述的方法，其中所述佐剂是无毒性脂质A相关佐剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述无毒性脂质A相关佐剂是吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在稳定的水包油乳液中配制GLA。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述第一指定抗原是(a)肿瘤相关抗原或(b)来自选自病毒、细菌、真菌和寄生虫的感染性微生物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一指定抗原是选自肾细胞癌抗原、前列腺癌抗原、间皮瘤抗原、胰腺癌抗原、黑色素瘤抗原、乳腺癌抗原、肺癌抗原和卵巢癌抗原的肿瘤相关抗原。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述前列腺癌抗原是前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、NKX3.1或前列腺特异性膜抗原。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一指定抗原来自病毒。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述病毒是单纯疱疹病毒-2(HSV-2)。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述第一指定抗原是HSV-2UL19多肽或HSV-2gD多肽。
29.根据权利要求12-22中任一项所述的方法，其中第一指定抗原和所述第二指定抗原的每一种是肿瘤相关抗原。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述第一指定抗原和所述第二指定抗原的每一种选自肾细胞癌抗原、前列腺癌抗原、间皮瘤抗原、胰腺癌抗原、黑色素瘤抗原、乳腺癌抗原、肺癌抗原和卵巢癌抗原。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第一指定抗原和所述第二指定抗原的每一种是选自前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、NKX3.1或前列腺特异性膜抗原的前列腺癌抗原。
32.根据权利要求12-22中任一项所述的方法，其中所述第一指定抗原和所述第二指定抗原的每一种是来自选自病毒、细菌、真菌和寄生虫的感染性微生物的抗原。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述感染性疾病生物是病毒。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述病毒是单纯疱疹病毒-2(HSV-2)。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第一指定抗原和所述第二指定抗原的至少一种是HSV-2UL19多肽并且所述第一指定抗原和所述第二指定抗原的另一种是HSV-2gD多肽。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述重组表达载体选自慢病毒载体基因组、痘病毒载体基因组、痘苗病毒载体基因组、腺病毒载体基因组、腺病毒相关病毒载体基因组、疱疹病毒载体基因组和α病毒载体基因组。
37.根据权利要求36所述的方法，其中将所述重组表达载体整合进入载体颗粒。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述载体颗粒优先将所述重组表达载体递送至抗原呈递细胞。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞，优选表达DC-SIGN的树突细胞。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述载体颗粒是包含慢病毒载体基因组的慢病毒载体颗粒；包含痘病毒载体基因组的痘病毒载体颗粒；包含痘苗病毒载体基因组的痘苗病毒载体颗粒；包含腺病毒载体基因组的腺病毒载体颗粒；包含腺病毒相关病毒载体基因组的腺病毒相关病毒载体颗粒；包含疱疹病毒载体基因组的疱疹病毒载体颗粒；或包含α病毒载体基因组的α病毒载体颗粒。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述载体颗粒是包含慢病毒载体基因组的慢病毒载体颗粒，和优先将所述慢病毒载体颗粒递送至表达DC-SIGN的树突细胞的包膜，任选地为虫媒病毒包膜或甲病毒包膜的变体的包膜。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述载体颗粒是包含优先将甲病毒载体颗粒递送至表达DC-SIGN的树突细胞的甲病毒载体颗粒。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述慢病毒载体颗粒还包含含有辛德比斯病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白包含相较于SEQ ID NO:1具有至少一个氨基酸变化的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的残基160不存在或为除谷氨酸外的氨基酸，并且其中所述E2糖蛋白不是包含辛德比斯病毒E3蛋白的融合蛋白的部分。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述E2糖蛋白结合树突细胞特异性细胞间粘附分子-3-捕捉非整联蛋白(DC-SIGN)。
45.一种制剂，其包含(a)第一免疫原性组合物，其包含至少一种能够诱导对于第一指定抗原是特异性的免疫反应的第一免疫原；和(b)第二免疫原性组合物，其包含含有编码所述第一免疫原的核酸序列的重组表达载体。
46.根据权利要求45所述的制剂，其中由所述第一免疫原诱导的特定免疫反应包括对于所述第一指定抗原是特异性的CD4T细胞反应。
47.根据权利要求45所述的制剂，其中由所述第一免疫原诱导的特定免疫反应包括对于所述第一指定抗原是特异性的CD8T细胞反应。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的制剂，其中所述第一免疫原性组合物还包含第二免疫原，并且其中所述重组表达载体还包含编码所述第二免疫原的核苷酸序列，其中所述第二免疫原诱导对于第二指定抗原是特异性的免疫反应。
49.根据权利要求48所述的制剂，其中所述第一指定抗原与所述第二指定抗原相同。
50.根据权利要求48所述的制剂，其中所述第一指定抗原与所述第二指定抗原不同。
51.根据权利要求45所述的制剂，其中所述重组表达载体还包含编码能够诱导对于第二指定抗原是特异性的免疫反应的第二免疫原的核苷酸序列。
52.根据权利要求51所述的制剂，其中所述第一指定抗原与所述第二指定抗原相同。
53.根据权利要求51所述的制剂，其中所述第一指定抗原与所述第二指定抗原不同。
54.根据权利要求51-53中任一项所述的制剂，其中由所述第一免疫原诱导的免疫反应包括对于所述第一指定抗原是特异性的CD4T细胞反应。
55.根据权利要求51-53中任一项所述的制剂，其中由所述第二免疫原诱导的免疫反应包括对于所述第二指定抗原是特异性的CD8T细胞反应。
56.根据权利要求45-55中任一项所述的制剂，其中(a)所述第一免疫原性组合物还包含佐剂；(b)所述第二免疫原性组合物还包含佐剂；或(c)所述第一免疫原性组合物和所述第二免疫原性组合物各自还包含佐剂。
57.根据权利要求56所述的制剂，其中所述佐剂是无毒性脂质A相关佐剂。
58.根据权利要求57所述的制剂，其中所述无毒性脂质A相关佐剂是吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。
59.根据权利要求58所述的制剂，其中在稳定的水包油乳液中配制GLA。
60.根据权利要求45-59中任一项所述的制剂，其中所述第一指定抗原是(a)肿瘤相关抗原或(b)来自选自病毒、细菌、真菌和寄生虫的感染性微生物。
61.根据权利要求60所述的制剂，其中所述第一指定抗原是选自肾细胞癌抗原、前列腺癌抗原、间皮瘤抗原、胰腺癌抗原、黑色素瘤抗原、乳腺癌抗原、肺癌抗原和卵巢癌抗原的肿瘤相关抗原。
62.根据权利要求61所述的制剂，其中所述前列腺癌抗原是前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、NKX3.1或前列腺特异性膜抗原。
63.根据权利要求60所述的制剂，其中所述第一指定抗原来自病毒。
64.根据权利要求63所述的制剂，其中所述病毒是单纯疱疹病毒-2(HSV-2)。
65.根据权利要求64所述的制剂，其中所述第一指定抗原是HSV-2UL19多肽或HSV-2gD多肽。
66.根据权利要求49-59中任一项所述的制剂，其中所述第一指定抗原和所述第二指定抗原的每一种是肿瘤相关抗原。
67.根据权利要求66所述的制剂，其中所述第一指定抗原和所述第二指定抗原的每一种选自肾细胞癌抗原、前列腺癌抗原、间皮瘤抗原、胰腺癌抗原、黑色素瘤抗原、乳腺癌抗原、肺癌抗原和卵巢癌抗原。
68.根据权利要求67所述的制剂，其中所述第一指定抗原和所述第二指定抗原的每一种是选自前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、NKX3.1或前列腺特异性膜抗原的前列腺癌抗原。
69.根据权利要求48-59中任一项所述的制剂，其中所述第一指定抗原和所述第二指定抗原的每一种是来自选自病毒、细菌、真菌和寄生虫的感染性微生物的抗原。
70.根据权利要求69所述的制剂，其中所述感染性疾病生物是病毒。
71.根据权利要求70所述的制剂，其中所述病毒是单纯疱疹病毒-2(HSV-2)。
72.根据权利要求71所述的制剂，其中所述第一指定抗原和所述第二指定抗原的至少一种是HSV-2UL19多肽并且所述第一指定抗原和所述第二指定抗原的另一种是HSV-2gD多肽。
73.根据权利要求45-72中任一项所述的制剂，其中所述重组表达载体选自慢病毒载体基因组、痘病毒载体基因组、痘苗病毒载体基因组、腺病毒载体基因组、腺病毒相关病毒载体基因组、疱疹病毒载体基因组和α病毒载体基因组。
74.根据权利要求73所述的制剂，其中将所述重组表达载体整合进入载体颗粒。
75.根据权利要求74所述的制剂，其中所述载体颗粒能够将所述重组表达载体递送至抗原呈递细胞。
76.根据权利要求75所述的制剂，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
77.根据权利要求74-76中任一项所述的制剂，其中所述载体颗粒是包含慢病毒载体基因组的慢病毒载体颗粒；包含痘病毒载体基因组的痘病毒载体颗粒；包含痘苗病毒载体基因组的痘苗病毒载体颗粒；包含腺病毒载体基因组的腺病毒载体颗粒；包含腺病毒相关病毒载体基因组的腺病毒相关病毒载体颗粒；包含疱疹病毒载体基因组的疱疹病毒载体颗粒；或包含α病毒载体基因组的α病毒载体颗粒。
78.根据权利要求77所述的制剂，其中所述载体颗粒是包含慢病毒载体基因组的慢病毒载体颗粒。
79.根据权利要求78所述的制剂，其中所述慢病毒载体颗粒还包含含有辛德比斯病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白包含相较于SEQ ID NO:1具有至少一个氨基酸变化的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的残基160不存在或为除谷氨酸外的氨基酸，并且其中所述E2糖蛋白不是包含辛德比斯病毒E3蛋白的融合蛋白的部分。
80.根据权利要求79所述的制剂，其中所述E2糖蛋白结合树突细胞特异性细胞间粘附分子-3-捕捉非整联蛋白(DC-SIGN)。
81.根据权利要求60-62和66-68中任一项所述的制剂，其用于诱导针对具有(a)所述第一指定抗原；(b)所述第二指定抗原；或(c)所述第一指定抗原和所述第二指定抗原的肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞反应。
82.根据权利要求60、63-65和69-72中任一项所述的制剂，其用于诱导针对具有(a)所述第一指定抗原；(b)所述第二指定抗原；或(c)所述第一指定抗原和所述第二指定抗原的感染性疾病微生物的细胞毒性T淋巴细胞反应。
83.根据权利要求60-62和66-68中任一项所述的制剂，其用于减小包含多个具有肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的肿瘤的发生或复发的可能性。
84.根据权利要求60、63-65和69-72中任一项所述的制剂，其用于预防或治疗由所述感染性微生物引起的感染。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104412108A (zh) * 2012-05-16 2015-03-11 免疫设计公司 用于hsv-2的疫苗
CN107073038A (zh) * 2014-03-14 2017-08-18 宾夕法尼亚大学理事会 在癌症和免疫恢复中监测cd4+1型t辅助细胞应答的方法
CN107980044A (zh) * 2015-04-13 2018-05-01 艾杜罗生物科技公司 用于治疗癌症的免疫原性融合蛋白
CN109369795A (zh) * 2018-11-14 2019-02-22 江南大学 一种调控巨噬细胞免疫功能活性的蛋白质及其应用
CN111163799A (zh) * 2017-07-28 2020-05-15 扬森疫苗与预防公司 用于异源repRNA免疫接种的方法和组合物
CN113648294A (zh) * 2021-08-26 2021-11-16 山东领海生物科技有限公司 β-双磺酰亚胺取代酮类化合物在治疗癌症中的应用

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8460674B2 (en) 2009-02-07 2013-06-11 University Of Washington HSV-1 epitopes and methods for using same
WO2010115172A2 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 University Of Washington Antigenic peptide of hsv-2 and methods for using same
US9457077B2 (en) 2009-11-18 2016-10-04 Katherine Rose Kovarik Method and system for targeting the microbiome to promote health and treat allergic and inflammatory diseases
US9585920B2 (en) 2011-02-04 2017-03-07 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US10940169B2 (en) 2015-11-30 2021-03-09 Joseph E. Kovarik Method for reducing the likelihood of developing cancer in an individual human being
US11998479B2 (en) 2011-02-04 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure
US11951139B2 (en) 2015-11-30 2024-04-09 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US9730967B2 (en) 2011-02-04 2017-08-15 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US11844720B2 (en) 2011-02-04 2023-12-19 Seed Health, Inc. Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis
US11951140B2 (en) 2011-02-04 2024-04-09 Seed Health, Inc. Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease
US10314865B2 (en) 2011-02-04 2019-06-11 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer and other age-related diseases by extending the healthspan of a human
WO2014082729A1 (en) * 2012-11-28 2014-06-05 Biontech Ag Individualized vaccines for cancer
EP2964254B1 (en) 2013-03-07 2019-09-18 University of Maryland, Baltimore Immunotherapeutic potential of modified lipooligosaccharides/lipid a
WO2014164699A1 (en) * 2013-03-11 2014-10-09 The Regents Of The University Of California Herpes virus vaccines and treatments
US9402888B2 (en) * 2013-03-14 2016-08-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating cancer
US10906941B2 (en) * 2013-04-15 2021-02-02 Duke University Methods of inducing an immune response against HIV-1 using recombinant envelopes with improved coverage
AU2014315275A1 (en) * 2013-09-05 2016-03-10 Immune Design Corp. Vaccine compositions for drug addiction
JP2016530300A (ja) * 2013-09-06 2016-09-29 ニューヨーク・ユニバーシティ シンドビスウイルスベクター及び腫瘍関連抗原を用いる抗腫瘍免疫誘導法
US9504743B2 (en) 2013-09-25 2016-11-29 Sequoia Sciences, Inc Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
US9149522B2 (en) 2013-09-25 2015-10-06 Sequoia Sciences, Inc. Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
US9149521B2 (en) 2013-09-25 2015-10-06 Sequoia Sciences, Inc. Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
US20150086592A1 (en) 2013-09-25 2015-03-26 Sequoia Sciences, Inc Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
BR112016008806A2 (pt) 2013-11-01 2017-10-03 Pfizer Vetores para expressão de antígenos associados à próstata
EP3071686B1 (en) 2013-11-22 2020-07-22 Cellectis SA Method for generating batches of allogeneic t-cells with averaged potency
US11969445B2 (en) 2013-12-20 2024-04-30 Seed Health, Inc. Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH
US11998574B2 (en) 2013-12-20 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for modulating an individual's skin microbiome
US11826388B2 (en) 2013-12-20 2023-11-28 Seed Health, Inc. Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation
US12005085B2 (en) 2013-12-20 2024-06-11 Seed Health, Inc. Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome
US11833177B2 (en) 2013-12-20 2023-12-05 Seed Health, Inc. Probiotic to enhance an individual's skin microbiome
US11529379B2 (en) 2013-12-20 2022-12-20 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing colorectal cancer in an individual human being
US11213552B2 (en) 2015-11-30 2022-01-04 Joseph E. Kovarik Method for treating an individual suffering from a chronic infectious disease and cancer
US11642382B2 (en) 2013-12-20 2023-05-09 Seed Health, Inc. Method for treating an individual suffering from bladder cancer
US11839632B2 (en) 2013-12-20 2023-12-12 Seed Health, Inc. Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris
US11026982B2 (en) 2015-11-30 2021-06-08 Joseph E. Kovarik Method for reducing the likelihood of developing bladder or colorectal cancer in an individual human being
US11672835B2 (en) 2013-12-20 2023-06-13 Seed Health, Inc. Method for treating individuals having cancer and who are receiving cancer immunotherapy
US11980643B2 (en) 2013-12-20 2024-05-14 Seed Health, Inc. Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection
BR112016018521A2 (pt) * 2014-02-14 2017-10-17 Immune Design Corp composição, e, kit.
JP2017522312A (ja) * 2014-07-15 2017-08-10 イミューン デザイン コーポレイション Ｔｌｒ４アゴニストアジュバント及びレンチウイルスベクターを用いたプライム・ブーストレジメン
RU2017132190A (ru) * 2015-03-18 2019-04-18 Омнисайт Гибридные белки, содержащие модифицированные поверхностные гликопротеины альфавируса и опухолеассоциированный антиген, и способы, связанные с ними
DK3294326T3 (da) * 2015-05-15 2021-05-31 Curevac Ag Prime-boost-regimer indbefattende indgivelse af mindst én mrna-konstruktion
CN108026593A (zh) * 2015-05-18 2018-05-11 卡琳缪恩股份有限公司 区分hiv-1与慢病毒载体的方法
KR20180043800A (ko) 2015-09-09 2018-04-30 이뮨 디자인 코포레이션 Ny-eso-1 특이적 tcrs 및 그의 사용 방법
EP3442999A2 (en) 2016-04-15 2019-02-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Icos ligand variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3443000A2 (en) 2016-04-15 2019-02-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3491013A1 (en) 2016-07-28 2019-06-05 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2018124615A1 (ko) * 2016-12-26 2018-07-05 재단법인 목암생명과학연구소 대상포진 백신 조성물
WO2018148180A2 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Immune Design Corp. Materials and methods for identifying and treating cancer patients
US11752206B2 (en) * 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
AU2018235838B2 (en) 2017-03-16 2023-12-14 Alpine Immune Sciences, Inc. CD80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3596116B1 (en) 2017-03-16 2023-09-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2018170023A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l2 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11160860B2 (en) * 2017-04-26 2021-11-02 Merck Sharp & Dohme Corp. HSV antigenic peptides and HSV protein vaccines
US20200054737A1 (en) * 2017-04-26 2020-02-20 Modema TX, Inc. Herpes simplex virus vaccine
CN111225675B (zh) 2017-06-02 2024-05-03 朱诺治疗学股份有限公司 使用过继细胞疗法治疗的制品和方法
SG11202002174SA (en) 2017-09-13 2020-04-29 Sanofi Pasteur Human cytomegalovirus immunogenic composition
MA50360A (fr) 2017-10-10 2020-08-19 Alpine Immune Sciences Inc Protéines immunomodulatrices de variants de ctla-4 et leurs utilisations
CA3078517A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Alpine Immune Sciences, Inc. Variant icos ligand immunomodulatory proteins and related compositions and methods
BR112020008308A2 (pt) 2017-11-03 2020-11-17 Nouscom Ag polipeptídeo, polinucleotídeo, vetor, coleção de dois ou mais vetores, composição farmacêutica e kit
US20230101432A1 (en) 2018-01-03 2023-03-30 Alpine Immune Sciences, Inc. Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
US20210363219A1 (en) 2018-06-15 2021-11-25 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
JP2022501361A (ja) 2018-09-19 2022-01-06 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド バリアントｃｄ８０融合タンパク質および関連構築物の方法および使用
JP2022510276A (ja) 2018-11-30 2022-01-26 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｃｄ８６バリアント免疫調節タンパク質およびその使用
WO2020214867A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of variant icos ligand (icosl) fusion proteins
AU2021268033A1 (en) 2020-05-08 2022-12-15 Alpine Immune Sciences, Inc. APRIL and BAFF inhibitory immunomodulatory proteins with and without a T cell inhibitory protein and methods of use thereof
JP2023527714A (ja) * 2020-05-14 2023-06-30 ナッツクラッカー セラピューティクス， インコーポレイテッド 抗原性ペイロードを含むポリヌクレオチド
AU2022208435A1 (en) 2021-01-18 2023-08-10 Conserv Bioscience Limited Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof
US20240139341A1 (en) * 2021-03-08 2024-05-02 The Regents Of The University Of California LENTIVIRUS PROTECTION VIA Fc OVEREXPRESSION
EP4333869A1 (en) 2021-05-07 2024-03-13 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods of dosing and treatment with a taci-fc fusion immunomodulatory protein
WO2023172883A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins of variant cd80 polypeptides, cell therapies thereof and related methods and uses
WO2024077018A2 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of taci-fc fusion immunomodulatory protein
WO2024105245A1 (en) * 2022-11-18 2024-05-23 Ceva Sante Animale Recombinant marek's disease virus and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003020876A2 (en) * 2001-08-31 2003-03-13 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b polypeptides, polypeptides and uses thereof
CN101516396A (zh) * 2006-09-26 2009-08-26 传染性疾病研究院 包含合成佐剂的疫苗组合物
US7744903B2 (en) * 1998-08-07 2010-06-29 University Of Washington Immunological herpes simplex virus antigens and methods for use thereof
WO2011011584A1 (en) * 2009-07-24 2011-01-27 Immune Design Corp Lentiviral vectors pseudotyped with a sindbis virus envelope glycoprotein

Family Cites Families (282)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3238190A (en) 1963-10-23 1966-03-01 Madaus & Co K G Fa Dr Aescin recovery
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3598122A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US4029762A (en) 1971-11-17 1977-06-14 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Lipid A-preparation
US4286592A (en) 1980-02-04 1981-09-01 Alza Corporation Therapeutic system for administering drugs to the skin
US4314557A (en) 1980-05-19 1982-02-09 Alza Corporation Dissolution controlled active agent dispenser
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4420558A (en) 1981-02-12 1983-12-13 Janssen Pharmaceutica N.V. Bright field light microscopic method of enumerating and characterizing subtypes of white blood cells and their precursors
US4379454A (en) 1981-02-17 1983-04-12 Alza Corporation Dosage for coadministering drug and percutaneous absorption enhancer
US4411993A (en) 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4420461A (en) 1982-05-26 1983-12-13 Ortho Diagnostic Systems Inc. Agglutination-inhibition test kit for detecting immune complexes
US7045313B1 (en) 1982-11-30 2006-05-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant vaccinia virus containing a chimeric gene having foreign DNA flanked by vaccinia regulatory DNA
US4543439A (en) 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
US4987237A (en) 1983-08-26 1991-01-22 Ribi Immunochem Research, Inc. Derivatives of monophosphoryl lipid A
US4743540A (en) 1983-09-27 1988-05-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Method for diagnosis of subclassifications of common varied immunodeficiency disease group
US4614722A (en) 1983-11-01 1986-09-30 Pasula Mark J Method and apparatus for measuring the degree of reaction between antigens and leukocyte cellular antibodies
US5147785A (en) 1983-11-01 1992-09-15 Amtl Corporation Method and apparatus for measuring the degree of reaction between a foreign entity and white blood cells
US4595654A (en) 1983-11-07 1986-06-17 Immunomedics Inc. Method for detecting immune complexes in serum
US4855238A (en) 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
US4703004A (en) 1984-01-24 1987-10-27 Immunex Corporation Synthesis of protein with an identification peptide
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US4844894A (en) 1984-07-12 1989-07-04 Ribi Immunochem Research Inc. Method of inhibiting the onset of septicemia and endotoxemia
US4629722A (en) 1984-07-12 1986-12-16 Ribi Immunochem Research, Inc. Method of inhibiting the onset of acute radiation syndrome
US5612041A (en) 1984-07-17 1997-03-18 Chiron Corporation Recombinant herpes simplex gD vaccine
US4568343A (en) 1984-10-09 1986-02-04 Alza Corporation Skin permeation enhancer compositions
US4902614A (en) 1984-12-03 1990-02-20 Teijin Limited Monoclonal antibody to human protein C
US4569794A (en) 1984-12-05 1986-02-11 Eli Lilly And Company Process for purifying proteins and compounds useful in such process
US4659659A (en) 1985-01-22 1987-04-21 Monsanto Company Diagnostic method for diseases having an arthritic component
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
US4746742A (en) 1985-11-28 1988-05-24 Toho Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Analogs of nonreducing monosaccharide moiety of lipid A
US6514691B1 (en) 1986-01-22 2003-02-04 Institut Pasteur Peptides of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), antibodies against peptides of HIV-2, and methods and kits for detecting HIV-2
US5310651A (en) 1986-01-22 1994-05-10 Institut Pasteur DNA probes of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), and methods employing these probes for dectecting the presence of HIV-2
US5976785A (en) 1986-01-22 1999-11-02 Institut Pasteur Competitive assays for determining the effectiveness of a human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) antiviral agent, employing peptides and proteins of HIV-2
US6054565A (en) 1986-03-03 2000-04-25 Institut Pasteur Nucleic Acids of HIV-2, Diagnostic Test Kit and Method using Nucleic Acid Probes of HIV-2
US5169763A (en) 1986-04-08 1992-12-08 Transgene S.A., Institut Pasteur Viral vector coding glycoprotein of HIV-1
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US5352449A (en) 1986-05-30 1994-10-04 Cambridge Biotech Corporation Vaccine comprising recombinant feline leukemia antigen and saponin adjuvant
US4948587A (en) 1986-07-08 1990-08-14 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transbuccal drug delivery
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US5011912A (en) 1986-12-19 1991-04-30 Immunex Corporation Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system
FR2672290B1 (fr) 1991-02-05 1995-04-21 Pasteur Institut Sequences peptidiques specifiques des stades hepatiques de p. falciparum porteuses d'epitopes capables de stimuler les lymphocytes t.
US5565209A (en) 1987-03-17 1996-10-15 Akzo Nobel N.V. Adjuvant mixture
CA1331443C (en) 1987-05-29 1994-08-16 Charlotte A. Kensil Saponin adjuvant
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
EP0304578B1 (en) 1987-06-22 2001-10-24 Medeva Holdings Bv Peptide comprising hepatitis B surface antigen
US4780212A (en) 1987-07-31 1988-10-25 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enchancement of membrane permeability
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
US5443964A (en) 1987-08-10 1995-08-22 Duke University Poxvirus insertion/expression vector
WO1989001973A2 (en) 1987-09-02 1989-03-09 Applied Biotechnology, Inc. Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
US4937190A (en) 1987-10-15 1990-06-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Translation enhancer
EP0324455A3 (en) 1988-01-15 1991-03-27 Hans O. Ribi Novel polymeric immunological adjuvants
GB2232892B (en) 1988-02-23 1991-07-24 John Mark Tucker Occlusive body for administering a physiologically active substance
DE68918494T2 (de) 1988-05-17 1995-03-23 Lubrizol Genetics Inc Pflanzliches Ubiquitinpromotorsystem.
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
GB8819209D0 (en) 1988-08-12 1988-09-14 Research Corp Ltd Polypeptide & dna encoding same
US5231168A (en) 1988-09-16 1993-07-27 Statens Seruminstitut Malaria antigen
US4999403A (en) 1988-10-28 1991-03-12 Exxon Chemical Patents Inc. Graft polymers of functionalized ethylene-alpha-olefin copolymer with polypropylene, methods of preparation, and use in polypropylene compositions
ES2160570T3 (es) 1988-12-16 2001-11-16 Nederlanden Staat Mutantes de neumolisina y vacunas de neumococos fabricadas a partir de los mismos.
EP0454781B1 (en) 1989-01-23 1998-12-16 Chiron Corporation Recombinant cells for therapies of infection and hyperproliferative disorders and preparation thereof
DK0382271T3 (da) 1989-02-04 1995-05-01 Akzo Nobel Nv Tocoler som adjuvanser i vacciner
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
FR2649012B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Emulsions multiphasiques injectables
FR2649013B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
SG48175A1 (en) 1989-07-25 1998-04-17 Smithkline Beecham Biolog Novel antigens and method for their preparation
WO1991002805A2 (en) 1989-08-18 1991-03-07 Viagene, Inc. Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US4981684A (en) 1989-10-24 1991-01-01 Coopers Animal Health Limited Formation of adjuvant complexes
US6120769A (en) 1989-11-03 2000-09-19 Immulogic Pharmaceutical Corporation Human T cell reactive feline protein (TRFP) isolated from house dust and uses therefor
US5298396A (en) 1989-11-15 1994-03-29 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Method for identifying T cells disease involved in autoimmune disease
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
US5124141A (en) 1990-06-14 1992-06-23 Flow Incorporated Method for diagnosing malaria
US5162990A (en) 1990-06-15 1992-11-10 The United States Of America As Represented By The United States Navy System and method for quantifying macrophage phagocytosis by computer image analysis
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
US6410010B1 (en) 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
US6277969B1 (en) 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
GB9105992D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
ATE248924T1 (de) 1991-05-06 2003-09-15 Us Gov Health & Human Serv Karcinoembryonale antigen expremierende rekombinante viren und methoden ihrer anwendung
EP1471147A3 (en) 1991-07-19 2007-03-21 The University Of Queensland Method of making a recombinant molecule for the expression of HPV-16 L1 protein
US5464387A (en) 1991-07-24 1995-11-07 Alza Corporation Transdermal delivery device
EP0596032B2 (en) 1991-07-25 2004-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Induction of cytotoxic t-lymphocyte responses
US6197311B1 (en) 1991-07-25 2001-03-06 Idec Pharmaceuticals Corporation Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses
US5530113A (en) 1991-10-11 1996-06-25 Eisai Co., Ltd. Anti-endotoxin compounds
AU660325B2 (en) 1991-10-11 1995-06-22 Eisai Co. Ltd. Anti-endotoxin compounds and related molecules and methods
SG48390A1 (en) 1991-11-16 1998-04-17 Smithkline Beecham Biolog Hybrid protein between cs from plasmodium and hbs ag
US6057427A (en) 1991-11-20 2000-05-02 Trustees Of Dartmouth College Antibody to cytokine response gene 2(CR2) polypeptide
CA2085827C (en) 1991-12-23 2003-10-14 Lucas A. T. Hilgers Adjuvant composition containing synthetic hydrophobic lipopolysaccharide
US5286718A (en) 1991-12-31 1994-02-15 Ribi Immunochem Research, Inc. Method and composition for ameliorating tissue damage due to ischemia and reperfusion
JPH05328975A (ja) 1992-06-02 1993-12-14 Takara Shuzo Co Ltd Ｅ１ａ−ｆ遺伝子
WO1993025234A1 (en) 1992-06-08 1993-12-23 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for targeting specific tissue
WO1993025698A1 (en) 1992-06-10 1993-12-23 The United States Government As Represented By The Vector particles resistant to inactivation by human serum
DK0671948T3 (da) 1992-06-25 1997-09-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccinepræparat indeholdende adjuvanser
ATE380871T1 (de) 1992-06-25 2007-12-15 Univ Georgetown Papillomavirus vakzine
US5273965A (en) 1992-07-02 1993-12-28 Cambridge Biotech Corporation Methods for enhancing drug delivery with modified saponins
WO1994001133A1 (en) 1992-07-08 1994-01-20 Schering Corporation Use of gm-csf as a vaccine adjuvant
JPH07509133A (ja) 1992-07-17 1995-10-12 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 動物疾患の処置のための方法および剤
US5786148A (en) 1996-11-05 1998-07-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotides encoding a novel prostate-specific kallikrein
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
US5437951A (en) 1992-09-03 1995-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins
US5411865A (en) 1993-01-15 1995-05-02 Iasys Corporation Method of detecting anti-leishmania parasite antibodies
DE122007000090I1 (de) 1993-03-09 2008-03-27 Univ Rochester Herstellung von menschlichem papillomavirus hüllprotein und virus-ähnlichen teilchen
ATE157882T1 (de) 1993-03-23 1997-09-15 Smithkline Beecham Biolog 3-0-deazylierte monophosphoryl lipid a enthaltende impfstoff-zusammensetzungen
US5532133A (en) 1993-06-02 1996-07-02 New York University Plasmodium vivax blood stage antigens, PvESP-1, antibodies, and diagnostic assays
US6106824A (en) 1993-08-13 2000-08-22 The Rockefeller University Expression of growth associated protein B-50/GAP-43 in vitro and in vivo
US5961970A (en) 1993-10-29 1999-10-05 Pharmos Corporation Submicron emulsions as vaccine adjuvants
EP0892445B1 (en) 1993-11-02 2004-04-07 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Semiconductor device comprising an aggregate of semiconductor micro-needles
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
US5885211A (en) 1993-11-15 1999-03-23 Spectrix, Inc. Microporation of human skin for monitoring the concentration of an analyte
US5458140A (en) 1993-11-15 1995-10-17 Non-Invasive Monitoring Company (Nimco) Enhancement of transdermal monitoring applications with ultrasound and chemical enhancers
EP0729473B1 (en) 1993-11-17 2000-08-23 OM Pharma Glucosamine disaccharides, method for their preparation, pharmaceutical composition comprising same, and their use
US5693531A (en) 1993-11-24 1997-12-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vector systems for the generation of adeno-associated virus particles
DE9319879U1 (de) 1993-12-23 1994-03-17 Ems-Inventa AG, Zürich Sequentiell Coextrudierte Kühlflüssigkeitsleitung
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5688506A (en) 1994-01-27 1997-11-18 Aphton Corp. Immunogens against gonadotropin releasing hormone
US5457041A (en) 1994-03-25 1995-10-10 Science Applications International Corporation Needle array and method of introducing biological substances into living cells using the needle array
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6447796B1 (en) 1994-05-16 2002-09-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Sustained release hydrophobic bioactive PLGA microspheres
US5591139A (en) 1994-06-06 1997-01-07 The Regents Of The University Of California IC-processed microneedles
WO1996002555A1 (en) 1994-07-15 1996-02-01 The University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7037712B2 (en) 1994-07-26 2006-05-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation DNA encoding ovine adenovirus (OAV287) and its use as a viral vector
GB9415319D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Medical Res Council HSV viral vector
SE9403137D0 (sv) 1994-09-20 1994-09-20 Perstorp Ab Derivatives of carbohydrates and compositions containing them
DE69534702T2 (de) 1994-09-23 2006-08-24 The University Of British Columbia, Vancouver Verfahren zur erhöhung der expression von endogenen peptiden tragenden mhc klasse i molekulen
PT784483E (pt) 1994-10-03 2001-05-31 Us Gov Health & Human Serv Composicao que compreende um virus recombinante que exprime um antigenio e um virus recombinante que exprime uma molecula imunoestimuladora
PT809700E (pt) 1994-10-07 2006-09-29 Univ Loyola Chicago Particulas semelhantes ao papilomavirus e proteinas de fusao, assim como metodos para a sua producao
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
FR2727689A1 (fr) 1994-12-01 1996-06-07 Transgene Sa Nouveau procede de preparation d'un vecteur viral
ATE274922T1 (de) 1995-02-08 2004-09-15 Takara Bio Inc Methoden zur krebskontrolle und -behandlung
AU4727296A (en) 1995-02-24 1996-09-11 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
US5912166A (en) 1995-04-21 1999-06-15 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis of leishmaniasis
US6846489B1 (en) 1995-04-25 2005-01-25 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines containing a saponin and a sterol
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5718904A (en) 1995-06-02 1998-02-17 American Home Products Corporation Adjuvants for viral vaccines
US5993800A (en) 1995-06-05 1999-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods for prolonging the expression of a heterologous gene of interest using soluble CTLA4 molecules and an antiCD40 ligand
US6417172B1 (en) 1995-06-05 2002-07-09 Eisai Co., Ltd. Prevention and treatment of pulmonary bacterial infection or symptomatic pulmonary exposure to endotoxin by inhalation of antiendotoxin drugs
US5981215A (en) 1995-06-06 1999-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Human criptin growth factor
US6309847B1 (en) 1995-07-05 2001-10-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method for detecting or monitoring the effectiveness of treatment of T cell mediated diseases
US6458366B1 (en) 1995-09-01 2002-10-01 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis
WO1997011708A1 (en) 1995-09-29 1997-04-03 Eisai Research Institute Method for treating alcoholic liver disease
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US5618275A (en) 1995-10-27 1997-04-08 Sonex International Corporation Ultrasonic method and apparatus for cosmetic and dermatological applications
US5843462A (en) 1995-11-30 1998-12-01 Regents Of The University Of Minnesota Diphtheria toxin epitopes
US5846758A (en) 1995-11-30 1998-12-08 His Excellency Ghassan I. Shaker Method for diagnosing autoimmune diseases
SE9600648D0 (sv) 1996-02-21 1996-02-21 Bror Morein Receptorbimdande enhet
US5656016A (en) 1996-03-18 1997-08-12 Abbott Laboratories Sonophoretic drug delivery system
ES2242226T3 (es) 1996-07-03 2005-11-01 Eisai Co., Ltd. Composiciones que contienen analogos del lipido a y procedimiento parasu preparacion.
CA2265889A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 The Regents Of The University Of California E25a protein, methods for production and use thereof
US5955306A (en) 1996-09-17 1999-09-21 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Genes encoding proteins that interact with the tub protein
ATE292980T1 (de) 1996-10-11 2005-04-15 Univ California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
US6797276B1 (en) 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US7033598B2 (en) 1996-11-19 2006-04-25 Intrabrain International N.V. Methods and apparatus for enhanced and controlled delivery of a biologically active agent into the central nervous system of a mammal
DE19654221B4 (de) 1996-12-23 2005-11-24 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Leitungsanschlußschaltkreis
US5840871A (en) 1997-01-29 1998-11-24 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Prostate-associated kallikrein
WO1998032869A1 (en) 1997-01-29 1998-07-30 Neurosearch A/S Expression vectors and methods for in vivo expression of therapeutic polypeptides
US6977073B1 (en) 1997-02-07 2005-12-20 Cem Cezayirli Method for stimulating an immune response
CO4870792A1 (es) 1997-02-25 1999-12-27 Corixa Corp Compuestos y conjunto de medios de diagnostico para detectar y vigilar la progresion de cancer de prostata
US6541212B2 (en) 1997-03-10 2003-04-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
CN1326564C (zh) 1997-04-01 2007-07-18 科里克萨有限公司 单磷酰基脂质a的水性免疫佐剂组合物
US6491919B2 (en) 1997-04-01 2002-12-10 Corixa Corporation Aqueous immunologic adjuvant compostions of monophosphoryl lipid A
US7037510B2 (en) 1997-04-18 2006-05-02 Statens Serum Institut Hybrids of M. tuberculosis antigens
US6555653B2 (en) 1997-05-20 2003-04-29 Corixa Corporation Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods for their use
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6358508B1 (en) 1997-06-11 2002-03-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor TR9
HUP0002475A3 (en) 1997-07-21 2002-01-28 Baxter Healthcare S A Wallisel Modified immunogenic pneumolysin compositions as vaccines
US6395713B1 (en) 1997-07-23 2002-05-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Compositions for the delivery of negatively charged molecules
GB9717953D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1279401B1 (en) 1997-09-05 2008-01-09 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Oil in water emulsions containing saponins
US6749856B1 (en) 1997-09-11 2004-06-15 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses
US6368604B1 (en) 1997-09-26 2002-04-09 University Of Maryland Biotechnology Institute Non-pyrogenic derivatives of lipid A
US7459524B1 (en) 1997-10-02 2008-12-02 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia protein, sequence and uses thereof
KR100735651B1 (ko) 1997-11-28 2007-07-06 세로노 제네틱스 인스티튜트 에스.에이. 클라미디아 트라코마티스 게놈 서열과 폴리펩티드, 이의단편 및 이의 용도, 특히, 감염의 진단, 예방 및 치료 용도
CA2317549C (en) 1998-01-05 2006-04-11 University Of Washington Composition for enhancing transport through lipid-containing membranes, and uses thereof
US7012134B2 (en) 1998-01-26 2006-03-14 Human Genome Sciences, Inc. Dendritic enriched secreted lymphocyte activation molecule
DE19803453A1 (de) 1998-01-30 1999-08-12 Boehringer Ingelheim Int Vakzine
WO1999040188A2 (en) 1998-02-05 1999-08-12 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccinations
ATE275421T1 (de) 1998-02-12 2004-09-15 Wyeth Corp Interleukin-12 und herpes simplex virusantigen enthaltende impfstoffe
US6596501B2 (en) 1998-02-23 2003-07-22 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of diagnosing autoimmune disease
FR2775601B1 (fr) 1998-03-03 2001-09-21 Merial Sas Vaccins vivants recombines et adjuves
EP1064025B1 (en) 1998-03-09 2006-09-13 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Combined vaccine compositions
CN1629185B (zh) 1998-04-07 2011-11-02 科里克萨公司 结核杆菌抗原融合蛋白及其应用
GB2336310B (en) 1998-04-14 2003-09-10 Stowic Resources Ltd Method of manufacturing transdermal patches
EP1073734B1 (en) 1998-04-15 2009-09-23 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Tumor associated nucleic acids and uses therefor
US6680175B2 (en) 1998-05-05 2004-01-20 Adherex Technologies, Inc. Methods for diagnosing and evaluating cancer
WO1999056776A2 (en) 1998-05-07 1999-11-11 Corixa Corporation Adjuvant composition and methods for its use
GB2337755B (en) 1998-05-29 2003-10-29 Secr Defence Virus vaccine
US6322532B1 (en) 1998-06-24 2001-11-27 3M Innovative Properties Company Sonophoresis method and apparatus
IL140845A0 (en) 1998-07-14 2002-02-10 Corixa Corp Compositions for therapy and diagnosis of prostate cancer
US6828155B1 (en) 1998-09-01 2004-12-07 Eisai Co., Ltd. Method for evaluating lipid a analog-containing injections
US6692752B1 (en) 1999-09-08 2004-02-17 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Methods of treating human females susceptible to HSV infection
US6375944B1 (en) 1998-09-25 2002-04-23 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for enhancing the immunostimulatory effect of interleukin-12
AU5980899A (en) 1998-09-25 2000-04-17 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Novel compounds
US7001770B1 (en) 1998-10-15 2006-02-21 Canji, Inc. Calpain inhibitors and their applications
PT1126876E (pt) 1998-10-16 2007-04-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Sistemas adjuvantes e vacinas
US6261573B1 (en) 1998-10-30 2001-07-17 Avant Immunotherapeutics, Inc. Immunoadjuvants
US6734172B2 (en) 1998-11-18 2004-05-11 Pacific Northwest Research Institute Surface receptor antigen vaccines
US6512102B1 (en) 1998-12-31 2003-01-28 Chiron Corporation Compositions and methods of diagnosis and treatment using casein kinase I
WO2000042994A2 (en) 1999-01-21 2000-07-27 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Inhibition of bacterial dissemination
AU769539B2 (en) 1999-01-29 2004-01-29 Zoetis Services Llc Adjuvants for use in vaccines
US20030170249A1 (en) 1999-02-19 2003-09-11 Hakomori Sen-Itiroh Vaccines directed to cancer-associated carbohydrate antigens
US6770445B1 (en) 1999-02-26 2004-08-03 Pacific Northwest Research Institute Methods and compositions for diagnosing carcinomas
MXPA01009073A (es) 1999-03-10 2002-05-06 Phogen Ltd Suministro de acidos nucleicos y proteinas a las celulas.
US6599710B1 (en) 1999-03-10 2003-07-29 The General Hospital Corporation Treatment of autoimmune disease
GB9906177D0 (en) 1999-03-17 1999-05-12 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
DE60030701T2 (de) 1999-04-07 2007-09-13 Okamoto, Hiroshi, Sendai VERFAHREN ZUM BEWERTEN VON AUTOIMMUNKRANKHEITEN, VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON GEGEN Reg GERICHTETEN AUTOANTIKÖRPERN
AU764969B2 (en) 1999-04-19 2003-09-04 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Vaccines
US6685699B1 (en) 1999-06-09 2004-02-03 Spectrx, Inc. Self-removing energy absorbing structure for thermal tissue ablation
JP4827353B2 (ja) 1999-08-09 2011-11-30 ターゲティッド ジェネティクス コーポレイション 鎖内塩基対を形成するような配列の設計による、組換えウイルスベクターからの一本鎖の異種ヌクレオチド配列の発現の増大
AU6884200A (en) 1999-08-26 2001-03-19 Biovitrum Ab Novel response element
GB9921146D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US7084256B2 (en) 1999-09-24 2006-08-01 Large Scale Biology Corporation Self antigen vaccines for treating B cell lymphomas and other cancers
EP1964573B1 (en) 1999-10-22 2014-11-26 Aventis Pasteur Limited Method of inducing and/or enhancing an immune response to tumor antigens
JP4162813B2 (ja) 1999-10-28 2008-10-08 久光製薬株式会社 イオントフォレーシス装置
US6218186B1 (en) 1999-11-12 2001-04-17 Trustees Of The University Of Pennsylvania HIV-MSCV hybrid viral vector for gene transfer
JP2003514824A (ja) 1999-11-15 2003-04-22 ビオミラ，インコーポレーテッド 合成脂質−ａ類似体およびその使用
US20020064801A1 (en) 1999-12-01 2002-05-30 Ryan Jeffrey R. Novel and practical serological assay for the clinical diagnosis of leishmaniasis
US6974588B1 (en) 1999-12-07 2005-12-13 Elan Pharma International Limited Transdermal patch for delivering volatile liquid drugs
US6587792B1 (en) 2000-01-11 2003-07-01 Richard A. Thomas Nuclear packing efficiency
GB0000891D0 (en) 2000-01-14 2000-03-08 Allergy Therapeutics Ltd Formulation
AU2001233132A1 (en) 2000-01-31 2001-08-07 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The National Institutes Of Health Hybrid adeno-retroviral vector for the transfection of cells
EP1122542A1 (en) 2000-02-01 2001-08-08 Anda Biologicals S.A. Method for the rapid detection of whole microorganisms on retaining membranes by use of chaotropic agents
AU2001241738A1 (en) 2000-02-25 2001-09-03 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis
ATE444372T1 (de) 2000-05-31 2009-10-15 Human Gene Therapy Res Inst Methode und zusammensetzungen für effizienten gentransfer durch transcomplementierende vektoren
DE10041515A1 (de) 2000-08-24 2002-03-14 Gerold Schuler Verfahren zur Herstellung gebrauchsfertiger, Antigen-beladener oder -unbeladener, kryokonservierter reifer dendritischer Zellen
US6969704B1 (en) 2000-08-25 2005-11-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for suppressing early growth response—1protein (Egr-1) to reduce vascular injury in a subject
US7060802B1 (en) 2000-09-18 2006-06-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tumor-associated marker
WO2002028424A2 (en) 2000-10-06 2002-04-11 Paradies H Henrich Kyberdrug as autovaccines with immune-regulating effects
WO2002032450A2 (en) 2000-10-18 2002-04-25 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccines
US20020130430A1 (en) 2000-12-29 2002-09-19 Castor Trevor Percival Methods for making polymer microspheres/nanospheres and encapsulating therapeutic proteins and other products
CA2462946C (en) 2001-01-26 2014-04-29 Jeffrey A. Lyon Recombinant p. falciparum merozoite protein-142 vaccine
US6893820B1 (en) 2001-01-31 2005-05-17 The Ohio State University Research Foundation Detection of methylated CpG rich sequences diagnostic for malignant cells
US7029685B2 (en) 2001-03-26 2006-04-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Plasmodium falciparum AMA-1 protein and uses thereof
EP1423405A4 (en) 2001-03-26 2005-01-05 Us Army AMA-1 PROTEIN OF PLASMODIUM FALCIPARUM AND ITS APPLICATIONS
US6933123B2 (en) 2001-04-05 2005-08-23 Yao Xiong Hu Peptides from the E2, E6, and E7 proteins of human papilloma viruses 16 and 18 for detecting and/or diagnosing cervical and other human papillomavirus associated cancers
US20030077829A1 (en) 2001-04-30 2003-04-24 Protiva Biotherapeutics Inc.. Lipid-based formulations
US6844192B2 (en) 2001-06-29 2005-01-18 Wake Forest University Adenovirus E4 protein variants for virus production
US7727974B2 (en) 2001-08-10 2010-06-01 Eisai R & D Management Co., Ltd. Methods of reducing the severity of mucositis
US7078180B2 (en) 2001-09-05 2006-07-18 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods and compositions useful for diagnosis, staging, and treatment of cancers and tumors
US20040161776A1 (en) 2001-10-23 2004-08-19 Maddon Paul J. PSMA formulations and uses thereof
US7060498B1 (en) 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
US7141540B2 (en) 2001-11-30 2006-11-28 Genta Salus Llc Cyclodextrin grafted biocompatible amphilphilic polymer and methods of preparation and use thereof
DK1461073T3 (da) 2001-11-30 2010-03-29 Us Gov Health & Human Serv Peptidagonister til prostataspecifikt antigen og anvendelser heraf
US6752995B2 (en) 2002-04-15 2004-06-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Nucleic acid and polypeptide sequences useful as adjuvants
US6908453B2 (en) 2002-01-15 2005-06-21 3M Innovative Properties Company Microneedle devices and methods of manufacture
US6676961B1 (en) 2002-03-06 2004-01-13 Automated Carrier Technologies, Inc. Transdermal patch assembly
EP1549322B1 (en) 2002-05-09 2010-02-17 Oncothyreon Inc. Lipid a and other carbohydrate ligand analogs
US7018345B2 (en) 2002-12-06 2006-03-28 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Iontophoresis system
US20060257416A1 (en) 2003-06-13 2006-11-16 Palmowski J M Materials and methods for improved vaccination
FR2862062B1 (fr) 2003-11-06 2005-12-23 Oreal Lipide a et composition topique, notamment cosmetique, le comprenant
US20050208020A1 (en) 2003-11-12 2005-09-22 Doolan Denise L Enhancement of vaccine-induced immune responses and protection by heterologous boosting with alphavirus replicon vaccines
EP1543837A1 (en) 2003-12-15 2005-06-22 Ruhr-Universität Bochum Virus-like particle (VLP) as vaccine
JP5108521B2 (ja) * 2004-10-14 2012-12-26 クルセル ホランド ベー ヴェー マラリア初回免疫／追加免疫ワクチン
WO2006055729A1 (en) 2004-11-16 2006-05-26 Transcutaneous Technologies Inc. Iontophoretic device and method for administering immune response-enhancing agents and compositions
US7550296B2 (en) 2004-12-01 2009-06-23 Bayer Schering Pharma Ag Generation of replication competent viruses for therapeutic use
WO2006130855A2 (en) 2005-06-01 2006-12-07 California Institute Of Technology Method of targeted gene delivery using viral vectors
ES2281252B1 (es) 2005-07-27 2009-02-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Vectores recombinantes basados en el virus modificado de ankara (mva) como vacunas preventivas y terapeuticas contra el sida.
WO2007100584A2 (en) 2006-02-16 2007-09-07 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antiviral agents and vaccines against influenza
PL2048955T3 (pl) 2006-07-21 2013-11-29 California Inst Of Techn Nakierowane dostarczanie genu dla szczepienia komórek dendrytycznych
US20090181078A1 (en) 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
CN102131522A (zh) 2007-01-12 2011-07-20 西安大略省大学 Hiv联合疫苗与初免加强方法
BRPI0813194B8 (pt) 2007-08-03 2021-05-25 Centre Nat Rech Scient kit, partículas de vetor lentiviral, composição de vetores plasmídicos, antígeno derivado de hiv-1 quimérico, proteína de envelope de vsv-g, moléculas de ácido nucleico, composição imunogênica e uso de um vetor lentiviral
CA2698668A1 (en) 2007-09-07 2009-03-19 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Synthetic lipid a derivative
TW200938633A (en) * 2007-12-06 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
DK2222861T3 (en) 2007-12-11 2018-02-05 Univ North Carolina Chapel Hill POLYPURIN-TRACT MODIFIED RETROVIRAL VECTORS
WO2009120947A1 (en) 2008-03-28 2009-10-01 Virxsys Corporation Lentivirus-based immunogenic vectors
JP5771605B2 (ja) 2009-05-22 2015-09-02 ジェノセア バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 単純ヘルペスウイルス２型に対するワクチン：免疫応答を誘発する組成物および方法
TWI494125B (zh) 2009-06-05 2015-08-01 Infectious Disease Res Inst 合成的葡萄吡喃糖基脂質佐劑
JP2013522231A (ja) 2010-03-11 2013-06-13 イミューン デザイン コーポレイション インフルエンザのためのワクチン
WO2012038832A2 (en) 2010-09-24 2012-03-29 Institut Pasteur Generation of replicating chimeric measles virus - retrovirus particles
US20130302368A1 (en) 2011-01-27 2013-11-14 Boro Dropulic Advanced Prime and Boost Vaccine
AU2012217723A1 (en) 2011-02-15 2013-08-29 Immune Design Corp. Methods for enhancing immunogen specific immune responses by vectored vaccines
WO2012149307A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Immune Design Corp. Synthetic long peptide (slp)-based vaccines
WO2012162428A1 (en) 2011-05-23 2012-11-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Prime-boost vaccination for viral infection
EP2794637B1 (en) 2011-12-23 2017-06-21 The University Of Western Ontario Vesicular stomatitis virus for prime boost vaccines
US8323662B1 (en) 2012-03-30 2012-12-04 Immune Design Corp. Methods useful for generating highly mannosylated pseudotyped lentiviral vector particles comprising a Vpx protein

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7744903B2 (en) * 1998-08-07 2010-06-29 University Of Washington Immunological herpes simplex virus antigens and methods for use thereof
EP2272859A2 (en) * 1998-08-07 2011-01-12 University of Washington Immunological herpes simplex virus antigens and methods for use thereof
WO2003020876A2 (en) * 2001-08-31 2003-03-13 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b polypeptides, polypeptides and uses thereof
CN101516396A (zh) * 2006-09-26 2009-08-26 传染性疾病研究院 包含合成佐剂的疫苗组合物
WO2011011584A1 (en) * 2009-07-24 2011-01-27 Immune Design Corp Lentiviral vectors pseudotyped with a sindbis virus envelope glycoprotein

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104412108A (zh) * 2012-05-16 2015-03-11 免疫设计公司 用于hsv-2的疫苗
CN107073038A (zh) * 2014-03-14 2017-08-18 宾夕法尼亚大学理事会 在癌症和免疫恢复中监测cd4+1型t辅助细胞应答的方法
CN107980044A (zh) * 2015-04-13 2018-05-01 艾杜罗生物科技公司 用于治疗癌症的免疫原性融合蛋白
CN111163799A (zh) * 2017-07-28 2020-05-15 扬森疫苗与预防公司 用于异源repRNA免疫接种的方法和组合物
CN109369795A (zh) * 2018-11-14 2019-02-22 江南大学 一种调控巨噬细胞免疫功能活性的蛋白质及其应用
CN113648294A (zh) * 2021-08-26 2021-11-16 山东领海生物科技有限公司 β-双磺酰亚胺取代酮类化合物在治疗癌症中的应用
CN113648294B (zh) * 2021-08-26 2024-01-23 山东领海生物科技有限公司 β-双磺酰亚胺取代酮类化合物在治疗癌症中的应用

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