CN107980044A - 用于治疗癌症的免疫原性融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于引发受试者中的免疫响应的组合物和方法。特别地，本发明涉及免疫原性融合蛋白和使用宿主细胞引发免疫响应的方法，所述宿主细胞包含编码所述融合蛋白的核酸分子。
Description
相关申请
本申请要求提交于2015年4月13日的美国临时申请第62/146,626号、提交于2015年4月13日申美国临时申请第62/146,654号和提交于2015年12月4日的美国临时申请第62/263,174号的权利。以上申请的全部教导通过援引并入本文中。
政府支持
本发明在美国陆军医学研究学习活动(U.S.Army Medical ResearchAcquisition Activity；USAMRAA)的合约W81XWH-12-1-0439下，在政府支持下进行。在本发明中政府具有某些权利。
背景技术
除皮肤癌以外，前列腺癌为美国男性中最常见的癌症。根据美国癌症协会(American Cancer Society)，估计在2015年，仅在美国将出现220,800例新的前列腺癌病例和27,540例由前列腺癌引起的死亡。约7个人中便有1个人在其生命周期期间被诊断患有前列腺癌。在最近十年期间，癌症诊断及治疗的进展使治疗选择方案增加，但未提供用于转移性前列腺癌患者的治愈性治疗。这些患者需要其他疗法。
发明内容
本文公开了融合蛋白，其包含表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)多肽和滑膜肉瘤X断点2(SSX2)多肽。在一些实施方式中，融合蛋白可包含一个或多个EGFRvIII多肽和SSX2多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，而所述SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
还提供了编码EGFRvIII-SSX2融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，所述核酸分子可包含：一个或多个EGFRvIII多核苷酸，其与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；和多核苷酸，其与如SEQ ID NO:9所述的SSX2多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
本文中公开了融合蛋白，其包含EGFRvIII多肽和前列腺酸磷酸酶(PAP)多肽。在一些实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、或iii)99％同一性、iii)99％同一性、或iv)100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，融合蛋白可包含一个或多个EGFRvIII多肽和PAP多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
还提供了编码EGFRvIII-PAP融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子可包含：一个或多个EGFRvIII多核苷酸，其与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；和多核苷酸，其与如SEQ ID NO:13所述的PAP33-386多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
本文公开了融合蛋白，其包含EGFRvIII多肽、NK3同源盒1(NKX3.1)多肽和前列腺特异性膜抗原(PSMA)多肽。在一些实施方式中，融合蛋白可包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:23的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，融合蛋白可包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
还提供了编码EGFRvIII-NKX3.1-PSMA融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子可包含：一个或多个EGFRvIII多核苷酸，其与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；多核苷酸，其与如SEQ ID NO:24所述的NKX3.111-234多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；以及多核苷酸，其与如SEQ ID NO:19所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在其它实施方式中，核酸分子可包含一个或多个EGFRvIII多核苷酸，其与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；多核苷酸，其与如SEQID NO:17所述的NKX3.1(R41G)11-234多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；和多核苷酸，其与如SEQ ID NO:19所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
本文公开了融合蛋白，其包含NKX3.1多肽和PAP多肽。在一些实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:27的氨基酸残基89至678所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白可包含NKX3.1多肽和PAP多肽，所述NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，而所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
还提供了编码NKX3.1-PAP融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子可包含与如SEQ ID NO:28所述的NKX3.1多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸以及与如SEQ ID NO:13所述的PAP33-386多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
本文公开了宿主细胞，其包含一个或多个所公开的核酸分子。在一些实施方式中，宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码以下物质的核酸序列：
a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和SSX2多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和PAP多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ IDNO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽和PAP多肽，所述NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
g)ActAN100-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100多肽和PAP多肽，所述ActAN100多肽包含与SEQ ID NO:33的氨基酸残基1至100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
h)其任意组合。
在一些方面，a)-h)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
还提供了引发受试者中的免疫响应的方法。在一些实施方式中，所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，该宿主细胞包含一个或多个核酸分子，所述核酸分子包含编码以下物质的核酸序列：
a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和SSX2多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和PAP多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ IDNO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽和PAP多肽，所述NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和SSX2多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
g)ActAN100*-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和PAP多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
h)其任意组合。
在一些方面，a)-h)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
提供引发受试者中的免疫响应的方法，其包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞表达一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白包括：
a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和SSX2多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和PAP多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ IDNO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽和PAP多肽，所述NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和SSX2多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
g)ActAN100*-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和PAP多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
h)其任意组合。
还提供了增加抗原性多肽的表达的方法。在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，所述核酸分子包含编码以下物质的核酸序列：
a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和SSX2多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和PAP多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ IDNO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽和PAP多肽，所述NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和SSX2多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
g)ActAN100*-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和PAP多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
h)其任意组合。
在一些方面，a)-h)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
本文公开了治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括对受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含一个或多个所公开的核酸分子。在一些实施方式中，所述方法可包含对受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含一个或多个核酸分子，所述核酸分子包含编码以下物质的核酸序列：
a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和SSX2多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和PAP多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ IDNO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽和PAP多肽，所述NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和SSX2多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
g)ActAN100-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100多肽和PAP多肽，所述ActAN100多肽包含与SEQ ID NO:33的氨基酸残基1至100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
h)其任意组合。
在一些方面，a)-h)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞表达一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白包括：
a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和SSX2多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和PAP多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ IDNO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽和PAP多肽，所述NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和SSX2多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
g)ActAN100-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100多肽和PAP多肽，所述ActAN100多肽包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基1至100所述的ActAN100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
h)其任意组合。
附图说明
当结合附图阅读时，应进一步理解发明内容以及以下具体实施方式。出于说明所公开的组合物和方法的目的，附图中展示了组合物和方法的示例性实施方式；然而，组合物和方法不限于所公开的特定实施方式。在附图中：
图1说明BH5290菌株的示例性示意图，其中五种癌症抗原性多肽表示为三种单独的免疫原性融合蛋白。
图2说明包含NKX3.1(R41G)变异的免疫原性融合物的表达。
图3A-图3E说明包含NKX3.1(R41G)变异的示例性免疫原性融合蛋白的免疫原性。(图3A)SSX2特异性免疫；(图3B)PAP特异性免疫；(图3C)NKX3.1特异性免疫；(图3D)PSMA特异性免疫；和(图3E)EGFRvIII特异性免疫。
图4说明用BH5290进行的疫苗接种针对野生型李斯特菌(Listeria)激发的保护性免疫。
图5A-图5B说明当与EGFRvIII融合时SSX2的表达。(A)用于检验在EGFRvIII存在下的SSX2表达的示例性细菌菌株。为了评估包括EGFRvIIIx5对抗原表达的影响，在相同Lm背景的tRNAArg基因座处引入仅在EGFRvIIIx5存在下不同的经匹配的SSX2表达盒，该Lm背景表达来自inlB基因座的ActAN100*-NKX3.1-PAP33-386融合蛋白。BH4598含有第一表达盒ActAN100*-SSX2，且BH4602含有第二表达盒ActAN100*-EGFRvIIIx5-SSX2(图5A)。所有表达盒使用actA启动子。(图5B)细胞内蛋白印迹结果。泳道1：Lm11(阴性对照)，泳道2：BH4598(ActAN100*-SSX2)，泳道3：BH4602(ActAN100*-EGFRvIIIx5-SSX2)。
图6说明当EGFRvIIIx5为免疫原性融合蛋白的一部分时的SSX2免疫响应。
图7A-图7B说明当与EGFRvIII的多重拷贝融合时的PAP表达。(A)构建六个PAP表达盒，其在构建体中所包括的EGFRvIII重复序列的拷贝数方面不同。在Lm11的tRNAArg基因座处整合所有构建体，产生六种Lm疫苗菌株：BH2868、PL1631、PL1629、PL1627、PL1625及PL1623。(B)通过细胞内蛋白印迹评估表达。泳道1：Lm11(无表达盒)；泳道2：BH2868表达ActAN100-PAP33-386；泳道3：PL1631表达ActAN100*-EGFRvIIIx1-PAP33-386；泳道4：PL1629表达ActAN100*-EGFRvIIIx2-PAP33-386；泳道5：PL1627表达ActAN100*-EGFRvIIIx3-PAP33-386；泳道6：PL1625表达ActAN100*-EGFRvIIIx4-PAP33-386；泳道7：PL1623表达ActAN100*-EGFRvIIIx5-PAP33-386。
图8说明当与EGFRvIII的多重拷贝融合时的PAP特异性免疫原性。测试六个表达PAP的Lm菌株的T细胞响应的诱导，所述菌株在EGFRvIII拷贝数方面不同(BH2868、PL1631、PL1629、PL1627、PL1625及PL1623)。
具体实施方式
本发明的示例性实施方式的说明如下。
结合附图，参考以下详细描述可更容易地理解所公开的组合物和方法，所述附图形成本发明的一部分。应理解，所公开的组合物和方法不限于本文中描述和/或展示的特定组合物和方法，且本文所使用的术语仅出于作为实施例来描述特定实施方式的目的，而并非意图限制所要求保护的组合物和方法。
除非以其他方式特定说明，否则任何关于可能的机制或作用模式或改良原因的说明仅意在进行说明，且所公开的组合物和方法不受限于任何此类建议的机制或作用模式或改良原因的正确性或不正确性。
在全文中，说明涉及组合物和使用所述组合物的方法。当本发明描述或要求保护与组合物相关的特征或实施方式时，此类特征或实施方式同样适用于使用该组合物的方法。类似地，当本发明描述或要求保护与使用组合物的方法相关的特征或实施方式时，此类特征或实施方式同样适用于组合物。
应了解，所公开的组合物和方法的某些特征，其为了清楚起见在本文中在单独实施方式的情形下描述，也可以单个实施方式的组合形式提供。相反，所公开的组合物和方法的多种特征，其为简洁起见在单个实施方式的情形下描述，也可单独或以任何子组合形式提供。
如本文中所使用，单数形式“一(a,an)”和“该(the)”包括复数形式。
在本公开内容通篇使用以下缩写：EGFRvIII(表皮生长因子受体变体III新抗原接合区)；EGFRvIIIx5(EGFRvIII的5个拷贝)；SSX2(滑膜肉瘤，X断点2)(登录号Q16385)；NKX3.1(NK3同源盒1多肽)(登录号Q99801)；PSMA(前列腺特异性膜抗原)(登录号Q04609)；PAP(前列腺酸磷酸酶)(登录号P15309)；Lm(单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes))；LADD(双重缺失单核细胞增生李斯特菌)。
德尔塔符号(Δ或“.DELTA.”)指缺失。举例而言，“ΔactA”(或“.DELTA.actA”)意谓全部或部分actA基因缺失。
如本文所使用，术语“受试者”指人类或非人类生物体。因此，本文中所描述的方法和组合物适用于人类及兽医学疾病。在某些实施方式中，受试者为“患者”，即接收针对疾病或病况的医学护理的活人。这包括正在接受病变迹象研究的不具有既定疾病的人。优选为患有恶性肿瘤的受试者，该恶性肿瘤表达EGFRvIII、SSX2、NKX3.1、PMSA及PAP中的一个或多个且优选每一个。在某些实施方式中，受试者患有前列腺癌，且优选患有转移性前列腺癌。
如本文所使用，术语“同一性百分比”、“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多肽之间相同(即同一)的氨基酸的百分比。两个或更多个多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多肽的氨基酸序列对准且对经对准的多肽中含有相同氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多肽中含有不同氨基酸残基的位置数目进行比较。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同氨基酸残基的位置数目除以多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同氨基酸残基的位置数目除以多肽中氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
“其免疫原性片段”包括融合蛋白中能够引起受试者中的免疫原性响应的部分。在一些方面，免疫原性片段包含融合蛋白、由融合蛋白组成或基本上由融合蛋白组成。在其他方面，免疫原性片段包含信号序列-融合蛋白、由信号序列-融合蛋白组成或基本上由信号序列-融合蛋白组成。
如本文中所使用，“融合蛋白”是指由接合两个或更多个多肽而制得的蛋白质。可通过以化学方式缀合多肽来产生融合蛋白。优选地，通过基因融合产生融合蛋白，其中编码个别多肽的核酸分子框内接合，使得核酸分子的转录及翻译产生包含个别多肽的单个蛋白质。所公开的融合蛋白可在多肽之间具有一个或多个连接残基。
如本文中所使用，“信号序列”是指多肽序列和编码其的核苷酸序列，其用于驱动融合蛋白的分泌。信号序列可操作地连接于包含融合蛋白的多肽且为具有包含融合蛋白的多肽的翻译阅读框。“信号序列”也可称为“分泌信号序列”。
如本文中所使用，“可操作地连接”指控制序列(诸如启动子核糖体结合位点)以保持组分的正常功能的方式的并置。“控制序列”典型地指对于宿主生物体中可操作地连接的编码序列的表达所必需的DNA序列。控制序列可包括启动子、核糖体结合位点及视情况选用的夏因/达尔加诺序列(Shine/Dalgarno sequence)。因此，与编码的信号序列“可操作地连接”的编码序列是指其中编码序列与信号序列以使信号肽被宿主细胞加工并且经加工的蛋白被分泌的方式接合的构造。如果需要，则可操作地连接于启动子的信号序列以使得分泌信号序列的转录及翻译由启动子、核糖体结合位点及夏因/达尔加诺序列控制的方式接合至启动子。
如本文所使用，“i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性”涵盖与参照项目(例如生物序列)的至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性。
对于EGFRvIII多肽和含有其的免疫原性融合蛋白，本文中所描述的任何序列变异性必须存在于SEQ ID NO:6的氨基酸残基7至14(EEKKGNYV)之外。换言之，序列变异性可存在于SEQ ID NO:6或含有其的免疫原性融合蛋白的氨基酸残基1至6(PASRAL)和/或SEQ IDNO:6或含有其的免疫原性融合蛋白的氨基酸残基15至21(VTDHGSC)中。举例而言，包含与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的氨基酸序列的EGFRvIII多肽涵盖与SEQ ID NO:6具有90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列，其中变异性存在于SEQID NO:6的氨基酸残基1至6或15至21中。因此，各EGFRvIII多肽和含有其的免疫原性融合蛋白将含有SEQ ID NO:6的氨基酸残基7至14(EEKKGNYV)。
可调节EGFRvIII多肽的长度以包括SEQ ID NO:6的更短部分。举例而言，在一些实施方式中，EGFRvIII多肽可包含与SEQ ID NO:6的氨基酸残基6至18具有至少90％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。在一些实施方式中，EGFRvIII多肽的一个或多个拷贝可包含与SEQ ID NO:6的氨基酸残基6至14具有至少90％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。如上文所描述，这些较短多肽中的变异性将存在于SEQ ID NO:6的氨基酸残基1至6或15至21中。因此，对于与SEQ ID NO:6的氨基酸残基6至18具有至少90％同一性的氨基酸序列，变异性可存在于SEQ ID NO:6的氨基酸残基6或15至18中。对于与SEQ ID NO:6的氨基酸残基6至14具有至少90％同一性的氨基酸序列，变异性可存在于氨基酸残基6中。
在本公开内容通篇中，描述了包含一个或多个EGFRvIII多肽的免疫原性融合蛋白以和编码包含一个或多个EGFRvIII多肽的免疫原性融合蛋白的核酸。EGFRvIII多肽可由表1中所提供的EGFRvIII核苷酸序列中的任一个编码。因此，在本公开内容通篇中，当EGFRvIII多核苷酸称为“与SEQ ID NO:5具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性”时(表1中的共有序列)，意在包括：与SEQ ID NO:42具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；与SEQ ID NO:43具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；与SEQ ID NO:44具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；与SEQ ID NO:45具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；和/或与SEQ ID NO:46具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。类似地，编码多种免疫原性融合蛋白的核苷酸序列可包含SEQ ID NO:42-46中的任一个。因此，本文中提供的各个含有EGFRvIII的免疫原性融合蛋白可由核酸分子编码，其中该核酸分子包含一个或多个多核苷酸，其与SEQ ID NO:42具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性、与SEQ ID NO:43具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性、与SEQ ID NO:44具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性、与SEQ ID NO:45具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性和/或与SEQ ID NO:46具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
表1
免疫原性融合蛋白
本文公开了免疫原性融合蛋白和编码所述融合蛋白的核酸分子。示例性免疫原性融合蛋白提供于表2及3中。表1提供由融合蛋白表达的抗原的示例性组合。表3提供多种融合蛋白的示例性表达盒、细菌菌株及氨基酸范围。
表2
免疫原性融合蛋白可包含抗原(即EGFRvIII、SSX2、NKX3.1、PAP、PSMA)的以上组合中的任一个。本文中所描述的抗原可包括作为来自全长蛋白质序列的I类MHC表位或II类MHC表位的序列。
EGFR为对细胞生长及存活至关重要的受体酪氨酸激酶。EGFR基因在人类癌症中频繁过表达或突变，包括头部及颈部、结肠、胰腺、乳腺、卵巢、肾脏和恶性神经胶质瘤。EGFR受体变体III(EGFRvIII)由外显子2至7的267氨基酸缺失及外显子1与外显子8的融合产生，产生在接合点处具有新的甘氨酸的肿瘤特异性肽。EGFRvIII呈现组成性、非配位体依赖性的信号传导。在一个实施方式中，所描述的EGFRvIII多核苷酸包含编码至少一个I类MHC表位或至少一个II类MHC表位的序列。类似地，本文中所描述的EGFRvIII多肽包括至少一个I类MHC表位或至少一个II类MHC表位。EGFRvIII突变体的N端10个残基的序列为LEEKKGNYVV，如SEQ ID NO:61所述。
SSX2属于高同源性滑膜肉瘤X(SSX)断点蛋白质家族。这些蛋白质可充当转录阻遏剂。SSX2基因以及SSX1和SSX4家族成员与在所有滑膜肉瘤中特征性发现的t(X；18)(p11.2；q11.2)易位有关。此易位引起染色体18上滑膜肉瘤易位基因与染色体X上SSX基因中的一个的融合。所编码的杂交蛋白质可能引起转化活性。此基因的选择性剪接产生多种转录变体。在一个实施方式中，所描述的SSX2多核苷酸包含编码至少一个I类MHC表位或至少一个II类MHC表位的序列。类似地，本文中所描述的SSX2多肽包括至少一个I类MHC表位或至少一个II类MHC表位。SSX2序列(Swiss Prot条目Q16385)如SEQ ID NO:62所述：
NKX3.1(NK3同源盒1多肽)(登录号Q99801)为转录因子，其优先结合共有序列5'-TAAGT[AG]-3'且可起转录阻遏剂作用。NKX3.1在正常前列腺发育、调节腺上皮的增殖和前列腺管的形成中起重要作用。在一个实施方式中，所描述的NKX3.1多核苷酸包含编码至少一个I类MHC表位或至少一个II类MHC表位的序列。类似地，本文中所描述的NKX3.1多肽包括至少一个I类MHC表位或至少一个II类MHC表位。NKX3.1的人类标准序列(Swiss Prot条目Q99801)如SEQ ID NO:29所述：
PSMA(前列腺特异性膜抗原)(登录号Q04609)具有叶酸水解酶和N-乙酰化-α-连接的酸性二肽酶(NAALADase)活性。PSMA为α-谷氨酸三肽的优先选择。在肠道中，PSMA为摄取叶酸所需要的；在大脑中，PSMA经由神经肽N-乙酰基天冬氨酰基谷氨酸(NAAG)的水解来调节激动性神经传递，从而释放谷氨酸。PSMA还参与前列腺肿瘤进程。在一个实施方式中，所描述的PSMA多核苷酸包含编码至少一个I类MHC表位或至少一个II类MHC表位的序列。类似地，本文中所描述的PSMA多肽包括至少一个I类MHC表位或至少一个II类MHC表位。PSMA的人类标准序列(Swiss Prot条目Q04609)如SEQ ID NO:63所述：
PAP(前列腺酸磷酸酶)(登录号P15309)为非特异性酪氨酸磷酸酶，其在酸性条件(pH 4-6)下使不同数目的底物去磷酸化，包括烷基、芳基和酰基正磷酸单酯以及磷酸化蛋白质。PAP具有脂质磷酸酶活性且使精浆中的溶血磷脂酸失活。在一个实施方式中，所描述的PAP多核苷酸包含编码至少一个I类MHC表位或至少一个II类MHC表位的序列。类似地，本文中所描述的PAP多肽包括至少一个I类MHC表位或至少一个II类MHC表位。PAP的人类标准序列(Swiss Prot条目P15309)如SEQ ID NO:64所述：
预测性算法“BIMAS”根据肽/HLA复合物的预测性半衰期解离将潜在HLA结合表位分级。“SYFPEITHI”算法根据说明主要和次要HLA结合锚定残基是否存在的评分来将肽分级。两种计算机化算法基于与先前公开的HLA结合表位具有类似结合基序的给定蛋白质内的氨基酸序列对候选表位进行评分。其他算法也可用于鉴别候选物以用于其他生物测试。
表3
EGFRvIII-SSX2融合蛋白
本文公开了融合蛋白，其包含表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)多肽和滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)多肽。
融合蛋白可包含EGFRvIII多肽的一个或多个拷贝。在一些实施方式中，融合蛋白可包含一个EGFRvIII多肽。在其它实施方式中，融合蛋白可包含多个EGFRvIII多肽。EGFRvIII多肽的拷贝的适合数目包括(但不限于)2、3、4、5个或更多个拷贝。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含一个EGFRvIII多肽(称为EGFRvIIIx1)。因此，在一些方面，融合蛋白可包含EGFRvIIIx1-SSX2融合蛋白。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含两个EGFRvIII多肽的拷贝(称为EGFRvIIIx2)。因此，在一些方面，融合蛋白可包含EGFRvIIIx2-SSX2融合蛋白。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含三个EGFRvIII多肽的拷贝(称为EGFRvIIIx3)。因此，在一些方面，融合蛋白可包含EGFRvIIIx3-SSX2融合蛋白。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含四个EGFRvIII多肽的拷贝(称为EGFRvIIIx4)。因此，在一些方面，融合蛋白可包含EGFRvIIIx4-SSX2融合蛋白。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含五个EGFRvIII多肽的拷贝(称为EGFRvIIIx5)。因此，在一些方面，融合蛋白可包含EGFRvIIIx5-SSX2融合蛋白。
一个或多个EGFRvIII多肽的拷贝中的每一个可包含与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，举例而言，EGFRvIII多肽可包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，EGFRvIII多肽可包含2、3、4、5个或更多个EGFRvIII多肽的拷贝，各拷贝具有与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，EGFRvIII多肽为SEQ ID NO:6。EGFRvIIIx5的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:8所述。
在一些方面，一个或多个EGFRvIII多肽的拷贝中的每一个可由与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些方面，一个或多个EGFRvIII多肽的拷贝中的每一个可基本上由与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列组成。
一个或多个EGFRvIII多肽的拷贝可包含与SEQ ID NO:6的氨基酸残基6至18具有至少90％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。在一些实施方式中，EGFRvIII多肽的一个或多个拷贝可包含与SEQ ID NO:6的氨基酸残基6至14具有至少90％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。
EGFRvIII多肽可在EGFRvIII多肽的N端、C端或N端及C端处由一个或多个序列侧接。切割序列经配置以由受试者中存在的蛋白酶加工。当EGFRvIII多肽包含2个或更多个EGFRvIII多肽的拷贝时，切割序列可存在于EGFRvIII多肽的个别拷贝之间。举例而言且不意欲为限制性，SEQ ID NO:8含有5个EGFRvIII多肽的拷贝(各EGFRvIII多肽的拷贝如SEQID NO:6所述)和切割序列(ASKVL/ADGSVKTS(SEQ ID NO:54)、ASKVA/GDGSIK(SEQ ID NO:55)、LSKVL/ADGSVK(SEQ ID NO:56)、ASKVA/GDGSIK(SEQ ID NO:57)和LSKVL/ADGSVK(SEQID NO:58)；其中“/”表示EGFRvIII多肽)。这些切割序列在自然界中仅为示例性的。适合的切割序列描述于美国专利申请第13/988,076号(美国专利公开第2014/037662号)；Toes等,J.Exp.Med.(2001)194:1-12；Lauer等,Infect.Immun.(2008)76:3742-53；和Sinnathamby等,J.Immunother.(2009)32:856-69中，其皆以全文引用的方式并入本文中。
EGFRvIII多肽可与SSX2多肽的N端或C端融合。EGFRvIII多肽优选可与SSX2多肽的N端融合。
适合的SSX2多肽包括SSX2的氨基酸1-234(“SSX2”或“SSX21-234”)和SSX2的氨基酸2-234(“SSX22-234”)。在一些实施方式中，SSX2多肽可包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。在一些方面，SSX2多肽为SEQ ID NO:10。在一些实施方式中，SSX2多肽可包含与如SEQ ID NO:10的氨基酸残基2-234所述的SSX22-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。
融合蛋白可包含一个或多个EGFRvIII多肽和SSX2多肽，其中EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白可包含一个或多个EGFRvIII多肽和SSX2多肽，其中EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10的氨基酸残基2-234所述的SSX22-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
所公开的融合蛋白可进一步包含信号序列，其中信号序列与EGFRvIII多肽和SSX2多肽一起位于翻译阅读框中。适合的信号序列包括例如ActAN100(如SEQ ID NO:60所述)、ActAN100*(如SEQ ID NO:2所述)、LLO441(如SEQ ID NO:49所述)、LLO441ΔPEST(如SEQ IDNO:51所述)和LLO441Δ26(如SEQ ID NO:53所述)。在一些实施方式中，信号序列可包含与如SEQ ID NO:60所述的ActAN100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，信号序列可包含与如SEQ ID NO:2中所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。因此，在一些实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:4所述的ActAN100*-EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
所公开的融合蛋白可在如本文中其他地方所公开的许多适合的宿主细胞中表达。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可在细菌中表达，诸如单核细胞增生李斯特菌或其经遗传修饰的形式。
还公开了编码EGFRvIII-SSX2融合蛋白的核酸分子。所公开的核酸分子可编码本文中所公开的EGFRvIII-SSX2融合蛋白中的任一个。
核酸分子可编码具有一个或多个EGFRvIII多肽的EGFRvIII-SSX2融合蛋白。在一些实施方式中，核酸分子可编码具有一个EGFRvIII多肽的EGFRvIII-SSX2融合蛋白。在其它实施方式中，核酸分子可编码具有多个EGFRvIII多肽的EGFRvIII-SSX2融合蛋白。由所公开的核酸分子编码的EGFRvIII多肽的适合数目包括(但不限于)2、3、4、5个或更多个拷贝。在一些实施方式中，核酸分子可编码具有5个EGFRvIII多肽的拷贝(EGFRvIIIx5)的EGFRvIII-SSX2融合蛋白。各EGFRvIII多肽可由EGFRvIII多核苷酸编码，该EGFRvIII多核苷酸具有与SEQ ID NO:5具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。EGFRvIIIx5多核苷酸的示例性核酸序列如SEQ ID NO:7中所述。因此，所公开的核酸分子可编码包含一个或多个EGFRvIII多肽的EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中EGFRvIII多肽由与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸编码。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。举例而言，核酸分子可编码EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中EGFRvIII多肽由与如SEQ ID NO:7所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸编码。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
所公开的核酸分子可编码EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中SSX2多肽由与如SEQ IDNO:9所述的SSX2多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸编码。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，核酸分子可包含一个或多个与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸以及与如SEQ ID NO:9所述的SSX2多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
核酸分子可编码EGFRvIIIx5-SSX2融合蛋白。在一些实施方式中，核酸分子可包含与如SEQ ID NO:7所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸以及与如SEQ ID NO:9所述的SSX2多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
核酸分子可进一步包含启动子、信号序列或其两者，其中启动子、信号序列或其两者与编码EGFRvIII多肽的核苷酸序列和编码SSX2多肽的核苷酸序列可操作地连接。适合的启动子包括例如actA(如SEQ ID NO:21所述)或hly(如SEQ ID NO:47所述)。启动子可包含例如与如SEQ ID NO:21所述的actA启动子具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。适合的信号序列包括例如ActAN100(如SEQID NO:59所述)、ActAN100*(如SEQ ID NO:1所述)、LLO441(如SEQ ID NO:48所述)、LLO441ΔPEST(如SEQ ID NO:50所述)和LLO441Δ26(如SEQ ID NO:52所述)。信号序列可包含例如与如SEQ ID NO:1所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。因此，在一些实施方式中，编码EGFRvIII-SSX2融合蛋白的核酸分子可包含与如SEQ ID NO:3所述的actA-ActAN100*-EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸、由该多核苷酸组成或基本上由该多核苷酸组成。
核酸分子可进一步包含其他核酸序列，包括(但不限于)限制核酸内切酶切割位点(克隆连接子)。核酸分子可使用多种适合的限制性核酸内切酶产生，其中核酸内切酶切割位点可保持于最终核酸分子中。
核酸分子中可包括的其他核酸序列包括“切割序列”(如本文中其他地方所定义)，其与个别EGFRvIII多核苷酸侧接。
核酸分子可为表达盒的一部分。表达盒可包含启动子、包含所公开的核酸分子的开放阅读框及3'非翻译区。表达盒可用于引导宿主细胞的机构产生所公开的融合蛋白。
还提供了包含所公开的核酸分子的载体。适合的载体包括例如细菌载体、病毒载体、裸DNA载体和裸RNA载体。
EGFRvIII-PAP融合蛋白
本文公开了融合蛋白，其包含EGFRvIII多肽和前列腺酸磷酸酶(PAP)多肽。
融合蛋白可包含EGFRvIII多肽的一个或多个拷贝。在一些实施方式中，融合蛋白可包含一个EGFRvIII多肽。在其它实施方式中，融合蛋白可包含多个EGFRvIII多肽。EGFRvIII多肽的拷贝的适合数目包括(但不限于)2、3、4、5个或更多个拷贝。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含一个EGFRvIII多肽(称为EGFRvIIIx1)。因此，在一些方面，融合蛋白可包含EGFRvIIIx1-PAP融合蛋白。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含两个EGFRvIII多肽的拷贝(称为EGFRvIIIx2)。因此，在一些方面，融合蛋白可包含EGFRvIIIx2-PAP融合蛋白。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含三个EGFRvIII多肽的拷贝(称为EGFRvIIIx3)。因此，在一些方面，融合蛋白可包含EGFRvIIIx3-PAP融合蛋白。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含四个EGFRvIII多肽的拷贝(称为EGFRvIIIx4)。因此，在一些方面，融合蛋白可包含EGFRvIIIx4-PAP融合蛋白。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含五个EGFRvIII多肽的拷贝(称为EGFRvIIIx5)。因此，在一些方面，融合蛋白可包含EGFRvIIIx5-PAP融合蛋白。
一个或多个EGFRvIII多肽的拷贝中的每一个可包含与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，举例而言，EGFRvIII多肽可包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，EGFRvIII多肽可包含2、3、4、5个或更多个EGFRvIII多肽的拷贝，各拷贝具有与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的氨基酸序列。EGFRvIIIx5的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:8中所述。
在一些方面，一个或多个EGFRvIII多肽的拷贝中的每一个可由与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些方面，一个或多个EGFRvIII多肽的拷贝中的每一个可基本上由与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，一个或多个EGFRvIII多肽的拷贝可包含与SEQ ID NO:6的氨基酸残基6至18具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。在一些实施方式中，一个或多个EGFRvIII多肽的拷贝可包含与SEQ ID NO:6的氨基酸残基6至14具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。
EGFRvIII多肽可在EGFRvIII多肽的N端和/或C端处由一个或多个序列侧接。切割序列经配置以由受试者中存在的蛋白酶加工。当EGFRvIII多肽包含2个或更多个EGFRvIII多肽的拷贝时，切割序列可存在于EGFRvIII多肽的个别拷贝之间。举例而言且不意欲为限制性，SEQ ID NO:8含有5个EGFRvIII多肽的拷贝(各EGFRvIII多肽的拷贝如SEQ ID NO:6中所述)和切割序列(ASKVL/ADGSVKTS(SEQ ID NO:54)、ASKVA/GDGSIK(SEQ ID NO:55)、LSKVL/ADGSVK(SEQ ID NO:56)、ASKVA/GDGSIK(SEQ ID NO:57)和LSKVL/ADGSVK(SEQ IDNO:58)；其中“/”表示EGFRvIII多肽)。这些切割序列在自然界中仅为示例性的。适合的切割序列描述于美国专利申请第13/988,076号(美国专利公开第2014/037662号)；Toes等,J.Exp.Med.(2001)194:1-12；Lauer等,Infect.Immun.(2008)76:3742-53；和Sinnathamby等,J.Immunother.(2009)32:856-69中，其皆以全文引用的方式并入本文中。
EGFRvIII多肽可与PAP多肽的N端或C端融合。EGFRvIII多肽优选可与PAP多肽的N端融合。
适合的PAP多肽包括PAP的氨基酸33-386(“PAP33-386”)。因此，在一些实施方式中，PAP多肽可包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，PAP多肽可由与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，PAP多肽可基本上由与如SEQ IDNO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:6所述的EGFRvIII多肽具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多肽，和与如SEQID NO:14所述的PAP33-386多肽具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多肽。举例而言，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:35的氨基酸残基89至476所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白可包含：两个多肽，其与如SEQ ID NO:6所述的EGFRvIII多肽具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；以及与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386多肽具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多肽。举例而言，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:37的氨基酸残基89至509所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白可包含：三个多肽，其与如SEQ ID NO:6所述的EGFRvIII多肽具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；以及与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386多肽具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多肽。举例而言，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:39的氨基酸残基89至541所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白可包含：四个多肽，其与如SEQ ID NO:6所述的EGFRvIII多肽具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；以及与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386多肽具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多肽。举例而言，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:41的氨基酸残基89至573所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白可包含：五个多肽，其与如SEQ ID NO:6所述的EGFRvIII多肽具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；以及与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386多肽具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多肽。举例而言，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
所公开的融合蛋白进一步包含信号序列，其中信号序列与EGFRvIII多肽和PAP多肽一起位于翻译阅读框中。适合的信号序列包括例如ActAN100(如SEQ ID NO:60所述)、ActAN100*(如SEQ ID NO:2所述)、LLO441(如SEQ ID NO:49所述)、LLO441ΔPEST(如SEQ IDNO:51所述)和LLO441Δ26(如SEQ ID NO:53所述)。在一些实施方式中，信号序列可包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，信号序列可包含与如SEQ ID NO:60所述的ActAN100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。因此，在一些实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:35所述的ActAN100*-EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:37所述的ActAN100*-EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ IDNO:39所述的ActAN100*-EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:41所述的ActAN100*-EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:12所述的ActAN100*-EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
所公开的融合蛋白可在如本文中其他地方所公开的许多适合的宿主细胞中表达。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可在细菌中表达，诸如单核细胞增生李斯特菌或其经遗传修饰的形式。
还公开了编码EGFRvIII-PAP融合蛋白的核酸分子。所公开的核酸分子可编码本文中所公开的EGFRvIII-PAP融合蛋白中的任一个。
核酸分子可编码具有一个或多个EGFRvIII多肽的EGFRvIII-PAP融合蛋白。在一些实施方式中，核酸分子可编码具有一个EGFRvIII多肽的EGFRvIII-PAP融合蛋白。在其它实施方式中，核酸分子可编码具有多个EGFRvIII多肽的EGFRvIII-PAP融合蛋白。由所公开的核酸分子编码的EGFRvIII多肽的适合数目包括(但不限于)2、3、4、5个或更多个拷贝。在一些实施方式中，核酸分子可编码具有1个EGFRvIII多肽的拷贝(EGFRvIIIx1)、2个EGFRvIII多肽的拷贝(EGFRvIIIx2)、3个EGFRvIII多肽的拷贝(EGFRvIIIx3)、4个EGFRvIII多肽的拷贝(EGFRvIIIx4)或5个EGFRvIII多肽的拷贝(EGFRvIIIx5)的EGFRvIII-PAP融合蛋白。EGFRvIII多核苷酸的示例性核酸序列如SEQ ID NO:5中所述且EGFRvIIIx5多核苷酸的示例性核酸序列如SEQ ID NO:7中所述。因此，所公开的核酸分子可编码EGFRvIII-PAP融合蛋白，其中融合蛋白包含1、2、3、4或5个EGFRvIII多肽的拷贝，该EGFRvIII多肽由与如SEQ IDNO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸编码。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，所公开的核酸分子可编码EGFRvIII-PAP融合蛋白，其中EGFRvIII多肽由与如SEQ IDNO:7所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸编码。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
所公开的核酸分子可编码EGFRvIII-PAP融合蛋白，其中PAP多肽由与如SEQ IDNO:13所述的PAP33-386多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸编码。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，核酸分子可包含：一个或多个EGFRvIII多核苷酸，其中各EGFRvIII多核苷酸与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；和多核苷酸，其与如SEQ ID NO:13所述的PAP33-386多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，核酸分子可包含与如SEQ ID NO:7所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸以及与如SEQ ID NO:13所述的PAP33-386多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
核酸分子可进一步包含启动子、信号序列或其两者，其中启动子、信号序列或其两者与编码EGFRvIII多肽的核苷酸序列和编码PAP多肽的核苷酸序列可操作地连接。适合的启动子包括例如actA(如SEQ ID NO:21所述)或hly(如SEQ ID NO:47所述)。启动子可包含例如与如SEQ ID NO:21所述的actA启动子具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。适合的信号序列包括例如ActAN100(如SEQID NO:59所述)、ActAN100*(如SEQ ID NO:1所述)、LLO441(如SEQ ID NO:48所述)、LLO441ΔPEST(如SEQ ID NO:50所述)和LLO441Δ26(如SEQ ID NO:52所述)。信号序列可包含例如与如SEQ ID NO:1所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。因此，在一些实施方式中，编码EGFRvIII-PAP融合蛋白的核酸分子可包含与如SEQ ID NO:34所述的actA-ActAN100*-EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸、由该多核苷酸组成或基本上由该多核苷酸组成。在一些实施方式中，编码EGFRvIII-PAP融合蛋白的核酸分子可包含与如SEQ ID NO:36所述的actA-ActAN100*-EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸、由该多核苷酸组成或基本上由该多核苷酸组成。在一些实施方式中，编码EGFRvIII-PAP融合蛋白的核酸分子可包含与如SEQ ID NO:38所述的actA-ActAN100*-EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸、由该多核苷酸组成或基本上由该多核苷酸组成。在一些实施方式中，编码EGFRvIII-PAP融合蛋白的核酸分子可包含与如SEQ ID NO:40所述的actA-ActAN100*-EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸、由该多核苷酸组成或基本上由该多核苷酸组成。在一些实施方式中，编码EGFRvIII-PAP融合蛋白的核酸分子可包含与如SEQ ID NO:11所述的actA-ActAN100*-EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸、由该多核苷酸组成或基本上由该多核苷酸组成。
核酸分子可进一步包含其他核酸序列，包括(但不限于)限制核酸内切酶切割位点(克隆连接子)和“切割序列”(如本文中其他地方所定义)。
核酸分子可为表达盒的一部分。表达盒可包含启动子、包含所公开的核酸分子的开放阅读框及3'非翻译区域。表达盒可用于引导宿主细胞的机构产生所公开的融合蛋白。
还提供了包含所公开的核酸分子的载体。适合的载体包括例如细菌载体、病毒载体、裸DNA载体和裸RNA载体。
EGFRvIII-NKX3.1-PSMA融合蛋白
本文公开了融合蛋白，其包含EGFRvIII多肽、NK3同源盒1(NKX3.1)多肽和前列腺特异性膜抗原(PSMA)多肽。
融合蛋白可包含EGFRvIII多肽的一个或多个拷贝。在一些实施方式中，融合蛋白可包含一个EGFRvIII多肽。在其它实施方式中，融合蛋白可包含多个EGFRvIII多肽。EGFRvIII多肽的拷贝的适合数目包括(但不限于)2、3、4、5个或更多个拷贝。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含一个EGFRvIII多肽(称为EGFRvIIIx1)。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含两个EGFRvIII多肽的拷贝(称为EGFRvIIIx2)。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含三个EGFRvIII多肽的拷贝(称为EGFRvIIIx3)。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含四个EGFRvIII多肽的拷贝(称为EGFRvIIIx4)。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含五个EGFRvIII多肽的拷贝(称为EGFRvIIIx5)。
一个或多个EGFRvIII多肽的拷贝中的每一个可包含与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，举例而言，EGFRvIII多肽可包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，EGFRvIII多肽可包含2、3、4、5个或更多个EGFRvIII多肽的拷贝，各拷贝具有与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。EGFRvIIIx5的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:8所述。
在一些方面，一个或多个EGFRvIII多肽的拷贝中的每一个可由与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些方面，一个或多个EGFRvIII多肽的拷贝中的每一个可基本上由与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，一个或多个EGFRvIII多肽的拷贝可包含与SEQ ID NO:6的氨基酸残基6至18具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。在一些实施方式中，一个或多个EGFRvIII多肽的拷贝可包含与SEQ ID NO:6的氨基酸残基6至14具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。
EGFRvIII多肽可在EGFRvIII多肽的N端、C端或N端及C端处由一个或多个序列侧接。切割序列经配置以由受试者中存在的蛋白酶加工。当EGFRvIII多肽包含2个或更多个EGFRvIII多肽的拷贝时，切割序列可存在于EGFRvIII多肽的个别拷贝之间。举例而言且不意欲为限制性，SEQ ID NO:8含有5个EGFRvIII多肽的拷贝(各EGFRvIII多肽的拷贝如SEQID NO:6所述)和切割序列(ASKVL/ADGSVKTS(SEQ ID NO:54)、ASKVA/GDGSIK(SEQ ID NO:55)、LSKVL/ADGSVK(SEQ ID NO:56)、ASKVA/GDGSIK(SEQ ID NO:57)和LSKVL/ADGSVK(SEQID NO:58)；其中“/”表示EGFRvIII多肽)。这些切割序列在自然界中仅为示例性的。适合的切割序列描述于美国专利申请第13/988,076号(美国专利公开第2014/037662号)；Toes等,J.Exp.Med.(2001)194:1-12；Lauer等,Infect.Immun.(2008)76:3742-53；和Sinnathamby等,J.Immunother.(2009)32:856-69中，其皆以全文引用的方式并入本文中。
优选地，融合蛋白可包含与NKX3.1多肽的N端融合的EGFRvIII多肽和与PSMA多肽的N端融合的NKX3.1多肽。EGFRvIII多肽、NKX3.1多肽和PSMA多肽的其他顺序也是适合的。举例而言：EGFRvIII-PSMA-NKX1；PSMA-NKX-EGFRvIII；PSMA-EGFRvIII-NKX1；NKX1-EGFRvIII-PSMA；和NKX1-PSMA-EGFRvIII融合蛋白是适合的。
适合的NKX3.1多肽包括NKX3.1的氨基酸11-234(“NKX3.111-234”)。在一些实施方式中，NKX3.1多肽可包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NKX3.1多肽可由与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，NKX3.1多肽可基本上由与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。
NKX3.111-234多肽可在氨基酸41处具有精氨酸(R)至甘氨酸(G)突变(“NKX3.1(R41G)”)。在一些实施方式中，NKX3.1多肽可包含与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NKX3.1多肽可由与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，NKX3.1多肽可基本上由与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。
适合的PSMA多肽包括PSMA的氨基酸1-20和44-750(PSMA1-20,44-750)或PSMA的氨基酸1-20、44-138和169-750(“PSMA1-20,44-138,169-750”)。PSMA多肽优选可包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，PSMA多肽可由与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，PSMA多肽可基本上由与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。
EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白可包含：
a)一个或多个EGFRvIII多肽，其具有与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)EGFRvIIIx5多肽，其与SEQ ID NO:8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
c)与如SEQ ID NO:23的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白可包含：
a)一个或多个EGFRvIII多肽，其具有与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)EGFRvIIIx5多肽，其具有与SEQ ID NO:8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
c)与如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
所公开的融合蛋白可进一步包含信号序列。在一些实施方式中，融合蛋白可进一步包含信号序列，其中信号序列与EGFRvIII多肽、NKX3.1多肽和PSMA多肽一起位于翻译阅读框中。适合的信号序列包括例如ActAN100(如SEQ ID NO:60所述)、ActAN100*(如SEQ IDNO:2所述)、LLO441(如SEQ ID NO:49所述)、LLO441ΔPEST(如SEQ ID NO:51所述)和LLO441Δ26(如SEQ ID NO:53所述)。在一些实施方式中，信号序列可包含与如SEQ ID NO:60所述的ActAN100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，信号序列可包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。因此，在一些实施方式中，EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:23所述的ActAN100*-EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。在一些实施方式中，EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:16所述的ActAN100*-EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。
所公开的融合蛋白可在如本文中其他地方所公开的许多适合的宿主细胞中表达。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可在细菌中表达，诸如单核细胞增生李斯特菌或其经遗传修饰的形式。
还公开了编码EGFRvIII-NKX3.1-PSMA融合蛋白的核酸分子。所公开的核酸分子可编码本文中所公开的EGFRvIII-NKX3.1-PSMA融合蛋白中的任一个。
核酸分子可编码具有一个或多个EGFRvIII多肽的EGFRvIII-NKX3.1-PSMA融合蛋白。在一些实施方式中，核酸分子可编码具有一个EGFRvIII多肽的EGFRvIII至NKX3.1-PSMA融合蛋白。在其它实施方式中，核酸分子可编码具有多个EGFRvIII多肽的EGFRvIII-NKX3.1-PSMA融合蛋白。由所公开的核酸分子编码的EGFRvIII多肽的适合数目包括(但不限于)2、3、4、5个或更多个拷贝。在一些实施方式中，核酸分子可编码具有5个EGFRvIII多肽的拷贝的EGFRvIII-NKX3.1-PSMA融合蛋白(EGFRvIIIx5)。EGFRvIII多核苷酸的示例性核酸序列如SEQ ID NO:5所述且EGFRvIIIx5多核苷酸的示例性核酸序列如SEQ ID NO:7所述。因此，所公开的核酸分子可编码EGFRvIII-NKX3.1-PSMA融合蛋白，其中融合蛋白包含多个EGFRvIII多肽，其各由与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸编码。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。所公开的核酸分子可编码EGFRvIII-NKX3.1-PSMA融合蛋白，其中EGFRvIII多肽由与如SEQ ID NO:7所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸编码。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
所公开的核酸分子可编码EGFRvIII-NKX3.1-PSMA融合蛋白，其中NKX3.1多肽由与如SEQ ID NO:24所述的NKX3.111-234多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸编码。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。或者，所公开的核酸分子可编码EGFRvIII-NKX3.1-PSMA融合蛋白，其中NKX3.1多肽由与如SEQ ID NO:17所述的NKX3.1(R41G)11-234多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸编码。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
所公开的核酸分子可编码EGFRvIII-NKX3.1-PSMA融合蛋白，其中PSMA多肽由与如SEQ ID NO:19所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸编码。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
编码EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白的核酸分子可包含以下物质、由以下物质组成或基本上由以下多核苷酸组成：
a)一个或多个EGFRvIII多核苷酸，其与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；与如SEQ IDNO:24所述的NKX3.111-234多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；和与如SEQ ID NO:19所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；或
b)与如SEQ ID NO:7所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；与如SEQ ID NO:24所述的NKX3.111-234多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；和与如SEQ ID NO:19所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。
在一些方面，以上列举的核酸分子可操作地连接于启动子。
编码EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白的核酸分子可包含以下物质、由以下物质组成或基本上由以下多核苷酸组成：
a)一个或多个EGFRvIII多核苷酸，其与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；与如SEQ IDNO:17所述的NKX3.1(R41G)11-234多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；和与如SEQ ID NO:19所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；或
b)与如SEQ ID NO:7所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；与如SEQ ID NO:17所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；和与如SEQ ID NO:19所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。
在一些方面，以上列举的核酸分子可操作地连接于启动子。
核酸分子可进一步包含启动子、信号序列或其两者，其中启动子、信号序列或其两者与编码EGFRvIII多肽、NKX3.1多肽和PSMA多肽的核苷酸序列可操作地连接。适合的启动子包括例如actA(如SEQ ID NO:21所述)或hly(如SEQ ID NO:47所述)。启动子可包含例如与如SEQ ID NO:21所述的actA启动子具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。适合的信号序列包括例如ActAN100(如SEQ ID NO:59所述)、ActAN100*(如SEQ ID NO:1所述)、LLO441(如SEQ ID NO:48所述)、LLO441ΔPEST(如SEQ ID NO:50所述)和LLO441Δ26(如SEQ ID NO:52所述)。信号序列可包含例如与如SEQ ID NO:1所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。因此，在一些实施方式中，编码EGFRvIII-NKX3.1-PSMA融合蛋白的核酸分子可包含与如SEQ ID NO:22所述的actA-ActAN100*-EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸、由该多核苷酸组成或基本上由该多核苷酸组成。在其它实施方式中，编码EGFRvIII-NKX3.1-PSMA融合蛋白的核酸分子可包含与如SEQ ID NO:15所述的actA-ActAN100*-EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸、由该多核苷酸组成或基本上由该多核苷酸组成。
核酸分子可进一步包含其他核酸序列，包括(但不限于)限制核酸内切酶切割位点(克隆连接子)和“切割序列”(如本文中其他地方所描述)。
核酸分子可为表达盒的一部分。表达盒可包含启动子、包含所公开的核酸分子的开放阅读框和3'非翻译区域。表达盒可用于引导宿主细胞的机构产生所公开的融合蛋白。
还提供了包含所公开的核酸分子的载体。适合的载体包括例如细菌载体、病毒载体、裸DNA载体和裸RNA载体。
NKX3.1-PAP融合蛋白
本文公开了融合蛋白，其包含NK3同源盒1(NKX3.1)多肽和PAP多肽。
适合的NKX3.1多肽包括全长NKX3.1(NKX3.1的氨基酸1-234；“NKX3.1”)。在一些实施方式中，NKX3.1多肽可包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NKX3.1多肽可由与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，NKX3.1多肽可基本上由与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。
适合的PAP多肽包括PAP的氨基酸33-386(“PAP33-386”)。因此，在一些实施方式中，PAP多肽可包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，PAP多肽可由与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，PAP多肽可基本上由与如SEQ IDNO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。
NKX3.1多肽可与PAP多肽的N端或C端融合。NKX3.1多肽优选可与PAP多肽的N端融合。
融合蛋白可包含NKX3.1多肽和PAP多肽、由NKX3.1多肽和PAP多肽组成或基本上由NKX3.1多肽和PAP多肽组成，该NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，该PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:27的氨基酸残基89至678所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。
所公开的融合蛋白可进一步包含信号序列。在一些实施方式中，融合蛋白可进一步包含信号序列，其中信号序列与NKX3.1多肽和PAP多肽一起位于翻译阅读框中。适合的信号序列包括例如ActAN100(如SEQ ID NO:60所述)、ActAN100*(如SEQ ID NO:2所述)、LLO441(如SEQ ID NO:49所述)、LLO441ΔPEST(如SEQ ID NO:51所述)和LLO441Δ26(如SEQID NO:53所述)。在一些实施方式中，信号序列可包含与如SEQ ID NO:60所述的ActAN100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，信号序列可包含与如SEQ ID NO:2中所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。因此，在一些实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:27所述的ActAN100*-NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
所公开的融合蛋白可在如本文中其他地方所公开的许多适合的宿主细胞中表达。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可在细菌中表达，诸如单核细胞增生李斯特菌或其经遗传修饰的形式。
还公开了编码NKX3.1-PAP融合蛋白的核酸分子。所公开的核酸分子可编码本文中所公开的NKX3.1-PAP融合蛋白中的任一个。
所公开的核酸分子可编码NKX3.1-PAP融合蛋白，其中NKX3.1多肽由与如SEQ IDNO:28所述的NKX3.1多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸编码。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
所公开的核酸分子可编码NKX3.1-PAP融合蛋白，其中PAP多肽由与如SEQ ID NO:13所述的PAP33-386多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸编码。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
核酸分子可编码NKX3.1-PAP33-386融合蛋白。在一些实施方式中，举例而言，核酸分子可包含与如SEQ ID NO:28所述的NKX3.1多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸，以及与如SEQ ID NO:13所述的PAP33-386多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
核酸分子可进一步包含启动子、信号序列或其两者，其中启动子、信号序列或其两者与编码NKX3.1多肽的核苷酸序列和编码PAP多肽的核苷酸序列可操作地连接。适合的启动子包括例如actA(如SEQ ID NO:21所述)或hly(如SEQ ID NO:47所述)。启动子可包含例如与如SEQ ID NO:21所述的actA启动子具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。适合的信号序列包括例如ActAN100(如SEQ IDNO:59所述)、ActAN100*(如SEQ ID NO:1所述)、LLO441(如SEQ ID NO:48所述)、LLO441ΔPEST(如SEQ ID NO:50所述)和LLO441Δ26(如SEQ ID NO:52所述)。信号序列可包含例如与如SEQ ID NO:1所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。因此，在一些实施方式中，编码NKX3.1-PAP融合蛋白的核酸分子可包含与如SEQ ID NO:26所述的actA-ActAN100*-NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸、由该多核苷酸组成或基本上由该多核苷酸组成。
核酸分子可进一步包含其他核酸序列，包括(但不限于)限制核酸内切酶切割位点(克隆连接子)。
核酸分子可为表达盒的一部分。表达盒可包含启动子、包含所公开的核酸分子的开放阅读框及3'非翻译区域。表达盒可用于引导宿主细胞的机构产生所公开的融合蛋白。
还提供了包含所公开的核酸分子的载体。适合的载体包括例如细菌载体、病毒载体、裸DNA载体和裸RNA载体。
ActAN100*-SSX2融合蛋白
本文公开了融合蛋白，其包含ActAN100*多肽和SSX2多肽。
适合的SSX2多肽包括SSX2的氨基酸1-234(“SSX2”或“SSX21-234”)和SSX2的氨基酸2-234(“SSX22-234”)。在一些实施方式中，SSX2多肽可包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，SSX2多肽可由与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，SSX2多肽可基本上由与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。
ActAN100*多肽可包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，融合蛋白可包含ActAN100*多肽和SSX2多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:31所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
其他适合的信号序列包括例如ActAN100(如SEQ ID NO:60所述)、LLO441(如SEQID NO:49所述)、LLO441ΔPEST(如SEQ ID NO:51所述)和LLO441Δ26(如SEQ ID NO:53所述)。
所公开的融合蛋白可在如本文中其他地方所公开的许多适合的宿主细胞中表达。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可在细菌中表达，诸如单核细胞增生李斯特菌或其经遗传修饰的形式。
还公开了编码ActAN100*-SSX2融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，编码ActAN100*-SSX2融合蛋白的核酸分子可包含ActAN100*多核苷酸和SSX2多核苷酸、由ActAN100*多核苷酸和SSX2多核苷酸组成或基本上由ActAN100*多核苷酸和SSX2多核苷酸组成，该ActAN100*多核苷酸与如SEQ ID NO:1所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性，该SSX2多核苷酸与如SEQ ID NO:9所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，编码ActAN100*-SSX2融合蛋白的核酸分子可包含与如SEQ ID NO:30所述的actA-ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸、由该多核苷酸组成或基本上由该多核苷酸组成。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
其他适合的适合的信号序列包括例如ActAN100(如SEQ ID NO:59所述)、LLO441(如SEQ ID NO:48所述)、LLO441ΔPEST(如SEQ ID NO:50所述)和LLO441Δ26(如SEQ IDNO:52所述)。
核酸分子可进一步包含其他核酸序列，包括(但不限于)限制核酸内切酶切割位点(克隆连接子)。核酸分子可使用多种适合的限制性核酸内切酶产生，其中核酸内切酶切割位点可保持于最终核酸分子中。
核酸分子可为表达盒的一部分。表达盒可包含启动子、包含所公开的核酸分子的开放阅读框及3'非翻译区域。表达盒可用于引导宿主细胞的机构产生所公开的融合蛋白。
还提供了包含所公开的核酸分子的载体。适合的载体包括例如细菌载体、病毒载体、裸DNA载体和裸RNA载体。
ActAN100-PAP融合蛋白
本文公开了融合蛋白，其包含ActAN100多肽和PAP多肽。
适合的PAP多肽包括PAP的氨基酸30-386(“PAP30-386”)。在一些实施方式中，PAP多肽可包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，PAP多肽可由与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，PAP多肽可基本上由与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列组成。
适合的信号序列包括例如ActAN100(如SEQ ID NO:60所述)、ActAN100*(如SEQ IDNO:2所述)、LLO441(如SEQ ID NO:49所述)、LLO441ΔPEST(如SEQ ID NO:51所述)和LLO441Δ26(如SEQ ID NO:53所述)。在一些实施方式中，ActAN100多肽可包含与SEQ ID NO:33的氨基酸残基1至100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，ActAN100*多肽可包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
ActAN100-PAP融合蛋白可进一步包含SL8多肽。SL8多肽为T细胞表位标签(来自鸡卵白蛋白的“SIINFEKL”(OVA257-264))，其可用于帮助通过例如蛋白印迹检测所连接的抗原。SL8为I类(Kb)受限肽表位，其由I类MHC分子(与C57/BL6小鼠相关的H-2Kb)呈递。
在一些实施方式中，ActAN100-PAP融合蛋白可包含ActAN100多肽和PAP多肽、由ActAN100多肽和PAP多肽组成或基本上由ActAN100多肽和PAP多肽组成，该ActAN100多肽包含与SEQ ID NO:33的氨基酸残基1至100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，该PAP多肽包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，ActAN100-PAP融合蛋白可包含ActAN100*多肽和PAP多肽、由ActAN100*多肽和PAP多肽组成或基本上由ActAN100*多肽和PAP多肽组成，该ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，该PAP多肽包含与如SEQ IDNO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQID NO:33的氨基酸残基1-459所述的ActAN100-PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。在一些实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:33所述的ActAN100-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。
所公开的融合蛋白可在如本文中其他地方所公开的许多适合的宿主细胞中表达。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可在细菌中表达，诸如单核细胞增生李斯特菌或其经遗传修饰的形式。
还公开了编码ActAN100-PAP融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，编码ActAN100-PAP融合蛋白的核酸分子可包含与如SEQ ID NO:32所述的actA-ActAN100-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸、由该多核苷酸组成或基本上由该多核苷酸组成。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
适合的信号序列包括例如ActAN100(如SEQ ID NO:59所述)、LLO441(如SEQ IDNO:48所述)、LLO441ΔPEST(如SEQ ID NO:50所述)和LLO441Δ26(如SEQ ID NO:52所述)。
核酸分子可进一步包含其他核酸序列，包括(但不限于)限制核酸内切酶切割位点(克隆连接子)。核酸分子可使用多种适合的限制性核酸内切酶产生，其中核酸内切酶切割位点可保持于最终核酸分子中。
核酸分子可为表达盒的一部分。表达盒可包含启动子、包含所公开的核酸分子的开放阅读框及3'非翻译区域。表达盒可用于引导宿主细胞的机构产生所公开的融合蛋白。
还提供了包含所公开的核酸分子的载体。适合的载体包括例如细菌载体、病毒载体、裸DNA载体和裸RNA载体。
包含编码免疫原性多肽的核酸分子的宿主细胞
还提供了包含所公开的核酸分子中的任一个的宿主细胞。还公开了表达由所公开的核酸分子中的任一个编码的融合蛋白的宿主细胞。
适合的宿主细胞包括例如细菌。宿主细胞可经减毒、共生和/或杀灭，但具有代谢活性。在示例性实施方式中，宿主细胞可为经减毒、共生和/或杀灭但具有代谢活性的细菌。适合的细菌包括(但不限于)单核细胞增生李斯特菌、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、大肠杆菌(Escherichia coli)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠伤寒沙门杆菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)或分枝杆菌(mycobacterium)物种，或其经修饰的形式。在一些实施方式中，举例而言，宿主细胞可为单核细胞增生李斯特菌或其经修饰的形式。修饰包括突变、变化及其他遗传改变/变异以及热处理或化学修饰，其降低宿主细胞对受试者的毒性。细菌可经修饰例如以降低与受试者内的细胞的结合、降低受试者内自一个细胞向另一个细胞的传播、降低受试者中的细胞外生长或降低受试者中的细胞内生长。
适合作为宿主细胞的细菌菌株包括美国专利申请第13/988,076号(美国专利公开案第2014/037662号)中所描述的细菌菌株，其以全文引用的方式并入本文中。举例而言，宿主细胞可为单核球增多性李斯特菌的活减毒菌株，其经遗传修饰以包含actA和/或inlB中的减毒突变，且优选为所有或一部分actA及inlB的缺失(在本文中称为“LmΔactA/ΔinlB”)，且含有编码免疫原性融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌可为actA缺失(ΔactA)突变体、actA插入突变体、inlB缺失(ΔinlB)突变体、inlB插入突变体或其组合。举例而言，单核细胞增生李斯特菌可为ΔactA/ΔinlB突变体。
宿主细胞可包含所公开的核酸分子中的一个或多个。一个或多个核酸分子可整合至宿主细胞基因组中。此类宿主细胞可含有受宿主细胞表达序列控制的核酸从而无需真核转录或翻译组件。核酸分子可整合至actA基因座、inlB基因座或tRNAArg基因座中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至actA基因座中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至inlB基因座中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至tRNAArg基因座中。表4提供包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子的宿主细胞的示例性清单，其中核酸分子整合至宿主细胞基因组中。以下清单仅意为示例性。
表4
相反，宿主细胞可包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子以染色体外方式位于宿主细胞内。举例而言，可将所公开的编码免疫原性融合蛋白的核酸分子中的一个或多个插入宿主细胞内附加型(episomal)质粒上的表达盒中。
在一些实施方式中，宿主细胞可包含所公开的核酸分子中的一个或多个，其中核酸分子包含：
a)多核苷酸的一个或多个拷贝，其与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性，和与如SEQ IDNO:9所述的SSX2多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；
b)多核苷酸的一个或多个拷贝，其与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性，和与如SEQ IDNO:13所述的PAP33-386多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；
c)多核苷酸的一个或多个拷贝，其与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；与如SEQ IDNO:24所述的NKX3.111-234多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；和与如SEQ ID NO:19所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；
d)多核苷酸的一个或多个拷贝，其与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；与如SEQ IDNO:17所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；和与如SEQ ID NO:19所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；
e)与如SEQ ID NO:28所述的NKX3.1多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸，和与如SEQ ID NO:13所述的PAP33-386多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；
f)与如SEQ ID NO:1所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的ActAN100*多核苷酸，和与如SEQ ID NO:9所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的SSX2多核苷酸；
g)与如SEQ ID NO:32所述的ActAN100-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；或
h)其任意组合，
i)其中核酸分子整合至actA基因座、inlB基因座或tRNAArg基因座中，或其中核酸分子插入宿主细胞内附加型质粒上的表达盒中。
在一些方面，a)-h)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
如本文中其他地方所公开，所公开的免疫原性融合蛋白和编码其的核酸分子可包含一个或多个EGFRvIII多肽。因此，“与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸的一个或多个拷贝”包括(但不限于)免疫原性融合蛋白和编码其的核酸分子，其包含2、3、4、5个或更多个EGFRvIII多肽的拷贝。
在一些实施方式中，宿主细胞可包含核酸分子中的一个或多个，所述核酸分子包含：
a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
c)与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
d)与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
e)与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
f)与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
g)与如SEQ ID NO:32所述的ActAN100-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核酸序列；
h)与如SEQ ID NO:34所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
i)与如SEQ ID NO:36所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
j)与如SEQ ID NO:38所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
k)与如SEQ ID NO:40所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
l)其任意组合，
m)其中核酸分子整合至actA基因座、inlB基因座或tRNAArg基因座中，或其中核酸分子插入宿主细胞内附加型质粒上的表达盒中。
在一些方面，a)-l)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
宿主细胞可包含核酸分子，其包含：(a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；(b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(c)与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至actA基因座中；可将与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中；且可将与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
宿主细胞可包含核酸分子，其包含：(a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；(b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(c)与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至actA基因座中；可将与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中；且可将与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
宿主细胞可包含核酸分子，其包含：(a)与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(b)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中，且可将与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
宿主细胞可包含核酸分子，其包含：(a)与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(b)与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中，且可将与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，其包含编码以下物质的核酸序列：
a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和SSX2多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和PAP多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ IDNO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽和PAP多肽，所述NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和SSX2多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
g)ActAN100-PAP30-386融合蛋白，其中融合蛋白包含ActAN100*多肽和PAP多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ IDNO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
其中核酸分子整合至actA基因座、inlB基因座或tRNAArg基因座中，或其中核酸分子插入宿主细胞内附加型质粒上的表达盒中。
在一些方面，a)-g)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
宿主细胞可表达一种或多种融合蛋白，其包含：
EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和SSX2多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和PAP多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽和PAP多肽，所述NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和SSX2多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ IDNO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
ActAN100-PAP30-386融合蛋白，其中融合蛋白包含ActAN100*多肽和PAP多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ IDNO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，其包含编码以下物质的核酸序列：
a)与如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
b)与如SEQ ID NO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
c)与如SEQ ID NO:23的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
d)与如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
e)与如SEQ ID NO:27的氨基酸残基89至678所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
f)与如SEQ ID NO:31所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
g)与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基1-459所述的ActAN100-PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
h)与如SEQ ID NO:35的氨基酸残基89至476所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
i)与如SEQ ID NO:37的氨基酸残基89至509所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
j)与如SEQ ID NO:39的氨基酸残基89至541所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
k)与如SEQ ID NO:41的氨基酸残基89至573所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；或
l)其任意组合；
m)其中核酸分子整合至actA基因座、inlB基因座或tRNAArg基因座中，或其中核酸分子插入宿主细胞内附加型质粒上的表达盒中。
在一些方面，a)-l)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
宿主细胞可表达一种或多种融合蛋白，其包含：
a)与如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
b)与如SEQ ID NO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
c)与如SEQ ID NO:23的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
d)与如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
e)与如SEQ ID NO:27的氨基酸残基89至678所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
f)与如SEQ ID NO:31所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
g)与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基1-459所述的ActAN100-PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
h)与如SEQ ID NO:35的氨基酸残基89至476所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
i)与如SEQ ID NO:37的氨基酸残基89至509所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
j)与如SEQ ID NO:39的氨基酸残基89至541所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
k)与如SEQ ID NO:41的氨基酸残基89至573所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；或
l)其任意组合。
本文中提供了重组型李斯特菌(Listeria)，其经修饰以包含所公开的核酸分子中的任一个。核酸分子可以染色体外形式存在于李斯特菌中，或可整合至细菌基因组中。在一些实施方式中，举例而言，宿主细胞可为单核细胞增生李斯特菌ΔactA/ΔinlB突变体，其具有编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，该免疫原性融合蛋白整合至actA基因座、inlB基因座或tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。李斯特菌可用作表达平台以用于表达对宿主细胞而言为异源的所公开的融合蛋白。此类表达可引起例如对含有宿主细胞的受试者中的异源性融合蛋白的免疫响应。
免疫原性融合蛋白的表达由Lm actA启动子驱动，其在Lm感染宿主细胞时高度诱导。actA基因驻留于PrfA区域中，其为表达受PrfA控制及诱导的一系列Lm毒性基因，PrfA为在受感染的宿主细胞的情形下诱导的转录活化因子蛋白质。所公开的核酸分子中的表达盒排他地利用Lm转录、翻译及分泌机制且其不含任何哺乳动物表达组件(诸如哺乳动物表达系统的启动子或终止子区域特征)。因此，与必须利用哺乳动物宿主细胞机制以表达指定目的基因的基于质粒DNA或基于病毒的载体不同，且根据定义，其中基因转移为基因表达的前提条件，Lm为“自含型(self-contained)”自由活有机体。在经疫苗接种的宿主的受感染的细胞内，排他地使用所公开的宿主细胞的原核表达机制以在宿主细胞内合成融合蛋白，其随后分泌至感染细胞的细胞质中以用于抗原处理及呈递。
在一些实施方式中，宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，其中所述一种或多种核酸分子包含如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2、如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386和如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，其中所述一种或多种核酸分子由以下物质组成：如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2、如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386和如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
宿主细胞可与药学上可接受的赋形剂组合。
本文中还提供了包含所公开的宿主细胞及药学上可接受的赋形剂的疫苗。疫苗可以足以引起如本文中所公开的适合的免疫响应的量施用于受试者。
引发免疫响应的方法
本文中还公开了引发受试者中的免疫响应的方法，其包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，该方法包括对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞表达本文中所公开的融合蛋白中的一个或多个。
如本文中所使用，“宿主细胞”包括一个或多个宿主细胞，其中各宿主细胞可包含一种或多种编码免疫原性融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，宿主细胞可包含相同的编码免疫原性融合蛋白的核酸分子。举例而言且不意欲为限制性，该方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-SSX2的核酸分子。在一些实施方式中，宿主细胞可包含不同的编码不同免疫原性融合蛋白的核酸分子。
所述方法可使用本文中所公开的宿主细胞中的任一个进行，其中宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子。
引发受试者中的免疫响应的方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，该宿主细胞包含一个或多个核酸分子，所述核酸分子包含编码以下物质的核酸序列：
a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ IDNO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含：NKX3.1多肽，其包含与如SEQID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含：ActAN100*多肽，其包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性。ii)95％同一性。iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
g)ActAN100*-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含：ActAN100*多肽，其包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
h)其任意组合。
在一些方面，a)-h)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
本文公开了引发受试者中的免疫响应的方法，其包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞表达一种或多种融合蛋白，其包含：
a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ IDNO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含：NKX3.1多肽，其包含与如SEQID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含：ActAN100*多肽，其包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
g)ActAN100*-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含：ActAN100*多肽，其包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
h)其任意组合。
在一些实施方式中，所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含：一个或多个与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸的拷贝，和与如SEQ ID NO:9所述的SSX2多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的免疫原性融合蛋白。
在一些实施方式中，所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含：一个或多个与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸的拷贝，和与如SEQ ID NO:13所述的PAP33-386多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的免疫原性融合蛋白。
在一些实施方式中，所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含：一个或多个与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸的拷贝；与如SEQ ID NO:24所述的NKX3.111-234多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；和与如SEQ ID NO:19所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的免疫原性融合蛋白。
在一些实施方式中，所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含：一个或多个与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸的拷贝；与如SEQ ID NO:17所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；和与如SEQ ID NO:19所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的免疫原性融合蛋白。
在一些实施方式中，所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含：与如SEQ IDNO:28所述的NKX3.1多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸，和与如SEQ ID NO:13所述的PAP33-386多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的免疫原性融合蛋白。
在一些实施方式中，所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含：与如SEQ ID NO:1所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的ActAN100*多核苷酸，和与如SEQ ID NO:9所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的SSX2多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的免疫原性融合蛋白。
在一些实施方式中，所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含与如SEQ ID NO:32所述的ActAN100-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的免疫原性融合蛋白。
在一些实施方式中，所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含以上核酸分子的任意组合。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的免疫原性融合蛋白。
宿主细胞可包含所公开的核酸分子中的一个或多个，其中核酸分子包含：
a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
c)与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
d)与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
e)与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
f)与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
g)与如SEQ ID NO:32所述的ActAN100-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核酸序列；
h)与如SEQ ID NO:34所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
i)与如SEQ ID NO:36所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
j)与如SEQ ID NO:38所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
k)与如SEQ ID NO:40所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；或
l)其组合。
在一些方面，a)-l)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，宿主细胞表达一种或多种融合蛋白，所述一种或多种融合蛋白由包含以下序列的核酸分子表达：
a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
c)与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
d)与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
e)与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
f)与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
g)与如SEQ ID NO:32所述的ActAN100-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核酸序列；
h)与如SEQ ID NO:34所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
i)与如SEQ ID NO:36所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
j)与如SEQ ID NO:38所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
k)与如SEQ ID NO:40所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；或
l)其组合。
在一些方面，a)-l)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含与如SEQ ID NO:32所述的ActAN100-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
该方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含与如SEQ ID NO:34所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
该方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含与如SEQ ID NO:36所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
该方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含与如SEQ ID NO:38所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
该方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含与如SEQ ID NO:40所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
该方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
如本文中先前所描述，核酸分子可整合至actA基因座、inlB基因座或tRNAArg基因座中或可插入宿主细胞内附加型质粒上的表达盒中。
在一些实施方式中，所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含一个或多个编码免疫原性融合蛋白的核酸分子。所述方法中可使用本文中描述的包含一个或多个核酸分子的宿主细胞中的任一个。
所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含：(a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；(b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(c)与如SEQ IDNO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至actA基因座中；可将与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中；且可将与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含：(a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；(b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(c)与如SEQ IDNO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至actA基因座中；可将与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中；且可将与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞表达一种或多种融合蛋白，该融合蛋白由包含以下序列的核酸分子表达：
a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和
c)与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。
在一些方面，a)-c)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，所述一个或多个核酸分子由以下序列组成：如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2、如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386及如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含：(a)与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(b)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中，且可将与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
所述方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子包含：(a)与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(b)与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中，且可将与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
本文中所公开的宿主细胞中的任一个适用于所公开的方法中。举例而言，宿主细胞可为单核细胞增生李斯特菌的活减毒菌株，其经遗传修饰以包含actA和/或inlB中的减毒突变，且优选缺失所有或一部分actA和inlB(在本文中称为“LmΔactA/ΔinlB”)，且含有编码免疫原性融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌可为actA缺失突变体、actA插入突变体、inlB缺失突变体、inlB插入突变体或其组合。举例而言，单核细胞增生李斯特菌可为ΔactA/ΔinlB突变体。
向受试者施用组合物的适合的模式包括(但不限于)静脉内、经口、皮下、皮内、肌肉内、腹膜内、经粘膜、经鼻施用或其任意组合。在一些实施方式中，施用步骤可静脉内进行。
宿主细胞可用作表达平台以在受试者内表达所公开的免疫原性融合蛋白，由此引发针对含有宿主细胞的受试者中的异源融合蛋白的免疫响应。举例而言，融合蛋白可由宿主细胞在受试者内受感染细胞的细胞质液中表达及分泌。受感染细胞包括受试者内任何可摄取宿主细胞的细胞。在一些实施方式中，受感染细胞可为抗原呈递细胞。抗原呈递细胞(APC)为用于向T细胞呈递抗原的免疫系统的细胞。APC包括树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、边际区域库普弗细胞(marginal zone Kupffer cells)、微神经胶质细胞、朗格罕氏细胞(Langerhans cells)、T细胞和B细胞。在一些实施方式中，融合蛋白可在受试者的一个或多个细胞中表达。
在一些实施方式中，方法可包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含：
a)与如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
b)与如SEQ ID NO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
c)与如SEQ ID NO:23的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
d)与如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
e)与如SEQ ID NO:27的氨基酸残基89至678所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
f)与如SEQ ID NO:35的氨基酸残基89至476所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
g)与如SEQ ID NO:37的氨基酸残基89至509所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
h)与如SEQ ID NO:39的氨基酸残基89至541所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
i)与如SEQ ID NO:41的氨基酸残基89至573所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；或
j)其任意组合。
在一些方面，a)-j)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
所公开的方法可用于引发EGFRvIII免疫响应、SSX2免疫响应、PAP免疫响应、NKX3.1免疫响应、PSMA免疫响应、针对李斯特菌的免疫性或其任意组合。因此，提供了引发受试者中的EGFRvIII免疫响应的方法，其包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子。还提供了引发受试者中的SSX2免疫响应的方法，其包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子。还提供了引发受试者中的PAP免疫响应的方法，其包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子。还提供了引发受试者中的NKX3.1免疫响应的方法，其包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子。还提供了引发受试者中的PSMA免疫响应的方法，其包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子。还提供了引发受试者中的针对李斯特菌的免疫性的方法，其包含对受试者施用包含单核细胞增生李斯特菌的组合物，其中宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子。
增加抗原性肽的表达的方法
本文中还公开了增加抗原性肽的表达的方法，其包含在宿主细胞中表达所公开的核酸分子中的一个或多个。
所述增加抗原性多肽的表达的方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含编码以下物质的核酸序列：
a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ IDNO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含：NKX3.1多肽，其包含与如SEQID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含：ActAN100*多肽，其包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
g)ActAN100*-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含：ActAN100*多肽，其包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
h)其任意组合。
在一些方面，a)-h)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
所述方法可使用本文中所公开的核酸分子中的任一个进行。在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含：与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸的一个或多个拷贝，和与如SEQ ID NO:9所述的SSX2多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含：与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸的一个或多个拷贝，和与如SEQ ID NO:13所述的PAP33-386多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含：与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸的一个或多个拷贝；与如SEQ ID NO:24所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；和与如SEQ ID NO:19所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含：与如SEQ ID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸的一个或多个拷贝；与如SEQ ID NO:17所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；和与如SEQ ID NO:19所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含：与如SEQ ID NO:28所述的NKX3.1多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸，和与如SEQ ID NO:13所述的PAP33-386多核苷酸具有至少90％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子可包含：与如SEQ ID NO:1所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸，和与如SEQ ID NO:9所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:32所述的ActAN100-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达以上核酸分子的任意组合。
宿主细胞可包含以下核酸分子中的一个或多个：
a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
c)与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
d)与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
e)与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
f)与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
g)与如SEQ ID NO:32所述的ActAN100-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核酸序列；
h)与如SEQ ID NO:34所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
i)与如SEQ ID NO:36所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
j)与如SEQ ID NO:38所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
k)与如SEQ ID NO:40所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；或
l)或其组合。
在一些方面，a)-l)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:34所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:36所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:38所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:40所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
如本文中先前所描述，核酸分子可整合至actA基因座、inlB基因座或tRNAArg基因座中或可插入宿主细胞内附加型质粒上的表达盒中。
在一些实施方式中，所述方法可包含在宿主细胞中表达以上核酸分子中的一个或多个。
所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含：(a)与如SEQ IDNO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；(b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(c)与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至actA基因座中；可将与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中；且可将与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含：(a)与如SEQ IDNO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；(b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(c)与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至actA基因座中；可将与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中；且可将与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含：(a)与如SEQ IDNO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(b)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中，且可将与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含：(a)与如SEQ IDNO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(b)与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中，且可将与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
所公开的方法可在任何支持或可经配置以支持所公开的核酸分子的转录和抗原性多肽的表达的宿主细胞中进行，包括(但不限于)细菌细胞、病毒细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。表达步骤可通过将核酸分子引入宿主细胞且使宿主细胞机构产生抗原性多肽来进行。举例而言，宿主细胞可为单核细胞增生李斯特菌的活减毒菌株，其经遗传修饰以包含actA和/或inlB中的减毒突变，且优选缺失所有或一部分actA和inlB(在本文中称为“LmΔactA/ΔinlB”)，且含有编码免疫原性融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌可为actA缺失突变、actA插入突变、inlB缺失突变、inlB插入突变或其组合。举例而言，单核细胞增生李斯特菌可为ΔactA/ΔinlB突变体。
作为另选，表达步骤可通过向感兴趣的细胞施用宿主细胞来进行，其中抗原性多肽在该感兴趣的细胞内产生。在一些实施方式中，表达步骤可通过用宿主细胞感染感兴趣的细胞来进行，其中抗原性多肽在感兴趣的细胞内产生。在一些实施方式中，表达步骤可通过向受试者施用宿主细胞来进行，其中抗原性多肽在受试者内产生。
所述方法可包含在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子编码包含以下序列的融合蛋白：
a)与如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
b)与如SEQ ID NO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
c)与如SEQ ID NO:23的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
d)与如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
e)与如SEQ ID NO:27的氨基酸残基89至678所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
f)与如SEQ ID NO:35的氨基酸残基89至476所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
g)与如SEQ ID NO:37的氨基酸残基89至509所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
h)与如SEQ ID NO:39的氨基酸残基89至541所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；
i)与如SEQ ID NO:41的氨基酸残基89至573所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列或其免疫原性片段；或
j)其任意组合。
在一些方面，a)-j)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
治疗癌症的方法
本文公开了治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括对受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含本文中所公开的核酸中的一个或多个。在一些实施方式中，宿主细胞表达由所述一个或多个核酸分子编码的一个或多个融合蛋白。举例而言，宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码以下物质的核酸序列：
a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ IDNO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含：NKX3.1多肽，其包含与如SEQID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含：ActAN100*多肽，其包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
g)ActAN100-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含：ActAN100多肽，其包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基1至100所述的ActAN100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
h)其任意组合。
在一些方面，a)-h)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
还公开了治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞表达一种或多种融合蛋白，其包含：
a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ IDNO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含：NKX3.1多肽，其包含与如SEQID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含：ActAN100*多肽，其包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
g)ActAN100-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含：ActAN100多肽，其包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基1至100所述的ActAN100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
h)其任意组合。
在一些实施方式中，宿主细胞表达(a)、(b)和(d)。
在一些实施方式中，所述一个或多个核酸分子可包含与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述一个或多个核酸分子可包含与如SEQ ID NO:34所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述一个或多个核酸分子可包含与如SEQ ID NO:36所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述一个或多个核酸分子可包含与如SEQ ID NO:38所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述一个或多个核酸分子可包含与如SEQ ID NO:40所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述一个或多个核酸分子可包含与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述一个或多个核酸分子可包含与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述一个或多个核酸分子可包含与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述一个或多个核酸分子可包含与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述一个或多个核酸分子可包含与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述一个或多个核酸分子可包含与如SEQID NO:32所述的ActAN100-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述一个或多个核酸分子可包含其任意组合。宿主细胞可表达由以上核酸分子中的任一个编码的融合蛋白。
在一些方面，所述方法包括对受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞表达一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白由包含以下序列的核酸分子表达：
a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和
c)与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。
在一些方面，a)-c)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，核苷酸序列可操作地连接于ActA启动子。ActA启动子可具有如SEQ ID NO:21所述的序列。
在一些方面，融合蛋白由核酸分子表达，该核酸分子由以下序列组成：
a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和
c)与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。
在一些方面，a)-c)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
在一些实施方式中，核苷酸序列可操作地连接于ActA启动子。ActA启动子可具有如SEQ ID NO:21所述的序列。
在一些方面，融合蛋白由核酸分子表达，该核酸分子由以下序列组成：如SEQ IDNO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2、如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386及如SEQ IDNO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
宿主细胞可包含整合至宿主细胞基因组中的核酸分子。此类宿主细胞含有受宿主细胞表达序列控制的核酸且从而无需真核转录或翻译组件。核酸分子可整合至actA基因座、inlB基因座或tRNAArg基因座中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至actA基因座中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至inlB基因座中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至tRNAArg基因座中。宿主细胞可包含编码融合蛋白的核酸分子，其中核酸分子以染色体外方式位于宿主细胞内。举例而言，可将所公开的编码免疫原性融合蛋白的核酸分子中的一个或多个插入宿主细胞内附加型质粒上的表达盒中。
所述方法可包含对受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含一个或多个核酸分子，所述核酸分子包含：(a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；(b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(c)与如SEQ IDNO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至actA基因座中；可将与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中；且可将与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
所述方法可包含对受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含一个或多个核酸分子，所述核酸分子包含：(a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；(b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(c)与如SEQ IDNO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至actA基因座中；可将与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中；且可将与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
所述方法可包含对受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含一个或多个核酸分子，所述核酸分子包含：(a)与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(b)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中，且可将与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
所述方法可包含对受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含一个或多个核酸分子，所述核酸分子包含：(a)与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和(b)与如SEQ ID NO:30所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些方面，可将与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至inlB基因座中，且可将与如SEQ ID NO:30所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列整合至tRNAArg基因座中。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。
PAP为由前列腺柱状上皮细胞(良性和恶性)分泌的主要蛋白质中的一种。PAP作为免疫疗法中的试剂的功效在西普亮塞-T(sipuleucel-T)的2010FDA许可中得以验证，西普亮塞-T为靶向PAP作为晚期前列腺癌的治疗的自体细胞免疫疗法。
PSMA为具有叶酸水解酶和神经羰基肽酶活性的100kDA II型跨膜糖蛋白。非分泌型、完整细胞表面膜蛋白PSMA在几乎所有前列腺癌症中表达，其中表达在高级恶性病、转移性疾病和抗去势性前列腺癌中逐渐增加。PSMA在前列腺癌中的作用未知，然而，PSMA的表达与疾病进程有关，其表明PSMA在前列腺癌的进程中具有功能性作用。PSMA也在实体肿瘤的新生血管而非正常脉管中表达。尽管在新生血管中的作用未知，但PSMA的叶酸水解酶活性可能在促进上皮组织中的血小管生成方面为重要的。
SSX蛋白为癌症-睾丸抗原(CTA)，其代表具有细胞核定位、HLA I类缺失型睾丸或卵巢生殖系细胞中的受限表达以及多种组织学来源的肿瘤中(尤其晚期癌症中)的频繁过表达的高度同源CTA的超家族。SSX蛋白的表达已与干细胞迁移相关，其表明其在转移性表达型中起重要生物作用。因为胚细胞不表达I类MHC分子，其受保护避免旁观者自体免疫性。SSX2在癌细胞中的过表达及其在正常HLA I类表达细胞中的受限表达使得SSX2成为基于T细胞的策略的特别有吸引力的免疫疗法靶标。CTA通常仅在睾丸的胚细胞中表达且已在癌症患者中展示自发性免疫原性。CTA在癌症组织中的异位表达使得这些蛋白质成为理想的免疫疗法目标。重要的是，选择SSX2作为前列腺癌的免疫目标，因为可在前列腺癌患者中检测到对SSX-2具有特异性的IgG响应及CD8+T细胞，且已在晚期前列腺癌中证明表达。
NKX3.1为同源盒蛋白且映射至人类染色体hp21的最小区域。NKX3.1为正常前列腺发育所需且与胚胎前列腺发育、新生分化和成年人功能的所有方面相关联。其为最早已知的前列腺形成标记物且在前列腺分化的所有阶段和成人期中持续表达。组织特异性调节基因NKX3.1为正常形态发生和前列腺的功能所必需的，而其失活可引起可模型化瘤前病况的前列腺上皮增生和发育不良。NKX3.1标记具有茎干类性质的腔细胞群，其在雄激素剥夺(androgen ablation)之后在前列腺中持续。重要的是，这些抗去势性NKX3.1表达细胞(CARN)据显示可充当前列腺癌的细胞来源，因为NKX3.1表达细胞的缺失使前列腺肿瘤在雄激素剥夺和睾酮耗尽之后不能发展。NKX3.1在CARN上的独特过表达使得有可能通过针对此抗原进行接种来靶向前列腺CSC的直接前驱物。此外，最近经由全基因组关联筛选发现人类NKX3.1为7种前列腺癌敏感性基因座中的1种，使其成为前列腺癌的免疫疗法的极具吸引力的新抗原靶标。当前分析指示可在所检验的几乎所有前列腺癌和癌转移中发现少量NKX3.1。因此，似乎在整个癌症进程中存在降低但不丧失的NKX3.1表达的选择。
EGFR为对细胞生长及存活至关重要的受体酪氨酸激酶。EGFR基因在人类癌症中频繁过表达或突变，包括头部及颈部、结肠、胰腺、乳腺、卵巢、肾脏和恶性神经胶质瘤。EGFRvIII由267个氨基酸缺失及外显子1与外显子8的融合产生，产生在接合点处具有新颖甘氨酸的肿瘤特异性肽。患有表达EGFRvIII的乳腺癌的患者具有针对此肽的可检测的体液及细胞免疫响应，表明其充当免疫原性新抗原。EGFRvIII重复序列由于其与融合蛋白(PAP、PSMA、SSX2和NKX3.1)的较高表达及针对前列腺癌相关抗原的较高抗原特异性免疫响应的相关性而被包括在所公开的免疫原性融合蛋白中。由于原生EGFR为正常功能细胞群中的信号转导所需的，值得注意的是，所公开的免疫原性融合蛋白仅含有由肿瘤细胞中外显子2至7的缺失表达的EGVRvIII新抗原区域的21氨基酸型片段。
因此，可用所公开的方法治疗适合的癌症，包括表达EGFRvIII的癌症、表达SSX2的癌症、表达PAP的癌症、表达NKX3.1的癌症、表达PSMA的癌症或其任意组合。所述癌症优选为前列腺癌。
本文中所公开的宿主细胞中的任一个适用于所公开的方法中。举例而言，宿主细胞可为单核细胞增生李斯特菌。在优选方面，宿主细胞可为单核细胞增生李斯特菌的活减毒菌株，其经遗传修饰以包含actA和/或inlB中的缓解突变，且优选缺失所有或一部分actA及inlB(在本文中称为“LmΔactA/ΔinlB”)，且含有编码所公开的免疫原性融合蛋白中的一个或多个的核酸分子。在一些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌可为actA缺失(ΔactA)突变体、actA插入突变体、inlB缺失(ΔinlB)突变体、inlB插入突变体或其组合。举例而言，单核细胞增生李斯特菌可为ΔactA/ΔinlB突变体。
宿主细胞可用作表达平台以用于表达由受试者内的核酸分子编码的免疫原性融合蛋白，由此引发针对EGFRvIII表达肿瘤细胞、SSX2表达肿瘤细胞、PAP表达肿瘤细胞、NKX3.1表达肿瘤细胞和/或PSMA表达肿瘤细胞的抗肿瘤响应。融合蛋白可由宿主细胞在受试者内受感染细胞的细胞质液中表达和分泌。受感染细胞包括受试者内任何可摄取宿主细胞的细胞。在一些实施方式中，受感染细胞可为抗原呈递细胞。
宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码与如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码与如SEQ ID NO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码与如SEQ ID NO:23的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码与如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码与如SEQ ID NO:27的氨基酸残基89至678所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码与如SEQ ID NO:31所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基1-459所述的ActAN100-PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码与如SEQ ID NO:35的氨基酸残基89至476所述的ActAN100*-EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码与如SEQ ID NO:37的氨基酸残基89至509所述的ActAN100*-EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码与如SEQ ID NO:39的氨基酸残基89至541所述的ActAN100*-EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码与如SEQ ID NO:41的氨基酸残基89至573所述的ActAN100*-EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。在一些方面，核酸分子可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，宿主细胞表达由核酸分子编码的融合蛋白。
宿主细胞可包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码以上氨基酸序列的任意组合的核酸序列。在一些实施方式中，宿主细胞表达由所述一个或多个核酸分子编码的融合蛋白的组合。举例而言，宿主细胞可表达一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白包含：
a)与如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)与如SEQ ID NO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和
c)与如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，a)-c)中列举的一个或多个核酸分子可操作地连接于启动子。
宿主细胞可表达一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白由以下序列组成：
a)与如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b)与如SEQ ID NO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和
c)与如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
宿主细胞可表达一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白由以下序列组成：如SEQ IDNO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2、如SEQ ID NO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386和如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750。
所公开的方法可进一步包含在施用组合物之前，测定在来自受试者的生物样品中EGFRvIII、SSX2、PAP、NKX3.1、PSMA或其任意组合的表达。用于测定来自受试者的生物样品中的EGFRvIII、SSX2、PAP、NKX3.1、PSMA或其组合的表达水平的方法包括(但不限于)免疫组织化学(IHC)、蛋白印迹、显微法、免疫沉淀、BCA分析法、分光光度法、体内成像或其任意组合。可在生物样品中检测EGFRvIII、SSX2、PAP、NKX3.1和/或PSMA，所述生物样品包括(但不限于)血液、淋巴、体液、骨髓、实体肿瘤样品或其任意组合。
组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂。举例而言，宿主细胞可与任何适合的缓冲液组合，包括(但不限于)磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)和丙三醇。在一个示例性实施方式中，可在杜贝克氏磷酸盐缓冲生理食盐水(Dulbecco's phosphate-buffered saline；PBS)和丙三醇中调配组合物，冷冻储存(处于或低于-60℃)直至施用，且在氯化钠中通过静脉内(IV)输注经适合的时间段施用。本领域技术人员已知，施用组合物的时间段部分地取决于癌症类型、癌症的严重程度和受试者的年龄、体重等。组合物优选可经数小时时段施用。举例而言，组合物可经1-2小时时段施用。在其它实施方式中，组合物可在小于1-2小时内施用。在其它实施方式中，组合物可在大于1-2小时内施用。
治疗可包括组合物的单次剂量或组合物的多次剂量。因此，所公开的方法可包含对受试者施用包含一次或多次剂量的宿主细胞的组合物，其中宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子。可决定剂量的次数的因素包括例如癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合。不意欲为限制性，可基于癌症的进程或减缓进程失效、癌症症状的严重程度增加或严重程度无变化、癌症症状的频率增加或频率无变化、肿瘤尺寸增加或肿瘤尺寸无变化或其任意组合来增加剂量的次数。举例而言，可对受试者施用1至100次剂量以上的组合物。
可决定宿主细胞的剂的因素包括例如癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合。在一些实施方式中，组合物可包含约1×108至约1×109个菌落形成单位(CFU)的宿主细胞。在一些方面，组合物可包含约1×108个CFU的宿主细胞。在一些方面，组合物可包含约1×109个CFU的宿主细胞。
组合物可约每7天施用一次、约每14天施用一次、约每21天施用一次、约每28天施用一次、约每35天施用一次、约每42天施用一次、约每49天施用一次、约每56天施用一次、约每63天施用一次、约每70天施用一次、约每77天施用一次、约每84天施用一次或约每91天施用一次。
基于前述内容，本领域技术人员将理解，可通过施用所描述剂量的本文所述的组合物中的任一个来治疗受试者的癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药以所描述的常规间隔重复。因此，在一个实施方式中，可以约1×108至约1×109个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每7天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×108至约1×109个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每14天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×108至约1×109个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每21天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×108至约1×109个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每35天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×108至约1×109个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每45天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×108至约1×109个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每60天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×108至约1×109个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每90天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×108个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每7天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×108个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每14天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×108个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每21天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×108个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每35天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×108个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每45天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×108个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每60天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×108个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每90天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×109个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每7天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×109个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每14天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×109个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每21天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×109个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每35天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×109个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每45天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×109个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每60天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。在一个实施方式中，可以约1×109个CFU的剂量对受试者施用组合物，以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每90天重复一次。此外，本文中所描述的组合物可以适于以此方式施用所述剂量的药物制剂形式制备。
治疗优选可包括其中不对受试者施用组合物的给药之间的时间段。举例而言，所述方法可包含对受试者施用第一剂量的包含宿主细胞的组合物，其中宿主细胞包含编码免疫原性融合蛋白的核酸分子，监测第一剂量的功效，且若第一剂量无效，则对受试者施用一次或多次剂量的组合物。可决定组合物的功效的因素包括例如癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合。不意欲为限制性，癌症发展或降低癌症进程失效、癌症症状的严重程度增加或严重程度不变化、癌症症状的频率增加或频率不变化、肿瘤尺寸增加或尺寸不变化或其任意组合可指示第一剂量的组合物无效。各次剂量之间适合的时间段包括数天、数周或数月。在一些实施方式中，各次剂量之间的时间段可为约1天至约90天、约5天至约80天、约10天至约70天、约15天至约60天、约20天至约50天或约25天至约40天。举例而言，各次剂量之间的周期可为约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约14天、约21天、约28天、约35天、约42天、约49天、约56天、约60天、约65天、约70天、约80天、约85天或约90天。
向受试者施用组合物的适合的模式包括(但不限于)静脉内、经口、皮下、皮内、肌肉内、腹膜内、经粘膜、经鼻施用或其任意组合。在一些实施方式中，施用步骤可在静脉内进行。
治疗可进一步包含在施用组合物之后对受试者施用抗生素。举例而言，一旦对患者施用最终剂量的组合物且在适合的间隔时间之后，可对患者施用抗生素。因此，在优选方面，在组合物的最后一次给药之后施用抗生素。在对青霉素过敏的受试者中，适合的抗生素包括(但不限于)阿莫西林或甲氧苄啶(trimethoprim)/磺胺甲基异噁唑。本领域技术人员将能够测定用于对受试者施用抗生素的足够的剂及给药方案。
提供以下实施例以进一步描述一些本文中所公开的实施方式。实施例意欲说明但不限制所公开的实施方式。
实施例
方法
疫苗菌株的分子构建
如Brockstedt,D.G.等人,Listeria-based cancer vaccines that segregateimmunogenicity from toxicity.PNAS(2004)101(38):13832-13837(其以全文引用的方式并入本文中)中所描述，在单核细胞增生李斯特菌ΔactAΔinlB菌株背景中构建所有疫苗菌株。使用单核细胞增生李斯特菌密码子偏好(codon bias)对EGFRvIII、SSX2、PAP、NKX3.1和PSMA开放阅读框进行密码子优化，接着对表1中所描述的片段进行PCR扩增且在actA启动子控制下克隆，且可操作地与经修饰的ActAN100*序列连接，如国际公开第WO2014/106123号、美国公开第2014/186387号中所公开(其通过援引并入本文)。通过等位基因交换在actA或inlB基因座处插入抗原表达盒，如Camilli,A.等人,Dual roles of plcA in Listeriamonocytogenes pathogenesis.Molecular Microbiology(1993)8(1):143-157中所描述(其以全文引用的方式并入本文)。通过自缺失actA或inlB的任一侧将约1千碱基的DNA序列克隆至pKSV7的衍生物中来组装等位基因交换载体。将抗原表达盒克隆至actA或inlB侧接同源性之间的pKSV7载体中。
将单一表达盒克隆至包含actA启动子、ActAN100*编码序列、5个21氨基酸型EGFRvIII接合区域的拷贝和经密码子优化的全长SSX2序列的actA等位基因交换载体中，且用于构建菌株BH5258及BH5290。类似地，将两个表达盒克隆至inlB等位基因交换载体中：第一表达盒包括actA启动子、ActAN100*编码序列、5个21氨基酸型EGFRvIII接合区域的拷贝和编码氨基酸33-386的经密码子优化的PAP(用于构建体BH5258和BH5290)；第二表达盒包括actA启动子、ActAN100*编码序列、全长经密码子优化的NKX3.1序列和编码氨基酸33-386的经密码子优化的PAP(用于构建菌株BH4598和BH4602)。如此前Camilli,A.等人,Dualroles of plcA in Listeria monocytogenes pathogenesis.Molecular Microbiology(1993)8(1):143-157中所述进行等位基因交换。
对于在tRNAArg基因座处插入的抗原表达盒，使用位点特异性再结合在Lm染色体上稳定地整合构建体。将抗原表达盒克隆至pPL2整合载体的衍生物中，如Lauer等人,Infect.Immun.(2008)76:3742-53(其以全文引用的方式并入本文中)中所描述，该载体经修饰以允许移除额外的包括所有抗生素抗性标记物的载体序列，如国际公开第WO2007/103225号、美国申请第PCT/US2007/005457号中所描述(其通过援引并入本文)。在跨越基因座处克隆并整合表达盒，其包括actA启动子、ActAN100*编码序列、5个EGFRvIII接合区域的拷贝、跨越氨基酸11-243的NKX3.1的经密码子优化序列及跨越氨基酸1-20、44-138和169-750的PSMA。两个变体菌株在氨基酸41处的NKX3.1编码序列中的单一编码氨基酸方面不同：BH5258编码氨基酸41处的精氨酸；且BH5290编码氨基酸41处的甘氨酸。利用来自温度敏感性质粒的短暂FLP重组酶表达来移除质粒主链和抗生素抗性标记物。通过DNA测序确认所有最终抗原表达盒。
细胞内蛋白印迹
在感染倍率(MOI)为10的情况下，小鼠树突状细胞株DC2.4用单核细胞增生李斯特菌株接种1小时，细胞用PBS和补充有50μg/mL庆大霉素的DMEM培养基洗涤3次。在感染后7小时收集细胞。细胞用SDS样品缓冲液溶解，收集并在4％～12％聚丙烯酰胺凝胶上处理，且转移至硝酸纤维素膜以用于蛋白印迹分析。使抗原检测可视化且使用针对ActA蛋白质的成熟N端培养的多克隆抗体利用Licor Odyssey IR检测系统进行定量，且用抗p60单克隆抗体针对p60表达(不相关Lm蛋白质)进行标准化。P60水平与实验中的细菌数目直接相关。
经疫苗接种的小鼠中的抗原特异性免疫响应
6周龄Balb/c小鼠(n＝5)以5×106cfu进行静脉内(IV)疫苗接种。在七天之后，收集脾脏且使用SSX2、PAP、NKX3.1或PSMA的重叠肽文库(以11个氨基酸重叠的15聚体肽)或非刺激性培养基对照物，通过IFNγELIspot分析法测定免疫响应。对于EGFRvIII特异性免疫原性，6周龄C3H/HeN小鼠(n＝5)以5×106cfu进行静脉内疫苗接种。在七天之后，收集脾脏且使用EGFRvIII26-33(Kk结合肽EEKKGNYV)通过IFNγELIspot检测测定免疫响应。通过非刺激性响应将各菌株/抗原的数据或作为减去背景(非刺激性)的数据作图。使用不成对T检验测定统计显著性。
针对野生型李斯特菌激发的保护性免疫
Balb/c小鼠用2×106cfu的各Lm菌株静脉内疫苗接种。40天后，如Lauer,2002中所述用5×104个cfu(2×LD50剂量)的WT Lm菌株DP-L4056静脉内激发小鼠。3天后，收集脾脏并均质化。在含有200μg/mL链霉素的BHI盘上将稀释物铺平板以测定每个器官的cfu。此分析法中的检出限(LOD)为50CFU。
癌症的治疗
进行在人类中首次行进(FIH)、1期、开放标记、多中心、2部分研究以表征安全性，测定2期剂量(RP2D)，评估初步临床功效且测定单一试剂ADU-741(也称为菌株BH5290)的免疫响应(在施用患有转移性抗去势性前列腺癌的受试者时)。受试者必须患有对激素疗法不起响应且在筛选时正在发展的疾病，且已接受至少2种先前批准的疗法。约42名受试者将参与研究。
第1部分(剂量升级)：经设计以基于安全性和药效学评估来测定RP2D。依次施用两种剂量的ADU-741(剂量群组1A：1×108个CFU及剂量群组1B：1×109个CFU)。参与受试者的总数将取决于何时和/或是否观测到剂量限制性毒性。
第2部分(剂量扩展)：经设计以在测定ADU-741的RP2D之后评估2个扩增群组(群组2A和2B)。扩增群组的目标为进一步评估ADU-741的安全性(群组2A)和评估处理前和处理后肿瘤位点处活检物的免疫响应(群组2B)。
一旦确定受试者符合研究条件，则在开放标记治疗周期期间，每21天静脉内施用一次ADU-741。经由周边静脉导管施用ADU-741。在1小时时段内施用研究药物，其中在必要时可选择增加输注持续时间。密切监测受试者的不良事件、实验室异常以及临床和免疫响应。施用治疗直至确认放射疾病进程、毒性不可接受、知情同意书被撤回、研究者决定停止治疗、开始后续抗癌疗法或资助者终止研究。评估安全性及功效。
研究群体——年龄超过18周岁、以组织学方式确认前列腺的腺癌(患有抗去势性转移性疾病)、接收至少2种先前批准的疗法且具有至少1种以下疾病进程标准的受试者符合研究条件：(1)前列腺特异性抗原(PSA)上升，其中有至少3次水平上升，各次测定之间的间隔>1周(最后一次测定必须具有≥2ng/ml的值，在参与之前的2周内获得)；(2)可测定的疾病，其定义为计算机断层摄影术(CT)或磁共振成像(MRI)扫描上的新的或进行性软组织疾病；(3)放射性核素骨扫描或18F氟化钠正电子发射断层摄影法/计算机断层摄影术(NaFPET/CT)结果，具有至少2个新的骨病灶，如通过前列腺癌临床试验工作组(ProstateCancer Clinical Trials Working Group；PCWG2)准则所测定；且必须接收至少2种先前批准的疗法。受试者的东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group；ECOG)表现状态评分必须为0或1。
功效评估——由研究者根据PCWG2准则、实体肿瘤(V1.1)(RECIST)准则中的响应评估准则及免疫相关响应准则(irRC)评估功效评定。使用具有胸部、腹部及骨盆的IV对比的CT扫描来评估疾病响应。对IV CT造影剂不耐受的受试者用口服造影剂进行CT扫描。可使用磁共振成像(MRI)评估无法使用CT充分成像的疾病位点。通过CT和/或MRI评估软组织疾病(即放射性可检测肿瘤)。进行放射性核素骨扫描或18F-NaF PET/CT以评估骨疾病位点。在整个研究期间，在各时间点使用与用于在基线下评估疾病相同的评估方法进行这些评估。也在后续抗癌疗法及治疗后的随访期中的整个存活期中收集数据。
结果
NKX3.1(R41G)引起所有所编码抗原的较高表达
两种多价疫苗菌株BH5258(含有“野生型”NKX3.1)和BH5290(具有NKX3.1R41G变异)在NKX3.1的位置41处的单个氨基酸方面不同。构建从所述的Lm基因组中的三个基因座表达五个所编码抗原的菌株(图1)。使用这些菌株感染小鼠树突状细胞株DC2.4，且使用半定量蛋白印迹测定表达。在大约预测尺寸处检测各融合蛋白。出人意料的是，对于各经编码的融合蛋白抗原(PSMA、PAP、NKX3.1、SSX2及EGFRvIII)，含有NKX3.1(R41G)变异的菌株中的表达高2.1倍至3.2倍，表明NKX3.1中的单一氨基酸变化可促进所有所编码抗原的表达。特别是，NKX3.1和PSMA在BH5290中高2.7倍，PAP在BH5290中的表达高3.2倍，SSX2在BH5290中高2.1倍且EGFRvIII在BH5290中高2.1倍至3.2倍。
NKX3.1(R41G)引起较高抗原特异性免疫原性
在小鼠中比较两种多价疫苗菌株BH5258和BH5290的T细胞免疫原性(图3)。在Balb/c小鼠中测定对SSX2、PAP、NKX3.1和PSMA的免疫响应。在C3H/HeN小鼠中测定EGFRvIII。在BH5290中，对5种所编码抗原中的4种的响应较高，在NKX3.1编码序列中具有单个氨基酸差异(NKX3.1(R41G))。与BH5258相比，在BH5290中的对PAP的响应统计学上较高。两种菌株的PSMA响应基本等效。BH5290与BH5258之间的单个氨基酸差异引起对大部分所编码抗原的较高免疫响应，表明其为更强效的前列腺癌疫苗。
BH5290在用WT Lm激发时诱导完全功能性和保护性免疫
如图4中所示，用BH5290进行的单一疫苗接种可诱导针对WT李斯特菌激发的全面保护性长期免疫。在WT-Lm激发之后，用BH5290进行的疫苗接种引起脾脏中CFU的5-log下降。功能性免疫为抗原特异性免疫响应的量级与免疫响应保护免受未来的激发的能力的组合。在此情况下，用完全毒力野生型李斯特菌激发测试功能性。在实验中包括用HBSS或Lm菌株DP-L4027(hly-)进行的疫苗接种作为阴性对照。
SSX2表达在包括EGFRvIIIx5作为融合蛋白的一部分时增加
为了评估EGFRvIIIx5的包涵体对抗原表达的影响，在相同Lm背景的tRNAArg基因座处引入仅在EGFRvIIIx5存在下不同的经匹配的SSX2表达盒，该Lm背景表达来自inlB基因座的ActAN100*-NKX3.1-PAP33-386融合蛋白。BH4598含有第一表达盒ActAN100*-SSX2，且BH4602含有第二表达盒ActAN100*-EGFRvIIIx5-SSX2(图5A)。所有表达盒使用actA启动子。接着通过细胞内蛋白印迹评估这些表达盒的表达(图5B)。泳道1：Lm11(阴性对照)，泳道2：BH4598(ActAN100*-SSX2)，泳道3：BH4602(ActAN100*-EGFRvIIIx5-SSX2)。在右侧指示各融合蛋白的全长定尺寸条带。对表达水平进行定量且针对组成性李斯特菌P60蛋白质将数据归一化。恒定表达盒(NKX3.1-PAP融合物)的相对表达水平在两个菌株之间类似(BH4598中为0.43且BH4602中为0.33)。然而，SSX2融合蛋白的表达在含有EGFRvIIIx5作为融合物的一部分的菌株中高200倍(在BH4598中为1且在BH4602中为224)。此数据明确表明EGFRvIIIx5增强SSX2的表达。
当EGFRvIIIx5为免疫原性融合蛋白的一部分时SSX2免疫响应显著较高
比较由BH4598和BH4602诱导的原发性免疫响应。BH4602诱导显著高于BH4598的SSX2特异性免疫响应(p＝0.0024)。这表明在免疫原性的小鼠模型中，来自EGFRvIII-SSX2融合蛋白的较高表达转化成较高免疫响应。
当与EGFRvIII的多重拷贝融合时的PAP表达较高
如图7中所示，每个额外的EGFRvIII重复单元引起较高PAP表达。分别在泳道2-7中测定相对表达：1倍、2.4倍、19.6倍、127倍、156倍及213倍。此外，EGFRvIIIx5与SSX2和PAP的融合物的表达增加可引起两种抗原的表达增加200倍。
PAP响应在与EGFRvIII的多重拷贝融合时较高且在与5个EGFRvIII的拷贝融合时显著较高
测试六个PAP表达Lm菌株的T细胞响应的诱导，所述菌株在EGFRvIII拷贝数方面不同(BH2868、PL1631、PL1629、PL1627、PL1625和PL1623)。BH2868(0个EGFRvIII的拷贝)诱导较低但可检测的PAP特异性免疫响应。所有包括至少一个EGFRvIII的拷贝作为PAP融合物的一部分的菌株诱导较高PAP特异性免疫响应，且免疫响应中存在反映表达量增加的趋势，这反映了更多的EGFRvIII的拷贝引起更高的免疫响应。从PL1623(5个EGFRvIII的拷贝)观测到最高免疫响应，且响应在统计上高于不具有EGFRvIII或具有1个EGFRvIII重复的拷贝的菌株。类似地，具有2个重复的拷贝的PL1629比具有0个EGFRvIII的拷贝的菌株诱导显著更高的PAP响应。
本领域技术人员应了解，可对本发明的优选实施方式进行许多变化及修改，且可在不偏离本发明的主旨的情况下进行此类变化及修改。因此，意在随附权利要求涵盖落在本发明的真实主旨和范围内的所有此类等效变化。
本文件中所引用或所描述的各专利、专利申请及公开的公开内容在此以全文引用的方式并入本文中。
表5
在一些实施方式中，本发明涉及融合蛋白，其包含表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)多肽和滑膜肉瘤X断点2(SSX2)多肽。在一些实施方式中，该EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，该融合蛋白包含多个EGFRvIII多肽。在一些实施方式中，该融合蛋白包含五个EGFRvIII多肽的拷贝。在某些实施方式中，该EGFRvIII多肽由一个或多个序列侧接。在某些实施方式中，EGFRvIII多肽与SSX2多肽的N端融合。在某些实施方式中，SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ IDNO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，融合蛋白包含与如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，融合蛋白包含信号序列，其中信号序列与EGFRvIII多肽和SSX2多肽一起位于翻译阅读框中。在某些实施方式中，信号序列与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。
在某些实施方式中，该融合蛋白在细菌中表达。在一个实施方式中，细菌为单核细胞增生李斯特菌。
在各种实施方式中，本发明还提供了编码前述实施方式中的任一个的融合蛋白的核酸分子。
在某些实施方式中，该核酸分子包含：一个或多个EGFRvIII多核苷酸，其与如SEQID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性，和与如SEQ ID NO:9所述的SSX2多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。
在一些实施方式中，核酸分子进一步包含启动子、信号序列或其两者，其中启动子、信号序列或其两者与编码EGFRvIII多肽的核苷酸序列和编码SSX2多肽的核苷酸序列可操作地连接。在某些实施方式中，启动子与如SEQ ID NO:21所述的actA启动子具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。在多种实施方式中，信号序列与如SEQ ID NO:1所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。在一些实施方式中，核酸分子为表达盒的一部分。
在一些实施方式中，本发明提供一种载体，其包含前述实施方式中的任一个的核酸分子。
在一些实施方式中，本发明还提供了包含前述实施方式中的任一个的核酸分子的宿主细胞。在某些实施方式中，该宿主细胞为细菌。在一个实施方式中，细菌为单核细胞增生李斯特菌。在一些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为actA缺失突变体、actA插入突变体、inlB缺失突变体、inlB插入突变体或其组合。在一个实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为ΔactA/ΔinlB突变体。在某些实施方式中，核酸分子整合至宿主细胞基因体中。在某些实施方式中，核酸分子整合至actA基因座、inlB基因座或tRNAArg基因座中。
在各种实施方式中，前述实施方式中的任一个的宿主细胞与药学上可接受的赋形剂组合。
在一些实施方式中，本发明提供一种疫苗，其包含前述实施方式中的任一个的宿主细胞及药学上可接受的赋形剂。
在某些实施方式中，本发明提供一种融合蛋白，其包含EGFRvIII多肽和前列腺酸磷酸酶(PAP)多肽。在一些实施方式中，该EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该融合蛋白包含多个EGFRvIII多肽。在一个实施方式中，该融合蛋白包含五个EGFRvIII多肽的拷贝。
在某些实施方式中，该EGFRvIII多肽由一个或多个序列侧接。在一些实施方式中，EGFRvIII多肽与PAP多肽的N端融合。
在一些实施方式中，PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，融合蛋白包含与如SEQ ID NO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ IDNO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，融合蛋白进一步包含信号序列，其中该信号序列与EGFRvIII多肽和PAP多肽一起位于翻译阅读框中。在某些实施方式中，信号序列与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。
在各种实施方式中，融合蛋白在细菌中表达。在一些实施方式中，细菌为单核细胞增生李斯特菌。
在某些实施方式中，本发明提供编码前述实施方式中的任一个的融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，该核酸分子包含：一个或多个EGFRvIII多核苷酸，其与如SEQ IDNO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性，和与如SEQ ID NO:13所述的PAP33-386多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。
在一些实施方式中，核酸进一步包含启动子、信号序列或其两者，其中启动子、信号序列或其两者与编码EGFRvIII多肽的核苷酸序列和编码PAP多肽的核苷酸序列一起位于翻译框架中。在某些实施方式中，启动子与如SEQ ID NO:21所述的actA启动子具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。在一些实施方式中，信号序列与如SEQ ID NO:1所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。
在一个实施方式中，该核酸分子为表达盒的一部分。
在某些实施方式中，本发明提供一种载体，其包含前述实施方式中的任一个的核酸分子。
在一些实施方式中，本发明提供一种宿主细胞，其包含前述实施方式中的任一个的核酸分子。在某些实施方式中，该宿主细胞为细菌。在一个实施方式中，细菌为单核细胞增生李斯特菌。在各种实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为actA缺失突变体、actA插入突变体、inlB缺失突变体、inlB插入突变体或其组合。在一个实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为ΔactA/ΔinlB突变体。
在一些实施方式中，核酸分子整合至宿主细胞基因体中。在某些实施方式中，核酸分子整合至actA基因座、inlB基因座或tRNAArg基因座中。
在某些实施方式中，宿主细胞与药学上可接受的赋形剂组合。
在一些实施方式中，本发明提供一种疫苗，其包含前述实施方式中的任一个的宿主细胞及药学上可接受的赋形剂。
在某些实施方式中，本发明提供一种融合蛋白，其包含EGFRvIII多肽、NK3同源盒1(NKX3.1)多肽和前列腺特异性膜抗原(PSMA)多肽。在一些实施方式中，该EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白包含多个EGFRvIII多肽。在一个实施方式中，融合蛋白包含五个EGFRvIII多肽的拷贝。
在一些实施方式中，该EGFRvIII多肽由一个或多个切割序列侧接。
在某些实施方式中，EGFRvIII多肽与NKX3.1多肽的N端融合，且其中NKX3.1多肽与PSMA多肽的N端融合。
在一些实施方式中，PSMA多肽包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.111-234(R41G)具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ IDNO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，融合蛋白包含与如SEQ ID NO:23的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ IDNO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，融合蛋白包含与如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，融合蛋白进一步包含信号序列，其中信号序列与EGFRvIII多肽、NKX3.1多肽和PSMA多肽一起位于翻译阅读框中。在一些实施方式中，信号序列与如SEQID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。
在各种实施方式中，融合蛋白在细菌中表达。在一个实施方式中，细菌为单核细胞增生李斯特菌。
在一些实施方式中，本发明提供一种编码前述实施方式中的任一个的融合蛋白的核酸分子。在某些实施方式中，该核酸分子包含：一个或多个EGFRvIII多核苷酸，其与如SEQID NO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；与如SEQ ID NO:24所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；和与如SEQ ID NO:19所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。
在一些实施方式中，核酸分子包含：一个或多个EGFRvIII多核苷酸，其与如SEQ IDNO:5所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性；与如SEQ ID NO:17所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸；和与如SEQ ID NO:19所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。
在一些实施方式中，核酸进一步包含启动子、信号序列或其两者，其中启动子、信号序列或其两者与编码EGFRvIII多肽、NKX3.1多肽和PSMA多肽的核苷酸序列一起位于翻译框架中。在一些实施方式中，启动子与如SEQ ID NO:21所述的actA启动子具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。在一些实施方式中，信号序列与如SEQ ID NO:1所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。
在一些实施方式中，前述实施方式中的任一个的核酸分子为表达盒的一部分。
在一些实施方式中，本发明提供一种载体，其包含前述实施方式中的任一个的核酸分子。
在一些实施方式中，本发明提供一种宿主细胞，其包含前述实施方式中的任一个的核酸分子。在一些实施方式中，宿主细胞为细菌。在一个实施方式中，细菌为单核细胞增生李斯特菌。在一些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为actA缺失突变体、actA插入突变体、inlB缺失突变体、inlB插入突变体或其组合。在一些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为ΔactA/ΔinlB突变体。
在一些实施方式中，核酸分子整合至宿主细胞基因体中。在一些实施方式中，核酸分子整合至actA基因座、inlB基因座或tRNAArg基因座中。
在一些实施方式中，前述实施方式中的任一个的宿主细胞与药学上可接受的赋形剂组合。
在各种实施方式中，本发明提供一种疫苗，其包含前述实施方式中的任一个的宿主细胞及药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方式中，本发明提供融合蛋白，其包含NK3同源盒1(NKX3.1)多肽和PAP多肽。在一些实施方式中，NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，NKX3.1多肽与PAP多肽的N端融合。
在一些实施方式中，PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，融合蛋白包含与如SEQ ID NO:27的氨基酸残基89至678所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，融合蛋白包含NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，融合蛋白进一步包含信号序列，其中该信号序列与NKX3.1多肽和PAP多肽一起位于翻译阅读框中。在一些实施方式中，信号序列与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。
在一些实施方式中，该融合蛋白在细菌中表达。在一个实施方式中，细菌为单核细胞增生李斯特菌。
在一些实施方式中，本发明提供一种编码前述实施方式中的任一个的融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:28所述的NKX3.1多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸，和与如SEQ ID NO:13所述的PAP33-386多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的多核苷酸。
在一些实施方式中，核酸进一步包含启动子、信号序列或其两者，其中启动子、信号序列或其两者与编码NKX3.1多肽的核苷酸序列和编码PAP多肽的核苷酸序列一起位于翻译框架中。在一些实施方式中，启动子与如SEQ ID NO:21所述的actA启动子具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。在一些实施方式中，信号序列与如SEQ ID NO:1所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性。
在一些实施方式中，该核酸分子为表达盒的一部分。
在一些实施方式中，本发明提供一种载体，其包含前述实施方式中的任一个的核酸分子。
在一些实施方式中，本发明提供一种宿主细胞，其包含前述实施方式中的任一个的宿主细胞。在一个实施方式中，该宿主细胞为细菌。在一些实施方式中，细菌为单核细胞增生李斯特菌。在一些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为actA缺失突变体、actA插入突变体、inlB缺失突变体、inlB插入突变体或其组合。在某一实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为ΔactA/ΔinlB突变体。在一些实施方式中，核酸分子整合至宿主细胞基因体中。在各种实施方式中，核酸分子整合至actA基因座、inlB基因座或tRNAArg基因座中。
在一些实施方式中，前述实施方式中的任一个的宿主细胞与药学上可接受的赋形剂组合。
在一些实施方式中，本发明提供一种疫苗，其包含前述实施方式中的任一个的宿主细胞及药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方式中，本发明提供宿主细胞，其包含一个或多个核酸分子，所述核酸分子包含编码以下物质的核酸序列：a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽，其与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白，其包含有包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列的一个或多个EGFRvIII多肽、包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列的NKX3.1多肽和包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列的PSMA多肽；d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽，其包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；g)ActAN100-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100多肽，其包含与SEQ ID NO:33的氨基酸残基1至100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或h)其任意组合。
在一些实施方式中，宿主细胞的核酸分子包含：a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；c)与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；d)与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；e)与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；f)与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；g)与如SEQ ID NO:32所述的ActAN100*-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；h)与如SEQ ID NO:34所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；i)与如SEQID NO:36所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；j)与如SEQ ID NO:38所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；k)与如SEQ ID NO:40所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；或l)其任意组合。
在一些实施方式中，宿主细胞为细菌。在一个实施方式中，细菌为单核细胞增生李斯特菌。在一些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为ΔactA/ΔinlB突变体。
在一些实施方式中，前述实施方式中的任一个的宿主细胞包含：a)与如SEQ IDNO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和c)与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，(a)被整合至actA基因座中，(b)被整合至inlB基因座中且(c)被整合至tRNAArg基因座中。
在一些实施方式中，前述实施方式中的任一个的宿主细胞包含：a)与如SEQ IDNO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和c)与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，(a)被整合至actA基因座中，(b)被整合至inlB基因座中且(c)被整合至tRNAArg基因座中。
在一些实施方式中，前述实施方式中的任一个的宿主细胞包含：a)与如SEQ IDNO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和b)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，(a)被整合至inlB基因座中且(b)被整合至tRNAArg基因座中。
在一些实施方式中，前述实施方式中的任一个的宿主细胞包含：a)与如SEQ IDNO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和b)与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，(a)被整合至inlB基因座中且(b)被整合至tRNAArg基因座中。
在一些实施方式中，前述实施方式中的任一个的宿主细胞的核酸分子包含编码以下序列的核酸序列：a)与如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；b)与如SEQ ID NO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；c)与如SEQ IDNO:23的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；d)与如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；e)与如SEQ ID NO:27的氨基酸残基89至678所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；f)与如SEQ ID NO:31所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；g)与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基1-459所述的ActAN100*-PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；h)与如SEQ ID NO:35的氨基酸残基89至476所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；i)与如SEQ ID NO:37的氨基酸残基89至509所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；j)与如SEQ ID NO:39的氨基酸残基89至541所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；k)与如SEQ ID NO:41的氨基酸残基89至573所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；或l)其任意组合。
在一些实施方式中，本发明提供引发受试者中的免疫响应的方法，其包含对受试者施用包含前述实施方式中的任一个的宿主细胞的组合物。
在一些实施方式中，本发明提供引发受试者中的免疫响应的方法，其包含对受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞表达一种或多种融合蛋白，其包含：a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ IDNO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽，其包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；g)ActAN100*-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽，其包含与如SEQ IDNO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或h)其任意组合。
在一些实施方式中，所述一种或多种融合蛋白由包含以下序列的核酸分子表达：a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；c)与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；d)与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；e)与如SEQID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；f)与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；g)与如SEQID NO:32所述的ActAN100*-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；h)与如SEQ ID NO:34所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；i)与如SEQ ID NO:36所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；j)与如SEQ ID NO:38所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；k)与如SEQ ID NO:40所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；或l)其任意组合。在一些实施方式中，(a)被整合至actA基因座中，(b)被整合至inlB基因座中且(c)被整合至tRNAArg基因座中。在某些实施方式中，(a)整合至actA基因座中，(b)整合至inlB基因座中且(d)整合至tRNAArg基因座中。在一些实施方式中，(e)被整合至inlB基因座中且(f)被整合至tRNAArg基因座中。在各种实施方式中，(e)被整合至inlB基因座中且(a)被整合至tRNAArg基因座中。
在一些实施方式中，所述一种或多种融合蛋白包含：a)与如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；b)与如SEQ ID NO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；c)与如SEQ ID NO:23的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；d)与如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；e)与如SEQ ID NO:27的氨基酸残基89至678所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；f)与如SEQ ID NO:35的氨基酸残基89至476所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；g)与如SEQ ID NO:37的氨基酸残基89至509所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；h)与如SEQ ID NO:39的氨基酸残基89至541所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；i)与如SEQ ID NO:41的氨基酸残基89至573所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或j)其任意组合。
在前述方法中的任一个的一些实施方式中，该宿主细胞为细菌。在一个实施方式中，细菌为单核细胞增生李斯特菌。在某些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为ΔactA/ΔinlB突变体。在各种实施方式中，在静脉内进行施用步骤。在一些实施方式中，所述一种或多种融合蛋白由宿主细胞在受试者内受感染细胞的细胞质液中表达及分泌。在一些实施方式中，受感染细胞为抗原呈递细胞。
在一些实施方式中，本发明提供增加抗原性多肽的表达的方法，该方法包括在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含编码以下物质的核酸序列：a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽，其包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；g)ActAN100*-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽，其包含与如SEQ IDNO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或h)其任意组合。
在某些实施方式中，所述一个或多个核酸分子包含：a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；c)与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；d)与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；e)与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；f)与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；g)与如SEQ ID NO:32所述的ActAN100*-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；h)与如SEQ ID NO:34所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；i)与如SEQID NO:36所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；j)与如SEQ ID NO:38所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；k)与如SEQ ID NO:40所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；或l)其任意组合。在一些实施方式中，(a)整合至actA基因座中，(b)整合至inlB基因座中且(c)整合至tRNAArg基因座中。在一些实施方式中，(a)整合至actA基因座中，(b)整合至inlB基因座中且(d)整合至tRNAArg基因座中。在一些实施方式中，(e)整合至inlB基因座中且(f)整合至tRNAArg基因座中。在一些实施方式中，(e)整合至inlB基因座中且(a)整合至tRNAArg基因座中。
在前述方法中的任一个的一些实施方式中，核酸分子编码融合蛋白，所述融合蛋白包含：a)与如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIII-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；b)与如SEQ IDNO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIII-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；c)与如SEQ ID NO:23的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；d)与如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；e)与如SEQID NO:27的氨基酸残基89至678所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；f)与如SEQ ID NO:35的氨基酸残基89至476所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；g)与如SEQ ID NO:37的氨基酸残基89至509所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；h)与如SEQ ID NO:39的氨基酸残基89至541所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；i)与如SEQ ID NO:41的氨基酸残基89至573所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或j)其任意组合。
在前述方法中的任一个的一些实施方式中，该宿主细胞为细菌。在某些实施方式中，细菌为单核细胞增生李斯特菌。
在前述方法中的任一个的一些实施方式中，表达步骤包含用宿主细胞使感兴趣的细胞感染。在一些实施方式中，该表达步骤包含对受试者施用宿主细胞。
在一些实施方式中，将前述宿主细胞中的任一个的核酸分子插入宿主细胞内附加型质粒上的表达盒中。
在一些实施方式中，前述宿主细胞中的任一个的核酸分子包含如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2、如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386及如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750。
在一些实施方式中，前述宿主细胞中的任一个的核酸分子由以下物质组成：如SEQID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2、如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386及如SEQ IDNO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750。
在前述方法中的任一个的一些实施方式中，所述一个或多个核酸分子包含：a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和c)与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。
在前述方法中的任一个的一些实施方式中，所述一个或多个核酸分子由以下序列组成：如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2、如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386及如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750。
在一些实施方式中，本发明提供治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞表达一种或多种融合蛋白，所述一种或多种融合蛋白包含：a)EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；b)EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；c)EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；d)EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PSMA多肽。其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；e)NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；f)ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽，其包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和SSX2多肽，其包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；g)ActAN100-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100多肽，其包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基1至100所述的ActAN100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，和PAP多肽，其包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或h)其任意组合。在一些实施方式中，宿主细胞表达(a)、(b)和(d)。
在一些实施方式中，所述一种或多种融合蛋白由核酸分子表达，该核酸分子包含：a)与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；b)与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；c)与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；d)与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；e)与如SEQID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；f)与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；g)与如SEQID NO:32所述的ActAN100-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；h)与如SEQ ID NO:34所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；i)与如SEQ ID NO:36所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；j)与如SEQ ID NO:38所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；k)与如SEQ ID NO:40所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；或l)其任意组合。
在一些实施方式中，所述一种或多种融合蛋白由包含(a)、(b)和(d)的核酸分子表达。在一些实施方式中，所述一种或多种融合蛋白由核酸分子表达，该核酸分子由(a)、(b)和(d)组成。在一些实施方式中，(a)、(b)和(d)可操作地连接于ActA启动子。在一些实施方式中，ActA启动子如SEQ ID NO:21所述。在一些实施方式中，(a)整合至actA基因座中，(b)整合至inlB基因座中且(c)整合至tRNAArg基因座中。在某些实施方式中，(a)整合至actA基因座中，(b)整合至inlB基因座中且(d)整合至tRNAArg基因座中。在一些实施方式中，(e)整合至inlB基因座中且(f)整合至tRNAArg基因座中。在某些实施方式中，(e)整合至inlB基因座中且(a)整合至tRNAArg基因座中。
在一些实施方式中，所述一种或多种融合蛋白由核酸分子表达，该核酸分子由以下物质组成：如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2、如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386及如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750。
在某些实施方式中，癌症为表达EGFRvIII的癌症、表达SSX2的癌症、表达PAP的癌症、表达NKX3.1的癌症、表达PSMA的癌症或其任意组合。在一个实施方式中，癌症为前列腺癌。
在某些实施方式中，宿主细胞为单核细胞增生李斯特菌。在各种实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为actA缺失(ΔactA)突变体、actA插入突变体、inlB缺失(ΔinlB)突变体、inlB插入突变体或其组合。在一个实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为ΔactA/ΔinlB突变体。
在前述治疗癌症的方法中的任一个的一些实施方式中，融合蛋白由宿主细胞在受试者内受感染细胞的细胞质液中表达及分泌。在某些实施方式中，受感染细胞为抗原呈递细胞。
在前述治疗癌症的方法中的任一个的一些实施方式中，所述一种或多种融合蛋白包含：a)与如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；b)与如SEQ IDNO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；c)与如SEQ ID NO:23的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；d)与如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；e)与如SEQ ID NO:27的氨基酸残基89至678所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；f)与如SEQ ID NO:31所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；g)与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基1-459所述的ActAN100-PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；h)与如SEQ ID NO:35的氨基酸残基89至476所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；i)与如SEQID NO:37的氨基酸残基89至509所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；j)与如SEQ ID NO:39的氨基酸残基89至541所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；k)与如SEQ ID NO:41的氨基酸残基89至573所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或其任意组合。
在前述治疗癌症的方法中的任一个的一些实施方式中，所述一种或多种融合蛋白包含(a)、(b)和(d)。
在前述治疗癌症的方法中的任一个的一些实施方式中，所述一种或多种融合蛋白由(a)、(b)和(d)组成。
在前述治疗癌症的方法中的任一个的一些实施方式中，所述一种或多种融合蛋白由以下物质组成：如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2、如SEQ IDNO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386及如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750。
在一些实施方式中，该方法进一步包含在施用组合物之前，测定来自受试者的生物样品中EGFRvIII、SSX2、PAP、NKX3.1、PSMA或其任意组合的表达。
在前述治疗癌症的方法中的任一个的一些实施方式中，组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在某些实施方式中，静脉内进行施用步骤。
在一些实施方式中，治疗癌症的方法进一步包含在施用组合物之后对受试者施用抗生素。在某些实施方式中，在组合物的最后一次施用之后施用抗生素。在相关实施方式中，抗生素为阿莫西林或甲氧苄啶/磺胺甲基异噁唑。
本文中所引用的所有专利、公开申请及参考文献的教导皆以全文引用的方式并入。
尽管已参考本发明的示例性实施方式特别展示并描述了本发明，但本领域技术人员应理解，可在不偏离由随附权利要求涵盖的本发明的范围的情况下对形式及细节做出各种变化。
Claims (43)
1.一种宿主细胞，其包含：
a.与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
b.与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和
c.与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。
2.一种宿主细胞，其包含：
a.与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
b.与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和
c.与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。
3.一种宿主细胞，其包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码以下物质的核酸序列：
a.EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和SSX2多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b.EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和PAP多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c.EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d.EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e.NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽和PAP多肽，所述NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f.ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和SSX2多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ IDNO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
g.ActAN100-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100多肽和PAP多肽，所述ActAN100多肽包含与SEQ ID NO:33的氨基酸残基1至100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ IDNO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
h.其任意组合。
4.如权利要求3所述的宿主细胞，其中所述核酸分子包含：
a.与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
b.与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
c.与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
d.与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
e.与如SEQ ID NO:26所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
f.与如SEQ ID NO:30所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
g.与如SEQ ID NO:32所述的ActAN100*-PAP30-386-SL8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核酸序列；
h.与如SEQ ID NO:34所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
i.与如SEQ ID NO:36所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
j.与如SEQ ID NO:38所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
k.与如SEQ ID NO:40所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；或
l.其任意组合。
5.如权利要求3或4所述的宿主细胞，其包含：
a.与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
b.与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和
c.与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。
6.如权利要求3或4所述的宿主细胞，其包含：
a.与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
b.与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和
c.与如SEQ ID NO:22所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。
7.如权利要求3-6中任一项所述的宿主细胞，其中所述核酸分子包含编码以下序列的核酸序列：
a.与如SEQ ID NO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b.与如SEQ ID NO:12的氨基酸残基89至606所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c.与如SEQ ID NO:23的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d.与如SEQ ID NO:16的氨基酸残基89至1177所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e.与如SEQ ID NO:27的氨基酸残基89至678所述的NKX3.1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f.与如SEQ ID NO:31所述的ActAN100*-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
g.与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基1至459所述的ActAN100*-PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
h.与如SEQ ID NO:35的氨基酸残基89至476所述的EGFRvIIIx1-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
i.与如SEQ ID NO:37的氨基酸残基89至509所述的EGFRvIIIx2-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
j.与如SEQ ID NO:39的氨基酸残基89至541所述的EGFRvIIIx3-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
k.与如SEQ ID NO:41的氨基酸残基89至573所述的EGFRvIIIx4-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
l.其任意组合。
8.一种引发受试者中的免疫响应的方法，其包括对该受试者施用包含权利要求1-7中任一项所述的宿主细胞的组合物。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其中所述核酸分子包含如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2、如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386和如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750。
10.如权利要求7所述的宿主细胞，其中所述核酸分子由如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2、如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386和如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750组成。
11.一种融合蛋白，其包含表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)多肽和滑膜肉瘤X断点2(SSX2)多肽。
12.如权利要求11所述的融合蛋白，其中所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
13.如权利要求11或12所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含多个EGFRvIII多肽。
14.如权利要求11-13中任一项所述的融合蛋白，其中所述SSX2多肽包含与如SEQ IDNO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
15.如权利要求11-14中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与如SEQ IDNO:4的氨基酸残基89至475所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
16.一种核酸分子，其编码权利要求11-15中任一项所述的融合蛋白。
17.一种载体，其包含权利要求16所述的核酸分子。
18.一种宿主细胞，其包含权利要求16所述的核酸分子。
19.一种疫苗，其包含权利要求18所述的宿主细胞和药学上可接受的赋形剂。
20.一种融合蛋白，其包含EGFRvIII多肽和前列腺酸磷酸酶(PAP)多肽。
21.如权利要求20所述的融合蛋白，其中所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
22.如权利要求20或21所述的融合蛋白，其中所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
23.一种核酸分子，其编码权利要求20-22中任一项所述的融合蛋白。
24.一种载体，其包含权利要求23所述的核酸分子。
25.一种宿主细胞，其包含权利要求23所述的核酸分子。
26.一种疫苗，其包含权利要求25所述的宿主细胞和药学上可接受的赋形剂。
27.一种融合蛋白，其包含EGFRvIII多肽、NK3同源盒1(NKX3.1)多肽和前列腺特异性膜抗原(PSMA)多肽。
28.如权利要求27所述的融合蛋白，其中所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
29.如权利要求27或28所述的融合蛋白，其中所述PSMA多肽包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。
30.如权利要求27-29中任一项所述的融合蛋白，其中所述NKX3.1多肽包含与如SEQ IDNO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
31.如权利要求27-29中任一项所述的融合蛋白，其中所述NKX3.1多肽包含与如SEQ IDNO:18所述的NKX3.111-234(R41G)具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列。
32.一种核酸分子，其编码权利要求27-31中任一项所述的融合蛋白。
33.一种宿主细胞，其包含权利要求32所述的核酸分子。
34.一种疫苗，其包含权利要求33所述的宿主细胞和药学上可接受的赋形剂。
35.一种融合蛋白，其包含NK3同源盒1(NKX3.1)多肽和PAP多肽。
36.一种核酸分子，其编码权利要求35所述的融合蛋白。
37.一种宿主细胞，其包含权利要求36所述的核酸分子。
38.一种疫苗，其包含权利要求37所述的宿主细胞和药学上可接受的赋形剂。
39.一种引发受试者中的免疫响应的方法，其包括对该受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中所述宿主细胞表达一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白包含：
a.EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和SSX2多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b.EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和PAP多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c.EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d.EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e.NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽和PAP多肽，所述NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f.ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和SSX2多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ IDNO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
g.ActAN100*-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和PAP多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ IDNO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
h.其任意组合。
40.一种增加抗原性多肽的表达的方法，该方法包括在宿主细胞中表达核酸分子，该核酸分子包含编码以下物质的核酸序列：
a.EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和SSX2多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b.EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和PAP多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c.EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d.EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e.NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽和PAP多肽，所述NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f.ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和SSX2多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ IDNO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
g.ActAN100*-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和PAP多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ IDNO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
h.其任意组合。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述一种或多种核酸分子包含：
a.与如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；
b.与如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列；和
c.与如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的核苷酸序列。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述一种或多种核酸分子由如SEQ ID NO:3所述的EGFRvIIIx5-SSX2、如SEQ ID NO:11所述的EGFRvIIIx5-PAP33-386和如SEQ ID NO:15所述的EGFRvIIIx5-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750组成。
43.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括对该受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中所述宿主细胞表达一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白包含：
a.EGFRvIII-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和SSX2多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ ID NO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
b.EGFRvIII-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和PAP多肽，所述EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
c.EGFRvIII-NKX3.111-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:25所述的NKX3.111-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
d.EGFRvIII-NKX3.1(R41G)11-234-PSMA1-20,44-138,169-750融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；NKX3.1多肽，其包含与如SEQ ID NO:18所述的NKX3.1(R41G)11-234具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；和PSMA多肽，其包含与如SEQ ID NO:20所述的PSMA1-20,44-138,169-750具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
e.NKX3.1-PAP33-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含NKX3.1多肽和PAP多肽，所述NKX3.1多肽包含与如SEQ ID NO:29所述的NKX3.1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:14所述的PAP33-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；
f.ActAN100*-SSX2融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100*多肽和SSX2多肽，所述ActAN100*多肽包含与如SEQ ID NO:2所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述SSX2多肽包含与如SEQ IDNO:10所述的SSX2具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
g.ActAN100-PAP30-386融合蛋白，其中该融合蛋白包含ActAN100多肽和PAP多肽，所述ActAN100多肽包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基1至100所述的ActAN100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列，且所述PAP多肽包含与如SEQ ID NO:33的氨基酸残基103-459所述的PAP30-386具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性、iii)99％同一性或iv)100％同一性的氨基酸序列；或
h.其任意组合。
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