EA019603B1

EA019603B1 - Новые и действенные пептиды мнс ii класса, полученные из сурвивина

Info

Publication number: EA019603B1
Application number: EA201071297A
Authority: EA
Inventors: Штефан Штефанофик; Сесиль Гуттефанж; Ханс-Георг Раммензее; Тони Вайншенк; Петер Левандровский
Original assignee: Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх
Priority date: 2008-05-14
Filing date: 2009-05-14
Publication date: 2014-04-30
Also published as: HK1156323A1; BR122019014468B8; EP2291395B1; ES2549088T3; CY1115999T1; EP2291395A1; DK2291395T3; EP2119726A1; US20130323272A1; EP2119726B1; HRP20150300T4; DK2119726T4; MX2010012443A; PT2119726E; PL2291395T5; BRPI0912622A2; PL2291395T3; DK2119726T3; ES2532896T3; KR20110021881A

Abstract

Настоящее изобретение относится к пептидам, нуклеиновым кислотам и клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака. Настоящее изобретение относится в дальнейшем к полученным из сурвивина опухолеассоциированным пептидным эпитопам цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ), в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует антиопухолевые иммунные ответы. Настоящее изобретение специфически относится к трем новым пептидным последовательностям и их вариантам, образованным из молекул HLA класса I и II человеческих опухолевых клеток, которые могут быть использованы в вакцинных композициях для вызывания противоопухолевых иммунных ответов.

Description

Настоящее изобретение относится к пептидам, нуклеиновым кислотам и клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака. Настоящее изобретение относится в дальнейшем к полученным из сурвивина опухолеассоциированным пептидным эпитопам цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ), в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. Настоящее изобретение специфически относится к трем новым пептидным последовательностям и их вариантам, образованным из молекул НЬА класса I и II человеческих опухолевых клеток, которые могут быть использованы в вакцинных композициях для вызывания противоопухолевых иммунных ответов.

Уровень техники

Глиомы являются опухолями головного мозга, возникающими из глиальных клеток нервной системы. Глиальные клетки, называемые обычно нейроглия или просто глия, являются ненейрональными клетками, которые обеспечивают поддержку и питание, поддерживают гомеостаз, формируют миелин и участвуют в передаче сигналов в нервной системе. Две наиболее важные подгруппы глиом - это астроцитомы и олигодендроглиомы, называемые в соответствии с видами нормальных глиальных клеток, из которых они образуются (астроциты или олигодендроциты соответственно). Относящаяся к подгруппе астроцитов мультиформная глиобластома (называемая далее глиобластомой) является наиболее распространенной злокачественной опухолью головного мозга взрослых людей, и на ее счет приходится прибл. 40% всех злокачественных опухолей головного мозга и прибл. 50% глиом (СВТКН8, 2006). Она агрессивно поражает центральную нервную систему и имеет наивысший уровень злокачественности (степень IV) среди всех глиом. Хотя наблюдается постоянный прогресс в их лечении благодаря усовершенствованию нейровизуализации, микрохирургии, различным возможностям лечения, таким как Темозоломид или облучение, глиобластомы остаются неизлечимыми (Масбопа1б, 2001; Вийоп апб Ргабок, 2000; Ргабок апб Ьеут, 2000). Процент летальных исходов при этой опухоли головного мозга очень высок: средняя ожидаемая продолжительность жизни после постановки первого диагноза составляет 9-12 месяцев. 5летний срок выживаемости в течение периода наблюдения с 1986 по 1990 составил 8,0%. На данный момент пятилетний срок выживаемости вследствие агрессивной терапии, включая макроскопическое удаление опухоли, все еще ниже 10% (Вийоп апб Ргабок, 2000; №ебет е! а1., 2000; ЫароШапо е! а1., 1999; Όηζζί е! а1., 2000). Соответственно, существует высокая потребность медицины в альтернативном и эффективном методе лечения.

Опухолевые клетки глиобластомы являются наиболее недифференцированными среди опухолей головного мозга, так что опухолевые клетки имеют высокий потенциал для миграции и пролиферации и являются высокоинвазивными, приводя к очень неутешительному прогнозу. Глиобластомы приводят к смерти из-за быстрого, агрессивного и инфильтрирующего роста в головном мозге. Паттерны инфильтрирующего роста являются причиной нерезектабельности этих опухолей. Глиобластомы также относительно резистентны к облучению и химиотерапии, и поэтому высок процент рецидивов после лечения. Кроме того, иммунный ответ на неопластические клетки довольно неэффективен для полного устранения всех неопластических клеток после резекции и лучевой терапии (Ко!б апб \Уе11ег, 1999; Όίχ е! а1., 1999; 8аЫоШл е! а1., 2000).

Глиобластома подразделяется на первичную глиобластому (бе поуо) и вторичную глиобластому в зависимости от различий в генном механизме во время злокачественной трансформации недифференцированных астроцитов или глиальных клеток-предшественников. Вторичная глиобластома возникает в более молодом возрасте, до 45 лет. В течение 4-5 лет, в среднем, вторичная глиобластома развивается из астроцитомы низкой степени, проходя стадию недифференцированной астроцитомы. Первичная глиобластома, напротив, возникает в более пожилом возрасте, в среднем это 55 лет. В целом, первичная глиобластома возникает как молниеносная глиобластома, характеризуясь прогрессированием опухоли в течение 3 месяцев, начиная с состояния без клинических или патологических отклонений (Ра1бо1оду апб Сепебск о! 1бе Иетуоик 8ук!етк. 29-39 ДАКС Ргекк, Ьуоп, Ртапее, 2000)).

Глиобластома мигрирует вдоль миелинизированных нервов и широко распространяется по центральной нервной системе. В большинстве случаев хирургическое вмешательство дает лишь ограниченно устойчивый терапевтический эффект (№ито1. Меб. СЫт. (Токуо) 34, 91-94, 1994; Ыеиго1. Меб. СЫт. (Токуо) 33, 425-458, 1993; №игора1бо1оду 17, 186-188, 1997) (Масбопа1б, 2001; Ргабок апб Ьеут, 2000).

Злокачественные клетки глиомы ускользают от обнаружения иммунной системой хозяина за счет выработки иммуноподавляющих веществ, которые наносят вред пролиферации Т-клеток и выработке иммуностимулирующего цитокина ИЛ-2 (Όίχ е! а1., 1999).

Внутричерепные неоплазмы могут возникнуть из любых структур или видов клеток, присутствующих в ЦНС, включая головной мозг, мягкие мозговые оболочки, мозговой придаток, череп и даже остаточную эмбриональную ткань. Общая ежегодная частота заболеваемости первичными опухолями головного мозга в Соединенных Штатах составляет 14 случаев на 100000. Наиболее распространенные первичные опухоли головного мозга - менингиомы, составляющие 27% всех первичных опухолей головного мозга, и глиобластомы, составляющие 23% всех первичных опухолей головного мозга (причем на счет глиобластомы приходятся 40% всех случаев злокачественных опухолей головного мозга взрослого насе

- 1 019603 ления). Многие из этих опухолей агрессивны и имеют высокую степень злокачественности. Первичные опухоли головного мозга являются наиболее распространенными солидными опухолями у детей и второй по частоте причиной смерти от рака после лейкемии у детей.

Поиск методов эффективного лечения пациентов от глиобластом продолжается и сейчас. Была изучена иммунотерапия, или лечение посредством стимуляции иммунной системы, в целях борьбы с данными неопластическими клетками. Первые обнадеживающие результаты были получены Νογ11ι\\ό4 ТйетареиДск с использованием препарата ЭСУах Вташ для лечения глиобластомы в рамках иммунотерапевтических исследований с человеческими пациентами, в которых могли быть индуцированы антигенспецифические ответы ЦТЛ, приводившие к увеличению средних сроков выживаемости в сравнении с теми, что были получены с применением стандартных методов лечения, сопровождаемых минимальной токсичностью (Не1шЬегдег е! а1., 2006).

Колоректальная карцинома

По данным Американского общества по борьбе с раком колоректальный рак (КРР) занимает третье место по частоте распространения в США, это заболевание поражает ежегодно более 175000 новых пациентов. В США, Японии, Франции, Германии, Италии, Испании и Великобритании оно поражает более 480000 пациентов. Это одна из наиболее частых причин смертности от рака в развитых странах. 1Годичный и 5-летний срок выживаемости для людей с колоректальным раком составляет 84 и 64% соответственно. Срок выживаемости продолжает снижается после 5 лет до 57% по истечении 10 лет после постановки диагноза. Если колоректальный рак обнаруживают на ранней, локализованной стадии, то 5летняя выживаемость составляет 90%; однако на этой стадии диагностируются лишь 39% случаев заболевания колоректальным раком, причиной тому - слишком низкий процент обследований. После того как рак распространился регионально, поразив соседние органы или лимфатические узлы. 5-летняя выживаемость сокращается до 68%. Для лиц с отдаленными метастазами 5-летняя выживаемость составляет 10%.

Исследователи предполагают, что возникновение колоректального рака является результатом взаимодействия между наследственными факторами и факторами окружающей среды. В большинстве случаев появляются аденоматозные полипы, становясь предшественниками колоректальных опухолей, хотя процесс их перехода в опухоль может занять много лет. Первостепенный фактор риска для заболевания колоректальным раком - это возраст, в 90% случаев диагноз был поставлен в возрасте более 50 лет. Другие факторы риска заболевания колоректальным раком по данным Американского общества по борьбе с раком включают употребление алкоголя, питание с высоким содержанием жиров и/или сырого мяса и неадекватное потребление фруктов и овощей. Число новых случаев продолжает расти, в особенности на территории таких стран, как Япония, где виновником может быть внедрение западных образцов питания с избыточным потреблением жира и мяса и снижение потребления волокнистой пищи. Несмотря на это, частота заболеваемости растет не так быстро, как раньше, что может быть связано с увеличением количества скринингов и удалением полипов, предотвращая, таким образом, прогрессирование заболевания и переход полипов в рак.

Как и при большинстве солидных опухолей, терапия первого ряда - операция, однако только пациенты на ранней стадии могут получить от этого пользу, значительной же доле пациентов диагноз ставится лишь на поздних стадиях заболевания. В химиотерапии колоректального рака на поздних стадиях стандартом лечения являются лечебные схемы, основанные на фторурациле. Большинство данных лечебных схем представляют собой т.н. курсы лечения ЕОЬЕОХ (вливание 5-ЕИ/лейковорин плюс оксалиплатин) и ЕОЬЕ1К1 (иринотекан, лейковорин, болюсное и продолжительное вливание 5-ЕИ).

Внедрение цитотоксических препаратов третьего поколения, таких как иринотекан и оксалиплатин, увеличило надежду на значительное улучшение эффективности, однако прогнозы до сих пор относительно безнадежные. Срок выживаемости при метастатической болезни, как правило, составляет приблизительно 20 месяцев и, в результате этого, остается высокой беспомощность медицины при данном заболевании.

Недавно стало доступным новое поколение медикаментов, действующих на молекулярные мишени, таких как Авастин (АуаШи) (бевацизумаб) и Эрбитукс (ЕтЬйих) (цетуксимаб), а около 40 соединений находятся на поздней стадии клинических исследований по лечению различных стадий колоректального рака. Комбинации из нескольких таких соединений повышают число потенциальных возможностей лечения, ожидаемых в будущем. Подавляющее большинство веществ находятся на 2-й фазе исследований, при этом данные соединения более часто, чем другие разрабатываемые медикаменты против колоректального рака, адресованы против ЕСЕК (рецептор эпидермального фактора роста), что связано с тем фактом, что у ~80% пациентов с колоректальным раком наблюдается повышенная экспрессия ЕСЕК.

На данный момент проводятся клинические исследования с пациентами II стадии с комбинацией химиотерапии с одобренными недавно моноклональными антителами (шАЬ§) (цетуксимаб + иринотекан или ЕОБЕОХ4; бевацизумаб в качестве монотерапии или вместе с ЕОБЕОХ4). Для получения статистически достоверных результатов по данным исследованиям необходимы 3-4-годичные периоды наблюдения.

Моноклональные антитела (шАЬк), используемые в настоящее время в онкологии, в целом имеют

- 2 019603 превосходные шансы на то, что они не будут создавать помех активной иммунотерапии. Действительно, имеются доклинические (САВК1ЬОУ1СН 1999) и клинические данные, предполагающие, что элиминация фактора роста эндотелия сосудов УЕСЕ (в случае бевацизумаба) вносит положительный вклад в опосредованную ДК (дендритные клетки) активацию Т-клеток (Окаба Т., Сйоид С., Тап§1к К., Нопд Т., 8рес1от Ν., Кишат К., Нит^йг Н.1., Эеу I., Νίχοη А.В., Ьует1у Н.К., С1ау Т., Моше М.А. ТНе еГГсс! оЕ апб-УЕСЕ Шетару оп шппаШге шуе1о1б се11 апб бепбпБс се11к ίη сапсег ра11еп1к. Сапсег 1ттипо1. ГттипоШег. 2008 1ап. 10).

Рак предстательной железы и другие опухоли

Число смертей от рака предстательной железы в 2007 г. ожидалось 27050, что делает его наиболее частой причиной смерти от рака у мужчин. Несмотря на то, что процент смертности среди белого и афроамериканского населения снижается с начала 1990-х годов, до сих пор число афроамериканских мужчин более чем в два раза превышает число белых мужчин. Рак предстательной железы является наиболее часто диагностируемым видом рака у мужчин. По неизвестным причинам частота заболеваемости значительно выше среди афроамериканцев, чем среди белых мужчин. Частота заболеваемости раком предстательной железы постоянно менялась на протяжении последних 20 лет: быстрый рост с 1988 г. по 1992 г., резкое снижение с 1992 г. по 1995 г. и умеренный рост с 1995 г. Данные тенденции отражают большей частью увеличение числа обследований на рак предстательной железы с помощью анализа крови на простатспецифический антиген (Р8А). Умеренный рост частоты заболеваемости за последнее десятилетие связан, скорее всего, с распространенным скринингом Р8А среди мужчин моложе 65 лет. Частота заболеваемости раком предстательной железы стабилизируется у мужчин 65 лет и старше. Число случаев достигло своего пика для белых мужчин в 1992 г. (237,6 случаев на 100000 человек) и для афроамериканцев - в 1993 г. (342,8 случаев на 100000 человек).

Лечение рака предстательной железы может включать внимательное наблюдение, операцию, лучевую терапию, высокоинтенсивный фокусированный ультразвук (НГЕИ), химиотерапию, криохирургию, гормональное лечение или какую-либо комбинацию. Какая из возможностей является наилучшей зависит от стадии заболевания, оценки по шкале Г лисона и уровня Р8А. Другие важные факторы - это возраст мужчины, общее состояние его здоровья и его отношение к возможным способам лечения и побочным эффектам от них. Так как все способы лечения могут иметь побочные эффекты, такие как эректильная дисфункция и недержание мочи, то в центре внимания при дискуссиях о способе лечения часто стоит возможность нахождения баланса между целью лечения и рисками, связанными с изменением стиля жизни.

Если рак распространился за пределы простаты, то возможности для лечения значительно изменяются, так что большинство врачей, лечащих рак предстательной железы, используют множество номограмм для предсказания вероятности распространения. Лечение с использованием внимательного наблюдения, высокоинтенсивного фокусированного ультразвука (НГЕИ), лучевой терапии, криохирургии и операции предлагаются обычно мужчинам, рак которых остается в пределах предстательной железы. Гормональная терапия и химиотерапия часто предусматриваются для лечения заболевания, которое распространилось за пределы простаты. Однако возможны исключения: лучевая терапия может использоваться для некоторых опухолей на поздних стадиях, а гормональная терапия - для опухолей на ранней стадии. Криотерапия, гормональная терапия и химиотерапия могут быть также предложены, если первоначальное лечение было неудачным, и рак прогрессирует.

У значительного числа пациентов с раком предстательной железы, которые подвергаются простатэктомии из-за клинического подозрения на рост внутри органа, окончательное гистологическое обследование операционного материала показывает локально экстенсивное распространение опухоли за пределы органа. Для этих пациентов существует высокий риск быстрого локального рецидива, обнаруживаемого обычно как повышение уровня Р8А с точки зрения биохимического рецидивирования заболевания. Терапевтические возможности в данной ситуации включают наружную лучевую терапию и гормональную абляцию; однако значимость данных терапевтических подходов, в особенности в отношении продления жизни пациента в долгосрочной перспективе, не подтверждена. Кроме того, необходимо учитывать возможность связанных с лечением осложнений, таких как появление стриктуры уретры (лучевая терапия), потеря полового влечения и импотенция, риск снижения содержания солей кальция в костях в связи с остеопорозом и существенно возросший риск патологической хрупкости костей (гормональная абляция).

Более 90% всех случаев заболевания раком предстательной железы обнаруживаются на локальной и региональной стадиях; 5-летняя относительная выживаемость для пациентов, опухоли которых были диагностированы на этих стадиях, достигает 100%. В течение последних 25 лет 5-летняя выживаемость для всех стадий в целом увеличилась с 69 до примерно 90%. В соответствии с последними данными относительная 10-летняя выживаемость составляет 93%, а 15-летняя - 77%. Разительное увеличение выживаемости, в особенности 5-летней, отчасти связано с ранней постановкой диагноза и улучшениями в лечении. Несмотря на это, сроки выживаемости значительно сокращаются после распространения на другие ткани и органы.

Рак легких

- 3 019603

В 2007 г. ожидается приблизительно 210000 новых случаев в США, что составляет около 15% всех диагнозов рака. Частота заболеваемости значительно снижается среди мужчин с 102 случаев на 100000 человек в 1984 г. до 78,5 в 2003 г. Среди женщин частота заболеваемости стабилизировалась после долгого периода роста. В целях лечения рак легких классифицируется клинически на мелкоклеточный (13%) или немелкоклеточный (87%).

Рак легких является наиболее частой причиной смертности от рака как среди мужчин, так и среди женщин. Около 160390 смертей, составляющих приблизительно 29% всех летальных исходов от рака, ожидаются в 2007 г. Начиная с 1987 г., от рака легких ежегодно умирало больше женщин, чем от рака молочной железы. Число смертей среди мужчин значительно снижалось в период с 1991 по 2003 гг., примерно на 1,9% ежегодно. Смертность от рака легких среди женщин сохраняется на неизменном уровне после продолжительного роста на протяжении нескольких десятилетий. Данные тенденции по смертности от рака легких отражают снижение числа курящих на протяжении последних 30 лет.

Вид лечения определяется типом (мелкоклеточный или немелкоклеточный) и стадией ракового заболевания и включают хирургическое вмешательство, лучевую терапию, химиотерапию, а также нацеленные биологические терапии, такие как бевацизумаб (Λνα4ίη®) и эрлотиниб (Татсеуа®). Для локализованного рака в качестве терапии обычно выбирается операция. Последние исследования указывают на то, что выживаемость с немелкоклеточным раком легких ранней стадии улучшается, если за операцией следует химиотерапия. Так как на момент своего обнаружения заболевание обычно распространилось, часто используются лучевая терапия и химиотерапия, иногда в сочетании с операцией. Химиотерапия в отдельности или в сочетании с лучевой терапией является стандартным лечением, выбираемым для мелкоклеточного рака легких; при данной схеме лечения большой процент пациентов испытывает ремиссию, которая в некоторых случаях бывает продолжительной.

Одногодичная относительная выживаемость для рака легких слегка возросла с 37% в 1975-1979 гг. до 42% в 2002 г. во многом благодаря усовершенствованиям в хирургической технике и комбинированным способам лечения. Однако 5-летний срок выживаемости для всех стадий в целом составил лишь 16%. Процент выживаемости для всех случаев, обнаруживаемых, когда заболевание все еще локализовано, составляет 49%; однако только 16% всех случаев рака легких диагностируются на этой ранней стадии.

Таблица 1 Предполагаемое количество случаев заболевания раком и смертей в зависимости от пола для США в 2007 г. (данные Атепсап Сапсег 8ос1е1у - Американское общество по борьбе с раком.

Сапсег Еас18 & Идитеа 2007. Л11ап(а: Атепсап Сапсег 8ос1е1у; 2007)

Место	Предполагаемое число новых случаев	Предполагаемое число смертей
Оба пола	Мужчины	Женщины	Оба пола	Мужчины	Женщины
Глиома и головной мозг	20 500	11 170	9 330	12 740	7 150	5 590
Молочная железа	180 510	2 030	178 480	40 910	450	40 460
Предстательная железа	218 890	218 890		27 050	27 050
Пищевод	15 560	12 130	3 430	13 940	10 900	3 040
Толстый кишечник	112 340	55 290	57 050	52 180	26 000	26 180
Почки	51 190	31 590	19 600	12 890	8 080	4 810
Поджелудочная железа	37 170	18 830	18 340	33 370	16 840	16 530
Плоскоклеточная карцинома; неоплазмы кожи с участием кератиношгтов	1 000000	н.о.	н.о.	н.о»	Н.О.	Н.О.
Лейкемия	44 240	24 800	19 440	21 790	12 320	9 470
Легкие	213 380	114 760	98 620	160 390	89 510	70 880
Лимфома не- Ходжкина	63 190	34 210	28 990	18 660	9 600	9 060
Яичник	22 430		22 430	15 280		15 280
Меланома	59 940	33 910	26 030	8 110	5 220	2 890

Таким образом, существует потребность в новом, эффективном и безопасном способе лечения глиобластомы, опухоли предстательной железы, рака молочной железы, рака пищевода, рака толстого кишечника, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы, рака легких, ЦНС, яичника, меланомы (Татт е! а1. 1998), рака поджелудочной железы, плоскоклеточной карциномы, лейкемии и медуллобластомы, а также других видов опухолей, демонстрирующих гиперэкспрессию сурвивина, который улучшал бы самочувствие пациентов без применения химиотерапевтических средств или других веществ, которые могут вызывать серьезные побочные эффекты.

Краткое изложение сущности изобретения

В первом своем аспекте настоящее изобретение относится к пептиду, включающему последова

- 4 019603 тельность, которая выбирается из группы с 8ЕО Ш N0: 1 по 8Е0 Ш N0: 3 или его вариант, который по крайней мере на 85% гомологичен с 8Е0 Ш N0: 1 по 8Е0 Ш № 3, или его вариант, который индуцирует Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным вариантным пептидом; причем указанный пептид не является полипептидом полной длины человеческого сурвивина. Предпочтительно указанный пептид выбирается из пептида, имеющего специфический подвид НЬА, такой как НЬА-А*02 или НЬА-ΌΚ

Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей пептид в соответствии с настоящим изобретением, или вектору экспрессии, способному экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту.

В третьем своем аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, включающей нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, где указанная клеткахозяин предпочтительно является антигенпрезентирующей клеткой, в частности дендритной клеткой или антигенпрезентирующей клеткой.

В четвертом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) ίη νίΐτο, включающему контактирование ЦТЛ ίη νίΐτο с нагруженными антигеном молекулами человека МНС I класса, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки или искусственной конструкции, имитирующей антигенпрезентирующую клетку, на период времени, достаточного для активации указанных ЦТЛ антиген-специфическим образом, где указанный антиген является пептидом в соответствии с настоящим изобретением.

Применение пептида в соответствии с настоящим изобретением, нуклеиновая кислота или вектор экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, клетка в соответствии с настоящим изобретением или активированный цитотоксический Т-лимфоцит, полученный в соответствии с настоящим изобретением для лечения рака или для изготовления медикамента против рака, где указанный медикамент предпочтительно является вакциной. Предпочтительно, если указанный рак выбирается из астроцитомы, пилоидной астроцитомы, дисэмбриопластической нейроэпителиальной опухоли, олигодендроглиомы, эпендимомы, мультиформной глиобластомы, смешанных глиом, олигоастроцитомы, медуллобластомы, ретинобластомы, нейробластомы, герминомы, тератомы, ганглиоглиомы, ганглиоцитомы, центральной ганглиоцитомы, примитивной нейроэктодермальной опухоли (ΡΝΕΤ, к примеру медуллобластома, медуллоэпителиома, нейробластома, ретинобластома, эпендимобластома), опухоли паренхимы шишковидной железы (к примеру, пинеоцитома, пинеобластома), опухолей, развивающихся из эпендимных клеток, опухолуй хороидного сплетения, нейроэпителиальных опухолей неопределенного происхождения (к примеру, глиоматоз гловного мозга, астробластома), глиобластомы, рака предстательной железы, рака молочной железы, рака пищевода, рака толстого кишечника, почечно-клеточной карциномы, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы, рака легких, ЦНС, яичника, меланомы, рака поджелудочной железы, плоскоклеточной карциномы, лейкемии и медуллобластомы, а также других видов опухолей или рака, демонстрирующих гиперэкспрессию сурвивина.

Вспомогательное оборудование, включающее контейнер, который содержит фармацевтическую композицию, содержащую пептид в соответствии с настоящим изобретением, нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, клетку в соответствии с настоящим изобретением или активированный Т-лимфоцит в соответствии с настоящим изобретением, в виде раствора или в лиофилизованной форме; (Ь) опционально - второй контейнер, содержащий разбавитель или восстанавливающий раствор для лиофилизованного состава; и (с) опционально - по крайней мере один пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов в соответствии с 8Е0 Ш N0: с 4 по 24, и (й) опционально - инструкции по применению раствора и/или восстановителя и/или по применению лиофилизованного состава.

Способ получения рекомбинантного антитела, специфически связывающегося с главным комплексом гистосовместимости человека (МНС) класса I или II в комплексе с рестриктированным по НЬА антигеном; метод, включающий иммунизацию измененного методом генной инженерии нечеловеческого млекопитающего, включающего клетки, экспрессирующие молекулы указанного главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I или II с растворимой формой молекулы МНС класса I или II в комплексе с указанным рестриктированным по НЬА антигеном; изоляция молекул мРНК из антитела для получения клеток указанного нечеловеческого млекопитающего; создание библиотеки фагового отображения, отображающего белковые молекулы, закодированные указанными молекулами мРНК; и изоляцию по меньшей мере одного фага из указанной библиотеки фагового отображения, указанный по меньшей мере один фаг, отображающий указанное антитело, специфически связываемое с указанным главным комплексом гистосовместимости человека (МНС) класса I или II в комплексе с указанным рестриктированным по НЬА антигеном.

Антитело, которое специфически связывается с главным комплексом гистосовместимости человека (МНС) класса I или II в комплексе с рестриктированным по НЬА антигеном, где антитело предпочтительно является поликлональным антителом, моноклональным антителом и/или химерным антителом.

Детальное описание изобретения

Термин пептид используется здесь для обозначения серий аминокислотных остатков, связанных друг с другом типично пептидными связями между α-аминными и карбонильными группами смежных

- 5 019603 аминокислот. Пептиды типично обладают длиной в 9 аминокислот, но могут быть короче - 8 аминокислот в длину и длиннее - 16 аминокислот в длину.

Термин олигопептид используется здесь для обозначения серий аминокислотных остатков, связанных один с другим типично пептидными связями между α-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина олигопептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока в нем сохраняются надлежащие эпитоп или эпитопы. Олигопептиды типично бывают менее чем около 30 аминокислотных остатков в длину и более чем около 14 аминокислот в длину.

Термин полипептид обозначает серии аминокислотных остатков, связанных друг с другом типично пептидными связями между α-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина полипептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока сохраняются надлежащие эпитопы. В отличие от терминов пептид или олигопептид, термин полипептид введен для обозначения молекул, содержащих более приблизительно 30 аминокислотных остатков.

Пептид, олигопептид, белок или полинуклеотид, кодирующий для такой молекулы, является иммуногенным (и, таким образом, иммуногеном в рамках настоящего изобретения), если он способен индуцировать иммунный ответ. В случае настоящего изобретения иммуногенность получает более специфическое определение как способность индуцировать Т-клеточный ответ. Таким образом, иммуноген должен представлять собой молекулу, которая способна индуцировать иммунный ответ, и, в случае настоящего изобретения, молекулу, способную индуцировать ответ Т-клетки.

Для Т-клеточного эпитопа необходим короткий пептид, который связан с рецептором МНС I или II класса, образующий трехчленный комплекс (α-цепь МНС класса I, β-2-микроглобулин и пептид), который может быть распознан Т-клеткой, несущей подходящий Т-клеточный рецептор, связывающийся с комплексом МНС/пептид с подходящей аффинностью. Пептиды, связывающиеся с молекулами МНС I класса, типично имеют длину в 8-14 аминокислот и, особенно типично, длину в 9 аминокислот. Тклеточные эпитопы, которые связываются с молекулами МНС II класса, типично имеют длину в 12-30 аминокислот. В случае пептидов, которые связываются с молекулами МНС II класса, один и тот же пептид и соответствующий Т-клеточный эпитоп могут иметь общий центральный сегмент, но различаться по общей длине из-за примыкающих последовательностей с различными длинами, расположенными перед аминным концом центральной последовательности и после ее карбоксильного конца соответственно. Рецепторы МНС II класса имеют более открытую структуру, пептиды, связанные с рецепторами МНС II класса, соответствующим образом, не полностью углублены в структуру пептидсвязывающей бороздки молекулы МНС II класса, как то имеет место быть с пептидсвязывающей бороздкой молекулы МНС I класса. Как ни удивительно, это не применимо к пептиду в соответствии с БЕЦ ГО N0: 1, так как небольшие изменения в длине пептида ведут к экстремальному снижению активности (см. ниже).

У человека имеется три различных генетических локуса, которые кодируют для молекул МНС I класса (молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (НЬЛ)): НЬЛ-Л, НЬА-В и НЬЛ-С. НЬЛ-Л*01, НЬЛ-Л*02 и НЬЛ-Л*11 являются примерами различных аллелей МНС I класса, которые могут экспрессироваться из этих локусов.

Таблица 2 аллелей, наиболее часто экспрессируемых в различных популяциях

%-ная вероятность экспрессии аллеля у индивида
30 наиболее экспрессируемых аллелей

Аллель	Европеоидная раса	Аллель	Афроамериканская раса	Аллель	Америка ноидная раса	Аллель ΑΊ101	Восточная раса
А‘0201	45,6%	С-0401	29,0%	А*0201	37,1%	38,4%
С*0701	27,7%	С'0701	25,4%	С'0401	25,4%	А’2402	33,7%
А*0101	27,4%	С*0602	23,0%	А*2402	24,9%	С*0702	33,3%
ΑΌ301	23,8%	А*0201	22,3%	С*0702	24,2%	с*еюг	27,7%

- 6 019603

0*0702	21,5%	А*2301	20,7%	С*0701	20,8%	А‘3303	23,3%
С*0401	21,2%	С*0202	19,0%	С*0304	14,4%	0*0801	21,6%
В*4402	20,2%	А*0301	18,7%	А*0301	14,3%	С‘0304	19.9%
ΒΌ702	18,1%	С*0702	18,1%	В*0702	13,2%	А*0201	18,1%
ΒΌ801	18,1%	В*5301	18,1%	В*3501	12,8%	8*4001	15,2%
С*0501	17,2%	В*0702	15,8%	С*0602	12,3%	0*0401	14,0%
0*0304	16,8%	С*1601	15,7%	0*0501	11,9%	В*5801	13,3%
С*0602	15,7%	В*1503	13,9%	А*0101	11,4%	В’4601	12,7%
ΑΊ101	15,3%	В*5801	13,5%	ΑΊ101	11,0%	В*5101	12,4%
В*4001	13,6%	А*6802	12,7%	В*5101	10,8%	С*0302	12,0%
А*2402	12,1%	0*1701	11,7%	С‘1601	10,6%	В*3802	11,4%
В*3501	10,7%	В*4501	10,8%	В*4403	9,9%	А‘0207	11,0%
С’ОЗОЗ	10,6%	В*4201	10,5%	С*0102	9,7%	В*1501	9,4%
В*5101	10,4%	А*3001	10,4%	А*2902	9,7%	ΑΌ206	9,3%
0*1203	9,9%	В*3501	10,1%	С’0802	9,3%	0*0303	9,2%
ΒΊ501	9,6%	ΑΌ101	10,0%	В*1801	9,1%	8*1502	9,1%
А*2902	8,9%	0*0304	9,3%	А*3101	8,9%	А*0203	8,8%
А*2601	8,2%	А*3002	9,2%	В*5201	8,6%	В*4403	8,6%
А’3201	8,2%	В’0801	8,5%	ΒΊ402	8,6%	С’1402	8,4%
С*0802	7,7%	А*3402	8,4%	0*0202	7,6%	В*3501	7,2%
А*2501	7,5%	А*7401	8,4%	С*1203	7,6%	0*0602	7,0%
В*5701	7,1%	А'ЗЗОЗ	8,0%	А-2601	7,6%	В*5401	6,9%
ΒΊ402	6,7%	0*1801	7,3%	А*6801	7,1%	ΒΊ301	6,6%
С*0202	6,6%	А*2902	7,2%	В*0801	7,0%	В*4002	6,3%
В*1801	6.4%	В*4403	6.9%	А'3002	6,8%	В*5502	6,3%
В*4403	6,4%	В*4901	6.9%	В*4402	6.5%	А*2601	6,0%

Человеческий геном имеет 3 различных локуса для генов МНС II класса: НЬА-ΌΚ, НЬА-ΌΟ и НЬАΌΡ. Рецепторы МНС II класса являются гетеродимерами, состоящими из α- и β-цепи, которые обе фиксируются на клеточной мембране с помощью трансмембранного региона. НЬА-ПКВ1*04 и НЬАΌΚΒ1*07 - это два примера различных β-аллелей МНС II класса, о которых известно, что они кодируются в данных локусах. Аллели II класса сильно полиморфичны, к примеру, было описано несколько сотен различных аллелей НЬА-ΌΚΒΤ Поэтому для терапевтических и диагностических целей крайне желателен пептид, который связывается с подходящей аффинностью с несколькими различными рецепторами НЬА II класса. Пептид, связывающийся с несколькими различными молекулами НЬА II класса, называется беспорядочно связывающимся пептидом.

Используемая здесь ссылка на последовательность ДНК включает как однонитевую, так и двунитевую ДНК. Таким образом, специфическая последовательность, если в контексте не указано иное, относится к однонитевой ДНК такой последовательности, дуплексу такой последовательности с его комплементом (двунитевая ДНК) и комплементу такой последовательности. Термин кодирующая область относится к тому участку гена, который естественно или нормально кодирует для экспрессионного продукта того гена в его естественном геномном окружении, т.е. участку, кодирующему ίη νίνο для нативного продукта экспрессии гена.

Кодирующая область может быть из нормального, мутировавшего или измененного гена или может даже быть из последовательности ДНК, или же гена, целиком синтезированного в лаборатории с использованием методов, хорошо известных специалистам из области синтеза ДНК.

Термин нуклеотидная последовательность относится к гетерополимеру дезоксирибонуклеотидов.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая для конкретного пептида, олигопептида или полипептида, может быть встречающейся в природе или может быть получена синтетически. В целом, фрагменты ДНК, кодирующие пептиды, полипептиды и белки данного изобретения, собраны из фрагментов кДНК и коротких олигонуклеотидных линкеров или же из серий олигонуклеотидов для обеспечения синтетического гена, который способен экспрессироваться в рекомбинантной транскрипционной единице, включающей регуляторные элементы, образованные из микробиального или вирусного оперона.

Термин продукт экспрессии означает полипептид или белок, являющийся естественным продуктом трансляции гена и кодирующих эквивалентов любой последовательности нуклеиновой кислоты, образующихся в результате вырожденности генетического кода и, таким образом, кодирующих для той/тех же самой(ых) нуклеиновой(ых) кислот(ы).

Термин фрагмент, если относится к кодирующей последовательности, означает участок ДНК,

- 7 019603 включающий меньше, чем полную кодирующую область, продукт экспрессии которого обязательно сохраняет ту же самую биологическую функцию или активность, что и продукт экспрессии полной кодирующей области.

Термин фрагмент ДНК относится к полимеру ДНК в виде отдельного фрагмента или в качестве компонента более крупной конструкции ДНК, которая была образована из ДНК, изолированной по крайней мере один раз в существенно чистой форме, т.е. без контаминирующих эндогенных материалов и в количестве или с концентрацией, позволяющей идентификацию, манипуляцию и получение фрагмента и его составных нуклеотидных последовательностей стандартными биохимическими методами, например с использованием вектора для клонирования. Такие фрагменты обеспечиваются в форме открытой рамки считывания, не прерываемой внутренними нетранслированными последовательностями или интронами, которые типично присутствуют в эукариотических генах. Последовательности нетранслированной ДНК могут быть представлены по ходу транскрипции из открытой рамки считывания, где она не интерферирует с манипуляцией или экспрессией кодирующих областей.

Термин праймер означает короткую последовательность нуклеиновой кислоты, которая может быть спарена с одной нитью ДНК и обеспечивает свободный конец 3'ОН, на котором ДНК-полимераза начинает синтезировать дезоксирибонуклеотидную цепь.

Термин промотор означает участок ДНК, задействованный в связывании РНК-полимеразы для инициации транскрипции.

Термин открытая рамка считывания (ОРС) означает серии триплетов, кодирующих для аминокислот без каких-либо терминирующих кодонов, и является последовательностью (потенциально), способной транслироваться в белок.

Понятие изолированный означает, что материал удален из его исходного окружения (к примеру, естественное окружение, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, представленный в живых организмах, не является изолированным, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, выделенный из некоторых или всех сосуществующих материалов природной системы, является изолированным. Такие полинуклеотиды могли быть частью вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могли быть частью композиции и все-таки могли быть изолированы, так что такой вектор или композиция не является частью своего естественного окружения.

Полинуклеотиды и рекомбинантные или иммуногенные полипептиды, раскрытые в соответствии с настоящим изобретением, могут также быть в очищенной форме. Термин очищенный не требует абсолютной чистоты; скорее он предназначен для дачи относительного определения и может включать препараты с высокой очисткой или препараты только с частичной очисткой в соответствии с тем, как эти термины понимаются специалистами соответствующей области. Например, отдельные клоны, изолированные из библиотеки кДНК, обычно очищались до электрофоретической чистоты. Очистка исходного материала или природного материала по крайней мере до одного порядка величины, предпочтительно двух или трех порядков и более предпочтительно четырех или пяти порядков величины определенно рассматривается. Более того, определенно рассматривается заявленный полипептид, чистота которого составляет предпочтительным образом 99,999% или по крайней мере 99,99 или 99,9% и еще более желательно 99 вес.% или более.

Нуклеиновые кислоты и продукты экспрессии полипептида, раскрываемые в соответствии с настоящим изобретением, в равной степени, как и векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые кислоты и/или такие полипептиды, могут быть в обогащенной форме. Используемый здесь термин обогащенный означает, что концентрация материала по крайней мере приблизительно в 2, 5, 10, 100 или 1000 раз выше его естественной концентрации (например), преимущественно 0,01 вес.%, предпочтительно по крайней мере около 0,1 вес.%. Рассматриваются также препараты с около 0,5, 1, 5, 10 и 20 вес.%. Последовательности, конструкции, векторы, клоны и другие материалы, включенные в настоящее изобретение, могут предпочтительно быть в обогащенной или изолированной форме.

Термин активный фрагмент означает фрагмент, который дает иммунный ответ (т.е. обладает иммуногенной активностью), если он введен отдельно или опционально с подходящим адъювантом животному, такому как млекопитающее, например кролику или мыши, также включая человека; таковой иммунный ответ, принимающий форму стимуляции ответа Т-клетки у животного-реципиента, такого как человек. Альтернативно активный фрагмент может также быть использован для инициации ответа Тклетки ίη νίίτο.

Используемые здесь термины участок, сегмент и фрагмент, если они использованы по отношению к полипептидам, относятся к непрерывной последовательности остатков, таких как аминокислотные остатки, последовательность которых формирует подкласс более крупной последовательности. Например, если полипептид был подвергнут обработке любой из известных эндопептидаз, таких как трипсин или химотрипсин, то полученные в результате такой обработки олигопептиды будут представлять участки, сегменты или фрагменты исходного полипептида. Это означает, что любой таковой фрагмент будет обязательно содержать как часть его аминокислотной последовательности сегмент, фрагмент или участок, который в значительной степени идентичен, если не в точности идентичен последовательности с δΕΟ ΙΌ N0: 1 по δΕφ ΙΌ N0: 3, которая соответствует встречающемуся в природе или материнскому

- 8 019603 белку с последовательностями с 8ЕЦ ГО N0: 1 по 8ЕЦ ГО N0: 3, а именно сурвивину. При использовании по отношению к полинуклеотидам такие термины относятся к продуктам, полученным при обработке указанных полинуклеотидов любой из известных эндонуклеаз.

В соответствии с настоящим изобретением термин процентная доля идентичности или идентичный с процентной долей, если он относится к последовательности, означает, что последовательность сравнивается с заявленной или описанной последовательностью после противопоставления сравниваемой последовательности (Сравниваемая последовательность) описанной или заявленной последовательности (Контрольная последовательность). Процентная доля идентичности определяется затем по следующей формуле:

Процентная доля идентичности = 100 [1-(С/В)], где С является числом различий между Контрольной последовательностью и Сравниваемой последовательностью по длине противопоставления между Контрольной последовательностью и Сравниваемой последовательностью, где (ί) каждое основание или аминокислота в Контрольной последовательности, которые не имеют соответствующего противопоставленного основания или аминокислоты в Сравниваемой последовательности, и (ίί) каждая брешь в Контрольной последовательности и (ш) каждое противопоставленное основание или аминокислота в Контрольной последовательности, которые отличаются от противопоставленного основания или аминокислоты в Сравниваемой последовательности, представляют собой различие;

В - это число оснований или аминокислот в Контрольной последовательности по длине противопоставления Сравниваемой последовательности с любой брешью, образующейся в Контрольной последовательности, считающейся также за основание или аминокислоту.

Если существует противопоставление между Сравниваемой последовательностью и Контрольной последовательностью, для которых процентная доля идентичности по расчетам выше, имеет значение приблизительного равенства или более чем установленной минимальной процентной доли идентичности, тогда Сравниваемая последовательность имеет установленную минимальную процентную долю идентичности с Контрольной последовательностью, если даже могут существовать противопоставления, в которых подсчитанная здесь выше процентная доля идентичности меньше, чем установленная процентная доля идентичности.

Исходные пептиды, раскрываемые здесь, могут быть модифицированы путем замещения одного или нескольких остатков в различных, по возможности отобранных, местах по длине пептидной цепи, если не заявлено иное. Такие замещения могут носить консервативный характер, например, где одна аминокислота заменяется аминокислотой с похожей структурой и характеристиками, так же как при замене гидрофобной аминокислоты на другую гидрофобную аминокислоту. Еще более консервативным будет замещение аминокислот одинакового или похожего размера и химического характера, такое как при замене лейцина на изолейцин. В исследованиях вариаций последовательностей внутри семейств встречающихся в природе гомологичных белков определенные замещения аминокислот переносятся гораздо чаще, чем другие, и они часто проявляют взаимосвязь со сходствами по размеру, заряду, полярности и гидрофобности между исходной аминокислотой и ее заменой; и таковой является основа определения консервативных замещений.

Консервативные замещения определены здесь как обмены внутри одной из последующих пяти групп: группа 1 - малые, алифатические, неполярные или слабо полярные остатки (А1а, 8ег, ТЬг, Рго, С1у); группа 2 - полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды (Акр, Аки, С1и, С1и); группа 3 полярные, положительно заряженные остатки (Ηίκ, Агд, Бук); группа 4 - крупные, алифатические, неполярные остатки (Ме!, Беи, 11е, Уа1, Сук); и группа 5 - крупные, ароматические остатки (РЬе, Туг, Тгр).

Менее консервативные замещения могут охватывать замещение одной аминокислоты другой, имеющей похожие характеристики, но отличающейся в какой-то степени по размеру, как в случае замещения аланина остатком изолейцина. Высоконеконсервативные замещения могут охватывать замещение кислой аминокислоты другой, которая имеет полярность, или даже такой, которая имеет щелочной характер. Такие радикальные замещения не могут, однако, быть отвергнуты как потенциально неэффективные из-за того, что химические эффекты не полностью предсказуемы, и радикальные замещения могут привести к увеличению случайных эффектов, в противном случае не предсказуемых, исходя из обычных химических принципов.

Разумеется, в таких замещениях могут участвовать другие структуры, отличающиеся от обычных Б-аминокислот. Таким образом, Ό-аминокислоты могут быть замещены Б-аминокислотами, обычно встречающимися в антигенных пептидах по изобретению и также охватываемые настоящим раскрытием сущности изобретения. Кроме того, аминокислоты, содержащие нестандартные В-группы (т.е. В-группы, отличающиеся от обнаруженных в распространенных 20 аминокислотах природных белков), могут быть также использованы в целях замещения для получения иммуногена и иммуногенных полипептидов в соответствии с настоящим изобретением.

Если были произведены замещения на более чем одной позиции для получения пептида с практиче

- 9 019603 ски эквивалентной или большей антигенной активностью, чем та, что определена ниже, то комбинации таких замещений будут проанализированы для определения того, приведут ли эти комбинации замещений к дополнительным или синергетическим эффектам по отношению к антигенности пептида. По большей части не более четырех позиций внутри пептида должны замещаться одновременно.

Термин Т-клеточный ответ означает специфическую пролиферацию и активацию эффекторных функций, индуцированных пептидом ίη νίΐτο или ίη νίνο. Для ЦТЛ, рестриктированных по МНС класса I, эффекторными функциями может быть лизис клеток-мишеней с введенным импульсным способом пептидом, с введенным импульсным способом предшественником пептида или клеток-мишеней, естественно презентирующих пептид, секреция цитокинов, предпочтительно интерферона-γ, ΤΝΡ-α или ИЛ-2, индуцированная пептидом, секреция эффекторных молекул, предпочтительно гранзимов или перфоринов, индуцированная пептидом, или дегрануляция. Для Т-хелперных клеток, рестриктированных по МНС класса II, эффекторными функциями может быть индуцированная пептидом секреция цитокинов, предпочтительно ΙΡΝ-γ, ΤΝΡ-α, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 или ИЛ-2, или индуцированная пептидом дегрануляция. Возможные эффекторные функции ЦТЛ и Т-хелперных клеток не ограничиваются данным списком.

Предпочтительно, если ЦТЛ, специфичные для пептида с 8ЕС ГО N0: 1 по 3, протестированы на замещенные пептиды; концентрация пептида, при которой замещенные пептиды достигают половины максимального роста лизиса относительно фона, составляет не более чем около 1 мМ, предпочтительно не более чем около 1 мкМ, более предпочтительно не более чем около 1 нМ и еще более предпочтительно не более чем около 100 пМ и наиболее предпочтительно не более чем около 10 пМ. Также предпочтительно, чтобы замещенный пептид распознавался ЦТЛ более чем одного индивида, по крайней мере двух и более предпочтительно трех индивидов.

Таким образом, эпитопы настоящего изобретения могут быть идентичны встречающимся в природе опухолеассоциированным или опухолеспецифическим эпитопам или могут включать эпитопы, отличающиеся не более чем четырьмя остатками от контрольного пептида, при условии, что они имеют, по существу, идентичную антигенную активность.

Стимуляция иммунных ответов находится под воздействием присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов сейчас улучшило возможности для использования иммунной системы хозяина для способствования иммунному ответу, специфическому для антигенов-мишеней, экспрессированных на поверхности опухолевых клеток, который благодаря данному механизму действия способен вызывать регрессию, задержку или замедление роста опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.

Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухоль-инфильтрирующих клеточных популяций или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака (Сйссусг е1 а1., 1993; Ζοΐι. III е1 а1., 1999). Основываясь на 415 тканевых препаратах пациентов, страдающих от колоректального рака, Са1оп и соавторы были в состоянии продемонстрировать, что вид, плотность и местонахождение иммунных клеток в опухолевой ткани являются действительно лучшим прогностическим фактором выживаемости пациентов, чем широко используемая классификация опухолей по ΤΝΜ (Са1оп е1 а1., 2006).

МНС класса I презентируют пептиды, образующиеся из протеолитического расщепления преимущественно эндогенных белков, ΌΚΙΡκ и более крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и, в первую очередь, презентировать пептиды экзогенных или трансмембранных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются (СгекбтееП, 1994). Комплексы из пептида и молекул МНС класса I распознаются СЭ8-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами, несущими подходящий ТКР (Т-клеточный рецептор), а комплексы из пептида и молекул МНС класса II распознаются СЭ4-положительными хелперными Т-клетками, несущими подходящий ТКР. Хорошо известно, что ТКР, пептид и МНС часто встречаются в стехиометрическом соотношении 1:1:1.

СЭ4-положительные хелперные Т-клетки играют важную роль в индуцировании и поддержании эффективных ответов СЭ8-положительных цитотоксических Т-клеток (\Уапд апб ЬМпдйопе, 2003; 8ип апб Веνаη, 2003; 81еб1оек апб 81еп, 2003). Первоначально прайминг и экспансия ЦТЛ в лимфатических узлах поддерживается СИ4+ Т-клетками (ЗейоепЬетдет е1 а1., 1998). Один механизм поэтому может служить руководством для наивных СИ8+ клеток к месту функционального взаимодействия СИ4+ Т-клетокАПК (СайеШпо е1 а1., 2006). В итоге образование функциональных клеток памяти СИ8+ во многих случаях зависит от поддержки СИ4+ Т-клеток (8ип апб Βеνаη, 2003; 1ап8§еп е1 а1., 2003). Для этих целей идентификация СЭ4-положительных Т-клеточных эпитопов, образованных из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), может быть чрезвычайно важна для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (КоЬауакЫ е1 а1., 2002; Οίπ е1 а1., 2003; Сп)аБе е1 а1., 2003). В области опухоли Т-хелперные клетки поддерживают благоприятное для ЦТЛ цитокиновое окружение (Οίπ апб В1апкепйеш, 2000; Мойата е1 а1., 2006) и привлекают эффекторные клетки, к примеру

- 10 019603

ЦТЛ, естественные киллерные клетки (ΝΚ), макрофаги, гранулоциты (Магхо с1 а1., 2000; Н\\апд с1 а1., 2007).

При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно рестриктирована по клеткам иммунной системы, в особенности профессиональным антигенпрезентирующим клеткам (АПК), например моноцитам, образованным из моноцитов клеткам, макрофагам, дендритным клеткам. Неожиданно было обнаружено, что опухолевые клетки раковых пациентов экспрессируют молекулы МНС класса II (Пеиде1 е! а1., 2006).

На моделях млекопитающих животных, например мышах, было показано, что даже при отсутствии эффекторных клеток (т.е. СЭ8-положительных Т-лимфоцитов), СЭ4-положительных Т-клеток достаточно для ингибирующего проявления опухолей посредством ингибирования ангиогенеза при секреции интерферон-γ (ΣΕΝγ) (Οίη аиб В1апкеп51ет. 2000). Также предлагалось прямое уничтожение опухолевых клеток цитотоксическими ί.Ό4+ Т-клетками посредством лимфотоксинов и гранзимов В (Реппа е! а1., 1992; Ыбаиа е! а1., 1992).

К тому же было показано, что СО4-положительные Т-клетки, распознающие пептиды из опухолеассоциированных антигенов, презентированные молекулами НЬА класса II, могут препятствовать опухолевой прогрессии посредством индукции ответов антител (АЬ) (Кеппебу е! а1., 2003).

В отличие от опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами НЬА класса I, до сих пор было описано лишь небольшое число лигандов класса II опухолеассоциированных антигенов (ТАА).

Так как конститутивная экспрессия молекул НЬА класса II обычно ограничена клетками иммунной системы (МасЬ е! а1., 1996), то возможность изоляции пептидов класса II напрямую из первичных опухолей считалась невозможной. Тем не менее, Оепд)е1 с соавторами недавно удалось идентифицировать ряд эпитопов МНС класса II напрямую из опухолей (\УО 2007/028574, ЕР 1760088 В1; (Эепде1 е! а1., 2006).

Антигены, которые распознаются опухолевыми специфическими цитотоксическими Тлимфоцитами, то есть их эпитопами, могут быть молекулами, образованными из любого класса белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д., которые экспрессированы и по сравнению с неизмененными клетками того же происхождения находятся в повышенном количестве в клетках соответствующей опухоли.

Актуальная классификация опухолеассоциированных антигенов (ТАА) включает следующие основные группы (ШмеШпо е! а1., 2005).

1. Раковые антигены семенника: первые в истории идентифицированные ТАА, которые могут распознаваться Т-клетками (уап бег Вгиддеп е! а1., 1991), принадлежат к этому классу, называвшемуся первоначально антиген ракового семенника (СТ), так как его члены экспрессируются в отличных по гистологической структуре опухолях человека, а среди нормальных тканей - только в сперматоцитах/сперматогониях семенника и изредка в плаценте. Так как клетки семенника не экспрессируют молекулы НЬА I и II класса, то эти антигены не могут быть распознаны Т-клетками в нормальных тканях и поэтому могут рассматриваться как иммунологически опухолеспецифические. Хорошо известными примерами антигенов СТ являются члены семейства МАСЕ или ΝΥ-Ε8Ο-1.

2. Дифференциационные антигены: данные ТАА встречаются в опухолевых и нормальных тканях, из которых образуется опухоль; большинство из них имеется в меланомах и нормальных меланоцитах. Многие из этих линиеспецифических белков меланоцитов участвуют в биосинтезе меланина и поэтому не являются опухолеспецифическими, однако, несмотря на это, они широко применяются в противораковой терапии. Примеры включают, но не ограничиваются, тирозиназу и Ме1аи-А/МАКТ-1 для меланомы или Р8А для рака простаты.

3. Гиперэкспрессированные ТАА: гены, кодирующие широко экспрессированные ТАА, были обнаружены в отличных по гистологической структуре опухолях, а также во многих нормальных тканях, в основном, с более низким уровнем экспрессии. Возможно, что многие эпитопы, процессируемые и потенциально презентируемые нормальными тканями, находятся ниже порогового уровня для распознавания Т-клетками, в то время как их гиперэкспрессия в опухолевых клетках может инициировать противораковый ответ, нарушая установившуюся ранее толерантность. Известными примерами ТАА этого класса являются Нег-2/пеи, сурвивин, теломераза или \УТ1.

4. Опухолеспецифические антигены: данные уникальные ТАА образуются из мутаций нормальных генов (таких как β-катенин, СЭК4 и т.д.). Некоторые из этих молекулярных изменений ассоциированы с неопластической трансформацией и/или прогрессией. Опухолеспецифические антигены, в основном, способны индуцировать сильные иммунные ответы, не заключая в себе риска аутоиммунных реакций по отношению к нормальным тканям. С другой стороны, данные ТАА в большинстве случаев релевантны только для определенной опухоли, на которой они были идентифицированы, и обычно не являются общими для многих отдельных опухолей.

5. ТАА, образующиеся из абнормальных пост-трансляционных модификаций: такие ТАА могут образоваться из белков, которые не являются ни специфическими, ни гиперэкспрессированными в опухолях, однако, несмотря на это, становятся опухолеассоциированными в ходе посттрансляционных процес

- 11 019603 сов, происходящих первоначально в опухолях. Примеры для этого класса берут свое начало в измененных паттернах гликозилирования, приводящих к новым эпитопам в опухолях, как в случае МиС1, или таких процессах, как белковый сплайсинг во время деградации, который может или не может быть опухолеспецифическим (Наиаба с1 а1., 2004; Ущпсгоп с1 а1., 2004).

6. Онковирусные белки: данные ТАА являются вирусными белками и могут играть ведущую роль в онкогенном процессе, и, так как они являются чужеродными (не человеческого происхождения), они могут провоцировать Т-клеточный ответ. Примерами таких белков являются вирусные белки человеческой папилломы типа 16, Е6 и Е7, которые экспрессированы в карциноме шейки матки.

Для того чтобы белки были узнаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или -ассоциированного антигена, и в целях применения в терапии должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен экспрессироваться преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в сравнительно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. число копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены часто образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например при контроле клеточного цикла или подавлении апоптоза. Кроме того, мишени нисходящего пути белков, напрямую являющихся причиной трансформации, могут быть также представлены в повышенном количестве и, таким образом, косвенно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода (8тдй-1а8И)а с1 а1., 2004). В обоих случаях необходимо, чтобы эпитопы присутствовали в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид (иммуногенный пептид), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести ίη νίίτο или ίη νίνο к Т-клеточному ответу.

В основном, любой пептид, способный связываться с молекулой МНС, может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа ίη νίίτο или ίη νίνο является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие иммунологической толерантности к данному конкретному эпитопу.

Поэтому опухолеассоциированные антигены (ТАА) являются отправным пунктом для разработки противораковой вакцины. Методы идентификации и характеристики ТАА основаны на использовании ЦТЛ, которые могут быть изолированы у пациентов или здоровых субъектов, или же они основаны на генерировании дифференциальных транскрипционных профилей или дифференциальных паттернов пептидной экспрессии между опухолевыми и нормальными тканями (Ееште1 еί а1., 2004; ΧνοίηδοΙιοηΚ еί а1., 2002).

Однако идентификация генов, гиперэкспрессированных в опухолевых тканях или человеческих опухолевых клеточных линиях или же селективно экспрессированных в таких тканях или клеточных линиях, не обеспечивает точной информацией об использовании антигенов, транскрибированных с данных генов, в иммунотерапии. Причиной тому то, что только отдельная субпопуляция эпитопов этих антигенов подходит для такого применения, так как Т-клетка с соответствующим ТКР должна быть в наличии, и необходимо, чтобы отсутствовала или была минимальной иммунологическая толерантность к этому конкретному эпитопу. Поэтому важно выбрать лишь те пептиды из гиперэкспрессированных или селективно экспрессированных белков, которые презентируются в соединении с молекулами МНС, против которых может быть обнаружена функциональная Т-клетка. Такая функциональная Т-клетка определяется как Т-клетка, которая при стимуляции специфическим антигеном может быть распространена клонально и способна к выполнению эффекторных функций (эффекторная Т-клетка).

Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа Т_Н1, поддерживают эффекторные функции СЭ8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих опухолеассоциированные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.

Так как оба вида ответов, зависящие от СЭ8 и от СЭ4. вносят свой вклад в противоопухолевый эффект сообща и усиливая друг друга, то идентификация и характеристика опухолеассоциированных антигенов, распознаваемых как СЭ8+ ЦТЛ (лиганд: молекула МНС I класса + пептидный эпитоп), так и СЭ4положительными хелперными Т-клетками (лиганд: молекула МНС II класса + пептидный эпитоп) являются важными при разработке противоопухолевых вакцин.

Ввиду серьезных побочных эффектов и расходов, связанных с лечением рака, крайне необходимы улучшенные методы прогнозирования и диагностики. Поэтому существует необходимость в идентификации других факторов, репрезентирующих биомаркеры для рака вообще и глиобластомы в частности. Кроме того, существует необходимость в идентификации факторов, которые могут быть использованы при лечении рака вообще и глиобластомы в частности.

- 12 019603

Кроме того, не существует признанного подхода к лечению пациентов с раком предстательной железы с биохимическим рецидивом после радикальной простатэктомии, обычно вызываемым резидуальным остатком опухоли ίη δίΐιι при наличии локально прогрессирующего роста опухоли. Желательны были бы новые терапевтические подходы, которые бы сопровождались низкой смертностью с адекватной терапевтической эффективностью по сравнению с имеющимися на данный момент терапевтическими подходами.

Данным изобретением обеспечиваются пептиды, которые полезны для лечения глиобластомы, рака предстательной железы и других опухолей, которые гиперэкспрессируют сурвивин. Как непосредственно показал масс-спектрометрический анализ, эти пептиды естественно презентировались молекулами НЬА на пробах первичной глиобластомы человека (см. пример 1 и фиг. 1) или в случае 8ΕΟ ΙΌ N0: 1 и 2, предсказанных по алгоритму 8ΥΕΡΕΙΤΗΙ (Каттепзее с1 а1., 1995), они должны беспорядочно связываться с аллелями НЬЛ-ЭК, НЬА-ЭКВ1*01, ΌΚΒ1*03, ΌΚΒ1*04, ΌΚΒ1*11 и ΌΚΒ1*15 (см. приложение). Основываясь на этих данных и частотности данных часто встречающихся аллелей ΌΚΒ1 (Μοτί е1 а1., 1995; Сйапоск е1 а1., 2004), можно предположить, что 92% А*02-положительных европеоидов экспрессируют по крайней мере один аллель ΌΚΒ1, который связывается с данными пептидами (8Ε0 ΙΌ N0: 1 по 8Ε0 ΙΌ N0: 3). 8Ε0 ΙΌ N0: 2 содержит такую же центральную последовательность как и 8Ε0 ΙΌ N0: 1, продленную двумя ^терминальными аминокислотами из естественной последовательности сурвивина, содержа описанный Т-клеточный эпитоп I класса из сурвивина (ΞΟιιηίΙζ е1 а1., 2000). 8Ε0 ΙΌ N0: 3 содержит такую же последовательность как и 8Ε0 ΙΌ N0: 1, где последняя С-терминальная аминокислота модифицирована из аспарагина (И) до аспарагиновой кислоты (Ό).

Исходный ген, из которого образованы с 8Ε0 ΙΌ N0: 1 по 8Ε0 ΙΌ N0: 3 - сурвивин, был представлен в гиперэкспрессированном состоянии при глиобластоме, опухоли предстательной железы, раке молочной железы, раке пищевода, колоректальном раке, светлоклеточной почечной карциноме, раке легких, ЦНС, яичника, меланоме (Татт е1 а1. 1998), раке поджелудочной железы, плоскоклеточной карциноме, лейкемии и медуллобластоме в сравнении с нормальными тканями (см. пример 2 и фиг. 2), демонстрируя высокую степень ассоциации данных пептидов с опухолью, т.е. эти пептиды в большом количестве презентируются на опухолевой ткани, но не на нормальных тканях.

Связанные с НЬА пептиды могут распознаваться иммунной системой, специально Тлимфоцитами/Т-клетками. Т-клетки могут разрушать клетки, презентирующие распознанный комплекс НЬА/пептид; к примеру опухолевые клетки глиобластомы, презентирующие образованные из сурвивина (с 8Ε0 ΙΌ N0: 1 по 8Ε0 ΙΌ N0: 3). Т-хелперные клетки, активированные образованными из сурвивина пептидами, могут ингибировать васкуляризацию опухоли, могут привлекать эффекторные клетки иммунной системы и способствовать праймингу ЦТЛ, пролиферации и устойчивому 0Ό8+ Т-клеточному ответу.

Как было показано, все пептиды настоящего изобретения в состоянии стимулировать Т-клеточные ответы (см. пример 3 и фиг. 3). Таким образом, пептиды полезны для генерирования иммунного ответа у пациента, который может уничтожать опухолевые клетки. Иммунный ответ у пациента может быть индуцирован при непосредственном введении описанных пептидов или подходящих веществпредшественников (к примеру, удлиненных пептидов, белков или нуклеиновых кислот, кодирующих эти пептиды) пациенту, в идеальном случае в комбинации с веществом, усиливающим иммуногенность (т.е. адъювантом). От иммунного ответа, вызванного такой терапевтической вакцинацией, может ожидаться, что он будет высокоспецифическим против опухолевых клеток, так как целевые пептиды настоящего изобретения не презентируются на нормальных тканях со сравнимыми количествами копий, предотвращая тем самым риск нежелательных аутоиммунных реакций против нормальных клеток у пациента.

Фармацевтические композиции включают пептиды как в свободной форме, так и в форме фармацевтически приемлемой соли.

Используемое здесь понятие фармацевтически приемлемая соль относится к производным раскрытых пептидов, причем пептид модифицирован путем получения кислотных или щелочных солей агента. Например, кислотные соли получают из свободного основания (типично, где нейтральная форма лекарственного средства имеет нейтральную группу -ЫН₂) с применением реакции с подходящей кислотой. Подходящие кислоты для получения кислотных солей включают как органические кислоты, например уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, пировиноградную кислоту, щавелевую кислоту, оксиянтарную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, р-толуолсульфокислоту, салициловую кислоту и подобные, так и неорганические кислоты, например хлористо-водородную кислоту, бромисто-водородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и подобные. И наоборот, приготовление щелочных солей кислотных составляющих, которые могут присутствовать на пептиде, приготовляются при использовании фармацевтически приемлемого основания, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, гидроксид кальция, триметиламин или подобных.

В одном особенно предпочтительном воплощении фармацевтические композиции включают пептиды в виде солей уксусной кислоты (ацетаты) или хлористо-водородной кислоты (хлориды).

- 13 019603

Кроме того, пептиды настоящего изобретения полезны не только для лечения рака, но и также в качестве диагностических средств. Так как пептиды были получены из глиобластомы и так как было определено, что данные пептиды не присутствуют в нормальных тканях, то эти пептиды могут быть использованы для постановки диагноза о наличии рака.

Присутствие заявленных пептидов на тканевых биоптатах может помочь патологу в постановке диагноза рака. Детекция конкретных пептидов с помощью антител, масс-спектрометрии или других методов, известных из уровня техники, могут дать знать патологу, что ткань является злокачественной или воспаленной или же поражена заболеванием общего порядка. Присутствие групп пептидов может позволить классифицировать или выделить подклассы пораженных тканей.

Детекция пептидов на образцах пораженной заболеванием ткани может позволить принять решение о преимуществах от терапии, воздействующей на иммунную систему, в особенности, если Т-лимфоциты, как известно или ожидается, задействованы в механизме действия. Отсутствие экспрессии МНС является хорошо описанным механизмом, при котором инфицированные или злокачественные клетки уклоняются от иммунного надзора. Таким образом, присутствие пептидов показывает, что этот механизм не используется проанализированными клетками.

Пептиды могут использоваться в анализе ответов лимфоцитов против таковых пептидов, таких как Т-клеточные ответы или ответы антител против пептида или пептида в комплексе с молекулами МНС. Данные иммунные ответы лимфоцитов могут использоваться в качестве прогностических маркеров для принятия решения о дальнейших этапах терапии. Данные иммунные ответы могут также использоваться в качестве суррогатных маркеров в иммунотерапевтических подходах, направленных на индуцирование ответов лимфоцитов с помощью различных средств, как, например, вакцинации белком, нуклеиновыми кислотами, аутологичными материалами, адаптивного переноса лимфоцитов. При генной терапии ответы лимфоцитов на пептиды могут быть рассмотрены в рамках оценки побочных эффектов. Мониторинг ответов лимфоцитов может также быть ценным инструментом для последующих обследований в случае трансплантации, к примеру, для детекции реакций хозяин против трансплантата и трансплантат против хозяина.

Пептиды могут использоваться для генерации и разработки специфических антител к комплексам МНС/пептид. Они могут быть использованы в терапии, нацеливающей токсины или радиоактивные вещества на пораженную ткань. Другим видом использования данных антител может быть нацеливание радионуклидов на пораженную ткань в целях визуализации, такой как РЕТ (позитронно-эмиссионная томография). Это может помочь в обнаружении небольших метастазов или в определении размера и точного расположения пораженных тканей.

Кроме того, пептиды могут быть использованы для верификации диагноза патолога, поставленного на основании биоптата.

В табл. 3 показаны пептиды в соответствии с настоящим изобретением, соответствующие им номера последовательностей 8ЕЭ ΙΌ N0; аллели НЬА, с которыми связываются соответствующие пептиды, и исходные белки, из которых могут быть образованы данные пептиды. Особенно интересен факт, что пептид в соответствии с 8ЕЭ ΙΌ N0: 2 связывается с НЬА-ЭК в равной степени, как и с НЬА-А*02, таким образом, вызывая два различных ответа.

Таблица 3

Пептиды настоящего изобретения

№ послед-ти	Код пептида	Последовательность	Аллели НЬА	Исходный белок (белки)
1	ΒΙΕ-002	ТЬСЕГЬКШКЕКАКЫ	НЬА-ЦК	Сурвивин
2	ΒΙΚ-004	БЬТЬСЕГЬЕШКЕКАКИ	НЬА-ЦК И НЬА-А*02	Сурвивин
³	В1К-002а	ТЬСЕРШЬРЕЕКАКБ	НЬА-ЦК	Сурвивин

Экспрессия В1ЯС5 (сурвивин), члена семейства белков-ингибиторов апоптоза (1АР), содержится в повышенном количестве в фетальных тканях и различных видах рака человека и со значительно сниженной экспрессией в нормальных взрослых дифференцированных тканях, в особенности, если у них низкий индекс пролиферации. Предполагается, что сурвивин способен к регуляции как клеточной пролиферации, так и отмирания апоптических клеток. Хотя сурвивин обычно находится на цитоплазматическом участке клетки и ассоциируется с плохим прогнозом при раке, также сообщалось о ядерной локализации, указывающей на благоприятный прогноз (О'ЭпксоП е! а1., 2003). Регуляцию сурвивина и с его помощью описывают несколькими механизмами. Предполагается, что сурвивин ассоциирован с молекулярным шапероном Нкр60. 1п νίνο, Нкр60 с избытком экспрессирован в первичных опухолях человека по сравнению с соответствующими нормальными тканями. Экстренная абляция Нкр60 небольшой интерферирующей РНК дестабилизирует митохондриальный пул сурвивина, вызывает митохондриальную дисфункцию и активирует каспазазависимый апоптоз (Όΐιοκίι е! а1., 2008). Кроме того, ингибирование Яак

- 14 019603 приводит к снятию сурвивинового тормоза на апоптозе и активации митохондриального апоптотического каскада реакций. В особенности в глиобластоме устойчивость к апоптозу может быть ликвидирована посредством Как-ингибитора, мишенью которого является сурвивин (В1ит е! а1., 2006). Вероятно, существует взаимосвязь между ΝΕ-кВ гиперактивностью в глиомах и гиперэкспрессией сурвивина, одного из генов-мишеней ΝΕ-кВ. Таким образом, активированные ΝΕ-κΒ антиапоптотические гены гиперэкспрессированы в пробах опухолей. В особенности, в глиобластоме обнаруживаются очень высокие уровни экспрессии сурвивина (ЛидПеп е! а1., 2008). Предполагается, что гиперэкспрессия сурвивина в глиомах головного мозга может играть важную роль в злокачественной пролиферации, антиапоптозе и ангиогенезе (Ζίκη е! а1., 2005; Ьш е! а1., 2006). Было произведено несколько анализов для изучения экспрессии сурвивина и его влияния на выживаемость при глиобластоме. В качестве обобщения экспрессия сурвивина, в особенности одновременная экспрессия в ядре и цитоплазме в астроцитных опухолях, была значительно ассоциирована со степенью злокачественности (с наибольшей экспрессией сурвивина в глиобластоме) и более короткими общими сроками выживаемости по сравнению с пациентами, у которых были сурвивин-негативные опухоли (Кармага е! а1., 2003; Бабо е! а1., 2007; иета!ки е! а1., 2005; Ме11а1 е! а1., 2008; Стипба е! а1., 2006; Х1е е! а1., 2006; Бакай е! а1., 2002; Сбактауатб е! а1., 2002).

Гиперэкспрессия сурвивина описывалась также для других опухолевых форм. При раке молочной железы гиперэкспрессия сурвивина ассоциирована с более высокой степенью злокачественности и более коротким сроком выживаемости без заболевания (УатакЫ1а е! а1., 2007; Л1-1оиб1 е! а1., 2007; Брап е! а1., 2004) Как было зафиксировано, в клеточных линиях рака пищевода, промоторная активность сурвивина была в 28,5 раз выше, чем в нормальных тканях (Ба!о е! а1., 2006). При колоректальном раке экспрессия сурвивина также ассоциирована с патологической степенью и метастазами лимфатических узлов (Тап е! а1., 2005). Как было показано, агрессивность светлоклеточной почечной карциномы ассоциирована с экспрессией сурвивина. Кроме того, экспрессия сурвивина обратно пропорционально ассоциирована со специфичной для рака выживаемостью (Кокап е! а1., 2005). Экспрессия сурвивина может быть обнаружена в наборе неоплазмов с участием кератиноцитов и гиперпролиферативных поражениях кожи, но не в нормальной коже (Во\\еп е! а1., 2004). В клеточных линиях рака поджелудочной железы сурвивин был амплифицирован в 58% проанализированных клеточных линий (МаЫатай е! а1., 2002). При плоскоклеточной карциноме экспрессия сурвивина может помочь идентифицировать случаи с более агрессивным и инвазивным клиническим фенотипом (Ьо е! а1., 2001).

Так как сурвивин является такой многообещающей мишенью при лечении рака, то исследования с использованием образованных из сурвивина пептидов показали, что сурвивин является иммуногенным для пациентов с опухолями, вызывая ответы, опосредованные СЭ8+ Т-клетками. В дополнение к этому, сурвивин специфически стимулировал СЭ4+ Т-клеточную реактивность лимфоцитов в периферической крови у тех же пациентов (Сакаб е! а1., 2003; йексбе е! а1., 2007).

Сурвивин (8νΝ, ВГК.С) гиперэкспрессирован во множестве раковых форм. Итак, гиперэкспрессия сурвивина в целом, как считается, ассоциирована с более коротким общим сроком выживаемости и более высокими степенями злокачественности.

йексбе (2006) раскрыл в рамках своего исследования (см. также (Иексбе е! а1., 2007)) эпитопыкандидаты, рестриктированные по МНС II класса и НЬЛ II класса, из сурвивина (8νΝ) и протеиназы-3 (РК3), которые были определены с помощью компьютерной программы ТЕРГТ0РЕ (В1ап апб Наттег, 2004). В результате анализа на ТЕРП0РЕ было получено 6 эпитопов-кандидатов для БVN и 11 эпитоповкандидатов для РК3 с большой вероятностью связывания для различных аллелей НЬЛ-ЭК. Данные 17 пептидов были использованы в иммунологических экспериментах с Т-клетками после синтеза и хроматографической очистки. Различные длины пептидов, полученные из перекрывающихся эпитопов, которые были учтены в одном пептиде (табл. 4).

Таблица 4

Названия, позиция АА и последовательности АА синтетических БVN пептидов, раскрытых в работе Р1ексбе 2006

Пептид	Позиция	Аминокислотная последовательность	Т-клеточная частотность
Зю	10-24 (ЗЕО Ю № 28)	Η<2ΡΪΊ,ΚΟΗΒΙ8ΤΓΚΝ	8,64*10'
$22	22-36 (ΞΕζ) Ю № 29)	ЕКЫИРГЬЕСАААТРЕ	772*10'
3-10	40-54 (5Е0 ΙΌ № 30)	ΕΑΟΓΙΗΑΡΤΕΝΕΡϋΕ	8, 64*10'
	58-72 (ΞΕΟ Ιϋ Ν' 31)	ЕЕСЕКЕЬЕСНЕРЦОО	4,32*10’⁷
	88-103 (5Е0 ΙΟ Ν' 32)	ЬСЕГЬКЬОКЕКАКЫК1	ΐ, 73*10’
31Ю	110-124 (3Ε0 Ю Ν' 33)	ΚΝΚΙΑΚΕΤΝΝΚΚΚΕΕ	8,64*10’

Примечания: Б₈₈ является фактически Б₉₈, таким образом, Р1ексбе и соавторы могли ошибаться в определении позиции данного эпитопа.

- 15 019603

Р1С5С11С проводил эксперименты по титрации с соответствующими пептидами для определения НЬЛ-аффинности пептида или НЬЛ/ТСВ-авидности пептида. Чем ниже концентрация пептида, тем выше аффинность связывания пептидных эпитопов с молекулами МНС, что является важной предпосылкой для естественной презентации истинных Т-клеточных эпитопов из внутриклеточного процессинга белкового антигена. Измеренная полумаксимальная пролиферативная активность пептид-специфических Тклеточных клонов составляла <50 нМ для 8₁₀, 400 - 700 нМ для 8₄₀, 2000 - 3000 нМ для 8₈₈ и 100 - 300 нМ для Р₅₈. Далее Р1С5С11С раскрывает, что лишь δνΝ-пептид 810 вызывал специфическую Т-клеточную пролиферацию во время воздействия рекомбинантным δνΝ-белком. Это было продемонстрировано для трех 8ц-специфических Т-клеточных клонов различных доноров. Р1С5С11С и соавторы исследовали процессинг и презентацию 8νΝ пептидных эпитопов из естественного антигена посредством кокультивирования пептид-специфических Т-клеточных клонов с ДК с введенным импульсным способом δνΝ-белком. Только δνΝ-пептид 8₁₀ был в состоянии вызвать специфическую Т-клеточную пролиферацию во время воздействия рекомбинантным δνΝ-белком. Это было продемонстрировано для трех 81₀-специфических Т-клеточных клонов различных доноров. Для РЮ-специфических Т-клеточных клонов специфической пролиферации в ответ на естественный антиген обнаружено не было.

Кроме того, опухолевые антигены из апоптических или некротических опухолевых клеток были усвоены АПК ίη νίνο, процессированы независимо от МНС II и презентированы СЭ4+ Т-клеткам. Для распознавания истинных 8₁₀ эпитопов Т-клетками в ДК импульсным способом были введены лизаты опухолевых клеток из различных δνΝ-положительных опухолевых клеточных линий. Для 8₁₀ эпитопа ίη νίίτο детектировалось непосредственное распознавание ДК с введенным импульсным способом лизатом из опухолевых клеточных линий Катра§-422, 1игка1 и НЬ-60. Это было продемонстрировано по крайней мере для трех 81₀-специфических Т-клеточных клонов различных доноров.

Чтобы показать, что эпитоп 8₁₀ может вызывать иммунный ответ у раковых пациентов, должно быть подтверждено присутствие соответствующих ί.Ό4+ Т-лимфоцитов в крови пациентов с опухолевыми заболеваниями. МПК различных пациентов изолировали и стимулировали пептидом 8₁₀. В этих целях у пациентов брали пробы МПК до начала лечения и после начала цитотоксической терапии; моноциты и В-клетки, содержащиеся во фракции МПК, использовали в качестве антиген-/пептидпрезентирующих клеток. После культивирования в течение одной недели клетки анализировали с учетом их пептид-специфической пролиферации с использованием метода включения [³Н]-тимидина. Из 13 обследованных пациентов у трех имелся обнаруживаемый пролиферативный ответ ίη νίίτο.

Потенциальное применение пептидных эпитопов в иммунотерапии обязательно зависит от того, реагируют ли пептид-специфические СЭ4+ Т-лимфоциты на соответствующий антиген. Распознавание естественно процессированного белкового антигена в виде подлинных или истинных эпитопов, в принципе, подвержено влиянию различных факторов.

Р1С5С11С показал, что распознавание белка могло быть установлено лишь для 8УЮэпитопа 8₁₀. Для других идентифицированных пептидов (8νΝ: 8₄₀, 8₈₈; РВ₃: Р₅₈, Р₂₁₆, Р₂₃₅ и Р₂₃₉) распознавание белка не могло быть установлено. Р1С5С11С и соавторы заявили, что во время эндосомального протеолиза важно, чтобы фрагменты настоящей последовательности не были деградированы, как в случае криптических эпитопов. В отличие от эпитопов, рестриктированных по МНС класса I, молекулы МНС II класса могут поглощать пептиды различных длин (12-28); поэтому не требуется протеолитического расщепления пептидных эпитопов до указанной длины.

Неожиданным образом, изобретатели показывают в настоящем изобретении, что другой эпитоп 8Еф ГО Ν0: 1, образованный из сурвивина, который короче, чем 8₈₈, но имеющий также перекрывающиеся участки, вызывал сильный иммунный ответ у 16 из 19 пациентов ίη νίνο (см. пример 4). Из-за высокого полиморфизма локуса НЬЛ-ΌΒ это также является подтверждением высоко беспорядочного связывания пептида с 8Еф ГО Ν0: 1, как и было предсказано, так как иммунный ответ может быть вызван только пептидом, связанным с молекулой НЬЛ.

Важность раковых форм, для которых в литературе была описана гиперэкспрессия сурвивина, проиллюстрирована в табл. 2. Формы рака, для которых гиперэкспрессия сурвивина является обычно описываемым свойством, стали причиной смерти в 415000 случаев в 2007 г. (см. табл. 1).

Р1С5С11С и соавторы (2006) показали ίη νίίτο присутствие подходящих предшественников для пептида 888 у трех из четырех доноров с перекрывающимися аллелями НЬЛ-ΌΒ. В данном случае совокупность фактов слишком мала, чтобы из этого можно было вывести беспорядочное связывание 8₈₈ с НЬЛ-ΌΒ, так как полученные результаты могут быть объяснены связыванием с двумя различными аллелями НЬЛ-ΌΒ (например, ΌΚ3 и ΌΚ11 или ΌΡ1 и ΌΚ3 или ΌΚ11 и ΌΡ4). Помимо этого, индикаторы стимуляции, полученные из довольно не специфического анализа пролиферации (включение [³Н]-тимидина) из цельных культур МПК, довольно низки, положительного контроля нет (к примеру, смесь хорошо охарактеризованных, сильно иммуногенных вирусных пептидов), и также нет подходящих негативных контролей (стимуляция во время анализа пролиферации с нерелевантным контрольным пептидом). Данные по частотности предшественников не были подтверждены вторым видом анализа.

В патенте У0 2007/036638 (ХУаид с1 а1.), среди прочих, раскрываются сурвивиновые пептиды аминокислотных последовательностей

- 16 019603

96-110 (ЬТЬбЕЕЬКЬПВЕВАК; 8Ер ГО N0: 25);

99-113 (^ЕΕ^К^^ВЕВЛКNКI; 8ЕО ГО N0: 26);

102-116 (ЬКЬПКЕВЛКХШАКЕ; 81Ь) ГО N0: 27).

В качестве участка, связывающегося с молекулами НЬА МНС класса II с хорошей аффинностью (ΣΟ₅₀ <1000 нМ), описан участок с 84 по 113. Несмотря на это, пептиды, исследованные \апд и соавторами, проявляют очень широкий спектр свойств связывания по отношению к различным молекулам НЬА, и указанные свойства связывания радикально отличаются даже внутри указанного региона, как было описано, если пептиды изменены в своей последовательности одной или двумя аминокислотами.

Пептид настоящего изобретения с 8Е0 ГО N0: 3 (Τ^6ЕΕ^К^^ВЕВЛК^; пептид В!Р-002а) включает последовательность пептида ВГВ-002 настоящего изобретения с 8Е0 ГО N0: 1, за исключением того, что на С-конце указанный пептид оканчивается аспарагиновой кислотой (Ό) вместо аспарагина (Ц). Пептид перекрывается с пептидом Рю5с11с δ₈₈, который содержит последние три аминокислоты МКГ Как было упомянуто выше, пептид 8₈₈ не был активным в специфическом анализе на Т-клеточную пролиферацию во время воздействия рекомбинантным белком 8УМ В отличие от этого, пептид В[В-002а давал сильный, относящийся к МНС II иммунный ответ. Не желая привязываться к теории, предполагается, что ферментативная конверсия аспарагина в аспарагиновую кислоту через аспарагиназу происходит ίη νίνο, и, таким образом, С-терминальная аминокислота модифицирована (пептид активируется и/или активируется впоследствии). Так как С-терминальный аспарагин пептида Рю^сНс δ₈₈ заблокирован двумя аминокислотами, указанный пептид не активен (в дальнейшем показывая важность изменения одной аминокислоты в активности данного пептида).

Более того, было замечено, что иммунные ответы и активности других пептидов, включающих Стерминальный аспарагин (такие как, например, 8Е0 ГО N0: 1), могут также зависеть от С-терминальной конверсии в кислую аминокислоту, в частности аспарагиновую кислоту. Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения пептид в соответствии с 8Е0 ГО N0: 1 может рассматриваться как пролекарство для 8Е0 ГО N0: 3, которой обеспечивается активный пептид в соответствии с 8Е0 ГО N0: 3 после ферментативной конверсии. Должно быть понятно, что настоящее изобретение также охватывает химическую конверсию аминокислоты, особенно аспарагина, и спонтанное деамидирование при потере одной молекулы воды.

Кроме того, примеры, показывающие активность для пептида в соответствии с 8Е0 ГО N0: 1 поддерживают также активность для модифицированного пептида в соответствии с 8Е0 ГО N0: 3.

В контексте настоящего изобретения может, кроме того, быть обнаружено, что растворимости пептидов в области пептида ВГВ-002 (участок с 84 по 113) радикально отличаются для очень похожих пептидов. Необходимо отметить, что у \апд и соавторов пептиды участка, близкого к пептиду ВГВ-002, были фактически не растворимы, а измерения связывания не могли быть выполнены.

Растворимости были определены следующим образом:

ВЖ-002 (8ЕГ) ГО N0: 1): <32,9 мг/мл (ацетат),

ВГО-йСа (8Е0 ГО N0: 3) (Ό вместо N на С-терминальном конце): <23,5 мг/мл,

ВГО-014 (соотносимый пептид по \апд, 8Е0 ГО N0: 25): <99,5 мг/мл.

Еще один другой аспект настоящего изобретения относится к антителу, которое специфически связывается с главным комплексом гистосовместимости человека (МНС) I или II класса в комплексе с НЬАрестриктированным антигеном (именуемое в дальнейшем также комплекс-специфическое антитело). Еще один другой аспект настоящего изобретения относится затем к методу получения указанного антитела, специфически связывающегося с главным комплексом гистосовместимости человека (МНС) I или II класса в комплексе с НЬА-рестриктированным антигеном, метод, включающий иммунизацию полученного с помощью генной инженерии нечеловеческого млекопитающего, включающего клетки, экспрессирующие указанный главный комплекс гистосовместимости человека (МНС) I или II класса с растворимой формой молекулы МНС I или II класса в комплексе с указанным НЬА-рестриктированным антигеном; изолирование молекул мРНК из антитела, вырабатывающего клетки указанного нечеловеческого млекопитающего; получение библиотеки фагового отображения, отображающей белковые молекулы, закодированные указанными молекулами мРНК; и изолирование по крайней мере одного фага из указанной библиотеки фагового отображения, указанный по крайней мере один фаг, отображающий указанное антитело, специфически связываемое с указанным главным комплексом гистосовместимости человека (МНС) I или II класса, в комплексе с указанным НЬА-рестриктированным антигеном. Соответствующие методы для получения таких антител и одноцепочных главных комплексов гистосовместимости I класса, в равной степени, как и другие инструменты для получения данных антител, раскрыты в \0 03/068201, \\'0 2004/084798, \\'0 01/72768, \\'0 03/070752 и у Сокеп С.Ь, ОепкЬегд 6., Ее\ А., Ере1 М., Вейег Υ. ВесотЫпай айгЬоФек \уйк МНС-гейпФей, рер11йе-5рес1Пс, Т-се11 гесерЮг-кке 8рес1Г1сйу: пе\у ЮоЬ ΐο 51нйу апкдеп ргезеййюп апй ТСВ-рерййе-МНС 1йегаскоп8. ί. Μο1. Весодпй. 2003 8ер-0с1; 16(5): 324-32; ЬепкЬегд 6., Ьем А., ЕйепЬаск Ь., Вепкаг I., Вейег Υ. 8е1есйуе 1агде11пд οΓ те1апота апй АРСз иыпд а гесотЫпай апкЬойу \\йк ТСВ-йке 5рес1Псйу ййес1ей Ю\уагй а те1апота ййГегепкакоп апкдеп. ί. Iттиηο1. 2003 8ер. 1; 171(5): 2197-207; и Сокеп С.Ь, 8апд 0., Υатаηο Υ., Тотаги и., ГасоЬзоп 8., Вейег Υ. ΌπόΦ ркепо1ур1с апа1у818 оГ китап МНС с1а§8 I апкдеп ргезейайоп: уймаИ/акоп, диаййакоп, апй ш йи йе1есйоп оГ

- 17 019603

Ьитап У1га1 ерйорек иктд рерббе-кресШс, МНС-гек1пс1еб Ьитап гесотЬтап! апбЬоб1ек. I. 1ттипо1. 2003 Арг. 15; 170(8): 4349-61, которые в целях настоящего изобретения в открытой форме включены сюда в своей целостности путем ссылки.

Предпочтительно, если антитело связывается с аффинностью связывания ниже 20 нмоль, предпочтительно ниже 10 нмоль с комплексом, который называется специфическим в контексте настоящего изобретения.

Термин антитело используется здесь в широком смысле и включает как поликлональные, так и моноклональные антитела. В дополнение к интактным молекулам иммуноглобулина в термин антитела включены также фрагменты или полимеры таких молекул иммуноглобулина и гуманизированные версии молекул иммуноглобулина при условии, что они проявляют одно из желаемых свойств (например, являются комплекс-специфическим антителом, как упомянуто выше, доставляют токсин к раковой клетке, экспрессирующей раковый ген-маркер на повышенном уровне, и/или ингибируют активность ракового полипептида-маркера, такого как сурвивин), описанных здесь.

Если возможно, антитела по изобретению могут быть куплены в коммерческих источниках. Антитела по изобретению могут быть также генерированы при использовании хорошо известных методов. Специалисту будет понятно, что для генерирования антител по изобретению могут использоваться либо раковые полипептиды-маркеры полной длины, либо их фрагменты. Полипептид, необходимый для генерирования антитела по изобретению, может быть частично или полностью очищенным из естественного источника или же может быть получен с помощью техники рекомбинантной ДНК. Например, кДНК, кодирующая сурвивиновый полипептид или его фрагмент, может быть экспрессирована в прокариотические клетки (например, бактерии) или эукариотические клетки (например, клетки дрожжей, насекомых или млекопитающих), после чего рекомбинантный белок может быть очищен и использован для получения препарата из моноклонального или поликлонального антитела, которое специфически связывается с раковым полипептидом-маркером, использованным для получения антитела. Комплекс-специфические антитела всегда будут получать, как описано выше.

Специалисту данной области будет известно, что получение двух или более различных панелей моноклональных или поликлональных антител увеличивает вероятность получения антитела со специфичностью и аффинностью, необходимыми для предназначенного для него использования (например, ЕБ18А, иммуногистохимия, визуализация ш у1уо, терапия на основе иммунотоксина). Антитела протестированы на желаемую для них активность с помощью известных методов в соответствии с целью использования антител (например, ЕБ18А, иммуногистохимия, иммунотерапия и т.д.; для получения дальнейшей информации по генерированию и испытанию антител см., например, Наг1оте апб Ьапе, АпбЬоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ., 1988). Например, антитела могут быть протестированы с помощью анализов ЕЫ8А. метода иммунного блотинга (\Уек1егп-Ыо1), иммуногистохимического окрашивания законсервированных формальдегидом раковых образцов или замороженных тканевых срезов. После их первоначальной характеристики 1п уйго антитела, предназначаемые для терапевтического или диагностического использования 1п у1уо тестируются в соответствии с известными клиническими методами анализа.

Термин моноклональное антитело, используемый здесь, обозначает антитело, полученное из, по существу, гомогенной популяции антител, т.е. отдельные антитела внутри популяции идентичны за исключением возможных естественных мутаций, которые могут быть представлены в небольших количествах. Моноклональные антитела здесь специфически включают химерные антитела, в которых участок тяжелой и/или легкой цепи идентичен или гомологичен с соответствующими последовательностями антител, образованных из конкретных видов или относящихся к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная(ые) цепь(и) идентична с или гомологична с соответствующими последовательностями антител, образованных из других видов или относящихся к другому классу или подклассу антител, в равной степени, как и фрагменты таких антител, пока они проявляют желаемую антагонистическую активность (патент США № 4816567).

Моноклональные антитела по изобретению могут быть приготовлены при использовании гибридомного метода. В рамках гибридомного метода мышь или другое подходящее животное-хозяин обычно иммунизируется иммунизирующим веществом, чтобы инициировать лимфоциты, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, которые будут специфически связываться с иммунизирующим веществом. Альтернативно лимфоциты могут быть иммунизированы 1п уйго.

Моноклональные антитела могут быть также получены с помощью методов с рекомбинантной ДНК, таких как описываемые в патенте США № 4816567. ДНК, кодирующая моноклональные антитела по изобретению, может быть без труда изолирована и разделена на последовательности с помощью стандартной методики (например, при использовании олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител).

1п уйго-методы также подходят для приготовления моновалентных антител. Расщепление антител для получения их фрагментов, в особенности ЕаЬ-фрагментов, может быть произведено при использовании стандартных техник, известных из уровня техники. К примеру, расщепление может производиться при использовании папаина. Примеры расщепления под воздействием папаина описываются в заявке

- 18 019603 νϋ 94/29348, опубликованной 22 декабря 1994 г., и в патенте США № 4342566. Расщепление антител под воздействием папаина обычно приводит к двум идентичным фрагментам, связывающимся с антигеном, называемым РаЬ-фрагментами, каждый из которых имеет отдельный антиген-связывающий сайт и остаточный Ре-фрагмент. В результате воздействия пепсином получается фрагмент, который имеет два антиген-комбинирующих сайта и все еще способен к кросс-линкингу антигена.

Фрагменты антитела, как связанные с другими последовательностями, так и не связанные, могут также включать вставки, делеции, замещения или другие избранные модификации конкретных участков или специфических аминокислотных остатков при условии, что активность фрагмента незначительно изменена или повреждена по сравнению с немодифицированным антителом или фрагментом антитела. Данные модификации могут обеспечивать некоторые дополнительные свойства, такие как добавление/удаление аминокислот, способных к дисульфидному связыванию, увеличение их биостойкости, изменение их секреторных характеристик и т.д. В любом случае фрагмент антитела должен обладать свойством биоактивности, таким как активностью связывания, регуляцией связывания на связывающем домене и т.д. Функциональные или активные участки антитела могут быть идентифицированы при мутагенезе специфического участка белка с последующей экспрессией и контролем экспрессированного полипептида. Такие методы полностью очевидны для опытного специалиста данной области техники и могут включать сайт-специфический мутагенез нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент антитела.

Антитела по изобретению могут в дальнейшем включать гуманизированные антитела или человеческие антитела. Гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител - это химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Ρν, РаЬ, РаЬ' или другие антиген-связывающие субпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела включают человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из определяющего комплементарного участка (СОК) реципиента замещены остатками из СОК нечеловеческих видов (донорское антитело), таких как мыши, крысы или кролики, имеющими желаемую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях остатки Ρν-каркаса (РК) человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими нечеловеческими остатками. Гуманизированные антитела могут также включать остатки, которые не встречаются ни в антителе-реципиенте, ни в импортированном СОК или каркасных последовательностях. В целом, гуманизированное антитело будет включать, по существу, все из по крайней мере одного и типично двух вариабельных доменов, в которых все или, по существу, все участки СОК соответствуют таковым из нечеловеческого иммуноглобулина, и все или, по существу, все из участков РК являются таковыми консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело оптимально также будет содержать по крайней мере один сегмент константного участка иммуноглобулина (Рс), типично - человеческого иммуноглобулина.

Методы гуманизации нечеловеческих антител хорошо известны из уровня техники. В целом, гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотный остаток, введенный в него из источника, являющегося нечеловеческим. Такие нечеловеческие аминокислотные остатки называются часто импортированными остатками, которые обычно берутся из импортированного вариабельного домена. Гуманизация может быть произведена в обязательном порядке посредством замены участков СОК или последовательностей СОК грызунов на соответствующие последовательности человеческого антитела. Соответственно, такие гуманизированные антитела являются химерными антителами (патент США № 4816567), где в обязательном порядке менее чем один интактный человеческий вариабельный домен был заменен соответствующей последовательностью нечеловеческого вида. На практике гуманизированные антитела являются типично человеческими антителами, в которых некоторые остатки СОК и, возможно, остатки РК заменены на остатки аналогичных сайтов антител грызунов.

Использоваться могут трансгенные животные (например, мыши), которые способны при иммунизации вырабатывать полный спектр человеческих антител при отсутствии выработки эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена участка присоединения тяжелой цепи антитела у химерных и мутантных мышей зародышевой линии приводит к полному ингибированию выработки эндогенных антител. Перенос генной матрицы иммуноглобулина человеческой зародышевой линии в таких мутантных мышей зародышевой линии будет приводить к выработке человеческих антител с антигенной стимуляцией. Человеческие антитела могут также быть получены в библиотеке фагового отображения, как это, например, описывается выше для комплекс-специфических антител.

Антитела по изобретению предпочтительно вводятся в субъект в фармацевтически приемлемом носителе. Подходящее количество фармацевтически приемлемой соли типично используется в составе для усиления изотонности состава. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают раствор натрия хлорида, раствор Рингера и раствор декстрозы. Уровень рН раствора составляет предпочтительно от около 5 до около 8 и более предпочтительно от около 7 до около 7,5. Кроме того, носители включают препараты продолжительного высвобождения, такие как полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, матрицы которых имеют вид профилированных изделий, к примеру пленки, липосомы или микрочастицы. Для специалиста данной области будет очевидно, что определенные носители могут быть более предпочтительными в зависимости, например, от способа введения

- 19 019603 и концентрации вводимого антитела.

Антитела могут вводиться в субъект, в пациента или клетку посредством инъекции (например, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно) или другими способами, такими как вливание, которое гарантирует доставку к кровотоку эффективным образом. Антитела могут также вводиться внутритуморальными или перитуморальными способами, чтобы вызвать локальные, а также и системные терапевтические эффекты. Предпочтительными являются локальная или внутривенная инъекция.

Эффективная дозировка и график введения антител могут быть определены эмпирически, а принятие таковых решений под силу специалисту данной области. Специалистам данной области будет понятно, что дозировка антител, которые должны быть введены, будет варьироваться в зависимости, например, от субъекта, которому будет вводиться антитело, способа введения, конкретного типа используемого антитела и других вводимых медикаментов. АпИЬоб1е8 ίη Нитап Όίαβηοδίδ апб Тйегару, НаЬег е! а1., еб§. Кауеп Рге§8, Νο\ν Уогк (1977) стр. 365-389. Типичная дневная дозировка антитела, используемого отдельно, может варьироваться от около 1 мкг/кг вплоть до 100 мг/кг по весу тела или более в день в зависимости от факторов, упоминаемых выше. Последующее введение антитела для лечения рака, эффективность терапевтического антитела могут быть оценены различными способами, известными компетентному специалисту. Например, размер, количество и/или распределение рака у субъекта, проходящего лечение, может контролироваться с помощью стандартных методов визуализации опухоли. Введенное в терапевтических целях антитело, которое блокирует рост опухоли, приводит к уменьшению размера и/или предотвращает развитие новых опухолей в сравнении с течением болезни, которое бы имело место без введения антитела, и является эффективным антителом для лечения раковых заболеваний.

Антитела могут также использоваться для диагностических анализов ш νίνο. В целом, антитело помечают радионуклеотидом (таким как ^ш1п, ⁹⁹Тс, ¹⁴С, ¹³¹Ι, ³Н, ³²Р или ³⁵§), так что опухоль может быть локализована с помощью иммуносцинтиграфии. В одном воплощении антитела или их фрагменты связываются с внеклеточными доменами двух или более раковых мишеней при показателе аффинности (Кб) ниже чем 1x10 мкМ.

Антитела для диагностического применения могут помечаться зондами, подходящими для обнаружения различными способами визуализации. Способы обнаружения зондов включают, но не ограничиваются, флуоресценцию, свет, конфокальную и электронную микроскопию; магнитно-резонансную визуализацию и спректроскопию; флюороскопию, компьютерную томографию и позитронно-эмиссионную томографию. Подходящие зонды включают, но не ограничиваются, флуоресцеин, родамин, эозин и другие флюорофоры, радиоизотопы, золото, гадолиний и другие лантаноиды, парамагнитное железо, фтор18 и другие позитронно-активные радионуклиды. Кроме того, зонды могут быть би- или мультифункциональными и обнаруживаться более чем одним из приведенных способов. Данные антитела могут быть помечены напрямую или опосредованно указанными зондами. Присоединение зондов к антителам включает ковалентное присоединение зонда, внедрение зонда в антитело и ковалентное присоединение комплексообразующего соединения для присоединения зонда, широко признанное среди прочих в данной области. Для иммуногистохимических исследований проба пораженной ткани может быть свежей, или замороженной, или может быть заделанной в парафин и законсервирована таким консервантом, как формалин. Законсервированный или заделанный срез содержит пробу, контактировавшую с помеченным первичным антителом и вторичным антителом, где антитело используется для обнаружения экспрессии белка ^ΑΝ ш δίΐιι.

Настоящее изобретение обеспечивает, таким образом, пептид, включающий последовательность, которая выбирается из группы с 8ЕО ΙΌ NО: 1 по 8ЕО ΙΌ NО: 3 или их вариант, который по крайней мере на 85%, предпочтительно на 95% гомологичен с 8ЕО ΙΌ NО: 1 по 8ЕО ΙΌ NО: 3 или их вариант, который будет индуцировать Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом.

В предпочтительном воплощении для лечения почечно-клеточной карциномы пептид с 8ЕО ΙΌ NО: 1, и/или 8ЕО ΙΌ NО: 2, и/или 8ЕО ΙΌ NО: 3 применяется в комбинации по крайней мере с двумя пептидами с 8ЕС) ΙΌ ΝΌ: 4 по 8ЕО ΙΌ 13 и 8ЕО ΙΌ 24. Пептид с 8ЕО ΙΌ 1 по 8ЕО ΙΌ 3 может поэтому вводиться отдельно или вместе с другими пептидами в одном составе.

- 20 019603

Внутреннее обозначение послед-ти	Антиген	Последовательность	Ν* послед-ти
ΙΜΑ-ΜΜΡ-001	Матричная металлопротеиназа 7	ЗОСМКСЮКЬУСККЗ	4
ΙΜΑ-ΑΕΕ-002	Адипофилин		5
ΙΜΑ-Α0Ε-001	Адипофилин	ΞνΑΞΤΙΤΘν	6
ΙΜΑ-ΑΡΟ-001	Аполипопротеин Ы	ΑΣΑϋΰνΟΚν	7
1МА-ССЫ-001	Циклин 01	ЬЬСАТСМГУ	8
1МА-сис-оо1	сисУ1АЗ	ΞνΓΑ^νναν	9
ΙΜΑ-Κ67-001	ΚΙΑΑ0367	АЬЕОООРНЬ	10
ΙΜΑ-ΜΕΤ-001	протоонкоген	γνορνιτετ	11
1НА-мис-001	мис1	ΒΤΑΡΡνΗΝν	12
1МА-КСЗ-001	КСЗ-5	ЪААЬРНЗСЬ	13
1МА-НВУ-001	ΗΒν	ΓΑΡ50ΓΓΡ5ν	14
ΙΜΑ-ΝζΑΝ-ΟΟΙ	Нейрокан	7ЬСЗРРРАУ	24

Подробное описание пептидов и антигенов, представленных выше, раскрыто в заявке №0 2007/028573.

В предпочтительном воплощении для лечения рака толстого кишечника пептид с 8ЕЦ ГО N0: 1 по 8Е0 ГО N0: 3 применяется в комбинации по крайней мере с двумя пептидами с 8ЕЦ ГО N0: 15 по 24, 4, 8, 11 или 12. Пептид с 8ЕЦ ГО N0: 1 по 8ЕЦ ГО N0: 3 может поэтому вводиться отдельно или вместе с другими пептидами в одном составе.

Ν* послед -ти	Ιϋ пептида	Последовательность	Символ гена	Функция	Связывается с МНС
15	С20-001	АЬЗИЬЕУГЬ	С20ог£42	задействован в присоединении актинового цитоскелета к ЕСМ	НЬА-А*02
16	ΝΟΧ-ΟΟΙ	ΙΙ,ΑΡνίΙ,ΥΙ	N0X1	ΝΑϋΡΗ-оксидаза	НЬА-А*02
17	ОЦС-001	ΙΤϋΏΚΙΝΕν	0ЦС1	Орнитиндекарбоксилаза	НЬА-А*02
18	РСИ-001	КЬМОЬОУЕОЬ	РСМД	вспомогательный белок ДНК-полимеразы дельта	НЬА-А*02
19	ТСЕВ1- 001	АЬГУКЪЪАЬА	ТСРВ1	трансформирующий фактор роста, бетаиндуцированный	НЬА-А*02
20	ТОР-001	КГГЦЕШУНА	ТОР2А/ТОР2 В	топоизомераза	НЪА-А*02

21	Τ6ΡΒΙ- 004	тррюанткыьышн	ТСЕВ1	тра нсформирующий фактор роста, бетаиндуцированный	НЬА-РК
22	СЕА-006	3ΡΟΥ3ΗΗΙΝΟΙΡΟΟΗΤ	СЕАСАМ5	Карциномоэмбриональн ый антиген	НЬА-ЕК
8	ССМ-001	ЪЪСАТСМЕУ	ССИ01	Циклин ϋΐ	НЬА-А*02
12	мис-001	5ΤΑ₽ΡνΗΝν	мис1	Муцин 1	НЬА-А*02
4	МНР-001	зоцо1ке1скъусккз	ΜΜΡ7	Металлопротеиназа 7	НЬА-ОК
23	СЕА-004	УЬЗСАИЬНЬ	СЕАСАМ5	Вариант пептида СЕА	НЬА-А*02
11	МЕТ-001	ΥνϋΡνΐΤ5Ι	МЕТ	Протоонкоген Меб	НЪА-А*02

Подробное описание пептидов и антигенов, представленных выше, раскрыто в заявках ЕР 07014796.2 и И8 60/953161.

Пептиды изобретения обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I или II.

В настоящем изобретении термин гомологичный относится к степени идентичности между последовательностями двух аминокислотных последовательностей, т.е. пептидных или полипептидных

- 21 019603 последовательностей. Упомянутая ранее гомология определяется при сравнении двух последовательностей, сопоставляемых в оптимальных условиях со сравниваемыми последовательностями. Сравниваемые последовательности могут иметь дополнение или делецию (например, разрыв и т.п.) в оптимальном противопоставлении двух последовательностей. Такая гомология последовательности может быть подсчитана с помощью создания противопоставления, например, по алгоритму С1ийа^ (Ыис1е1с Лаб Век., 22(22): 4673 4680 (1994). Широкораспространенное программное обеспечение для анализа последовательностей, в частности Уесйг ΝΤΙ, ΟΕΝΕΤΥΧ, или аналитические инструменты, предоставляемые общественными банками данных.

Специалист данной области будет в состоянии оценить, будут ли Т-клетки, индуцированные вариантом специфического пептида, способны к перекрестной реакции с самим пептидом (Εοη§ еί а1., 2001); (2агетЬа еί а1., 1997; Сο1οтЬеίί^ еί а1., 2006; Аррау еί а1., 2006).

Вариантом данной аминокислотной последовательности изобретатели обозначают, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью) так, что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬА, по существу, таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности с 8ΕΟ ГО ΝΟ: 1 по 24. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться со связывающей бороздкой подходящей молекулы МНС, такой как НЬА-А*02 или -ЭВ, и, таким образом, он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность связываться с ТКР активированных ЦТЛ. Данные ЦТЛ могут впоследствии вступать в перекрестную реакцию с клетками и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, который содержит естественную аминокислотную последовательность родственного пептида, как определено в аспектах этого изобретения. По информации из научной литературы (Ватшемкее еί а1., 1997) и банков данных (Ваттеикее еί а1., 1999) конкретные позиции связывающихся с НЬА пептидов являются типичными якорными остатками, формирующими центральную последовательность, подходящую к соединительному элементу рецептора НЬА, который определяется полярными, электрофизическими, гидрофобными и пространственными свойствами полипептидных цепей, образующих связывающую бороздку. Так, специалист данной области будет в состоянии модифицировать аминокислотные последовательности, предложенные в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1 по 24, сохраняя известные якорные остатки, и будет способен определить, сохранят ли варианты способность связываться с молекулами МНС класса I или II. Варианты настоящего изобретения сохраняют способность связываться с ТКР активированных ЦТЛ, которые могут впоследствии вступать в перекрестную реакцию с и уничтожать клетки, экспрессирующие полипептид, который содержит естественную аминокислотную последовательность родственного пептида, как определено в аспектах этого изобретения.

Те аминокислотные остатки, которые не обязательно вносят вклад во взаимодействие с Тклеточным рецептором, могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, чье включение, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с релевантным МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого изобретатели включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности, или их участок, или их вариант, как дано.

Таблица 5

Варианты и участок пептида в соответствии с 8Ε0 ГО ΝΟ: 24

В дальнейшем известно, что пептиды, презентированные МНС класса II, образованы коровой по

- 22 019603 следовательностью, имеющей аминокислотную последовательность, подходящую к конкретному НЬАаллель-специфическому фрагменту и, факультативно, Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты, которые не препятствуют функции коровой последовательности (т.е. считаются нерелевантными для взаимодействия пептида и всех или подклассов клонов Т-клетки, распознающих естественную копию). Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты могут иметь длину, например, от 1 до 10 аминокислот соответственно. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для погрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт процессинга более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но, в основном, они могут иметь молекулярный вес меньше чем 100000, предпочтительно меньше чем 50000, более предпочтительно меньше чем 10000 и типично около 5000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков и наиболее предпочтительно между 30 и 8 остатками. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также пептиды и их варианты, в которых указанный пептид или вариант имеет общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и наиболее предпочтительно между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.

Для пептидов, рестриктированных по МНС II класса, в молекуле МНС могут быть представлены несколько различных пептидов с одинаковой центральной (коровой) последовательностью. Так как взаимодействие с распознающей Т-(хелперной) клеткой определяется центральной последовательностью из 9 до 11 аминокислот, то одним и тем же клоном Т-(хелперной) клетки могут распознаваться несколько вариантов по длине. Таким образом, несколько различных вариантов по длине центральной связывающейся последовательности могут быть использованы для непосредственной погрузки на молекулы МНС II класса без нужды в дальнейшем процессинге и обработке на Ν- или С-терминальных концах. В соответствии с этим, встречающиеся в природе или искусственные варианты, которые индуцируют Тклеточную перекрестную реакцию с пептидом по изобретению, часто являются вариантами по длине.

Если пептид, который длиннее, чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС II класса, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному НЬА-связывающему участку, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС II класса или презентировать пептид Т(хелперной) клетке. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть использованы более крупные пептиды, например, если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антигенпрезентирующими клетками. Однако в одинаковых случаях было показано, что примыкающие участки центральной последовательности могут оказывать влияние на связывание пептида с молекулой МНС II класса или взаимодействие димерного комплекса МНС-пептид с ТКР в обоих направлениях по сравнению с контрольным пептидом с такой же центральной последовательностью. Внутримолекулярные третичные структуры внутри пептида (к примеру, петлеобразное образование) обычно снижают аффинности к МНС или ТКР. Внутримолекулярные взаимодействия примыкающих участков с частями МНС или ТКР вне связывающих бороздок пептида могут стабилизировать взаимодействие. Такие изменения в аффинности могут иметь исключительное влияние на потенциал пептида МНС класса II по вызыванию ответов Т(хелперных) клеток.

Также возможно, чтобы эпитопы МНС I класса, хотя они обычно имеют длину между 8-10 аминокислотами, генерировались при процессинге пептидов из более длинных пептидов или белков, включающих истинный эпитоп. Предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к истинному эпитопу, по существу, не влияли на протеолитическое расщепление, необходимое для выявления истинного эпитопа во время процессинга.

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также пептиды и варианты эпитопов МНС класса I, в которых указанный пептид или вариант имеет общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и наиболее предпочтительно между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 аминокислот.

Разумеется, пептид или вариант в соответствии с настоящим изобретением будет обладать способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса. Связывание пептида или варианта с комплексом МНС может быть проверено методами, известными из уровня техники, например, теми, что описываются в литературе для различных аллелей МНС II класса (к примеру, Уод! е! а1., 1994; Ма1сЬегек е! а1., 1994; Маша е! а1., 1999; Наттег е! а1., 1995; Тотркиъ е! а1., 1993; Воу!оп е! а1., 1998).

В особенно предпочтительном воплощении изобретения пептид состоит или преимущественно состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с 8ЕО Ш ΝΟ: 1 по 8ЕО Ш ΝΟ: 3.

Пептиды в соответствии с настоящим изобретением могут также состоять из непрерывного фрагмента аминокислот, как обозначено в 8ЕО Ш ΝΟ: 1 по 3, где указанный фрагмент является частью указанной последовательности, имеющей длину по крайней мере 8 аминокислот (к примеру, 8, 9, 10, 11, 12,

- 23 019603

13, 14, 15 или 16) при условии, что центральная последовательность присутствует в указанном пептиде, усиливая его функциональность в инициации иммунного ответа в соответствии с описываемым здесь.

Состоящий преимущественно из подразумевает, что пептид в соответствии с настоящим изобретением, помимо последовательности в соответствии с любой из 8ЕЭ ГО N0: 1 по 8ЕЭ ГО N0: 3 или одним из их вариантов, содержит дополнительные находящиеся на Ν- и/или С-конце фрагменты аминокислот, которые не являются обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как эпитоп для эпитопа молекул МНС.

Тем не менее, эти фрагменты могут быть важны для обеспечения эффективного введения пептида в соответствии с настоящим изобретением в клетки. В одном воплощении настоящего изобретения пептид является белком слияния, который включает, например, 80 Ν-терминальных аминокислот НЬЛ-ΌΚ антиген-ассоциированной инвариантной цепи (р33, в дальнейшем Н), как взятый из банка данных Νί'ΒΕ инвентарный номер - СепВапк Ассеккюп-питЬет Х00497 (81тиЬт, М. е1 а1., 1984).

Примеры для дальнейших предпочтительных пептидов включают пептиды, имеющие специфический подвид НЬА, и способны стимулировать клетки СЭ8, и где указанный пептид включает специфический якорный аминокислотный фрагмент, как приведено в последующей табл. 6.

Таблица 6

Подвиды НЬА и якорные фрагменты предпочтительных пептидов в соответствии с 8ЕЭ ГО Ν0: 24

бильности и/или связывания с молекулами МНС в целях получения более сильного иммунного ответа. Методы для такой оптимизации пептидной последовательности хорошо известны из уровня техники и включают, например, введение обратных пептидных или непептидных связей.

В пептидах с обратной связью аминокислотные остатки присоединены не пептидными связями (-С0-NН-), но пептидная связь является обратной. Такие ретро-обратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например такими, как описано в работе Ме/1еге и соавторов (1997) 1. Iттиηο1. 159-3237, включенной сюда путем ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, но не ориентацию боковых цепей. Ме/1еге и соавторы (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны для связывания с МНС и ответов Т-хелперных клеток. Ретро-обратные пептиды, которые содержат связи ΝΉ-00 вместо пептидных связей С0-NН, намного более устойчивы к протеолизу.

Непептидной связью, является, например, -СНг-ΝΉ, -СН₂§-, -СН₂СН₂-, -СН=СН-, -СОСН₂-, -СН(ОН)СН₂- и -СН₂§0-. Патент США № 4897445 обеспечивает метод твердофазного синтеза непептидных связей (-СН₂-NН) в полипептидных цепях, что включает полипептиды, синтезированные с использованием стандартной методики, и непептидную связь, синтезированную при реакции аминоальдегида и аминокислоты в присутствии NаСNВНз.

Пептиды, включающие последовательности, описанные выше, могут быть синтезированы с дополнительными химическими группами, находящимися на их аминном и/или карбоксильном концах, для увеличения стабильности, биологической доступности и/или аффинности пептидов. Например, гидрофобные группы, такие как карбобензоксильные, данзильные или трет-бутилоксикарбонильные группы, могут быть добавлены к аминным окончаниям пептидов. Подобным образом, ацетильная группа или 9фторенилметоксикарбонильная группа может быть введена в аминные окончания пептидов. Кроме того, гидрофобная группа, трет-бутилоксикарбонильная или амидная группа может быть добавлена к карбоксильным окончаниям пептидов.

Далее, все пептиды по изобретению могут быть синтезированы в целях изменения их пространственной конфигурации. Например, Ό-изомер одного или более аминокислотных остатков пептида может быть использован скорее, чем обычный Ь-изомер. Более того, по крайней мере один из аминокислотных остатков пептидов по изобретению может быть замещен одним из хорошо известных не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Изменения, такие как данные, могут служить для повышения стабильности, биологической доступности и/или связывающих свойств пептидов по изобретению.

Подобным образом, пептид или вариант по изобретению может быть модифицирован химическим способом посредством реакции специфических аминокислот как до, так и после синтеза пептида. Примеры таких модификаций хорошо известны из уровня техники и обобщаются, например, в работе Я. ЬипбЫаб, С1ет1са1 Веадепй £от РгоШп МобШсайоп, 3гб еб. СЯС Ргекк, 2005, которая включена сюда путем ссылки. Химическая модификация аминокислот включает, но не ограничивается, модификацию с

- 24 019603 помощью ацилирования, амидирования, пиридоксилирования лизина, восстановительного алкилирования, тринитробензилирования аминных групп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (ТИВ8), амидную модификацию карбоксильных групп и сульфгидрильную модификацию с помощью окисления надмуравьиной кислотой цистеина до цистеиновой кислоты, образование ртутных производных, образование смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями, реакцию с малеимидом, карбоксиметилирование йодоуксусной кислотой или йодацетамидом и карбамоилирование цианатом при щелочном уровне рН, хотя не ограничиваясь ими. В этой связи специалист данной области может проконсультироваться с главой 15 раздела СиггеШ Рто1осо1к в журнале Рго1ет §с1епсе, Ебк. СоНдап е1 а1. (1оЬп ХУПеу & 8опк NΥ 1995-2000) для получения более обширной информации о методах, связанных с химической модификацией белков.

Вкратце, модификация, например, остатков аргинила в белках часто основана на реакции вицинальных дикарбонильных соединений, таких как фенилглиоксаль, 2,3-бутандион и 1,2-циклогександион для формирования аддукта. Другим примером является реакция метилглиоксаля с остатками аргинина. Цистеин может быть модифицирован без сопутствующей модификации других нуклеофильных сайтов, таких как лизин и гистидин. В результате для модификации цистеина доступно большое число реагентов. Веб-сайты компаний, таких как 8щта-А1бпс1Г (1Шр://\\л\л\\81дта-а1бпс11.сот). предоставляют информацию по специфическим веществам.

Также распространена селективная редукция дисульфидных связей в белках. Дисульфидные связи могут быть образованы и оксидированы во время тепловой обработки биофармацевтических средств.

К-реагент Вудворда может использоваться для модификации специфических остатков глютаминовой кислоты. №(3-(диметиламинопропил)-Н'-этилкарбодиимид может использоваться для формирования внутримолекулярных поперечных связей между остатком лизина и остатком глютаминовой кислоты.

Например, диэтилпирокарбонат является реагентом для модификации остатков гистидила в белках. Гистидин может также быть модифицирован при использовании 4-гидрокси-2-ноненала.

Реакция остатков лизина и других α-аминных групп полезна, например, при связывании пептидов с поверхностями или перекрестном связывании (кросс-линкинг) белков/пептидов. Лизин является сайтом присоединения поли(этилен)гликоля и основным сайтом модификации при гликировании белков. Остатки метионина в белках могут быть модифицированы с помощью, например, йодацетамида, бромэтиламина и хлорамина Т. Тетранитрометан и №ацетилимидазол могут быть использованы для модификации остатков тирозила. Кросс-линкинг через образование дитирозина может быть произведен с ионами перекиси водорода/меди.

В последних исследованиях по модификации триптофана используются №бромсукцинимид, 2гидрокси-5-нитробензилбромид или 3-бром-3-метил-2-(2-нитрофенилмеркапто)-3Н-индол (ВРХ8скатол).

Успешная модификация терапевтических белков и пептидов с РЕС-полиэтиленгликолем часто ассоциируется с увеличением циркуляторного полураспада, в то время как кросс-линкинг белков с глутаральдегидом, полиэтиленгликоль-диакрилатом и формальдегидом используется для приготовления гидрогелей. Химическая модификация аллергенов для иммунотерапии часто достигается при карбамоилировании цианатом калия.

Пептид или вариант, в котором пептид модифицирован или включает непептидные связи, является предпочтительным воплощением изобретения. В целом, пептиды и варианты (по крайней мере, те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы Етосполиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Ьи и соавторов (1981), и в прилагающихся ссылках. Временная защита ^аминогруппы предусмотрена группой 9флуоренилметилоксикарбонил (Етос). Повторное расщепление этой высоко щелоче-лабильной защитной группы осуществляется при использовании 20% пиперидина в ^№диметилформамиде. Функциональности боковой цепи могут быть защищены как их бутиловые эфиры (в случае серинтреонина и тирозина), бутиловые сложные эфиры (в случае глютаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), бутилоксикарбониловое производное (в случае лизина и гистидина), тритиловое производное (в случае цистеина) и производное 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (в случае аргинина). Где глютамин или аспарагин являются С-терминальными остатками, для защиты боковой цепи амидо-функциональностей используется 4,4'-диметоксибензгидрильная группа. Твердофазный носитель основан на полимере полидиметилакриламида, состоящем из трех мономеров: диметилакриламида (остов-мономер), бисакрилоилэтилендиамина (кросс-линкер) и метилового эфира акрилоилсаркозина (функционализирующий агент). Использованным агентом с расщепляемым соединением пептид-смола является кислотнолабильное производное 4-гидроксиметилфеноксиуксусной кислоты. Все аминокислотные производные добавляются как их преформированные симметричные ангидридные производные за исключением аспарагина и глютамина, которые добавляются с применением метода обратного соединения, опосредованного ^№дициклогексилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазолом. Все реакции сочетания и снятия защитных групп отслеживались с помощью нингидрина, тринитробензолсульфоновой кислоты или технологии контроля изотином. После завершения синтеза пептиды отщепляются от смолы-носителя сопутствующим удалением защитных групп боковой цепи при обработке 95% трифторуксусной кислотой, со- 25 019603 держащей 50% поглотителя примесей. Обычно используемые поглотители включают этандитиол, фенол, анизол и воду, окончательный выбор зависит от составляющих аминокислот синтезированного пептида. Также возможна комбинация твердофазных и жидкофазных методов для синтеза пептидов (см., например, ВгискбогГег с1 а1. 2004 и прилагающиеся ссылки).

Трифторуксусная кислота удаляется выпариванием в вакууме с последующим измельчением с диэтиловым эфиром для получения сырого пептида. Любые представленные поглотители удаляются простой технологией экстракции, которая при лиофилизации водной фазы позволяет получить сырой пептид без поглотителей. Реагенты для синтеза пептидов, как правило, имеются в наличии, например, в Са1Ыос11ст-№уаЬюе11ст (Великобритания) Ыб, Ыойтдйат N07 201. Великобритания.

Очистка может быть произведена любой техникой или комбинацией таких техник как рекристаллизация, эксклюзивная (по размеру) хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обратнофазная высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием, к примеру, градиентного разделения ацетонитрил/вода.

Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, электрофореза, в частности капиллярного электрофореза, твердофазной экстракции (ТФЭ), обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке атомами (ЕАВ), а также массспектрометрический анализ МАЙО! и Е53-0-ТОЕ.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид), кодирующую пептид или вариант пептида по изобретению. Полинуклеотид может быть, например, ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК или их комбинациями, как одно-, так и/или двухнитевыми; натуральными или стабилизированными формами полинуклеотидов, таких как, например, полинуклеотиды с фосфоротиоатным остовом, и может или не может содержать интроны в период времени кодирования для пептида. Разумеется, только пептиды, которые содержат встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные встречающимися в природе пептидными связями, могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением.

Был разработан ряд методов для связывания полинуклеотидов, в особенности ДНК, с векторами, например, с помощью дополнительных липких концов. К примеру, в сегмент ДНК могут быть добавлены дополнительные гомополимерные участки для внесения в вектор ДНК. Вектор и сегмент ДНК в таком случае соединены водородной связью между дополнительными гомополимерными концевыми участками, образуя рекомбинантные молекулы ДНК.

Синтетические сшивающие агенты, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, обеспечивают альтернативный способ присоединения сегмента ДНК к векторам. Синтетические сшивающие агенты, содержащие ряд сайтов рестрикционной эндонуклеазы, имеются в продаже в различных источниках, включая ЕНетаЦогиб Вю1сс1то1ощс8 Ше., Не\г Нагеи СН США.

Желаемый способ модификации ДНК, кодирующей полипептид по изобретению, - это использование цепной реакции полимеразы, как раскрыто в работе (8а1к1 е1 а1. (1988)). Этот метод может быть использован для введения ДНК в подходящий вектор, например при инженерии в подходящих сайтах рестрикции, или же он может быть использован для модификации ДНК другими пригодными путями, известными из уровня техники. Если используются векторы, то предпочтительными являются оспенные или аденовирусные векторы.

Затем ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) может экспрессироваться в подходящего хозяина для получения полипептида, включающего пептид или вариант по изобретению. Таким образом, ДНК, кодирующая пептид или вариант по изобретению, может быть использована в соответствии с известными техниками, модифицированная соответствующим образом с учетом приведенных здесь идей, для создания вектора экспрессии, который затем используется для трансформации подходящей клеткихозяина для экспрессии и получения полипептида по изобретению. Такие техники включают те, что раскрыты в патентах США №№ 4440859, 4530901, 4582800, 4677063, 4678751, 4704362, 4710463, 4757006, 4766075 и 4810648.

ДНК (или в случае ретровирусных векторов - РНК), кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть присоединена к обширному ряду других последовательностей ДНК для введения в адекватного хозяина. ДНК-спутник будет зависеть от природы хозяина, способа введения ДНК хозяину и от того, желательно ли эписомальное поддержание или интеграция.

Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными последовательностями, распознающимися желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами. Как правило, не все хозяева трансформируются вектором. Поэтому будет необходимо выбрать трансформированные клетки-хозяева. Одна из техник отбора включает введение в вектор экспрессии последовательности ДНК с любыми необходимыми элементами контроля, кодирующей выбранный признак в трансформированной клетке, та

- 26 019603 кой как невосприимчивость к антибиотикам.

Альтернативно ген для такого выбираемого признака может быть на другом векторе, который используется для котрансформации желаемой клетки-хозяина. Клетки-хозяева, которые были трансформированы рекомбинантной ДНК по изобретению, культивируются затем в течение достаточного времени и при адекватных условиях, известных специалистам данной области, с учетом раскрытых здесь идей, что ведет к экспрессии полипептида, который после этого может быть получен.

Известно множество систем экспрессии, включающих бактерии (например, Е. сой и ВасШик киЫШк), дрожжи (например, 8ассйатотусек сегеуыае). мицелиальные грибы (например, АкрегдШик крес.), растительные клетки, клетки животных и насекомых. Предпочтительно, чтобы система была клетками млекопитающих, такими как клетки СНО, имеющимися в наличии в АТСС Се11 Вю1оду Со11ес11оп.

Типичная клеточная векторная плазмида млекопитающих для конститутивной экспрессии включает промотор СМУ или 8У40 с подходящим концевым участком поли А и маркером устойчивости, таким как неомицин. Одним примером является р8УЪ, имеющимся в наличии в Рйагтас1а, Р1кса1атау, N1, США. Примером индуцируемого вектора экспрессии млекопитающих является рМ8С, имеющийся также в наличии в Рйаттааа. Пригодными плазмидными векторами дрожжей являются рЯ8403-406 и рЯ8413416, и они, как правило, имеются в наличии в 81га1адепе С1ошпд 8ук1етк, Ьа 1о11а, СА 92037, США. Плазмиды рЯ8403, рЯ8404, рЯ8405 и рЯ8406 являются дрожжевыми интегрирующими плазмидами (У1рк) и включают дрожжевые селектируемые маркеры Н183, ТЯР1, ЬЕИ2 и иЯА3. Плазмиды рЯ8413416 являются дрожжевыми центромерными плазмидами (Усрк). Основанные на промоторе векторы СМУ (например, из 8|§та-А1бпс11) обеспечивают кратковременную или устойчивую экспрессию, цитоплазмическую экспрессию или секрецию и Ν-терминальную или С-терминальную маркировку в различных комбинациях ЕЬАС, 3хЕЬАС, с-тус или МАТ. Данные белки слияния позволяют детекцию, очистку и анализ рекомбинантного белка. Слияния с двойной меткой обеспечивают гибкость при детекции.

Сильный промоторный регуляторный участок цитомегаловируса человека (СМУ) возбуждает конститутивные уровни белковой экспрессии, достигающие 1 мг/л в клетках СО8. Для менее активных клеточных линий белковые уровни типично составляют ~0,1 мг/л. Присутствие точки начала репликации 8У40 будет приводить к высоким уровням репликации ДНК в терпящих репликацию 8У40 клетках СО8. Векторы СМУ, например, могут содержать точку начала для репликации рМВ1 (производное рВЯ322) в бактериальных клетках, ген Ь-лактамазы для отбора устойчивости к ампициллину у бактерий, йСН ро1уА и точку начала Г1. Векторы, содержащие лидерную последовательность пре-про-трипсина (РРТ), могут направлять секрецию белков слияния ЕЬАС в культуральную среду для очистки с использованием антител ЛNТI-Е^ЛС, смол и планшетов. Другие векторы и системы экспрессии для применения с различными клетками-хозяевами хорошо известны из уровня техники.

Настоящее изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной с помощью полинуклеотидной векторной модели настоящего изобретения. Клетка-хозяин может быть как прокариотической, так и эукариотической. Бактериальные клетки могут быть, предпочтительно, прокариотическими клетками-хозяевами при некоторых условиях и типично являются штаммом Е. сой, таким как, например, Е. сой штамма ИН5, имеющимся в наличии в Ве!йекба Кекеагсй ЬаЬога1ог1ек 1пс., Ве!йекба, МИ, США, и ЯЯ1, имеющимся в наличии в Американской коллекции типов культур (Атепсап Туре Си11иге Со11ес11оп (АТСС)), ВоскуШе, МИ, США (№ АТСС 31343). Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, таких как мышь, крыса, обезьяна или человеческие фибробластные клетки и клеточные линии толстого кишечника. Дрожжевые клетки-хозяева включают УРН499, УРН500 и УРН501, которые, как правило, имеются в наличии в 81га1адепе С1ошпд 8ук1етк, Ьа 1о11а, СА 92037, США. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), имеющиеся в наличии в АТСС как ССБ61, ΝΙ4 эмбриональные клетки швейцарской мыши МН/3Т3, имеющиеся в наличии в АТСС как СЯЕ 1658, почечные клетки обезьяны СО8-1, имеющиеся в наличии в АТСС как СЯБ 1650 и клетки 293, являющиеся эмбриональными клетками печени человека. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки 8Г9, которые могут трансфецироваться с помощью бакуловирусных векторов экспрессии. Обзор в отношении выбора подходящих клеток-хозяев для экспрессии представлен, например, в пособии авторов Раийпа Ва1Ьак и Атдейа Ьотепсе Ме1йобк ш Мо1еси1аг Вю1оду ЯесотЫпап! Оепе Ехргеккюп, Яеу|е\\'к апб Рго1осо1к, ч. 1, 2 изд., I8ВN 978-1-58829-262-9, и другой литературе, известной специалисту данной области.

Трансформация адекватных клеток-хозяев с помощью модели ДНК настоящего изобретения совершается при помощи хорошо известных способов, которые обычно зависят от типа используемого вектора. Относительно трансформации прокариотических клеток-хозяев см., например, Сойеп и соавторы (1972) Ргос. Νη11. Асаб. 8ск И8А 69, 2110 и 8атЬтоок и соавторы (1989) Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬота1огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮгу, Со1б 8рттд НагЬог, Нью-Йорк. Трансформация дрожжевых клеток описывается у 8йеттап и соавторов (1986) Ме!йобк 1п Уеак1 Сепейск, А ЬаЬота1огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог, Нью-Йорк. Также подходит метод Бигса (Веддк) (1978) №11иге 275,104-109. Что касается клеток позвоночных, то подходящие для трансфекции таких клеток реагенты, например фосфат кальция и ИЕАЕ-декстран или липосомальные составы, имеются в наличии в 81га1адепе С1ошпд 8ук1етк или Ь1Ге

- 27 019603

Тес11по1още5 Ιικα СаййегкЬигд, ΜΌ 20877, США. Электропорация также подходит для трансформации и/или трансфекции клеток и хорошо известна из уровня техники для трансформации дрожжевых клеток, бактериальных клеток, клеток насекомых и клеток позвоночных.

Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат конструкцию ДНК настоящего изобретения, могут быть идентифицированы хорошо известными способами, такими как ПЦР. Альтернативно наличие белка в супернатанте может выявляться применением антител.

Следует понимать, что некоторые клетки-хозяева по изобретению подходят для получения пептидов по изобретению, например бактериальные, дрожжевые клетки и клетки насекомых. Тем не менее, другие клетки-хозяева могут быть пригодны в конкретных терапевтических методах. Например, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, могут с пользой быть использованы для экспрессии пептидов по изобретению так, что их можно будет нагружать на адекватные молекулы МНС. Таким образом, актуальное изобретение обеспечивает клетку-хозяина, включающую нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с изобретением.

В предпочтительном воплощении клетка-хозяин является антигенпрезентирующей клеткой, в частности дендритной клеткой или антигенпрезентирующей клеткой. АПК, нагруженные рекомбинантным белком слияния, содержащим простатическую кислую фосфатазу (РАР), на данный момент проходят исследования в целях лечения рака простаты (81ри1еисе1-Т) (8та11 Е.1. е! а1., 2006; Кгш е! а1., 2006).

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ получения пептида или его варианта; способ, включающий культивацию клетки-хозяина и изоляцию пептида из клетки-хозяина или его культуральной среды.

В другом воплощении пептид, нуклеиновая кислота или вектор экспрессии по изобретению используются в медицине. Например, пептид или его вариант может приготавливаться для внутривенной (ί.ν.) инъекции, подкожной (з.с.) инъекции, внутрикожной (ί.ά.) инъекции, внутрибрюшной (1.р.) инъекции, внутримышечной (1.т.) инъекции. Предпочтительные способы пептидной инъекции включают 8.с., ί.ά., ί.ρ., 1.т. и ί.ν. Предпочтительные способы инъекции ДНК включают ί.ά., 1.т., 8.с, 1.р. и ί.ν. Вводиться могут дозы, к примеру, между 50 мкг и 1,5 мг, предпочтительно от 125 до 500 мкг пептида или ДНК и будут зависеть от соответствующего пептида или ДНК. Дозы в данных пределах успешно использовались в предыдущих клинических исследованиях (Βπιπδνίβ е! а1., 2006; §1аеЫег е! а1., 2007).

Другой аспект настоящего изобретения включает способ получения активированных Т-клеток ш νίϊγο; способ, включающий контактирование Т-клеток ш νίΐτο с нагруженными антигеном молекулами МНС Ι или ΙΙ класса человека, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточного для активации антиген-специфическим образом Т-клетки, где антиген является пептидом в соответствии с изобретением. Предпочтительным образом, достаточное количество антигена используется с антигенпрезентирующей клеткой.

В случае эпитопа МНС класса ΙΙ, используемого в качестве антигена, Т-клетки являются СЭ4положительными хелперными клетками, предпочтительным образом типа Т_Н1. Молекулы МНС класса ΙΙ могут быть экспрессированы на поверхности любой подходящей клетки. Предпочтительно, если клетка в естественных условиях не экспрессирует молекулы МНС класса ΙΙ (в этом случае клетка трансфецирована для экспрессии такой молекулы). Альтернативно, если клетка в естественных условиях экспрессирует молекулы МНС класса ΙΙ, то предпочтительно, чтобы клетка была дефектной для сигнальных путей процессинга или презентации антигена. Тогда на клетку, экспрессирующую молекулы МНС класса ΙΙ, возможна полная погрузка выбранного пептидного антигена до активации Т-клетки.

Антигенпрезентирующая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулы МНС класса ΙΙ на своей поверхности и предпочтительно обычно является не способной самостоятельно нагружать на указанную молекулу МНС класса ΙΙ выбранный антиген. Молекула МНС ΙΙ класса может быть легко нагружена выбранным антигеном ш νίίτο.

Предпочтительно, если в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т2, ВМА-8 и клетки дрозофилы. ТАР - это транспортер, ассоциированный с процессингом антигена.

Нагружающая пептидом дефектная клеточная линия Т2 человека имеется в наличии в Атепсап Туре СиЙиге Со11ес1юп, 12301 Рагк1а\уп Опте, ВоскуШе, Магу1апб 20852, США под каталоговым № СКЬ 1992; клеточная линия дрозофилы линия 8сйпе1бег 2 имеется в наличии в АТСС под каталоговым № СКЕ 19863; клеточная линия мыши КМА-8 описывается у Кагге и соавторов 1985.

Предпочтительно, если указанная клетка-хозяин до трансфекции, в основном, не экспрессирует молекулы МНС Ι класса. Также предпочтительно, если клетка-стимулятор экспрессирует молекулу, важную для обеспечения сигнала костимуляции для Т-клеток, такую как любая из В7.1, В7.2, Ιί.ΆΜ-1 и ЬЕА 3. Последовательности нуклеиновой кислоты многочисленных молекул МНС ΙΙ класса и костимулирующих молекул общедоступны в банках данных СепВапк и ЕМВЬ.

Аналогично, в случае использования эпитопа МНС класса Ι в качестве антигена, Т-клетки являются СП8-положительными ЦТЛ.

Если антигенпрезентирующая клетка трансфецирована для экспрессии такого эпитопа, то предпоч

- 28 019603 тительно, чтобы клетка включала вектор экспрессии, способный экспрессировать пептид, содержащий с 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1 по 8ЕЦ ГО ΝΟ: 3 или их вариантную аминокислотную последовательность.

Для генерации ЦТЛ ίη νίίτο могут быть использованы многие другие способы. Например, в методах, описанных у Ρеοр1ек и соавторов (1995) и Ка\\'акат1 и соавторов (1992), используются аутологичные опухоль-инфильтрующие лимфоциты при генерации ЦТЛ. Для приготовления ЦТЛ Ρ1еЬаηкк^ и соавторы (1995) используют аутологичные лимфоциты периферической крови (ЛПК). ^сИтик и соавторы (1997) описывают получение аутологичных ЦТЛ посредством импульсного введения пептида или полипептида в дендритные клетки или посредством инфицирования рекомбинантным вирусом. Н111 и соавторы (1995) и 1еготе и соавторы (1993) для получения аутологичных ЦТЛ используют В-клетки. Кроме того, для получения аутологичных ЦТЛ могут быть использованы макрофаги с введенным импульсным методом пептидом или полипептидом или инфицированные рекомбинантным вирусом. 8. Vа1ίе^ и соавторы (2003) описывают прайминг Т-клеток ίη νίίτο с использованием искусственных антигенпрезентирующих (аАПК) клеток, что является также подходящим способом генерации Т-клеток против выбранного пептида. В данном исследовании аАПК были генерированы при соединении преформированных комплексов МНС-пептид с поверхностью полистироловых частиц (микрошарики) с помощью биохимического способа с биотином-стрептавидином. Данная система допускает точный контроль плотности МНС на аАПК, который позволяет селективно вызвать высоко- или низкоавидные антигенспецифические Т-клеточные ответы с высокой эффективностью из проб крови. Кроме комплексов МНС/пептид аАПК должны нести другие белки с костимулирующей активностью, такие как антитела анти-СП28, соединенные с их поверхностью. Кроме того, такая основанная на аАПК система часто требует добавления адекватных растворимых факторов, к примеру цитокинов, таких как интерлейкин-12.

При получении Т-клеток могут быть также использованы аллогенные клетки, и метод детально описывается в патенте νΟ 97/26328, включенном сюда путем ссылки. Например, кроме клеток дрозофилы и Т2-клеток для презентации антигенов могут использоваться другие клетки, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО), бакуловирус-инфицированные клетки насекомых, бактерии, дрожжи, инфицированные осповакциной клетки-мишени. Кроме того, могут быть использованы растительные вирусы (см., например, работу ΡογΙπ е1 а1. (1994)), которая описывает развитие мозаичного вируса китайской вигны как высокопродуктивную систему для презентации чужеродных пептидов.

Активированные ЦТЛ, которые направлены против пептидов по изобретению, полезны для терапии. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные Т-клетки, получаемые вышеупомянутыми методами по изобретению.

Активированные Т-клетки, полученные с помощью приведенного выше способа, будут селективно распознавать клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность с 8ЕЦ ГО № 1 по 8ЕЦ ГО ΝΟ: 3.

Предпочтительно, чтобы Т-клетка распознавала клетку при взаимодействии посредством своего ТКР с комплексом НЬА-пептид (например, присоединение). Т-клетки применимы в методе уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, где пациенту вводится эффективное число активированных Т-клеток. Т-клетки, которые введены пациенту, могут быть получены от пациента и активироваться, как описывалось выше (т.е. они являются аутологичными Т-клетками). Альтернативно Т-клетки получают не от пациента, а от другого индивида. Разумеется, предпочтительно, если индивид является здоровым индивидом. Здоровым индивидом изобретатели обозначают, что индивид имеет, в общем, хорошее здоровье, предпочтительно он имеет компетентную иммунную систему и более предпочтительно не страдает ни одним заболеванием, которые можно легко проконтролировать и выявить.

Клетками-мишенями для СГО4-положительных Т-клеток ίη νίνο в соответствии с настоящим изобретением могут быть клетки опухоли (которые иногда экспрессируют МНС класса II) и/или стромальные клетки, окружающие опухоль (опухолевые клетки) (которые иногда также экспрессируют МНС класса II); ^η^1 е1 а1., 2006)).

Т-клетки настоящего изобретения могут быть использованы в качестве активных ингредиентов в терапевтической композиции. Таким образом, изобретение обеспечивает также способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению; способ, включающий введение пациенту эффективного числа Т-клеток, как определено выше.

Под понятием аберрантно экспрессированный изобретатели подразумевают также, что полипептид гиперэкспрессирован по сравнению с нормальными уровнями экспрессии или что ген является молчащим в ткани, из которой образовалась опухоль, однако он экспрессирован в опухоли. Под понятием гиперэкспрессирован изобретатели понимают, что полипептид представлен на уровне, который по крайней мере в 1,2 раза выше уровня, представленного в нормальной ткани; предпочтительно по крайней мере в 2 раза и более предпочтительно по крайней мере в 5 или 10 раз выше уровня, представленного в нормальной ткани.

Т-клетки могут быть получены способами, известными из уровня техники, например теми, что описаны выше. Протоколы для этого т.н. адоптивного переноса Т-клеток хорошо известны из уровня техни

- 29 019603 ки и с ними можно ознакомиться, например, в работах (КокепЬегд е! а1., 1987; КокепЬегд е! а1., 1988; Эиб1еу е! а1., 2002; Уее е! а1., 2002; Эиб1еу е! а1., 2005); обобщение (СаШпош е! а1., 2006) и (Могдап е! а1., 2006).

Любая молекула по изобретению, т.е. пептид, нуклеиновая кислота, вектор экспрессии, клетка, активированные ЦТЛ, Т-клеточный рецептор или нуклеиновая кислота, кодирующая его, полезна для лечения нарушений, характеризующихся клетками, ускользающими от иммунного ответа. Поэтому любая молекула настоящего изобретения может применяться в качестве медикамента или при изготовлении медикамента. Молекула может быть использована сама по себе или в комбинации с другой(ими) молекулой(ами) по изобретению или известной(ыми) молекулой(ами).

Предпочтительно, если медикамент настоящего изобретения является вакциной. Она может вводиться непосредственно пациенту в пораженный орган или систематично 1.б., 1.т., к.с, 1.р. и ί.ν. или вноситься ех νί\Ό в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ш νίΙΐΌ для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки 1п νιΙΐΌ, то может быть полезно, чтобы клетки были трансфецированными, чтобы коэкспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2. Пептид может быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом (см. ниже) или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Пептид может быть также конъюгирован с подходящим носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (КЕН) или маннан (см. \УО 95/18145 и Ьопдепескет е! а1. (1993)). Пептид может быть также меченым или может быть белком слияния или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют СЭ4 или ί.Ό8 ЦТЛ. Тем не менее, стимуляция СЭ8 ЦТЛ более эффективна в присутствии помощи, производимой ί.Ό4 хелперными Т-клетками. Таким образом, для эпитопов МНС I класса, которые стимулируют СЭ8 ЦТЛ, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют СО4-положительные Т-клетки. СЭ4- и СО8-стимулирующие эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в настоящем изобретении.

В одном аспекте вакцина включает по крайней мере один пептид, имеющий аминокислотную последовательность, предложенную в 8Еф ГО N0: 1, 2 и 3, и по крайней мере один дополнительный пептид предпочтительно от 2 до 50, более предпочтительно от 2 до 25, еще более предпочтительно от 2 до 15 и наиболее предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 пептидов. Пептид(ы) может(могут) быть образован(ы) из одного или более специфических ТАА и может(могут) связываться с молекулами МНС класса I и/или класса II. Предпочтительно, чтобы по крайней мере один дополнительный пептид имел аминокислотную последовательность, предложенную в 8Еф ГО N0: 4 по 24.

Полинуклеотид может быть, по существу, чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Нуклеиновая кислота может быть ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК (циклогексанилнуклеиновая кислота), РНК или их комбинацией. Методы конструирования и введения такой нуклеиновой кислоты хорошо известны из уровня техники. Обзор представлен, к примеру, в работах Раксо1о 8., 2006; 8!ап К., 2006 или А. МаНбаут 2006. Полинуклеотидные вакцины легки в приготовлении, однако способ действия этих векторов по индуцированию иммунного ответа понят не полностью. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные ДНК и/или РНК, такие как системы, которые основаны на аденовирусе, вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры и хорошо известны из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством ген-пистолета. Пептид или пептиды, закодированные нуклеиновой кислотой, могут быть белком слияния, например, с эпитопом, который стимулирует Т-клетки для соответствующего противоположного гипервариабельного участка (СОК), как описывается выше.

Медикамент по изобретению может также включать один или более адъювант. Адъюванты - это вещества, которые неспецифически усиливают или потенцируют иммунный ответ (например, иммунные ответы, опосредованные ЦТЛ или хелперными Т-клетками (Т_Н) на антиген, и могут, таким образом, рассматриваться как полезные в медикаменте настоящего изобретения. Подходящие адъюванты включают, но не ограничиваются, 1018 К8, соли алюминия, АтрНуах, А815, ВСС, СР-870,893, СрС7909, СуаА, б8иМ, флагеллин или лиганды ТЬК5, полученные из флагеллина, лиганд РЬТ3, ГМ-КСФ, ГС30, ГС31, имиквимод (АБОАКА), ^пРас! ВМР321, интерлейкины, такие как ^-2, ГО-К, ^-21, интерферон-α или β или их пегилированные производные, К Ра!сН, ^8, КСОМАТКГХ, КСОМк, ^иνIттиηе, ^^роVас, МАЬР2, МР59, монофосфорил липид А, монтанид ^8 1312, монтанид КА 206, монтанид КА 50ν, монтанид КА-51, эмульсии вода в масле и масло в воде, ОК-432, ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ОЭТАК, ОкрА, векторная система РерТе1®, микрочастицы РЬС и декстрана, резиквимод, 8КЕ172, вирусомы и другие вирусоподобные частицы, ΥΕ-17Ό, VЕСΡ !гар, К848, β-глюкан, Рат3Сук, стимулон Ас.|ш1а 0821, который получают из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитации бактериаль

- 30 019603 ных клеточных стенок и другие запатентованные адъюванты, такие как КтЫ'к Эс1ох. Οιιίΐ или 8нрегГо5. Предпочтительными адъювантами являются такие, как адъювант Фрейнда или ГМ-КСФ. Несколько иммунологических адъювантов (например, МР59), специфических для дендритных клеток и их приготовление были описаны ранее (Эириб М. с1 а1., 1998; ΆΙΙίδοη 1998). Также могут использоваться цитокины. Несколько цитокинов были присоединены напрямую для оказания влияния на миграцию дендритных клеток к лимфоидным тканям (например, ΤΝΕ-α), ускоряя созревание дендритных клеток до эффективных, презентирующих антиген Т-лимфоцитам, клеток (например, ГМ-КСФ, ИЛ-1 и ИЛ-4) (патент США № 5849589, специфически включенный сюда в его целостности путем ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-23, ИЛ-7, ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β) (ОаЬп1оу1е11 с1 а1., 1996).

Об иммуностимулирующих олигонуклеотидах СрО также сообщалось, что они усиливают эффекты адъювантов в составе вакцин. Теоретически не связанные, СрО-олигонуклеотиды при активации врожденной (неадаптивной) иммунной системы действуют с помощью То11-подобных рецепторов (ТЬК), в основном ТЬК9. Вызванная СрО активация ТЬК.9 усиливает антиген-специфические гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, аутологичные клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Более важно то, что улучшается созревание и дифференциация дендритных клеток, приводя к улучшенной активации Тщ-клеток и интенсивной генерации цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦДЛ) даже при отсутствии помощи СИ4 Тклеток. Отклонение в сторону Т_Н1, вызванное стимуляцией ТЬК.9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (ΙΡΑ), который обычно способствует отклонению в сторону Т_Н2. СрО-олигонуклеотиды проявляют даже большую адъювантную активность, если они входят в состав или вводятся вместе с другими адъювантами или в таких составах как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или подобных составах, которые в особенности необходимы для инициации сильного ответа, если антиген относительно слаб. Они также ускоряют иммунную реакцию и позволяют снизить дозы антигена на приблизительно два порядка величины с ответами антитела, сравнимыми с полной дозой вакцины без СрО в некоторых экспериментах (Кпед с1 а1., 2006). В патенте США № 6406705 В1 описывается комбинированное применение СрО-олигонуклеотидов, адъювантов, не включающих нуклеиновые кислоты, и антигена для вызывания антиген-специфического иммунного ответа. Антагонистом СрО ТБВ9 является 68ЫМ (контурный иммуномодулятор двойного действия) компании Мо1одеп (Берлин, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения. Также могут быть использованы другие молекулы, связывающиеся с ТЕК, такие как РНК, связывающаяся с ТЬВ 7, ТЬВ 8 и/или ТЬВ 9.

Другие примеры полезных адъювантов включают, но не ограничиваются химически модифицированными СрО (например, СрВ, Иета), аналогами бкРНК, такими как Ро1у(1:С) и АтрНОеп, не-СрО бактериальной ДНК или РНК, а также иммуноактивными малыми молекулами и антителами, такими как циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, ^Х-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафениб, темозоломид, темсиролимус, ХЬ-999, СР-547632, пазопаниб, УБОР Тгар, ΖΌ2171, ΑΖΌ2171, анти-СТЬА4 и 8С58175, которые могут действовать терапевтически и/или как адъювант. Количества и концентрации адъювантов и вспомогательных веществ, полезных в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом без проведения излишних экспериментов. Предпочтительными адъювантами являются 68Ь1М, интерферон-α, -β, СрО7909, 1С31, АЬИАКА (имиквимод), Реу1Тег, ΚΝΑ, тадалафил, темозоломид и 1иу1ттипе.

Настоящее изобретение обеспечивает медикамент, который полезен для лечения рака, в частности глиомы и рака головного мозга, рака груди, рака предстательной железы, рака пищевода, колоректального рака, рака почек, рака поджелудочной железы, плоскоклеточной карциномы и неоплазмов кожи с участием кератиноцитов, лейкемии, рака легких, рака яичника и меланомы.

Настоящее изобретение включает вспомогательное оборудование, включающее: (а) контейнер, содержащий фармацевтическую композицию, описанную выше, в виде раствора или в лиофилизованной форме; (Ь) опционально - второй контейнер, содержащий разбавитель или восстанавливающий раствор для лиофилизованного состава; и (с) опционально - инструкции по (ί) применению раствора или (и) восстановителя и/или по применению лиофилизованного состава.

В дальнейшем оборудование может включать один или более (ш) буфер, (ίν) разбавитель, (ν) фильтр, (νί) иглу или (νίί) шприц. Контейнер является предпочтительно флаконом, ампулой, шприцем или пробиркой; и он также может быть контейнером многоразового использования. Фармацевтическая композиция предпочтительно лиофилизована.

Вспомогательное оборудование настоящего изобретения предпочтительно включает лиофилизованный состав настоящего изобретения в подходящем контейнере и инструкции для ее восстановления и/или по ее применению. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, ампулы (например, двухкамерные ампулы), шприцы (такие как двухкамерные шприцы) и пробирки. Контейнер может быть сделан из разнообразных материалов, таких как стекло или пластик. Предпочтительным образом вспомогательное оборудование и/или контейнер содержит инструкции для, или связанные с контейнером, кото

- 31 019603 рые дают указания для восстановления и/или применения. Например, на этикетке может быть указано, что лиофилизованный состав должен восстанавливаться до пептидных концентраций, как те, что описаны выше. На этикетке в дальнейшем может быть указано, что состав применяется или предназначается для подкожного введения.

Контейнер с составом может быть ампулой многоразового использования, которая позволяет повторное введение (например, от 2 до 6 введений) восстановленного состава. Вспомогательное оборудование может включать в дальнейшем второй контейнер, включающий подходящий разбавитель (например, раствор бикарбоната натрия).

При смешивании разбавителя и лиофилизованного состава окончательная концентрация пептида в восстановленном составе составляет предпочтительно по крайней мере 0,15 мг/мл/пептид (=75 мкг) и предпочтительно не более чем 3 мг/мл/пептид (=1500 мкг). Вспомогательное оборудование может в дальнейшем включать другие материалы, желательные с коммерческой и с точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и упаковочные вкладыши с инструкциями по применению.

Вспомогательное оборудование настоящего изобретения может иметь один контейнер, который содержит состав фармацевтических композиций в соответствии с настоящим изобретением с или без других компонентов (например, других соединений или фармацевтических композиций этих других соединений) или может иметь отдельные контейнеры для каждого компонента.

Вспомогательное оборудование по изобретению предпочтительно включает состав по изобретению, укомплектованный для применения в комбинации с ковведением второго соединения (такого как адъюванты (например, ГМ-КСФ), химиотерапевтического средства, натурального продукта, гормона или антагониста, средства против ангиогенеза или ингибитора; апоптоз-индуцирующего средства или хелатора) или их фармацевтической композиции. Компоненты вспомогательного оборудования до введения пациенту могут предварительно быть организованы в комплекс, или же каждый компонент может находиться в отдельном отличном контейнере. Компоненты вспомогательного оборудования могут обеспечиваться одним или несколькими жидкостными растворами, предпочтительно водным раствором, более предпочтительно стерильным водным раствором. Компоненты вспомогательного оборудования могут также обеспечиваться твердой формой, которая может быть превращена в жидкости при добавлении подходящих растворителей, которые предпочтительным образом предоставляются в другом, отличном, контейнере.

Контейнер терапевтического оборудования может быть ампулой, пробиркой, колбой, флаконом, шприцем или любыми другими средствами, заключающими в себе твердое вещество или жидкость. Обычно, если имеются более одного компонента, оборудование содержит вторую ампулу или другой контейнер, который позволяет отдельную дозировку. Оборудование может также содержать другой контейнер для фармацевтически приемлемой жидкости. Терапевтическое оборудование будет предпочтительно содержать приспособление (например, одну или более иглу, шприцы, пипетки для глаз, пипетки и т.д.), которое позволяет введение веществ по изобретению, которые являются компонентами настоящего оборудования.

Настоящий состав подходит для введения пептидов любым приемлемым способом, таким как оральный (энтеральный), назальный, офтальный, подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутривенный или трансдермальный. Предпочтительно, чтобы введение было к.с, и наиболее предпочтительно 1.б. Введение может производиться инфузионным насосом.

Теперь настоящее изобретение будет описано с помощью последующих примеров, которые описывают его предпочтительные воплощения, тем не менее, не ограничивая ими изобретение. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки в чертежах и списке последовательностей.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлен масс-спектр Е81-жидкостной хроматографии, идентифицирующий опухолеассоциированный пептид NСАN-001 из пробы глиобластомы СВ 1006.

На фиг. 2 показан профиль экспрессии мРНК гена NСАN, кодирующего пептид, ассоциированный с глиобластомой NСАN-001. Экспрессия этого гена отсутствует или находится на низком уровне в нормальных тканях, в то время как она сильно увеличена в пробах глиобластомы (СВ1006Т по СВ1011Т; ΝΟΗ359Τ и N0^61^.

На фиг. 3 показан профиль относительной экспрессия мРНК гена В1ВС.5. Экспрессия этого гена отсутствует или находится на низком уровне в нормальных тканях, в то время как она сильно увеличена в пробах опухолей.

На фиг. 4а и 4Ь показаны присутствие Р8МА и сурвивин-специфические секретирующие ΙΡΝγ СВ4+Т-клетки в моноцитах периферической крови (МПК) в различные точки времени вакцинированного пациента, которые были определены с использованием метода 1Е№,'-ЕН8роЕ Точки времени: до вакцинации (а) и после 3-й (Ь), 6-й (с), 7-й (б), 8-й (е), 9-й (ί), 10-й (д), 11-й (Ь) вакцинации.

На фиг. 5 показано присутствие сурвивин-специфических ΙΡΝγ-, ИЛ-5, ИЛ-10, Т№а

- 32 019603 секретирующих С04' Т-клеток в МПК в три различные точки времени у вакцинированного пациента, которые определялись посредством анализа Κ’8. Точки времени: после 1-й (а), 3-й (Ь), 7-й (с) вакцинации.

На фиг. 6 показана биохимическая реакция у пациентов 8 и 10, указывающая на стабильность Р8А с ростом не более чем в 10% по сравнению с базисным Р8А.

На фиг. 7 показана биохимическая реакция у пациентов 11 и 16, указывающая на рост Р8А ΌΤ без стабильности Р8А.

На фиг. 8 показана биохимическая реакция у пациента 5, указывающая на рост Р8А ΌΤ без стабильности Р8А.

На фиг. 9 показана биохимическая реакция у пациентов 1, 4, 10, 12 и 13, указывающая на отсутствие изменений Р8А ΌΤ во время вакцинации.

На фиг. 10 показана биохимическая реакция у пациентов 2, 6, 9, 14, 18 и 19, указывающая на отсутствие изменений Р8А ΌΤ во время вакцинации.

На фиг. 11 показана биохимическая реакция у пациентов 7, 15 и 17, указывающая на временное снижение Р8А или рост ΌΤ с последующим снижением ΌΤ.

На фиг. 12 показано, что в рамках исследования вакцинации против рака предстательной железы ВIΚ-002-пептид-специфические клоны СЭ4+ Т-клеток могли быть установлены у нескольких вакцинированных раковых пациентов, которые являются функциональными в отношении выработки ΓΕΝ-γ в ответ на ВЕК.-002. \Уапд и соавторы, 2008 описывают Т-клеточные клоны, полученные от здоровых доноров, только после нескольких повторов ш νίίτο прайминга и стимуляции, так как присутствующие Тклетки могут быть индуцированы у пациентов посредством вакцинации. РМА/иономицин = не зависимая от антигена активация; сурвивин (II): стимуляция ВЕК.-002; Р8МА (II): стимуляция нерелевантным пептидом. Все реактивные клетки являются СП4-положительными.

На фиг. 13 показано, что ВЕК.-002 естественно презентируется дендритными клетками. Незрелые дендритные клетки, инкубировавшиеся с рекомбинантным белком сурвивином, распознаются ВЕК.-002специфическими Т-клетками вакцинированных пациентов, как показывает внутриклеточное окрашивание цитокинов. Данные результаты позволяют предположить, что ВЕК.-002 естественно процессируется протеиназами внутри дендритных клеток, и что эпитоп ВЕК.-002 не разрушается во время процессинга. Кроме того, эти СО4+ Т-клетки являются многофункциональными, так как они секретируют цитокины ΣΕΝ-γ, ΤΝΕ-α и ИЛ-2, имеют поверхностную экспрессию лиганда СЭ40 (СЭ154) и дегрануляцию, определяемую поверхностной экспрессией СО107а. Указанный Т-клеточный ответ является антигенспецифическим, так как Т-клетки не активированы дендритными клетками, инкубированными с нерелевантным белком КАР80 или пептидом ШУ-001.

На фиг. 14 показано, что высокая фракция ВIΚ-002-специфических СЭ4+ Т-клеток, полученных от вакцинированных ВЕК.-002 пациентов с раком предстательной железы, экспрессирует полезные цитокины ΞΕΝ-γ, ΤΝΡ -α, ИЛ-2, в то время как иммунорегулирующие цитокины ИЛ-10 и ИЛ-17 не экспрессируются в таком масштабе. Приводятся первичные данные и обобщенные данные по внутриклеточному окрашиванию цитокинов Т-клеток, специфических для В[И-002 или двух контрольных пептидов, рестриктированных по классу II.

На фиг. 15 показано, что несколько опухолевых клеточных линий, экспрессирующих различные аллели НЬА-ΌΚ, распознаются полученными от пациента МПК (показано для пациентов Рго26 и Рго15). 1. У пациентов вырабатываются мультиклональные Т-клеточные ответы после вакцинации ВЕК.-002; 2. ВЕК.-002 проявляет беспорядочное связывание с несколькими аллелями НЬА II класса: ΌΚ1 (см. также ^апд и соавторы), ЭО5 (не тестировался ^апд и соавторами), ΌΚ11 (см. также \Уапд и соавторы) или ΌΚΒ3 (в отличие от \Уапд и соавторов, 2008, табл. 1); 3. Функциональная презентация ВIΚ-002 возможна в контексте нескольких молекул НЬА II класса (выработка ΤΝΕ-α). Как и для НЬА I класса (НЬА-А, -В, С), в принципе, для НЬА II класса могут быть обнаружены также три различных генных локуса, которые функционально экспрессируют молекулы II класса на поверхности клетки, а именно НЬА-Όρ, НЬА-ЭР и НЬА-ΌΚ Молекулы I класса состоят из тяжелой цепи (-А, -В, -С) и β-2-микроглобулина, являющегося постоянным во всех трех генах. Несмотря на это, молекулы II класса состоят из каждой из двух вариабельных цепей (α и β). Таким образом, сложная запись генетической информации всегда осложнена для класса II. В таблице приводятся так называемые серологические виды, которые базируются на связывании с антителом. Таким образом, ЭОЛ, например, включает различные аллели НЬА-Όρ α и β цепей, которые обычно встречаются вместе и реагируют с определенным антителом.

- 33 019603

Клетки в таблице

Название	клеточная линия	Лит-ра
АЬ	Е418 ЕВУ трансформированная Вклеточная линия	Нитап 1гптипо1оду Уо1ите 51 , Хззие 1, ΝονδίϊΐΕΘΓ 1996, стр. 13-22
ЬАМ	клеточная линия В- лимфомы	Опсодепотхсз 19 ЗерЕетЬег 2002, Уо1ите 21, ЦитЬег 42, стр. 6549- 6556
НО301	ЕВУ трансформированная В- клеточная линия	ТЪе «1оигпа1 οί 1ттипо1оду, 1998, 160: 3363-3373.

ВМ15	Ог11 + АРС клеточная линия	ТЬе <7оигпа1 о£ 1тгаипо1оду, 2004, 173: 1876-1886
МСАК	гомозиготная В-ЬСЬ	Селе ТЬегару (2004) 11, 1408-1415
ъсг-ΕΒν	аутологичная Б- клеточная линия	Сапсег 1ттип1Ьу, νοί. 2, р. 9 (19 ПиХу 2002)
ЕМЛ	В-лимфобластоидная клеточная линия	ЕСАСС Νο. 8602103 1НИ ИитЬег 9097: и Нит 1ттипо1. 1980 Оес;1 (4) :3638.

с 8Ε0 ГО Ν0: 1 по 8Еф ГО Ν0: 3 демонстрируют последовательности опухолеассоциированного пептида настоящего изобретения, полученного из сурвивина, с 8Ε0 ГО Ν0: 4 по 8Еф ГО Ν0: 13 и 8Еф ГО Ν0: 24 демонстрируют последовательности других опухолеассоциированных пептидов, использованных в настоящем изобретении,

8Еф ГО Ν0: 14 демонстрирует последовательности пептида НΒV, с 8Ε0 ГО Ν0: 15 по 8Еф ГО Ν0: 23 демонстрируют последовательности других опухолеассоциированных пептидов, использованных в настоящем изобретении, с 8Еф ГО Ν0: 25 по 8Еф ГО Ν0: 27 демонстрируют последовательности ассоциированных пептидов из работы ХУамд и соавторов. (ХУ0 2007/036638), с 8ΕΟ ГО Ν0: 28 по 8Еф ГО Ν0: 33 демонстрируют последовательности опухолеассоциированных пептидов из работы Р1С5С11С.

с 8Еф ГО Ν0: 34 по 8Еф ГО Ν0: 63 демонстрируют последовательности пептидов, представленных в примере 3, с 8Еф ГО Ν0: 64 по 8Еф ГО Ν0: 65 демонстрируют последовательности пептидов, использованных в примере 4, с 8Еф ГО Ν0: 66 по 8Еф ГО Ν0: 72 демонстрируют последовательности пептидов, использованных в примере 5.

Примеры

Пример 1. Идентификация опухолеассоциированных пептидов, презентируемых на поверхности клетки.

Пробы тканей.

Опухолевые и здоровые ткани пациентов были предоставлены клиниками Норба1 Саηίοиа1 υηίνβτδίНиге бе Ссисус, г. Женева (Меб1са1 Οηсο1οду ΕοόοπιΙοίΎ οί Тииюг Iттиηο1οду) и №игос1пгигд15с11с υπίусгШаХ-Кбшк , г. Гейдельберг, Германия (молекулярно-биологическая лаборатория). Перед проведением хирургического вмешательства было получено информированное согласие всех пациентов в письменной форме. Сразу же после операции ткани были подвергнуты шоковой заморозке в жидком азоте и хранились до изоляции пептидов при -80°С.

Изоляция пептидов НЬЛ из проб тканей.

Пептидные пулы НЬЛ из подвергнутых шоковой заморозке проб тканей были получены методом иммунопреципитации из плотных тканей в соответствии с незначительно измененным протоколом (Ра1к, К. й а1., 1991; 8еедег, Р.Н. й а1., Т, 1999) при использовании НЬЛ-Л*02-специфического антитела ВВ7.2 или НЬЛ-Л, -В, -С-специфического антитела ХУ6/32, С№т-активированной сефарозы, кислотной обработки и ультрафильтрации.

Метод второй.

Полученные пулы пептидов НЬЛ были разделены в соответствии с их гидрофобностью обратнофазной хроматографией (Асс.|ш1у иРЬС 5у51ет, ХУа1ег5) и элюированные пептиды анализировали на гибридном масс-спектрометре ί-Τφ- 0тЬбтар (ΤΙ^πηοΕ^ίΓοη), снабженном источником Ε8Γ Пулы пептидов

- 34 019603 наносили непосредственно на аналитическую микрокапиллярную колонку из плавленого кварца (75 мкм 1.б. х 250 мм) с обратнофазным материалом 1,7 мкм С18 (\Уа1егк) с применением скорости потока в 400 нл/мин. Затем, пептиды разделяли с использованием двухэтапного 180-минутного бинарного градиента от 10 до 33% В при скорости потока в 300 нл/мин. Градиент был составлен из растворителя А (0,1% муравьиной кислоты в воде) и растворителя В (0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле). Позолоченный стеклянный капилляр (Р1соТ1р, Νονν 0Ь)есБуе) использовали для введения в источник микро-Е8Ь Массспектрометр ЬТр-0гЬйгар работал в зависимом от данных режиме с применением стратегии ТОР5. Вкратце, цикл сканирования начинался с полного сканирования с высокой точностью масс на спектрометре 0гЬйгар (Я = 30 000), за чем следовало сканирование М8/М8 на 0гЬйгар (Я = 7500) на 5 особенно многочисленных ионах-предшественниках с динамическим исключением отобранных ранее ионов. Тандемные масс-спектры интерпретировали на 8ЕСЬЕ8Т с дополнительным ручным управлением. Идентифицированную последовательность пептида подтверждали сравнением генерированного фрагментационного образца естественного пептида с фрагментационным образцом синтетического контрольного пептида с идентичной последовательностью. На фиг. 1 представлен отдельный спектр, полученный из опухолевой ткани для пептида NСАN-001ассоциированного с МНС класса I.

Пример 2. Определение профиля экспрессии генов, кодирующих пептиды по изобретению.

Не все пептиды, идентифицированные как презентируемые на поверхности опухолевых клеток молекулами МНС, подходят для иммунотерапии, потому что большинство этих пептидов образованы из нормальных клеточных белков, экспрессируемых многими видами клеток. Только немногие из этих пептидов являются опухолеассоциированными и, скорее всего, способны индуцировать Т-клетки с высокой специфичностью распознавания опухоли, из которой они были образованы. В целях идентификации таких пептидов и минимизации риска аутоиммунности, вызванной при вакцинации, изобретатели фокусировали свое внимание на тех пептидах, которые образованы из белков, гиперэкспрессированных на опухолевых клетках в сравнении с большинством нормальных тканей.

Идеальный пептид будет образован из белка, являющимся уникальным для опухоли и не присутствующим ни в одной другой ткани. Для идентификации пептидов, которые образованы из генов с профилем экспрессии, похожим на идеальный, идентифицированные пептиды соотносили с белками и генами, из которых они были образованы и генерировали экспрессионные профили этих генов.

Источники РНК и приготовление.

Хирургически удаленные тканевые препараты были предоставлены двумя различными клиническими центрами (см. табл. 1) после получения формы информированного согласия от каждого пациента. Препараты опухолевой ткани были мгновенно заморожены в жидком азоте после операции и впоследствии гомогенизированы с помощью ступки и пестика в жидком азоте. Суммарная РНК была приготовлена из данных проб с использованием ТЯИо1 (Шуйгодеп, Каг1кгийе, Германия) с последующей очисткой на Я№аку (^ΆΟΕΝ, НПбеп, Германия); оба метода осуществлялись в соответствии с указаниями производителей.

Суммарная РНК здоровых человеческих тканей была куплена (АтЫоп, Нипйпдбоп, Великобритания; ОогИесй, Не1бе1Ьегд, Германия; 81га1адепе, Атйегбат, Нидерланды; ВюСйаш, Нау^агб, СА, США). РНК нескольких индивидов (от 2 до 123 индивидов) была смешана таким образом, что РНК каждого индивида имела равный вес. Лейкоциты были изолированы из проб крови 4 здоровых добровольцев.

Качество и количество проб суммарной РНК было подтверждено на биоанализаторе АдПеп1 2100 (Адйеп1, \Уа1бЬгопп, Германия) с использованием лабораторного оборудования ЯNА 6000 Р1со ЬаЬСШр Кй (Адйей).

Эксперименты с микрочипами.

Анализ экспрессии генов всех проб РНК из опухолевой и нормальной ткани был произведен с помощью олигонуклеотидных микрочипов АГГуте1г1х Нитап Сепоте (НС) И133А или НС-И133 Р1ик 2.0 (АГГуте1г1х, 8ап1а С1ага, СА, США). Все этапы были выполнены в соответствии с руководством АГГуте1пх. Вкратце, двухнитевую кДНК синтезировали из 5-8 мкг суммарной РНК с использованием 8ирегксг1р1 ЯТИ (Шуйгодеп) и олиго-бТ-Т7 праймера (М^С В1о1есй, ЕЬегкЬегд, Германия), как описывается в руководстве. Транскрипцию ш уйго производили на ВюАггау Н1дй У1е1б ЯNА Тгапкспр! ЬаЬеШпд Кй (ΕΝΖ0 П1адпокйск, Шс., Рагш1пдба1е, ΝΥ, США) Гог 1йе И133А аггаук ог \\йй 1йе СепеСйпр ГУТ ЬаЬеШпд Кй (АГГутеййх) для микрочипов И133 Р1ик 2.0 с последующей фрагментацией, гибридизацией кРНК и окрашиванием стрептавидин-фикоэритрином и биотинилированным антистрептавидиновым антителом (Мо1еси1аг РгоЬек, Ьейбеп, Нидерланды). Изображения сканировали на АдПеп1 2500А СепеАггау 8саппег (И133А) или АГГутеййх Сепе-Сй1р 8саппег 3000 (И133 Р1ик 2.0), а данные анализировали в программе СС08 (АГГутеййх) с использованием настроек по умолчанию для всех параметров. Для упорядочивания использовались 100 генов домашнего хозяйства, предоставленных АГГутеййх. Относительные значения экспрессии были подсчитаны с показаний сигнальной программы, и значение нормальной пробы было произвольно задано значением 1,0.

Экспрессионный профиль исходного гена NСАN пептида NСАN-001 настоящего изобретения свидетельствует о высокой экспрессии в опухолевой ткани глиобластомы, в то время как ген не экспрессирован или экспрессирован на очень низких уровнях в нормальных тканях (фиг. 2).

- 35 019603

Пример 3. Пептиды с участком НЬЛ-ЭК из сурвивина (кЮккрго!: 015392).

Предсказание эпитопов.

Предсказание потенциальных лигандов НЬЛ-ЭК производилось при использовании интернет-банка данных БУЕРЕЙНР Вкратце, проводилась проверка последовательности сурвивина по отношению к паттерну матрицы, при котором оценивается каждая аминокислота внутри нонамерной центральной последовательности 15-мерных пептидов, подходящих для соответствующего участка НЬЛ-ЭК. Якорные остатки приводятся со значениями вплоть до 10; значения других остатков - вплоть до 3, отражая предпочтения аминокислот для конкретных позиций внутри пептида. Теоретический максимальный показатель для пептида-кандидата находится в диапазоне от 28 до 43; значения для распространенных природных лигандов обычно превышают 20.

Т^СЕΕ^К^^КЕКАКN (БЕЦ ГО N0: 1) (или усеченные версии) представлена среди пептидов с наивысшими значениями в 5 из 6 прогнозов.

ΌΚβ1*01 (макс. теоретич. показатель 43)

58	ЕЕСЕКЕЕЕСИЕРБОО (5ЕС Ю Ν' 34)	36
98	ЬСЕГЬКЬОЕЕКАКЫК (5Е(2 Ю № 35)	28
22	ЕКЫНРЕЪЕССАСТРЕ (БЕС Ю № 36)	28
ϋΚΒΙ	*03 (макс, теоретич. показатель 40)
99	СЕГ1К1ЛЖЕЙАКЫК1 (5Е0 Ιϋ Ν' 37)	29
10	ИСРГЪКОНМЗТЕКЫ (5Е2 Ю № 38)	26
3	АРТЬРРАИОРЕЬКОН (ЗЕО Ю № 39)	25
ϋΚΒ1*04 (макс, теоретич. показатель 28)
98	ЬСЕЕЪКЬОКЕКАКЫК (ЗЕС Ю № 40)	28
10	ΜΟΡΓΣΚΟΗΚΙΞΤΓΚΝ (ЗЕО Ю Ν' 41)	28
3	АРТЬРРАИСРЕЬКОН (БЕС ΙΌ № 42)	26
ЭКВ1*07 (макс, теоретич. показатель 34)
121	ΚΚΕΕΕΕΤΑΕΚνΚΚΑΙ (ЗЕС Ю Ν' 43)	24
128	АЕК\7ВЕА1Е()ЬААМВ (БЕС Ю Ν' 44)	24
3	АРТЬРРАИОРГЬКОН (БЕС Ιϋ № 45)	22
16	ϋΗΒΙδΤΓΚΝΝΡΓΕΕΟ (ЗЕО Ю Ν' 4 6)	20
28	ЬЕССАСТРЕРМАЕАС (ЗЕС Ю Ν' 47)	18
40	ΕΑΟΕΙΗΟΡΤΕΝΕΡΌΙ- (БЕС Ю № 48)	18
93	ЕЕЕЬТЬСЕГЬКЫЖЕ (БЕС Ю Ν* 4 9)	16
103	ΚΕϋΗΕΡΙΑΚΝΚΙΑΚΕΤ (БЕС Ю Ν' 50)	16
ϋΚΒ1*11 (макс, теоретич. показатель 38)
98	ЪСЕЕЪКЬПВЕКАКЫК (БЕС Ιϋ Ν' 51)	32
83	ССАЕЬЗУККСГЕЕЬТ (БЕС Ю Ν' 52)	24
58	ЕГСГКЕЬЕСИЕРООО (5Εζ) Ю № 53)	22
ϋΚΒ1*15 (макс, теоретич. показатель 34)
95	ЕЬТЬСЕГЬКЫЖЕКА (БЕС ΙΟ № 54)	30
19	ГЗТГКИИРГЬЕССАС (ЗЕС Ю Ν' 55)	28
55	АССГЕСГКЕЬЕСИЕР (ЗЕО Ю Ν' 5 6)	28

Этапы, ведущие к принятию решения о последовательности.

1. Для каждого пептида необходима 9-мерная центральная последовательность для связывания с НЬЛГОК. Предсказанные центральные последовательности:

- 36 019603

ϋΒΒ1*01	РЬКЬРКЕКА	(ЗЕО	Ιϋ	№	57)
РКВ1*03	ЪКЬОКЕКАК	(ЗЕО	10	Ν·	58)
ϋΚΒ1*04	ЕЬКЪОКЕКА	(ЗЕО	10	Ν'	59)
ϋΚΒ1*11	ЕЬКЪОКЕКА	(ЗЕО	10	Ν'	60)
0КВ1*15	ЬСЕЕЬКЬОК	(ЗЕО	10	№	61)

2. Комбинирование центральных последовательностей для получения одной беспорядочной центральной последовательности:

скомбинировано: ЬСЕЕЬКЬПКЕКЛК (8Е0 ГО N0: 62).

3. Добавление примыкающих последовательностей до конечной длины в 15 аминокислот.

Заключение: ТЕСЕЕЕКЬПКЕКАК (8ЕО ГО N0: 63).

Пример 4. Клиническое исследование проводилось для подтверждения иммуногенности пептида с 8ΕΌ ГО N0: 1.

Первоочередной целью было исследование основанного на Р8А (простата-специфический антиген) ответа (Р8А-К) на подкожное введение набора простата-специфических пептидов (вакцинационная терапия) пациентам с биохимическим рецидивом после радикальной простатэктомии без обнаружения явных метастатических очагов.

Второй целью исследования было изучение переносимости и осуществимости введения вакцины пациентам с раком предстательной железы при особенном учете иммунологических феноменов с точки зрения Т-клеточного ответа.

Исследование было разработано как проспективное рандомизированное исследование фазы Ι/ΙΙ для показания биохимический рецидив после радикальной простатэктомии без обнаружения явных метастатических очагов.

Испытуемая группа.

Частью данного исследования фазы Ι/ΙΙ стала попытка вызывания Р8А-регрессии в качестве индикатора прекращения роста опухоли посредством вакцинации набором простата-специфических пептидов пациентов с НЬА-А*02⁺ с биохимическим рецидивом после радикальной простатэктомии. Комбинация простата-специфических пептидов вводилась подкожно с оценкой силы соответствующего иммунного ответа в контексте разнообразных форм введения антигенных структур.

В отличие от предыдущих исследований вакцинаций целью запланированного исследования было лечение пациентов с небольшим бременем опухолевого заболевания, еще не обнаруживаемого с помощью процедур визуализации. Все пациенты были иммунизированы одинаковым способом с использованием известных простата-специфических антигенных структур для усиления иммунного ответа на злокачественные трансформированные клетки. Лечение прошли 19 пациентов.

Таблица 7

Испытуемая группа

	Всего		Среднее	Диапазон применения
Возраст	19		63	55-77
До нео-/ адъбвантноголечения
Нет	11	58
Облучение	3	16
Периодическая гормональная терапия	2	11
Облуч. + Период. гормон, терапия	2	11
Облуч. + химиотерапия	1	5
ΤΝΜ ад КРХ
Т2а-с КО	6	32
ТЗа-с КО	6	32
Т2а-с К1	3	16
ТЗа-с К1	3	16
ТЗаЫ2 КО	1	5
По шкале глисона
5-7	10	53
8-10	3	16
неизвестно	6	32
КРХ до вакцинации, в месяцах			41	9-124
Первый рецидив после операции, в месяцах			14	1-90
РЗА в начале вакцинации			0,76	0,14-10,8

- 37 019603

Схема лечения.

После исключения явных метастатических очагов с помощью компьютерной томографии и сцинтиграфии скелета пациентам с обнаруженным Р8А-рецидивом после предварительной радикальной простатэктомии в соответствии с различными формами введения вводилась подкожно простата-специфическая пептидная вакцина (увеличение Р8А на 50% во время двух измерений по истечении по крайней мере 14 дней). Вакцину вводили 8 раз в 0, 7, 14, 28, 42 и 56 день (приблизительно 100 мкг на пептид и инъекцией каждый раз). После каждой вакцинации и снова на 70 день проводилось измерение Р8А для оценки терапевтической реакции.

Если обнаруживалась реакция опухоли (полная ремиссия [Р8А-СЯ], частичная ремиссия [Р8А-РК] или стабильное клиническое состояние [без изменений Р8А-НС]), пациенту вводили вакцину один раз в месяц для поддержания терапии в соответствии с выбранной формой введения. Реакции пациента на вакцинацию давали подробную оценку следующим образом:

полная ремиссия (Р8А-СЯ): нормализация первоначально повышенного уровня Р8А, подтвержденная измерениями, проведенными по крайней мере по истечении 4 недель. Нормализация дефинируется как самый низкий уровень Р8А, составляющий <0,2 нг/мл, который мог бы ожидаться после радикальной простатэктомии с полным удалением опухоли или простаты.

Частичная ремиссия: а) Р8А-РК <80% (снижение первоначально повышенного уровня на 80%, подтвержденное измерениями, проведенными по крайней мере по истечении 4 недель); и Ь) Р8А-РК <50% (снижение первоначально повышенного уровня на 50%, подтвержденное измерениями, проведенными по крайней мере по истечении 4 недель).

Стабильное состояние (Τ8Λ-8Ό): без существенных изменений в течение по крайней мере 4 недель. Это включает стабилизацию и снижение на менее чем 50% и увеличение на менее чем 10%, подтвержденное измерениями, проведенными по крайней мере по истечении 4 недель.

Прогрессирование (Р8А-РП): увеличение уровня Р8А на более чем 10%. В случае прогрессии Р8А исследование завершалось.

После рекрутирования пациентов для исследования применялась эпитоп-специфическая вакцина; учитывались белки, специфически экспрессируемые в эпителиальных клетках простаты (к примеру, Р8МА/Р8СА). В дополнение к исследованию общей эффективности вводившейся вакцины в отношении мониторинга роста остаточных опухолевых фракций, как это было оценено при Р8А-мониторинге, в данном исследовании изучались эффекты от различных способов вакцинации в отношении эффективной модуляции иммунной системы. В дополнение к простому подкожному введению пептидов в соответствии с изобретением в отдельности использовались также различные комбинации с адъювантами. Вакцина включала комбинацию по крайней мере из 6 пептидов, полученных из Р8А, Р8СА, Р8МА, сурвивина, ТКР-Р8 и простеина соответственно. Пептид, полученный из МР вируса гриппа, использовали в качестве положительного контроля. Пептиды, полученные из Р8МА и сурвивина, использовали в качестве Тхелперных эпитопов. В частности, использовались депо и адъювантная активность для пептидных вакцин из монтанида (состав из классического неполного адъюванта Фрейнда, подходящий для введения человеку), который недавно был описан в очень выгодном свете. В этих целях 500 мкл пептидного раствора смешивали с 500 мкл монтанида и вводили. Тем самым получалась эмульсия вода в масле, которая медленно, в течение нескольких недель, высвобождает антиген, содержащийся в водной фазе. Физическая стойкость эмульсии очень высока, так как при 4°С она может храниться более 3 месяцев без значительного разделения фаз. Функция депо монтанида успешно нашла применение в нескольких исследованиях вакцин (Ока е1 а1., 2004).

На одном направлении исследования изучалась эффективность вакцинации во время сопутствующей стимуляции иммунной системы факторами роста, ГМ-КСФ, раствором для инъекций Ьеикше®. ГМКСФ - это адъювант, очень часто используемый в исследованиях пептидных вакцинаций, в некоторых из которых сообщается об усиленных клинических и Т-клеточных ответах. Изначально ГМ-КСФ играет роль в рекрутинге и является фактором дифференциации дендритных клеток, за счет которого, как считается, увеличивается число дендритных клеток в месте введения вакцины. Хотя ГМ-КСФ самостоятельно не активирует антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки и макрофаги, сообщалось о непрямой активации ίη νίνΌ (Мо1епкатр е1 а1., 2005).

Другое направление исследования было посвящено изучению эффективности вакцинации во время сопутствующей активации дендритных клеток при накожном использовании имиквимода. Имиквимод применялся в виде 5% мази (АИага). Она имеет сильное иммуностимулирующее воздействие посредством своего влияния на ТЬК7-положительные клетки (к примеру, плазмацитоидные ДК, клетки Лангерганса, дермальные ДК), активируя МуЭ88-зависимый сигнальный путь. Активированные АПК высвобождают Т-клеточную стимуляцию и воспалительные цитокины, увеличивают костимуляцию и мигрируют к дренирующим лимфатическим узлам. Потенциал имиквимода по усилению пептид-индуцированного ответа ЦТЛ при подмешивании антигенов в мазь или применении А1бага на месте инъекций к.с. или ί.ά. для антигенов был продемонстрирован на моделях с животными.

Другое направление исследования было посвящено изучению эффективности вакцинации во время

- 38 019603 сопутствующей активации дендритных клеток при их смешивании с протамин-стабилизированной мРНК, кодирующей муцин-1 для активации ТЬК 7/8. мРНК демонстрирует широкую активацию популяций иммунных клеток мыши и человека. Присутствие в составе полиосновного белка протамина повышает полураспад мРНК и вызывает формирование потенциальных депо-формирующих частиц. Этот адъювант может поэтому совмещать депо-формирующие и АПК-формирующие свойства.

Вкратце, формы введения вакцины включали следующие подходы:

a) подкожное введение пептидной вакцины, эмульсифицированной в монтаниде;

b) подкожное введение пептидной вакцины, эмульсифицированной в 500 мкл монтанида, в комбинации с топическим введением 225 мкл ГМ-КСФ с целью получения более сильного иммунного ответа, вызванного сопутствующим введением факторов роста;

c) подкожное введение пептидной вакцины, эмульсифицированной в 500 мкл монтанида, в комбинации с локальной гипертемией, применяемой после с целью получения индуцированного термально более сильного иммунного ответа;

б) подкожное введение пептидной вакцины, эмульсифицированной в 500 мкл монтанида, в комбинации с накожным применением имиквимода в целях активации дендритных клеток посредством ТЬК7;

е) подкожное введение пептидной вакцины, эмульсифицированной в 500 мкл монтанида, вместе с 55 мкл муцина-1 мРНК/протамина в целях активации дендритных клеток посредством ТЬК 7/8.

Схема вакцинации.

Общая продолжительность исследования составила 3 года. Простата-специфические пептидные вакцины вводили пациентам в 0, 7, 14, 28, 42 и 56 дни. Пациентам со стабильным протеканием болезни или объективным ответом опухоли (Р8А-СК или Р8А-РК) вакцину вводили раз в месяц 1.б., пока не обнаруживалась явная прогрессия. Исходя из имеющегося опыта, инъекции на основе пептидов переносятся без значительных побочных реакций. Так как реакция на вакцинацию оценивалась только серологически на основе измерений Р8А, то в начале исследования проводился тест для определения, не интерферирует ли введенная вакцина с измерениями Р8А ш νίΙΐΌ, что могло бы симулировать клинический ответ. В 0, 7, 14, 28, 42, 56 и 70 день брались пробы крови для лабораторных анализов, определения уровней Р8А, лейкоцитарной формулы, анализа ЕАС8 и цитокинов. Если лечение продолжалось после 70 дня, проводили 6-недельный мониторинг Р8А в целях своевременного обнаружения неудачи лечения.

Лечение прекращали, если документировалось появление прогрессии болезни, выражавшееся в продолжительном повышении уровня Р8А.

Начиная с 84 дня, иммунизационная терапия продолжалась с 4-недельными перерывами до документированной прогрессии вплоть до 420 дня (15 месяцев). Решения в отношении продолжения лечения (в случае успеха) вне данного исследования принимались, исходя из каждого индивидуального случая. Неожиданных побочных реакций в этом исследовании не было.

Лабораторные анализы включали тесты на коагуляцию, электролиты, лактатдегидрогеназу, β2-Μ, СК, ферменты печени, билирубин, креатинин, мочевую кислоту, общий белок, коагуляцию, Среактивный белок, дифференцированную лейкоцитарную формулу с мазком, уровень Р8А, цитокины, ЕАС8, ЕйкроР

Анализ реакции кожи на указанные бактериальные и грибные антигены (48-72 ч после введения, гиперчувствительность замедленного типа (ЭТН), опосредованная Т-клетками, будет служить в качестве анализа клеточной иммунной системы пациента до начала исследования).

Пептиды, необходимые для исследования (нонапептиды), были изготовлены в лаборатории РЭ Эг. 81еГап 81еуапоу1с на кафедре РгоГ. Н.-С. Каттепкее. Эти пептиды очищали на ВЭЖХ и анализировали с помощью масс-спектрометрии. Чистоту пептидов можно также проверить посредством ВЭЖХ, массспектрометрии и секвенирования методом Эдмана. С помощью этих методов может документироваться чистота вплоть до 98% (которая должна рассматриваться как максимально возможная в соответствии с современными методами). Синтезированные пептиды растворяли в ДМСО (Сгуо8иге, \УАК СЬеш1е Меб1са1 СшЬН; 10 мг/мл), разбавляли до соотношения 1:10 в Атри\уа (Егекешик КаЬ1) и аликвотировали в стерильных условиях.

Клинический ответ.

У двух пациентов с помощью ПЭТ-КТ можно было обнаружить локальные рецидивы, после того как была обнаружена локальная опухоль при длительном цифровом ректальном обследовании. У оставшихся 17 пациентов по окончании исследования не могло быть установлено местонахождение активности заболевания.

Во время повторного лабораторного анализа лейкоцитарной формулы или экстенсивной клинической химии не обнаружилось ни каких-либо отклонений, ни изменений во время исследования.

Из 19 пациентов 16 пациентов реагировали на пептид из сурвивина ΙΙ (ГЕИ-у ЕЫ8Р0Т, +/ЧС8) в соответствии с 8ЕО ΙΌ N0: 1. Среди них были 12 пациентов с индукцией антисурвивинового Т-клеточного ответа при вакцинации, 2 с существовавшими предварительно антисурвивиновыми Т-клетками и 2 пациента, у которых невозможно было установить, были ли существовавшие предварительно Т-клетки в избытке.

- 39 019603

Биохимический ответ.

Полный ответ рассматривался как не обнаруживаемый уровень Р8А в соответствии с самым низким уровнем, обнаруживаемым лабораторией, сотрудничающей после изначально повышенного уровня Р8А. Измерения должны были быть подтверждены после периода времени, составляющего по крайней мере 4 недели. РВ >80% и >50% должен пройти повторную оценку после 4 недель соответственно. Уровень Р8А, находящийся в диапазоне между снижением на менее чем 50% и ростом на менее чем 10%, отражал стабильное состояние заболевания, если был подтвержден по крайней мере после 4 недель. Прогрессирующим заболевание считалось, если Р8А возрастал на более чем 10% по сравнению с началом лечения.

Биохимический ответ у пациентов, которые завершили исследование, наблюдался, пока они не начинали последующее лечение местным облучением или антигормональную терапию. 19 пациентов дали согласие на участие в исследовании, и данные анализировали с самым долгим последующим наблюдением, составившим около 3,75 года.

Стабильность Р8А (простата-специфический антиген) и увеличение ΌΤ (время удвоения).

Уровень Р8А 2 пациентов (10,2%) выражал стабильность в соответствии с упомянутыми выше критериями для биохимического ответа, которые подразумевают, что по окончании исследования не было зафиксировано роста уровня Р8А более чем на 10% по сравнению с началом исследования (фиг. 6, табл. 8, 9 и 10). Последующее наблюдение в этих двух случаях проводилось 14 и 16 месяцев спустя после проведения последней вакцинации. Средняя продолжительность стабильного состояния составила 24 месяца (28 и 31) в момент прекращения сбора данных со средним числом вакцинаций - 18 (14 и 20).

Один пациент из этих двух пациентов имел частичный ответ >50% в течение периода в 9 месяцев с последующим периодом медленного роста Р8А со временем удвоения в 20,5 в сравнении с 9,8 месяцами до вакцинации. Начальный рецидив Р8А начинался 18 месяцев спустя после операции для опухоли ρΤ2ρΝ0 ΟΕηκοη 5.

Во время анализа данных пациент № 8 имел стабильное протекание болезни с начала программы вакцинации 28 месяцев назад. Он прервал лечение в связи с аллергической реакцией после 10 месяцев и 14-й вакцинации. У него сложилась неблагоприятная ситуация с рТ3Ь ΟΕηκοη 3+4 с наиболее низким уровнем Р8А после радикальной простатэктомии, не выше 0,6 нг/мл, и прогрессией Р8А без запоздания во времени после начального снижения после операции. Время удвоения замедлилось с 6,6 до 148 месяцев.

Данные два пациента лечились имиквимодом, наносившимся дермально в месте введения при каждой пептидной вакцинации (фиг. 9-11, табл. 13).

Рост Р8А ΌΤ без стабильности Р8А.

Р8А ΌΤ пациента 11 был повышен с 1,5 до 10,1 месяцев в течение шести месяцев исследования. Так как он начал с уровнем Р8А в 10,8 нг/мл и достиг 17,8 нг/мл, он завершил процедуры исследования для прохождения антиандрогенной монотерапии без каких-либо злокачественных поражений, выявленных ПЭТ-КТ. Ему вводили А1бага в качестве адъюванта.

Пациент 16 начал вакцинацию с муцин-1-мРНК/протамином со временем удвоения в 6,1 месяцев. Скорость Р8А снизилась до времени полураспада в 2,7 месяцев для пяти месяцев с последующим статистически подсчитанным ростом Р8А ΌΤ в 14,4 месяцев, который продолжается 16 месяцев после начала лечения. Начиная с уровня Р8А в 0,29 нг/мл, он снизился до 0,19 нг/мл во время первых 5 месяцев во время лечения в рамках исследования, вырос до 0,4 нг/мл в течение последующих 8 месяцев и закончил исследование с протокольным значением в 0,41 нг/мл 19 месяцев спустя после начала лечения (фиг. 7 табл. 8 и 10).

Прогрессия Р8А.

У пациента 5 наблюдалась прогрессия во время исследования в соответствии с предполагавшимся временем удвоения Р8А до вакцинации. Однако у него произошло снижение Р8А со временем полураспада в 20,2 месяца в течение продолжительного периода после завершения лечения, составившего 10 месяцев на момент завершения сбора данных. Он все еще не проходил никакого вторичного лечения после завершения вакцинации. Ему вводили монтанид в качестве единственного адъюванта (фиг. 8, табл. 13).

- 40 019603

Таблица 8

Время удвоения Р8А в месяцах

	Всего	%	Среднее геометриче ское значение	Диапазон ЭТ
Уровень Р5А ϋΤ до вакцинации в месяцах	19		8,3	1,5-44,8
Уровень РЗА ϋΤ по завершении исследования или в конце последующих обследований	18’		11,2	2,2-148
Без изменений РЗА ОТ во время вакцинации	11	58		2,2-44,8
Повышенный уровень РЗА ϋΤ по завершении исследования	4	21
Без изменений Р8А ΩΤ во время вакц., но со снижением впоследствии	1	5
Временное снижение РЗА или рост ϋΤ с последующим снижением ОТ	3	16

* Р8А ОТ по завершении исследования или в конце последующих обследований не был охвачен для пациента 5 из-за снижения Р8А.

Таблица 9

Стабильность Р8А с ростом не более чем на 10% по сравнению с базисным Р8А

	РЗА базисный, нг/мл	РЗА конец исследования, нг/мл	РЗА _КОнеи последующих обследований, нг/мл	Месяцев _с момента исходного измерения
Пац. 3	0,7	0,51	0,73	31
Пац. 8	1,76	1,84	1,85	28

Таблица 10

Постоянный рост Р8А ОТ в месяцах во время вакцинации

	1^ое ОТ до вакцинации, в месяцах	2^ое ϋΤ во время вакцинации, в месяцах	3^е ОТ во время вакцинации, в месяцах
Пац. 3	9,8	- 2,3	20,5
Пац. 8	6, 6	148
Пац. 11	1,5	10,1
Пац. 16	6,1	-2,7	14,4
среднее геометрическое значение ОТ	4,9	25,	8

- 41 019603

Таблица 11

Без изменений Р8А ΌΤ, в месяцах, во время вакц., но со снижением после

	1ЫИ дгр _{до ВаК}Ц_ИНац_ИИ(. _В	2™ ОТ во время вакцинации, в
	месяцах	месяцах
Пац. 5	3,2	- 20,2

Таблица 12

Временное снижение/стабильность Р8А ΌΤ, в месяцах, последовавшее за быстрым ростом

	1^ое ЕТ до вакцинации, в месяцах	2^ое ϋΤ всвремя вакцинации, в месяцах	3^е ОТ во время вакцинации, в месяцах	ЕТ вовремя вакцинации, в месяцах
Лац. 7	3,7	21, 5	2,8
Лац, 15	1,3	25, 8	-9,9	7,4
Лац. 17	10,2	-1, 9	4,8

Таблица 13 Адъюванты и реакция пациентов.

Без ответа Р8А (-), временный спад Р8А и последующий ускоренный рост (+/-), рост Р8А ΌΤ (+)

Синтез.

Пептиды синтезировали с использованием полностью автоматизированного устройства синтеза пептидов ЕР8 221, выпускаемого компанией АЫтей. Программа синтеза полностью осуществлялась по стандартным протоколам производителя. Насколько это было возможно, для каждого пептида регистрировали номера партий реагентов.

Процесс получения сырого пептида.

Процесс получения сырого пептида осуществляли посредством отщепления от смолы-носителя и высвобождения защитных групп боковой цепи с помощью ΤΕЛ/фенол/этандитиол/тиоанисол/вода (90/3,75/1,25/2,5/2,5, соотношение по объему соответственно) 1 ч или 3 ч (пептиды с аргинином). Преципитация сырого пептида в метил-трет-бутиловом эфире, промывание метил-трет-бутиловым эфиром и дважды диэтиловым эфиром, сушка и растворение пептидного пеллета в уксусной кислоте. Другая преципитация в диэтиловом эфире, сушка, повторное растворение в воде, лиофилизация.

Препаративная ВЭЖХ.

Система ВЭЖХ Уапап 81аг хроматографическая колонка 250x10 мм С18 5 мкм (изготовитель: 21етег). Маловязкий растворитель А: вода с 0,1% ΤΕΆ, маловязкий растворитель В: ацетонитрил с 0,08% ΤΕА. Градиент, использованный для разделения, ориентирован на гидрофобность пептида. Отдельные фракции пептида лиофилизировали.

Анализ.

Для каждого пептида записывали хроматограмму ВЭЖХ и массовый спектр МАЙШ с целью подтверждения идентичности (посредством молярной массы в массовом спектре) и чистоты (посредством областей наивысших точек в хроматограмме ВЭЖХ).

Синтетические пептиды и стимуляторы.

Синтетические пептиды, использованные для стимуляции и функциональных тестов, были эпито

- 42 019603 пами, образованными из ВИЧ (ВИЧ дад 164-181): УУОКЕУКТЕКАЕОАЗОЕУ (8Е0 ΙΌ NО: 65), отрицательный контроль), Р8МА 459-473: ^УТЬВУПСТРЬМУЗЬ (8Е0 ΙΌ NО: 64) и сурвивин 97-111: ТЕСЕЕЕКЕОЕЕЕАК^ (8Е0 ΙΌ NО: 1). Стафилококковый энтеротоксин В (8ЕВ, 81дта-А1бгюй, ТаиГкйсйеп, Германия) использовался в качестве стимуляции положительного контроля для СЭ4' Т-клеток в интерферон-γ ЕЫЗРОТ.

Амплификация 1п νίΓτο специфических Т-клеток.

Мононуклеарные клетки периферической крови пациентов с карциномой предстательной железы были получены в различное время в период вакцинации и подвержены криоконсервации с 90% фетальной сыворотки теленка и 10% ДМСО в жидком азоте. После размораживания приблизительно 5х10⁶ клеток культивировали (24-луночный планшет для культивации клеток, Стешет Вю-Опе, Епскепйаикеп, Германия) в среде ΙΜΌΜ с добавлением 50 и/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина (все Βίο\\Ίιί!Гакег, Уегу1ег8, Бельгия), 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки (с.с. рго, №и8ГабГ, Германия) и 50 мкМ β-меркаптоэтанола при 37°С и 7,5% СО₂. Пулы синтетических пептидов, связывающихся с НЬА ΙΙ класса, добавляли в первый день, по 5 мкг/мл каждого, и культуру дополняли рекомбинантным человеческим ИЛ-2 (г-ЫЬ2, Β&Ό 8у5!ет5 СтЬН, ^екЬабеп, Германия) на 2, 5, 7 и 9 дни Тклеточной стимуляции.

Анализ с помощью метода иммуноферментных зон (ЕЫЗРОТ).

Функциональность обогащенных Т-клеток проверялась стандартным анализом Интерферон-γ ЕЫЗРОТ в соответствии с рекомендациями наблюдательного органа организации 'ΌΜΊ' (Иммунотерапия против рака) (\\л\лу.с-пп!.огд). Вкратце, клетки собирали после 12-дневной культивации, промывали, считали и высевали в культуральную среду на планшете ЕЫЗРОТ (ΜΠ^οκ, 8сйета1Ьасй, Германия). Между 0,15 и 0,25х10⁶ клеток были протестированы в дупликатах и трипликатах в присутствии синтетических пептидов с 2,5 мкг/мл или ЗЕВ с 1 мкг/мл. Выработка ΙΕΝ-γ обнаруживалась парой специфических моноклонольных антител (1Э1-к и 7-В6-1, оба ΜаЬΐесй, №1ска 8Ггапб, Швеция) после 26-часовой инкубации при 37°С и 5% СО₂. Авидин-щелочную фосфатазу Ех!гаА\збт-А1каНпе и субстрат ΒСIР/NΒТ (оба компонента компании 8|дта-А1бпс11) добавляли на 1 ч и 10 мин соответственно. Анализ ЕЫЗРОТ проводили с использованием ридеров Iттиηо8роΐ (8епе§ 3А и 5, Се11и1аг Тесйпо1оду ЬГб., Аа1еп, Германия).

Внутриклеточное окрашивание цитокинов.

Клетки, полученные на ЕЫЗРОТ, культивировали затем в присутствии 2 нг/мл г-ЫЬ2 в течение 9 дополнительных дней. После данного рестимуляционного периода эффекторы собирали, промывали и стимулировали стандартными методами пептидами в количестве 5 мкг/мл или РМА и иономицином (50 нг/мл и 1 мкМ соответственно) в присутствии Со1д1-8ТОР (ВО Вюкшепсеу Не1бе1Ьегд, Германия), следуя инструкциям производителя. После 6-часового периода инкубации клетки промывали в РВ8 1% ЕС8 0,02% №ιΝ₃ и окрашивали моноклональными антителами ^оАЬ) СЭ4-АРС-Су7 (ВО Вюкаепсек) и СЭ8РЕ-Су7 (Весктап СоиЙег) в течение 20 мин при 4°С в темноте. После этапа промывания клетки пермеабилизировали 20 мин в реагенте СуГоДх/СуГорегт (ВО Вюкшепсек), затем окрашивали на внутриклеточные цитокины в течение 30 мин. Использованными ΜоΑЬ были IЕN-γ-ЕIТС, ИЛ-10-РЕ (оба компонента компании ВО Вюкаепсек), ИЛ-5-АРС (Μ^1!еηу^ ВюГес, ВегдЦсй С1абЬасй, Германия) и Т№-а-Рас1йс В1ие (Вю1едепб, Зап О1едо, США). Обнаружение клеток производили на Су!оте!ег Сап!о ΙΙ с использованием программы ОВа, а анализ - на Е1о\у1о (ВО Вюкаепсек).

Пример 5. Связывание ВГВ-11, ВЖ.-12 и ВЖ.-13 с НЬА-А*0211.

Целью данного анализа была оценка аффинности ВЖ.-004 (Е^Т^СЕЕ^К^^ВЕВΑКN (8ЕО ΙΌ NО: 2)) С-терминальных пептидов по отношению к молекуле МНС, закодированной аллелем НЬА-А*0211, так как об этом аллеле сообщалось, что он обладает способностью связываться с пептидами с Стерминальными аспарагиновыми остатками. Лиганды МНС с С-терминальным N встречаются не очень часто, и мы протестировали лишь 66 пептидов с N на С-конце. Остальное множество - это не связчики, однако существуют несколько исключений: ΒΕΥΝΕ8ΕΕΝ (8ЕО ΙΌ NО: 66) крепко связывается с А*0211, и также ΥΑ^СС^\VΥN (8ЕО ΙΌ NО: 67) связывается с А*0211.

Тесты отчетливо показали, что связывание с НЬА-А*0211 имело место для ВГВ-11 (Стерминальный нонамер: КЕОКЕКАКП (8ЕО ΙΌ NО: 68)) и ВЖ.-13 (С-терминальный декамер: ЬКЕОВЕВΑКN (8ЕО ΙΌ NО: 69)) при более высоких концентрациях, но не для ВЖ.-12 (С-терминальный октамер: ЕОКЕКАКП (8ЕО ΙΌ NО: 70)). Пептид положительного контроля (последовательность: Е^Р8^ΥЕР8V (8ЕО ΙΌ NО: 71)) проявлял явные свойства связывания.

Принципы теста.

Анализ имеет следующий вид: стабильные комплексы НЬА/пептид состоят из трех молекул: тяжелой цепи НЬА, β-2 микроглобулина (Ь2т) и пептидного лиганда. Активность денатурированных рекомбинантных молекул НЬА-А*0211 с тяжелой цепью сама по себе может быть сохранена, делая их функциональными эквивалентами пустых молекул НЬА-А*0211. Если они растворены в водном буфере, содержащем Ь2т и подходящий пептид, то данные молекулы быстро и эффективно сворачиваются в полной зависимости от пептида. Наличие данных молекул использовалось в анализе, основанном на методике ЕЬ^А, для измерения аффинности взаимодействия между пептидом и молекулой НЬА класса Ι

- 43 019603 (8у1уеЧег-Ну1б е1 а1., 2002).

Очищенные рекомбинантные молекулы НЬА-А*0201 инкубировали вместе с Ь2т и ступенчатыми дозами интересующего пептида. Количество новообразовавшихся комплексов НЬА/пептид определялось количественным методом ЕЫ8А. Константы диссоциации (значения К_с) вычислялись с использованием стандартной калибровочной кривой, записанной с титров комплекса калибровки НЬА/пептид. Погрешность измерений была слишком велика, чтобы дать достоверные значения К_с, хотя можно сказать, что значение К_с для ВИК13 находится в диапазоне положительного контроля, причем значение К_с для ВШ11 выше. Более низкое значение К_с отражает более высокую аффинность к НЬА-А*0211.

Сила связывания нонамера ВШ-П и нонамера ВШ.-Па по отношению к нескольким аллелям с помощью 8ΥΡРЕIТНI

КЬОКЕКАКЦ	(5Е2	Обозначение	Название	относит.	показ-
Ю № 72)		аллеля	аллеля	показ-ль	ль
КЪОКЕКАКЦ		74	А*0301	0,45	20
КШКЕКАКЦ		65	А*0201	0,42	15
КШНЕКАКЦ		99	В*1501 (В62)	0,36	10
КЬОКЕВАКО		334	А*0101	0,28	14
КШКЕКАКЫ	(5Е0	Обозначение	Название	относит.	показ-
Ю № 68)		аллеля	аллеля	показ-ль	ль
КШКЕКАКМ		74	А*0301	0, 45	20
ΚΣΡΚΕΚΑΚΝ		65	А*0201	0,42	15
КШКЕНАКИ		99	В*1501 (В62)	0,36	10
КШКЕКАКЫ		334	А*0101	0, 28	14

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Пептид, содержащий последовательность, выбранную из группы 8ЕО ГО N0: 1 - 8Е0 ГО N0: 3, где указанный пептид имеет длину от 15 до 30 аминокислот.
2. Пептид по п.1, где пептид состоит из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 1 - 8Е0 ГО N0: 3.
3. Пептид по п.1 или 2, где указанный пептид является слитым белком, в частности, содержащим N концевые аминокислоты антигенассоциированной инвариантной цепи (И) НЬА-ЭК.
4. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид по любому из пп.1-3.
5. Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по п.4.
6. Клетка-хозяин, не являющаяся клеткой человека, содержащая нуклеиновую кислоту по п.4 или вектор экспрессии по п.5, причем клетка является антигенпрезентирующей клеткой, в частности дендритной клеткой.
7. Способ получения пептида по любому из пп.1-3, включающий культивирование клетки-хозяина по п.6 в условиях, обеспечивающих экспрессию нуклеиновой кислоты по п.4 и выделение пептида из культуральной среды.
8. Способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) ш νίΙΐΌ, включающий приведение в контакт ЦТЛ ш νίΙΐΌ с нагруженными антигеном человеческими молекулами МНС I или II класса, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки или искусственной конструкции, имитирующей антигенпрезентирующую клетку, в течение времени, достаточного для активации указанных ЦТЛ антигенспецифическим образом, где указанный антиген является пептидом по любому из пп.1-3.
9. Применение пептида по любому из пп.1-3, нуклеиновой кислоты по п.4 или вектора экспрессии по п.5, клетки-хозяина по п.6 или активированного Т-лимфоцита, полученного в соответствии с п.8 для получения лекарственного средства для лечения рака.
10. Применение по п.9, где лекарственное средство является вакциной.
11. Применение по п.9 или 10, где указанный рак выбран из астроцитомы, пилоидной астроцитомы, дисэмбриопластической нейроэпителиальной опухоли, олигодендроглиомы, эпендимомы, мультиформной глиобластомы, смешанных глиом, олигоастроцитомы, медуллобластомы, ретинобластомы, нейробластомы, герминомы, тератомы, ганглиоглиомы, ганглиоцитомы, центральной ганглиоцитомы, примитивных нейроэктодермальных опухолей ^N8^ к примеру медуллобластомы, медуллоэпителиомы, нейробластомы, ретинобластомы, эпендимобластомы), опухолей паренхимы шишковидной железы (к примеру, пинеоцитомы, пинеобластомы), опухолей, развивающихся из эпендимных клеток, опухолей хориоидного сплетения, нейроэпителиальных опухолей неопределенного происхождения (к примеру, глиоматоза головного мозга, астробластомы), глиобластомы, опухоли предстательной железы, рака груди, рака пищевода, рака толстого кишечника, колоректального рака, почечно-клеточной карциномы, рака

- 44 019603 легких, ЦНС, яичника, меланомы, рака поджелудочной железы, плоскоклеточной карциномы, лейкемии или медуллобластомы и других опухолей или видов рака, проявляющих гиперэкспрессию сурвивина или нейрокана.
12. Применение по любому из пп.9-11, дополнительно включающее комбинированное использование по крайней мере одного пептида, выбранного из группы, состоящей из пептидов 8Ер ГО NО: 4-13 и 24, для получения лекарственного средства для лечения рака почек.
13. Применение по любому из пп.9-11, дополнительно включающее комбинированное использование по крайней мере одного пептида, выбранного из группы, состоящей из пептидов 8Ер ГО NО: 4, 8, 11, 12 и 15-24, для получения лекарственного средства для лечения рака толстого кишечника.
14. Набор, содержащий:

(a) контейнер, который содержит фармацевтическую композицию, содержащую пептид по любому из пп.1-3, нуклеиновую кислоту по п.4 или вектор экспрессии по п.5, клетку-хозяин по п.6 или активированный цитотоксический Т-лимфоцит, полученный способом по п.8, в виде раствора или в лиофилизованной форме;

(b) при необходимости, второй контейнер, содержащий разбавитель или восстанавливающий раствор для лиофилизованного состава; и (c) при необходимости, по крайней мере один пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов 8Ες ГО №: 4-24.
15. Применение любого пептида 8Ер ГО NО: 1-24 для получения антитела, которое является специфическим против комплекса указанного пептида и соответствующей молекулы НЬА.