CN102027006A - 源自生存素的新型强力mhc ⅱ类肽 - Google Patents

源自生存素的新型强力mhc ⅱ类肽 Download PDF

Info

Publication number
CN102027006A
CN102027006A CN2009801175640A CN200980117564A CN102027006A CN 102027006 A CN102027006 A CN 102027006A CN 2009801175640 A CN2009801175640 A CN 2009801175640A CN 200980117564 A CN200980117564 A CN 200980117564A CN 102027006 A CN102027006 A CN 102027006A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
cell
cancer
seq
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009801175640A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102027006B (zh
Inventor
斯蒂芬·斯蒂万诺维奇
赛瑟利·戈泰芬奇斯
汉斯-宙戈·冉曼思
托尼·怀申克
彼得·莱维卓尔斯奇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Immatics Biotechnologies GmbH
Original Assignee
Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39789337&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN102027006(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Immatics Biotechnologies GmbH filed Critical Immatics Biotechnologies GmbH
Publication of CN102027006A publication Critical patent/CN102027006A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102027006B publication Critical patent/CN102027006B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001148—Regulators of development
    • A61K39/00115—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/7056—Lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明进一步涉及源自生存素的肿瘤相关细胞毒性T辅助细胞(CTL)肽表位，为单独或与作为刺激抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物的活性药物成分的其它肿瘤相关肽组合在一起。本发明特别涉及三种新型肽序列及其变体，其源自可用于引发抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物中的人肿瘤HLA I类和II类分子。

Description

源自生存素的新型强力MHC II类肽
本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、核酸和细胞。尤其是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明进一步涉及源自生存素的肿瘤相关细胞毒性T辅助细胞(CTL)肽表位，为单独或结合其它作为刺激抗肿瘤免疫反应疫苗复合物的活性药物成分的肿瘤相关肽。本发明尤其涉及三种新型肽序列及其变体，系源自可用于引发抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物中的人肿瘤HLA I类和II类分子。
发明背景
神经胶质瘤是源自神经系统胶质细胞的脑肿瘤。神经胶质细胞(Glial cell)，通常称为神经胶质(neuroglia)或简单地称为胶质(glia)，是提供支持和营养、保持动态平衡、形成髓鞘和参与神经系统信号传输的非神经元细胞。神经胶质瘤的两个最重要的亚群为星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤，根据其来源的正常胶质细胞类型(分别为星形胶质细胞和少突胶质细胞)而得名。多形性胶质母细胞瘤(以下简称胶质母细胞瘤)属于星形细胞瘤的亚群，是成人中最常见的恶性脑肿瘤，约占所有恶性脑肿瘤的40％，约占胶质瘤的50％(CBTRUS，2006)。它对中枢神经系统有很强的侵袭性，是所有胶质瘤中恶性水平最高(Ⅳ级)的肿瘤。由于神经影像学、显微外科学、各种治疗方案(如替莫唑胺或放射)的进步，在该疾病的治疗方法上已经取得了稳步发展，虽然如此，胶质母细胞瘤仍无法治愈(Macdonald，2001；Burton and Prados，2000；Prados and Levin，2000)。该类型的脑肿瘤致死率非常高：自首次确诊后的预期平均存活时间为9至12个月。在1986年到1990年的观察期，其5年存活率为8.0％。截至目前，侵入性治疗，包括肿瘤全切除，治疗后五年存活率仍然不足10％(Burton and Prados，2000；Nieder et al.，2000；Napolitano et al.，1999；Dazzi et al.，2000)。因此，医学上对替代性的有效治疗方法有着强烈的需求。
胶质母细胞瘤的肿瘤细胞是脑肿瘤中分化最低的肿瘤细胞，所以，肿瘤细胞很可能迁移和增殖，并且具有高度的浸润性，从而导致预后非常差。由于胶质母细胞瘤在大脑中呈快速、侵袭性及浸润性生长，因此会导致死亡。浸润性生长模式导致这些肿瘤具有不可切除的特性。同时，胶质母细胞瘤对放疗、化疗也具有相对的抗性，因此，治疗后复发率高。此外，在手术切除和放疗后，肿瘤细胞的免疫反应对彻底消除肿瘤细胞无效(Roth and Weller，1999；Dix et al.，1999；Sablotzki et al.，2000)。
胶质母细胞瘤分为原发性胶质母细胞瘤(新肿瘤)和继发性胶质母细胞瘤，这取决于在未分化星形胶质细胞或胶质前体细胞的恶性转化期间基因机制上的差异。继发性胶质母细胞瘤发生在最大年龄为45岁的较年轻的人群中。平均在4到5年期间，继发性胶质母细胞瘤从低级别的星形细胞瘤发展为未分化的星形细胞瘤。相比之下，原发性胶质母细胞瘤主要发生在较年长的人群中，平均年龄为55岁。一般来说，原发性胶质母细胞瘤作为暴发性胶质母细胞瘤而发生，特点是在3个月内就可从无任何临床或病理异常状态进展为胶质母细胞瘤(Pathology and Genetics of the Nervous Systems.29-39(IARC Press，Lyon，France，2000))。
胶质母细胞瘤沿有髓神经迁移并在中枢神经系统中广泛扩散。对于大多数病例，手术治疗只显示出有限的可持续疗效(Neurol.Med.Chir.(Tokyo)34，91-94，1994；Neurol.Med.Chir.(Tokyo)33，425-458，1993；Neuropathology 17，186-188，1997)(Macdonald，2001；Prados and Levin，2000)。
恶性胶质瘤细胞通过产生会削弱T细胞增殖的免疫抑制物以及产生免疫刺激因子IL-2，而逃开宿主免疫系统的侦测(Dix et al.，1999)。
颅内肿瘤可发生于CNS的任何结构或细胞类型，包括脑、脑膜、脑垂体、头骨、甚至残留的胚胎组织。在美国，原发性脑肿瘤的总体年发病率是每10万人中有14例。最常见的原发性脑肿瘤为脑膜瘤，占所有原发性脑肿瘤的27％，以及胶质母细胞瘤，占所有原发性脑肿瘤的23％(而成人中，胶质母细胞瘤占恶性脑瘤的40％)。这些肿瘤中，很多都具有侵袭性，并且级别高。原发性脑肿瘤是儿童中最常见的实体瘤，在儿童中，是仅次于白血病的第二位最常见癌症死亡原因。
如今，对胶质母细胞瘤患者有效治疗方法的探究工作仍在进行。已有研究对抗这些肿瘤细胞的免疫疗法或通过征募免疫系统的治疗方法。首先，在人类的免疫治疗研究中，Northwest Therapeutics使用“DCVax Brain”(脑癌疫苗)治疗胶质母细胞瘤获得了令人鼓舞的成果，其可诱导抗原特异性CTL反应，与正在采用的标准治疗相比，延长了中位存活时间，同时最大限度地降低了毒性(Heimberger et al.，2006)。
结直肠癌
根据美国癌症协会的报道，在美国，结直肠癌(CRC)是位于第三位的最常见癌症，受罪的新患者每年超过175,000名。在美国、日本、法国、德国、意大利、西班牙和英国，每年有超过480,000例患者罹患该疾病。它是发达国家癌症死亡的最常见原因之一。结直肠癌患者的1年和5年相对存活率分别为84％和64％。确诊5年后存活率继续下降，10年时下降至57％。如果结直肠癌在早期未扩散阶段被发现，则5年存活率为90％；但是只有39％的结直肠癌患者会在此阶段得到确诊，主要原因是筛查率低。当癌细胞已发生区域扩散而累及邻近器官或淋巴结后，5年存活率下降至68％。有远处转移的患者5年存活率仅为10％。
研究表明，结直肠癌的发病是遗传和环境因素之间相互作用的结果。在大多数病例中，结直肠肿瘤似乎由腺瘤息肉演变而来；但是这个演变过程可能需要很多年。结直肠癌的主要风险因素是年龄，90％的病例在50岁之后诊断患有此病。根据美国癌症协会的报道，结直肠癌的其它风险因素包括饮酒、高脂肪和/或红色肉类饮食、水果和蔬菜的摄取量不足。结直肠癌的发病率继续上升，特别是日本等地区，这些地区接受西化饮食，摄入过多的脂肪和肉类而纤维摄入量减少，这些因素可能是罪魁祸首。但是发病率的上升速度比不上以前，这可能是由于进行了更多的筛查和息肉切除从而防止了息肉发展成为癌症。
和大多数实体肿瘤的治疗一样，一线治疗为手术治疗，然而，手术受益者仍仅限于早期患者，但有很大一部分患者在确诊时已是晚期。基于氟尿嘧啶的化疗方案是晚期结直肠癌的标准治疗。这些治疗方案的大多数为所谓的FOLFOX方案(输注5-FU/亚叶酸+奥沙利铂)和FOLFIRI(伊立替康、亚叶酸，团注和连续输注5-FU)方案。
第三代细胞毒素类药物的引入，如伊立替康和奥沙利铂，增加了显著改善疗效的希望，但预后仍较差，转移癌的存活率一般仍只有大约20个月，因此，治疗该疾病的需求仍远未满足。
最近出现了新一代药物，即靶向分子药物，如阿瓦斯丁(贝伐单抗)和爱必妥(西妥昔单抗)，而且大约有40种针对不同阶段结直肠癌的化合物处于后期临床开发阶段。这些化合物中的几种相结合可增加未来潜在治疗选择的数量。绝大部分药物都处于二期阶段，在结直肠癌的临床研究中，这些化合物靶向表皮生长因子受体(EGFR)比靶向其它靶标更经常，这是由于在约80％的结直肠癌患者中，EGRF表达都上调。
针对II期结直肠患者使用最近批准的单克隆抗体(mAb)联合化疗(西妥昔单抗+伊立替康或FOLFOX4方案；贝伐单抗单药或与FOLFOX4方案联合)的临床试验目前正在进行。经过三至四年的观察，预计这些试验会得出有统计学意义的结果。
目前肿瘤科所用的单克隆抗体(mAb)一般都很可能不会干扰积极免疫治疗。事实上，有临床前(GABRILOVICH 1999)和临床证据表明，用贝伐单抗消耗VEGF可导致DC介导的T细胞激活的积极结果(Osada T，Chong G，Tansik R，Hong T，Spector N，Kumar R，Hurwitz HI，Dev I，Nixon AB，Lyerly HK，Clay T，Morse MA.The effect of anti-VEGFtherapy on immature myeloid cell and dendritic cells in cancer patients.Cancer ImmunolImmunother.2008Jan 10.)。
前列腺癌和其它肿瘤
据估计，2007年有27050人死于前列腺癌，它是男性癌症死亡的首要原因。虽然自20世纪90年代初以来，其死亡率在白人和非裔美国男性中一直下降，但是，非裔美国男性的死亡率仍然比白人男性高两倍以上。前列腺癌是男性中最常见的癌症。非裔美国男性的发病率显著高于白人男性，其原因不明。在过去20年里，前列腺癌的发病率发生了很大的变化：在1988-1992年期间迅速上升、1992-1995年期间急剧下降、自1995年以来略有增加。这些趋势在很大程度上反映了采用前列腺特异抗原(PSA)血液检查进行前列腺癌筛查的增加。过去10年中发病率增加趋缓最有可能是由于在65岁以上的男性中普遍开展PSA筛查。在65岁以上的男性中，前列腺癌的发病率趋于稳定。在白人男性中，发病率于1992年达到高峰(每100000人男性中有237.6人)，而在非裔美国男性中，于1993年达到高峰(每100000人男性中有342.8人)。
前列腺癌的治疗包括观察等待、手术、放射治疗、高强度聚焦超声(HIFU)、化疗、冷冻手术、激素治疗、或一些组合疗法。哪种方案最佳取决于疾病的阶段、Gleason评分和PSA水平。其它重要因素是男性的年龄、一般健康状况、以及对潜在治疗及其可能副作用的感觉。由于所有的治疗均可能有一定的副作用，如：勃起功能障碍和尿失禁，因此治疗讨论往往注重于治疗目标和生活方式改变的风险之间的平衡。
如果癌症已扩散出前列腺，治疗选择会发生明显的变化，因此，大多数治疗前列腺癌的医生使用各种诺模图来预测扩散概率。观察等待、HIFU、放射治疗、冷冻手术和外科手术一般在癌症仍然局限在前列腺内的男性中进行。激素疗法和化疗常常在疾病已经扩散出前列腺的患者中进行。但是，也有特例：对于一些晚期肿瘤，可使用放射治疗，对于一些早期肿瘤，可使用激素治疗。如果初始的治疗失败并且癌症进展，也可使用冷冻疗法、激素疗法、化疗。
在因临床怀疑器官有限生长而接受前列腺癌根治术的前列腺癌患者中，很多人的手术准备确诊性病理检验显示，局部性扩展肿瘤扩展至器官的边界之外。这些患者有早期局部复发的高风险，就生化复发而言，由于PSA水平不断增高，通常可以检测。在这种情况下的治疗性选择包括外部放疗和激素治疗；然而，这些治疗方法的价值，特别是延长患者的长期存活率方面，不能认为已经得到证实。此外，可能的治疗相关并发症，如尿道狭窄的发展(放疗)、性欲丧失和阳痿、骨质疏松方面的骨骼中钙盐降低的风险、以及病理性骨折风险明显增加(激素消融)，也必须予以考虑。
在所有前列腺癌中，有90％以上在发现时处于局部性和区域性阶段；肿瘤在此阶段确诊的患者5年相对存活率接近100％。在过去25年中，所有阶段肿瘤组合在一起的5年存活率从69％上升至接近90％。根据最新的数据，10年相对存活率为93％，15年相对存活率为77％。存活率，特别是5年存活率的巨大提升，部分归因于早期诊断和治疗的改进。但是，在肿瘤扩散至其它组织和器官后，患者的存活率显著下降。
肺癌
2007年美国预计新发病例为21万例，约占确诊癌症病例的15％。男性发病率显著下降，从1984年的每10万人102例高点，下降到2003年的78.5例。在女性中，这一发病率在一段长期的增长之后正趋向于平稳。为了治疗之目的，临床上肺癌分为小细胞肺癌(13％)和非小细胞肺癌(87％)。
在男性和女性中，癌症相关死亡的大多数均为肺癌。据估计，2007年有16.039万人死亡，约占所有癌症死亡人数的29％。自1987年以来，每年死于肺癌的女性多于乳腺癌患者。从1991年至2003年，男性的死亡率持续下降，每年约下降1.9％。女性肺癌死亡率在连续增长几十年后正趋于平稳。肺癌死亡率的这些趋势反映了过去30年吸烟率的下降。
治疗选择根据癌症的类型(小细胞和非小细胞肺癌)和阶段进行确定，包括手术、放疗、化疗、靶向生物治疗，如贝伐单抗
Figure BPA00001255738000061
和埃罗替尼
Figure BPA00001255738000062
对于局部癌，通常选择外科手术治疗。最近的研究表明，手术随后化疗可提高早期非小细胞肺癌的存活率。由于该疾病在发现时通常已经扩散，因此，常常使用放射和化疗，有时与手术联合使用。单一化疗或放化疗结合是治疗小细胞肺癌的通常选择；采用这一方案，有很大比例的患者获得缓解，在一些病例中，缓解为持久缓解。
肺癌的1年相对存活率在1975-1979年期间为37％，至2002年，略上升至42％，这主要是由于手术技术的改进和组合疗法的使用。然而，所有阶段的肺癌组合在一起，5年存活率仅为16％。对于疾病在检出时仍为局部性的病例，存活率为49％；但是仅有16％的肺癌在此早期得到确诊。
表1：2007年美国按性别估计的新发癌症病例和死亡人数(American Cancer Society.Cancer Facts&Figures 2007.Atlanta：American Cancer Society；2007.)
Figure BPA00001255738000071
因此，对于胶质母细胞瘤、前列腺肿瘤、乳腺癌、食管癌、结直肠癌、透明细胞肾细胞癌、肺癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌、黑色素瘤(Tamm等人，1998年)胰腺癌、鳞状细胞癌、白血病和髓母细胞瘤以及表现出过度表达生存素的其它肿瘤仍然需要有效且安全的新治疗选择，从而在不使用化疗药物或其它可能导致严重副作用的药物的情况下，增强患者的安康。
发明内容
在本发明的第一方面，本发明涉及一种肽，包含选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.3的组的一个序列、或该序列的与SEQ ID No.1至SEQ ID No.3具有至少85％同源性的一种变体、或该序列的诱导T细胞与所述变异肽发生交叉反应的一种变体；其中所述肽不是人类生存素的全长多肽。优选地，所述肽选自具有特异性HLA亚型如HLA-A*02或HLA-DR的一种肽。
在本发明的第二个方面，本发明涉及一种核酸，编码根据本发明的一种肽或一种能表达所述核酸的表达载体。
在本发明的第三方面，本发明涉及一种宿主细胞，包括根据本发明的核酸或表达载体，其中所述宿主细胞优选为抗原提呈细胞，特别是树突状细胞或抗原提呈细胞。
在本发明的第四方面，本发明涉及一种体外制造激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，包括将CTL与载有抗原的人I或II类MHC分子进行体外接触，该等分子在合适的抗原提呈细胞表面或人工构造的模拟抗原提呈细胞表面上表达一段足够的时间从而可以按抗原特异性方式激活CTL，其中所述抗原为根据本发明的肽。
使用根据本发明的一种肽、根据本发明的核酸或表达载体、根据本发明的细胞或根据本发明制造的一种激活的细胞毒性T淋巴细胞，用以治疗癌症或用以制造抗癌药物，其中所述药物优选为一种疫苗。优选地，所述癌症系选自星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、胚胎发育不良性神经上皮瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、多形性胶质母细胞瘤、混合型胶质瘤、少突星形细胞瘤、髓母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、生殖细胞瘤、畸胎瘤、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、中央神经节细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNET，如髓母细胞瘤、髓上皮瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、管膜母细胞瘤)、松果体实质肿瘤(如松果体细胞瘤、成松果体细胞瘤)、室管膜细胞瘤、脉络丛肿瘤、来源不明的神经上皮肿瘤(如大脑胶质瘤病、星形母细胞瘤)、胶质母细胞瘤、前列腺肿瘤、乳腺癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、肺癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、鳞状细胞癌、白血病和髓母细胞瘤以及过度表达生存素的其它肿瘤或癌症。
一种药盒，包括：(a)一个容器，其含有一种根据本发明的一种肽、根据本发明的核酸或表达载体、根据本发明的一种细胞或根据本发明的一种激活的细胞毒性T淋巴细胞的溶液或冻干形式的药物组合物；(b)可选的第二个容器，其含有冻干粉剂型的稀释剂或重组溶液；(c)可选的至少一种选自由根据SEQ ID 4至24的肽构成的组的肽，以及(d)可选的使用溶液和/或重组和/或使用冻干粉剂型的说明书。
一种生产特异性结合至与一种HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织相容性复合体(MHC)的一种重组抗体的方法，该方法包括：以与所述HLA限制性抗原络合的一种可溶性形式的人主要组织相容性复合体(MHC)I或II类分子对包含表达所述I或II类人MHC细胞的基因工程非人哺乳动物进行免疫；将mRNA分子与产生所述非人哺乳动物细胞的抗体分离；产生一个显示由所述mRNA分子编码的蛋白分子的噬菌体显示库；以及将至少一个噬菌体与所述噬菌体显示库分离，所述至少一个噬菌体显示可特异性结合至与所述HLA限制性抗原络合的所述I或II类人主要组织相容性说复合体(MHC)。
一种抗体，其特异性结合至与一种HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织相容性说复合体(MHC)，其中该抗体优选为多克隆抗体、单克隆抗体和/或嵌合抗体。
具体实施方式
本文使用的术语“肽”是指一系列氨基酸残基，通常以α-氨基酸与相邻氨基酸的羰基团之间的肽键相互连接。这些肽的长度通常为9个氨基酸，但至短可为8个氨基酸长度，至长可为16个氨基酸长度。
本文使用的术语“寡肽”是指一系列氨基酸残基，通常以α-氨基酸与相邻氨基酸的羰基团之间的肽键相互连接。寡肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要在寡肽中保持正确的表位即可。通常，寡肽长度约小于30个氨基酸残基，约长于14个氨基酸。
“多肽”这一术语是指一系列氨基酸残基，通常以α-氨基酸与相邻氨基酸的羰基团之间的肽键相互连接。多肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要保持正确的表位即可。与术语肽或寡肽相对，“多肽”这一术语是指包含多于约30个氨基酸残基的分子。
一种肽、寡肽、蛋白质或编码该分子的核苷酸如果能诱导免疫反应，则具有“免疫原性”(因此是本发明中的一种“免疫原”)。在本发明的情况下，免疫原性的更具体定义是诱导T细胞反应的能力。因此，“免疫原”是一种能够诱导免疫反应的分子，并且在本发明的情况下，是一种能诱导T细胞反应的分子。
T细胞“表位”要求的是一种结合至MHC I或II类受体上的短肽，从而形成一种三元复合体(MHC I类α链、β-2-微球蛋白和肽)，其可由载有以相应亲和力结合至MHC/肽复合体的匹配T细胞受体的一种T细胞进行识别。结合至MHC I类分子的肽的典型长度为8至14个氨基酸，最典型为9个氨基酸长度。结合至MHC II类分子上的T细胞表位的典型长度为12至30个氨基酸。对于表位结合至MHC II类分子的情况，同一个肽与相应的T细胞表位可共享一个共同的核心节段，但是由于核心序列的氨基末端上游和核心序列的羧基端下游的侧翼序列分别具有不同的长度，因而总体长度不同。MHC II类受体具有更开放的构造，结合至MHC II类受体上的肽相应地不完全埋于MHC II类分子的肽结合槽裂结构中，这是因为它们位于MHC I类分子的肽结合槽裂之中。出人意料的是，对于根据SEQ ID NO：1的肽，情况并非如此，因为肽长度的微小差异会导致活性的极度降低(见下文)。
在人类中，有三种编码MHC I类分子的不同基因位点(人MHC分子也是指定的人白细胞抗原(HLA))：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02和HLA-A*11是可从这些基因位点表达的不同MHC I类等位基因的实例。
表2：在不同人群中表达的前30位等位基因
Figure BPA00001255738000101
Figure BPA00001255738000111
MHC II类基因的人基因组有三种不同基因位点：HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。MHC II类受体是异源二聚体，包含一个α链和一个β链，两者均通过跨膜区在细胞膜中锚定。HLA-DRB1*04和HLA-DRB1*07是两种不同的MHC II类β等位基因的例子，它们已知在这些位点被编码。II类等位基因具有很高的多态性，例如，已经描述的有数百种不同的HLA-DRB1等位基因。因此，为了治疗和诊断目的，与数种不同的HLA II类受体以合适的亲和力结合的肽是非常理想的。与数种不同的HLA II类分子结合的肽被称为混杂结合剂。
本文提到的DNA序列既包括单链DNA也包括双链DNA。因此，除非本文另有所指，否则具体的序列是该序列的单链DNA、该序列与其互补序列的双工(双链DNA)以及该序列的互补序列。“编码区”这一术语是指在基因的天然基因组环境中天然或正常编码该基因的表达产物的那部分基因，即，体内编码该基因的天然表达产物的区域。
编码区可来自正常基因、突变基因或异常基因，甚至还可以来自DNA序列，完全可在实验室中使用本领域熟知的DNA合成方法合成。
“核苷酸序列”这一术语是指脱氧核苷酸的杂聚物。
编码特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可为天然核苷酸序列，也可为合成核苷酸序列。一般来说，编码肽、多肽以及本发明蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸衔接物，或一系列寡核苷酸组成，以提供一种合成基因，该基因能够在包含源自微生物或病毒操纵子的调节元素的重组转录单元中被表达。
“表达产物”这一术语是指多肽或蛋白，它是基因和遗传码退化并因而编码同样的氨基酸所造成的任何核酸序列编码同等物的翻译产物。
“片断”这一术语，当指的是一种编码序列时，表示包含非完整编码区的DNA的一部分，其表达产物与完整编码区表达产物基本上具有相同的生物学功能或活性。
“DNA片段”这一术语是指一种DNA聚合物，以单独的片段形式或一种较大DNA结构的组分形式存在，它们从至少分离过一次的DNA中以基本纯净的形式获得，即不含污染性内源性材料，并且获得的数量或浓度能够使用标准生化方法，例如使用克隆载体，进行识别、操纵和回收该片段及其组分核苷酸序列。此等片段以开放阅读框架(未被内部未翻译序列打断)或内含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。未翻译DNA序列可能存在于开放阅读框架的下游，在那里其不会干预编码区的操纵或表达。
“引物”这一术语表示一种短核酸序列，其可与一个DNA链配对，并在DNA聚合酶开始合成脱氧核糖核酸链之处提供一个游离的3′-OH末端。
“启动子”这一术语表示参与RNA聚合酶的结合从而启动转录的DNA区域。
“开放阅读框架(ORF)”这一术语是指编码无终密码子的氨基酸的一系列三联体，并且是一种(潜在地)可翻译成蛋白质的序列。
“分离”这一术语表示一种物质从其原来的环境(例如，如果是天然发生的则是天然环境)中被移走。例如，活体动物中的天然核苷酸或多肽不是分离的，但是，从天然系统中一些或所有共存物质中分离出来的核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可能是载体的一部分和/或此类多核苷酸和多肽可能是一种组合物的一部分，并且由于该载体或组合物不是其天然环境的一部分，因此它仍然是分离的。
本发明公开的多核苷酸和重组或免疫原性多肽也可能以“纯化”形式存在。“纯化”这一术语并非要求绝对的纯度；而是一个相对的定义，可能包括高度纯化或仅部分纯化的制剂，相关领域的技术人员能理解这些术语。例如，从cDNA库中分离出的各克隆物已用传统方法纯化为具有电泳同质性。明确考虑到将起始材料或天然物质纯化至少一个数量级，优选为两或三个数量级，更优选为四或五个数量级。此外，明确考虑到所述多肽的纯度优选为99.999％，或至少为99.99％或99.9％；甚而适宜为以重量计99％或更高。
根据本发明公开的核酸和多肽表达产物，以及包含此类核酸和/或多肽的表达载体可能以“浓缩的形式”存在。本文使用的术语“浓缩”是指材料的浓度至少是其自然浓度的大约2、5、10、100或1000倍，有优势的是，按重量计为0.01％，优选为至少0.1％。也明确考虑到，按重量计约为0.5％、1％、5％、10％和20％的浓缩制剂。序列、构型、载体、克隆物以及包含本发明的其它材料可有优势地以浓缩或分离的形式存在。
“活性片段”这一术语是指产生免疫反应的片段(即具有免疫原性活性)，不论是单独或可选地与合适的佐剂一起给予一种动物，比如哺乳动物，例如兔子或小鼠，也包括人；这种免疫反应采用的形式是在接受动物(如：人)体内刺激T细胞反应。或者，“活性片段”也可用于诱导体外T细胞反应。
本文使用的“部分”(portion)、“节段”(segment)、“片段”(fragment)这几个术语，当与多肽相关地使用时是指残基的连续序列，比如氨基酸残基，其序列形成一个较大序列的子集。例如，如果一个多肽以任一种肽链内切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)进行处理，则该处理获得的寡肽会代表起始多肽的部分、节段或片段。这表示，任何此类片段必定包含与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3序列基本相同(如果不是完全相同)的一个节段、片段或部分作为其氨基酸序列的一部分，该节段、片段或部分对应SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：3序列的自然存在蛋白或“母”蛋白，即生存素。当与多核苷酸相关地使用时，这些术语系指用任何共同核酸内切酶处理所述多核苷酸产生的产物。
根据本发明，术语“等同度百分比”或“等同百分比”，如果指的是序列，则表示在待对比序列(“被对比序列”)与所述序列或权利要求的序列(“参考序列”)对准之后将被对比序列与所述序列或权利要求的序列进行比较。然后根据下列公式计算等同度百分比：
等同度百分比＝100[I-(C/R)]
其中C是参考序列与被对比序列之间对准长度上参考序列与被对比序列之间的差异数量，其中
(i)参考序列中每个碱基或氨基酸序列在被对比序列中没有对应的对准碱基或氨基酸；
(ii)参考序列中每个空隙，以及
(iii)参考序列中每个对准碱基或氨基酸与被比对比序列中对准碱基或氨基酸不同，即构成一个差异；
并且R是参考序列与被对比序列对准长度上在参考序列中产生任何空隙也计算为一个碱基或氨基酸的参考序列中的碱基或氨基酸数目。
如果“被对比序列”和“参考序列”之间存在的一个对准按上述计算的等同度百分比大致等于或大于指定的最低等同度百分比，则被对比序列与参考序列具有指定的最低等同度百分比，虽然可能存在按本文上述计算的等同度百分比低于指定等同度百分比的对准。
如果无另有说明，那么本文公开的原始肽可以通过在肽链内的不同(可能为选择性)位点上取代一个或多个残基而被修饰。此取代可能是保守性的，例如，其中一个氨基酸被具有类似结构和特点的另一个氨基酸所取代，比如其中一个疏水性氨基酸被另一个疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或类似的大小和化学性质的氨基酸间的取代，例如，亮氨酸被异亮氨酸取代。在天然同源蛋白质家族序列变异的研究中，某些氨基酸取代比其它氨基酸取代更经常被耐受，这经常表现出同原始氨基酸与其取代物之间在大小、电荷、极性和疏水性上的相似性相关，这是确定“保守取代”的基础。
在本文中，保守取代定义为在以下五种基团之一的内部进行交换：基团1-小脂肪族、非极性或略具极性的残基(Ala，Ser，Thr，Pro，Gly)；基团2-极性、带负电荷的残基及其酰胺(Asp，Asn，Glu，Gln)；基团3-极性、带正电荷的残基(His，Arg，Lys)；基团4-大脂肪族非极性残基(Met，Leu，Ile，Val，Cys)以及基团5-大芳香残基(Phe，Tyr，Trp)。
较不保守的取代可能涉及一个氨基酸被另一个具有类似特点但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如：丙氨酸被异亮氨酸残基取代。高度不保守的取代可能涉及一个酸性氨基酸被另一个具有极性或甚至具有碱性性质的氨基酸所取代。然而，这种“激进的”取代不能认为是无效的而不予考虑，因为化学作用是不完全可预测的，激进的取代可能会带来其简单化学原理中无法预见的偶然效果。
当然，这种取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其它结构。因此，D-氨基酸可能被本发明的抗原肽中常见的L-氨基酸取代，也仍在本公开的范围之内。此外，具有非标准R基团的氨基酸(即，除了天然蛋白的20个常见氨基酸之外的R基团)也可以用于取代之目的，以生产根据本发明的免疫原和免疫原性多肽。
如果在一个以上位置上的取代发现导致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定义值，则对这些取代的组合进行测试，以确定组合的取代是否产生对肽抗原性的叠加或协同效应。肽内被同时取代的位置最多不能超过四个。
术语“T细胞反应”是指由一种肽在体外或体内诱导的效应子功能的特异性扩散和激活。对于MHC I类限制性CTL，效应子功能可能为溶解肽脉冲的、肽前体脉冲的或天然肽提呈的靶细胞、分泌细胞因子，优选为肽诱导的干扰素γ、TNF-α或IL-2，分泌效应分子、优选为肽或脱颗粒作用诱导的颗粒酶或穿孔素。对于MHC II类限制辅助性T细胞效应子功能可能为肽诱导的细胞因子分泌，优选为，IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL5、IL-10或IL-2或肽诱导的脱颗粒作用。CTL和辅助性T细胞的可能效应子功能不仅限于此列表所述功能。
优选情况是，当来源于SEQ ID NO：1至3任何序列的肽特异性CTL相比于取代肽受到检测时，如果取代肽在相对于背景肽溶解度增加达到最大值的一半，则该肽浓度不超过约1mM，优选为不超过约1μM，更优选为不超过约1nM，再优选为不超过约100pM，最优选为不超过约10pM。也优选为，取代肽被一个以上的CTL识别，最少为2个，更优选为3个。
因此，本发明所述的表位可能与天然肿瘤相关表位或肿瘤特异性表位相同，也可能包括来自参考肽的不超过四个残基的不同肽，只要它们有基本相同的抗原活性即可。是否能刺激免疫反应取决于是否存在被宿主免疫系统视为异物的抗原。发现肿瘤相关抗原的存在增加了运用宿主免疫系统促进免疫反应的可能性，该免疫反应具有对表达于肿瘤细胞表面的靶向抗原的特异性并且通过该作用机制能够诱导肿瘤消退、生长停止或生长放缓。对于癌症免疫疗法，目前正在探索各种利用免疫系统的体液和细胞免疫作用的机制。
细胞免疫反应的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的细胞毒性T细胞(CTL)表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用(Cheever et a1.，1993；Zeh，III et al.，1999)。根据对415份来自结直肠癌患者的样本的分析结果，Galon等人证明了肿瘤组织中免疫细胞的类型、密度和位置实际上是比广泛采用的肿瘤TNM分期更好的患者存活率预测因子(Galon et al.，2006)。
MHC I类分子提呈主要为内源性的蛋白、DRIPS和较大肽裂解生成的肽。MHC II类分子主要发现于专业抗原提呈细胞(APC)上，并且主要提呈在内吞作用过程中由APC占据并且随后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽(Cresswell，1994)。肽和MHC I类分子的复合物由负载相应TCR(T细胞受体)的CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞进行识别，肽和MHC II类分子的复合物由负载相应TCR的CD4阳性辅助T细胞进行识别。本领域已熟知TCR、肽和MHC由此按1∶1∶1的化学计算量而存在。
CD4阳性辅助T细胞在诱导和维持CD8阳性细胞毒性T细胞的有效反应中发挥重要作用(Wang and Livingstone，2003；Sun and Bevan，2003；Shedlock and Shen，2003)。最初，CTL在淋巴结中的启动和扩展由CD4+T细胞支持(Schoenberger et al.，1998)。因此，一个机制可能引导幼稚CD8+细胞至功能性CD4+T细胞所在的地方-APC相互作用(Castellino et al.，2006)。最后，功能性CD8+记忆细胞的产生在大多数情况下依赖于CD4+T细胞的协助(Sun and Bevan，2003；Janssen et al.，2003)。由于这些原因，肿瘤相关抗原(TAA)衍生的CD4阳性T细胞表位的识别对开发能引发抗肿瘤免疫反应的药物产品可能非常重要(Kobayashi et al.，2002；Qin et al.，2003；Gnjatic et al.，2003)。在肿瘤部位，T辅助细胞维持着对CTL友好的细胞因子环境(Qin and Blankenstein，2000；Mortara et al.，2006)并吸引效应细胞，如CTL、NK细胞、巨噬细胞、粒细胞(Marzo etal.，2000；Hwang et al.，2007)。
在没有炎症的情况下，MHC II类分子的表达主要局限于免疫系统细胞，尤其是专业抗原提呈细胞(APC)，例如，单核细胞、单核细胞源性细胞、巨噬细胞、树突状细胞。出人意料的是，在癌症患者的肿瘤细胞中发现有MHC II类分子的表达(Dengjel et al.，2006)。
哺乳动物(如小鼠)模型显示，即使没有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应细胞(即，CD8阳性T淋巴细胞)，CD4阳性T细胞也能通过分泌干扰素-γ(IFNγ)抑制血管生成从而抑制肿瘤的显现(Qin and Blankenstein，2000)。另外，有人提出以细胞毒性CD4+T细胞通过淋巴毒素和颗粒酶B直接杀死肿瘤细胞(Penna et al.，1992；Littaua et al.，1992)。
此外，研究还显示，由于CD4阳性T细胞可从由HLA II类分子提呈的肿瘤相关抗原中识别出肽，因此能够通过诱导抗体(Ab)反应而阻止肿瘤进展(Kennedy et al.，2003)。
与结合至HLA I类分子的肿瘤相关肽相反，迄今只有少量的肿瘤相关抗原(TAA)的II类配体获得描述。
由于HLA II类分子的组成性表达通常仅限于免疫系统的细胞(Mach et al.，1996)，因此，直接从原发肿瘤中分离II类肽被认为是不可能的事。然而，Dengjel等人最近成功地在肿瘤中直接识别了多个MHC II类表位(WO 2007/028574，EP 1760088B1；(Dengjel et al.，2006)。
肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞所识别的抗原，即它们的表位，可以是源自所有蛋白类型的分子，如酶、受体、转录因子等，它们在相应肿瘤的细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达上调。
肿瘤相关抗原(TAA)的目前分类主要包括以下几组(Novellino et al.，2005)：
1.癌-睾丸抗原：T细胞能够识别的最先确认的TAA(van der Bruggen et al.，1991)属于这一类抗原，由于其成员表达于组织学相异的人肿瘤中、正常组织中、仅在睾丸的精母细胞/精原细胞中、偶尔在胎盘中，因此，它最初被称为癌-睾丸(CT)抗原。由于睾丸细胞不表达HLA I类和II类分子，所以，在正常组织中，这些抗原不能被T细胞识别，因此在免疫学上可考虑为具有肿瘤特异性。CT抗原大家熟知的例子是MAGE家族成员或NY-ESO-1。
2.分化抗原：肿瘤和正常组织(肿瘤源自该组织)都含有TAA，大多数TAA发现于黑色素瘤和正常黑色素细胞中。许多此类黑色素细胞谱系相关蛋白参与黑色素的生物合成，因此这些蛋白不具有肿瘤特异性，但是仍然被广泛用于癌症的免疫治疗。例子包括，但不仅限于，黑色素瘤的酪氨酸酶和Melan-A/MART-1或前列腺癌的PSA。
3.过度表达的TAA：在组织学相异的肿瘤中以及许多正常组织中都检测到了基因编码被广泛表达的TAA，一般表达水平较低。有可能许多由正常组织加工和潜在提呈的表位低于T细胞识别的阈值水平，而它们在肿瘤细胞中的过度表达能够通过打破先前确立的耐受性而引发抗癌反应。这类TAA的典型例子为Her-2/neu、生存素、端粒酶或WT1。
4.肿瘤特异性抗原：这些独特的TAA产生于正常基因(如β-catenin、CDK4等)的突变。这些分子变化中有一些与致瘤性转化和/或进展相关。肿瘤特异性抗原一般可在不对正常组织带来自体免疫反应风险的情况下诱导很强的免疫反应。另一方面，这些TAA在多数情况下只与其上确认了有TAA的确切肿瘤相关，并且通常在许多个体肿瘤之间并不都共享TAA。
5.由异常翻译后修饰产生的TAA：此类TAA可能由肿瘤中既不具有特异性也不过度表达的蛋白产生，但仍然通过主要对肿瘤具有活性的翻译后加工而具有肿瘤相关性。此类TAA产生于变糖基化模式的改变，导致肿瘤产生针对MUC1的新型表位或在降解过程中导致诸如蛋白拼接的事件，这可能具有也可能不具有肿瘤特异性(Hanada etal.，2004；Vigneron et al.，2004)。
6.肿瘤病毒蛋白：这些TTA是病毒蛋白，可在致癌过程中发挥关键作用，并且由于它们是外源蛋白(非人源蛋白)，所以能够激发T细胞反应。这类蛋白的例子有人乳头状瘤16型病毒蛋白、E6和E7，它们在宫颈癌中表达。
蛋白要被细胞毒性T淋巴细胞识别为具有肿瘤特异性抗原或相关性抗原并用于治疗，必须具备特殊的条件。该抗原应主要由肿瘤细胞表达，而不由正常健康组织表达，或表达数量相对较少。更为适宜的情况是，该相应抗原不仅出现于一种肿瘤中，而且浓度(即每个细胞的相应肽拷贝数目)高。肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原往往是源自直接参与因细胞周期控制或凋亡抑制中的一项功能而发生的正常细胞向肿瘤细胞转化的蛋白。另外，这些直接导致转化事件的蛋白的下游靶标也可能会被上调，因此可能与肿瘤间接相关。这些间接肿瘤相关抗原也可能是预防接种方法的靶标(Singh-Jasujaet al.，2004)。在这两种情况中，至关重要的是，都要存在抗原氨基酸序列的表位，所以这种来自肿瘤相关抗原的肽(“免疫原性肽”)可导致体外或体内T细胞反应。
基本上，任何能与MHC分子结合的肽都可能充当一个T细胞表位。诱导体外或体内T细胞反应的前提是存在具有相应TCR的T细胞并且不存在对该特定表位的免疫耐受性。
因此，TAA是开发肿瘤疫苗的起点。识别和表征TAA的方法基于对患者或健康受试者CTL的使用情况，或基于肿瘤与正常组织肽之间差别转录特性或差别表达模式的产生(Lemmel et al.，2004；Weinschenk et al.，2002)。
然而，对肿瘤组织或人肿瘤细胞株中过度表达或选择性表达的基因的识别并不提供在免疫疗法中使用这些基因所转录抗原的准确信息。这是因为，有着相应TCR的T细胞必须要存在而且对这个特定表位的免疫耐受性必须不存在或为最低水平，因此，这些抗原的表位只有一部分适合这种应用。因此，只选择那些蛋白过度表达或选择性表达的肽，并且这些肽是与可找到对抗性功能性T细胞的MHC分子结合在一起被提呈，这一点非常重要。这种功能性T细胞被定义为在以特异性抗原刺激后能够克隆地扩展并能够执行效应子功能(“效应子T细胞”)的T细胞。
辅助T细胞在编排抗肿瘤免疫的CTL效应子功能中发挥着重要作用。触发TH1细胞反应的辅助T细胞表位支持CD8阳性杀伤性T细胞的效应子功能，其中包括直接对抗在细胞表面显示肿瘤相关肽/MHC复合物的肿瘤细胞的细胞毒性功能。这样，肿瘤相关T辅助细胞表位单独使用或与其它肿瘤相关肽结合使用可作为刺激抗肿瘤免疫反应的疫苗化合物的活性药物成分。
由于CD8依赖型和CD4依赖型这两种反应共同并协同地促进抗肿瘤作用，因此，确定和表征由CD8+CTL(配体：MHC I类分子+肽表位)或CD4阳性T辅助细胞(配体：MHC II类分子)识别的肿瘤相关抗原对开发肿瘤疫苗非常重要。
考虑到治疗癌症相关的严重副作用和费用，迫切需要更好的预后和诊断方法。因此，有必要确定代表癌症生物标志物的其它因子，尤其是胶质母细胞瘤。此外，有必要确定可用于治疗癌症的因子，尤其是胶质母细胞瘤。
此外，还没有确立的治疗设计，可用于根治性前列腺切除术后生化性复发的前列腺患者，复发通常是由原发部位残留的肿瘤出现局部晚期肿瘤生长所致。需要会降低发病率且疗效与现有治疗方法相当的新型治疗方法。
本发明提出了有利于治疗胶质母细胞瘤、前列腺癌以及其它过度表达生存素的肿瘤的肽。这些肽由质谱分析法部分直接显示，由HLA分子在人原发性胶质母细胞瘤样本上自然提呈(请参见实施例1和图1)，或在SEQ ID 1和2的情况下，根据SYFPEITHI预测算法(Rammensee et al.，1995)预测为与HLA-DR等位基因HLA-DRB1*01、DRB1*03、DRB1*04、DRB1*11和DRB1*15结合(参见附件)的混杂结合剂。基于该数据和这些常出现的DRB1等位基因的出现频率(Mori et al.，1995；Chanock et al.，2004)，我们可以假设，92％的A*02阳性的白种人表达至少一种与这些肽结合的DRB1等位基因(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3)。SEQ ID NO：2含有与SEQ ID NO：1相同的核心序列，由自然生存素序列中的两个N-末端氨基酸拉长为包含生存素中所述I类T细胞的表位(Schmitz et al.，2000)。SEQ ID NO：3含有与SEQ IDNO：1相同的序列，其中最后一个C-端氨基酸由天冬酰胺(N)修饰为天冬氨酸(D)。
衍生SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3序列的源基因-生存素-显示，其与正常细胞相比，在胶质母细胞瘤、前列腺肿瘤、乳腺癌、食管癌、结直肠癌、透明细胞肾细胞癌、肺癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌、黑色素瘤(Tamm等，1998)、胰腺癌、鳞状细胞癌、白血病和髓母细胞瘤中呈高度过度表达(请参见实施例2和图2)，这表明该肽与肿瘤关联程度高，即这些肽在肿瘤组织上被强劲提呈，但不在正常组织上被提呈。
HLA结合肽能够被免疫系统识别，特别是T淋巴细胞/T细胞。T细胞能够破坏提呈被识别的HLA/肽复合物，如：提呈生存素衍生肽的胶质母细胞瘤肿瘤细胞(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3)。由生存素衍生肽激活的辅助T细胞能抑制肿瘤血管形成，能吸引免疫系统的效应子细胞并促进CTL的启动、增殖和持续的CD8+T细胞反应。
本发明的所有肽已被证明具有刺激T细胞反应的能力(参见实施例3和图3)。因此，该等肽可用于在患者中产生免疫反应，从而能够毁灭肿瘤细胞。患者的免疫反应能够通过直接给予患者所述肽或前体物质(如，加长肽、蛋白或编码这些肽的核酸)，较理想是与加强免疫原性的制剂相结合，而进行诱导。源自该治疗性疫苗的免疫反应预期能够高度特异性地对抗肿瘤细胞，因为本发明的目标肽在正常组织上提呈的复制数目较少，防止患者发生对抗正常细胞的不良自体免疫反应的风险。
药品组合物包括游离形式或以一种药用盐形式存在的肽。
此处使用的“药用盐”系指所公开的肽的一种衍生物，其中该肽由制酸或药剂的碱盐进行改性。例如，酸性盐采用自由基(通常其中药物的中性形式具有一种中性-NH2基团)通过与合适酸发生反应而制得。适合制备酸盐的酸包括有机酸，如：乙酸、丙酸、羟基酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水杨酸等等、以及无机酸，如：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一种肽上提呈的酸性基团的碱盐制剂使用药用碱基进行制备，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等等。
在特别优选的实施例中，药物组合物包括乙酸(醋酸盐)或盐酸(氯化物)形式的肽。
本发明的肽除了用于治疗癌症，也可用于诊断。由于肽由胶质母细胞瘤产生，并且已确定这些肽在正常组织中不存在，因此这些肽可用于诊断癌症是否存在。
组织切片中含权利要求的肽，可有助于病理师诊断癌症。用抗体、质谱或其它本领域内已知的方法检测某些肽可使病理师判断该组织为恶性的、炎症还是一般病变。肽基团的提呈使得能对病变组织进行分类或进一步分成子类。
对病变标本中肽的检测使得能对免疫系统治疗方法的利益进行判断，特别是如果T淋巴细胞已知或预计与作用机制有关。MHC表达的缺失是一种机制，充分说明了哪些受感染的恶性细胞逃避了免疫监视。因此，肽的提呈表明，分析过的细胞并没有利用这种机制。
肽可用于分析淋巴细胞对肽的反应(如T细胞反应)，或抗体对肽或MHC分子络合的肽发生的反应。这些淋巴细胞反应可以作为预后指标，决定是否采取进一步的治疗。这些反应也可以用作免疫疗法中的替代指标，旨在以不同方式诱导淋巴细胞反应，如接种蛋白疫苗、核酸、自体材料、淋巴细胞过继转移。基因治疗中，淋巴细胞对肽发生的反应可以在副作用的评估中考虑。淋巴细胞反应监测也可能成为移植疗法随访检查中的一种有价值的工具，如，用于检测移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。
肽可用于生成和开发出针对MHC/肽复合物的特定抗体。这些抗体可用于治疗，将毒素或放射性物质靶向病变组织。这些抗体的另一用途是为了成像之目的(如PET)将放射性核素靶向病变组织。这可有助于检测小转移灶或确定病变组织的大小和准确位置。
此外，可用这些TUMAP在活检样本的基础上验证病理师对癌症的诊断。
表3显示了根据本发明的肽、它们各自的SEQ ID NO、各个肽所结合的HLA等位基因，以及产生这些肽的源蛋白。具有特别利益的一个事实是，根据SEQ ID：2所述的肽与HLA-DR以及HLA-A*02结合，从而引发两种不同的反应。
表3：本发明中的肽
Figure BPA00001255738000221
在胎儿组织和各种人癌症组织中，BIRC5(生存素)-细胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的一员-表达升高，在成熟的正常分化组织中，尤其当其增殖指数低时，表达大大降低。生存素似乎具有同时调节细胞增殖和凋亡的能力。虽然生存素通常位于细胞胞质区内并与癌症预后较差有关，但是，也层有报告预示着有利预后(O′Drisco1l et al.，2003)的核局部化。几种机制已经描述了生存素的调控和通过生存素的调控。生存素似乎与分子伴侣Hsp60有关。在体内与相应的正常组织相比，Hsp60大量表达于人原发肿瘤中。小的干扰性RNA对Hsp60的急性消融扰乱了生存素的线粒体库，诱导线粒体功能障碍，并激活了半胱天冬酶依赖的细胞凋亡(Ghosh et al.，2008)。此外，对Ras的抑制在细胞凋亡后导致生存素释放“刹车”，并激活了线粒体凋亡通路。特别是在胶质母细胞瘤中，靶向生存素的Ras抑制剂可消除抗细胞凋亡作用(Blum et al.，2006)。胶质瘤中NF-κB过度活跃似乎与生存素(一种NF-κB靶基因)高表达之间具有相关性。因此，NF-κB激活的抗凋亡基因在肿瘤样本中呈高表达。特别是在胶质母细胞瘤中，可检测到非常高水平的生存素表达(Angileri et al.，2008)。这表明，生存素在脑胶质瘤中的过度表达可能在恶性增殖、抗凋亡和血管生成中起着重要作用(Zhen etal.，2005；Liu et al.，2006)。有人已经进行数次分析研究了生存素的表达及其对胶质母细胞瘤患者生存的影响。总之，与罹患生存素阴性肿瘤的患者相比，生存素的表达，尤其是在星形细胞瘤细胞核和细胞质中的同时表达，与恶性程度(在胶质母细胞瘤中生存素表达最高)和较短的总存活时间显著相关(Kajiwara et al.，2003；Saito et al.，2007；Uematsu et al.，2005；Mellai et al.，2008；Grunda et al.，2006；Xie et al.，2006；Sasaki et al.，2002；Chakravarti et al.，2002)。
对于其它肿瘤，也报告过生存素过度表达。在乳腺癌中，生存素表达与较高级别和较短的无病存活率相关(Yamashita et al.，2007；Al-Joudi et al.，2007；Span et al.，2004)。在食管癌细胞系中，生存素的启动子活性被证明高于正常组织的28.5倍(Sato et al.，2006)。在结直肠癌中，生存素表达也与病理分级和淋巴结转移相关(Tan et al.，2005)。对透明细胞肾细胞癌的侵袭性被证明与生存素的表达有关。此外，生存素的表达与特定癌症存活率呈反相关(Kosari et al.，2005)。生存素的表达在所有角化细胞肿瘤和高增殖细胞病灶中均可检测到，但在正常皮肤中检测不到(Bowen et al.，2004)。在胰腺癌细胞株中，检测的细胞株58％有生存素扩增(Mahlamaki et al.，2002)。在鳞状细胞癌中，生存素的表达可以帮助确定更具侵袭性和浸润性临床表型的病例(Lo et al.，2001)。
由于生存素是很有希望成为癌症治疗的一个目标，因此，使用生存素衍生肽的研究表明，生存素通过引发CD8+T细胞介导的反应而在肿瘤患者中具有免疫原性。此外，生存素特异性地刺激了取自相同患者的外周血淋巴细胞中的CD4+T细胞的反应性(Casati et al.，2003；Piesche et al.，2007)。
生存素(SVN、BIRC)在众多癌症中呈过度表达。因此，在一般情况下，生存素的过度表达被认为与较短的总体生存期和更高的恶性级别相关。
作为其研究的一部分，Piesche(2006)发现(也请参阅(Piesche et al.，2007))了生存素(SVN)和蛋白酶-3(PR3)中有MHC II类和HLA II类限制性候选表位，它们使用电脑程序TEPITOPE得到确定(Bian and Hammer，2004)。TEPITOPE分析产生了6个SVN候选表位和11个PR3候选表位，它们与各种HLA-DR等位基因有较高的结合概率。在合成和色谱纯化后，这17个肽在T细胞免疫实验中运用。表位重叠造成这些肽具有可变的长度，因为重叠的表位被认为同在一个肽内(表4)。
表4：Piesche 2006年发现的SVN合成肽的AA位置和AA序列。
Figure BPA00001255738000241
(注：S88实际上为S98，因此，Piesche等人在确定这个表位的位置时可能出现了错误)。
Piesche做了相应肽的滴定实验从而评价肽HLA的亲和力或肽HLA/TCR的亲合力。肽浓度越低，肽表位与MHC分子的结合亲和力越高，这是从蛋白抗原的细胞内加工中自然提呈“真正”T细胞表位的重要前提。S10的肽特异性T细胞克隆物的一半最大增殖活性为＜50nM，S40为400-700nM，S88为2000-3000nM，P58为100-300nM。Piesche还进一步发现，仅有SVN肽S10在与重组SVN蛋白接触的过程中引发特异性T细胞增殖。这表现在来自不同供体中的三个S10特异性T细胞克隆物中。Piesche等人用经SVN蛋白脉冲的DC通过共同培养肽特异性T细胞克隆物，研究了来自天然抗原的SVN肽表位的加工和提呈。仅有SVN肽S10可在与重组SVN蛋白接触的过程中引发特异性T细胞增殖。这表现在来自不同供体中的三个S10特异性T细胞克隆物中。对于PR3特异性T细胞克隆物，未检测到对自然抗原产生特异性增殖反应。
此外，来自细胞凋亡或坏死肿瘤细胞的肿瘤抗原由APC在体内进行内部化，由MHCII类分子进行独立加工并被提呈至CD4+T细胞。对于真正S10表位的T细胞识别，来自各种SVN阳性肿瘤细胞株并含有肿瘤细胞裂解物的DC经过了脉冲处理。对于S10表位，检测了来自肿瘤细胞株Karpas-422、Jurkat和HL-60的经裂解物脉冲的DC的直接体外识别。这表现在来自不同供体中的至少三个S10特异性T细胞克隆物中。
为了表明该表位S10可引发癌症患者免疫反应，必须确认肿瘤患者血液中存在相应的CD4+T细胞。对来自不同患者的PBMC进行分离并用S10肽进行刺激。为此，在开始治疗前和开始细胞毒静止治疗之后，从患者身上抽取PBMC样本，PBMC片段中所含的单核细胞和B细胞被用作抗原-/肽提呈细胞。经过一周培养，使用[3H]-胸腺嘧啶核苷渗入法分析这些细胞的肽特异性增殖作用。在检查的13例患者中，有3例检测到体外增殖反应。
在免疫疗法中可能使用的肽表位主要取决于肽特异性CD4+T淋巴细胞是否与相应的抗原反应。“真正的”或“真实的”表位形式的自然加工蛋白抗原的识别原则上受各种因素的影响。
Piesche证明了仅SVN表位S10可检测到蛋白质识别。对于其它已确认的肽(SVN：S40、S88；PR3：P58、P216、P235和P239)，均未检测到蛋白识别。Piesche等人提出，重要的是在胞内蛋白质水解期间，存在的序列模序体没有被降解，不像“隐秘”表位会被降解。相对于MHC I类限制性表位，MHC II类分子可接受可变长度肽(12-28)；因此，不需要肽表位的肽蛋白水解为规定长度。
出人意料的是，发明人在本发明中证明了另外一种表位，即来源于短于S88但也有重叠的生存素的SEQ ID NO：1在19名患者中有16位中引发了体外强免疫反应。(见实施例4)。由于HLA-DR位点的高度多态性，这也是所预测的肽SEQ ID NO：1的高度混杂结合的一个证据，因为免疫反应只能由结合至HLA分子的肽引发。
文献中对癌症实体生存素过度表达的重要性进行了描述，如表2所示。2007年，生存素过度表达为常见描述特征的癌症指征的死亡占41.5万例以上(见表1)。
Piesche等人(2006)在体外显示了，四例带有重叠HLA-DR等位基因的供体中，有三例存在肽S88的相应前体。这里，证据太小不足以推导出S88与HLA-DR的混杂性结合，因为所得的结果可解释为与两种不同的HLA-DR等位基因(如DR3和DR11，或DR1和DR3，或DR11和DR4)结合。此外，一项相当不具有特异性的增殖试验([3H]-胸腺嘧啶核苷渗入法)从整个PBMC培养物中所获的刺激指数相当低，并且缺少一个阳性对照(例如良好表征的、强免疫原性的病毒肽的混合物)和缺少相应的阴性对照(在增殖试验期间用无关对照肽进行刺激)。前体频率的数据没有用第二种检测方法进行证实。
其它发明，如WO 2007/036638(，，Wang et al“)公开了氨基酸序列的生存素肽。
96-110(LTLGEFLKLDRERAK；SEQ ID No 25)；
99-113(GEFLKLDRERAKNKI；SEQ ID No 26)；和
102-116(LKLDRERAKNKIAKE；SEQ ID No 27)。
描述了区域84至113为MHC II类以“良好”亲和力(IC50＜1000nM)与HLA分子结合的一个区域。然而，Wang等人研究的肽显示了与不同HLA分子的非常广泛的结合，并且如果该等肽的序列有一个或两个氨基酸发生转移，则在所述区域内的所述结合会有大幅的不同。
本发明的SEQ ID NO：3的肽(TLGEFLKLDRERAKD；“BIR-002a”肽)包括本发明的SEQ ID NO：1的BIR-002肽的一个序列，但在C-端的情况下，所述肽的末端为氨基酸天冬氨酸(D)而不是天冬酰胺(N)者。该肽与Piesche所述的肽S88重叠，后者包含最后3个氨基酸NKI。如上所述，S88肽在与重组SVN蛋白接触期间，特异性T细胞增殖测定法没有检测出活性。与此相反，BIR-002a肽显示了强大的MHC II类相关的免疫反应。如果不想要被理论束缚，可假设天冬酰胺通过天冬酰胺酶在体外酶转化成天冬氨酸，因此，C-端氨基酸被修饰(并且该肽变为激活和/或进一步激活)。由于Piesche肽S88的C-端天冬酰胺被两个氨基酸阻止，因此，所述肽没有活性(进一步显示了单一氨基酸改变对该肽活性的重要性)。
此外，有人指出，包含C-端天冬酰胺的其它肽的免疫反应和活性(如：SEQ ID NO：1)可能也依赖于C-端转化为氨基酸，特别是天冬氨酸。因此，本发明的一个方面，根据SEQ ID NO：1的肽可视为SEQ ID NO：3的一个“前体药物”，其在酶转化之后提供根据SEQ ID NO：的活性肽。应了解，本发明还包含了氨基酸的化学转化，尤其是天冬酰胺，以及通过丢失一个水分子的自发去酰胺。
此外，显示根据SEQ ID NO：1的肽的活性的例子也支持了根据SEQ ID NO：3的经修饰的肽的活性。
在本发明内容中可进一步发现，BIR-002肽区(区域84至113)内肽的溶解度与非常相似的肽有着非常大的不同。还必须注意到，Wang等人提出的位于BIR-002肽附近区域的肽实际上不可溶，并且无法对结合进行研究。
溶解度确定如下：
BIR-002(SEQ ID No：1)：＜32,9mg/mL(醋酸)
BIR-002a(SEQ ID No：3)(C-末端为D，而不是N)：＜23,5mg/mL
BIR-014(Wang提出的对比肽SEQ ID No.25)：＜99,5mg/mL
本发明的另一个方面涉及一种抗体，其特异性结合至与HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织相容性复合体(MHC)(以下也称为“复合物特异性抗体”)。此外，本发明的另一个方面涉及产生特异性结合至与HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织相容性复合体(MHC)的一种抗体的方法，该方法包括：用可溶形式的与HLA限制性抗原络合的(MHC)I或II类分子对包含表达所述主要组织相容性说复合体(MHC)I或II类的基因工程非人哺乳动物进行免疫；将mRNA分子与产生所述非人哺乳动物细胞的抗体分离；产生一个噬菌体显示库，显示由所述mRNA分子编码的蛋白分子；以及将至少一个噬菌体与所述噬菌体显示库分离，所述的至少一个噬菌体显示所述抗体可特异性地结合至与HLA限制性抗原络合的所述人主要组织相容性说复合体(MHC)I或II类。产生这种抗体和单链I类主要组织相容性复合物的相应方法，以及产生这些抗体的其它工具在WO 03/068201、WO 2004/084798、WO 01/72768、WO 03/070752以及Cohen CJ，Denkberg G，Lev A，Epel M，Reiter Y.Recombinant antibodies with MHC-restricted，peptide-specific，T-cell receptor-like specificity：new tools to study antigenpresentation and TCR-peptide-MHC interactions.J Mol Recognit.2003Sep-Oct；16(5)：324-32.；Denkberg G，Lev A，Eisenbach L，Benhar I，Reiter Y.Selective targeting of melanomaand APCs using a recombinant antibody with TCR-like  specificity directed toward amelanoma differentiation antigen.J Immunol.2003Sep 1；171(5)：2197-207；以及Cohen CJ，Sarig O，Yamano Y，Tomaru U，Jacobson S，Reiter Y.Direct phenotypic analysis of humanMHC class I antigen presentation：visualization，quantitation，and in situ detection of humanviral epitopes using peptide-specific，MHC-restricted human recombinant antibodies.JImmunol.2003Apr 15；170(8)：4349-61中进行了披露，为了本发明之目的，所有参考文献通过引用被完整地并入本文。
优选地，该抗体与复合体的结合亲和力低于20纳摩尔，优选为低于10纳摩尔，这在本发明情况下被视为具有“特异性”。
本文中术语“抗体”意义广泛，既包括多克隆也包括单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子，“抗体”这一术语还包括这些免疫球蛋白分子和人源化免疫球蛋白分子的片段或聚合物，只要它们表现出本文所述的任何期望属性(例如，以上所述的作为复合体特异性抗体、将毒素传递给癌症标志物基因表达水平增加的癌症细胞和/或抑制生存素等癌症标志物多肽的活性)。
只要有可能，本发明的抗体可从商业来源购买。本发明的抗体也可能使用已知的方法制得。技术人员会了解全长癌症标志物多肽或其片段可用于制备本发明的抗体。用于产生本发明抗体的多肽可部分或全部地由天然源经纯化而得，也可利用重组DNA技术生产。例如，编码生存素多肽的cDNA或其中一个片段，可在原核细胞中(如：细菌)或真核细胞(如：酵母、昆虫或哺乳动物细胞)中表达，之后，可纯化重组蛋白，并用于产生一种特异性结合用于产生该抗体的癌症标志物多肽的单克隆或多克隆抗体制剂。复合体特异性抗体通常按如上所述进行产生。
本领域的技术人员会明白，两种或两种以上不同集合的单克隆抗体或多克隆抗体能最大限度地增加获得一种含预期用途所需的特异性和亲和力(例如，ELISA法、免疫组织化学、体内成像、免疫毒素疗法)的抗体的可能性。根据抗体的用途，用已知的方法对其期望活性进行测试(例如，ELISA法、免疫组织化学、免疫治疗等；要获取产生和测试抗体的进一步指导，请参阅，例如，Harlow and Lane，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988)。例如，该抗体可用ELISA法、免疫印迹法、免疫组织化学染色福尔马林固定的癌症样本或冰冻的组织切片进行检测。在初次体外表征后，用于治疗或体内诊断用途的抗体根据已知的临床测试方法进行检测。
此处使用的术语“单克隆抗体”系指从大量同质抗体中获得的一种抗体，即，由相同的抗体组成的抗体群，但可能少量提呈的自然突变除外。此处所述的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与从特定物种中获得的抗体或属于特定抗体类型和分类型抗体的相应序列相同(同质)，同时，剩余链与从其它物种中获得的抗体或属于特定抗体类型和子类型抗体的相应序列以及这些抗体的片段相同(同质)，只要他们表现出预期的拮抗活性(美国4816567号专利)。
本发明的单克隆抗体可能使用杂交瘤方法制得。在杂交瘤方法中，老鼠或其它适当的宿主动物，通常用免疫制剂以引发产生或能产生将特异性结合至免疫制剂的抗体。或者，淋巴细胞可在体外进行免疫。
单克隆抗体也可由DNA重组方法制得，如：美国4816567号专利所述。编码本发明单克隆抗体的DNA可很容易地使用传统程序进行分离和测序(例如：通过使用能与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
体外方法也适用于制备单价抗体。抗体消化以产生抗体的片段，尤其是Fab片段，可以通过使用本领域已知的常规技术完成。例如，可以通过使用木瓜蛋白酶完成消化。木瓜蛋白酶消化的例子在1994年12月22日公布的WO 94/29348和美国4342566号专利中有描述。抗体的木瓜蛋白酶消化通常产生两种相同的抗原结合性片段，称为Fab片段(每个片段都有一个抗原结合点)和残余Fe片段。胃蛋白酶处理产生一个片段，它有两个抗原结合位点，并仍具有交联抗原的能力。
抗体片段，不论其是否附着于其它序列，均可包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、删除、替换、或其它选择性修饰，但前提是，片段的活性与非修饰的抗体或抗体片段相比没有显著的改变或损害。这些修饰可提供一些额外的属性，如：删除/添加可与二硫键结合的氨基酸，以增加其生物寿命、改变其分泌特性等。在任何情况下，抗体片段必须拥有生物活性的特性，如：结合活性、调节结合域的结合力等。抗体的功能性或活性区域可通过蛋白特定区域的基因突变、随后表达和测试所表达的多肽进行确定。这些方法为本行业技术人员所熟知，可包括编码抗体片段的核酸的特定位点基因突变。
本发明的抗体可进一步包括人源化抗体或人抗体。非人(如：鼠)抗体的人源化形式为嵌合抗体免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如：Fv、Fab、Fab′或抗体的其它抗原结合序列)，其中包含从非人免疫球蛋白中获得的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有与其特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠或兔子)CDR的残基取代。在某些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架(FR)残基被相应的非人残基取代。人源化抗体可能还包括既非受体抗体、也非输入CDR或框架序列中发现的残基。一般来说，人源化抗体将包括几乎所有的至少一个、通常为二个可变域，其中，全部或几乎全部的CDR区域均对应于非人免疫球蛋白的区域并且全部或几乎全部的FR区域均为人免疫球蛋白相同序列的区域。理想情况是，人源化抗体还将包括至少免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的一部分。
人源化非人抗体的方法为本行业所熟知。一般来说，人源化抗体具有一个或多个从非人源头引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基往往被称为“输入”残基，通常从“输入”可变域中获得。人源化基本上可以通过将啮齿动物CDR或CDR序列取代为相应的人抗体序列而完成。因此，这种“人源化”抗体为嵌合抗体(美国4816567号专利)，其中大大少于完整的人可变域被来自于非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常为人抗体，其中有些CDR残基以及可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代。
可使用免疫后在内源性免疫球蛋白产生缺失时能产生完整人抗体的转基因动物(如：小鼠)。例如，它被描述为，嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链连接区域基因的纯合性缺失导致内源性抗体生成的完全抑制。在此种系变种小鼠中人种系免疫球蛋白基因阵列的转移在抗原挑战后将导致人抗体的生成。人抗体也可在噬菌体展示库中生成为，例如，上述的复合体特异性抗体。
本发明的抗体优选为通过药用载体的形式给予受试者。通常，在制剂中使用适量的药用盐，以使制剂等渗。药用载体的例子包括生理盐水、林格氏液和葡萄糖溶液。溶液的pH值优选为约5至8，更优选为约7至7.5。此外，载体还包括缓释制剂，如：含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，其中基质为有形物品形式，如：薄膜、脂质体或微粒。本行业的技术人员熟知，某些载体可能为更优选，取决于例如，抗体的给药途径和浓度。
该抗体可通过注射(如：静脉内、腹腔内、皮下、肌肉内)或通过输注等其它方法给予受试者、患者或细胞，确保其以有效的形式传输到血液中。这些抗体也可以通过瘤内或瘤周途径给予，从而发挥局部和全身的治疗作用。局部或静脉注射为优选。
抗体给药的有效剂量和时间表可根据经验确定，并且作出此类决定属本行业的技术范围内。本行业的技术人员会明白，必须给予的抗体剂量根据以下因素会有所不同，例如：接受抗体的受试者、给药途径、使用的抗体以及其它正在使用的药物的特定类型。Antibodies in Human Diagnosis and Therapy，Haber et al，eds.Raven Press，New York(1977)pp.365-389。单独使用的抗体的通常日剂量可能为约1μg/kg至最多100mg/kg体重或更多，这取决于上述因素。给予抗体治疗癌症后，治疗抗体的疗效可通过技术人员熟知的不同方法评估。例如：接受治疗的受试者癌症的大小、数量和/或分布可使用标准肿瘤成像技术进行监测。因治疗而给予的抗体与不给予抗体时的病程相比，可阻止肿瘤生长、导致肿瘤缩小、和/或阻止新肿瘤的发展，这样的抗体是一种有效治疗癌症的抗体。
该抗体也可用于体内诊断实验。一般来说，抗体用放射性核素标记(如：111In、99Tc、14C、131I、3H、32P或35S)，从而可免疫闪烁扫描法使肿瘤局限化。在一实施例中，其中的抗体或片段与两个或两个以上癌症靶标的细胞外域结合，并且亲和力值(Kd)低于1x10μM。
诊断用抗体可通过各种影像学方法使用适合检测的探针进行标记。探针检测方法包括但不限于，荧光、光、共聚焦和电镜方法；磁共振成像和光谱学技术；透视、电脑断层扫描和正电子发射断层扫描。合适的探针包括但不限于，荧光素、罗丹明、曙红及其它荧光团、放射性同位素、黄金、钆和其它稀土、顺磁铁、氟-18和其它正电子发射放射性核素。此外，探针可能是双功能或多功能的，并且用一种以上的上述方法可进行检测。这些抗体可用所述的探针直接或间接进行标记。抗体探针的连接，包括探针的共价连接、将探针融合入抗体、以及螯合化合物的共价连接从而结合探针、以及其它本行业熟知的方法。对于免疫组织化学方法，疾病组织样本可能是新鲜或冷冻或可能包埋于石蜡中以及用福尔马林等防腐剂固定。固定或包埋的切片包括与标记一抗和二抗接触的样本，其中该抗体用于检测原位NCAN蛋白的表达。
因此，本发明提供一种肽，其包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的组的一个序列或该序列的与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3至少85％同源、优选为95％同源的变体，或该序列的可诱导T细胞与所述肽发生交叉反应的变体。
在治疗肾细胞癌的一个优选实施例中，SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2和/或SEQ IDNO：3的肽与SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：24中的至少两种肽联合使用。由此，SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的肽可单独给予或与其它肽一起以一个制剂的形式给予。
Figure BPA00001255738000321
WO 2007/028573中披露了上述肽和抗原的详细描述。
在治疗结肠癌的一个优选实施例中，SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的肽与SEQ ID NO：15至24、4、8，、11或12中的至少两种肽联合使用。由此，SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：3的肽可单独地给予或与其它肽一起以一个制剂的形式给予。
Figure BPA00001255738000331
EP07014796.2和US 60/953，161中披露了上述肽和抗原的详细描述。
本发明的肽具有与主要组织相容性复合体(MHC)I或II类分子结合的能力。
在本发明中，“同源性”一词系指两个氨基酸序列即肽或多肽序列之间的等同度。前文所述的“同源”是通过将两个序列在最优条件下在待比较序列之上进行对准而确定的。此处，待比较序列可能在两个序列的最佳对准中有增加或删除(例如，空隙等)。此类序列同源性可通过使用ClustalW等算法创建一个对准而进行计算(Nucleic Acid Res.，22(22)：46734680(1994)。也可用使用一般序列分析软件，更具体地说，是VectorNTI、GENETYX或由公共数据库提供的分析工具。
本领域技术人员能评估特定肽变体诱导的T细胞是否可与该肽本身发生交叉反应(Fonget al.，2001)；(Zaremba et al.，1997；Colombetti et al.，2006；Appay et al.，2006)。
发明人用给定氨基酸序列的“变体”表示，一个或多个氨基酸残基等的侧链通过被另一个天然氨基酸残基的侧链或其它侧链取代而发生改变，这样，这种肽仍然能够以含有给定氨基酸序列SEQ ID NO：1至24的肽大致同样的方式与HLA分子结合。例如，一种肽可能被修饰以便至少维持(如没有提高)其能与HLA-A*02或-DR等合适MHC分子的结合槽相互作用和结合，以及至少维持(如没有提高)其与激活CTL的TCR结合的能力。随后，这些CTL可与细胞和杀伤细胞发生交叉反应，这些细胞表达多肽(其中包含本发明中定义的同源肽的天然氨基酸序列)。正如科学文献(Rammensee etal.，1997)和数据库(Rammensee et al.，1999)中所述，HLA-A结合肽的某些位点通常为锚定残基，可形成一种与HLA结合槽的结合模序相称的核心序列，其定义由构成结合槽的多肽链的极性、电物理、疏水性和空间特性确定。因此，本领域技术人员能够通过保持已知的锚残基来修饰SEQ ID No：1至24提出的氨基酸序列，并且能确定这些变体是否保持与MHC I或II类分子结合的能力。本发明的变体保持与激活CTL的TCR结合的能力，随后，这些CTL可与表达一种包含本发明定义的同源肽的天然氨基酸序列的多肽的细胞发生交叉反应并杀死该等细胞。
这些基本不与T细胞受体互动的氨基酸残基可通过取代另一个几乎不影响T细胞反应并不妨碍与相关MHC结合的氨基酸而得到修饰。因此，除了特定限制性条件外，本发明的肽可能为任何包括给定氨基酸序列或部分或其变体的肽(发明人所用的这个术语包括寡肽或多肽)。
表5：根据SEQ IDNO：24所述的肽的变体和模序
Figure BPA00001255738000341
提呈MHC II类的肽更为大家熟知，这些肽由含有一个“核心序列”，该序列含有一种与某种HLA特异性模序相配的氨基酸序列，视情况还含有不干扰肽核心序列功能的N和/或C-端延伸区(即，它们被视为与肽和所有或部分能识别其天然配对物的T细胞克隆物之间的相互作用无关)。N-和/或C端可分别延伸1至10个氨基酸的长度。这些肽可直接用于加载MHC II类分子或其序列可克隆入下文所述载体。由于这些肽可在细胞内形成较大肽加工过程的最终产物，因此，也可用长肽。本发明的肽的大小不限，但通常它们的分子量可能小于100000，优选为小于50000，更优选为小于10000，通常约为5000。对于氨基酸残基数目，本发明中的肽可能少于1,000个残基，优选为少于500个残基，更优选为少于100个残基，最优选为30至8个残基。因此，本发明还提出了总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至16个(即8、9、10、11、12、13、14、15或16个)氨基酸的肽或变体。
对于MHC II类限制肽，MHC分子可能提呈具有相同核心序列的几个不同的肽。由于于识别T(辅助)细胞的相互作用由9至11个氨基酸的核心序列界定，因此几种长度变体可能由相同的T(辅助)细胞克隆物识别。因此，核心结合序列的几个不同长度变体可能用于MHC II类分子的直接加载而不需要在N-或C-端进行进一步的加工和修饰。相应地，诱导T细胞与本发明中的肽发生交叉反应的天然或人工变体往往为长度可变的变体。
如果长度约为12个氨基酸残基的肽直接与MHC II类分子结合，那么，侧翼有核心HLA结合区、且不会对该肽与MHC II类分子的结合槽特异性结合能力或该肽提呈至T(辅助)细胞的能力产生重大影响的残基则为优选。但是，正如上所述，应了解，可使用较大的肽(例如，核苷酸进行编码时)，因为这些较大的肽可被适当的抗原提呈细胞分成片段。然而，在相同的情况下，与具有相同核心序列的参考肽相比，其表明，核心序列侧翼区能影响该肽与MHC II类分子的结合或与两个方向均有TCR的二聚MHC肽复合体的相互作用。该肽内的分子内三级结构(如环形成)通常会降低对MHC或TCR的亲和力。肽结合槽旁有部分MHC或TCR的侧翼区之间的相互作用可稳定这种相互作用。亲和性的这些变化能够对诱导T(辅助)细胞反应的MHC II类肽的电位产生巨大影响。
MHC I类表位(通常长度为8至10个氨基酸)也可能由肽从较长的肽或包含实际表位的蛋白中加工而产生。两侧有实际表位的残基优选为在加工过程中几乎不影响暴露实际表位所需蛋白裂解的残基。
因此，本发明还提出了MHC I类表位的肽和变体，其中所述肽或抗体的总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至16个(即8、9、10、11、12、13、14、15或16个)氨基酸。
当然，本发明的肽或变体能与人主要组织相容性复合体(MHC)I或II类分子结合。肽或变体与MHC复合物的结合可用本领域内的已知方法进行测试，例如，文献中所述的检测不同MHC II类等位基因的方法(例如，Vogt et al.，1994；Malcherek et al.，1994；Manici et al.，1999；Hammer et al.，1995；Tompkins et al.，1993；Boyton et al.，1998)。
在本发明的一个特别优选实施例中，肽系由或基本系由根据SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：3的氨基酸序列构成。
根据本发明所述的肽也可由SEQ ID NO：1至3中所述氨基酸的连续伸展区组成，其中所述伸展是长度为8个氨基酸(例如：8、9、10、11、12、13、14、15或16)的肽的一部分，只要所述肽具有核心序列，使之在引发本文所述的免疫反应中发挥功能。
“基本由...构成”系指本发明的肽，除了根据SEQ ID No.1至SEQ ID No.3中的任一序列或其变体构成外，还含有位于其它N和/或C端延伸处的氨基酸，而它们不一定能形成作为MHC分子表位的肽。
但这些延伸区域对有效将本发明中的肽引进细胞具有重要作用。在本发明的一实施例中，肽为融合蛋白，含来自NCBI、GenBank登录号X00497的HLA-DR抗原相关不变链(p33，以下称为“Ii”链)的80个N-端氨基酸等(Strubin，M.et al 1984)。
进一步优选肽的实例包括：含有特异性HLA亚型、能够刺激CD8细胞的肽，其中所述肽包括特异性锚氨基酸模序，如下表6所示：
表6：根据SEQ ID NO：24所述的优选肽的HLA亚型和锚模序
此外，该肽或变体可进一步修饰以提高稳定性和/或与MHC分子结合，从而引发更强的免疫反应。肽序列的该类优化方法是本领域内所熟知的，包括，例如，反式肽键和非肽键的引入。
在反式肽键氨基酸中，肽(-CO-NH-)并未连接其残基，但是其肽键是反向的。这种逆向反向模拟肽(retro-inverso peptidomimetics)可通过本领域已知的方法制备，例如：Meziere等在《免疫学杂志》((1997)J.Immunol.159，3230-3237)中所述的方法，以引用的方式并入本文。这种方法涉及制备包含骨架(而并非侧链)改变的模拟肽。Meziere等人(1997年)的研究显示，这些模拟肽有利于MHC的结合和辅助性T细胞的反应。以NH-CO键替代CO-NH肽键的逆向反向肽大大地提高了抗水解性能。
非肽键为-CH2-NH、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-等。美国4897445号专利提出了多肽链中非肽键(-CH2-NH)的非固相合成法，该方法涉及按标准程序合成的多肽以及通过氨基醛和一种含NaCNBH3的氨基酸相互作用而合成的非肽键。
含上述序列的肽可与其氨基和/或羧基末端的其它化学基团进行合成，从而提高肽的稳定性、生物利用度、和/或亲和力等。例如，苄氧羰基、丹酰基等疏水基团或叔丁氧羰基团可加入肽的氨基末端。同样，乙酰基或9-芴甲氧羰基可能位于肽的氨基末端。此外，疏水基团、叔丁氧羰基团或氨基团都可能被加入肽的羧基末端。
另外，本发明中的所有肽都可能经合成而改变其空间构型。例如，可能使用这些肽的一个或多个氨基酸残基的右旋体，通常不是其左旋体。更进一步地，本发明中肽的至少一个氨基酸残基可被熟知的一个非天然氨基酸残基取代。诸如此类的改变可能有助于增加本发明肽的稳定性、生物利用度和/或结合作用。
同样，本发明中的肽或变体可在合成肽之前或之后通过特异氨基酸的反应而进行化学修饰。此类修饰的实施例为本领域所熟知，例如，在R.Lundblad所著的《ChemicalReagents for Protein Modification》(3rd ed.CRC Press，2005)中有概述，以参考文献的方式并入本文。虽然氨基酸的化学修饰方法无限制，但其包括(但不限于)通过以下方法修饰：酰基化、脒基化、赖氨酸吡哆基化、还原烷基化、以2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苯基化氨基团、通过将半胱氨酸过甲酸氧化为磺基丙氨酸而对羧基团和巯基进行氨基修饰、形成易变衍生物、与其它巯基化合物形成混合二硫化合物、与马来酰亚胺反应，与碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化、在碱性pH值下与氰酸盐甲氨酰化。在这方面，技术人员参考了《Current Protocols In Protein Science》(Eds.Coligan et al.(John Wiley&Sons NY 1995-2000))中第15章所述的在蛋白质化学修饰相关的广泛方法。
简言之，修饰蛋白质的精氨酰残基等往往基于于邻二羰基化合物(如苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮以及1，2-烯巳二酮)的反应而形成加合物。另一个实施例是丙酮醛与精氨酸残基的反应。半胱氨酸可在赖氨酸和组氨酸等亲核位点不作随同修饰的情况下就得到修饰。因此，有大量试剂可进行半胱氨酸的修饰。Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com)等公司的网站含有具体试剂的信息。
蛋白质中二硫键的选择性还原也很普遍。二硫键可在生物制药热处理中形成和氧化。
伍德沃德氏试剂K可用于修饰特定的谷氨酸残基。N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基-碳二亚胺可用于形成赖氨酸残基和谷氨酸残基的分子内交联。
例如：焦碳酸二乙酯是修饰蛋白质组氨酸残基的试剂。组氨酸也可使用4-羟基-2-壬烯醛进行修饰。
赖氨酸残基与其它α-氨基团的反应，例如，有利于肽结合到蛋白/肽的表面或交联处。赖氨酸聚是多(乙烯)乙二醇的附着点，也是蛋白质糖基化的主要修饰位点。蛋白质的蛋氨酸残基可通过碘乙酰胺、溴乙胺、氯胺T等被修饰。四硝基甲烷和N-乙酰基咪唑可用于酪氨酸残基的修饰。经二酪氨酸形成的交联可通过过氧化氢/铜离子完成。
对色氨酸修饰的最近研究中使用了N-溴代琥珀酰亚胺、2-羟基-5-硝基苄溴或3-溴-3-甲基-2-(2-硝苯巯基)-3H-吲哚(BPNS-粪臭素)。
当蛋白与戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯和甲醛的交联用于配制水凝胶时，治疗性蛋白和含聚乙二醇的肽的成功修饰往往可延长循环半衰期。针对免疫治疗的变态反应原化学修饰往往通过氰酸钾的氨基甲酰化实现。
一种肽或变体，其中肽被修饰或含非肽键，优选为本发明的实施例。一般来说，肽和变体(至少含氨基酸残基之间的肽联接)可使用Lu等人(1981年)以及此处列出的参考文献所披露的固相肽合成Fmoc-聚酰胺模式进行合成。芴甲氧羰基(Fmoc)团对N-氨基提供临时保护。使用N，N-二甲基甲酰胺中的20％二甲基哌啶中对这种碱高度敏感的保护基团进行重复分裂。由于它们的丁基醚(在丝氨酸苏氨酸和酪氨酸的情况下)、丁基酯(在谷氨酸和天门冬氨酸的情况下)、叔丁氧羰基衍生物(在赖氨酸和组氨酸的情况下)、三苯甲基衍生物(在半胱氨酸的情况下)及4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基衍生物(在精氨酸的情况下)，侧链功能可能会受到保护。只要谷氨酰胺和天冬酰胺为C-末端残基，侧链氨基功能保护所使用的是由4，4′-二甲氧基二苯基团。固相支撑基于聚二甲基丙烯酰胺聚合物，其由三个单体二甲基丙烯酰胺(骨架单体)、双丙烯酰乙烯二胺(交联剂)和N-丙烯酰肌胺酸甲酯(功能剂)构成。使用的肽-树脂联剂为酸敏感的4-羟甲基苯氧乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物均作为其预制对称酸酐衍生物加入，但是天冬酰胺和谷氨酰胺除外，它们使用被逆转的N，N-二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑介导的耦合程序而加入。所有的耦合和脱保护反应用茚三酮、硝基苯磺酸或isotin测试程序监测。合成完成后，用浓度为95％含50％清道夫混合物的三氟醋酸，从伴随去除侧链保护基团的树脂支承物中裂解肽。常用的清道夫混合物包括乙二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，准确的选择依据合成肽的氨基酸组成。此外，固相和液相方法结合使用对肽进行合成是可能的(例如，请参阅Bruckdorfer等人(2004)所用的方法以及本文引用的参考文献)。
三氟乙酸用真空中蒸发、随后用承载粗肽的二乙基乙醚滴定进行去除。用简单萃取程序(水相冻干后，该程序制得不含清道夫混合物的肽)清除任何存在的清道夫混合物。肽合成试剂一般可从Calbiochem-Novabiochem(英国)公司(NG72QJ，英国)获得。
纯化可通过以下技术的任何一种或组合方法进行，如：再结晶法、体积排阻色谱法、离子交换色谱法、疏水作用色谱法以及(通常)反相高效液相色谱法(如使用乙腈/水梯度分离)。
肽分析可使用以下方法进行：薄层色谱法、电泳法、特别是，毛细管电泳法、固相萃取法(CSPE)、反相高效液相色谱法、酸水解后的氨基酸分析、快原子轰击(FAB)质谱分析法以及MALDI、ESI-Q-TOF质谱分析法。
另一方面，本发明提出了一种编码本发明中肽或肽变体的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可能为，例如，DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA或其组合物，它们可为单链和/或双链、或多聚核苷酸的原生或稳定形式(如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸)，并且只要它编码肽，就可能包含也可能不包含内含子。当然，多聚核苷酸只能编码加入天然肽键并含有天然氨基酸残基的肽。另一个方面，本发明提出了一种可根据本发明表达多肽的表达载体。
对于连接多核苷酸，已经开发出多种方法，尤其是针对DNA，可通过向载体补充可连接性末端等方法进行连接。例如，可向DNA片段加入补充性均聚物轨道，之后DNA片段被插入到载体DNA。然后，通过补充性均聚物尾巴的氢键结合，将载体和DNA片段结合，从而形成重组DNA分子。
含有一个或多个酶切位点的合成接头为DNA片段与载体连接提供了另一种方法。含各种限制性核酸内切酶的合成接头可通过多种渠道购得，其中包括从国际生物技术公司(International Biotechnologies Inc，New Haven，CN，美国)购得。
编码本发明多肽的DNA理想修饰方法是利用Saiki等人(1988年)所采用的聚合酶链反应方法。此方法可用于将DNA引入合适的载体(例如，通过设计合适的酶切位点)，也可用于本领域已知的其它有用方法修饰DNA。如果使用病毒载体，痘病毒载体或腺病毒载体为优选。
之后，DNA(或在逆转录病毒载体情况下，RNA)可能表达于合适的宿主，从而制成含本发明肽或变体的多肽。因此，可根据已知技术使用编码本发明肽或变体的DNA，用本文所述方法适当修饰后，构建表达载体，然后表达载体用于转化合适宿主细胞，从而表达和产生本发明中的多肽。这些方法包括下列美国专利中披露的方法：4,440,859、4,530,901、4,582,800、4,677,063、4,678,751、4,704,362、4,710,463、4,757,006、4,766,075和4,810,648。
编码含本发明化合物多肽的DNA(或在逆转录病毒载体情况下，RNA)可能被加入到其它多种DNA序列，从而引入到合适的宿主中。同伴DNA将取决于宿主的性质、DNA引入宿主的方式、以及是否需要保持为游离体还是要相互结合。
一般来说，DNA可以适当的方向和正确的表达阅读框架附着到一种表达载体(如质粒)中。如有必要，该DNA可能与所需宿主所识别的相应转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，尽管表达载体中一般存在此类控制功能。然后，该载体通过标准方法被引入宿主。一般来说，并不是所有的宿主都会被载体转化。因此，有必要选择转化过的宿主细胞。选择方法包括用任何必要的控制元素向表达载体插入一个DNA序列，该序列对转化细胞中的可选择性属性(如抗生素耐药性)进行编码。
另外，有这种选择属性的基因可在另外一个载体上，该载体用来协同转化所需的宿主细胞。然后，本发明中的重组DNA所转化的宿主细胞在本文中所述本领域技术人员熟悉的合适条件下培养足够长的时间，从而表达之后可回收的肽。
有许多已知的表达系统，包括细菌(如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、酵母(如酵母菌)、丝状真菌(如曲霉菌)、植物细胞、动物细胞及昆虫细胞。该系统可优选为哺乳动物细胞，如来自ATCC细胞生物学库(Cell Biology Collection)中的CHO细胞。典型的哺乳动物细胞组成型表达载体质粒包括CMV或含一个合适的多聚A尾巴的SV40启动子以及抗性标志物(如新霉素)。一个实例为从Pharmacia公司(Piscataway，新泽西，美国)获得的pSVL。一种可诱导型哺乳动物表达载体的例子是pMSG，也可以从Pharmacia公司获得。有用的酵母质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，一般可从Stratagene Cloning Systems公司(La Jolla，CA 92037，美国)获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合型质粒(YIp)，并插入了酵母可选择性标记物HIS3、TRP1、LEU2和URA3。pRS413-416质粒为酵母着丝粒质粒(Ycp)。基于CMV启动子的载体(如，来自于Sigma-Aldrich公司)提供了瞬时或稳定的表达、胞浆表达或分泌，以及FLAG、3xFLAG、c-myc或MATN不同组合物中的N-端或C-端标记。这些融合蛋白可用于检测、纯化及分析重组蛋白。双标融合为检测提供了灵活性。
强劲的人巨细胞病毒(CMV)启动子调控区使得COS细胞中的组成蛋白表达水平高达1mg/L。对于较弱的细胞株，蛋白水平一般低于0.1mg/L。SV40复制原点的出现将导致DNA在SV40复制容纳性COS细胞中高水平复制。例如，CMV载体可包含细菌细胞中的pMB1(pBR322的衍生物)复制原点、细菌中进行氨苄青霉素抗性选育的β-内酰胺酶基因、hGH polyA和f1的原点。含前胰岛素原引导(PPT)序列的载体可使用抗FLAG抗体、树脂和板引导FLAG融合蛋白分泌到进行纯化的培养基中。其它与各种宿主细胞一起应用的载体和表达系统是本领域熟知众所周知的。
本发明还涉及一种宿主细胞，其以本发明的多核苷酸载体构建转化而来。宿主细胞可为原核细胞，也可为真核细胞。在有些情况下，细菌细胞为优选原核宿主细胞，典型为大肠杆菌株，例如，大肠杆菌菌株DH5(从Bethesda Research Laboratories公司(Bethesda，MD，美国)获得)和RR1(从美国菌种保藏中心(ATCC，Rockville，MD，美国)，ATCC编号31343获得)。首选的真核宿主细胞包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选为脊椎动物细胞，如：小鼠、大鼠、猴子或人成纤维细胞和结肠癌细胞株中的细胞。酵母宿主细胞包括YPH499、YPH500和YPH501，一般可从StratageneCloning Systems公司(La Jolla，CA 92037，美国)获得。首选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为ATCC中的CCL61细胞、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3为ATCC中的CRL 1658细胞、猴肾源性COS-1细胞为ATCC中的CRL 1650细胞以及人胚胎肾细胞的293号细胞。首选昆虫细胞为Sf9细胞，可用杆状病毒表达载体转染。有关针对表达选择合适宿主细胞的概要，可从教科书(Paulina Balbás and ArgeliaLorence“Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression，Reviews andProtocols”，Part One，Second Edition，ISBN 978-1-58829-262-9)和本领域技术人员知道的其它文献中查到。
含本发明DNA结构的适当宿主细胞的转化可使用大家熟知的方法完成，通常取决于使用载体的类型。对于原核宿主细胞的转化，可参阅，如：Cohen等人(1972)在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1972，69，2110中以及Sambrook等人(1989)所著《MolecularCloning，A Laboratory Manual》Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY中使用的方法。酵母细胞的转化在Sherman等人(1986)在Methods In Yeast Genetics，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY中有描述。Beggs，Beggs(1978)Nature275，104-109中所述方法也很有用。对于脊椎动物细胞，转染这些细胞的试剂等，例如，磷酸钙和DEAE-葡聚糖或脂质体配方，可从Stratagene Cloning Systems公司或Life Technologies公司(Gaithersburg，MD 20877，美国)获得。电穿孔也可用于转化和/或转染细胞，是本领域用于转化酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞和脊椎动物细胞大家熟知的方法。
被成功转化的细胞(即含本发明DNA结构的细胞)可用大家熟知的方法(如PCR)进行识别。另外，上清液存在的蛋白可使用抗体进行检测。
应了解，本发明中的某些宿主细胞用于制备本发明中的肽，例如细菌细胞、酵母细胞和昆虫细胞。但是，其它宿主细胞可能对某些治疗方法有用。例如，抗原提呈细胞(如树突状细胞)可用于表达本发明中的肽，使他们可以加载入相应的MHC分子中。因此，本发明提出了含本发明中核酸或表达载体的一种宿主细胞。
在一个优选实施例中，宿主细胞为抗原提呈细胞，尤其是树突状细胞或抗原提呈细胞。目前，载有含前列腺酸性磷酸酶(PAP)的重组融合蛋白正在针对用于治疗前列腺癌(Sipuleucel-T)进行研究(Small EJ et al 2006；Rini et al 2006)。
另一方面，本发明提出了一种配制一种肽及其变体的方法，该方法包括培养宿主细胞和从宿主细胞或其培养基中分离肽。
在另一个实施例中，本发明中的肽、核酸或表达载体用于药物中。例如，肽或其变体可制备为静脉(i.v.)注射剂、皮下(s.c.)注射剂、皮内(i.d.)注射剂、腹腔(i.p.)注射剂、肌肉(i.m.)注射剂。肽注射的优选方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的优选方法为i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如，给予50μg至1.5mg，优选为125μg至500μg的肽或DNA，这取决于具体的肽或DNA。上述剂量范围在以前的试验中成功使用(Brunsvig et al 2006；Staehler et al 2007)。
本发明的另一方面包括一种体外制备激活的T细胞的方法，该方法包括将T细胞与载有抗原的人I或II类MHC分子进行体外连接，这些分子在合适的抗原提呈细胞表面表达足够的一段时间从而以抗原特异性方式激活T细胞，其中所述抗原为根据本发明所述的一种肽。优选情况是，足够量的抗原与抗原提呈细胞一同使用。
当MHC II类表位用作一种抗原时，T细胞为CD4阳性辅助细胞，优选为TH1型。MHC II类分子可表达于任何合适细胞的表面。优选为不自然表达MHC II类分子的细胞(在这种情况下，转染细胞表达此类分子)。或者，如果该细胞自然表达MHC II类分子，则优选情况是该细胞在抗原加工或抗原提呈途径中有缺陷。这样，表达MHCII类分子的细胞有可能在激活T细胞之前就完全载入选定肽抗原。
抗原提呈细胞(或刺激因子细胞)通常在其表面有一个MHC II类分子，优选为其本身基本上不能以选定抗原加载所述MHC II类分子。MHC II类分子可很容易在体外载入选定抗原。
优选情况是，哺乳动物细胞的TAP肽转运载体缺乏或水平下降或功能降低。缺乏TAP肽转运载体的适合细胞包括T2、RMA-S和果蝇细胞。TAP表示转运载体相关的抗原加工。
人体肽载入的缺陷细胞株T2从属美国菌种保藏中心(ATCC，12301Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，美国)目录号CRL1992；果蝇细胞株Schneider 2号株从属ATCC目录CRL 19863；小鼠RMA-S细胞株Karre等人在1985年描述过。
优选情况是，宿主细胞在转染前基本上不表达MHC I类分子。刺激因子细胞还优选为表达对T细胞共刺激信号起到重要作用的分子，如，B7.1、B7.2、ICAM-1和LFA 3中的任一种分子。大量MHC II类分子和共刺激分子的核酸序列可从GenBank和EMBL数据库中公开获得。
同样，当MHC I类表位用作一种抗原时，T细胞为CD8阳性CTL。
如果抗原提呈细胞受到转染而表达这种表位，则优选的细胞包括一个表达载体，该载体有能力表达含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的肽或其变体氨基酸序列。
可使用其它一些方法来体外生成CTL。例如，可使用Peoples等人(1995)描述的方法和Kawakami等人(1992)使用自体肿瘤浸润性淋巴细胞生成CTL的方法。Plebanski等人在(1995)使用自体外周血淋巴细胞(PLB)制得CTL。Jochmus等人(1997)描述了用肽或多肽脉冲处理树突状细胞或通过与重组病毒感染而制成自体CTL。Hill等人(1995)和Jerome等人(1993)使用B细胞制成自体CTL。此外，用肽或多肽脉冲处理或用重组病毒感染的巨噬细胞可用于配制自体CTL。Walter等人在2003年描述了通过使用人工抗原提呈细胞(aAPC)体外启动T细胞，这也是生成作用于所选肽的T细胞的一种合适方法。在这项研究中，根据生物素：链霉素生物化学方法通过将预制的MHC：肽复合物耦合到聚苯乙烯颗粒(微球)而生成aAPC。该系统实现了对aAPC上的MHC密度进行精确调节，这使得可以在血液样本中选择地引发高或低亲合力的高效抗原特异性T细胞反应。除了MHC：肽复合物外，aAPC还应携运含共刺激活性的其它蛋白，如耦合至表面的抗-CD28抗体。此外，此类基于aAPC的系统往往需要加入适当的可溶性因子，例如，诸如白细胞介素-12的细胞因子。
也可用同种异体细胞制得T细胞，在WO 97/26328中详细描述了一种方法，以参考文献方式并入本文。例如，除了果蝇细胞和T2细胞，也可用其它细胞来提呈肽，如CHO细胞、杆状病毒感染的昆虫细胞、细菌、酵母、牛痘感染的靶细胞。此外，也可使用植物病毒(例如，参阅Porta等人(1994)描述了将豇豆花叶病毒开发为一种提呈外来肽的高产系统。
被激活的T细胞直接针对本发明中的肽，有助于治疗。因此，本发明的另一方面提出了用本发明前述方法制得的激活T细胞。按上述方法制成的激活T细胞将会有选择性地识别异常表达含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽的一种细胞。
优选情况是，T细胞通过与其含HLA/肽复合物的TCR相互作用(如，结合)而识别该细胞。T细胞是杀伤患者靶细胞方法中有用的细胞，其靶细胞异常表达含本发明中氨基酸序列的多肽。此类患者给予有效量的激活T细胞。给予患者的T细胞可能源自该患者，并按上述方法激活(即，它们为自体T细胞)。或者，T细胞不是源自该患者，而是来自另一个人。当然，优选情况是该供体为健康人。发明人使用健康人摂系指一个人一般状况良好，优选为免疫系统合格，更优选为无任何可很容易测试或检测到的疾病。
根据本发明，CD4阳性T细胞的体内靶细胞可为肿瘤细胞(有时表达MHC II类抗原)和/或肿瘤周围的基质细胞(肿瘤细胞)(有时也表达MHC II类抗原；(Dengje1 etal.，2006))。
本发明所述的T细胞可用作治疗性组合物中的活性成分。因此，本发明也提出了一种杀伤患者靶细胞的方法，其中患者的靶细胞异常表达含本发明中氨基酸序列的多肽，该方法包括给予患者上述有效量的T细胞。
发明人所用的“异常表达”的意思还包括，与正常表达水平相比，多肽过度表达，或该基因在源自肿瘤的组织中未表达，但是在该肿瘤中却表达。“过度表达”系指多肽水平至少为正常组织中的1.2倍；优选为至少为正常组织中的2倍，更优选为至少5或10倍。
T细胞可用本领域已知的方法制得(如，上述方法)。T细胞继转移方案为本领域所熟知的方案并可在以下参考文献中找到，例如：(Rosenberg et al.，1987；Rosenberg et al.，1988；Dudley et al.，2002；Yee et al.，2002；Dudley et al.，2005)；综述(Gattinoni et al.，2006)和(Morgan et al.，2006)。
本发明的任一分子(即肽、核酸、表达载体、细胞，激活CTL、T细胞受体或编码核酸)都有益于治疗疾病，其特点在于细胞逃避免疫反应的打击。因此，本发明的任一分子都可用作药剂或用于制造药剂。这种分子可单独使用也可与本发明中的其它分子或已知分子联合使用。
本发明中所述的药剂优选为一种疫苗。该疫苗可直接给到患者的受影响器官，也可i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射方式全身给药，或体外应用到来自患者或其细胞株的细胞(随后再将这些细胞注入到患者中)，或体外用于从来自患者的免疫细胞的一个细胞亚群(然后再将细胞重新给予患者)。如果核酸体外注入细胞，可能有益于细胞转染，以共同表达免疫刺激细胞因子(如白细胞介素-2)。肽可完全单独给药，也可与免疫刺激佐剂相结合(见下文)、或与免疫刺激细胞因子联合使用、或以适当的输送系统给药(例如脂质体)。该肽也可共轭形成一种合适的载体(如钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)或甘露)到合适的载体(参阅WO 95/18145及Longenecker等人(1993))。该肽也可进行标记、或可能是一种融合蛋白或是杂合分子。本发明中给出肽序列的肽预期会刺激CD4或CD8T细胞。但是，有CD4T辅助细胞提供帮助时，对CD8CTL的刺激更为有效。因此，对于刺激CD8CTL的MHC I类表位，一种杂合分子的融合伙伴或片段提供了刺激CD4阳性T细胞的适当表位。CD4-和CD8刺激表位为本领域所熟知、并包括本发明中确定的表位。
一方面，疫苗包括至少含有SEQ ID NO：1、2或3中提出的一种肽以及至少另外一种肽，优选为2至50个、更优选为2至25个、再优选为2至15个、最优选为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个肽。肽可能从一个或多个特定TAA中衍生，并且可能与MHC I类和/或II类分子结合。优选情况是，至少有一个其它肽具有SEQIDNO：4至24中提出的氨基酸序列。
多聚核苷酸可为基本纯化形式，也可包被于载体或输送系统。核酸可能为DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA，也可能为其组合物。这种核酸的设计和引入方法为本领域所熟知。例如，下列文献中有其概述：Pascolo S.2006；Stan R.2006或A Mahdavi2006。多核苷酸疫苗很容易制备，但这些载体诱导免疫反应的作用模式尚未彻底了解。合适的载体和输送系统包括病毒DNA和/或RNA，如基于腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺相关病毒或含一种以上病毒元素的混合病毒的系统。非病毒输送系统包括阳离子脂质体和阳离子聚合物，是DNA输送所属领域内熟知的系统。也可使用物理输送系统，如通过“基因枪”。肽或核酸编码的肽可以是一种融合蛋白，例如，含刺激T细胞进行上述CDR的表位。
本发明的药剂也可能包括一种或多种佐剂。佐剂是那些非特异性地增强或加强免疫反应的物质(例如，通过CTL和辅助T(TH)细胞介导的对一种抗原的免疫应答，因此被视为对本发明的药剂有用。适合的佐剂包括(但不仅限于)1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870，893、CPG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生的TLR5配体、FLT3配体、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特(ALDARA)、ImuFact IMP321、白细胞介素IL-2、IL-13、IL-21、干扰素α或β或其聚乙二醇衍生物、IS Patch、IS S、ISCOMATRIX、ISCOMs、JuvImmune、LipoVac、MALP2、MF59、单磷酰脂A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、水包油和油包水乳状液、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、载体系统、PLG和做旋糖苷微粒、resiquimod、SRL172、病毒颗粒和其它病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支杆菌提取物和细菌细胞壁合成模拟物的Aquila公司的QS21刺激子，以及其它专有佐剂，如：Ribi′s Detox。优选佐剂如：弗氏佐剂或GM-CSF。前人对一些树突状细胞特异性免疫佐剂(如MF59)及其制备方法进行了描述(Dupuis M et al 1998；Allison 1998)。也可使用细胞因子。一些细胞因子直接影响树突状细胞向淋巴组织迁移(如，TNF-)，加速树突状细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原提呈细胞(如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国5849589号专利，特别以其完整引用形式并入本文)，并充当免疫佐剂(如IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α、IFN-β)(Gabrilovich et al1996)。
据报告，CpG免疫刺激寡核苷酸可提高佐剂在疫苗中的作用。如果没有理论的约束，CpG寡核苷酸可通过Toll样受体(TLR)(主要为TLR9)激活先天(非适应性)免疫系统从而起作用。CpG引发的TLR9活化作用提高了对各种抗原的抗原特异性体液和细胞反应，这些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被杀死的病毒、树突状细胞疫苗、自体细胞疫苗以及预防性和治疗性疫苗中的多糖结合物。更重要的是，它会增强树突状细胞的成熟和分化，导致TH1细胞的活化增强以及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成加强，甚至CD4T细胞帮助的缺失。甚至有疫苗佐剂的存在也能维持TLR9活化作用诱发的TH1偏移，这些佐剂如：正常促进TH2偏移的明矾或弗氏不完全佐剂(IFA)。CpG寡核苷酸与以下其它佐剂或配方一起制备或联合给药时，表现出更强的佐剂活性，如微粒、纳米粒子、脂肪乳或类似制剂，当抗原相对较弱时，这些对诱发强反应尤为必要。他们还能加速免疫反应，使抗原剂量减少约两个数量级，在有些实验中，对不含CpG的全剂量疫苗也能产生类似的抗体反应(Krieg et al 2006)。美国6406705B1号专利对CpG寡核苷酸、非核酸佐剂和抗原结合使用促使抗原特异性免疫反应进行了描述。一种CpG TLR9拮抗剂为Mologen公司(德国柏林)的dSLIM(双干环免疫调节剂)，这是本发明药物组合物的优选成分。也可使用其它如TLR结合分子，如：RNA结合TLR7、TLR8和/或TLR9。
其它有用的佐剂例子包括(但不限于)化学修饰性CpG(如CpR、Idera)、dsRNA模拟物，如，Poly(I∶C)和AmpliGen、非CpG细菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗体，如：环磷酰胺、舒尼替单抗、贝伐单抗、西乐葆、NCX-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、替莫唑胺、temsirolimus、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、VEGF Trap、ZD2171、AZD2171、抗-CTLA4和SC58175，这些药物都可能有治疗作用和/或充当佐剂。技术人员无需过度进行不当实验就很容易确定本发明中有用的佐剂和添加剂的数量和浓度。优选佐剂为dSLIM、干扰素-α、干扰素-β、CPG7909、IC31、ALDARA(咪喹莫特)、PeviTer、RNA、他达拉非，替莫唑胺和JuvImmune。
本发明提供了一种用于治疗癌症、特别是神经胶质瘤和脑癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、肾癌、胰腺癌、皮肤鳞状细胞癌和角化细胞肿瘤、白血病、肺癌、卵巢癌和黑色素瘤的药剂。
本发明的一个试剂盒套件包括：(a)一个容器，包含上述溶液或冻干粉形式的药物组合物；(b)可选项，第二个容器，含冻干粉剂型的稀释剂或重组溶液；及(c)可选项，(i)使用溶液或(ii)重组和/或使用冻干粉剂型的说明书。
该套件还步包括一个或多个(iii)缓冲剂，(iv)稀释剂，(v)过滤液，(vi)针，或(v)注射器。容器优选为瓶子、西林瓶、注射器或试管；也可为多用途容器。药物组合优选为冻干粉剂。
本发明中的套件优选包含一种置于合适容器中的冻干制剂以及重组和/或使用说明。适当的容器包括，例如瓶子、西林瓶(如双室瓶)、注射器(如双室注射器)和试管。该容器可能由多种材料制成，如玻璃或塑料。优选情况是，套件和/或容器上有说明，表明重组和/或使用的指示。例如，标签可能表明冻干剂型重组为上述肽浓度。该标签可进一步表明制剂用于皮下注射。
存放制剂的容器可使用多用途西林瓶，使得可重复给予(例如，2至6次)重组剂型。该套件可进一步包括装有合适稀释剂(如碳酸氢钠溶液)的第二个容器。稀释液和冻干制剂混合后，重组制剂中的肽终浓度优选为至少0.15mg/mL/肽(＝75μg)，不超过3mg/mL/肽(＝1500μg)。该套件还可包括商业和用户角度来说可取的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂，过滤液、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。
本发明中的套件可能有一个单独的容器，其中包含本发明所述的药物组合物制剂，该制剂可有其它成分(例如，其它化合物或及其药物组合物)，也可无其它成分，或者每种成分都有其不同容器。
优选情况是，本发明的套件包括与本发明的一种制剂，包装后与第二种化合物(如佐剂(例如GM-CSF)、化疗药物、天然产品、激素或拮抗剂、抗血管生成剂或抑制剂、凋亡诱导剂或螯合剂)或其药物组合物联合使用。该套件的成分可进行预络合或每种成分在给予患者之前可放置于单独的不同容器。该套件的成分可以是一种或多种溶液，优选为水溶液，更优选为无菌水溶液。该套件的成分也可为固体形式，加入合适的溶剂后转换为液体，最好放置于另一个不同的容器中。
治疗套件的容器可能为西林瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器、或任何其它盛装固体或液体的工具。通常，当成分不只一种时，套件将包含第二个西林瓶或其它容器，使之可以单独定量。该套件还可能包含另一个装载药用液体的容器。优选情况是，治疗套件将包含一个设备(如，一个或多个针头、注射器、滴眼器、吸液管等)，使得可注射本发明的药物(本套件的组合物)。
本发明的药物配方适合以任何可接受的途径进行肽给药，如口服(肠道)、鼻内、眼内、皮下、皮内、肌内，静脉或经皮给药。优选为皮下给药，最优选为皮内给药，也可通过输液泵给药。
下列描述优选方案的实施例将对本发明进行说明(但是不仅限于此)。为了本发明之目的，所有参考文献均以完整引用的形式并入本文。在图和序列表中
附图简要说明
图1显示了电喷雾-液相色谱质谱确定来自胶质母细胞瘤样本GB1006的肿瘤相关肽NCAN-001。
图2描述了编码胶质母细胞瘤相关肽NCAN-001的基因NCAN的mRNA表达谱。该基因在正常组织中不表达或表达很低，而在胶质母细胞瘤样本(GB1006T至GB1011T；NCH359T和NCH361T)中表达量大大增加。
图3描述了基因BIRC 5的相关mRNA表达谱。该基因在正常组织中不表达或表达很低，而在肿瘤样本中表达量大大增加。
图4a和4b描述了外周血单核细胞(PBMC)中PSMA和生存素特异性IFN-分泌CD4+T细胞的提呈，它们于不同时间点取自使用IFN-EliSpot检测的免疫患者中。
时间点：疫苗接种前(a)以及疫苗接种后3.(b)、6.(c)、7.(d)、8.(e)、9.(f)、10.(g)、11.(h)。
图5显示了PBMC中生存素特异性IFN-、IL-5、IL-10、TNFα-分泌CD4+T细胞的提呈，它们于不同时间点取自使用ICS-Assay检测的免疫患者中。时间点：疫苗接种后1.(a)、3.(b)、7.(c)。
图6显示了8和10号患者中的生化反应，表明PSA稳定，与基线PSA相比，上升的幅度不超过10％。
图7显示了11和16号患者中的生化反应，表明PSA DT升高，PSA不稳定。
图8显示了5号患者中的生化反应，表明PSA DT升高，PSA不稳定。
图9显示了1、4、10、12和13号患者中的生化反应，表明在疫苗接种期间PSA DT无改变。
图10显示了2、6、9、14、18和19号患者中的生化反应，表明在疫苗接种期间PSADT无改变。
图11显示了7、15和17号患者中的生化反应，表明PSA暂时下降或DT上升，之后DT下降。
图12显示了前列腺癌疫苗接种研究中，BIR-002-肽特异性CD4+T细胞克隆物可通过几位接种疫苗后的患者建立，这些患者具有产生IFN-γ以对Bir-002产生反应的功能。Wang等人于2008年描述了仅经过几轮体外启动和刺激后就从健康供体中获得了T细胞，同时出现的T细胞可以通过接种疫苗在患者中诱导。PMA/离子霉素＝抗原非依赖型非特异性活化；生存素(II)：BIR-002刺激；PSMA(II)：用不相关肽进行刺激。所有反应细胞均呈CD4阳性。
图13显示了BIR-002由树突状细胞自然提呈。以重组生存素蛋白培养的未成熟树突状细胞由来自免疫患者并用细胞内细胞因子染色显示的BIR-002特异性T细胞识别。这些结果表明，BIR-002由蛋白酶在树突状细胞内自然加工，并且加工不破坏Bir-002表位。此外，这些CD4+T细胞具有多种功能，因为它们分泌细胞因子IFN-γ、TNF-(α和IL-2，表面表达CD40配体(CD154)，并且表面表达CD107a提示脱颗粒。提示的T细胞反应具有抗原特异性，因为用不相关蛋白RAP80或HIV-001肽培养的树突状细胞不激活T细胞。
图14显示了从接受BIR-002接种的前列腺癌患者中获得的大部分BIR-002-特异性CD4+T细胞均表达有益的细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2，而免疫调节细胞因子IL-10和IL-17的表达没有达到这种程度。显示的内容为从BIR-002特异性T细胞或两种对照II类限制肽的细胞内细胞因子染色获得的主要数据和总结数据。
图15显示了几种表达不同HLA-DR等位基因的肿瘤细胞系由源自患者的PBMC识别(患者Pro26和Pro15)。因此：1.患者在接受BIR-002接种后出现多克隆T细胞反应；2.BIR-002显示了与几种HLA II类等位基因的混杂结合：DR1(也请参阅Wang等人)、DQ5(Wang等人未检测)、DR11(也请参阅Wang等人)或DRB3(对比Wang等人，2008年，表1)；3.在几种HLA II类分子的环境下，BIR-002也可能出现功能性提呈(产生TNF-α)。至于HLA(HLA-A、-B和C)原则上也可发现在细胞表面表达功能性II类分子的II类HLA的3种不同基因位点，即HLA-DQ、HLA-DP和HLA-DR。I类分子由一个重链(-A、-B、-C)和一个在所有三种基因中不变的β-2-微球蛋白组成。但是，II类分子由两个可变链(α和β)中的任一个组成。因此，成熟的基因分型总是有II类分子。表中提出了血清类型，其基于抗体结合情况。因此，例如：“DQ3”包括HLA-DQ α和β链的不同等位基因，它们一般在一起并与特定的抗体反应。表中的细胞如下：
Figure BPA00001255738000531
SEQ ID No 1至SEQ ID No 3显示了本发明从生存素中获得的肿瘤相关肽的序列。
SEQ ID No 4至SEQ ID No 13和SEQ ID No 24显示了本发明所用的其它肿瘤相关肽的序列。
SEQ ID No 14显示了HBV肽的序列。
SEQ ID No 15至SEQ ID No 23显示了本发明所用的其它肿瘤相关肽的序列。
SEQ ID No 25至SEQ ID No 27显示了Wang等人所述的相关肽的序列。(WO2007/036638)。
SEQ ID No 28至SEQ ID No 33显示了Piesche所述的肿瘤相关肽的序列。
SEQ IDNo 34至SEQ IDNo 63显示了实施例3中指定的肽的序列。
SEQ ID No 64至SEQ ID No 65显示了实施例4中所用的肽的序列。
SEQ ID No 66至SEQ ID No 72显示了实施例5中所用的肽的序列。
实施例
实施例1：
细胞表面提呈的肿瘤相关肽的识别
组织样本
患者肿瘤组织和健康组织由
Figure BPA00001255738000541
Cantonal Universitaire de Genève(医学肿瘤学(肿瘤免疫学)实验室)和Neurochirurgische
Figure BPA00001255738000542
Heidelberg(Molekularbiologisches Labor)提供。所有患者在手术前都获得了书面知情同意。手术后立即用液态氮对组织进行冷休克处理，在分离肽前储存于-80℃下。
从组织样本中分离HLA肽
根据方案(Falk，K.et al1991；Seeger，F.H.et al.T 1999)略加修改，使用HLA-A*02特异性抗体BB7.2或HLA-A、-B、-C特异性抗体W6/32、CNBr活化的琼脂糖凝胶、酸处理和超滤方法以固体组织的免疫沉淀法获得了冷休克组织样本的HLA肽库。
方法二：
获得的HLA肽库根据其疏水性用反相色谱(Acquity UPLC system，Waters)分离，洗脱肽用装有电喷雾源的LTQ-Orbitrap杂交质谱(ThermoElectron)进行了分析。肽库被直接载入填充有1.7μm C18反相材料(Waters)的分析用熔炼石英微毛细管柱(75μm内径x 250mm)，应用流速为400nL每分钟。随后，使用来自流速为300nL每分钟、浓度为10％至33％溶剂B中的两步180分钟二元梯度法对肽进行分离。梯度由溶剂A(含0.1％甲酸的水)和溶剂B(含0.1％甲酸的乙腈)。金镀膜玻璃毛细管(PicoTip，New Objective)用于引入到微电喷雾源。使用前5(TOP5)策略在数据依赖模式下操作LTQ-Orbitrap质谱仪。简言之，首先以高精确质量完全扫描在orbitrap开始一个扫描周期(R＝30000)，之后用先前选定离子的动态排除技术在orbitrap中对5种含量最为丰富的前体离子进行MS/MS扫描(R＝7500)。串联质谱以SEQUEST和另一种手动控制器进行解读。生成的自然肽破碎模式与合成序列相同参考肽的破碎模式进行比较后，确保了被识别的肽序列。图1显示了从肿瘤组织中获得的MHC II类相关肽NCAN-001的一个典型谱。
实施例2：
编码本发明肽的基因的表达谱
并不是所有确定为由MHC分子提呈于肿瘤细胞表面的肽都适合用于免疫治疗，这是因为这些肽大部分都由许多类型细胞表达的正常细胞蛋白衍生而来。这些肽只有很少一部分具有肿瘤相关性，并可能能够诱导对其来源肿瘤识别有高特异性的T细胞。为了确定这些肽并最大限度地降低这些肽接种所诱导的自身免疫风险，发明人主要采用从过度表达于肿瘤细胞上(与大多数正常组织相比)的蛋白中所获得的肽。
理想的肽来源于对该肿瘤独一无二且不出现于其它组织中的蛋白中。为了确定具有与理想基因相似表达谱的基因所产生的肽，确定的肽被分别分配到蛋白和基因中，从中获得基因并生成这些基因的表达谱。
RNA来源与制备
手术切除组织标本由两个不同的临床中心(参见实施例1)在获得每名患者的书面知情同意后提供。手术后立即在液态氮中速冻肿瘤组织标本，之后在液态氮中用杵臼匀浆。使用TRIzol(Invitrogen公司，Karlsruhe，德国)之后用RNeasy(QIAGEN公司，Hilden，德国)清理从这些样本中制备总RNA；这两种方法都根据制造商的方案进行。
健康人体组织中的总RNA从商业途径获得(Ambion公司，Huntingdon，英国；Clontech公司，海德堡，德国；Stratagene公司，阿姆斯特丹，荷兰；BioChain公司，Hayward，CA，美国)。混合数个人(2至123个人)的RNA，从而使每个人的RNA得到等加权。白细胞从4个健康志愿者的血液样本中分离获得。
所有RNA样本的质量和数量都在Agilent 2100Bioanalyzer分析仪(Agilent公司，Waldbronn，德国)上使用RNA 6000Pico LabChip Kit试剂盒(Agilent公司)进行评估。
微阵列实验
所有肿瘤和正常组织的RNA样本都使用Affymetrix Human Genome(HG)U133A或HG-U133Plus 2.0Affymetrix寡核苷酸芯片(Affymetrix公司，Santa Clara，CA，美国)进行基因表达分析。所有步骤都根据Affymetrix手册进行。简言之，如手册中所述，使用SuperScript RTII(Invitrogen公司)以及oligo-dT-T7引物(MWG Biotech公司，Ebersberg，德国)从5-8μgRNA中合成双链cDNA。用BioArray High Yield RNATranscript Labelling Kit(ENZO Diagnostics公司，Farmingdale，NY，美国)进行U133A测定或用GeneChip IVT Labelling Kit(Affymetrix公司)进行U133Plus 2.0测定，之后用链霉亲和素-藻红蛋白和生物素化抗链霉素蛋白抗体(Molecular Probes公司，Leiden，荷兰)进行破碎、杂交和染色，这样完成体外转录。用Agilent 2500AGeneArray Scanner(U133A)或Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000(U133Plus 2.0)对图像进行扫描，用GCOS软件(Affymetrix公司)在所有参数默认设置情况下对数据进行分析。为了实现标准化，使用了Affymetrix公司提供的100种管家基因(housekeeping gene)。相对表达值用软件给定的signal log ratio进行计算，正常样本的值任意设置为1.0。
本发明NCAN-001肽的源基因NCAN的表达谱显示，该基因在胶质母细胞瘤肿瘤组织中呈高表达，而在正常组织中不表达或表达很低(图2)。
实施例3：
来自生存素的HLA-DR模序肽(swissprot：O15392)
表位预测：使用了www database SYFPEITHI对潜在HLA-DR配体进行了预测。简单来说，针对基质模式，对生存素的序列进行了筛查，这种模式在拟合各个HLA-DR模序的15mer肽的九聚物核心序列内评估了每个氨基酸。锚残基的规定价高达10；其它残基的价高达3，反映了肽内的某些位置氨基酸肽的偏好。候选肽价的理论最高分值为28至43不等；丰富的天然配体的分值通常高于20。
TLGEFLKLDRERAKN(SEQ ID No.1)(或截断版本)在6次预测值中位于前5位的分值中均出现。
DRB1*01(最高理论分值为43)
58FFCFKELEGWEPDDD(SEQ ID No.34)            36
98LGEFLKLDRERAKNK(SEQ ID No.35)            28
22FKNWPFLEGCACTPE(SEQ ID No.36)            28
DRB1*03(最高理论分值为40)
99GEFLKLDRERAKNKI(SEQ ID No.37)            29
10WQPFLKDHRISTFKN(SEQ ID No.38)            26
3APTLPPAWQPFLKDH(SEQ ID No.39)             25
DRB1*04(最高理论分值为28)
98LGEFLKLDRERAKNK(SEQ ID No.40)            28
10WQPFLKDHRISTFKN(SEQ ID No.41)            28
3APTLPPAWQPFLKDH(SEQ ID No.42)             26
DRB1*07(最高理论分值为34)
121KKEFEETAEKVRRAI(SEQ ID No.43)           24
128AEKVRRAIEQLAAMD(SEQ ID No.44)           24
3APTLPPAWQPFLKDH(SEQ ID No.45)             22
16DHRISTFKNWPFLEG(SEQ ID No.46)            20
28LEGCACTPERMAEAG(SEQ ID No.47)            18
40EAGFIHCPTENEPDL(SEQ ID No.48)            18
93FEELTLGEFLKLDRE(SEQ ID No.49)            16
103KLDRERAKNKIAKET(SEQ ID No.50)           16
DRB1*11(最高理论分值为38)
98LGEFLKLDRERAKNK(SEQ ID No.51)            32
83GCAFLSVKKQFEELT(SEQ ID No.52)            24
58FFCFKELEGWEPDDD(SEQ ID No.53)            22
DRB1*15(最高理论分值为34)
95ELTLGEFLKLDRERA(SEQ ID No.54)            30
19ISTFKNWPFLEGCAC(SEQ ID No.55)            28
55AQCFFCFKELEGWEP(SEQ ID No.56)            28
对序列作出决定的步骤
1.对于每种肽，HLA-DR结合需要9mer核心序列。预计的核心序列：
DRB1*01FLKLDRERA(SEQ ID No.57)
DRB1*03LKLDRERAK(SEQ ID No.58)
DRB1*04FLKLDRERA(SEQ ID No.59)
DRB1*11FLKLDRERA(SEQ ID No.60)
DRB1*15LGEFLKLDR(SEQ ID No.61)
2.将核心序列结合以获得一个混杂核心序列：
结合：LGEFLKLDRERAK(SEQ ID No.62)
3.将侧翼序列加至最终长度为15个氨基酸：
最终：TLGEFLKLDRERAK(SEQ ID No.63)
实施例4：
进行临床研究中以确认含有SEQ ID NO：1的肽的免疫原性。主要研究目标是：在未检测到明确的转移病灶且前列腺癌根治术后出现生物化学复发的患者中，对皮下注射前列腺特异性肽(接种疗法)的基于PSA(前列腺特异抗原)的反应(PSA-R)。
次要研究目标是：在患有特别考虑为T细胞反应相关的免疫现象的前列腺癌患者中，研究给予接种疗法的耐受性和可行性。
该研究设计为前瞻性、随机I/II期研究，适应症为“未检测到明确的转移病灶且前列腺癌根治术后出现生物化学复发”。
研究人群
作为本I/II期研究的一部分，我们试图通过在前列腺癌根治术后出现生物化学复发的HLA-A*02+患者中接种前列腺特异性肽从而诱导PSA衰退作为肿瘤生长停止的指标。前列腺特异性肽的组合物经皮下注射，并在抗原性结构的各种给药方式下评估各自的免疫反应程度。
相对于以前的疫苗接种研究，本研究计划的目标是治疗肿瘤负荷小且影像学程序不能检测出的患者。所有的患者都使用已知的前列腺特异性抗原结构的同样方式进行免疫，以增强对恶性转化细胞的免疫反应。-19例患者接受了治疗。
表7：研究人群
  总共   ％   中位数   范围
  年龄   19   63   55-77
  在新/辅助治疗之前
  无   11   58
  放疗   3   16
  间歇性荷尔蒙疗法   2   11
  放疗+间歇性荷尔蒙疗法   2   11
  放疗+化疗   1   5
  RPXTNM分期
  T2a-cR0   6   32
  T3a-cR0   6   32
  T2a-cR1   3   16
  T3a-cR1   3   16
  T3aN2R0   1   5
  Gleason评分
  5-7   10   53
  8-10   3   16
  未知   6   32
  接种前RPX月数   41   9-124
  OP后首次复发月数   14   1-90
  开始接种时的PSA   0.76   0.14-10.8
治疗时间表
在使用电脑断层扫描和骨骼显像排除明显的转移病灶后，根据不同的给药方式将前列腺特异性肽疫苗皮下注射至在前列腺根治术后检测到PSA复发的患者中(PSA在至少14天间隔的两次测量中上升了50％)。该疫苗在每8天的倍数给予，即第0、7、14、28、42和56天给予(每个肽以及每次注射量约为100微克)。每次接种治疗以及在第70天，测定PSA以评估治疗反应。
如果检测到了肿瘤反应(完全缓解[PSA-CR]、部分缓解[PSA-PR]、或病程稳定[无变化，PSA-NC])，则接受了疫苗的患者根据所选择的给药方式每月维持一次。对患者的免疫治疗反应进行了评估，详细如下：
完全缓解(PSA-CR)：在间隔至少4周后测量确定：最初升高的PSA水平正常化。正常化定义为PSA最低值＜0.2ng/ml，这是完全摘除肿瘤或前列腺的前列腺癌根治术后的预期值。
部分缓解：a)PSA-PR≤80％(在间隔至少4周后测量确定最初升高的PSA水平下降80％)；以及b)PSA-PR≤50％(在间隔至少4周后测量确定最初升高的PSA水平下降50％。)
病情稳定(PSA-SD)：在至少四周后无显著变化。这包括在间隔至少4周后测量确定具有稳定性以及下降小于50％、升高小于10％。
进展(PSA-PD)：PSA水平上升超过10％。如果PSA进展，则终止研究。
在本研究患者注册后，使用表位特异性疫苗；考虑在前列腺上皮细胞(如：PSMA/PSCA)中特异性表达的蛋白。除了研究注射疫苗的一般疗效(PSA监测方法评估的残留肿瘤生长分数)，本研究还研究了各种接种方法的效果(免疫系统的有效调制)。除了单独皮下注射根据发明所述的肽之外，还使用了佐剂的各种组合物。该疫苗包括了分别从PSA、PSCA、PSMA、生存素、TRP-P8和Prostein获得的至少6种肽的组合物。从流感MP获得的肽作为阳性对照物使用。从PSMA和生存素中获得的肽用于T辅助表位。特别是，用了Montanide(适合用于人身上的一个经典的不完全弗氏佐剂)肽疫苗的长效和辅助活性，最近其被描述为十分有利。为此，500μl肽溶液以500μl Montanide混合，之后给药。因此，制成油水乳剂，在数周内缓慢释放水相中所含的抗原。该乳剂的物理稳定性非常高，可在4℃的环境下储存3个月以上，并且无明显相位分离。Montanide的长效功能数个疫苗接种试验中得到了使用，并且获得良好效果(Oka et al.，2004)。
有一个研究组研究了以生长因子、GM-CSF、
Figure BPA00001255738000611
注射液伴随刺激期间的接种疗效。GM-CSF是肽接种试验中非常常用的一种佐剂，这些研究中有几个研究报告提高了临床及T细胞反应。最初，GM-CSF为树突状细胞招募和分化因子，被认为可增加疫苗注射部位的树突状细胞的数量。虽然GM-CSF不能自身激活抗原，将细胞提呈为树突状细胞和巨噬细胞，但是有体内间接激活的报道(Molenkamp et al.，2005)。
另一个研究组研究了经上皮细胞使用咪喹莫特伴随活化树突状细胞期间接种的疗效。咪喹莫特以5％软膏(Aldara)给予。它通过对TLR7阳性细胞(如：浆细胞样DC、朗格汉斯细胞、皮肤DC)的作用而具有强免疫刺激性，激活MyD88依赖性途径。被激活的APC释放T细胞刺激性和炎症细胞因子，上调共刺激和迁移到引流淋巴结。通过将抗原混合至软膏或通过向皮下或皮内注射抗原部位应用Aldara，从而使咪喹莫特有可能加强肽诱导的CTL反应，这已经在动物模型中得到证明。
另一个研究组通过将树突状细胞与鱼精蛋白稳定的mRNA编码粘蛋白-1混合以将其伴随激活以活化TLR 7/8，该组研究了在所述伴随激活期间接种的疗效。mRNA显示了小鼠和人免疫细胞群的广泛激活。该制剂中聚碱性蛋白鱼精蛋白的存在提高了mRNA的半衰期并诱导了可能长效粒子的形成。因此，这种佐剂可与长效特性和APC激活特性结合。
总之，该疫苗的给予方式包括以下方法：
a)Montanide乳化肽疫苗的皮下注射；
b)500μl Montanide中乳化肽疫苗的皮下注射联合外用225μl GM-CSF，以期达到伴随生长因子给药所引发的更强的免疫反应；
c)500μl Montanide中乳化肽疫苗的皮下注射联合局部热疗，后者的目的是达到热诱导的更强的免疫反应；
d)500μl Montanide中乳化肽疫苗的皮下注射联合经上皮给予咪喹莫特，以通过TLR 7激活树突状细胞；
d)500μl Montanide中乳化肽疫苗与55μl粘蛋白-1mRNA/鱼精蛋白一起皮下注射，以通过TLR 7/8激活树突状细胞。
时间表
本研究为期3年。前列腺特异性肽疫苗在第0、7、14、28、42和56天给予患者。对于病情稳定或获得客观肿瘤反应(PSA-CR或PSA-PR)的患者，每月皮内注射接种一次疫苗直到发生可检测到的进展。根据迄今为止的经验，肽注射液可耐受且没有明显不良反应。由于对接种疗法的反应仅根据PSA测量进行了血清学评估，因此，在研究开始时进行一项测试以确定注射的疫苗是否干扰体外的PSA测量值，这可刺激临床反应。在第0、7、14、28、42、56和70天，抽取血液样本做化验、PSA水平、血细胞分类计数、FACS分析和细胞因子测试。如果连续治疗到第70天，则进行为期6周的PSA监测，以便及时发现治疗失败。
如果疾病进展得到证明且伴有PSA持续升高，则结束治疗。
从第84天开始，继续运用免疫疗法，间隔时间为4周，直到发生可证明的进展或至第420天(第15个月)。在本研究外继续治疗(在成功病例中)的决定在逐个病例的基础上作出。本研究未发生意料之外的不良反应。
该实验室测试包括凝血、电解质、LDH、β2-M、CK、肝酶、胆红素、肌酐、尿酸、总蛋白、CRP、涂片血细胞分类计数、PSA水平、细胞因子、FACS、Elispot。
皮肤对定义细菌和真菌抗原的反应(注射48-72小时后，T细胞介导的迟发型超敏反应(DTH))的分析在本研究开始前将作为患者细胞免疫系统的分析。
研究所需的肽(九肽)由PD Dr.Stefan Stevanovic实验室在Prof.H.-G.Rammensee部制造。这些肽用HPLC法进行纯化并进行质谱分析。这些肽的纯度也可用HPLC、质谱和Edman测序法进行检查。使用这些方法，纯度可高达98％(根据当前方法的状态必须视为最高值)。所合成的肽溶于DMSO(CryoSure，WAK Chemie MedicalGmbH；10mg/ml)中，在Ampuwa(Fresenius Kabi)中稀释为1∶10，并在无菌条件下分成等份。
临床反应
在两名患者中，在连续直肠指检发现局部肿瘤后，PET-CT扫描可显示局部复发。在其余的17名患者中，在终止研究时，无法证实疾病活跃部位。
血细胞分类计数或大量临床化学的的重复实验室评估未发现研究期间有任何异常。
在这19例患者中，有16例对根据SEQ ID NO：1所述的生存素II肽(IFN-g ELISPOT，+/-ICS)发生反应。其中，有12名患者在疫苗接种后，诱导了抗生存素T细胞反应。有2名患者之前存在抗T细胞以及2名患者未确定之前是否存在丰富的抗生存素T细胞。
生化反应
根据PSA初次升高后合作实验室最低可检测值，完全反应被视为不可检测的PSA值。测量值必须在至少间隔4周后确认。PR＞80％和＞50％必须在四周后做相应的重新评估。PSA下降小于50％或升高小于10％反映了病情稳定(如果在至少四周后确认)。疾病进展被视为在治疗开始时PSA上升超过10％。
终止研究的患者的生化反应得到跟踪，直到他们获得了放射或抗荷尔蒙疗法的进一步治疗。19例患者同意参加并且对数据进行了分析，随访最长为时约3.75年。
PSA稳定性和DT升高
根据上述生化反应的标准：治疗开始时PSA值上升不超过10％，2例(10.2％)患者在研究结束时PSA值表现出稳定性(图6，表8、9、10)。在最后一次注射疫苗后的14和16月分别对上述两名病例进行了随访。在数据截止时，稳定的平均时间为24个月(28和31个月)，平均接种了18(14和20)次疫苗。
在这两个患者中，1例患者显示部分反应＞50％的时间为9个月，之后，一段时间PSA缓慢上升，时间为20.5个月，是疫苗接种之前9.8个月的2倍。初始PSA在pT2pN0Gleason 5肿瘤手术后18个月开始复发。
分析数据发现，8号患者自28个月前接种计划开始以来病情稳定。在第10个月以及第14次疫苗接种后因过敏反应而停止了治疗。他存在不利的pT3b Gleason 3+4情况，在前列腺癌根治术后PSA值不低于0.6ng/ml，在术后首次下降后PSA很快进展。倍增时间从6.6个月减缓至148个月。
这两名患者在每次接种肽疫苗时都在给药部位皮下注射咪喹莫特(图9、10和11，表13)。
PSA DT升高，PSA不稳定
第11号患者的PSADT在研究的六个月期间从1.5个月上升至10.1个月。开始时他的PSA值为10.8ng/ml，在终止研究程序接受抗雄激素单一疗法时，进展至17.8ng/ml，但PET-CT未发现可见的恶性病变。他接受了Aldara作为佐剂。
第16号患者开始进入疫苗治疗+粘蛋白-1-mRNA/鱼精蛋白，倍增时间为6.1个月间。五个月期间的PSA速率下降至半衰期为2.7个月，之后，PSA DT经统计学计算为上升14.4个月，且在治疗后持续16个月。最初PSA为0.29ng/ml，在治疗期间的前5个月内下降至0.19ng/ml，在以后的8个月内上升至0.4ng/ml，在治疗开始19个月后按研究方案终止研究时，为0.41ng/ml(图7，表8和10)。
PSA进展
根据接种疫苗前估计的PSA倍增时间，第5号患者在研究期间出现了进展。但是，截止数据显示，在治疗结束继续10个月后，他的PSA值下降，半衰期为20.2个月。他在接种疫苗结束后仍未接受任何二次治疗。他接受了montanide疫苗注射作为唯一的佐剂(图8、表13)。
表8：按月计算的PSA倍增时间
Figure BPA00001255738000641
*研究结束或随访结束时的PSA DT未纳入患者数据。5由于PSA下降
表9：与基线PSA相比PSA稳定性上升的幅度不超过10％
Figure BPA00001255738000642
Figure BPA00001255738000651
表10：几个月接种期间内PSA DT永久上升
Figure BPA00001255738000652
表11：几个月接种期间内PSA DT无变化，但之后下降
表12：PSA DT暂时下降/稳定数个月之后加速上升
Figure BPA00001255738000654
表13：佐剂和患者反应无PSA反应(-)、PSA暂时下降并且之后加速上升(+/-)、PSADT上升(+)
Figure BPA00001255738000661
合成
肽使用Abimed制造完全自动EPS 221肽合成器进行合成。合成计划遵循制造商的标准方案。在可能范围内，每种肽的试剂批号均注册。
加工成原料肽
通过剥离合成树脂并用TFA/酚/乙烷二硫/茴香硫醚/水(体积百分比分别为90/3.75/1.25/2.5/2.5)释放侧链保护基团1或3小时(含精氨酸的肽)，从而对原料肽进行加工。原料肽在甲基叔丁基醚中沉淀，用甲基叔丁基醚冲洗并用二乙醚冲洗两次，之后在醋酸中晾干和溶解肽颗粒。在二乙醚中再次沉淀，在水中晾干、再悬浮，之后冷冻干燥。
制备用HPLC
HPLC系统为可变“星形”，层析柱250×10mm C185μm(制造商为Ziemer)。流动溶剂A：含0.1％TFA的水，流动溶剂B：含0.08％TFA的乙腈。用于分离的梯度面向肽的疏水性。分离出的肽组分冻干。
分析
对于每种肽，高效液相色谱和MALDI质谱均作记录，以证明其身份(通过质谱摩尔质量)和纯度(通过HPLC色谱的峰值区)。
合成肽与刺激
用于刺激和功能测试的合成肽是HIV源性表位(HIV gag 164-181：YVDRFYKTLRAEQASQEV(SEQ ID No：65)，阴性对照)，PSMA 459-473：NYTLRVDCTPLMYSL(SEQ ID No：64)和生存素97-1l1：TLGEFLKLDRERAKN(SEQID No：1)。葡萄球菌肠毒素B(SEB，Sigma-Aldrich，Taufkirchen，德国)用作阳性对照，对Interferon-ELISPOT的CD4+T细胞进行刺激。
特异性T细胞体外扩增
来自前列腺癌的外周血单核细胞在接种期间不同的时间点获得，并且冷冻于含90％胎牛血清和10％DMSO的液态氮中。解冻后，约5×106个细胞培养(24孔细胞培养板，Greiner Bio-One公司，Frickenhausen，德国)于补充50U/ml青霉素的IMDM培养基、50mL链霉素(所有均为Biowhittaker公司产品，Verviers，比利时)、10％热灭活人血清(c.c.pro，Neustadt，德国)和50M 50℃条件下的β-巯基乙醇以及7.5％的CO2。第1天加入储存的合成HLA II类结合分子，每份的浓度为5g/ml，并且于T细胞刺激的第2、5、7和9天向培养液中补充重组人IL-2(r-hIL2，R&D Systems公司，Wiesbaden，德国)。
酶联免疫斑点(ELISPOT)法
根据CIMT监测小组(www.c-imt.org)的推荐，使用标准的IFN-ELISPOT法对扩展T细胞的功能进行测试。简单来说，细胞在12天培养后收集，在ELISPOT板(Millipore公司，Schwalbach，德国)上的培养基中洗涤、计数和接种。0.15至0.25×106个细胞按一式两份或一式三份测试，出现浓度为2.5g/ml的合成肽或1g/ml的SEB。IFN-.的生成情况在37℃和5％CO2下，用一对特异性单克隆抗体(1D1-k和7-B6-1，两者均为Mabtech公司产品，Nacka Strand，瑞典)进行检测。分别加入ExtraAvidin-碱性磷酸酶和BCIP/NBT底物(两者均为Sigma-Aldrich公司的产品)1小时10分钟。ELISPOT分析使用ImmunoSpot阅读器(3A和5系列，Cellular技术有限公司，Aalen，德国)。
细胞内细胞因子染色
从ELISPOT中重新获得细胞在2ng/ml r-hIL2中进一步培养另外9天。在此重新刺激期间，用标准检测方法以含Golgi-STOP(BD Biosciences公司，Heidelberg，德国)的5g/ml肽或PMA和离子霉素(分别为50ng/ml和1M)遵循制造商的说明收集、洗涤、和刺激效应子。经过6个小时的培养期，细胞在PBS 1％FCS 0.02％NaN3洗涤并用单克隆抗体(MoAb)CD4-APC-Cy7(BD Biosciences公司)和CD8-PE-Cy7(Beckman Coulter公司)在4℃下避光染色。洗涤步骤后，用Cytofix/Cytoperm试剂(BD Biosciences公司)浸透20分钟，然后染色细胞内细胞因子30分钟。使用的MoAb为IFN--FITC、IL-10-PE(两者均为BD Biosciences公司的产品)、IL-5-APC(Miltenyi Biotec公司，Bergisch Gladbach，德国)以及TNF--Pacific Blue(Biolegend公司，San Diego，CA)。细胞采集使用软件Diva和FlowJo分析(BDBiosciences公司)在Cytometer Canto II完成。
实施例5：
将BIR-11、BIR-12和BIR-13与HLA-A*0211结合
本分析的目的是评估BIR-004(ELTLGEFLKLDRERAKN(SEQ ID No：2))C-末端肽对HLA-A*0211等位基因编码的MHC分子的亲和力，该等位基因报告有与含C-末端天冬酰胺残基的肽结合的能力。具有C-末端N的MHC配体频率不是很高，我们只测试了C-端含有N的66种肽。绝大多数是非结合剂，但是，也有少数例外：
RLYNFSFLN(SEQ ID No：66)与A*0211结合力强，并且YADGGQWYN(SEQ ID No：67)也与A*0211...结合”)。
这些测试清楚地表明，BIR-11(C-末端九聚物：KLDRERAKN(SEQ ID No：68))和BIR-13(C-末端十倍体：LKLDRERAKN(SEQ ID No：69))与HLA-A*0211结合，但不与BIR-12(C-末端八聚物：LDRERAKN(SEQ ID No：70))结合。阳性对照肽(序列：FLPSDYFPSV(SEQ ID No：71))显示了明确的结合特性。
测试原理
检测方法如下：稳定HLA/肽复合物包括三种分子：HLA重链、β-2微球蛋白(b2m)和肽类配体。变性重组HLA-A*0211重链分子的活性便可进行保存，使之功能与“空载HLA-A*0211”相当。被稀释为包含b2m和相应肽的水缓冲液后，这些分子以完全肽依赖方式迅速有效地折叠。这些可用的分子用于基于ELISA的检测方法中，来衡量肽和HLA I类分子相互作用间的亲和力{Sylvester-Hvid，2002SYLVESTERHVID2002/id}。
纯化的重组HLA-A*0211分子与b2m、不同等级剂量的肽一起培养。从头折叠HLA/肽复合物的量用定量ELISA法测定。解离常数(KD值)使用从校准HLA/肽复合物稀释液中记录的标准曲线进行计算。测量结果偏差太大，难以得出可靠的KD值，尽管可以说BIR13的KD值在阳性对照范围内而BIR-11的KD值较高。KD值较低反映对HLA-A*0211的亲和力较高。
使用SYFPEITHI测得的九聚物BIR-11和九聚物BIR-11a对几种等位基因的结合分值
KLDRERAKD    等位基因
(SEQ IDNo：72)      ID      等位基因名称         Rel分值    分值
KLDRERAKD           74      A*0301               0.45       20
KLDRERAKD           65      A*0201               0.42       15
KLDRERAKD           99      B*1501(B62)          0.36       10
KLDRERAKD           334     A*0101               0.28       14
KLDRERAKN           等位基因
(SEQ ID No：68)     ID      等位基因名称         Rel分值    分值
KLDRERAKN           74      A*0301               0.45       20
KLDRERAKN           65      A*0201               0.42       15
KLDRERAKN           99      B*1501(B62)          0.36       10
KLDRERAKN           334     A*0101               0.28       14
引用文献列表
Reference List
Al-Joudi  FS，Iskandar  ZA，Imran  AK  (2007).Survivin  expression  correlates withunfavourable prognoses in invasive ductal carcinoma of the breast.Med J Malaysia 62，6-8.al-Sheneber IF，Shibata HR，Sampalis J，Jothy S(1993).Prognostic significance ofproliferating cell nuclear antigen expression in colorectal cancer.Cancer 71，1954-1959.
Angileri FF，Aguennouz M，Conti A，La TD，Cardali S，Crupi R，Tomasello C，Germano A，Vita G，Tomasello F(2008).Nuclear factor-kappaB activation and differential expression ofsurvivin and Bcl-2in human grade 2-4astrocytomas.Cancer.
Apostolopoulos V，McKenzie IF(1994).Cellular mucins：targets for immunotherapy.CritRev.Immunol.14，293-309.
Appay V，Speiser DE，Rufer N，Reynard S，Barbey C，Cerottini JC，Leyvraz S，Pinilla C，Romero P(2006).Decreased specific CD8+T cell cross-reactivity of antigen recognitionfollowing vaccination with Melan-A peptide.Eur.J Immunol.36，1805-1814.
Asher RA，Morgenstern DA，Fidler PS，Adcock KH，Oohira A，Braistead JE，Levine JM，Margolis RU，Rogers JH，Fawcett JW(2000).Neurocan is upregulated in injured brain and incytokine-treated astrocytes.J Neurosci.20，2427-2438.
Bamias A，Chorti M，Deliveliotis C，Trakas N，Skolarikos A，Protogerou B，Legaki S，Tsakalou G，Tamvakis N，Dimopoulos MA(2003).Prognostic significance of CA 125，CD44，and epithelial membrane antigen in renal cell carcinoma.Urology 62，368-373.
Barnd DL，Lan MS，Metzgar RS，Finn OJ(1989).Specific，Major HistocompatibilityComplex-Unrestricted Recognition of Tumor-Associated Mucins by Human Cytotoxic TCells.PNAS86，7159-7163.
Bates S，Bonetta L，MacAllan D，Parry D，Holder A，Dickson C，Peters G (1994).CDK6(PLSTIRE)and CDK4(PSK-J3)are a distinct subset of the cyclin-dependent kinases thatassociate with cyclin D 1.Oncogene9，71-79.
Beilmann M，Vande Woude GF，Dienes HP，Schirmacher P (2000).Hepatocyte growthfactor-stimulated invasiveness ofmonocytes.Blood95，3964-3969.
Berger M，Bergers G，Arnold B，Hammerling GJ，Ganss R(2005).Regulator of G-proteinsignaling-5induction in pericytes coincides with active vessel remodeling duringneovascularization.Blood 105，1094-1101.
Bertoletti A，Chisari FV，Penna A，Guilhot S，Galati L，Missale G，Fowler P，Schlicht HJ，Vitiello A，Chesnut RC，.(1993).Definition of a minimal optimal cytotoxic T-cell epitopewithin the hepatitis B virus nucleocapsid protein.J.Virol.67，2376-2380.
Bladt F，Riethmacher D，Isenmann S，Aguzzi A，Birchmeier C(1995).Essential role for the c-met receptor in the migration of myogenic precursor cells into the limb bud.Nature 376，768-771.
Blum R，Jacob-Hirsch J，Rechavi G，Kloog Y(2006).Suppression of survivin expression inglioblastoma cells by the Ras inhibitor farnesylthiosalicylic acid promotes caspase-dependentapoptosis.Mol.Cancer Ther.5，2337-2347.
Borset M，Seidel C，Hjorth-Hansen H，Waage A，Sundan A(1999).The role of hepatocytegrowth factor and its receptor c-Met in multiple myeloma and other blood malignancies.Leuk.Lymphoma 32，249-256.
Bottaro DP，Rubin JS，Faletto DL，Chan AM，Kmiecik TE，Vande Woude GF，Aaronson SA(1991).Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogeneproduct.Science 251，802-804.
Bowen AR，Hanks AN，Murphy KJ，Florell SR，Grossman D(2004).Proliferation，apoptosis，and survivin expression in keratinocytic neoplasms and hyperplasias.Am J Dermatopathol.26，177-181.
Boyton RJ，Lohmann T，Londei M，Kalbacher H，Halder T，Frater AJ，Douek DC，Leslie DG，Flavell RA，Altmann DM(1998).Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responsesassociated with susceptibility or resistance to type I diabetes：analysis in disease discordanthuman twins，non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice.Int.Immunol.10，1765-1776.
Bramhall SR，Neoptolemos JP，Stamp GW，Lemoine NR(1997).Imbalance of expression ofmatrix metalloproteinases(MMPs)and tissue inhibitors of the matrix metalloproteinases(TIMPs)in human pancreatic carcinoma.J Pathol.182，347-355.
Brossart P，Heinrich KS，Stuhler G，Behnke L，Reichardt VL，Stevanovic S，Muhm A，Rammensee HG，Kanz L， Brugger W(1999a).Identification of HLA-A2-restricted T-cellepitopes derived from the MUC l tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies.Blood 93，4309-4317.
Brossart P，Heinrich KS，Stuhler G，Behnke L，Reichardt VL，Stevanovic S，Muhm A，Rammensee HG，Kanz L，Brugger W(1999b).Identification of HLA-A2-restricted T-cellepitopes derived from the MUC1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies.Blood93，4309-4317.
Brossart P，Wirths S，Stuhler G，Reichardt VL，Kanz L，Brugger W(2000).Induction ofcytotoxic T-lymphocyte responses in vivo after vaccinations with peptide-pulsed dendriticcells.Blood96，3102-3108.
Browner MF，Smith WW，Castelhano AL(1995).Matrilysin-inhibitor complexes：commonthemes among metalloproteases.Biochemistry 34，6602-6610.
Burton EC，Prados MD(2000).Malignant gliomas.Curr.Treat.Options.Oncol 1，459-468.Cao Y，Karsten U，Zerban H，Bannasch P(2000).Expression of MUC 1，Thomsen-Friedenreich-related antigens，and cytokeratin 19in human renal cell carcinomas and tubularclear cell lesions.Virchows Arch.436，119-126.
Casati C，Dalerba P，Rivoltini L，Gallino G，Deho P，Rini F，Belli F，Mezzanzanica D，CostaA，Andreola S，Leo E，Parmiani G，Castelli C(2003).The apoptosis inhibitor protein survivininduces tumor-specific CD8+and CD4+T cells in colorectal cancer patients.Cancer Res.63，4507-4515.
Castellino F，HuangAY，tan-Bonnet G，Stoll S，Scheinecker C，Germain RN(2006).Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+T cells to sites of CD4+T cell-dendritic cell interaction.Nature440，890-895.
CBTRUS.Primary  Brain  Tumors in the  United  States，Statistical  Report.2006.Ref Type：Internet Communication
Chakravarti A，Noll E，Black PM，Finkelstein DF，Finkelstein DM，Dyson NJ，Loeffier JS(2002).Quantitatively determined survivin expression levels are of prognostic value in humangliomas.J Clin Oncol 20，1063-1068.
Chanock SJ，Foster CB，Miller FW，O′Hanlon TP(2004).HLA-A，-B，-Cw，-DQA1and-DRB1 Alleles in a Caucasian Population from Bethesda，USA.Hum.Immunol.65，1211-1223.
Cheever MA，Chen W，Disis ML，Takahashi M，Peace DJ(1993).T-cell immunity tooncogenic proteins including mutated ras and chimeric bcr-abl.Ann N.Y.Acad.Sci.690，101-112.
Chen X，Higgins J，Cheung ST，Li R，Mason V，Montgomery K，Fan ST，van de RM，So S(2004).Novel endothelial cell markers in hepatocellular carcinoma.Mod.Pathol.17，1198-1210.
Colombetti S，Basso V，Mueller DL，Mondino A(2006).Prolonged TCR/CD28engagementdrives IL-2-independent T cell  clonal  expansion through  signaling mediated by themammalian target of rapamycin.J Immunol.176，2730-2738.
Cresswell P(1994).Assembly，transport，and function ofMHC class II molecules.Annu.Rev.Immunol.12，259-293.
Dazzi C，Cariello A，Giannini M，Del DM，Giovanis P，Fiorentini G，Leoni M，Rosti G，TurciD，Tienghi A，Vertogen B，Zumaglini F，De GU，Marangolo M(2000).A sequential chemo-radiotherapeutic treatment for patients with malignant gliomas：a phase II pilot study.Anticancer Res.20，515-518.
De VL，Zheng B，Fischer T，Elenko E，Farquhar MG(2000).The regulator of G proteinsignaling family.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.40，235-271.
Delsol G，Al ST，Gatter KC，Gerdes J，Schwarting R，Caveriviere P，Rigal-Huguet F，RobertA，Stein H，Mason DY(1988).Coexpression of epithelial membrane antigen(EMA)，Ki-1，and interleukin-2receptor by anaplastic large cell lymphomas.Diagnostic value in so-calledmalignant histiocytosis.Am.J.Pathol.130，59-70.
Dengi el J，Nastke MD，Gouttefangeas C，Gitsioudis G，Schoor O，Altenberend F，Muller M，Kramer B，Missiou A，Sauter M，Hennenlotter J，Wernet D，Stenzl A，Rammensee HG，Klingel K，Stevanovic S(2006).Unexpected Abundance of HLA Class II Presented Peptidesin Primary Renal Cell Carcinomas.Clin Cancer Res.12，4163-4170.
Denys H，De WO，Nusgens B，Kong Y，Sciot R，Le AT，Van DK，Jadidizadeh A，Tejpar S，Mareel M，Alman B，Cassiman JJ(2004).Invasion and MMP expression profile in desmoidtumours.Br.J Cancer90，1443-1449.
Deshpande A，Sicinski P，Hinds PW(2005).Cyclins and cdks in development and cancer：aperspective.Oncogene 24，2909-2915.
Di Renzo MF，Olivero M，Giacomini A，Porte H，Chastre E，Mirossay L，Nordlinger B，BrettiS，Bottardi S，Giordano S，.(1995).Overexpression and amplification of the met/HGFreceptor gene during the progression of colorectal cancer.Clin.Cancer Res.1，147-154.
Dix AR，Brooks WH，Roszman TL，Morford LA (1999).Immune defects observed in patientswith primary malignant brain tumors.J Neuroimmunol.100，216-232.
Dong G，Chen Z，Li ZY，Yeh NT，Bancroft CC，Van WC(2001).Hepatocyte growthfactor/scatter factor-induced activation of MEK and PI3K signal pathways contributes toexpression of proangiogenic cytokines interleukin-8and vascular endothelial growth factor inhead and neck squamous cell carcinoma.Cancer Res.61，5911-5918.
Duchateau PN，Pullinger CR，Cho MH，Eng C，Kane JP(2001).Apolipoprotein L genefamily：tissue-specitic expression，splicing，promoter regions；discovery of a new gene.J.Lipid Res.42，620-630.
Duchateau PN，Pullinger CR，Orellana RE，Kunitake ST，Naya-Vigne J，O′Connor PM，Malloy MJ，Kane JP(1997).Apolipoprotein L，a new human high density lipoproteinapolipoprotein expressed by the pancreas.Identification，cloning，characterization，and plasmadistribution ofapolipoprotein L.J.Biol.Chem.272，25576-25582.
Dudley ME，Wunderlich JR，Robbins PF，Yang JC，Hwu P，Schwartzentruber DJ，TopalianSL，Sherry R，Restifo NP，Hubicki AM，Robinson MR，Raffeld M，Duray P，Seipp CA，Rogers-Freezer L，Morton KE，Mavroukakis SA，White DE，Rosenberg SA(2002).Cancerregression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes.Science 298，850-854.
Dudley ME，Wunderlich JR，Yang JC，Sherry RM，Topalian SL，Restifo NP，Royal RE，Kammula U，White DE，Mavroukakis SA，Rogers LJ，Gracia GJ，Jones SA，Mangiameli DP，Pelletier MM，Gea-Banacloche J，Robinson MR，Berman DM，Filie AC，Abati A，RosenbergSA(2005).Adoptive cell transfer therapyfollowing non-myeloablative but lymphodepletingchemotherapyfor the treatment of patients with refractory metastatic melanoma.J.Clin.Oncol.23，2346-2357.
Duperray C，Klein B，Durie BG，Zhang X，Jourdan M，Poncelet P，Favier F，Vincent C，Brochier J，Lenoir G，.(1989).Phenotypic analysis of human myeloma cell lines.Blood 73，566-572.
Engel M，Maurel P，Margolis RU，Margolis RK(1996).Chondroitin sulfate proteoglycans inthe developing central  nervous  system.I.cellular sites  of synthesis  of neurocan andphosphacan.J Comp Neurol.366，34-43.
Ferracini R，Di Renzo MF，Scotlandi K，Baldini N，Olivero M，Lollini P，Cremona O，Campanacci M，Comoglio PM(1995).The Met/HGF receptor is over-expressed in humanosteosarcomas and is activated by either a paracrine or an autocrine circuit.Oncogene 10，739-749.
Finn OJ，Jerome KR，Henderson RA，Pecher G，Domenech N，Magarian-Blander J，Barratt-Boyes SM (1995).MUC-1epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines.Immunol.Rev.145，61-89.
Fischer J，Palmedo G，von KR，Bugert P，Prayer-Galetti T，Pagano F，Kovacs G(1998).Duplication and overexpression of the mutant allele of the MET proto-oncogene in multiplehereditary papillary renal cell tumours.Oncogene 17，733-739.
Fong L，Hou Y，Rivas A，Benike C，Yuen A，Fisher GA，Davis MM，Engleman EG(2001).Altered peptide ligand vaccination with Flt3ligand expanded dendritic cells for tumorimmunotherapy.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A98，8809-8814.
Friedlander DR，Milev P，Karthikeyan L，Margolis RK，Margolis RU，Grumet M(1994).Theneuronal  chondroitin  sulfate proteoglycan neurocan binds to the neural cell adhesionmolecules Ng-CAM/L1/NILE and N-CAM，and inhibits neuronal adhesion and neuriteoutgrowth.J Cell Biol.125，669-680.
Fujita K，Denda K，Yamamoto M，Matsumoto T，Fujime M，Irimura T(1999).Expression ofMUC 1mucins inversely correlated with post-surgical survival of renal cell carcinomapatients.Br.J.Cancer80，301-308.
Furge KA，Kiewlich D，Le P，Vo MN，Faure M，Howlett AR，Lipson KE，Woude GF，WebbCP(2001).Suppression of Ras-mediated tumorigenicity and metastasis through inhibition ofthe Met receptor tyrosine kinase.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A98，10722-10727.
Furge KA，Zhang YW，Vande Woude GF(2000).Met receptor tyrosine kinase：enhancedsignaling through adapter proteins.Oncogene 19，5582-5589.
Furuya M，Nishiyama M，Kimura S，Suyama T，Naya Y，Ito H，Nikaido T，Ishikura H (2004).Expression of regulator of G protein signalling protein 5(RGS5)in the tumour vasculature ofhuman renal cell carcinoma.J.Pathol.203，551-558.
Gaire M，Magbanua Z，McDonnell S，McNeil L，Lovett DH，Matrisian LM (1994).Structureand expression of the human gene for the matrix metalloproteinase matrilysin.J Biol Chem.269，2032-2040.
Galon J，Costes A，Sanchez-Cabo F，Kirilovsky A，Mlecnik B，Lagorce-Pages C，Tosolini M，Camus M，Berger A，Wind P，Zinzindohoue F，Bruneval P，Cugnenc PH，Traj anoski Z，Fridman WH，Pages F (2006).Type，density，and location of immune cells within humancolorectal tumors predict clinical outcome.Science 313，1960-1964.
Gattinoni L，Powell DJ，Jr.，Rosenberg SA，Restifo NP (2006).Adoptive immunotherapy forcancer：building on success.Nat.Rev.Immunol.6，383-393.
Gendler S，Taylor-Papadimitriou J，Duhig T，Rothbard J，Burchell J (1988).A highlyimmunogenic region of a human polymorphic epithelial mucin expressed by carcinomas ismade up of tandem repeats.J.Biol.Chem.263，12820-12823.
Gerner EW，Meyskens FL，Jr.(2004).Polyamines and cancer：old molecules，newunderstanding.Nat.Rev.Cancer4，781-792.
Gherardi E，Stoker M(1991).Hepatocyte growth factor--scatter factor：mitogen，motogen，and met.Cancer Cells 3，227-232.
Ghosh JC，Dohi T，Kang BH，Altieri DC(2008).Hsp60regulation of tumor cell apoptosis.JBiol.Chem.283，5188-5194.
Girling A，Bartkova J，Burchell J，Gendler S，Gllett C，Taylor-Papadimitriou J(1989).A coreprotein epitope of the polymorphic epithelial mucin detected by the monoclonal antibody SM-3is selectively exposed in a ranae of primary carcinomas.Int.J.Cancer43，1072-1076.Gnj atic S，Atanackovic D，Jager E，Matsuo M，Selvakumar A，Altorki NK，Maki RG，DupontB，Ritter G，Chen YT，Knuth A，Old LJ (2003).Survey of naturally occurring CD4+T cellresponses aggainst NY-ESO-1in cancer patients：correlation with antibody responses.ProcNatl.Acad.Sci.U.S.A 100，8862-8867.
Gong L，Jiang C，Zhang B，Hu H，Wang W，Liu X(2006).Adenovirus-mediated Expressionof Both Antisense Ornithine Decarboxylase and S-adenosylmethionine DecarboxylaseInduces G(1)Arrest in HT-29Cells.J Biochem.Mol.Biol 39，730-736.
Grumet M，Friedlander DR，Sakurai T (1996).Functions of brain chondroitin sulfateproteoglycans during developments：interactions with adhesion molecules.Perspect.Dev.Neurobiol.3，319-330.
Grumet M，Milev P，Sakurai T，Karthikeyan L，Bourdon M，Margolis RK，Margolis RU(1994).Interactions with tenascin and differential effects on cell adhesion of neurocan andphosphacan，two major chondroitin sulfate proteoglycans of nervous tissue.J Biol.Chem.269，12142-12146.
Grunda JM，Nabors LB，Palmer CA，Chhieng DC，Steg A，Mikkelsen T，Diasio RB，Zhang K，Allison D，Grizzle WE，Wang W，Gillespie GY，Johnson MR(2006).Increased expression ofthymidylate synthetase(TS)，ubiquitin specific protease  10(USP 10)and survivin isassociated with poor survival in glioblastoma multiforme(GBM).J Neurooncol.80，261-274.
Gursky S，Olopade OI，Rowley JD (2001).Identification of a 1.2Kb cDNA fragment from aregion on 9p21commonly deleted in multiple tumor types.Cancer Genet.Cytogenet.129，93-101.
Halaban R (1999).Melanoma cell autonomous growth：the Rb/E2F pathway.CancerMetastasis Rev.18，333-343.
Hammer J，Gallazzi F，Bono E， Karr RW，Guenot J，Valsasnini P，Nagy ZA，Sinigaglia F(1995).Peptide binding specificity of HLA-DR4molecules：correlation with rheumatoidarthritis association.J Exp.Med 181，1847-1855.
Hanada K，Yewdell JW，Yang JC(2004).Immune recognition of a human renal cancerantigen through post-translational protein splicing.Nature427，252-256.
Hedberg Y，Davoodi E，Roos G，Ljungberg B，Landberg G(1999).Cyclin-D1expression inhuman renal-cell carcinoma.Int.J.Cancer84，268-272.
Heid HW，Moll R，Schwetlick I，Rackwitz HR，Keenan TW(1998).Adipophilin is a specificmarker of lipid accumulation in diverse cell types and diseases.Cell Tissue Res.294，309-321.
Heimberger AB，Hussain SF，Aldape K，Sawaya R，Archer GA，Friedman H，Reardon D，Friedman A，Bigner DD，Sampson JH.Tumor-specific peptide vaccination in newly-diagnosed patients with GBM.Journal of Clinical Oncology，2006ASCO Annual MeetingProceedings Part I Vol 24，No.18S(June 20Supplement)，2006：2529.20-6-2006.
Herz C，Aumailley M，Schulte C，Schlotzer-Schrehardt U，Bruckner-Tuderman L，Has C(2006).Kindlin-1is a phosphoprotein involved in regulation of polarity，proliferation，andmotility of epidermal keratinocytes.J Biol Chem.281，36082-36090.
Hwang ML，Lukens JR，Bullock TN(2007).Cognate memory CD4+T cells generated withdendritic cell priming influence the expansion，trafficking，and differentiation of secondaryCD8+T cells and enhance tumor control.J Immunol.179，5829-5838.
Jadeski LC，Chakraborty C，Lala PK(2003).Nitric oxide-mediated promotion of mammarytumour cell migration requires sequential activation of nitric oxide synthase，guanylatecyclase and mitogen-activated protein kinase.Int.J.Cancer 106，496-504.
Janssen EM，Lemmens EE，Wolfe T，Christen U，yon Herrath MG，Schoenberger SP(2003).CD4+T cells are required for secondary expansion and memory in CD8+T lymphocytes.Nature421，852-856.
Jarvinen TA，Liu ET  (2006).Simultaneous  amplification of HER-2(ERBB2)andtopoisomerase IIalpha(TOP2A)genes--molecular basis for combination chemotherapy incancer.Curr.Cancer Drug Targets.6，579-602.
Jones LL，Margolis RU，Tuszynski MH(2003).The chondroitin sulfate proteoglycansneurocan，brevican，phosphacan，and versican are differentially regulated following spinalcord injury.Exp.Neurol.182，399-411.
Jucker M，Gunther A，Gradl G，Fonatsch C，Krueger G，Diehl V，Tesch H(1994).TheMet/hepatocyte growth factor receptor (HGFR)gene is overexpressed in some cases ofhuman leukemia and lymphoma.Leuk.Res.18，7-16.
Kajiwara Y，Yamasaki F，Hama S，Yahara K，Yoshioka H，Sugiyama K，Arita K，Kurisu K(2003).Expression of survivin in astrocytic tumors：correlation with malignant grade andprognosis.Cancer 97，1077-1083.
Kellner U，Sehested M，Jensen PB，Gieseler F，Rudolph P(2002).Culprit and victim--DNAtopoisomerase II.Lancet Oncol.3，235-243.
Kennedy RC，Shearer MH，Watts AM，Bright RK(2003).CD4+T lymphocytes play a criticalrole in antibody production and tumor immunity against simian virus 40large tumor antigen.Cancer Res.63，1040-1045.
Kloeker S，Major MB，Calderwood DA，Ginsberg MH，Jones DA，Beckerle MC(2004).TheKindler syndrome protein is regulated by transforming growth factor-beta and involved inintegrin-mediated adhesion.J.Biol.Chem.279，6824-6833.
Kobayashi H，Omiya R，Ruiz M，Huarte E，Sarobe P，Lasarte JJ，Herraiz M，Sangro B，PrietoJ，Borras-Cuesta F，Celis E (2002).Identification of an antigenic epitope for helper Tlymphocytes from carcinoembryonic antigen.Clin Cancer Res.8，3219-3225.
Koochekpour S，Jeffers M，Rulong S，Taylor G，Klineberg E，Hudson EA，Resau JH，VandeWoude GF (1997).Met and hepatocyte growth factor/scatter factor expression in humangliomas.Cancer Res.57，5391-5398.
Kosari F，Parker AS，Kube DM，Lohse CM，Leibovich BC，Blute ML，Cheville JC，Vasmatzis G(2005).Clear cell renal cell carcinoma：gene expression analyses identify apotential signature for tumor aggressiveness.Clin Cancer Res.11，5128-5139.
Kraus S，Abel PD，Nachtmann C，Linsenmann HJ，Weidner W，Stamp GW，Chaudhary KS，Mitchell SE，Franke FE，Lalani e(2002).MUC 1mucin and trefoil factor 1protein expressionin renal cell carcinoma：correlation with prognosis.Hum.Pathol.33，60-67.
Kurokawa Y，Matoba R，Nakamori S，Takemasa I，Nagano H，Dono K，Umeshita K，Sakon M，Monden M，Kato K (2004).PCR-array gene expression profiling of hepatocellular carcinoma.J.Exp.Clin.Cancer Res.23，135-141.
Lemmel C，Weik S，Eberle U，Dengjel J，Kratt T，Becker HD，Rammensee HG，Stevanovic S(2004).Differential quantitative analysis of MHC ligands by mass spectrometry using stableisotope labeling.Nat.Biotechnol.22，450-454.
Leontiou C，Lightowlers R，Lakey JH，Austin CA(2003).Kinetic analysis of humantopoisomerase IIalpha and beta DNA binding by surface plasmon resonance.FEBS Lett.554，206-210.
Leroy X，Copin MC，Devisme L，Buisine MP，Aubert JP，Gosselin B，Porchet N(2002).Expression of human mucin genes in normal kidney and renal cell carcinoma.Histopathology40，450-457.
Lew DJ，Dulic V，Reed SI (1991).Isolation of three novel human cyclins by rescue of G1cyclin (Cln)function in yeast.Cell 66，1197-1206.
Li G，Schaider H，Satyamoorthy K，Hanakawa Y，Hashimoto K，Herlyn M(2001).
Downregulation of E-cadherin and Desmoglein 1by autocrine hepatocyte growth factorduring melanoma development.Oncogene 20，8125-8135.
Li H，LeungTC，Hoffman S，Balsamo J，Lilien J(2000).Coordinate regulation of cadherinand integrin function by the chondroitin sulfate proteoglycan neurocan.J Cell Biol.149，1275-1288.
Lin TS，Chiou SH，Wang LS，Huang HH，Chiang SF，Shih AY，Chen YL，Chen CY，Hsu CP，Hsu NY，Chou  MC，Kuo  SJ，Chow  KC  (2004).Expression  spectra  of matrixmetalloproteinases in metastatic non-small cell lung cancer.Oncol.Rep.12，117-723.
Littaua RA，Takeda A，Cruz J，Ennis FA(1992).Vaccinia virus-specific human CD4+cytotoxic T-lYmphocyte clones.J Virol.66，2274-2280.
Liu X，Chen N，Wang X，He Y，Chen X，Huang Y，Yin W，Zhou Q(2006).Apoptosis andproliferation markers in diffusely infiltrating astrocytomas：profiling of 17molecules.JNeuropathol.Exp.Neurol.65，905-913.
Livingston BD，Crimi C，Grey H，Ishioka G，Chisari FV，Fikes J，Grey H，Chesnut RW，SetteA(1997).The hepatitis B virus-specific CTL responses induced in humans by lipopeptidevaccination are comparable to those elicited by acute viral infection.J.Immunol.159，1383-1392.
Lo ML，Staibano S，Pannone G，Mignogna MD，Mariggio A，Salvatore G，Chieffi P，Tramontano D，De RG，Altieri DC(2001).Expression of the apoptosis inhibitor survivin inaggressive squamous cell carcinoma.Exp.Mol.Pathol.70，249-254.
Loden M，Stighall M，Nielsen NH，Roos G，Emdin SO，Ostlund H，Landberg G(2002).Thecyclin D 1high and cyclin E high subgroups of breast cancer：separate pathways intumorogenesis based on pattern of genetic aberrations and inactivation of the pRb node.Oncogene 21，4680-4690.
Louhelainen J，Wijkstrom H，Hemminki K(2000).Initiation-development modelling ofallelic losses on chromosome 9in multifocal bladder cancer.Eur.J.Cancer 36，1441-1451.
Macdonald DR(2001).Temozolomide for recurrent high-grade glioma.Semin.Oncol 28，3-12.
Mach B，Steimle V，Martinez-Soria E，Reith W (1996).Regulation of MHC class IIgenes：lessons from a disease.Annu.Rev.Immunol.14，301-331.
Mahlamaki EH，Barlund M，Tanner M，Gorunova L，Hoglund M，Karhu R，Kallioniemi A(2002).Frequent amplification of 8q24，11q，17q，and 20q-specific genes in pancreatic cancer.Genes Chromosomes.Cancer 35，353-358.
Malcherek G，Gnau V，Stevanovic S，Rammensee HG，Jung G，Melms A(1994).Analysis ofallele-specific contact sites ofnatural HLA-DR17ligands.J Immunol.153，1141-1149.
Manici S，Sturniolo T，Imro MA，Hammer J，Sinigaglia F，Noppen C，Spagnoli G，Mazzi B，Bellone M，Dellabona P，Protti MP(1999).Melanoma cells present a MAGE-3epitope toCD4(+)cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11.JExp.Med 189，871-876.
Margolis RK，Rauch U，Maurel P，Margolis RU(1996).Neurocan and phosphacan；twomajor nervous tissue-specific chondroitin sulfate proteoglycans.Perspect.Dev.Neurobiol.3，273-290.
Mark AS，Mangkornkanok M(1989).B-cell lymphoma marking only with anti-epithelialmembfane antigen.Cancer 63，2152-2155.
Marzo AL，Kinnear BF，Lake RA，Frelinger JJ，Collins EJ，Robinson BW，Scott B(2000).Tumor-specific CD4+T cells have a major″post-licensing″role in CTL mediated anti-tumorimmunity.J Immunol.165，6047-6055.
Maulik G，Kij ima T，Ma PC，Ghosh SK，Lin J，Shapiro GI，Schaefer E，Tibaldi E，JohnsonBE，Salgia R(2002).Modulation of the c-Met/hepatocyte growth factor pathway in small celllung cancer.Clin.Cancer Res.8，620-627.
Mayer A，Takimoto M，Fritz E，Schellander G，Kofler K，Ludwig H(1993).The prognosticsignificance of proliferating cell nuclear antigen，epidermal growth factor receptor，and mdrgene expression in colorectal cancer.Cancer 71，2454-2460.
McKeon RJ，Jurynec MJ，Buck CR(1999).The chondroitin sulfate proteoglycans neurocanand phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar.J Neurosci.19，10778-10788.
Mellai M，Caldera V，Patrucco A，Annovazzi L，Schiffer D(2008).Survivin expression inglioblastomas correlates with proliferation，but not with apoptosis.Anticancer Res.28，109-118.
Meyer-Puttlitz B，Junker E，Margolis RU，Margolis RK(1996).Chondroitin sulfateproteoglycans in the developing central nervous system.II.Immunocytochemical localizationof neurocan and phosphacan.J Comp Neurol.366，44-54.
Miyazaki K，Hattori Y，Umenishi F，Yasumitsu H，Umeda M(1990).Purification andcharacterization of extracellular  matrix-degrading  metalloproteinase，matrin (pump-1)，secretedfrom human rectal carcinoma cell line.Cancer Res.5O，7758-7764.
Mizuno K，Higuchi O，Ihle JN，Nakamura T(1993).Hepatocyte growthfactor stimulatesgrowth of hematopoietic progenitor cells.Biochem.Biophys.Res.Commun.194，178-186.
Molenkamp BG，Vuylsteke RJ，van Leeuwen PA，Meijer S，Vos W，Wijnands PG，ScheperRJ，de Gruijl TD(2005).Matched skin and sentinel lymph node samples of melanomapatients reveal exclusive migration ofmature dendritic cells.Am.J Pathol.167，1301-1307.
Monajemi H，Fontijn RD，Pannekoek H，Horrevoets AJ(2002).The apolipoprotein L genecluster has emerged recently in evolution and is expressed in human vascular tissue.Genomics 79，539-546.
Montesano R，Soriano JV，Malinda KM，Ponce ML, Bafico A，Kleinman HK，Bottaro DP，Aaronson SA (1998).Differential effects of hepatocyte growth factor isoforms on epithelialand endothelial tubulogenesis.Cell Growth Differ.9，355-365.
Morgan RA，Dudley ME，Wunderlich JR，Hughes MS，Yang JC，Sherry RM，Royal RE，Topalian SL， Kammula US，Restifo NP，Zheng Z，Nahvi A，de Vries CR，Rogers-Freezer LJ，Mavroukakis SA，Rosenberg SA (2006).Cancer Regression in Patients After Transfer ofGenetically Engineered Lymphocytes.Science.
Morgenstem DA，Asher RA，Fawcett JW(2002).Chondroitin sulphate proteoglycans in theCNS injury response.Prog.Brain Res.137，313-332.
Mori M，Barnard GF，Mimori K，Ueo H，Akiyoshi T，Sugimachi K(1995).Overexpression ofmatrix metalloproteinase-7mRNA in human colon carcinomas.Cancer 75，1516-1519.
Mortara L，Castellani P，Meazza R，Tosi G，De Lerma BA，Procopio FA，Comes A，Zardi L,Ferrini S，Accolla RS (2006).CIITA-induced MHC class II expression in mammaryadenocarcinoma leads to a Th1 polarization of the tumor microenvironment，tumor rejection，and specific antitumor memory.Clin Cancer Res.12，3435-3443.
Mott JD，Werb Z(2004).Regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases.Curr.Opin.Cell Biol 16，558-564.
Nakamura T，Tabuchi Y，Nakae S，Ohno M，Saitoh Y (1996).Serum carcinoembryonicantigen levels and proliferating cell nuclear antigen labeling index for patients with colorectalcarcinoma.Correlation with tumor progression and survival.Cancer 77，1741-1746.
Naldini L，Vigna E，Narsimhan RP，Gaudino G，Zarnegar R，Michalopoulos GK，ComoglioPM (1991).Hepatocyte growth factor(HGF)stimulates the tyrosine kinase activity of thereceptor encoded by the proto-oncogene c-MET.Oncogene 6，501-504.
Napolitano M，Keime-Guibert F，Monjour A，Lafitte C，Ameri A，Cornu P，Broet P，DelattreJY(1999).Treatment of supratentorial glioblastoma multiforme with radiotherapy and acombination of BCNU and tamoxifen：a phase II study.J Neurooncol.45，229-235.
Nieder C，Grosu AL，Molls M(2000).A comparison of treatment results for recurrentmalignant gliomas.Cancer Treat.Rev.26，397-409.
Noto H，Takahashi T，Makiguchi Y，Hayashi T，Hinoda Y，Imai K(1997).Cytotoxic Tlymphocytes derived from bone marrow mononuclearcells of multiple myeloma patientsrecognize an underglycosylated form of MUC 1mucin.Int.Immunol.9，791-798.
Novellino L，Castelli C，Parmiani G(2005).A listing of human tumor antigens recognized byT cells：March 2004update.Cancer Immunol.Immunother.54，187-207.
O′Driscoll L，Linehan R，Clynes M(2003).Survivin：role in normal cells and in pathologicalconditions.Curr.Cancer Drug Targets.3，131-152.
Ohara O，Nagase T，Ishikawa K，Nakaj ima D，Ohira M，Seki N，Nomura N(1997).Construction and characterization of human brain cDNA libraries suitable for analysis ofcDNA clones encoding relatively large proteins.DNA Res.4，53-59.
Oka Y，Tsuboi A，Taguchi T，Osaki T，Kyo T，Nakaj ima H，Elisseeva OA，Oji Y，KawakamiM，Ikegame K，Hosen N，Yoshihara S，Wu F，Fujiki F，Murakami M，Masuda T，Nishida S，Shirakata T，Nakatsuka S，Sasaki A，Udaka K，Dohy H，Aozasa K，Noguchi S，Kawase I，Sugiyama H(2004).Induction of WTl(Wilms′tumor gene)-specific cytotoxic T lymphocytesby WTl peptide vaccine and the resultant cancer regression.Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A101，13885-13890.
Penna A，Fowler P，Bertoletti A，Guilhot S，Moss B，Margolskee RF，Cavalli A，Valli A，Fiaccadori F，Chisari FV，.(1992).Hepatitis B virus(HBV)-specific cytotoxic T-cell(CTL)response in humans：characterization of HLA class II-restricted CTLs that recognizeendogenously synthesized HBV envelope antigens.J Virol.66，1193-1198.
Piesche M，Hildebrandt Y，Zettl F，Chapuy B，Schmitz M，Wulf G，Trurnper L，Schroers R(2007).Identification of a promiscuous HLA DR-restricted T-cell epitope derived from theinhibitor of apoptosis protein survivin.Hum.Immunol.68，572-576.
Pons E，Uphoff CC，Drexler HG(1998).Expression of hepatocyte growth factor and itsreceptor c-met in human leukemia-lymphoma cell lines.Leuk.Res.22，797-804.
Ponzetto C，Bardelli A，Maina F，Longati P，Panayotou G，Dhand R，Waterfield MD，Comoglio PM(1993).A novel recognition motif for phosphatidylinositol 3-kinase bindingmediates its association with the hepatocyte growth factor/scatter factor receptor.Mol.CellBiol.13，4600-4608.
Prados MD，Levin V(2000).Biology and treatment of malignant glioma.Semin.Oncol 27，1-10.
Previsani N，Lavanchy D (2002).Hepatitis B.World Health Organization Department ofCommunicable Diseases Surveillance and Response.2002WHO/CDS/CSR/LYO/2002.2：Hepatitis B.
Qian CN，Guo X，Cao B，Kort EJ，Lee CC，Chen J，Wang LM，Mai WY，Min HQ，Hong MH，Vande Woude GF，Resau JH，Teh BT(2002).Met protein expression level correlates withsurvivalin patients with late-stage nasopharyngeal carcinoma.Cancer Res.62，589-596.
Qin Z，Blankenstein T(2000).CD4+T cell--mediated tumor rej ection involves inhibition ofangiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells.Immunity.12，677-686.
Qin Z，Schwartzkopff J，Pradera F，Kammertoens T，Seliger B，Pircher H，Blankenstein T(2003).A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejectionby CD8+T cells.Cancer Res.63，4095-4100.
Quantin B，Murphy G，Breathnach R(1989).Pump-1cDNA codes for a protein withcharacteristics similar to those of classical collagenase family members.Biochemistry 28，5327-5334.
Rae FK，Stephenson SA，Nicol DL，Clements JA (2000).Novel association of a diverse rangeof genes with renal cell carcinoma as identified by differential display.Int.J.Cancer88，726-732.
Ramirez R，Hsu D，Patel A，Fenton C，Dinauer C，Tuttle RM，Francis GL(2000).Over-expression of hepatocyte growth factor/scatter factor(HGF/SF)and the HGF/SF receptor(cMET)are associated with a high risk of metastasis and recurrence for children and youngadults with papillary thyroid carcinoma.Clin Endocrinol.(Oxf)53，635-644.
Rammensee HG，Bachmann J，Emmerich NP，Bachor OA，Stevanovic S(1999).SYFPEITHI：database for MHC ligands and peptide motifs.Immunogenetics 50，213-219.
Rammensee，H.G.，Bachmann，J.，and Stevanovic，S.(1997).MHC Ligands and Peptide Motifs.Springer-Verlag，Heidelberg，Germany).
Rammensee HG，Friede T，Stevanoviic S(1995).MHC ligands and peptide motifs：firstlisting.Immunogenetics41，178-228.
Rauch U，Feng K，Zhou XH(2001).Neurocan：a brain chondroitin sulfate proteoglycan.CellMol.LifeSci.58，1842-1856.
Rehermann B，Nascimbeni M(2005).Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virusinfection.Nat.Rev.Immunol.5，215-229.
Retzler C，Gohring W，Rauch U (1996).Analysis of neurocan structures interacting with theneural cell adhesion molecule N-CAM.J Biol.Chem.271，27304-27310.
Rosenberg SA，Lotze MT，Muul LM，Chang AE，Avis FP，Leitman S，Linehan WM，Robertson CN，Lee RE，Rubin JT，.(1987).A progress report onthe treatment of 157patientswith advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2or high-doseinterleukin-2alone.N.Engl.J.Med.316，889-897.
RosenbergSA，Packard BS，Aebersold PM，Solomon D，Topalian SL，Toy ST，Simon P，Lotze MT，Yang JC，Seipp CA，.(1988).Use of tumor-infiltrating lymphocytes andinterleukin-2in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma.A preliminaryreport.N.Engl.J Med 319，1676-1680.
Roth W，Weller M(1999).Chemotherapy and immunotherapy of malignant glioma：molecular mechanisms and clinical perspectives.Cell Mol.LifeSci.56，481-506.
Rubin JS，Bottaro DP，Aaronson SA (1993).Hepatocyte growth factor/scatter factor and itsreceptor，the c-met proto-oncogene product.Biochim.Biophys.Acta 1155，357-371.
Ruiz M，Kobayashi H，Lasarte JJ，Prieto J，Borras-Cuesta F，Celis E，Sarobe P (2004).Identification and characterization of a T-helper peptide from carcinoembryonic antigen.ClinCancer Res.10，2860-2867.
Sablotzki A，Ebel H，Muhling J，Dehne MG，Nopens H，Giesselmann H，Hempelmann G(2000).Dysregulation of immune response following neurosurgical operations.ActaAnaesthesiol.Scand.44，82-87.
Sadler E，Klausegger A，Muss W，Deinsberger U，Pohla-Gubo G，Laimer M，Lanschuetzer C，Bauer JW，Hintner H (2006).Novel KIND 1gene mutation in Kindler syndrome with severegastrointestinal tract involvement.Arch.Dermatol.142，1619-1624.
Saha S，Bardelli A，Buckhaults P，Velculescu VE，Rago C，St CB，Romans KE，Choti MA，Lengauer C，Kinzler KW，Vogelstein B(2001).A phosphatase associated with metastasis ofcolorectal cancer.Science 294，1343-1346.
Saino M，Maruyama T，Sekiya T，Kayama T，Murakami Y(2004).Inhibition of angio genesisin human glioma cell lines by antisense RNA from the soluble guanylate cyclase genes，GUCY1A3and GUCY1B3.Oncol.Rep.12，47-52.
Saito T，Arifin MT，Hama S，Kajiwara Y，Sugiyama K，Yamasaki F，Hidaka T，Arita K，Kurisu K(2007).Survivin subcellular localization in high-grade astrocytomas：simultaneousexpression in both nucleus and cytoplasm is negative prognostic marker.J Neurooncol.82，193-198.
Sakaguchi A，Kikuchi A(2004).Functional compatibility between isoform alpha and beta oftype II DNA topoisomerase.J Cell Sci.117，1047-1054.
Sasaki T，Lopes MB，Hankins GR，Helm GA (2002).Expression of survivin，an inhibitor ofapoptosis protein，in tumors of the nervous system.Acta Neuropathol.104，105-109.
Sato F，Abraham JM，Yin J，Kan T，Ito T，Mori Y，Hamilton JP，Jin Z，Cheng Y，Paun B，Berki AT，Wang S，Shimada Y，Meltzer SJ (2006).Polo-like kinase and survivin areesophageal tumor-specific promoters.Biochem.Biophys.Res.Commun.342，465-471.
Schmidt C，Bladt F，Goedecke S，Brinkmann V，Zschiesche W，Shar pe M，Gherardi E，Birchmeier C(1995).Scatter factor/hepatocyte growth factor is essential for liverdevelopment.Nature 373，699-702.
Schmitz M，Diestelkoetter P，Weigle B，Schmachtenberg F，Stevanovic S，Ockert D，Rammensee HG，Rieber EP(2000).Generation of survivin-specific CD8+T effector cells bydendritic cells pulsed with protein or selected peptides.Cancer Res.60，4845-4849.
Schoenberger SP，Toes RE，van d，V，Offringa R，Melief CJ(1998).T-cell help for cytotoxicT lymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions.Nature 393，480-483.
Schubert U，Anton LC，Gibbs J，Norbury CC，Yewdell JW，Bennink JR(2000).Rapiddegradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes.Nature404，770-774.
Shedlock DJ，Shen H(2003).Requirement for CD4T cell help in generating functional CD8T cell memory.Science 300，337-339.
Siddiqui J，Abe M，Hayes D，Shani E，Yunis E，Kufe D(1988).Isolation and Sequencing of acDNA Coding for the Human DF3Breast Carcinoma-Associated Antigen.PNAS85，2320-2323.
Singh-Jasuja  H，Emmerich  NP，Rammensee  HG  (2004).The  Tubingen  approach：identification，selection，and validation of tumor-associated HLA peptides for cancer therapy.Cancer Immunol.Immunother.53，187-195.
Smith GM，Strunz C(2005).Growth factor and cytokine regulation of chondroitin sulfateproteoglycans by astrocytes.Glia 52，209-218.
Span PN，Sweep FC，Wiegerinck ET，Tjan-Heijnen VC，Manders P，Beex LV，de Kok JB(2004).Survivin is an independent prognostic marker for risk stratification of breast cancerpatients.Clin Chem.50，1986-1993.
Sun JC，Bevan MJ(2003).Defective CD8T cell memory following acute infection withoutCD4T cell help.Science 300，339-342.
Takahashi T，Makiguchi Y，Hinoda Y，Kakiuchi H，Nakagawa N，Imai K，Yachi A(1994).Expression of MUC 1on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL againstMUC1 from a multiple myeloma patient.J.Immunol.153，2102-2109.
Takayama H，Larochelle WJ，Sharp R，Otsuka T，Kriebel P，Anver M，Aaronson SA，MerlinoG (1997).Diverse tumorigenesis associated with aberrant developmnent in miceoverexpressing hepatocyte growth factor/scatter factor.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A94，701-706.
Takayama H，LaRochelle WJ，Anver M，Bockman DE，Merlino G(1996).Scatterfactor/hepatocyte growth factor as a regulator of skeletal muscle and neural crest development.PNAS93，5866-5871.
Tan HY，Liu J，Wu SM，Luo HS(2005).Expression of a novel apoptosis inhibitor-survivin incolorectal carcinoma.World J Gastroenterol.11，4689-4692.
Ten KM，van der Wal JB，Sluiter W，Hofland LJ，Jeekel J，Sonneveld P，van Eijck CH(2006).The role of superoxide anions in the development of distant tumour recurrence.Br.J Cancer.Teofili L，Di Febo AL，Pierconti F，Maggiano N，Bendandi M，Rutella S，Cingolani A，Di RN，Musto P，Pileri S，Leone G，Larocca LM (2001).Expression of the c-met proto-oncogene andits ligand，hepatocyte growth factor，in Hodgkin disease.Blood97，1063-1069.
Tompkins SM，Rota PA，Moore JC，Jensen PE(1993).A europium fluoroimmunoassay formeasuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins.J Immunol.Methods 163，209-216.
Tripathi A，Dasgupta S，Roy A，Sengupta A，Roy B，Roychowdhury S，Panda CK(2003).Sequential deletions in both arms of chromosome 9are associated with the development ofhead and neck squamous cell carcinoma in Indian patients.J.Exp.Clin.Cancer Res.22，289-297.
Troussard X，vet-Loiseau H，Macro M，Mellerin MP，Malet M，Roussel M，Sola B(2000).Cyclin D 1expression in patients with multiple myeloma.Hematol.J.1，181-185.Tuck AB，Park M，Sterns EE，Boag A，Elliott BE(1996).Coexpression of hepatocyte growthfactor and receptor(Met)in human breast carcinoma.Am.J.Pathol.148，225-232.
Uehara Y，Minowa O，Mori C，Shiota K，Kuno J，Noda T，Kitamura N(1995).Placentaldefect and embryonic lethality in mice lacking hepatocyte growth factor/scatter factor.Nature373，702-705.
Uematsu M，Ohsawa I，Aokage T，Nishimaki K，Matsumoto K，Takahashi H，Asoh S，Teramoto A，Ohta S(2005).Prognostic significance of the immunohistochemical index ofsurvivin in glioma：a comparative study with the MIB-1index.J Neurooncol.72，231-238.
van der Bruaaen P，Traversari C，Chomez P，Lurquin C，De PE，Van den EB，Knuth A，BoonT(1991).A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a humanmelanoma.Science 254，1643-1647.
van d，V，Taher TE，Keehnen RM，Smit L，Groenink M，Pals ST(1997).Paracrine regulationof germinal center B cell adhesion through the c-met-hepatocyte growth factor/scatter factorpathway.J.Exp.Med.185，2121-2131.
Vasef MA，Brynes RK，Sturm M，Bromley C，Robinson RA(1999).Expression of cyclin D1in parathyroid carcinomas，adenomas，and hyperplasias：a paraffin immunohistochemicalstudy.Mod.Pathol.12，412-416.
Vigneron N，Stroobant V，Chapiro J，Ooms A，Degiovanni G，Morel S，van der BP，Boon T，Van Den Eynde BJ(2004).An antigenic peptide produced by peptide splicing in theproteasome.Science 304，587-590.
Vogt AB，Kropshofer H，Kalbacher H，Kalbus M，Rammensee HG，Coligan JE，Martin R(1994).Ligand motifs of HLA-DRB5*0101and DRB1*1501molecules delineated from self-petptides.J Immunol.153，1665-1673.
Walter S，Herrgen L，Schoor O，Jung G，Wernet D，Buhring HJ，Rammensee HG，StevanovicS(2003).Cutting edge：predetermined avidity of human CD8T cells expanded on calibratedMHC/anti-CD28-coated microspheres.J.Immunol.171，4974-4978.
Wang FQ，So J，Reierstad S，Fishman DA(2005).Matrilysin(MMP-7)promotes invasion ofovarian cancer cells by activation of progelatinase.Int.J Cancer 114，19-31.
Wang JC，Livingstone AM(2003).Cutting edge：CD4+T cell help can be essential forprimary CD8+T cell responses in vivo.J Immunol.171，6339-6343.
Wang R，Ferrell LD，Faouzi S，Maher JJ，Bishop JM(2001).Activation of the Met receptorby cell attachment induces and sustains hepatocellular carcinomas in transgenic mice.J.CellBiol.153，1023-1034.
Weber RG，Rieger J，Naumann U，Lichter P，Weller M (2001).Chromosomal imbalancesassociated with response to chemotherapy and cytotoxic cytokines in human malignantglioma cell lines.Int.J.Cancer91，213-218.
Weinschenk T，Gouttefangeas C，Schirle M，Obermayr F，Walter S，Schoor O，Kurek R，Loeser W，Bichler KH，Wernet D，Stevanovic S，Rammensee HG (2002).Integratedfunctional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines.CancerRes.62，5818-5827.
Weinstein EJ，Bourner M，Head R，Zakeri H，Bauer C，Mazzarella R(2003).URP 1：amember of a novel family of PH and FERM domain-containing membfane-associatedproteins is significantly over-expressed in lung and colon carcinomas.Biochim.Biophys.Acta 1637，207-216.
Wierecky J，Muller MR，Horger MS，Brugger W，Kanz L，Brossart P(2005).Induction ofclinical and immunological responses in patients with metastatic renal cell carcinoma aftervaccinations with peptide pulsed dendritic cells.J Clin Oncol (Meeting Abstracts)23，2507.
Xie D，Zeng YX，Wang HJ，Wen JM，Tao Y，Sham JS，Guan XY(2006).Expression ofcytoplasmic and nuclear Survivin in primary and secondary humanglioblastoma.Br.J Cancer94，108-114.
Xiong Y，Connolly T，Futcher B，Beach D (1991).Human D-type cyclin.Cell 65，691-699.Yamashita S，Masuda Y，Kurizaki T，Haga Y，Murayama T，Ikei S，Kamei M，Takeno S，Kawahara K(2007).Survivin expression predicts early recurrence in early-stage breast cancer.Anticancer Res.27，2803-2808.
Yee C，Thompson JA，Byrd D，Riddell SR，Roche P，Celis E，Greenberg PD(2002).AdoptiveT cell therapy using antigen-specific CD8+T cell clones for the treatment of patients withmetastatic melanoma：in vivo persistence，migration，and antitumor effect of transferred Tcells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A99，16168-16173.
Young AN，Amin MB，Moreno CS，Lim SD，Cohen C，Petros JA，Marshall FF，Neish AS(2001).Expression profiling of renal epithelial neoplasms：a method for tumor classificationand discovery ofdiagnostic molecular markers.Am.J.Pathol.158，1639-1651.
Zacharias U，Rauch U(2006).Competition and cooperation between tenascin-R，lecticans andcontactin 1regulate neurite growth and morphology.J Cell Sci.119，3456-3466.
Zaremba S，Barzaga E，Zhu M，Soares N，Tsang KY，Schlom J (1997).Identification of anenhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen.Cancer Res.57，4570-4577.
Zamegar R，Michalopoulos GK(1995).The many faces of hepatocyte growth factor：fromhepatopoiesis to hematopoiesis.J.Cell Biol.129，1177-1180.
Zeh HJ，III，Perry-Lalley D，Dudley ME，Rosenberg SA，Yang JC(1999).High avidity CTLsfor two self-antigens demonstrate superior in vitro and in vivo antitumor efficacy.J Immunol.162，989-994.
Zhang B，Liu XX，Zhang Y，Jiang CY，Hu HY，Gong L，Liu M，Teng QS(2006).Polyaminedepletion by ODC-AdoMetDC antisense adenovirus impairs human colorectal cancer growthand invasion in vitro and in vivo.J Gene Med8，980-989.
Zhen HN，Zhang X，Hu PZ，Yang TT，Fei Z，Zhang JN，Fu LA，He XS，Ma FC，Wang XL(2005).Survivin expression and its relation with proliferation，apoptosis，and angiogenesis inbrain gliomas.Cancer 104，2775-2783.
Zhou YT，Guy GR，Low BC(2005).BNIP-2induces cell elongation and membraneprotrusions by interacting with Cdc42via a unique Cdc42-binding motif within its BNIP-2and Cdc42GAP homology domain.Exp.Cell Res.303，263-274.
Figure IPA00001255737600021
Figure IPA00001255737600031
Figure IPA00001255737600051
Figure IPA00001255737600061
Figure IPA00001255737600071
Figure IPA00001255737600081
Figure IPA00001255737600111
Figure IPA00001255737600121
Figure IPA00001255737600131
Figure IPA00001255737600141

Claims (15)

1.一种肽包含选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.3的组的一个序列或该序列的与SEQ ID No.1至SEQ ID No.3具有95％同源性的一种变体，或该序列的诱导与所述变异肽发生T细胞交叉反应的一种变体；其中，所述肽不是人类生存素的全长多肽。
2.根据权利要求1的肽或其变体，其中所述肽或其变体保持着与人类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)I类或II类分子相结合的能力，并且其中所述肽优选能够刺激CD4或CD8T细胞。
3.根据权利要求1或2的肽，其中所述肽选自具有选自HLA-DR和HLA-A*02的组的一种特异性HLA亚型的一种肽，并且其中所述肽优选包含其特异性锚氨基酸基序。
4.根据权利要求1至3任一项所述的肽，其中所述肽或其变体的总长度为8至100个氨基酸，优选为8至30个氨基酸，更优选为8至16个氨基酸，最优选为该肽是由或基本由根据SEQ ID No.1至SEQ ID No.3的任一氨基酸序列组成。
5.根据权利要求1至4任一项所述的肽，其中所述肽为融合蛋白，尤其包含HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸。
6.根据权利要求1至5任一项所述的一种编码肽的核酸或一种能表达所述核酸的表达载体。
7.根据权利要求1至5任一项所述的肽、或根据权利要求6所述的药用核酸或表达载体。
8.一种宿主细胞包含根据权利要求6所述的核酸或表达载体，其中所述宿主细胞优选为抗原提呈细胞，尤其是树突状细胞或抗原提呈细胞。
9.一种制备根据权利要求1至7任一项所述的肽的方法，该方法包括培养根据权利要求11所述的表达权利要求8所述核酸的宿主细胞或根据权利要求9的表达载体，以及从该宿主细胞或其培养基中分离出肽。
10.一种体外制备激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，包括将CTL与载有抗原的人类I或II类MHC分子进行体外接触，该等分子在合适的抗原提呈细胞表面或人工模拟构造的抗原提呈细胞表面上表达一段足够的时间从而可以以抗原特异性方式激活所述CTL，其中所述抗原为权利要求1至5任一项所述的肽。
11.使用根据权利要求1至5任一项所述的一种肽、根据权利要求6所述的一种核酸或表达载体、根据权利要求8所述的一种细胞或根据权利要求10所述的一种激活细胞毒性T淋巴细胞进行治疗癌症或制造抗癌药品，其中所述药物优选为疫苗。
12.根据权利要求11所述的使用，其中所述癌症选自星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、胚胎发育不良性神经上皮瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、多形性胶质母细胞瘤、混合型胶质瘤、少突星形细胞瘤、髓母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、生殖细胞瘤、畸胎瘤、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、中央神经节细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNET，例如髓母细胞瘤、髓上皮瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、管膜母细胞瘤)、松果体实质肿瘤(例如松果体细胞瘤、成松果体细胞瘤)、室管膜细胞瘤、脉络丛肿瘤、来源不明的神经上皮肿瘤(例如大脑胶质瘤病、星形母细胞瘤)或胶质母细胞瘤、前列腺肿瘤、乳腺癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、肺癌、中枢神经系统癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、鳞状细胞癌、白血病和髓母细胞瘤以及其他显示过量表达生存素或神经蛋白聚糖的肿瘤或癌症。
13.使用根据权利要求11或12所述的一种肽，联合至少一种选自由根据SEQ ID 4至13以及24的肽构成的组，用以治疗肾癌，或联合至少一种选自由根据SEQ ID 4、8、11、12和15至24的肽构成的组，用以治疗结肠癌或制造抗结肠癌的药品。
14.一种药盒，包括：
(a)一个容器，含有根据权利要求1至5任一项所述的一种肽、根据权利要求6所述的一种核酸或表达载体、根据权利要求8所述的一种细胞或根据权利要求10所述的溶液或冻干形式的激活细胞毒性T淋巴细胞的药物组合物。
(b)可选的第二个容器，其含有冻干粉剂型的稀释剂或重组溶液；
(c)可选的至少一种选自由根据SEQ ID 4至24的肽构成的组的肽，以及
(d)可选的使用溶液和/或重组和/或使用冻干粉剂型的说明书。
15.一种抗体，当其与一种相应HLA分子络合时特异性对抗根据ID 1至24的任一序列的肽，其中该抗体优选为多克隆抗体、单克隆抗体和/或嵌合抗体。
CN200980117564.0A 2008-05-14 2009-05-14 源自生存素的强力mhc ii类肽 Expired - Fee Related CN102027006B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5318208P 2008-05-14 2008-05-14
EP08008944.4 2008-05-14
EP08008944.4A EP2119726B2 (en) 2008-05-14 2008-05-14 Novel and powerful MHC-class II peptides derived from survivin and neurocan
US61/053,182 2008-05-14
PCT/EP2009/003447 WO2009138236A1 (en) 2008-05-14 2009-05-14 Novel and powerful mhc-class ii petptides derived from survivin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102027006A true CN102027006A (zh) 2011-04-20
CN102027006B CN102027006B (zh) 2016-01-13

Family

ID=39789337

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980117564.0A Expired - Fee Related CN102027006B (zh) 2008-05-14 2009-05-14 源自生存素的强力mhc ii类肽

Country Status (24)

Country Link
US (5) US8647629B2 (zh)
EP (3) EP2119726B2 (zh)
JP (1) JP5663473B2 (zh)
KR (2) KR101602024B1 (zh)
CN (1) CN102027006B (zh)
AU (1) AU2009248413B2 (zh)
BR (2) BRPI0912622A2 (zh)
CA (1) CA2724198C (zh)
CY (2) CY1115999T1 (zh)
DK (2) DK2119726T5 (zh)
EA (1) EA019603B1 (zh)
ES (2) ES2532896T5 (zh)
HK (2) HK1209757A1 (zh)
HR (2) HRP20150300T4 (zh)
HU (2) HUE024541T2 (zh)
MX (1) MX2010012443A (zh)
NO (1) NO2119726T3 (zh)
NZ (1) NZ588605A (zh)
PL (2) PL2119726T5 (zh)
PT (2) PT2119726E (zh)
RS (1) RS53872B2 (zh)
SI (2) SI2119726T2 (zh)
UA (1) UA103481C2 (zh)
WO (1) WO2009138236A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107428810A (zh) * 2015-03-17 2017-12-01 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于胰腺癌和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物
CN107531754A (zh) * 2015-03-27 2018-01-02 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于各种肿瘤免疫治疗的新型肽和肽组合物
CN107922469A (zh) * 2015-07-15 2018-04-17 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于上皮性卵巢癌和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物
CN109152813A (zh) * 2016-05-25 2019-01-04 伊玛提克斯生物技术有限公司 作为靶标以及用于胆囊癌和胆管癌以及其他癌症免疫治疗的新型肽、肽组合物
CN109937364A (zh) * 2016-06-27 2019-06-25 朱诺治疗学股份有限公司 Mhc-e限制性表位、结合分子以及相关方法和用途

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012079878A2 (en) * 2010-12-14 2012-06-21 Immatics Biotechnologies Gmbh Hla-binding peptides derived from prostate-associated antigenic molecules and methods of use thereof
WO2006023598A2 (en) 2004-08-19 2006-03-02 University Of Maryland, Baltimore Prostate-specific antigen-derived mhc class ii-restricted peptides and their use in vaccines to treat or prevent prostate cancer
US7994276B2 (en) * 2007-07-27 2011-08-09 Immatics Biotechnologies Gmbh Composition of tumour-associated peptides and related anti-cancer vaccine
DE602008000891D1 (de) * 2008-04-30 2010-05-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Neuartige Formulierungen von Tumor-assoziierten Peptiden, welche an menschliche Leukozytenantigene der Klasse I oder II für Impfungen binden
HUE024541T2 (hu) 2008-05-14 2016-01-28 Immatics Biotechnologies Gmbh Szurvivinbõl és neurocanból származó új és hatásos II-es osztályú MHC peptidek
ES2667025T3 (es) * 2009-12-15 2018-05-09 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Composición seca de hormona de crecimiento unida transitoriamente a un portador de polímero
FR2955112B1 (fr) 2010-01-14 2012-01-20 Isp Investments Inc Nouveaux peptides anti-age modulateurs de la survivine et compositions les comprenant
GB201004575D0 (en) * 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh Composition of tumor associated peptides and related anti cancer vaccine for the treatment of gastric cancer and other cancers
GB201009222D0 (en) * 2010-06-02 2010-07-21 Immatics Biotechnologies Gmbh Improved cancer therapy based on tumour associated antigens derived from cyclin D1
US9109007B2 (en) * 2010-08-18 2015-08-18 Purdue Pharma L.P. MHC-I restricted epitopes containing non-natural amino acid residues
CN102181401B (zh) * 2011-02-01 2013-04-24 北京市肿瘤防治研究所 存活素酶联免疫试剂盒及其应用
RU2687144C2 (ru) * 2013-02-05 2019-05-07 Нитто Денко Корпорейшн Композиция противораковой вакцины, содержащей пептид wt1, для трансдермального введения
DE102013012432A1 (de) * 2013-07-29 2015-01-29 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Immuntherapie von Prostatakrebs
WO2015066057A2 (en) * 2013-10-28 2015-05-07 Baylor College Of Medicine Expansion of cmv-specific t cells from cmv-seronegative donors
GB201319446D0 (en) 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
GB201321242D0 (en) * 2013-12-02 2014-01-15 Immune Targeting Systems Its Ltd Immunogenic compound
KR20220167337A (ko) * 2015-03-27 2022-12-20 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 다양한 종양에 대한 면역요법에서의 사용을 위한 펩티드 및 펩티드의 조합
NL2014935B1 (en) 2015-06-08 2017-02-03 Applied Immune Tech Ltd T cell receptor like antibodies having fine specificity.
EP3919507A3 (en) * 2015-07-01 2022-01-12 Immatics Biotechnologies GmbH Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
GB201513921D0 (en) * 2015-08-05 2015-09-23 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against prostate cancer and other cancers
MY198087A (en) * 2015-10-05 2023-07-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against small cell lung cancer and other cancers
GB201521746D0 (en) * 2015-12-10 2016-01-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against CLL and other cancers
PE20230343A1 (es) * 2015-12-11 2023-03-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptidos que estimulan respuestas inmunitarias antitumorales
IL259931B2 (en) 2015-12-16 2024-02-01 Gritstone Bio Inc Identification of neo-antigens, preparation, and use
GB201522667D0 (en) * 2015-12-22 2016-02-03 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against breast cancer and other cancers
SG10202111399YA (en) 2015-12-22 2021-11-29 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against breast cancer and other cancers
GB201604458D0 (en) * 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against cancers
GB201604755D0 (en) * 2016-03-21 2016-05-04 Vaxeal Res Sas Immunogenic compositions
US20200237819A1 (en) * 2016-06-28 2020-07-30 Geneius Biotechnology, Inc. T cell compositions for immunotherapy
CA3031170A1 (en) 2016-09-21 2018-03-29 Amal Therapeutics Sa Fusion comprising a cell penetrating peptide, a multi epitope and a tlr peptide agonist for treatment of cancer
EP4317432A3 (en) 2016-12-08 2024-04-17 Immatics Biotechnologies GmbH T cell receptors with improved pairing
DE102016123893A1 (de) 2016-12-08 2018-06-14 Immatics Biotechnologies Gmbh T-Zellrezeptoren mit verbesserter Bindung
AR110857A1 (es) 2017-01-27 2019-05-08 Immatics Biotechnologies Gmbh Péptidos y combinaciones de péptidos para el uso en la inmunoterapia contra el cáncer de ovario y otros tipos de cáncer
EP3573647B1 (en) 2017-01-27 2023-04-05 Immatics Biotechnologies GmbH Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
US20180264095A1 (en) 2017-03-03 2018-09-20 Treos Bio Zrt Population-based immunogenic peptide identification platform
US10800823B2 (en) * 2017-07-07 2020-10-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against lung cancer, including NSCLC, SCLC and other cancers
CA3075363A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Enterome S.A. Microbiota sequence variants of tumor-related antigenic epitopes
AU2018348165A1 (en) 2017-10-10 2020-05-21 Gritstone Bio, Inc. Neoantigen identification using hotspots
KR20200090855A (ko) 2017-11-22 2020-07-29 그릿스톤 온콜로지, 인코포레이티드 신생항원에 대한 접합 에피토프 제시 감소
DE102018107224A1 (de) * 2018-02-21 2019-08-22 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptide und Kombinationen von Peptiden nicht-kanonischen Ursprungs zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten
WO2019197563A2 (en) 2018-04-11 2019-10-17 Enterome S.A. Immunogenic compounds for treatment of fibrosis, autoimmune diseases and inflammation
FI3773689T3 (fi) 2018-04-11 2023-01-31 Antigeenisiä peptidejä syövän ehkäisyyn ja hoitoon
WO2019218016A1 (en) * 2018-05-15 2019-11-21 Interk Peptide Therapeutics Limited Peptide activating agent
JP2021523945A (ja) * 2018-05-15 2021-09-09 インテルク ペプチド セラピューティクス リミテッド 活性化剤
MA53543A (fr) 2018-09-04 2021-07-14 Treos Bio Ltd Vaccins peptidiques
WO2021074389A1 (en) 2019-10-16 2021-04-22 Enterome S.A. Immunogenic compounds for treatment of adrenal cancer
SI4021487T1 (sl) 2019-11-15 2024-03-29 Enterome S.A., Antigenski peptidi za preprečevanje in zdravljenje b-celične malignosti
IL296881A (en) * 2020-04-14 2022-12-01 Universit? De Montr?Al New antigens specific for acute myeloid leukemia (aml) and their uses
IL308018A (en) * 2021-04-30 2023-12-01 Kalivir Immunotherapeutics Inc Oncolytic viruses for different MHC expression
WO2023021056A1 (en) * 2021-08-17 2023-02-23 Intomics A/S Vaccine design pipeline
WO2023187127A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Enterome S.A. Antigenic peptides for prevention and treatment of cancer

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004022709A2 (en) * 2002-09-06 2004-03-18 Mannkind Corporation Epitope sequences
WO2007036638A1 (fr) * 2005-09-30 2007-04-05 Commissariat A L'energie Atomique Epitopes t cd4+ de la survivine et leurs applications

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4440859A (en) 1977-05-27 1984-04-03 The Regents Of The University Of California Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
ES8105035A1 (es) 1978-12-22 1981-05-16 Biogen Nv Un metodo para producir al menos un polipeptido que muestra antigenicidad de hbv
US4530901A (en) 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4342566A (en) 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
US4678751A (en) 1981-09-25 1987-07-07 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
US4766075A (en) 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US4582800A (en) 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4677063A (en) 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
US4772547A (en) * 1986-02-03 1988-09-20 Hoffmann-La Roche Inc. HTLV-III envelope peptides
US4897445A (en) 1986-06-27 1990-01-30 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Method for synthesizing a peptide containing a non-peptide bond
US5057540A (en) * 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
ES2138662T3 (es) 1993-06-03 2000-01-16 Therapeutic Antibodies Inc Produccion de fragmentos de anticuerpos.
AUPM322393A0 (en) 1993-12-24 1994-01-27 Austin Research Institute, The Mucin carbohydrate compounds and their use in immunotherapy
DE69723230T2 (de) 1996-01-17 2004-05-27 Imperial College Innovations Ltd. Immunotherapie mit verwendung von zytotoxischen t lymphozyten (ctl)
US5849589A (en) 1996-03-11 1998-12-15 Duke University Culturing monocytes with IL-4, TNF-α and GM-CSF TO induce differentiation to dendric cells
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6420518B1 (en) * 1997-04-04 2002-07-16 Genetech, Inc. Insulin-like growth factor agonist molecules
US6255055B1 (en) * 1998-03-09 2001-07-03 Wisconsin Alumni Research Foundation c-myc coding region determinant-binding protein (CRD-BP) and its nucleic acid sequence
US6274362B1 (en) * 1999-02-04 2001-08-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. RGS-containing molecules and uses thereof
IL151860A0 (en) 2000-03-27 2003-04-10 Technion Res & Dev Foundation Single chain class i major histocompatibility complexes, constructs encoding same and methods of generating same
US20040191260A1 (en) 2003-03-26 2004-09-30 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof
EP1300418A1 (en) * 2001-10-04 2003-04-09 Erasmus Universiteit Rotterdam Gene regulation by oligopeptides
WO2003042661A2 (en) * 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
WO2003051051A1 (en) 2001-12-13 2003-06-19 Koninklijke Philips Electronics N.V. Recommending media content on a media system
US7892559B2 (en) * 2002-01-30 2011-02-22 Survac Aps Survivin-derived peptides and use thereof
US6992176B2 (en) 2002-02-13 2006-01-31 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease
JP2005533486A (ja) 2002-02-20 2005-11-10 ダイアックス、コープ Ｍｈｃ−ペプチド複合体結合リガンド
DE10225144A1 (de) 2002-05-29 2003-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh An MHC-Moleküle bindende Tumor-assoziierte Peptide
US7468254B2 (en) * 2003-01-21 2008-12-23 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP
JP2007519910A (ja) * 2004-01-28 2007-07-19 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 腫瘍関連ペプチドの同定および定量方法
DE102004026135A1 (de) * 2004-05-25 2006-01-05 Immatics Biotechnologies Gmbh An MHC-Moleküle bindende Tumor-assoziierte Peptide
WO2006023598A2 (en) * 2004-08-19 2006-03-02 University Of Maryland, Baltimore Prostate-specific antigen-derived mhc class ii-restricted peptides and their use in vaccines to treat or prevent prostate cancer
PT1806359E (pt) 2005-09-05 2010-05-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptídeos associados a tumor ligando promiscuamente às moléculas do antigénio de leucócitos humanos (hla) da classe ii
PL1760089T3 (pl) 2005-09-05 2010-03-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptydy towarzyszące nowotworom, wiążące się z cząsteczkami klasy I i II antygenów ludzkich leukocytów (HLA) i związana z nimi szczepionka przeciwnowotworowa
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
WO2007056511A2 (en) † 2005-11-09 2007-05-18 Ontherix, Inc. Metal-binding therapeutic peptides
US7994276B2 (en) * 2007-07-27 2011-08-09 Immatics Biotechnologies Gmbh Composition of tumour-associated peptides and related anti-cancer vaccine
DE602008000891D1 (de) * 2008-04-30 2010-05-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Neuartige Formulierungen von Tumor-assoziierten Peptiden, welche an menschliche Leukozytenantigene der Klasse I oder II für Impfungen binden
HUE024541T2 (hu) † 2008-05-14 2016-01-28 Immatics Biotechnologies Gmbh Szurvivinbõl és neurocanból származó új és hatásos II-es osztályú MHC peptidek
ES2536465T3 (es) * 2008-10-01 2015-05-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Composición de péptidos tumor-asociados y relacionados con la vacuna contra el cáncer para el tratamiento de glioblastoma (GBM) y otros cánceres

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004022709A2 (en) * 2002-09-06 2004-03-18 Mannkind Corporation Epitope sequences
WO2007036638A1 (fr) * 2005-09-30 2007-04-05 Commissariat A L'energie Atomique Epitopes t cd4+ de la survivine et leurs applications

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107428810A (zh) * 2015-03-17 2017-12-01 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于胰腺癌和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物
CN107531754A (zh) * 2015-03-27 2018-01-02 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于各种肿瘤免疫治疗的新型肽和肽组合物
CN107922469A (zh) * 2015-07-15 2018-04-17 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于上皮性卵巢癌和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物
CN114163501A (zh) * 2015-07-15 2022-03-11 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于上皮性卵巢癌和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物
CN109152813A (zh) * 2016-05-25 2019-01-04 伊玛提克斯生物技术有限公司 作为靶标以及用于胆囊癌和胆管癌以及其他癌症免疫治疗的新型肽、肽组合物
CN109152813B (zh) * 2016-05-25 2024-01-16 伊玛提克斯生物技术有限公司 作为靶标以及用于胆囊癌和胆管癌以及其他癌症免疫治疗的新型肽、肽组合物
CN109937364A (zh) * 2016-06-27 2019-06-25 朱诺治疗学股份有限公司 Mhc-e限制性表位、结合分子以及相关方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP2291395B1 (en) 2015-08-12
EP2291395A1 (en) 2011-03-09
CY1115999T1 (el) 2017-01-25
KR20110021881A (ko) 2011-03-04
HK1156323A1 (zh) 2012-06-08
KR20130041375A (ko) 2013-04-24
JP2011520436A (ja) 2011-07-21
AU2009248413A1 (en) 2009-11-19
HUE024541T2 (hu) 2016-01-28
DK2119726T5 (en) 2018-03-26
RS53872B2 (sr) 2018-06-29
PT2119726E (pt) 2015-03-30
US20140127242A1 (en) 2014-05-08
SI2291395T1 (sl) 2015-10-30
US10434136B2 (en) 2019-10-08
SI2291395T2 (sl) 2019-03-29
ES2532896T3 (es) 2015-04-01
WO2009138236A1 (en) 2009-11-19
EP2119726B2 (en) 2017-11-29
ES2549088T5 (es) 2019-04-29
HRP20150300T4 (hr) 2018-03-09
ES2549088T3 (es) 2015-10-22
CN102027006B (zh) 2016-01-13
US8647629B2 (en) 2014-02-11
DK2119726T4 (en) 2018-02-19
AU2009248413B2 (en) 2014-07-17
PL2291395T3 (pl) 2016-01-29
MX2010012443A (es) 2010-12-20
US20100029571A1 (en) 2010-02-04
KR101602024B1 (ko) 2016-03-09
HK1209757A1 (zh) 2016-04-08
EP2119726B1 (en) 2014-12-24
EA019603B1 (ru) 2014-04-30
NO2119726T3 (zh) 2015-05-23
US9498512B2 (en) 2016-11-22
HUE028102T2 (en) 2016-11-28
DK2291395T3 (da) 2015-09-21
BRPI0912622A2 (pt) 2016-05-03
SI2119726T1 (sl) 2015-05-29
BR122019014468B1 (pt) 2020-09-15
DK2119726T3 (en) 2015-02-16
RS53872B1 (en) 2015-08-31
DK2291395T4 (en) 2019-02-18
PT2291395E (pt) 2015-10-23
CA2724198C (en) 2016-03-22
HRP20150300T1 (hr) 2015-04-24
PL2291395T5 (pl) 2019-04-30
US20140086943A1 (en) 2014-03-27
ES2532896T5 (es) 2018-03-20
US20200078439A1 (en) 2020-03-12
PL2119726T5 (pl) 2018-04-30
KR101509284B1 (ko) 2015-04-10
HRP20151135T4 (hr) 2019-03-08
EP2899206A1 (en) 2015-07-29
US20130323272A1 (en) 2013-12-05
EP2119726A1 (en) 2009-11-18
JP5663473B2 (ja) 2015-02-04
HRP20151135T1 (hr) 2015-11-20
CY1117171T1 (el) 2017-04-05
SI2119726T2 (en) 2018-03-30
PL2119726T3 (pl) 2015-05-29
NZ588605A (en) 2012-06-29
EA201071297A1 (ru) 2011-04-29
UA103481C2 (ru) 2013-10-25
EP2291395B2 (en) 2018-11-14
BR122019014468B8 (pt) 2021-07-27
US11957729B2 (en) 2024-04-16
CA2724198A1 (en) 2009-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11957729B2 (en) Powerful MHC-class II peptides derived from survivin
KR102493344B1 (ko) 자궁암 치료
ES2607460T3 (es) Nueva inmunoterapia contra varios tumores incluidos tumores neuronales y cerebrales
CN101809148A (zh) 神经元和脑肿瘤的新型免疫疗法
EP3897698A2 (en) Immunotherapy with b*08 restricted peptides and combination of peptides against cancers and related methods
AU2017247607A1 (en) Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against AML and other cancers
Class et al. Patent application title: NOVEL AND POWERFUL MHC-CLASS II PEPTIDES DERIVED FROM SURVIVIN Inventors: Hans Georg Rammensee (Tuebingen, DE) Hans Georg Rammensee (Tuebingen, DE) Stefan Stevanovic (Tuebingen, DE) Stefan Stevanovic (Tuebingen, DE) Cecile Gouttefanges (Tuebingen, DE) Toni Weinschenk (Aichwald, DE) Peter Lewandrowski (Tubingen-Unterjesingen, DE) Assignees: IMMATICS BIOTECHNOLOGIES GMBH

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160113

Termination date: 20210514