BR122019014468B1

BR122019014468B1 - Uso de peptídeos de mhc de classe ii derivados de survivina

Info

Publication number: BR122019014468B1
Application number: BR122019014468-0A
Authority: BR
Inventors: Stefan Stevanovic; Cécile Gouttefangeas; Hans-Georg Rammensee; Toni Weinschenk; Peter LEWANDROWSKI
Original assignee: Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2008-05-14
Filing date: 2009-05-14
Publication date: 2020-09-15
Also published as: ES2549088T3; EP2119726B2; US11957729B2; US20100029571A1; EP2119726A1; HUE024541T2; US8647629B2; EP2119726B1; CY1117171T1; HRP20150300T4; PL2119726T3; AU2009248413B2; US10434136B2; SI2119726T2; CA2724198A1; KR20110021881A; PL2291395T5; JP5663473B2; DK2119726T4; HK1156323A1

Abstract

a presente invenção refere-se a peptídeos, ácidos nucleicos e células para utilização em métodos imunoterápicos. em particular, a presente invenção refere-se à imunoterapia do câncer. a presente invenção refere-se ainda a epitopos peptídicos de célula t citotóxica (ctl) associados a tumores e derivados de survivina, sozinhos ou em combinação com outros peptídeos associados a tumores, que sirvam de ingredientes farmacêuticos ativos em composições de vacinas estimuladoras de respostas imunes antitumorais. a presente invenção refere-se a três novas sequências peptídicas e suas variações derivadas de moléculas hla classe i ou ii de células tumorais humanas, que podem ser usadas em composições de vacinas para provocar respostas imunes antitumorais.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a peptídeos, ácidos nucleicos e células para utilização em métodos imunoterápicos. Em particular, a presente invenção refere-se à imunoterapia do câncer. A presente invenção refere-se ainda a epitopos peptídicos de célula T citotóxica (CTL) associada a tumores e derivados de survivina, sozinhos ou em combinação com outros peptídeos associados a tumores, que sirvam de ingredientes farmacêuticos ativos em composições de vacinas estimuladoras de respostas imunes antitumorais. A presente invenção refere-se a três novas sequências peptídicas e suas variações derivadas de moléculas HLA classe I ou II de células tumorais humanas utilizáveis em composições de vacinas para provocar respostas imunes antitumorais.

Antecedentes da Invenção

[0002] Gliomas são tumores de cérebro provenientes de células gliais no sistema nervoso. As células gliais, geralmente chamado neuroglia ou simplesmente glia, são células não neuronais que fornecem apoio e nutrição, mantêm homeostase, formam mielina e participam na transmissão de sinal no sistema nervoso. Os dois subgrupos de gliomas mais importantes são astrocitomas e oligodendrogliomas, denominados de acordo com o tipo normal de célula glial da qual eles se originaram (astrócitos ou oligodendrócitos, respectivamente). Pertencente ao subgrupo de astrocitomas, o glioblastoma multiforme (citado a partir de agora simplesmente como glioblastoma) é o tumor de cérebro maligno mais comum em adultos e é responsável por aproximadamente 40% de todos os tumores malignos de cérebro e aproximadamente 50% dos gliomas (CBTRUS, 2006). Ele invade agressivamente o sistema nervoso central e é classificado no nível mais elevado de malignidade (grau IV) entre todos os gliomas. Glioblastomas continuam sendo incuráveis, embora haja progresso constante em seu tratamento devido a melhorias em neuroimagens, microcirurgia e diferentes opções de tratamento, tal como temozolomida e radiação (Macdonald, 2001; Burton and Prados, 2000; Prados and Levin, 2000). A taxa de letalidade deste tumor cerebral é muito alta: a expectativa de vida média é 9 a 12 meses depois do primeiro diagnóstico. O índice de sobrevivência de 5 anos de 1986 a 1990 era de 8.0%. Até agora, o índice de sobrevivência de cinco anos que após terapia agressiva inclusive ressecção de tumor bruto ainda é menos do que 10% (Burton and Prados, 2000; Nieder et al., 2000; Napolitano et al., 1999; Dazzi et al., 2000). Consequentemente, há uma forte necessidade médica para uma alternativa e método terapêutico eficaz.

[0003] As células de tumor de glioblastomas são as mais não diferenciadas entre os tumores de cérebro, pois as células de tumor têm alto potencial de migração e proliferação e são altamente invasivas, resultando em um prognóstico muito pobre. Glioblastomas levam à morte devido a um crescimento rápido, agressivo e infiltrativo no cérebro. O padrão de crescimento infiltrativo é responsável pela natureza inresectável destes tumores. Glioblastomas também são relativamente resistentes à radiação e quimioterapia e, sendo assim, os índices de recorrência pós-tratamento são altos. Além do mais, a resposta imune às células neoplásicas é basicamente ineficaz em erradicar completamente todas as células neoplásicas seguindo terapias de resecção e radiação (Roth and Weller, 1999; Dix et al., 1999; Sablotzki etal., 2000).

[0004] Glioblastoma é classificado em glioblastoma primário (de novo) e glioblastoma secundário, dependendo das diferenças no mecanismo de gene durante a transformação maligna de astrócitos não diferenciados ou células de glial precursoras. Glioblastoma secundário ocorre em uma população mais jovem de até 45 anos de idade. Durante 4 a 5 anos, em média, o glioblastoma secundário desenvolve-se de um astrocitoma de baixo nível a um astrocitoma não diferenciado. Em contraste, o glioblastoma primário predominantemente ocorre numa população mais velha com uma idade média de 55 anos. Geralmente, o glioblastoma primário ocorre como glioblastoma fulminante caracterizado por progressão de tumor dentro de 3 meses a partir do estado sem anormalidades clínicas ou patológicas (Pathology and Genetics of the Nervous Systems. 29-39 (IARC Press, Lyon, France, 2000)).

[0005] Glioblastoma migra ao longo de nervos de mielinizados e se expande largamente no sistema nervoso central. Na maioria dos casos o tratamento cirúrgico só mostra efeito terapêutico sustentável limitado (Neurol. Med. Chir. (Tóquio) 34, 91-94, 1994; Neurol. Med. Chir. (Tóquio) 33, 425-458, 1993; Neuropathology 17, 186-188, 1997), (Macdonald, 2001; Prados and Levin, 2000).

[0006] Células malignas de glioma fogem da detecção pelo sistema imune do hospedeiro ao produzir agentes imunossupressivos que comprometem a proliferação de células Tea produção de citoquinas imunoestimulantes IL-2 (Dix et al., 1999).

[0007] Os neoplasmas intracraniais podem surgir de qualquer tipo de estruturas ou células presentes no SNC, inclusive o cérebro, meninges, glândula pituitária, crânio e mesmo do tecido embrionário residual. A incidência anual de tumores cerebrais primários nos Estados Unidos é de 14 casos por 100.000. Os tumores de cérebro primários mais comuns são meningiomas, representando 27% de todos os tumores primários de cérebro, e glioblastomas, representando 23% de todos os tumores primários de cérebro (sendo que glioblastomas representam 40% dos tumores malignos de cérebro em adultos). Muitos destes tumores são agressivos e de alto nível. Tumores primários de cérebro são os tumores sólidos mais comuns em crianças e a segunda causa mais frequente de morte por câncer depois de leucemia em crianças.

[0008] A procura por um tratamento eficaz de glioblastomas em pacientes continua até hoje. Uma imunoterapia, ou tratamento via recrutamento do sistema imune, para combater estas células neoplásicas tem sido pesquisada. Primeiros resultados incentivadores foram obtidos em estudos imunoterapêuticos em humanos, nos quais respostas específicas de antígeno CTL puderam ser induzidas levando a um prolongamento dos tempos de sobrevivência mediana em comparação com aqueles obtidos na aplicação de tratamento padrão acompanhado por toxicidade mínima (Heimberger et al., 2006).

Carcinoma colorretal

[0009] De acordo com a Sociedade Americana de Câncer, câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comum nos EUA, afligindo mais de 175.000 novos pacientes cada ano. Nos EUA, Japão, França, Alemanha, Itália, Espanha e Reino Unido, ele afeta mais de 480.000 pacientes. É uma das causas mais comuns de mortalidade de câncer em países desenvolvidos. A sobrevivência relativa de 1 e 5 anos para pessoas com câncer colorretal é de 84% e 64%, respectivamente. A sobrevivência continua em queda depois de 5 anos para 57% em 10 anos após o diagnóstico. Quando o câncer colorretal é detectado numa fase precoce, localizada, a sobrevivência de 5 anos é de 90%, no entanto, apenas 39% dos cânceres colorretais são diagnosticados nesta fase, principalmente devido às baixas taxas de triagem. Depois que o câncer se espalhou regionalmente a envolver órgãos adjacentes ou linfonodos, a sobrevivência de 5 anos cai para 68%. Para pessoas com metástases distantes a sobrevivência de 5 anos é de 10%.

[00010] A pesquisa sugere que o princípio do câncer colorretal é o resultado de interações entre fatores herdados e ambientais. Na maioria dos casos, pólipos adenomatosos pareçam ser precursores de tumores colorretal; contudo, a transição pode demorar muitos anos. O fator primário de risco para câncer colorretal é a idade, com 90% de casos diagnosticados sobre a idade de 50 anos. Outros fatores de risco para câncer colorretal de acordo com a Sociedade Americana de Câncer incluem consumo de álcool, uma dieta alta em gordura e/ou de carne vermelha e uma ingestão insuficiente de frutas e verduras. A incidência continua a aumentar, especialmente em áreas tal como no Japão, onde a adoção de dietas ocidentalizadas com gordura em excesso, ingestão de carne e uma diminuição na ingestão de fibra podem ser a causa. No entanto, índices de incidência não aumentam tão rápido como previamente que pode ser devido ao aumento de proteções e remoções de pólipo, prevenindo assim uma progressão de pólipos ao câncer.

[00011] Como na maioria dos tumores sólidos, o tratamento de primeira linha é a cirurgia, no entanto, seus benefícios permanecem reservados a pacientes do estágio inicial, mas uma proporção significativa de pacientes é diagnosticada em estágios avançados da doença. Para regimes avançados de quimioterapia de câncer colorretal, regimes baseados em fluorouracila são um padrão de tratamento. A maioria destes regimes são os chamados protocolos FOLFOX (5-FU infusional/leucovorina mais oxaliplatina) e FOLFIRI (irinotecan, leucovorina, bolus e 5 FU de infusão contínua).

[00012] A introdução de citotóxicos de terceira-geração tal como irinotecan e oxaliplatina levantou a esperança de melhorar significativamente a eficácia, mas o prognóstico é ainda relativamente pobre, e o índice de sobrevivência geralmente permanece em aproximadamente 20 meses em doença metastática e, como um resultado, as expectativas não satisfeitas nesta doença permanecem elevadas.

[00013] Recentemente uma nova geração de drogas, agentes de alvo molecular, tais como Avastin (Bevacizumab) e Erbitux (Cetuximab), tornaram-se disponíveis e aproximadamente 40 compostos estão em etapa avançada de desenvolvimento clínico para diferentes estágios de câncer colorretal. As combinações de vários destes compostos aumentam o número de opções potenciais de tratamento a serem esperados para o futuro. A maioria vasta de substâncias está na fase II, com EGFR endereçado por estes compostos mais frequentemente do que por qualquer outra droga em desenvolvimento para câncer colorretal, que é devido ao fato de que em ~80% dos pacientes com câncer colorretal, a expressão de EGFR é sobrerregulada.

[00014] Testes clínicos com pacientes na etapa II combinando quimioterapia com os anticorpos monoclonais recentemente aprovados (mAbs) (cetuximab + irinotecan ou FOLFOX4; bevacizumab como um agente único ou junto com FOLFOX4) são conduzidos atualmente. Três a quatro anos de observação são esperados para resultados estatisticamente significativos destes testes.

[00015] Os anticorpos monoclonais (mAbs) atualmente usados em oncologia em geral tem uma chance excelente de não interferir na imunoterapia ativa. Na verdade, não há evidência pré-clínica (GABRILOVICH 1999) e clínica sugerindo que a depleção de VEGF (por bevacizumab) contribui positivamente para a ativação mediada DC de células T (Osada T, Chong G, Tansik R, Hong T, Spector N, Kumar R, Hurwitz HI, Dev I, Nixon AB, Lyerly HK, Clay T, Morse MA. The effect of anti-VEGF therapy on immature myeloid cell and dendritic cells in cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 2008 Jan 10.).

Carcinoma da próstata e outros tumores

[00016] Com uma estimativa de 27.050 óbitos em 2007, o câncer de próstata é a principal causa de morte por câncer nos homens. Embora as taxas de mortalidade tenham diminuído entre os homens brancos e afro-americanos desde o início de 1990, as taxas de homens afro-americanos permaneceram mais do que o dobro das taxas nos homens brancos. O câncer de próstata é o câncer mais frequentemente diagnosticado nos homens. Por razões que permanecem obscuras, a incidência é significativamente maior em homens afro-americanos do que nos homens brancos. As taxas de incidência de câncer de próstata têm mudado substancialmente nos últimos 20 anos: aumentou rapidamente entre 1988-1992, decaiu acentuadamente entre 1992-1995 e aumentou modestamente desde 1995. Estas tendências refletem em grande parte, o aumento dos testes do câncer da próstata com exame de sangue de antígeno prostático específico (PSA). Aumentos moderados das incidências na última década, mais provavelmente foram causados pelos testes PSA frequentemente realizados entre os homens com menos de 65 anos. Taxas de incidência de câncer de próstata têm sido estabilizadas nos homens com 65 anos e mais velhos. Taxas de pico em homens brancos em 1992 (237,6 por 100.000 homens) e homens afro- americanos em 1993 (342,8 por 100.000 homens).

[00017] Tratamento para câncer de próstata pode envolver a espera vigilante, cirurgia, radioterapia, ultrassom focalizado de alta intensidade (HIFU), a quimioterapia, a criocirurgia, a terapia hormonal, ou alguma combinação. Qual é a melhor opção depende do estágio da doença, do escore Gleason e do nível de PSA. Outros fatores importantes são a idade do homem, sua saúde geral, e os seus sentimentos sobre os tratamentos possíveis e seus possíveis efeitos colaterais. Como todos os tratamentos podem ter efeitos colaterais significativos, como a disfunção erétil e incontinência urinária, discussões de tratamento muitas vezes se concentram em equilibrar os objetivos da terapia com os riscos de alterações de estilo de vida.

[00018] Se o câncer se espalhou além da próstata, as opções de tratamento se alteram significativamente, a maioria dos médicos que tratam de câncer de próstata usa uma variedade de nomogramas para prever a probabilidade do câncer se espalhar. Tratamento por conduta expectante, HIFU, radioterapia, crioterapia e cirurgia são geralmente oferecidos aos homens cujo câncer ainda permanece dentro da próstata. A terapia hormonal e quimioterapia são reservadas para as doenças que se espalharam além da próstata. No entanto, há exceções: a terapia de radiação pode ser utilizada para alguns tumores avançados, e a terapia hormonal pode ser utilizada para alguns tumores em estágio inicial. A crioterapia, a terapia hormonal, e a quimioterapia e também pode ser oferecidas se o tratamento inicial falhar e se o câncer avançar.

[00019] Em um número significativo de pacientes com carcinoma de próstata submetidos à prostatectomia radical por causa da suspeita clínica de crescimento limitados aos órgãos, um processamento histológico definitivo do preparo cirúrgico mostra um tumor localmente extensivo ultrapassando as fronteiras do órgão. Esses pacientes têm um risco elevado de recaída local precoce, geralmente detectável como um nível de PSA crescente em termos de recidiva bioquímica. As opções de tratamento nesta situação incluem a radioterapia externa e a ablação hormonal, no entanto, o valor destas abordagens terapêuticas, especialmente no que diz respeito ao prolongamento da sobrevivência a longo prazo do paciente, não deve ser considerado como comprovado. Além disso, a perda de possíveis complicações associadas ao tratamento, tais como o desenvolvimento de estenose uretral (radioterapia), do libido e da impotência, o risco de uma redução de sais de cálcio do esqueleto, em termos de osteoporose, e um risco significativamente aumentado de fraturas ósseas (ablação de hormônios) devem ser considerados.

[00020] Mais de 90% de todos os cânceres da próstata são detectados nas fases locais e regionais, a taxa de sobrevivência de 5 anos em relação aos pacientes cujos tumores são diagnosticados nestes estágios se aproxima de 100%. Nos últimos 25 anos, a taxa de sobrevivência de 5 anos para todas as fases combinadas aumentou de 69% para quase 90%. De acordo com os dados mais recentes, a sobrevivência de 10 anos relativa é de 93% e sobrevivência de 15 anos é de 77%. As melhorias dramáticas na sobrevivência, especialmente de cinco anos, são em parte atribuível a um diagnóstico mais adiantado e melhorias no tratamento. No entanto, a taxa de sobrevivência cai significativamente após a disseminação para outros tecidos e órgãos.

Câncer de pulmão

[00021] Estimativa 210.000 novos casos são esperados em 2007 no EUA., representando cerca de 15% dos diagnósticos de câncer. A taxa de incidência está a diminuir significativamente nos homens, depois de uma elevação de 102 casos por 100.000 habitantes em 1984 para 78,5 em 2003. Nas mulheres, a taxa se aproxima de um patamar após um longo período de crescimento. O câncer de pulmão é classificado clinicamente como de pequenas células (13%) ou células não pequenas (87%) para os efeitos do tratamento.

[00022] O câncer de pulmão é responsável pela maioria das mortes por câncer em homens e mulheres. Estima-se que 160.390 mortes, que representam cerca de 29% das mortes por câncer, são esperadas para ocorrer em 2007. Desde 1987, mais mulheres morreram a cada ano por câncer de pulmão do que de câncer de mama. As taxas de mortalidade continuaram a diminuir significativamente nos homens de 1991-2003 em cerca de 1,9% ao ano. As taxas de morte por câncer de pulmão feminino estão se aproximando de um patamar fixo após aumentar continuamente durante várias décadas. Estas tendências da mortalidade por câncer de pulmão refletem a queda nas taxas de fumantes nos últimos 30 anos.

[00023] As opções de tratamento são determinadas pelo tipo (de pequenas células e células não pequenas) e estágio do câncer e incluem cirurgia, radioterapia, quimioterapia e terapias biológicas específicas, tais como o bevacizumabe (Avastin®) e erlotinibe (Tarceva®). Para os cânceres localizados, a cirurgia é geralmente o tratamento de escolha. Estudos recentes indicam que a sobrevivência no câncer de pulmão em estágio inicial, em células não pequenas é melhorada pela quimioterapia após a cirurgia. Pelo fato da doença costumar a se espalhar pelo tempo que for descoberto, a radioterapia e a quimioterapia são utilizadas com frequência, às vezes em combinação com a cirurgia. Quimioterapia isoladamente ou combinada com a radiação é o tratamento usual de escolha para o câncer de pulmão de pequenas células; sobre este regime, uma grande porcentagem de pacientes sofre de remissão, que é de longa duração, em alguns casos.

[00024] A sobrevivência em 1 ano relativo para câncer de pulmão aumentou ligeiramente de 37% em 1975-1979 para 42% em 2002, em grande parte devido às melhorias nas técnicas cirúrgicas e terapias combinadas. O índice de sobrevivência de 5 anos em todos os estágios é de apenas 16%. A taxa de sobrevivência é de 49% dos casos detectados quando a doença ainda é localizada, no entanto, apenas 16% dos cânceres do pulmão são diagnosticados nesta fase inicial. Tabela 1: estimativa de casos novos de câncer e mortes por sexo para os EUA: em 2007 (American Cancer Society. Cancer Facts & Figures 2007. Atlanta: American Cancer Society; 2007.)

[00025] Permanece, portanto, a necessidade de uma nova opção de tratamento eficaz e seguro para o glioblastoma, tumor de próstata, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer colorretal, carcinoma de células claras de células renais, câncer de pulmão, SNC, ovário, melanoma (Tamm et al. 1998), câncer de pâncreas, carcinoma epidermoide, leucemia e meduloblastoma e outros tumores que mostram uma superexpressão de survivina, melhorando o bem-estar dos pacientes sem o uso de agentes quimioterápicos ou outros agentes que podem provocar efeitos colaterais graves.

Sumário da Invenção

[00026] Em um primeiro aspecto da mesma, a presente invenção refere-se a um peptídeo compreendendo uma sequência selecionada do grupo SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 3 ou um variante destes que é 85% homóloga a SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 3 ou um variante destas que induzirá células T cruzando com a variante do dito peptídeo, na qual o dito peptídeo não é o polipeptídeo de comprimento total da survivina humana. Preferencialmente, o dito peptídeo é selecionado a partir de um peptídeo tendo um subtipo HLA específicos, como o HLA- A*02 ou HLA-DR.

[00027] Em um segundo aspecto da mesma, a presente invenção diz respeito a um ácido nucleico, codificando um peptídeo de acordo com a presente invenção, ou um vetor de expressão capaz de expressar disse ácidos nucleicos.

[00028] Em seu terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico ou o vetor de expressão de acordo com a presente invenção, em que a dita célula hospedeira de preferência é uma célula apresentadora de antígeno, em particular uma célula dendrítica ou célula apresentadora de antígenos.

[00029] Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a um método in vitro para a produção de linfócitos T citotóxicos ativados (CTL), que compreende contatar CTL in vitro com moléculas MHC de classe I carregadas com antígeno humano expressos na superfície de uma célula adequada apresentadoras de antígenos ou uma construção artificial que imita uma célula apresentadora de antígeno por um período de tempo suficiente para ativar a CTL de uma forma específica do antígeno, no qual o dito antígeno é um peptídeo de acordo com a presente invenção.

[00030] Uso de um peptídeo de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico ou o vetor de expressão de acordo com a presente invenção, a célula de acordo com a presente invenção, ou um linfócito T citotóxico ativado produzido de acordo com a presente invenção para o tratamento do câncer ou para a fabricação de um medicamento contra o câncer, em que o dito medicamento de preferência é uma vacina. Preferencialmente, o dito câncer é selecionado a partir de astrocitoma, astrocitoma pilocítica, tumor neuroectodérmico disembrioplástico, oligodendrogliomas, ependimoma, glioblastoma multiforme, gliomas mistos, oligoastrocitomas, meduloblastoma, retinoblastoma, neuroblastoma, germinoma, teratoma, gangliogliomas, gangliocitoma, gangliocitoma central, tumores neuroectodérmico primitivo (PNET, por exemplo, meduloblastoma, meduloepitelioma, neuroblastoma, retinoblastoma ependimoblastoma,), tumores do parênquima pineal pineocitoma (por exemplo, pineoblastoma), tumores de células ependimárias, tumores do plexo coroide, tumores gliais de origem incerta (por exemplo, gliomatose cerebral, astroblastoma), tumor de próstata glioblastoma, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma de células renais, carcinoma claro de células renais, câncer de pulmão, SNC, ovário, câncer melanoma de pâncreas, carcinoma epidermoide, leucemia, meduloblastoma, e outros tumores ou cânceres mostrando uma superexpressão de survivina.

[00031] Um kit contendo: (a) um recipiente que contém uma composição farmacêutica contendo um peptídeo de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico ou o vetor de expressão de acordo com a presente invenção, uma célula de acordo com a presente invenção, ou um linfócito T citotóxico ativado de acordo com a presente invenção, em solução ou na forma liofilizada, (b) opcionalmente, a solução de uma segunda embalagem contendo um solvente ou de reconstituição, para a formulação liofilizada, (c) opcionalmente, pelo menos um peptídeo selecionado do grupo constituído de peptídeos de acordo com a SEQ ID Nos 4 a 24, e (d) opcionalmente, instruções para o uso da solução e / ou a reconstituição e / ou o uso da formulação liofilizada.

[00032] Um método para a produção de um anticorpo que se liga especificamente a um complexo de histocompatibilidade humana principal (MHC) de classe I ou II complexado com um antígeno HLA- restrito, o método compreendendo: um imunizante geneticamente modificado não humano compreendendo células de mamíferos expressando os principais complexos de histocompatibilidade humana (MHC) de classe I ou II com uma forma solúvel de uma classe de moléculas MHC I ou II complexada com o dito antígeno HLA-restrito; isolando moléculas de mRNA de células produtoras de anticorpos do referido mamífero não humano, produzindo uma biblioteca de visualização de fagos exibindo proteína moléculas codificadas pelas ditas moléculas de mRNA; e isolando pelo menos uma biblioteca fagos da dita visualização de fagos, sendo que pelo menos um fago exibindo o referido anticorpo específico ligável para o dito complexo de histocompatibilidade humana principal (MHC) de classe I ou II complexado com o dito antígeno HLA-restrito.

[00033] Um anticorpo que se liga especificamente a um complexo de histocompatibilidade humana principal (MHC) de classe I ou II complexado com um antígeno HLA-restrito, onde o anticorpo de preferência é um anticorpo policlonal, anticorpos monoclonais e / ou um anticorpo quimérico.

Descrição detalhada da invenção

[00034] O termo "peptídeo" é usado aqui para designar uma série de resíduos de aminoácido, conectados um ao outro tipicamente por ligações peptídicas entre os grupos alfa-aminos e carbonilos dos aminoácidos adjacentes. Os peptídeos têm tipicamente 9 aminoácidos de comprimento, mas podem ser tão curtos quanto 8 aminoácidos de comprimento e tão longos quanto 16 aminoácidos de comprimento.

[00035] O termo "oligopeptídeo" é usado aqui para designar uma série de resíduos de aminoácido, conectados um ao outro tipicamente por ligações peptídicas entre os grupos alfa-aminos e carbonilos dos aminoácidos adjacentes. O comprimento do oligopeptídeo não é crítico para a invenção, enquanto o epitopo ou os epitopos corretos forem mantidos nele. Os oligopeptídeos são tipicamente menores do que aproximadamente 30 resíduos de aminoácido em comprimento e maiores do que aproximadamente 14 aminoácidos em comprimento.

[00036] O termo "polipeptídeo" é usado para designar uma série de resíduos de aminoácido, conectados um ao outro tipicamente por ligações peptídicas entre os grupos alfa-aminos e carbonilos dos aminoácidos adjacentes. O comprimento do polipeptídeo não é crítico para a invenção, enquanto o epitopo ou os epitopos corretos forem mantidos nele. Em contraste com os termos peptídeo ou oligopeptídeo, o termo polipeptídeo refere-se a moléculas contento mais do que aproximadamente 30 resíduos aminoácidos.

[00037] Um peptídeo, oligopeptídeo, proteína, ou codificação de polinucleotídeo para tal molécula é "imunogênico" (e assim um "imunógeno" dentro da presente invenção), se ele for capaz de induzir uma resposta imune. No caso da presente invenção, a imunogenicidade é mais precisamente definida como a capacidade de induzir uma resposta de célula T. Assim, um "imunógeno" seria uma molécula que seja capaz de induzir uma resposta imune, e no caso da presente invenção, uma molécula capaz de induzir uma resposta de célula T.

[00038] Um "epitopo" de célula T requer um peptídeo pequeno que é ligado a um receptor MHC da classe I ou II, formando um complexo ternário (cadeia alfa MHC da classe I, microglobulina beta-2 e peptídeo) que pode ser reconhecido por um rolamento de células T um receptor de células T que correspondem à ligação com o complexo MHC / peptídeo com afinidade adequada. Peptídeos ligação a moléculas MHC de classe I são geralmente de 8 a 14 aminoácidos de comprimento, e mais geralmente 9 aminoácidos de comprimento. Epitopos de células T que se ligam a moléculas MHC da classe II têm tipicamente 12 a 30 aminoácidos de comprimento. No caso dos peptídeos que se ligam às moléculas MHC da classe II, o mesmo peptídeo e o epitopo de célula T correspondente podem compartilhar um segmento núcleo comum, mas diferem no comprimento, devido à sequência de acompanhamento de diferentes comprimentos a montante do amino-terminal da sequência núcleo e a jusante do seu carbóxi-terminal, respectivamente. Receptores MHC da classe II têm uma conformação mais aberta, peptídeos ligados a receptores MHC da classe II são correspondentemente não completamente enterrados na estrutura da molécula de fenda de ligação de peptídeo MHC de classe II, pois eles estão na fenda de ligação de peptídeo MHC de classe I. Surpreendentemente, este não é o caso dos peptídeos de acordo com SEQ ID No 1, com pequenas variações no comprimento da ligação de peptídeos a uma redução extrema de atividade (vide abaixo).

[00039] Em humanos, existem três diferentes loci genéticos que codificam moléculas MHC da classe I (as moléculas de MHC do ser humano também são designadas antígenos leucocitários humanos (HLA)): HLA-A, HLA-B, e HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02, e HLA-A*11 são exemplos de diferentes moléculas MHC de classe I que podem ser expressas a partir destes loci. Tabela 2: os 30 alelos mais expressos em diferentes populaces

[00040] Há três locais genéticos diferentes que se codificam para moléculas MHC de classe II: HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP. Receptores MHC da classe II são heterodímeros constituídos por uma cadeia alfa e uma beta, ambas ancorando na membrana da célula através de uma região transmembrana. HLA-DRB1*04 e HLA-DRB1*07 são dois exemplos de diferentes alelos MHC da classe II beta que são conhecidos por serem codificados nesses locais. Alelos de classe II são muito polimórficos, por exemplo, várias centenas de diferentes alelos HLA-DRB1 têm sido descritas. Portanto, para fins terapêuticos e de diagnóstico, um peptídeo que se liga com afinidade adequada para vários receptores diferentes HLA de classe II é altamente desejável. Um peptídeo de ligação a várias moléculas diferentes HLA de classe II é chamado ligador promíscuo.

[00041] Como usado anteriormente, a referência a uma sequência de DNA inclui tanto um DNA de fita única como um de fita dupla. Assim, a sequência específica, a menos que o contexto indique contrariamente, refere ao DNA de fita única de tal sequência, o dúplex de tal sequência com seu complemento (DNA fita dupla) e o complemento de tal sequência. O termo "região de codificação" refere- se a essa porção de um gene que codifica-se naturalmente ou normalmente para o produto de expressão desse gene em seu ambiente natural genômico, isto é, a região codificando-se in vivo para o produto nativo de expressão do gene.

[00042] A região que se codifica pode ser de um gene normal, mutado ou alterado, ou mesmo proveniente de uma sequência de DNA, ou gene, totalmente sintetizado nos métodos utilizados em laboratório, bem-conhecidos pelos versados na técnica de síntese de DNA.

[00043] O termo "sequência de nucleotídeos" refere-se a um heteropolímero de desoxirribonucleótideos.

[00044] A sequência de nucleotídeos de codificação para um peptídeo particular, oligopeptídeo, ou polipeptídeo podem ocorrer naturalmente ou eles podem ser construídos sinteticamente. Geralmente, segmentos de DNA de codificação dos peptídeos, polipeptídeos, e proteínas desta invenção são montados de fragmentos de cDNA e ligadores de oligonucleotídeos curtos, ou de uma série de oligonucleotídeos, para fornecer um gene sintético de que é capaz de ser expresso numa unidade transcricional recombinante contendo elementos reguladores derivados de um operon microbial ou virai.

[00045] O termo "produto de expressão" significa o polipeptídeo ou proteína que é o produto natural de tradução do gene e qualquer sequência de ácido nucleico codificando resultados equivalentes de degeneração de código genético e, desta forma, codificando para o(s) mesmo(s) aminoácido(s).

[00046] O termo "fragmento", quando se refere a uma sequência de codificação, significa uma porção de DNA compreendendo menos do que a região de codificação completa, cujo produto de expressão essencialmente retém a mesma função ou atividade biológica do produto de expressão de toda a região de codificação.

[00047] O termo "segmento de DNA" se refere a um polímero de DNA, na forma de um fragmento separado ou como um componente maior de DNA, que foi derivado de DNA isolado pelo menos uma vez em forma substancialmente pura, isto é, livre de materiais endógenos contaminados e numa quantidade ou concentração que capacita identificação, manipulação e recuperação do segmento e suas sequências componentes de nucleotídeos por métodos bioquímicos padronizados, por exemplo, utilizando-se um vetor que clona. Tais segmentos são fornecidos na forma de uma leitura aberta emoldurada ininterrupta por sequências internas não traduzidas, ou introns, que são tipicamente presente em genes eucarióticos. As sequências de DNA não traduzidas podem estar presentes na jusante da leitura aberta emoldurada, onde o mesmo não interfere em manipulação ou expressão das regiões que codificam.

[00048] O termo "iniciador" significa uma sequência de ácido nucleico curta que pode ser emparelhada com uma fita de DNA e fornece um terminal 3'-OH livre, no qual uma polimerase de DNA começa uma síntese de uma corrente de desoxirribonucleótideo.

[00049] O termo "promotor" significa uma região de DNA envolvida em encadernação de polimerase de RNA para iniciar transcrição.

[00050] O termo "quadro de leitura aberta (ORF)" indica uma série de codificação de aminoácidos trigêmeos sem quaisquer códons de terminação e é uma sequência (potencialmente) traduzível para a proteína.

[00051] O termo "isolado" significa que o material é retirado de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural, se ele ocorre naturalmente). Por exemplo, um polinucleotídeo que ocorre naturalmente ou presente em um animal vivo não é isolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo - separado de alguns ou todos os materiais que coexistem no sistema natural - é isolado. Tais polinucleotídeos poderiam ser parte de um vetor e / ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos poderiam ser parte de uma composição, e ainda serem isolados em tal vetor ou composição, que não faz parte do seu ambiente natural.

[00052] Os polinucleotídeos, e polipeptídeos recombinantes ou imunogênicos, descritos de acordo com a presente invenção, também podem estar em forma "purificada". O termo "purificado" não exige pureza absoluta; e sim é pretendido como uma definição relativa, e pode incluir preparações que sejam altamente purificadas ou preparações que só são parcialmente purificadas, como esses termos são entendidos pelos versados na técnica. Por exemplo, clones individuais isolados de uma biblioteca de cDNA que foram purificados de maneira convencional para homogeneidade eletroforética. A purificação do material inicial ou material natural para ao menos uma ordem de magnitude, preferivelmente duas ou três ordens e, mais preferivelmente, quatro ou cinco ordens de magnitude sejam expressamente contempladas. Além do mais, o polipeptídeo reivindicado que tem uma pureza preferivelmente de 99.999%, ou ao menos 99.99% ou 99.9%; e ainda desejavelmente 99% por peso ou maior é expressamente contemplado.

[00053] Os ácidos nucleicos e produtos de expressão polipeptídeo descritos de acordo com a presente invenção, bem como vetores de expressão contendo esses ácidos nucleicos e/ou polipeptídeos, podem estar em "forma enriquecida". Como usado aqui, o termo "enriquecido" significa que a concentração do material é pelo menos aproximadamente 2, 5, 10, 100, ou 1000 vezes maior do que a sua concentração natural (por exemplo), vantajosamente 0,01 %, por peso, preferivelmente pelo menos aproximadamente 0,1% por peso. Preparações enriquecidas de aproximadamente 0,5%, 1%, 5%, 10%, e 20% por peso também são contemplados. As sequências, construtos, vetores, clones, e outros materiais constituindo a presente invenção podem vantajosamente estar em forma enriquecida ou isolada.

[00054] O termo "fragmento ativo" significa um fragmento que gera uma resposta imune (isto é, tem atividade imunogênica) quando administrado, sozinho ou opcionalmente com um adjuvante conveniente, a um animal, tal como a um mamífero, por exemplo, um coelho ou um camundongo, ou também um ser humano, tal resposta imune toma a forma de estimular uma resposta de célula T dentro do animal recipiente, tal como um ser humano. Por outro lado, o "fragmento ativo" também pode ser usado para induzir uma resposta de célula T in vitro.

[00055] Como utilizado aqui, os termos "porção", "segmento" e "fragmento", quando utilizados em relação aos polipeptídeos, referem- se a uma sequência contínua de resíduos, como resíduos de aminoácidos, que formam um subconjunto de sequência maior. Por exemplo, se um polipeptídeo for submetido a um tratamento com qualquer uma das endopeptidases comuns, tal como tripsina ou quinotripsina, os oligopeptídeos resultantes de tal tratamento representariam porções, segmentos ou fragmentos do polipeptídeo iniciais. Isto significa que qualquer fragmento como irá conter um segmento necessariamente como parte de sua sequência de aminoácidos, fragmento ou porção, que é substancialmente idêntico, se não exatamente idêntico, a uma sequência de SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 3, que correspondem à proteína que ocorre naturalmente, ou proteína "parental" da SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 3, ou seja, survivina. Quando usado em relação a polinucleotídeos, tais termos referem-se aos produtos produzidos por tratamento dos ditos polinucleotídeos com qualquer uma das endonucleases comuns.

[00056] De acordo com a presente invenção, o termo "identidade por cento" ou "idêntico por cento" quando se referir a uma sequência, significa que uma sequência é comparada com uma sequência reivindicada ou descrita depois do alinhamento da sequência ser comparada (a "Sequência Comparada") com a sequência reivindicada ou descrita (a "Sequência de Referência"). A Identidade Por Cento é então determinada de acordo com a seguinte fórmula:

[00057] Identidade por cento = 100 [I -(C/R)]

[00058] onde C é o número de diferenças entre a Sequência de Referência e a Sequência Comparada sobre o comprimento de alinhamento entre a Sequência de Referência e a Sequência Comparada, na qual

[00059] cada base ou aminoácido na Sequência de Referência que não tem uma base ou aminoácido correspondente alinhados na Sequência Comparada e

[00060] cada lacuna na Sequência de Referência e

[00061] cada base ou aminoácido alinhado na Sequência de Referência que seja diferente de uma base ou aminoácido alinhado correspondentemente na Sequência Comparada; constitui a diferença;

[00062] e R é o número de bases e aminoácidos na Sequência de Referência sobre o comprimento de alinhamento entre a Sequência Comparada com qualquer lacuna criada na Sequência de Referência também considerada como uma base ou um aminoácido.

[00063] Se um alinhamento existe entre a Sequência Comparada e a Sequência de Referência para as quais a identidade por cento como calculada acima é aproximadamente igual ou maior do que um mínimo especificado como Identidade por Cento, então a Sequência Comparada tem o mínimo especificado à Identidade por Cento mesmo que os alinhamentos possam existir, sendo que a Identidade por Cento calculada acima é menor do que a Identidade Por Cento especificada.

[00064] Os peptídeos originais descritos aqui podem ser modificados pela substituição de um ou mais resíduos em áreas diferentes, talvez seletivas, dentro da corrente peptídica, se não contrariamente determinadas. Tais substituições podem ser de uma natureza conservadora, por exemplo, onde um aminoácido é substituído por um aminoácido de estrutura e características similares, tal como onde um aminoácido hidrofóbico é substituído por outro aminoácido hidrofóbico. Ainda mais conservador seria a substituição de aminoácidos do mesmo tamanho ou tamanho similar e natureza química, tal como quando uma leucina é substituída por isoleucina. Em estudos de variações de sequência em famílias de proteínas homólogas que ocorrem naturalmente, algumas substituições de aminoácidos são mais toleradas do que outras, e estas muitas vezes mostram correlação de similaridades em tamanho, carga, polaridade e hidrofobicidade entre o aminoácido original e sua substituição, e essa é a base para a definição de "substituições conservadoras".

[00065] Substituições conservadoras são aqui definidas como trocas dentro de um dos cinco seguintes grupos: grupo 1 - resíduos pequenos, alifáticos, não polares ou levemente polares (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); grupo 2 - resíduos polares, carregados negativamente e seus amidos (Asp, Asn, Glu, Gin); grupo 3 - resíduos polares, carregados positivamente (His, Arg, Lys); grupo 4 - resíduos grandes, alifáticos, não polares (Met, Leu, He, Vai, Cys); e grupo 5 - resíduos grandes, aromáticos (Phe, Tyr, Trp).

[00066] Substituições menos conservadoras talvez envolvam a reposição de um aminoácido por outro que tenha características similares, mas é um pouco diferente em tamanho, tal como a substituição de uma alanina por um resíduo de isoleucina. Substituições altamente não conservadoras talvez envolva substituir um aminoácido acídico por um que seja polar, ou mesmo para um que seja básico em caráter. Tais substituições "radicais" não podem, no entanto, ser menosprezadas como potencialmente ineficaz, pois efeitos químicos não são totalmente previsíveis e substituições radicais também poderão resultar em efeitos esplendidos contrariamente não previsíveis de princípios químicos simples.

[00067] Naturalmente, tais substituições podem envolver estruturas diferentes dos L-aminoácidos comuns. Assim, D-aminoácidos talvez sejam substituídos pelos L-aminoácidos geralmente achados nos peptídeos antigênicos da invenção e, mais ainda, serem abrangidos pela descrição aqui tratada. Além do mais, aminoácidos possuindo grupos R não regulares (isto é, grupos R diferentes daqueles achados nos 20 aminoácidos comuns de proteínas naturais) também podem ser usados para propósitos de substituição para produzir imunógenos e polipeptídios imunogênicos de acordo com a invenção presente.

[00068] Se for determinado que substituições em mais de uma posição resultem em um peptídeo com atividade antigênica substancialmente equivalente ou maior como definido abaixo, então as combinações dessas substituições serão testadas para determinar se as substituições combinadas resultam em efeitos aditivos ou sinergéticos sobre a antigenicidade do peptídeo. Na maioria dos casos, não mais de quatro posições dentro do peptídeo seriam simultaneamente substituídas.

[00069] O termo "resposta de célula T" significa a proliferação e ativação específica de funções efetoras induzidas por um peptídeo in vitro ou in vivo. Para MHC CTLs restritos da classe I, as funções efetoras podem ser lise de células-alvo que apresentam peptídeo de forma peptídeo-pulsado, peptídeo-precursor-pulsado ou natural, secreção de citoquinas, preferivelmente Interferon-gama, TNF-alfa, ou IL-2 induzidos por peptídeo, secreção de moléculas efetoras, preferivelmente granzimas ou perforinas induzidas por peptídeo, ou degranulação. Para células T auxiliares MHC restritas da classe II, as funções efetoras podem ser secreções induzidas por peptídeo de citoquinas, preferivelmente, IFN-gama, TNF-alfa, IL-4, IL5, IL-10, ou IL- 2, ou degranulação induzida por peptídeo. Possíveis funções efetoras para CTLs e células T auxiliares não são limitados a esta lista.

[00070] Preferivelmente, quando os CTLs específicos para um peptídeo derivaram de qualquer uma das SEQ ID No: 1 a 3 são testados contra os peptídeos substituídos, a concentração peptídica em que os peptídeos substituídos realizam a metade do aumento máximo em lises relativa ao fundo não é mais do que aproximadamente 1 mM, preferivelmente não mais do que aproximadamente 1 pM, mais preferivelmente não mais do que aproximadamente 1 nM, e ainda mais preferivelmente não mais do que aproximadamente 100 pM, e em sua maioria preferivelmente não mais do que aproximadamente 10 pM. Também é preferido que o peptídeo substituído seja reconhecido por CTLs de mais de um indivíduo, ao menos dois, e mais preferivelmente três indivíduos.

[00071] Assim, os epitopos da presente invenção podem ser idênticos aos epitopos associados a tumores ou específicos de tumores que ocorrem naturalmente ou pode incluir epitopos que se diferem por não mais de quatro resíduos do peptídeo de referência, contanto que eles tenham atividade antigênica substancialmente idêntica.

[00072] A estimulação da resposta imune depende da presença de antígenos que sejam reconhecidos como estranhos pelo sistema imune do hospedeiro. A descoberta da existência de antígenos associados a tumores agora levantou a possibilidade de usar um sistema imune do hospedeiro para fomentar uma resposta imune que seja específica para antígenos-alvo expressos na superfície de células de tumor e que por este mecanismo de ação seja capaz de induzir regressão, estase ou crescimento mais lento do tumor. Vários mecanismos de aproveitamento das armas humorais e celulares do sistema imunológico estão sendo explorados atualmente na imunoterapia do câncer.

[00073] Alguns elementos específicos da resposta imune celular são capazes de reconhecer e destruir células tumorais. O isolamento de células T citotóxicas (CTL) a partir de populações celulares que se infiltram no tumor ou, a partir do sangue periférico, sugere que essas células desempenham um papel importante nas defesas imunes naturais contra o câncer (Cheever et al., 1993; Zeh, III et al., 1999). Baseado na análise de 415 espécimes de pacientes sofrendo de câncer colorretal, Galon et al. puderam demonstrar esse de tipo, densidade e localização de células imunes em tecido de tumor são realmente um melhor prognosticador para sobrevivência de pacientes do que o largamente utilizado enquadramento TNM de tumores. (Galon et al., 2006).

[00074] MHC da classe I apresentam peptídeos que resultam de clivagem de proteolítica de proteínas predominantemente endógenas, DRIPs e peptídeos maiores. Moléculas MHC da classe II podem ser encontradas predominantemente em células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs) e peptídeos presentes provenientes principalmente de proteínas exógenas ou transmembranas que são ocupadas por APCs durante o curso de endocitose, e transformadas posteriormente (Cresswell, 1994). Os complexos de peptídeo e molécula MHC de classe I são reconhecidos por linfócitos T citotóxicos CD8 positivos suportando o TCR apropriado (receptor de células T) e complexos de peptídeo e molécula MHC de classe II que são reconhecidos por células T auxiliares CD4 positivas suportando o TCR apropriado. Sabe-se que o TCR, o peptídeo e o MHC estão assim presentes em uma quantidade estequiométrica de 1:1:1.

[00075] As células T auxiliares CD4 positivas fazem um papel importante em induzir e apoiar respostas eficazes por células T citotóxicas CD8 positivas. (Wang and Livingstone, 2003; Sun and Bevan, 2003; Shedlock and Shen, 2003). Inicialmente, a preparação e a expansão de CTLs nos gânglios linfáticos são apoiadas por células T CD4 + (Schoenberger et al., 1998) . Um mecanismo, portanto, poderia ser a orientação de células CD8 + para o local de células T CD4 + funcionais de interação APC (Castellino et al., 2006). Finalmente, a geração de células de memória funcional CD8 + está na maioria dos casos, dependente da assistência de células T CD4 + (Sun and Bevan, 2003; Janssen et al., 2003). Por estas razões, a identificação de epitopos de células T de CD4 positivos derivados de tumor associados a antígenos (TAA) é de grande importância para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos para desencadear respostas imunes antitumorais (Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003). No local do tumor, as células T auxiliares apoiam um meio de citoquinas CTL amigáveis (Qin and Blankenstein, 2000; Mortara et al., 2006) e atraem células efetoras como, por exemplo, células CTLs NK, macrófagas, granulócitos (Marzo et al., 2000; Hwang et al., 2007).Na ausência de inflamação, a expressão de moléculas MHC de classe II se restringe principalmente a células do sistema imunológico, em especial às células profissionais apresentadoras de antígenos (APC), como por exemplo, os monócitos, células derivadas de monócitos, macrófagos e células dendríticas. Em pacientes com câncer, as células do tumor surpreendentemente expressaram moléculas MHC da classe II (Dengjel et al., 2006). Foi mostrado em modelos animais mamíferos, por exemplo, em camundongos, que mesmo na ausência de células efetoras de CTL (isto é, linfócitos de T CD8-positiva), células de T CD4-positivas são suficientes para impedir a manifestação de tumores via inibição de angiogênese por secreção de interferon-gama (IFNy) (Qin and Blankenstein, 2000). Também foi proposta a eliminação direta de células tumorais por células T citotóxicas CD4 + via linfotoxinas e granzimas B (Penna et al., 1992; Littaua et al., 1992).

[00076] Adicionalmente, foi demonstrado que células de T CD4- positivas reconhecidas de peptídeos de antígenos associados a tumor apresentados por moléculas HLA de classe II podem agir contra progressão de tumor via indução de respostas (Ab) de anticorpo (Kennedy etal., 2003).

[00077] Em contraste com peptídeos associados tumor que se ligam a moléculas HLA de classe I, apenas um número pequeno de ligantes da classe II de antígenos associados a tumor (TAA) foram descritos até a data de hoje.

[00078] Considerando que a expressão constitutiva das moléculas HLA classe II normalmente se limita a células do sistema imunológico (Mach et al., 1996), não se considerava possível isolar peptídeos classe II diretamente a partir de tumores primários. No entanto, Dengjel et al. recentemente foram bem-sucedidos em identificar um número de epitopos MHC de classe II diretamente de tumores (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1; Dengjel et al., 2006).

[00079] Os antígenos que são reconhecidos pelos linfócitos T citotóxicos específicos do tumor, ou seja, os seus epitopos, podem ser moléculas derivadas de todas as classes de proteínas, tais como enzimas, receptores, fatores de transcrição, etc. que são expressos e, em comparação com células inalteradas da mesma origem, regulamentados em células do respectivo tumor.

[00080] A classificação atual de antígenos associados a tumor (TAAs) contém os seguintes grupos importantes: (Novellino et al., 2005):

[00081] Os antígenos de câncer de testículo: os primeiros TAAs já identificados que puderam ser reconhecidos por células T (van der Bruggen et al., 1991) pertencem a esta classe, que originalmente foi chamada antígenos câncer-testículo (CT) por causa da expressão de seus membros em tumores humanos histologicamente diferentes e, entre tecidos normais, só em espermatócitos/espermatogônias de testículo e, ocasionalmente, em placentas. Já que as células de testículo não expressam moléculas HLA de classe I e II, estes antígenos não podem ser reconhecidos por células T em tecidos normais e, portanto podem ser considerados como imunologicamente tumor-específico. Exemplos conhecidos para antígenos de CT são os membros de família MAGE ou NY-ESO-1.

[00082] Os antígenos de diferenciação: estes TAAs são compartilhados entre tumores e o tecido normal do qual o tumor surgiu; a maioria é achada em melanomas e melanócitos normais. Muitos destas proteínas de linhagem relacionada de melanócitos são envolvidos na biossíntese de melanina e, portanto, não são específicos de tumor, mas não obstante largamente são usados para imunoterapia do câncer. Os exemplos incluem, mas não são limitados a, tirosinase e Melan-A/MART-1 para melanoma nem PSA para próstata câncer.

[00083] TAAS superexpressos: genes codificando TAAs largamente expressos foram detectados em tipos de tumores histologicamente diferentes assim em muitos tecidos normais, geralmente com expressão de nível mais baixo. É possível que muitos dos epitopos processados e potencialmente apresentado por tecidos normais estão sob o nível de limiar para reconhecimento de célula T, enquanto sua superexpressão em células de tumor pode desencadear uma resposta anticâncer quebrando a tolerância previamente estabelecida. Exemplos proeminentes para esta classe de TAAs são Her-2/neu, Survivina, Telomerase ou WT1.

[00084] Antígenos específicos de tumor: estes TAAs raros surgem de mutações de genes normais (tal como β-catenina, CDK4, etc.). Algumas destas mudanças moleculares são associadas com progressão e/ou transformação neoplásica. Os antígenos específicos de tumor geralmente podem induzir respostas imunes fortes sem induzir o risco para reações autoimunes contra tecidos normais. Por outro lado, estes TAAs são na maioria dos casos só relevante ao tumor exato, em que eles foram identificados e normalmente não são compartilhados entre muitos tumores individuais.

[00085] TAAs surgem de modificações anormais pós-translacionais: tais TAAs podem surgir de proteínas que não são nem específicas nem superexpressas em tumores, mas não obstante tornam-se associadas a tumor por processos pós-translacionais principalmente ativos em tumores. Os exemplos para esta classe surgem de padrões alterados de glicosilação levando a epitopos novos em tumores como para MUC1 ou eventos como junção de proteína durante degradação que podem ou não pode ser específica de tumor. (Hanada et al., 2004; Vigneron et al., 2004).

[00086] Proteínas oncovirais: estes TAAs são proteínas virais que podem fazer um papel crítico no processo oncogênico e, pelo fato de serem proteínas estranhas (não de origem humana), podem evocar uma resposta de célula T. Os exemplos de tais proteínas são as proteínas de vírus do tipo 16 humano da papiloma, E6 e E7, que são expressos em carcinomas cervicais.

[00087] Para que as proteínas sejam reconhecidas pelos linfócitos T citotóxicos como antígenos específicos ou associados do tumor e, para que sejam usadas num tratamento, elas precisam atender a certos pré-requisitos. O antígeno deve ser expresso principalmente por células tumorais e não por tecidos saudáveis normais ou preferivelmente em quantidades pequenas. Além disso, é desejável que o respectivo antígeno esteja presente não só num tipo específico de tumor, mas também que esteja presente em altas concentrações (por ex., número de cópias do respectivo peptídeo por célula). Antígenos específicos ou associados de tumor frequentemente são derivados de proteínas diretamente envolvidas em transformação de uma célula normal a uma célula de tumor, devido a uma função, por exemplo, em controle de ciclo de célula ou supressão de apoptose. Adicionalmente, alvos na jusante das proteínas também diretamente causativos para uma transformação também podem ser super- regulados e assim podem ser indiretamente associados a tumor. Tais antígenos indiretamente associados a tumor também podem ser alvos de uma tentativa de vacinação. (Singh-Jasuja et al., 2004). Em ambos os casos, é essencial a presença de epitopos na sequência de aminoácidos do antígeno, uma vez que esse peptídeo ("peptídeo imunogênico"), derivado de um antígeno associado a tumor, deve induzir uma resposta da célula T in vitro ou in vivo.

[00088] Basicamente, qualquer peptídeo capaz de ligar uma molécula MHC pode funcionar como um epitopo de célula T. Um pré- requisito para a indução de uma resposta de célula T in vitro ou in vivo é a presença de uma célula T com um TCR correspondente e a ausência de tolerância imunológica para este epitopo particular.

[00089] Portanto, TAAs são um ponto inicial para o desenvolvimento de uma vacina antitumor. Os métodos para identificar e caracterizar as TAAs são baseados no uso de CTL que pode ser isolado de pacientes ou pessoas saudáveis, ou são baseados na geração de perfis diferenciais de transcrição ou padrões de expressão peptídicos diferenciais entre tumores e tecidos normais. (Lemmel et al., 2004; Weinschenk etal., 2002).

[00090] No entanto, a identificação de genes sobre-expressos em tecidos de tumor ou linhagens humanas de célula de tumor, ou seletivamente expressos em tais tecidos ou linhas de célula, não fornece informações precisas quanto ao uso dos antígenos sendo transcritos destes genes numa terapia imune. Isto é porque só uma subpopulação individual de epitopos destes antígenos é conveniente para tal aplicação, pois uma célula de T com um TCR correspondente tem que estar presente e a tolerância imunológica para este epitopo particular deve estar ausente ou mínima. É, portanto, importante selecionar só esses peptídeos de proteínas sobre-expressos ou seletivamente expressos que são apresentados em relação a moléculas de MHC contra que uma célula T funcional pode ser achada. Tal célula T funcional é definida como uma célula T, pois o estímulo com um antígeno específico pode ser clonalmente expandido e pode executar funções efectoras ("célula T de efectoras").

[00091] As células T auxiliares desempenham um importante papel na coordenação da função efetora das células T citotóxicas na imunidade antitumoral. Os epitopos das células T auxiliares que provocam uma resposta das células T auxiliares do tipo TH1 apoiam as funções efetoras das células T assassinas CD8+, que incluem funções citotóxicas dirigidas contra as células tumorais que apresentam complexos peptídeo/MHC associados ao tumor nas superfícies celulares. Desta forma, os epitopos peptídicos de célula T auxiliar associados a tumores, isoladamente ou em combinação com outros peptídeos associados a tumores, podem servir como ingredientes farmacêuticos ativos em composições de vacinas estimuladoras das respostas imunes antitumor.

[00092] Já que ambos os tipos de respostas, CD8 e CD4 dependente, contribuem conjuntamente e sinergicamente para o efeito antitumor, a identificação e a caracterização de antígenos de associados a tumor reconhecidos por qualquer CD8 + CTLs (ligando: molécula MHC de classe I + epitopo peptídico) ou por células T auxiliares CD4-positivas (ligando: molécula MHC de classe II + epitopo peptídico) é importante no desenvolvimento de vacinas de tumor.

[00093] Considerando os graves efeitos colaterais e as despesas associadas com o câncer, melhores métodos de diagnóstico e prognóstico são desesperadamente necessários. Portanto, há a necessidade de identificar outros fatores que representam biomarcadores para o câncer em geral e glioblastoma em particular. Portanto, há a necessidade de identificar outros fatores que possam ser usados no tratamento do câncer em geral e glioblastoma em particular.

[00094] Além disso, não há nenhum projeto terapêutico estabelecido para pacientes de câncer de próstata com recidiva bioquímica após prostatectomia radical, geralmente causada por tumor residual deixado in situ na presença de crescimento de tumor localmente avançado. Deseja-se atualmente novas abordagens terapêuticas que confiram menor morbidade com eficácia terapêutica comparável em relação às abordagens terapêuticas disponíveis.

[00095] A presente invenção fornece peptídeos que são úteis em tratar glioblastoma, o câncer de próstata e outros tumores que superexpressam survivina. Estes peptídeos foram parcialmente mostrados diretamente por espectrometria de massa naturalmente apresentados por moléculas HLA em amostras de glioblastoma humanas primárias (vide exemplo 1 e figura 1), ou no caso de SEQ ID No: 1 e 2 previstos, de acordo com o algoritmo de predição SYFPEITHI (Rammensee et al., 1995) em serem ligadores promíscuos aos alelos HLA-DRBV01, DRBV03, DRB1*04, DRBV11, e DRB1*15 (vide anexo). Com base nestes dados e nas frequências desses alelos DRB1 frequentes (Mori et al., 1995; Chanock et al., 2004), pode presumir-se que 92% dos caucasianos A*02 positivos expressam pelo menos um alelo DRB1 que liga estes peptídeos (SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 3). SEQ ID No: 2 contém a sequência de mesmo núcleo como SEQ ID No: 1, alongada por dois aminoácidos N-terminais da sequência de survivina natural para conter uma classe descrita I epitopo de célula T de survivina (Schmitz et al., 2000). SEQ ID No: 3 contém a sequência de mesmo núcleo como na SEQ ID No: 1, onde o aminoácido C-terminal passado é modificado a partir de uma asparagina (N) de ácido aspártico (D).

[00096] A fonte de genes a partir da qual SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 3 são derivadas - survivina - mostrou-se ser altamente superexpressa no glioblastoma, no tumor de próstata, no câncer de mama, câncer de esôfago, câncer colorretal, carcinoma de células de células renais claras, câncer de pulmão, SNC, ovário, melanoma (Tamm et al. 1998), câncer de pâncreas, carcinoma epidermoide, leucemia e meduloblastoma em comparação com tecidos normais (vide exemplo 2 e figura 2), demonstrando um elevado grau de associação de tumor do peptídeo, ou seja, estes peptídeos estão fortemente representados no tecido tumoral, mas não no tecido normal.

[00097] Peptídeos ligados a HLA-LIMITE podem ser reconhecidos pelo sistema imune, especificamente linfócitos T/ células T. As células T podem destruir as células apresentando o complexo HLA/peptídeo reconhecido, por exemplo, células de tumor de glioblastoma apresentando peptídeos derivados de survivina (SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 3). Células T auxiliares ativadas pelos peptídeos derivados de survivina podem inibir a vascularização do tumor, podem atrair células efetoras do sistema imune e podem facilitar preparação CTL, proliferação e resposta sustentada de célula T CD8 +.

[00098] Todos os peptídeos da invenção presente foram mostrados ser capazes de estimular respostas de célula T (vide exemplo 3 e figura 3). Assim, os peptídeos são úteis para gerar uma resposta imune em um paciente, no qual células de tumor podem ser destruídas. Uma resposta imune num paciente pode ser induzida por administração direta dos peptídeos descritos ou substâncias precursoras convenientes (por exemplo, peptídeos alongados, proteínas, ou ácidos nucleicos codificando estes peptídeos) ao paciente, idealmente em combinação com um agente melhorando a imunogenicidade (isto é, um adjuvante). A resposta imune que se origina de tal vacinação terapêutica pode ser esperada em ser altamente específica contra células de tumor porque os peptídeos-alvo da invenção presente não são apresentados em tecidos normais em números de cópia comparáveis, prevenindo o risco de reações indesejáveis autoimunes contra células normais no paciente.

[00099] As composições farmacêuticas incluem os peptídeos, tanto na forma livre ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitável.

[000100] Conforme utilizado aqui, "um sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um derivado do peptídeo descrito onde o peptídeo é alterado por formação de ácido ou por sais básicos do agente. Por exemplo, sais ácidos são preparados a partir da base livre (normalmente onde a forma neutra da droga tem um grupo NH2 neutro), envolvendo uma reação com ácido adequado. Ácidos adequados para a preparação de sais de ácidos incluem tanto os ácidos orgânicos, por exemplo, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malônico, succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, etanosulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácidos salicílicos e similares, bem como ácidos inorgânicos, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico e similares. Inversamente, a preparação de sais de base provenientes de moléculas ácidas, que podem estar presentes em um peptídeo, é efetuada utilizando-se uma base farmaceuticamente aceitável como 0 hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amónio, hidróxido de cálcio, trimetilamino ou similar.

[000101] Em uma variante especialmente preferida, as composições farmacêuticas compreendem peptídeos como sais de ácido acético (acetatos) ou ácido clorídrico (cloretos).

[000102] Além de serem úteis para tratar 0 câncer, os peptídeos da invenção presente são também úteis como diagnósticos. Já que os peptídeos foram gerados de glioblastoma e já que foi determinado que estes peptídeos não estão presentes em tecidos normais, estes peptídeos podem ser usados para diagnosticar a presença de um câncer.

[000103] A presença dos peptídeos reivindicados em biópsias de tecido pode auxiliar um patologista no diagnóstico do câncer. A detecção de certos peptídeos por meio de anticorpos, espectrometria de massa ou outros métodos sabidos na técnica podem contar ao patologista que o tecido é maligno ou inflamado ou geralmente doente. A presença dos grupos de peptídeos pode capacitar classificação ou subclassificação de tecidos doentes.

[000104] A detecção de peptídeos em espécime doente de tecido pode capacitar a decisão sobre o benefício de terapias envolvendo o sistema imune, especialmente se linfócitos T são conhecidos ou esperados em ser envolvido no mecanismo de ação. Perda de expressão de MHC é um mecanismo bem descrito, no qual células malignas ou infectadas escapam imunomonitorização. Assim, presença de peptídeos mostra que este mecanismo não é explorado pelas células analisadas.

[000105] Os peptídeos podem ser usados para analisar respostas de linfócito contra esses peptídeos tal como respostas de célula T ou respostas de anticorpo contra o peptídeo ou o TUMAP complexado para as moléculas de MHC. Estas respostas de linfócito podem ser usadas como marcadores de prognóstico para decisão em outros passos de terapia. Estas respostas também podem ser usadas como marcadores de substituto em tentativas de imunoterapia tentando induzir respostas por meios diferentes, por exemplo, vacinação de proteína, ácidos nucleicos, materiais autólogos, transferência adotiva de linfócitos. Em cenários de terapia de gene, respostas de linfócito contra peptídeos podem ser consideradas na avaliação de efeitos colaterais. Monitoração de respostas de linfócito também talvez seja uma ferramenta valiosa para exames complementares de terapias de transplantação, por exemplo, para a detecção de transplante contra hospedeiro e hospedeiro contra doenças de transplante.

[000106] Os peptídeos podem ser usados para gerar e desenvolver anticorpos específicos contra complexos de MHC/peptídeo. Estes podem ser usados para terapia, atacando toxinas ou substâncias radioativas no tecido doente. Outro uso destes anticorpos pode estar atacando radionuclídeos no tecido doente para propósitos de imagens tal como PET. Este uso pode ajudar a detectar metastases pequenas ou determinar o tamanho e localização precisa de tecidos doentes.

[000107] Além do mais, eles podem ser usados para verificar-se um diagnóstico de patologista sobre um câncer, com base numa amostra de biópsias.

[000108] A tabela 3 mostra os peptídeos de acordo com a presente invenção, seu respectivo SEQ ID No, os alelos HLA para que os respectivos peptídeos, e as proteínas de fonte das quais estes peptídeos possam surgir. O interesse especial é o fato dos peptídeos de acordo com SEQ ID No 2 se ligarem ao HLA-DR, assim como HLA- A*02, portanto, provocando duas respostas diferentes. Tabela 3: peptídeos da presente invenção

[000109] Expressão de BIRC5 (survivina), um membro do inibidor da família de proteína de apoptose (IAP), é elevada em tecidos fetais e em vários cânceres humanos, com expressão muito reduzida no tecido de adulto normal diferenciado, especialmente se o seu índice de proliferação é baixa. Survivina parece ser capaz de regular tanto a proliferação celular como a morte celular apoptótica. Apesar da survivina geralmente ser localizada na região citoplasma celular e associada, também têm sido relatados prognósticos pobres sobre o câncer, localização nuclear e indicativos de prognóstico favoráveis (O'Driscoll et al., 2003). Regulamento de survivina e através dela tem sido descrito por diversos mecanismos. Survivina parece estar associada com a chaperone Hsp60 molecular. In vivo, Hsp60 é abundantemente expressa em tumores primários humanos em comparação tecidos normais direcionados. Ablação aguda de Hsp60 por RNA de baixa interferência desestabiliza a piscina mitocondrial de survivina, induz disfunção mitocondrial e ativa a apoptose caspase- dependente (Ghosh et al., 2008). Além disso, a inibição de Ras resulta na liberação do survivina "freio" na apoptose e na ativação da via apoptótica mitocondrial. Especialmente no glioblastoma, a resistência a apoptose pode ser abolida por um inibidor de Ras que atinge a survivina (Blum et al., 2006). Também parece haver uma correlação entre hiperatividade NF-kappaB em gliomas e hiperexpressão da survivina, um dos genes-alvo NF-kappaB. Assim, os genes NF-kappaB ativados antiapoptóticos são hiperexpressos em amostras de tumor. Especialmente no glioblastoma, níveis muito altos de expressão de survivina são detectáveis (Angileri et al., 2008). É sugerido que a sobre-expressão de survivina em gliomas cerebrais pode desempenhar um papel importante na proliferação maligna, na antiapoptose e na angiogênese (Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006). Várias análises foram realizadas para estudar a expressão de survivina e seu impacto na sobrevivência em glioblastoma. Para resumir, a expressão de survivina, especialmente a expressão simultânea nos núcleos e citoplasma em tumores astrocíticos foi significativamente associada com o grau de malignidade (com expressão maior de survivina em glioblastoma) e menor tempo de sobrevivência global em comparação com pacientes que tiveram tumores de survivina negativa (Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai etal., 2008; Grunda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki etal., 2002; Chakravarti etal., 2002).

[000110] Superexpressão de survivina tem sido descrita também para entidades de outro tumor. No câncer de mama, a expressão survivina está associada com o grau mais elevado e menor sobrevivência livre de doença (Yamashita et al., 2007; Al-Joudi et al., 2007; Span et al., 2004). Em linhas de células de câncer de esôfago, a atividade promotora de survivina mostrou ser 28,5 vezes maior do que em tecidos normais (Sato et al., 2006). No câncer colorretal, a expressão de survivina também é associada com o grau patológico e com a metástase linfonodal (Tan et al., 2005). A agressividade do carcinoma de células renais claras demonstrou estar associada com a expressão de survivina. Além disso, a expressão da survivina está inversamente associada com a sobrevivência específica do câncer (Kosari et al., 2005). A expressão de survivina pode ser detectada em um painel de neoplasias queratinocíticas e lesões de pele hiperproliferativas, mas não em pele normal (Bowen et al., 2004). Em linhas celulares do câncer pancreático, a survivina foi ampliada em 58% das linhas celulares testadas (Mahlamaki et al., 2002). No carcinoma de células escamosas, a expressão de survivina pode ajudar a identificar os casos com fenótipo clínico mais agressivo e invasivo (Lo et al., 2001).

[000111] Como a survivina é um alvo promissor para o tratamento de câncer, os estudos com peptídeos derivados de survivina mostraram que survivina é imunogênica em pacientes com tumor, elicitando respostas mediada por células T CD8+. Além disso, survivina especificamente estimulou reatividade de células T CD4+ em linfócitos periféricos do sangue dos mesmos pacientes (Casati et al., 2003; Piesche et al., 2007).

[000112] Survivina (SVN, BIRC) é superexpressa em uma infinidade de entidades do câncer. Assim, em geral, acredita-se que a superexpressão da survivina está associada com menor sobrevivência global, e níveis de malignidade mais elevados.

[000113] Como parte de seus estudos, Piesche (2006) descreveu (vide também (Piesche et al., 2007)) que epitopos candidatos restritos a MHC classe II e HLA classe II em survivina (SVN) e em proteinase-3 (PR3), que foram determinados utilizando o programa de computador TEPITOPE (Bian e Hammer, 2004). A análise TEPITOPE rendeu 6 epitopos candidatos para SVN e 11 epitopos candidatos para PR3 com alta probabilidade de ligação para vários alelos HLA-DR. Estes 17 peptídeos foram usados em experimentos imunológicos de células T após a síntese e purificação cromatográfica. Os comprimentos variáveis dos peptídeos resultantes da sobreposição de epitopos que foram considerados em conjunto em um peptídeo (tabela 4). Tabela 4: nomes, a posição de AA, e sequências AA dos peptídeos SVN sintéticos descritos por Piesche 2006.

[000114] (Nota: Sss na verdade é S98, assim, Piesche et al. pode ter cometido um erro na determinação da posição deste epitopo).

[000115] Experimentos de titulação com os peptídeos correspondentes foram realizadas por Piesche para estimar a afinidade de peptídeos HLA ou a avidez de peptídeo HLA / TCR. Quanto menor concentração de peptídeos, maior afinidade com a ligação do epitopos peptídicos às moléculas MHC, um requisito importante para a apresentação natural da epitopos "genuínos" de células T de um processo intracelular do antígeno de proteína. A atividade medida, máxima metade proliferativa dos clones de célula T específicos dos peptídeos clones foram <50 nM para S10, 400 a 700 nM para S40, 2000 a 3000 nM para Sss e 100 a 300 nM para P58. Piesche ainda descreveu que apenas 0 peptídeo S10 SVN gerou uma proliferação de células T específicas durante a exposição com a proteína recombinante SVN. Isto foi demonstrado em três clones de células T específicos de S10 provenientes de diferentes doadores. Piesche et al. investigou 0 tratamento e a apresentação de epitopos peptídicos SVN do antígeno natural por cocultura de clones de células T específicos dos peptídeos com SVN DCs pulsados por proteína. Somente 0 SVN peptídeo S10 foi capaz de causar a proliferação de células T específicas durante a exposição com a proteína recombinante SVN. Isto foi demonstrado em três clones de células T específicos de S10 provenientes de diferentes doadores. Nenhuma proliferação específica em resposta ao antígeno natural foi detectada para os clones de células T específicas de PR3.

[000116] Além disso, os antígenos de tumor necrótico ou apoptótico das células tumorais foram internalizados pelos APCs in vivo, tratados de forma independente de MHC II, e apresentados a células T CD4+. Para 0 reconhecimento de células T do epitopo S10 genuíno, foram pulsados DCs com lisados de células tumorais de várias linhagens de células tumorais positivas SVN. Para o epitopo Sw, reconhecimento direto in vitro de DCs pulsados no lisado de linhas células de do tumor Karpas-422, Jurkat, e HL-60 foram detectados. Isto foi demonstrado em pelo menos três clones de células T específicos de Sw provenientes de diferentes doadores.

[000117] Para mostrar que o epitopo Sw pode induzir uma resposta imune em pacientes com câncer, a presença dos linfócitos T CD4+ correspondentes no sangue de pacientes com tumor teve de ser confirmada. PBMCs de vários pacientes foram isoladas e estimuladas com o peptídeo Sw. Para esta finalidade amostras PBMC foram extraídas de pacientes antes do início do tratamento e após o início da terapia citotóxica estática; monócitos e células B contidos na fração de PBMC foram utilizados como células apresentadoras de antígeno / peptídeo. Após uma semana de cultura, as células foram analisadas no que diz respeito à suas proliferações específicas de peptídeo usando um ensaio de incorporação de timidina-[3H], Dos 13 pacientes testados, três apresentaram uma resposta proliferativa detectada in vitro.

[000118] O uso potencial na imunoterapia de epitopos de peptídicos depende, essencialmente, se os linfócitos T CD4+ específicos dos peptídeos respondem ao antígeno correspondente. O reconhecimento do antígeno da proteína naturalmente processado sob a forma de epitopos "genuínos" ou "verdadeiros" é influenciado por vários fatores, em princípio.

[000119] Piesche mostrou que o reconhecimento da proteína foi detectado apenas para o SVN epitopo S10. Para os outros peptídeos identificados (SVN: S40, See; PR3: Pss, P216, P235, e P239) não foi detectado nenhum reconhecimento da proteína. Piesche et al. afirmou que é importante, durante a proteólise endosomal, que os motivos da presente sequência não sejam degradados, como no caso dos epitopos "crípticos". Em contraste com epitopos MHC restritos da classe I, as moléculas de MHC da classe II podem carregar peptídeos de comprimento variável (12 a 28) e, portanto, a clivagem proteolítica do epitopos peptídicos em comprimentos definido não é necessária.

[000120] Surpreendentemente, os inventores demonstraram na presente invenção que outro epitopo, SEQ ID No: 1, derivado survivina - que é menor do que Sss, mas que também se sobrepõe - suscitou uma forte reação imunológica em 16 dos 19 pacientes in vivo, (vide o exemplo 4). Devido ao elevado polimorfismo do locus HLA-DR, esta é também uma prova da ligação altamente promíscua do peptídeo SEQ ID No: 1, como previsto, pois uma resposta imunológica só pode ser evocada por um peptídeo ligado a uma molécula HLA.

[000121] A importância das entidades de câncer, para os quais uma superexpressão de survivina foi descrita na literatura, é ilustrada pela tabela 2. Indicações de câncer, para o qual a superexpressão da survivina é uma característica comumente descrita, foram responsáveis por mais de 415.000 mortes em 2007 (vide tabela 1).

[000122] Piesche et al. (2006) demonstraram in vitro na presença de precursores adequados para o peptídeo S88 em três dos quatro doadores com sobreposição de alelos HLA-DR. Aqui, o corpo de prova é muito pequeno para deduzir uma ligação promíscua do Sss ao HLA- DR, pois os resultados obtidos podem ser explicados pela ligação de dois alelos HLA-DR diferentes (por exemplo, DR3 e DR11, ou DR1 e DR3, ou DR11 e DR4). Além disso, os índices de estimulação obtidos por um ensaio de proliferação bastante inespecífico (incorporação de timidina [3H]) de culturas PBMC inteiras, são bastante baixos e falta um controle positivo (por exemplo, uma mistura fortemente imunogênica de peptídeos virais bem caracterizados) e controles adequados negativos (estimulação durante o ensaio de proliferação com um peptídeo de controle irrelevante) estão faltando. Os dados sobre as frequências de precursores não foram confirmados por um segundo tipo de ensaio.

[000123] WO 2007/036638 (Wang et al.), entre outros, descreve peptídeos survivina das sequências de aminoácidos

[000124] 96-110 (LTLGEFLKLDRERAK; SEQ ID No 25);

[000125] 99-113 (GEFLKLDRERAKNKI; SEQ ID No 26); e

[000126] 102-116 (LKLDRERAKNKIAKE; SEQ ID No 27).

[000127] A região 84-113 é descrita como uma região ligando moléculas MHC de classe II HLA com "boas" afinidades (IC50 < 1000 nM). No entanto, os peptídeos analisados em Wang et al. mostraram um espectro muito amplo de ligação para as diferentes moléculas HLA, e a dita ligação ainda difere drasticamente na referida região, tal como descrito, se os peptídeos são deslocados em sua sequência por um ou dois aminoácidos.

[000128] Peptídeos da presente invenção da SEQ ID No: 3 (TLGEFLKLDRERAKD; "peptídeo BIR-002A") compreende uma sequência do peptídeo 002 BIR da presente invenção de SEQ ID No: 1, exceto que 0 terminal C, daquele peptídeo termina com 0 aminoácido ácido aspártico (D) ao invés de asparagina (N). Tal peptídeo sobrepõe 0 peptídeo Sss de Piesche, que contém os últimos três aminoácidos NKI. Como mencionado acima, 0 peptídeo Sss estava inativo num ensaio de proliferação de células T específicas durante a exposição com a proteína recombinante SVN. Em contraste, 0 peptídeo BIR-002A apresentou uma forte resposta imune relacionada com MHC II. Sem querer ser vinculado pela teoria, supõe-se que uma conversão enzimática da asparagina em ácido aspártico através de uma asparaginase ocorre in vivo e, portanto, 0 terminal de aminoácidos C é modificado (e 0 peptídeo torna-se ativado e / ou mais ativado). Já que 0 terminal asparagina C do peptídeo de Piesche Sss é bloqueado por dois aminoácidos, 0 dito peptídeo está inativo (mas mostrando a importância de uma única mudança de aminoácido na atividade deste peptídeo).

[000129] Além disso, observou-se que as imunorrespostas e as atividades de outros peptídeos compreendendo uma asparagina terminal C (como, por exemplo, SEQ ID No: 1) talvez também dependa de uma conversão do terminal C em um ácido aminoácido, em particular o ácido aspártico. Assim, em um aspecto da invenção presente, o peptídeo de acordo com SEQ ID No 1 pode ser visto como um "pró-fármaco" para SEQ ID No: 3, que prevê o peptídeo ativo de acordo com SEQ ID No: 3 após a conversão enzimática. Deve ser entendido que a presente invenção também engloba a conversão química do aminoácido, principalmente asparagina e a desaminação espontânea pela perda de uma molécula de água.

[000130] Além disso, o exemplo mostrando uma atividade para o peptídeo de acordo com SEQ ID No: 1 também suporta uma atividade para o peptídeo modificado de acordo com SEQ ID No: 3.

[000131] Além disso, pôde ser descoberto no contexto da presente invenção que a solubilidade dos peptídeos na área do peptídeo BIR- 002 (região 84 a 113) diferem drasticamente de peptídeos similares. Tem de ser observar que, em Wang et al. peptídeos na região próxima ao peptídeo BIR-002 eram realmente insolúveis, e os estudos de ligação não podem ser realizados.

[000132] A solubilidade foi determinada como segue:

[000133] BIR-002 (SEQ ID No: 1): < 32,9 mg / mL (acetato)

[000134] BIR-002a (SEQ ID No: 3) (D, em vez de N no final do terminal C): < 23,5 mg/mL

[000135] BIR-014 (peptídeo comparativo de Wang, SEQ ID No. 25): <99,5 mg/mL

[000136] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga especificamente a um complexo de histocompatibilidade humana principal (MHC) classe I ou II complexado com um antígeno restrito a HLA (a seguir também designado como "anticorpo específico do complexo"). Um outro aspecto da presente invenção está relacionado com um método para a produção de tal anticorpo que se liga especificamente a um complexo de histocompatibilidade humana principal (MHC) de classe I ou II complexado com um antígeno HLA-restrito, o método compreendendo: um imunizante geneticamente modificado não humano compreendendo células de mamíferos expressando os principais complexos de histocompatibilidade humana (MHC) de classe I ou II com uma forma solúvel de uma classe de moléculas MHC I ou II complexada com o dito antígeno HLA-restrito; isolando moléculas de mRNA de células produtoras de anticorpos do referido mamífero não humano, produzindo uma biblioteca de visualização de fagos exibindo proteína moléculas codificadas por moléculas de mRNA disse, e isolando pelo menos uma biblioteca fagos da dita visualização de fagos, sendo que pelo menos um fago exibindo o referido anticorpo específico ligável para o dito complexo de histocompatibilidade humana principal (MHC) de classe I ou II complexado com o dito antígeno HLA-restrito. Respectivos métodos para produzir tais anticorpos e complexos de histocompatibilidade principal de classe I em cadeia única, bem como outras ferramentas para a produção destes anticorpos são descritos em WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, e Cohen CJ, Denkberg G, Lev A, Epel M, Reiter Y. Recombinant antibodies with MHC-restricted, peptidespecific, T-cell receptor-like specificity: new tools to study antigen presentation and TCR-peptide-MHC interactions. J Mol Recognit. 2003 Set-Out, 16 (5):324-32.; Denkberg G, Lev A, L Eisenbach, Benhar I, Reiter Y. Segmentação seletiva de melanoma e APCs usando urn anticorpo com especificidade TCR, dirigidas a um antígeno de diferenciação melanoma. J Immunol. 2003 Sep 1; 171 (5):2197-207; e Cohen CJ, Sarig O, Yamano Y, Tomaru II, Jacobson S, Reiter Y. Análise direta fenotípica de apresentação de antígenos MHC classe I humanos: visualização, quantificação e detecção in situ de epitopos humanos virais usando peptídeos específicos, anticorpos humanos recombinantes restritos de MHC. J Immunol. 2003 15 de abril, 170 (8):4349-61, que, para efeitos da presente invenção, são explicitamente incorporados por referência em suas totalidades.

[000137] Preferencialmente, o anticorpo é obrigatório, com uma afinidade de ligação com menos de 20 nanomolares, de preferência abaixo dos 10 nanomolares, para o complexo, que é considerado "específico" no contexto da presente invenção.

[000138] O termo "anticorpo" é usado aqui em sentido amplo e inclui tanto anticorpos policlonais e como monoclonais. Além de moléculas de imunoglobulina intacta, também estão incluídos no conceito de "anticorpos" fragmentos ou polímeros de moléculas de imunoglobulinas e as versões humanizadas de moléculas de imunoglobulinas, desde que eles apresentem uma das propriedades desejadas (por exemplo, sendo um complexo de anticorpos específicos como acima, a entrega de uma toxina de uma célula de câncer que expresse um gene marcador de câncer em um nível mais elevado e / ou iniba a atividade de uma proteína marcadora de câncer, como survivina) aqui descritas.

[000139] Sempre que possível, os anticorpos da invenção podem ser adquiridos a partir de fontes comerciais. Os anticorpos da invenção também podem ser gerados através de métodos bem-conhecidos. O versado na técnica vai entender que todo o comprimento dos polipeptídeos marcadores de câncer ou fragmentos do mesmo podem ser usados para gerar os anticorpos da invenção. Um polipeptídeo a ser usado para gerar um anticorpo da invenção pode ser total ou parcialmente purificado a partir de uma fonte natural, ou podem ser produzidos utilizando técnicas de DNA recombinante. Por exemplo, um DNA que codifica um polipeptídeo de survivina, ou um fragmento desta, pode ser expresso em células procarióticas (por exemplo, bactérias), ou células eucarióticas (por exemplo, leveduras, insetos, ou células de mamíferos), após o qual a proteína recombinante pode ser purificada e usada para gerar uma preparação de anticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam especificamente ao polipeptídeo marcador do câncer usado para gerar o anticorpo. Anticorpos específicos de complexo serão normalmente gerados como mostrado acima.

[000140] Versados na técnica, sabem que a geração de dois ou mais conjuntos diferentes de anticorpos monoclonais ou policlonais maximiza a probabilidade de obtenção de um anticorpo com especificidade e afinidade necessária para a sua utilização (por exemplo, ELISA, imuno-histoquímica, imagens in vivo, terapia imunotoxina). Os anticorpos são testados para a atividade pretendida pelos métodos conhecidos, em conformidade com os fins para que os anticorpos devam ser utilizados (por exemplo, ELISA, imuno- histoquímica, imunoterapia, etc, para mais orientações sobre a geração e teste de anticorpos, vide, por exemplo, Harlow e Lane, anticorpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988). Por exemplo, os anticorpos podem ser testados em ensaios de ELISA, Western blot, imuno- histoquímica das amostras de câncer de formalina fixa ou cortes de tecido congelado. Após a sua caracterização inicial in vitro, os anticorpos destinados para fins terapêuticos ou de uso em diagnóstico in vivo são testados de acordo com métodos conhecidos de teste clínicos.

[000141] O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, ou seja, os anticorpos individuais, incluindo a população são idênticos, exceto para possíveis mutações naturais que possam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais daqui incluem especificamente os anticorpos "quiméricos", nos quais há uma parte da cadeia pesada e / ou leve, são idênticos ou homólogos a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma classe de anticorpos específicos ou subclasse, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é/são idênticos ou homólogos a sequências correspondentes em anticorpos derivadas de uma outra espécie ou pertencente a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, enquanto exibem a atividade desejada antagônica (U.S. Pat. No. 4, 816,567).

[000142] Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser preparados através de métodos de hibridoma. Em um método de hibridoma, um rato ou outro animal hospedeiro adequado, geralmente é imunizado com um agente imunizante para provocar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente ao imunizante. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro.

[000143] Os anticorpos monoclonais também podem ser feitos através de métodos de DNA recombinante, tal como as descritas na U. S. Pat. No. 4,816,567. DNA que codifica os anticorpos da invenção podem ser prontamente isolados e sequenciados utilizando-se os procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos murinos).

[000144] Métodos in vitro também são adequados para a preparação de anticorpos monovalentes. Digestão de anticorpos para produzir fragmentos, especialmente os fragmentos Fab, pode ser realizada utilizando-se técnicas de rotina conhecida na técnica. Por exemplo, a digestão pode ser realizada utilizando-se papaína. Exemplos de digestão papaína são descritos no WO 94/29348 publicado em 22 de dezembro de 1994 e U.S. Pat. No. 4,342,566. Digestão de papaína de anticorpos normalmente produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, chamados de fragmentos Fab, cada um com um único sítio de ligação de antígeno, e um fragmento Fe residual. O tratamento de pepsina resulta num fragmento que tem dois sítios - que combinam antígeno - e ainda é capaz de ligação cruzada de antígenos.

[000145] Os fragmentos de anticorpos, sejam anexados a outras sequências, ou não, também podem incluir inserções, exclusões, substituições ou outras modificações selecionadas de determinadas regiões ou resíduos de aminoácidos específicos, desde que a atividade do fragmento não seja significativamente alterada ou diminuída em relação aos anticorpos não modificados ou fragmentos de anticorpo. Essas modificações podem prever algumas propriedades adicionais, tais como para remover / adicionar aminoácidos capazes de ligação de dissulfeto, para aumentar a sua longevidade de biológica, alterar as suas características secretoras, etc. Em qualquer caso, o fragmento de anticorpo deve possuir uma propriedade bioativa, como atividade obrigatória, regulamentação da vinculação no domínio de ligação, etc. Regiões funcionais ou ativas dos anticorpos podem ser identificadas por mutagênese de uma região específica da proteína, seguidas de expressão e de testes do polipeptídeo expresso. Tais métodos são prontamente aparentes a um médico especializado na matéria e pode incluir a mutagênese específica de sítio do ácido nucleico que codifica o fragmento de anticorpo.

[000146] Os anticorpos da invenção ainda podem compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Formas humanizadas de não humanos (por exemplo, murino) os anticorpos são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos das mesmas (como Fv, Fab, Fab' ou outras subsequências de ligação de antígenos de anticorpos), que contém sequência mínimos derivados da imunoglobulina não humana. Anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpos destinatários) nas quais os resíduos de uma região complementar de determinação (CDR) do destinatário são substituídos por resíduos de um CDR de uma espécie não humana (anticorpos de doador), como o camundongo, o rato ou o coelho com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, quadro Fv (FR) dos resíduos das imunoglobulinas humanas são substituídos pelos resíduos correspondentes não humanos. Anticorpos humanizados também podem incluir os resíduos que se encontram nem no anticorpo destinatário nem no CDR importado ou nas sequências de quadro. Em geral, o anticorpo humanizado compreende substancialmente todos os domínios variáveis, que são ao todo pelo menos um, e tipicamente dois, em que todas ou quase todas as regiões CDR correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ou quase todas as regiões FR são àquelas de uma sequência de imunoglobulina humana de consenso. O anticorpo humanizado otimamente também incluirá, pelo menos, uma parte da região constante da imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana.

[000147] Métodos para a humanização de anticorpos não humanos são bem-conhecidas na matéria. Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Estes resíduos aminoácidos não humanos são muitas vezes referidos como resíduos de "importação", que normalmente são tomados a partir de uma "importação" de domínio variável. Humanização pode ser feita essencialmente através da substituição de CDRs roedores ou sequências CDR para as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Assim, como "humanizados" os anticorpos são anticorpos quiméricos (U.S. Pat. No. 4,816,567), onde substancialmente menos do que um domínio variável intacto humano foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos são anticorpos humanizados tipicamente humanos em que alguns resíduos CDR e, possivelmente, alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sites similares em anticorpos de roedores.

[000148] Animais transgênicos (por exemplo, ratos), que são capazes, após a imunização, de produzir um repertório cheio de anticorpos humanos, na ausência da produção endógena de imunoglobulinas, que também podem ser utilizados. Por exemplo, tem sido descrito que a deleção homozigótica do gene da região de junção de cadeia pesada do anticorpo em camundongos mutantes quiméricos e de linha germinal resultou em inibição completa da produção endógena de anticorpos. Transferência da matriz do gene humano germinal de imunoglobulina em tal linha germinal de ratos mutantes vai resultar na produção de anticorpos humanos frente ao desafio de antígeno. Os anticorpos humanos podem ser produzidos em bibliotecas de mostra fago, como, por exemplo, conforme o indicado acima para o complexo de anticorpos específicos.

[000149] Os anticorpos da invenção são preferivelmente administrados a um paciente em um veículo farmaceuticamente aceitável. Normalmente, uma quantidade adequada de um sal farmaceuticamente aceitável é utilizada na formulação para tornar a formulação isotônica. Exemplos do transportador farmaceuticamente aceitável incluem salina, solução de Ringer e solução de dextrose. O pH da solução é de preferência cerca de 5 a cerca de 8, e mais preferivelmente cerca de 7 a cerca de 7,5. Outros veículos incluem preparações de liberação sustentada, tais como matrizes semipermeáveis de sólidos polímeros hidrofóbicos contendo o anticorpo, do qual as matrizes estão na forma de artigos em molde, por exemplo, filmes, lipossomas ou micropartículas. Torna-se evidente que para aqueles versados na técnica que alguns veículos podem ser preferíveis, dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração de anticorpos que está sendo administrada.

[000150] Os anticorpos podem ser administrados ao objeto, paciente, ou célula por injeção (por exemplo, por via intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular), ou por outros métodos, como infusão, que garanta a sua entrega para a corrente sanguínea de uma forma eficaz. Os anticorpos também podem ser administrados por via intratumoral ou peritumoral, para exercer efeitos terapêuticos sistêmicos e locais. A injeção local ou intravenosa é preferida.

[000151] Doses eficazes e horários para administrar os anticorpos podem ser determinados de forma empírica, e fazer essas determinações está dentro da habilidade na técnica. Aqueles versados na técnica vão entender que a dosagem de anticorpos que deve ser administrada irá variar dependendo, por exemplo, do sujeito que irá receber os anticorpos, da via de administração, do tipo de anticorpo utilizado e de outras drogas a serem administradas. Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds. Raven Press, New York (1977) pp. 365-389. lima dose diária típica do anticorpo utilizado isoladamente pode variar de cerca de 1 pg/kg até 100 mg/kg de peso corporal por dia ou mais, dependendo dos fatores acima mencionados. Após a administração de um anticorpo para tratamento do câncer, a eficácia do anticorpo terapêutico pode ser avaliada de diversas maneiras bem-conhecidas do versado qualificado. Por exemplo, o tamanho, número e/ou distribuição de câncer em um sujeito tratamento que receba o tratamento pode ser controlado por meio de técnicas padrão de imagem do tumor. Um anticorpo administrado terapeuticamente que prende o crescimento de tumor, resulta em diminuição do tumor, e/ou impede o desenvolvimento de novos tumores, em comparação com o curso da doença - que ocorria na ausência da administração de anticorpo - é um anticorpo eficaz para o tratamento de cânceres.

[000152] Os anticorpos também podem ser utilizados para ensaios de diagnóstico in vivo. Geralmente, o anticorpo é marcado com um radionucleotideo (como 111 In, "Tc, 14C, 1311, 3H, 32P ou 35S) de modo que o tumor possa ser localizado usando imunocintiografia. Em uma modalidade, os anticorpos ou fragmentos ligam os domínios extracelulares de dois ou mais alvos do câncer e o valor de afinidade (Kd) é inferior a 1x1 OpM.

[000153] Anticorpos para uso diagnóstico podem ser rotulados com sondas de detecção por diferentes métodos de imagem. Os métodos de detecção de sondas incluem, mas não estão limitados a, fluorescência, luz, microscopia confocal e eletrônica; imagem de ressonância magnética e espectroscopia, fluoroscopia, tomografia computadorizada e tomografia por emissão de positrons. Sondas adequadas incluem, mas não estão limitados a, fluoresceína, rodamina, eosina e outros fluoróforos, radioisótopos, ouro, gadolínio e outros lantanídeos, ferro paramagnético, flúor 18 e outros radionuclideos emissores de positrons. Além disso, as sondas podem ser bi- ou multifuncionais e podem ser detectáveis por mais de um dos métodos listados. Esses anticorpos podem ser marcados diretamente ou indiretamente com as provas citadas. A ligação de testes para os anticorpos inclui ligação covalente da sonda, a incorporação da sonda para o anticorpo, e a ligação covalente de um composto quelante para ligação da sonda, entre outros bem-reconhecidos na matéria. Por imuno-histoquímica, a amostra de tecido de doença pode ser fresca ou congelada, ou podem ser embebida em parafina e fixada com um conservante, como formalina. As seções fixas ou embutidas que contêm a amostra são contatadas com um anticorpo marcado primário e secundário de anticorpos, onde o anticorpo é usado para detectar a proteína NCAN expressa in situ.

[000154] A presente invenção fornece, assim, um peptídeo compreendendo uma sequência que é selecionada do grupo da SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 3 ou uma variante dela que é pelo menos 85%, de preferência pelo menos 95% homóloga para SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 3 ou uma variante dele que vai induzir reação cruzada das células T com os peptídeos ditos.

[000155] Em uma modalidade preferida para o tratamento de carcinoma de células renais, o peptídeo da SEQ ID No: 1 e/ou SEQ ID No: 2 e/ou SEQ ID No: 3 é usado em combinação com pelo menos dois dos peptídeos com SEQ ID No: 4 a SEQ ID No: 13 e SEQ ID No: 24. O peptídeo da SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 3 podem, assim, ser administrados separadamente ou em conjunto com os outros peptídeos em uma formulação.

[000156] Uma descrição detalhada dos peptídeos e dos antígenos fornecidos acima foi descrita em WO 2007/028573.

[000157] Em uma modalidade preferida para o tratamento de câncer de cólon, o peptídeo da SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 3 é usado em combinação com pelo menos dois dos peptídeos com SEQ ID No: 15 a 24, 4, 8, 11 ou 12. O peptídeo da SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 3 podem, assim, ser administrados separadamente ou em conjunto com os outros peptídeos em uma formulação.

[000158] Uma descrição detalhada dos peptídeos e dos antígenos fornecidos acima foram descritas em EP07014796.2 e US 60/953,161.

[000159] Os peptídeos da invenção têm a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade humana (MHC) classe I ou II.

[000160] Na presente invenção, o termo "homólogo" refere ao grau de identidade entre sequências de duas sequências de aminoácido, isto é, peptídeo ou sequências polipeptídicas. A "homologia" acima mencionada é determinada comparando-se duas sequências alinhadas sob condições ideais sobre as sequências serem comparadas. As sequências a serem comparadas podem ter uma adição ou supressão (por exemplo, lacuna e similares) no alinhamento ideal das duas sequências. Essa homologia de sequência pode ser calculada através da criação de alinhamento, utilizando, por exemplo, o algoritmo ClustalW (Nucleic Acid Res., 22(22): 4673 4680 (1994). Software para análise de sequências disponíveis comumente, mais especificamente, Vector NTI, GENETYX ou ferramentas de análise fornecidas por bancos de dados públicos.

[000161] Um versado na técnica será capaz de avaliar, se as células T induzidas por uma variante de um peptídeo específico será capaz de efetuar uma reação cruzada com o próprio peptídeo (Fong et al., 2001); (Zaremba etal., 1997; Colombetti etal., 2006; Appay etal., 2006).

[000162] Com uma "variante" da sequência de aminoácido específico, os inventores querem dizer que nas cadeias laterais, por exemplo, um ou dois dos resíduos de aminoácidos são alterados (por exemplo, substituindo-os com a cadeia lateral de outro resíduo de aminoácidos surgido naturalmente ou uma cadeia do outro lado), de tal modo que o peptídeo ainda seja capaz de ligar a uma molécula HLA substancialmente da mesma forma que um peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos determinada na SEQ ID No 1 a 24. Por exemplo, um peptídeo pode ser modificado de modo que ao menos mantenha, se não melhora, a capacidade de interagir e de ligar ao sulco comprometedor de uma molécula conveniente de MHC, tal como HLA- A*02 ou -DR, e nessa maneira ele ao menos mantém, se não melhora, a capacidade de ligar ao TCR de CTL ativado. Estes CTL subsequentemente cruzam com células e destroem células que expressam um polipeptídeo que contenha a sequência natural de aminoácido do peptídeo de cognato como definido nos aspectos da invenção. Como pode ser derivado da literatura científica (Rammensee et al., 1997) e bases de dados, (Rammensee et al., 1999), certas posições de peptídeos que se ligam a HLA são tipicamente resíduos de âncora formando uma sequência de centro servindo ao motivo comprometedor do receptor de HLA, que é definido por cadeias polipeptídicas polares, eletrofísicas, hidrofóbicas e propriedades espaciais constituindo o sulco comprometedor. Assim, um versado na técnica seria capaz de modificar as sequências de aminoácidos definidas na SEQ ID No 1 a 24, mantendo a âncora conhecida de resíduos, e seria capaz de determinar se as variantes mantêm a capacidade de vincular moléculas MHC de classe I ou II. As variantes da presente invenção mantêm a capacidade de se ligar à TCR da CTL ativada, o que poderá, posteriormente, cruzar e matar as células que expressam um polipeptídio contendo a sequência de aminoácido natural do peptídeo cognato, tal como definido nos aspectos da invenção.

[000163] Esses resíduos de aminoácido que não contribuem substancialmente a interações com o receptor de células T podem ser modificados por substituição com outro aminoácido cuja integração substancialmente não afeta reatividade de célula T e não elimina encadernação ao MHC relevante. Assim, aparte da condição dada, o peptídeo da invenção pode ser qualquer peptídeo (sendo que aqui os inventores incluem oligopeptídeo ou polipeptídeo), que inclui as sequências de aminoácido ou uma porção ou variante disso como dado. Tabela 5: variantes e motivo do peptídeo de acordo com SEQ IP No: 24

[000164] Além do mais é conhecido para peptídeos MHC apresentados de classe II, que estes peptídeos são compostos de uma "sequência de centro" tendo uma sequência de aminoácido servindo a um certo motivo alelo HLA específico, e opcionalmente extensões terminais N e/ou C que não interferem na função da sequência de centro (isto é, são considerados como irrelevantes para a interação do peptídeo e todos ou um subconjunto de clones de células T reconhecendo a contrapartida natural). As extensões do terminal N e / ou C podem conter, por exemplo, de 1 a 10 aminoácidos de comprimento, respectivamente. Estes peptídeos podem ser usados diretamente para carregar moléculas MHC da classe II ou da sequência podem ser clonadas nos vetores de acordo com a descrição contida abaixo. Como estes peptídeos constituem o produto final do processamento de peptídeos maiores dentro da célula, peptídeos mais longos também podem ser usados. Os peptídeos da invenção podem ser de qualquer tamanho, mas tipicamente podem ser menos que 100.000 em peso molecular, preferivelmente menos que 50.000, mais preferivelmente menos que 10.000 e tipicamente aproximadamente 5.000. Em termos do número de resíduos de aminoácido, os peptídeos da invenção podem ter menos que 1.000 resíduos, preferivelmente menos que 500 resíduos, mais preferivelmente menos que 100, mais preferivelmente menos que 100 e a maioria preferivelmente entre 30 e 8 resíduos. Assim, a presente invenção também fornece peptídeos e variantes, em que o dito peptídeo ou variante tem um comprimento total entre 8 e 100, de preferência entre 8 e 30, e mais preferido entre 8 e 16, ou seja, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 aminoácidos.

[000165] Para peptídeos MHC de classe II restritos, vários peptídeos diferentes com a sequência do mesmo núcleo podem ser apresentados na molécula de MHC. Como a interação com a célula T (auxiliar) reconhecida é definida por uma sequência de núcleo de 9 a 11 aminoácidos, várias variantes de comprimento podem ser reconhecidas pelo mesmo clone de célula T (auxiliar). Assim, várias versões de diferentes comprimentos de uma sequência de núcleo obrigatório podem ser utilizadas para carregamento direto de moléculas MHC classe II sem necessidade de processamento adicional de aparar as pontas terminais N ou C. Correspondentemente, variantes ocorrendo naturalmente ou artificialmente que induzem células T que cruzam com um peptídeo da invenção são frequentemente variantes de longo comprimento.

[000166] Se um peptídeo que é mais longo que ao redor de 12 resíduos de aminoácido, ele é usado diretamente para ligar a uma molécula MHC de classe II, sendo que é preferido que os resíduos que ladeiam a região de encadernação de HLA de centro são resíduos, que substancialmente não afetam a capacidade do peptídeo ligar especificamente ao sulco comprometedor das moléculas MHC de classe II ou apresentar o peptídeo à célula T (auxiliar). No entanto, como já indicado acima, será apreciado que peptídeos maiores podem ser usados, por exemplo, quando codificados por um polinucleotídeo, desde que estes peptídeos maiores possam ser fragmentados por células convenientes que apresentam antígenos. No entanto, em alguns casos tem sido demonstrado que a sequência núcleo de regiões de acompanhamento pode influenciar a ligação ao peptídeo da molécula MHC de classe II ou a interação do MHC dimérica: peptídeo complexo com o TCR em ambos os sentidos em relação a um peptídeo de referência com o mesmo núcleo de sequência. Estruturas intramoleculares terciárias no peptídeo (por exemplo, a formação de alça), normalmente, diminuem as afinidades do MHC e TCR. Interações intermoleculares das regiões de acompanhamento com as partes do MHC e TCR junto aos orifícios de peptídeo de ligação podem estabilizar a interação. Essas mudanças na afinidade pode ter uma influência dramática sobre o potencial de um peptídeo MHC de classe II para induzir as respostas da célula T (auxiliar).

[000167] É também possível, que epitopos MHC da classe I, embora normalmente entre 8 a 10 aminoácidos de comprimento, sejam gerados por processamento peptídico de peptídeos mais longos ou proteínas que incluem o epitopo real. É preferido que os resíduos que ladeiam o epitopo real são resíduos que não afetam substancialmente a clivagem proteolítica necessária para expor o epitopo real durante processamento.

[000168] Assim, a presente invenção também fornece peptídeos e variantes, em que o peptídeo ou variantes de epitopos MHC da classe I, têm um comprimento total entre 8 e 100, de preferência entre 8 e 30, e mais preferido entre 8 e 16, ou seja, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 aminoácidos.

[000169] Naturalmente os peptídeos ou variantes de acordo com a presente invenção têm a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade humana (MHC) classe I ou II. A encadernação de um peptídeo ou uma variante a um complexo MHC pode ser testada por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, esses descritos na literatura para diferentes alelos MHC da classe II (por exemplo, Vogt etal., 1994; Malcherek et al., 1994; Manici etal., 1999; Hammer et al., 1995; Tompkins etal., 1993; Boyton etal., 1998).

[000170] Numa modalidade particularmente preferida da invenção o peptídeo consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 3.

[000171] Os peptídeos de acordo com a presente invenção também podem consistir em um trecho contínuo de aminoácidos como representado na SEQ ID No: 1 a 3, onde o dito trecho é uma parte da sequência, tendo um comprimento mínimo de 8 aminoácidos (por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16), enquanto uma sequência de núcleo está presente no dito peptídeo, tornando-o funcional para provocar uma resposta imunológica, como é descrito aqui.

[000172] "Consistindo essencialmente em" quer dizer que um peptídeo de acordo com a invenção presente, além da sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 3 ou uma variante dessas, contém extensões N e/ou C terminalmente localizados de aminoácidos que necessariamente não formam a parte do peptídeo que funciona como um epitopo para epitopos de moléculas MHC.

[000173] Não obstante, estas extensões podem ser importantes para fornecer uma introdução eficiente do peptídeo - de acordo com a invenção presente - nas células. Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo é uma proteína de fusão que inclui, por exemplo, os aminoácidos de terminal N 80 do antígeno associado à cadeia invariante HLA-DR (p33, a seguir simplesmente "li") como derivado do NCBI, GenBank Número acessão X00497 (Strubin, M. etal. 1984).

[000174] Exemplos de peptídeos mais preferidos incluem peptídeos com um subtipo HLA específico, e é capaz de estimular as células CD8, e em que o dito peptídeo compreende o motivo âncora aminoácido específico, conforme ilustrado na tabela 6. Tabela 6: subtipos HLA e motivos âncora do peptídeo preferido de acordo com SEQ IP No 24:

[000175] Além do mais, o peptíd eo ou variant te podem ser modificados mais adiante para melhorar a estabilidade e/ou ligar a moléculas de MHC para extrair uma resposta imune mais forte. Os métodos para tal otimização de uma sequência peptídica são bem- conhecidos na arte e incluem, por exemplo, a introdução de ligações peptídicas inversas ou ligações não peptídicas.

[000176] Em uma ligação peptídica inversa, resíduos de aminoácido não são unidos por conexões (-CO-NH-) de peptídeo, mas a ligação peptídica é invertida. Tais peptideomiméticos retroinversos podem ser criados usando-se métodos conhecidos na técnica, por exemplo, tal como esses descritos em Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230- 3237, aqui incorporados por referência. Este aprimoramento envolve a criação de pseudopeptídeos contendo alterações envolvendo a vértebra, e não a orientação de correntes laterais. Meziere etal. (1997) mostra que para encadernação de MHC e respostas de célula T auxiliares, estes pseudopeptídeos são úteis. Os peptídeos retroinversos, que contêm ligações NH-CO ao invés de ligações peptídicas CO-NH, são muito mais resistentes a proteólise.

[000177] Uma ligação não peptídica é, por exemplo, -CH2-NH, - CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, e -CH2SO-. A Patente dos Estados Unidos 4,897,445 fornece um método para a síntese sólida de fase de ligação não peptídica (-CH2-NH) em correntes de polipeptídeo que envolvem polipeptídeos sintetizados por procedimentos padronizados e a ligação não peptídica sintetizada por reagir com um aminoaldeído e um aminoácido na presença de NaCNBH3.

[000178] Os peptídeos constituindo as sequências descritas acima podem ser sintetizados com grupos químicos adicionais presentes em seus terminais aminos e/ou carbóxi, para melhorar a estabilidade, biodisponibilidade e/ou afinidade dos peptídeos. Por exemplo, grupos hidrofóbicos tal como carbobenzoxila, dansila, ou os grupos de t- butiloxicarbonila podem ser adicionados aos terminais amino dos peptídeos. Da mesma maneira, um grupo de acetila ou um grupo de 9- fluorenilmetóxi-carbonila podem ser colocados nos terminais amino dos peptídeos. Adicionalmente, o grupo hidrofóbico, t-butiloxicarbonila ou grupo aminado podem ser adicionados aos terminais amino dos peptídeos.

[000179] Além disso, os peptídeos da invenção podem ser sintetizados de tal modo que sua configuração estérea seja alterada. Por exemplo, o D-isômero de um ou mais dos resíduos aminoácidos do peptídeo pode ser usado, ao invés do L-isômero normal. Mais ainda, ao menos um dos resíduos de aminoácido dos peptídeos da invenção pode ser substituído por um dos resíduos aminoácidos conhecidos que ocorrem não naturalmente. As alterações tal como estas podem servir para aumentar a estabilidade, biodisponibilidade e/ou de ação de ligação dos peptídeos da invenção.

[000180] Similarmente, um peptídeo ou variante da invenção podem ser modificados quimicamente reagindo com aminoácidos específicos antes ou depois da síntese do peptídeo. Os exemplos para tais modificações são bem-conhecidos na arte e são resumidos, por exemplo, em R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005, que é incorporado aqui por referência. Modificação química de aminoácidos inclui, mas não é limitado a, modificação por acilação, amidinação, piridoxilação de lisina, alquilação redutiva, trinitrobenzilação de grupos aminados com ácido sulfônico 2,4,6-trinitrobenzeno (TNBS), modificação de amido dos grupos de carboxila e modificação de sulfidrilo por oxidação performica ácida de cisteína, a ácido de cisteico, formação de derivados mercuriais, formação de bissulfeto misturado com outros compostos de tiol, reação com maleimida, carboximetilação com ácido de iodoacético ou iodoacetamida e carbamoilação com cianeto em pH alcalino, embora sem limitação a isso. Nesta consideração, a pessoa versada é referida ao Capítulo 15 dos Protocolos Atuais em Ciência de Proteína, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Filhos NY 1995-2000) para metodologia mais extensa relativa à modificação química das proteínas.

[000181] Em resumo, a modificação dos resíduos de arginila em proteínas frequentemente é baseada na reação de compostos de dicarbonil vicinais tal como fenilglioxal, butanodiona 2,3 e ciclo- hexanodionas 1,2 para formar um aducto. Outro exemplo é a reação de metilglioxal com resíduos de arginina. Cisteína pode ser modificada sem modificação concomitante de outros nucleofílica locais tal como histidina e lisina. Como um resultado, um grande número de reagentes está disponível para a modificação de cisteína. Os sites das companhias, tal como o da Sigma-Aldrich (http://www.sigma- aldrich.com), fornecem informações sobre reagentes específicos.

[000182] Redução seletiva de ligações de dissulfeto em proteínas é também comum. As ligações de dissulfeto podem ser formadas e podem ser oxidadas durante o tratamento térmico de biofármacos.

[000183] O reagente K de Woodward pode ser usado para modificar resíduos ácidos glutãmicos específicos. N-(3-(dimetilamino)propil)-N'- etilcarbodi-imido pode ser usado para formar ligações cruzadas intramoleculares entre um resíduo de lisina e um resíduo ácido glutâmico.

[000184] Por exemplo, dietilpirocarbonato é um reagente para a modificação de resíduos de histidila em proteínas. Histidina também pode ser modificada para usar 4-hidróxi-2-nonenal.

[000185] A reação de resíduos de lisina e outros grupos a-aminados é, por exemplo, útil em ligação de peptídeos a superfícies ou na conexão cruzada de proteínas/peptídeos. Lisina é o local de anexo de poli(etileno)glicol e o local importante de modificação na glicação de proteínas. Os resíduos de metionina em proteínas podem ser modificados com, por exemplo, iodoacetamida, bromoetilamina e cloramina T. Tetranitrometano e N-acetilimidazola podem ser usados para a modificação de resíduos de tirosila. Ligação cruzada através da formação de ditirosina pode ser realizada com peróxido de hidrogênio / ions de cobre.

[000186] Estudos recentes na modificação de triptofano usaram N- bromossuccinimida, 2-hidróxi-5-nitrobenzilo ou brometo de 3-bromo-3- metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-3H-indol (BPNS-escatol).

[000187] Modificação bem-sucedida de proteínas terapêuticas e peptídeos com PEG frequentemente é associada com uma extensão de meia-vida circulatória enquanto que uma ligação cruzada de proteínas com glutaraldeído, diacrilato de polietilenoglicol e formaldeído é usada para a preparação de hidrogéis. Modificação química de alérgenos para imunoterapia frequentemente é realizada por carbamilação com cianeto de potássio.

[000188] Um peptídeo ou variante, em que o peptídeo é modificado ou inclui ligação não peptídica é uma personificação preferida da invenção. Geralmente, peptídeos e variantes (ao menos esses a conter conexões peptídicas entre resíduos de aminoácido) podem ser sintetizados pelo modo de Fmoc-poliamido de síntese de fase sólida peptídica como descrito por Lu et al. (1981) e referências lá contidas. Proteção de grupo N-amino temporária é proporcionada pelo grupo 9- fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc). Clivagem repetitiva deste grupo de proteção de base altamente lábil é feia usando-se piperidina 20% em N, N-dimetilformamida. As funcionalidades de corrente lateral podem ser protegidas como seus éteres de butila (no caso de treonina de serina e tirosina), éteres de butila (no caso de ácidos glutâmicos e ácidos aspárticos), derivado de butiloxicarbonila (no caso de histidina e lisina), derivado de tritila (no caso de cisteína) e derivado de 4-metóxi- 2,3,6-trimetilbenzenossulfonila (no caso de arginina). Onde glutamina ou asparagina são resíduos de terminal C, o uso é feito do grupo 4,4'- dimetoxibenz-hidrila para proteção das funcionalidades laterais de amido de corrente. O apoio de fase sólida é baseado num polímero de polidimetil-acrilamida constituído do três monomeres de dimetilacrilamida (espinha-monomer), diamina de bisacriloiletileno (vinculador cruzado) e éster de metil de acriloilsarcosina (agente de funcionalização). O agente peptídico-a-resina ligado de clivagem usado é o ácido derivativo de 4 hidroximetil-fenoxiacético lábil a ácido. Todos derivados de aminoácido são adicionados como seus derivados simétricos pré-formados de anidrido com a exceção de asparagina e glutamina, que são adicionados usando um procedimento invertido mediado por N, N-diciclo-hexil-carbodi-imida/1-hidroxibenzotriazola. Todas as reações de engate e desproteção são controladas usando-se ninidrina, ácido sulfônico de trinitrobenzeno ou procedimentos de prova de isotina. Sobre conclusão de síntese, peptídeos são rachados do apoio de resina com remoção concomitante de lado-corrente protegendo os grupos por tratamento com 95% de ácido trifluoroacético contendo uma mistura de 50 % de interceptor radical. Interceptores radicais geralmente usados incluem etanditiol, fenol, anisolo e água, a escolha exata dependendo dos aminoácidos constituintes do peptídeo a ser sintetizado. Também uma combinação de metodologias em fase sólida e fase de solução para a síntese de peptídeos é possível (vide, por exemplo, Bruckdorfer et al. 2004 e as referências como citadas lá).

[000189] O ácido trifluoroacético é retirado por evaporação in vacuo, com trituração subsequente com éter de dietila proporcionando o peptídeo bruto. Quaisquer interceptores radicais presentes são retirados por um procedimento simples de extração no qual a liofilização da fase aquosa proporciona peptídeo bruto de interceptores radicais. Reagentes para síntese peptídica são geralmente disponíveis de, por exemplo, Calbiochem-Novabiochem (Reino Unido) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Reino Unido.

[000190] A purificação pode ser realizada por qualquer um, ou uma combinação de técnicas tal como a recristalização, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de íon-intercâmbio, cromatografia de interação de hidrofóbico e (normalmente) cromatografia líquida de alto desempenho na fase reversa usando-se, por exemplo, separação de declive de acetonitrila/água.

[000191] A análise de peptídeos pode ser executada usando-se cromatografia de camada fina, eletroforese, em tubo particular eletroforese capilar, extração de fase sólida (CSPE), cromatografia líquida de alto desempenho na fase reversa, análise de aminoácido depois da hidrólise ácida e por bombardeio rápido de átomos (FAB) análise espectrométrica de massa, assim como MALDI e ESI-Q-TOF análise espectrométrica de massa.

[000192] Mais um aspecto da invenção fornece um ácido nucleico (por exemplo, um polinucleotídio) codificando um peptídeo ou variante da invenção. O polinucleotídio pode ser, por exemplo, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA ou combinações dos mesmos, tanto de fita única como de fita dupla, ou formas nativas ou estabilizadas de polinucleotídio, tal como, por exemplo, polinucleotídios com uma espinha de fosforotioato, e pode ou não pode conter introns contanto que ele se codifica para o peptídeo. Naturalmente, só os peptídeos contendo resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente são unidos por ligações peptídicas que surgiram naturalmente, que podem ser codificados por um polinucleotídio. Um ainda mais aspecto da invenção fornece um vetor de expressão capaz de expressar um polinucleotídeo de acordo com a invenção.

[000193] Uma variedade de métodos foi desenvolvida para ligar polinucleotídeos, especialmente DNA, a vetores, por exemplo, via terminais coesos complementares. Por exemplo, áreas complementares de homopolímero podem ser adicionadas ao segmento de DNA ser inserido ao vetor DNA. O segmento de vetor e DNA e são então unidos por hidrogênio ligado entre as caudas complementares de homopolímero para formar moléculas de DNA recombinante.

[000194] Ligadores sintéticos contendo um ou mais locais de restrição fornecem um método alternativo de unir-se ao segmento de DNA a vetores. Ligadores sintéticos contendo uma variedade de locais de endonuclease de restrição estão comercialmente disponíveis de um número de fontes inclusive na International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, EUA.

[000195] Um método desejável de modificar o DNA codificando o polipeptídeo da invenção utiliza a reação em cadeia de polimerase como descrito por (Saiki et al. (1988)). Este método pode ser usado para a introdução do DNA em um vetor adequado, por exemplo, através de engenharia em sítios de restrição adequados, ou ele pode ser usado para modificar o DNA de outras formas úteis como é conhecido na técnica. Se vetores virais são usados, vetores de vírus varicela ou adenovirus são preferidos.

[000196] O DNA (ou no caso de vetores retrovirais, RNA) pode ser expresso num hospedeiro conveniente para produzir um polipeptídeo constituindo o peptídeo ou variante da invenção. Assim, o DNA codificando o peptídeo ou variante da invenção pode ser usado de acordo com técnicas conhecidas, adequadamente modificado em vista dos ensinos contidos nisto, para construir um vetor de expressão, que então é usado para transformar uma célula apropriada de hospedeiro para a expressão e produção do polipeptídeo da invenção. Tais técnicas incluem aquelas descritas na US Patente n 0 4.440.859, 4.530.901, 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751, 4.704.362, 4.710.463, 4.757.006, 4.766.075 e 4.810.648.

[000197] O DNA (ou no caso de vetores retrovirais, RNA) codificando o polipeptídeo constituindo o composto da invenção pode ser unido a uma variedade larga de outras sequências de DNA para introdução num hospedeiro apropriado. O companheiro DNA dependerá em sua natureza do hospedeiro, da maneira da introdução do DNA no hospedeiro, e se é desejada uma manutenção episomal ou integração.

[000198] Geralmente, o DNA é inserido num vetor de expressão, tal como um plasmida, em orientação adequada e corrigida lendo-se a armação para expressão. Se for necessário, o DNA pode ser ligado às sequências reguladora de nucleotídeo de controle transcricional e translacional apropriado reconhecido pelo hospedeiro desejado, embora tais controles sejam geralmente disponíveis no vetor de expressão. O vetor então é introduzido no hospedeiro através de técnicas normais. Geralmente, não todos os hospedeiros serão transformados pelo vetor. Portanto, será necessário selecionar para células transformadas de hospedeiro. Uma técnica de seleção envolve incorporar no vetor de expressão uma sequência de DNA, com quaisquer elementos necessários de controle, que codifica para uma característica selecionável na célula transformada, tal como resistência antibiótica.

[000199] Alternativamente, o gene para tal característica de selecionável pode estar em outro vetor, que é usado para cotransformar a célula desejada de hospedeiro. Células hospedeiras que foram transformadas pelo recombinante DNA da invenção são então cultivadas para um tempo suficiente e sob condições apropriadas conhecidas a esses versados na técnica em vista dos ensinos descritos aqui para permitir a expressão do polipeptídeo, que então pode ser recuperado.

[000200] Muitos sistemas de expressão são conhecidos, inclusive bactérias (para exemplo, E. coli e Bacillus subtil is), fermentos (para exemplo, Saccharomyces cerevisiaé), fungos filamentosos (para exemplo, Aspergillus spec), células de planta, células animais e células de insetos. Preferivelmente, o sistema pode ser de células mamíferas tal como células de CHO disponíveis da Coleção de Biologia de Célula de ATCC.

[000201] Um plasmido de vetor de célula mamífero típico para expressão constitutiva constitui o CMV ou promotor SV40 com um polo conveniente cauda A e um marcador de resistência, tal como neomicina. Um exemplo é pSVL disponível de Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA. Um exemplo de um vetor de expressão induzível mamífera é o pMSG, também disponível de Pharmacia. Vetores úteis de fermento plasmida são pRS403-406 e pRS413-416 e estão geralmente disponíveis por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA. Plasmidas pRS403, pRS404, pRS405 e pRS406 são plasmidas integrantes de fermento (Ylps) e incorporam os marcadores de fermento selecionável HIS3, TRP1, LEU2 e URA3. Plasmidas pRS413- 416 são plasmidas centromeres de fermento (Ycps). Os vetores à base de promotor CMV (por exemplo, aqueles de Sigma-Aldrich) fornecem expressão transitória ou estável, expressão ou secreção citoplásmico, e N-terminal ou C-terminal etiquetando em várias combinações de FLAG, 3xFLAG, c-myc ou MAT. Estas proteínas de fusão permitirão a detecção, tratamento e análise da proteína recombinante. As fusões de etiqueta dupla fornecem flexibilidade em detecção.

[000202] A região reguladora de citomegalovírus humano forte (CMV) gera altos níveis de expressão constitutiva de proteína, tão altos quanto 1 mg/L em células COS. Para linhas de células menos potentes, os níveis de proteína são tipicamente ~ 0,1 mg / L. A presença da origem de replicação SV40 resultará em altos níveis de replicação do DNA na replicação SV40 células permissivas COS. Os vetores de CMV, por exemplo, podem conter o pMB1 (derivado de pBR322) origem para replicação em células bacterianas, o gene b- lactamase para seleção de resistência de ampicilina em bactérias, polyA hGH, e a origem f1. Vetores contendo o líder de sequência preprotripsina (PPT) pode dirigir a secreção de proteínas de fusão FLAG no meio de cultura para purificação usando anticorpos ANTI- FLAG, resinas, e pratos. Outros vetores e sistemas de expressão são bem-conhecidos na técnica para uso com uma variedade de células hospedeiras.

[000203] A presente invenção também relaciona a uma célula hospedeira transformada com um construto de vetor de polinucleotídeo da presente invenção. A célula hospedeira pode ser ou procarióticas ou eucarióticas. Células bacterianas podem ser preferencialmente células hospedeiras procarióticas e, em algumas circunstâncias, tipicamente uma estirpe de E. coli, tais como, por exemplo, as estirpes de E. coli DH5 disponíveis de Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EUA, e RR1 disponível da American Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, MD, EUA (No ATCC 31343). Células eucarióticas preferidas de hospedeiro incluem fermento, inseto e células mamíferas, preferivelmente células vertebradas tal como essas de um camundongo, rato, macaco ou células humanas fibroblásticas e linhas de célula de cólon. Células hospedeiras de fermento incluem YPH499, YPH500 e YPH501 que geralmente são disponíveis por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA. Células hospedeiras mamíferas preferidas incluem ovário chinês de hamster (CHO) células disponíveis do ATCC como CCL61, NIH/3T3 de células de embrião de camundongo suíço de NIH disponível do ATCC como CRL 1658, células COS-1 derivadas de rim de macaco disponíveis do ATCC como as células CRL 1650 e 293 que são células embrionárias humanas de rim. Células preferidas de inseto são células Sf9 que podem ser transfectadas com vetores de expressão baculovírus. Uma vista geral concernente à escolha de células convenientes de hospedeiro para expressão pode ser achada em, por exemplo, no texto de Paulina Balbás e Argélia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols", Parte Um, Segunda Edição, ISBN 978-1- 58829-262-9, e outra literatura conhecida à pessoa versada.

[000204] A transformação de células hospedeiros apropriados com um construto de DNA da presente invenção é realizada por métodos bem-conhecidos que tipicamente dependem do tipo de vetor usado. No que diz respeito à transformação de células do hospedeiro procariótico, vide, por exemplo, Cohen et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 2110, e Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. A transformação de células de fermento é descrita em Sherman et al. (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. O método de Beggs (1978) Nature 275,104-109 também é útil. Com referência a células vertebradas, reagentes úteis em transferir tais células, por exemplo, fosfato de cálcio e DEAE-dextrano ou formulações de lipossoma, estão disponíveis de Stratagene Cloning Systems, ou Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EUA. Eletroporação é também útil para transfectar e/ou transformar células e é bem-conhecida na técnica para transformar célula de fermento, células bacterianas, células de inseto e células vertebradas.

[000205] Células transformadas com êxito, isto é, células que contêm um construto de DNA da presente invenção, podem ser identificadas por técnicas bem-conhecidas tal como PCR. Por outro lado, a presença da proteína no sobrenadante pode ser detectada usando-se anticorpos.

[000206] Será apreciado, que certas células hospedeiras da invenção são úteis na preparação dos peptídeos da invenção, por exemplo, células bacterianas, de fermento e de inseto. No entanto, outras células hospedeiras podem ser úteis em certos métodos terapêuticos. Por exemplo, células apresentando antígenos, tal como células dendríticas, podem ser sensatamente usadas para expressar os peptídeos da invenção de tal modo que elas possam ser carregadas em moléculas MHC apropriadas. Assim, a invenção atual fornece uma célula de hospedeiro constituindo um ácido nucleico ou um vetor de expressão de acordo com a invenção.

[000207] Numa modalidade preferida, a célula hospedeira é uma célula que apresenta antígeno, em particular uma célula dendrítica ou célula que apresenta antígeno. APCs carregadas com uma proteína de fusão recombinante contendo fosfatase de ácido prostático (PAP) estão atualmente sob investigação para o tratamento de câncer de próstata (Sipuleucel-T) (Small EJ et al. 2006; Rini et al. 2006)

[000208] Mais um aspecto da invenção fornece um método de produzir um peptídeo ou seu variante, que constituindo a cultura de uma célula hospedeiro que isola o peptídeo da célula hospedeiro ou seu meio de cultura.

[000209] Em outra modalidade o peptídeo, o ácido de nucleico ou o vetor de expressão da invenção são usados em medicina. Por exemplo, o peptídeo ou seu variante podem ser preparados para injeção intravenosa (i.v.), injeção subcutânea (s.c.), injeção intradermal (i.d.), injeção intraperitoneal (i.p.), injeção intramuscular (i.m.). Métodos preferidos de injeção de peptídeos incluem i.c., i.d., i.p., i.m., e i.v. Métodos preferidos de injeção de DNA incluem i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Doses, por exemplo, entre 50 pg e 1,5 mg, de preferência, 125 pg a 500 pg de peptídeo ou DNA podem ser dadas e vão depender do respectivo peptídeo ou DNA. As doses deste alcance foram usadas com êxito em testes prévios (Brunsvig et al. 2006; Staehler et al. 2007).

[000210] Outro aspecto da presente invenção inclui um método in vitro para a produção de células T ativadas, o método compreendendo o contacto de células T in vitro com moléculas humanas MHC da classe I ou II expressas na superfície de uma célula adequada que apresenta antígeno por um período de tempo suficiente para ativar a célula T de maneira antigênica específica, na qual o dito antígeno é um peptídeo de acordo com a invenção. Preferivelmente uma quantidade suficiente do antígeno é usada com uma célula apresentadora de antígenos.

[000211] No caso de um epitopo MHC da classe II sendo usado como um antígeno, as células T são células ajudantes CD4 positivas, preferivelmente do tipo THI. AS moléculas MHC de classe II podem ser expressas na superfície de qualquer célula conveniente. Preferivelmente a célula naturalmente não expressa moléculas MHC de classe II (neste caso a célula foi transfectada para expressar tal molécula). Por outro lado, se a célula naturalmente expressa moléculas MHC de classe II, é presumível que ele está com defeito no processamento de antígenos ou nos caminhos apresentadoras de antígenos. Desta maneira, é possível para a célula expressando as moléculas MHC de classe II ser completamente carregada com um antígeno peptídico escolhido antes de ativar a célula T.

[000212] A célula apresentadora de antígeno (ou célula estimuladora) normalmente tem moléculas MHC da classe II em sua superfície e, de preferência, por si só é substancialmente incapaz de carregar a dita molécula MHC da classe II com o antígeno selecionado. As moléculas MHC de classe II podem ser facilmente carregadas com o antígeno selecionado in vitro.

[000213] Preferivelmente a célula mamífera carece ou tem um nível reduzido da função do transportador peptídico TAP. Células convenientes que carecem de transportador peptídico TAP incluem T2, RMA-S e células Drosophila. TAP é o transportador associado com Processamento de Antígeno.

[000214] O peptídeo humano carregando linha de célula T2 deficiente está disponível na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EUA sob o Catalogue No CRL 1992; a linha de células de drosofila Schneider está disponível no ATCC sob o Catalogue No CRL 19863; a linha de célula de RMA-S de camundongo é descrita em Karre et al. 1985.

[000215] De preferência, antes da transfecção a célula hospedeiro substancialmente não expressa nenhuma molécula MHC de classe I. Também é preferível que a célula estimuladora expresse uma molécula importante para fornecer um sinal coestimulatório de células T, como qualquer B7.1, B7.2, ICAM-1 e LFA 3. As sequências de ácido nucleico de inúmeras moléculas MHC classe de II, e das moléculas coestimulatórias, estão disponíveis ao público a partir do banco de dados GenBank e EMBL.

[000216] Da mesma forma, no caso de um epitopo MHC da classe I sendo usado como um antígeno, as células de T são células CTLs CD8 positivas.

[000217] Se uma célula apresentadora de antígenos for transfectada para expressar tal epitopo, preferivelmente a célula constitui um vetor de expressão capaz de expressar um peptídeo contendo SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 3 ou a sequência de aminoácido variante.

[000218] Um número de outros métodos pode ser usado para gerar CTL in vitro. Por exemplo, os métodos descritos em Peoples et al. (1995) e Kawakami et al. (1992) usam linfócitos autólogos com infiltração de tumor na geração de CTL. Plebanski et al. (1995) utiliza linfócitos autólogos periféricos de sangue (PLBs) na preparação de CTL. Jochmus et al. (1997) descreve a produção de CTL autólogos pulsando células dendriticas com peptídeo ou polipeptídeo, ou via infecção com vírus recombinantes. Hill et al. (1995) e Jerome et al. (1993) utilizam células de B na produção de CTL autólogos. Além do mais, macrófagos pulsados com peptídeo ou polipeptídeo, ou infectado com vírus recombinante, pode ser usado na preparação de CTL autólogos. S. Walter et al. 2003 descreve a preparação in vitro de células T usando antígeno artificial apresentando células (aAPCs), que também é uma maneira conveniente para gerar células T contra o peptídeo de escolha. Neste estudo, aAPCs foram gerados pelo engate de MHC pré-formados: complexos peptídicos à superfície de partículas de poliestireno (microflanges) por biotina: bioquímica de estreptavidina. Este sistema permite o controle exato da densidade de MHC em aAPCs, que permite seletivamente extrair respostas de avidez alta ou baixa específica de antígeno de célula T com alta eficiência de amostras de sangue. À parte de MHC: complexos peptídicos, aAPCs devem carregar outras proteínas com atividade de coestimulatórias como anticorpos anti-CD28 unidas à sua superfície. Além do mais, tais sistemas baseados em aAPC frequentemente exigem a adição de fatores solúveis apropriados, por exemplo citoquinas como interleucina-12.

[000219] As células alogênicas também podem ser usadas na preparação de células T em um método descrito em detalhe em WO 97/26328, incorporado nisto por referência. Por exemplo, além de células de drosofila e células T2, outras células podem ser usadas para apresentar antígenos tal como células de CHO, células de inseto infectados com baculovirus, bactérias, fermento, células-alvo de vaccinia infectadas. Em adição, vírus de planta pode ser usado (vide, por exemplo, Porta et al. (1994)) que descreve o desenvolvimento de vírus de mosaico cowpea como um sistema de alto rendimento para a apresentação de peptídeos estrangeiros.

[000220] As células T ativadas, que são dirigidas contra os peptídeos da invenção, são úteis em terapia. Assim, mais um aspecto da invenção fornece células ativadas de T conseguível pelos métodos precedentes da invenção. As células T ativadas, que são produzidas pelo método acima, seletivamente reconhecem uma célula que aberrantemente expressa um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 3.

[000221] Preferivelmente, a célula T reconhece a célula por interagir através de seu TCR com o HLA/complexo de peptídeo (por exemplo, ligando). As células T são úteis num método de eliminação de células- alvo em paciente cujas células-alvo aberrantemente expressam um polipeptídeo constituindo uma sequência de aminoácido da invenção, na qual ao paciente é administrado um número eficaz de células T ativadas. As células T administradas ao paciente podem ser derivadas do paciente e ativadas como descrito acima (ou seja, elas são células T autólogas). Alternativamente, as células T não são do paciente, mas de outro indivíduo. Naturalmente, é preferido se o indivíduo é um indivíduo saudável. Com "indivíduo saudável" os inventores querem dizer que o indivíduo está geralmente em boa saúde, preferivelmente com um sistema imune competente e, mais preferivelmente, não sofre de qualquer doença que prontamente pode ser testada e detectada.

[000222] In vivo, as células-alvo para as células T CD4 positivas de acordo com a invenção presente podem ser células do tumor (que às vezes expressam MHC de classe II) e/ou células estromais ao redor do tumor (células de tumor) (que às vezes também expressam MHC de classe II (Dengjel etal., 2006)).

[000223] As células T da presente invenção podem ser usadas como ingredientes ativos de uma composição terapêutica. Assim, a invenção também fornece um método de matar células-alvo em um paciente, cujas células-alvo aberrantemente expressam um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos da invenção, o método compreendendo a administração ao paciente de um número efetivo de células T como definido acima.

[000224] Com "aberrantemente expresso" os inventores também querem dizer que o polipeptídeo é sobre-expresso se comparado com níveis normais de expressão ou quando o gene é silencioso no tecido do qual o tumor foi derivado, mas no tumor em si ele é expresso. Por "sobre-expresso" os inventores querem dizer que o polipeptídeo é presente num nível em pelo menos 1,2 vez maior daquele presente em tecido normal; preferivelmente ao menos 2 vezes, e mais preferivelmente ao menos 5 vezes ou 10 vezes o nível atual presente no tecido normal.

[000225] Células T podem ser obtidas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles descritos acima. Os protocolos para esta transferência adotiva das assim chamadas células T são bem- conhecidos na técnica e podem ser achados, por exemplo, em (Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1988; Dudley et al., 2002; Yee et et al., 2002; Dudley et al., 2005); e revisados em (Gattinoni et al., 2006).

[000226] Qualquer molécula da invenção, isto é, o peptídeo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula, CTL ativado, receptor de célula T ou a codificação do ácido nucleico é útil para o tratamento de desordens, caracterizado por células escapando de uma resposta imune. Portanto qualquer molécula da presente invenção pode ser utilizada como medicamento ou para a fabricação de um medicamento. A molécula pode ser usada por si mesma ou em combinação com outra(s) molécula(s) da invenção ou (uma) molécula(s) conhecida(s).

[000227] Preferencialmente, o medicamento da presente invenção é uma vacina. Ela pode ser administrada diretamente ao paciente, no órgão afetado ou do sistematicamente i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v., ou aplicada ex vivo a células derivadas do paciente ou uma linha de célula humana que subsequentemente foram administradas ao paciente, ou usadas in vitro para selecionar um subpopulação de células imunes derivadas do paciente, que são então readministradas ao paciente. Se o ácido nucleico é administrado a células in vitro, pode ser útil para as células se elas forem transfectadas de forma a coexpressar citoquinas imunoestimulantes, como interleucina-2. Os peptídeos podem ser substancialmente puros, ou combinados com um adjuvante imunoestimulante (vide abaixo), ou usados em combinação com citoquinas imunoestimulantes, ou ser administrados com um sistema de administração adequado, por exemplo, lipossomas. O peptídeo também pode ser conjugado com um veículo apropriado, como o hemocianina do molusco fechadura (KLH) ou manana (vide WO 95/18145 e Longenecker et al. (1993)). O peptídeo também pode ser marcado, ser uma proteína de fusão ou uma molécula híbrida. Espera-se que os peptídeos cujas sequências são dadas na presente invenção estimulem as células T CD4 ou CD8. No entanto, a estimulação das CTLs CD8 é mais eficiente quando houver ajuda por parte das células T auxiliares CD4. Assim, para epitopos MHC da Classe I que estimulam CTL CD8, o parceiro de fusão ou secções de uma molécula híbrida adequada proporciona epitopos que estimulam as células T CD4 positivas. Os epitopos que estimulam as CD4 e CD8 são bem-conhecidos no estado da técnica, e incluem aqueles identificados na presente invenção.

[000228] Em um aspecto, a vacina compreende pelo menos um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID No 1, 2 ou 3 e pelo menos um peptídeo adicional, de preferência de dois a 50, mais de preferência de dois a 25, ainda mais preferencialmente dois a 15 e ainda mais preferencial mente dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou treze peptídeos. O(s) peptídeo(s) pode(m) ser derivado(s) de um ou mais TAAs específicos e podem ligar moléculas MHC da classe I e/ou classe II. De preferência, pelo menos um peptídeo adicional tem a sequência de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID No: 4 a 24.

[000229] O polinucleotídeo pode ser substancialmente puro, ou estar contido num vetor conveniente ou sistema de entrega. O ácido nucleico pode ser DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA ou combinações dos mesmos. Métodos para a concepção e introdução de um ácido nucleico são bem-conhecidas na técnica. Uma visão geral é fornecida, por exemplo, por Pascolo S. 2006; Stan R. 2006, ou A Mahdavi 2006. Vacinas polinucleotídicas são fáceis de se preparar, mas o modo de ação desses vetores em induzir uma resposta imunológica não é totalmente compreendido. Vetores convenientes e sistemas de entrega incluem DNA virai e/ou de RNA, tal como sistemas baseados em adenovirus, vírus de vaccinia, retrovirus, vírus de herpes, vírus associado a adenos ou híbridos contendo elementos de mais de um vírus. Sistemas não virais de entrega incluem lipídios catiônicos e polímeros catiônicos e são bem-conhecidos na técnica de entrega de DNA. Entrega física, tal como via um direcionador de genes, também pode ser usada. O peptídeo ou peptídeos codificados pelo ácido nucleico também pode ser uma proteína de fusão, por exemplo, com um epitopo que estimula células T para o respectivo CDR oposto como observado acima.

[000230] O medicamento da invenção também pode incluir um ou mais adjuvantes. Adjuvantes são substâncias que não reforçam ou potencializam especificamente a resposta imune (por exemplo, respostas imunes mediadas por CTLs e células T auxiliares (TH)) para um antígeno, e terão, portanto, de ser considerados úteis para o medicamento da presente invenção. Adjuvantes adequados incluem, mas não estão limitados a, 1018 ISS, sais de alumínio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelina ou TLR5 ligantes derivados de flagelina, FLT3 ligante, GM-CSF, IC30, IC31 , Imiquimod (ALDARA), ImuFact IMP321, Interleucinas como IL-2, IL-13, IL-21, interferon-alfa-ou beta, ou pegylated, seus derivados, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, Juvlmmune, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipídico A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsões água em óleo e óleo em água, OK-432, OM-174, OM-197 - MP-CE, ONTAK, OspA, PepTel® sistema vetor, PLG e micropartículas dextram, resiquimodo, SRL172, Virosomes e outros vírus, como partículas, YF-17D, armadilha VEGF, R848, beta-glucano, Pam3Cys, QS21 stimulon da Aquila, que é obtido a partir de saponina, micobacterianos extratos bacteriano e síntese da parede celular mímica, e de outros adjuvantes proprietários, como Detox da Ribi, Quil, ou Superfos. Adjuvantes, tais como os da Freund ou GM-CSF, são preferidos. Vários adjuvantes imunológicos (por exemplo, MF59) específicos para células dendríticas e suas preparações foram descritas anteriormente (Dupuis M et al. 1998; Allison 1998). Também é possível utilizar citoquinas. Várias citoquinas têm sido diretamente ligadas à célula dendrítica que influencia a migração para os tecidos linfoides (por exemplo, TNF-a), acelerando a maturação das células dendríticas em células eficientes apresentadoras de antígenos para linfócitos T (por exemplo, a GM- CSF, IL-1 e IL -4) (U.S. Pat. N 0 5849589, especificamente aqui incorporados por referência em sua totalidade) e agindo como imunoadjuvantes (por exemplo, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa. IFN- beta) (Gabrilovich etal. 1996).

[000231] Oligonucleotides imunoestimulatórios CpG também foram relatados para melhorar os efeitos de adjuvantes na elaboração de uma vacina. Sem estar vinculada por teoria, oligonucleotides CpG atuam através da ativação do sistema imunitário da inata (não adaptativo), através de receptores do tipo "toll" (TLR), principalmente TLR9. Ativação TLR9 de CpG disparado aumenta as respostas humorais e celulares específicas do antígeno para uma ampla variedade de antígenos, incluindo antígenos de peptídeo ou proteína, vírus vivos ou mortos, vacinas de células dendríticas, vacinas celulares autólogas e polissacarídeos conjugados em ambas as vacinas, profiláticas e terapêuticas. Mais importante é o fato que ela reforça a maturação e diferenciação de células dendríticas, resultando em uma maior ativação de células Tm e em uma forte geração de linfócitos T citotóxicos (CTL), mesmo na ausência da ajuda de células T CD4. O viés de TH1 induzida por estimulação de TLR9 é mantida mesmo na presença de adjuvantes de vacina, tais como alumínio ou adjuvante incompleto de Freund (IFA) que, normalmente, promove um viés de TH2. Oligonucleótidos CPG mostram uma atividade ainda maior de adjuvante quando formulado ou coadministrado com outros adjuvantes ou em formulações como as micropartículas, nanopartículas, emulsões lipídicas ou formulações similares, que são especialmente necessárias para induzir uma resposta forte quando o antígeno é relativamente fraco. Eles também aceleram a resposta imune e permitem as doses de antígeno a serem reduzidas por aproximadamente duas ordens de magnitude, com respostas comparáveis de anticorpo para a vacina de dose integral sem CpG em algumas experiências (Krieg et al. 2006). US Pat. No. 6,406,705 B1 descreve o uso combinado de CPG oligonucleotídios, adjuvantes de ácido não nucleico e um antígeno para induzir uma resposta imune específica do antígeno. Uma CPG TLR9 antagonista é o dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) por Mologen (Berlim, Alemanha), que é um componente preferido da composição farmacêutica da presente invenção. Outras moléculas que se ligam a TLR, como a TLR 7, TLR 8 e / ou TLR 9 que se ligam ao RNA também podem ser utilizadas.

[000232] Outros exemplos de adjuvantes úteis incluem, mas não estão limitados a CpGs quimicamente modificados (por exemplo, CPR, Idera), dsRNA análogos, como a Poly(l:C) e AmpliGen, não CPG bacteriana DNA ou RNA, bem como pequenas moléculas e anticorpos imunoativos tais como a ciclofosfamida, sunitiniba, Bevacizumab, Celebrex, NCX-4016, sildenafila, tadalafila, vardenafila, Sorafenib, temozolomide, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4 e SC58175, que podem agir terapeuticamente e/ou como um adjuvante. As quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser facilmente determinadas pelo versado sem experimentação. Adjuvantes preferidos são dSLIM, interferon-alfa, interferon-beta, CpG7909, IC31, ALDARA (Imiquimod), PeviTer, RNA, tadalafil, temozolomide, e Juvlmmune.

[000233] A presente invenção proporciona um medicamento que é útil no tratamento do câncer, em particular glioma e câncer cerebral, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de esôfago, câncer colorretal, câncer renal, câncer de pâncreas, carcinoma de células escamosas e neoplasias queratinocíticas da pele, leucemia, câncer de pulmão, câncer de ovário e melanoma.

[000234] Além disso, a presente invenção ainda inclui um kit composto por: (a) um recipiente contendo uma composição farmacêutica, de acordo com a descrição acima, em solução ou em forma liofilizada (b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou uma solução para a reconstituição para tal formulação liofilizada, e (c) opcionalmente, as instruções para (i) o uso da solução, ou (ii) reconstituição e / ou uso da formulação liofilizada.

[000235] O kit pode ainda incluir um ou mais tampões (iii), um diluente (iv), um filtro (v), uma agulha (vi), ou uma seringa (v). O recipiente deve ser de preferência uma garrafa, um frasco, uma seringa ou um tubo de ensaio, e ele pode ser um recipiente multiuso. A composição farmacêutica é, de preferência, liofilizada.

[000236] Kits da presente invenção contêm, de preferência, uma formulação liofilizada da presente invenção em um recipiente adequado assim como as instruções para a sua reconstituição e / ou utilização. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos (por exemplo, frascos de câmara dupla), seringas (por exemplo, seringas de câmara dupla) e tubos de ensaio. O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de materiais como vidro ou plástico. Preferencialmente, o kit e / ou o recipiente contêm instruções sobre o recipiente ou similares que indicam as direções para a reconstituição e / ou utilização. Por exemplo, o rótulo poderá indicar que a formulação liofilizada deverá ser reconstituída a concentrações de peptídeos, tal como descrito acima. O rótulo ainda pode indicar que a formulação é destinada ou apropriada para administração subcutânea.

[000237] O recipiente que detém a formulação pode ser um frasco multiuso, que permite a repetição de administrações (por exemplo, 2 a 6 administrações), da formulação reconstituída. O kit ainda pode incluir um segundo recipiente, contendo um diluente adequado (por exemplo, solução de bicarbonato de sódio).

[000238] Após a mistura do diluente e da formulação liofilizada, a concentração no final de peptídeo na formulação reconstituída é, de preferência, pelo menos, 0,15 mg/mL/peptídeo (= 75pg) e preferencialmente não superior a 3 mg/mL/peptídeo (= 1500pg). O kit ainda pode incluir outros materiais, conforme desejado a partir de uma perspectiva comercial ou do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e suplementos de embalagem com instruções de utilização.

[000239] Kits da presente invenção podem ter um único recipiente que contém a formulação das composições farmacêuticas, segundo a presente invenção, com ou sem outros componentes (por exemplo, outros compostos ou composições farmacêuticas desses outros compostos), ou podem ter recipientes distintos para cada componente.

[000240] Preferencialmente, kits da invenção incluem uma formulação da invenção embalada para uso em combinação com a coadministração de um segundo composto (como adjuvantes (por exemplo GM-CSF), um agente quimioterápico, um produto natural, um hormônio ou antagonista, um agente ou inibidor de antiangiogênese, um agente indutor de apoptose ou um quelante) ou uma composição farmacêutica dos mesmos. Os componentes do kit podem ser pré- complexados ou cada componente pode ser depositado separadamente em recipientes distintos antes da administração a um paciente. Os componentes do kit podem ser fornecidos em uma ou mais soluções líquidas, de preferência, uma solução aquosa, ainda mais preferencialmente, uma solução aquosa estéril. Os componentes do kit também podem ser fornecidos como sólidos, que podem ser convertidos em líquidos através da adição de solventes adequados, que devem ser fornecidos preferencialmente em um recipiente distinto.

[000241] O recipiente de um kit terapêutico pode ser um frasco, tubo de ensaio, container, garrafa, seringa, ou quaisquer outros meios de armazenamento de sólidos ou líquidos. Normalmente, quando há mais de um componente, o kit deverá conter um segundo frasco ou outro recipiente, que permita separar a dosagem. O kit também pode conter um outro recipiente para um líquido farmaceuticamente aceitável. De preferência, o kit terapêutico deverá conter um aparelho (por exemplo, uma ou mais agulhas, seringas, conta-gotas, pipetas, etc), que permita a administração correta dos agentes da invenção que são componentes do presente kit.

[000242] A presente formulação é adequada para a administração dos peptídeos por qualquer via aceitável, tal como a oral (entérica), nasal, oftálmica, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa ou transdérmica. Preferencialmente a administração s.c., e mais de preferência, i.d. A administração pode ser por bomba de infusão.

[000243] A presente invenção será agora descrita nos exemplos a seguir, que descrevem suas modalidades preferidas sem que ela seja limitada, no entanto, a estes exemplos. Para os fins da presente invenção, todas as referências aqui citadas passam a fazer parte integral deste documento por referência. Nas figuras e na listagem de sequência Descrição curta dos desenhos

[000244] Figura 1 mostra o espectro de cromatografia de massas ESI líquida para identificar o tumor associado ao peptídeo NCAN-001 a partir da amostra de glioblastoma GB1006.

[000245] Figura 2 descreve o perfil de expressão mRNA do gene NCAN que codifica o glioblastoma associado ao peptídeo NCAN-001. Expressão deste gene está ausente ou muito baixa em tecidos normais, embora seja fortemente aumentada nas amostras glioblastoma (GB1006T para GB1011T; NCH359T e NCH361T).

[000246] Figura 3 mostra o perfil de expressão relativa de mRNA do gene de expressão BIRC.5. deste gene está ausente ou muito baixo em tecidos normais, embora seja fortemente aumentado em amostras de tumor.

[000247] Figuras 4a e 4b mostram a presença de PSMA e Survivina específicos secretores de células T IFND CD4+ mononucleares do sangue periférico de células (PBMC) de diferentes momentos de um paciente vacinado, que foram determinados utilizando-se um DFDD ELISpot. Os momentos: pré-vacinal (a) e depois 3. (b), 6. (c), 7. (d), 8. (e), 9. (f), 10. (g), 11. (h) vacinação.

[000248] Figura 5 mostra a presença de survivina específica IFND-, IL-5, IL-10, segregando células TCD4+TNFα PBMC em três diferentes momentos de um paciente vacinado, que foram determinados via ensaio ICS. Os momentos: após a 1. (a), 3. (b), 7. (c), vacinação.

[000249] Figura 6 mostra a resposta bioquímica em pacientes 8 e 10, mostrando estabilidade PSA sem aumento superior a 10% do valor basal de PSA.

[000250] Figura 7 mostra a resposta bioquímica em pacientes 11 e 16, mostrando aumento de PSA DT sem estabilidade PSA.

[000251] Figura 8 mostra a resposta bioquímica no paciente 5, mostrando aumento de PSA DT sem estabilidade PSA.

[000252] Figura 9 mostra a resposta bioquímica nos pacientes 1, 4, 10, 12 e 13 mostrando nenhuma alteração de PSA DT durante a vacinação.

[000253] Figura 10 mostra a resposta bioquímica em pacientes 2, 6, 9, 14, 18 e 19 mostrando nenhuma alteração de PSA DT durante a vacinação.

[000254] Figura 11 mostra a resposta bioquímica em pacientes 7, 15 e 17 mostram o declínio de PSA ou aumento intercalar DT seguido de diminuição DT.

[000255] Figura 12 mostra que a partir do estudo de vacinação do câncer de próstata, clones CD4+ BIR-002-peptídeo específico de célula T poderiam ser estabelecidos a partir de vários pacientes vacinados com câncer que estão funcional com relação à produção de IFN-gama em resposta ao BIR-002. Wang et al. 2008 descrevem clones de células T obtidos a partir de doadores saudáveis após várias rodadas de iniciação in vitro e estímulo, enquanto as células T presentes puderam ser induzidas em pacientes com vacinação. PMA/ionomicina = antígeno de ativação independente de inespecíficos; Survivina (II): Estimulação BIR- 002; PSMA (II): estimulação com peptídeos irrelevantes. Todas as células reativas são CD4 positivas.

[000256] Figura 13 mostra que BIR-002 é, naturalmente, apresentado pelas células dendríticas. Células dendríticas imaturas incubadas com a proteína recombinante survivina são reconhecidas pelas células T BIR-002 específicas de pacientes vacinadas, conforme mostrado por coloração de citoquinas intracelulares. Estes resultados sugerem que BIR-002 é, naturalmente, processado por proteinases dentro das células dendríticas e que o epitopo BIR-002 não é destruído pelo tratamento. Além disso, essas células T CD4+ são multifuncionais, pois elas secretam citoquinas IFN-gama, TNF-alfa e IL-2, têm a expressão de superfície do ligante CD40 (CD154) e desgranulam indicadas pela expressão de superfície CD107a. A resposta das células T indicadas é específica de antígenos, pois as células T não são ativadas por células dendríticas incubadas com a proteína RAP80 irrelevantes, ou peptídeos HIV-001.

[000257] Figura 14 mostra que uma fração de células T específicas BIR-002 CD4+ derivadas de pacientes com câncer de próstata vacinados com BIR-002 expressam citoquinas benéfico IFN-gama, TNF-alfa, IL-2, enquanto as citoquinas imunomoduladoras IL-10 e IL-17 não são expressas a esse ponto. São mostrados dados primários e dados resumidos de citoquinas intracelulares coloração de células T especificas para BIR-002 ou dois peptídeos de controle restrito da classe II.

[000258] Figura 15 mostra que várias linhagens de células tumorais que expressam diferentes alelos HLA-DR são reconhecidas pelo paciente de PBMCs derivados (indicado para os pacientes Pro26 e Pro15). Assim: 1. pacientes desenvolvem resposta multiclonal de células T após a vacinação com BIR-002, 2. BIR-002 mostra ligação promíscua a vários alelos HLA da classe II: DR1 (vide também Wang et al.), DQ5 (não foi testado por Wang et al.), DR11 (vide também Wang et al.) ou DRB3 (em contraste com Wang et al.et al.. 2008, tabela 1), 3. Apresentação funcional do BIR-002 é possível no contexto de várias moléculas HLA de classe II (produção de TNF-alfa). Quanto ao HLA de classe I (HLA-A, B, C), em princípio, três loci de genes diferentes podem ser encontrados para HLA de classe II que expressam moléculas da classe funcional II na superfície das células, ou seja, HLA-DQ, HLA-DP e HLA-DR. Moléculas de classe I são compostas de uma cadeia pesada (-A, B, -C) e um beta-2 microglobulina, que é constante em todos os três genes. No entanto, as moléculas de classe II são compostas de duas cadeias de cada variável (alfa e beta). Assim, a digitação geneticamente sofisticada é sempre complicada com a classe II. Na tabela são dados os tipos chamados sorológicos, que são baseados na ligação de anticorpos. Assim, "DQ3", por exemplo, é composto por diferentes alelos de HLA- DQ cadeias alfa e beta que são comumente encontrados em conjunto e reagem com um anticorpo específico. As células da tabela são:

[000259] SEQ ID n° 1 ao n 0 SEQ ID 3 mostram as sequências do peptídeo associado a tumor da presente invenção derivados de survivina.

[000260] SEQ ID n° 4 a SEQ ID n 0 13 e SEQ ID No 24 mostram as sequências de outros peptídeos associados a tumor utilizados na presente invenção.

[000261] SEQ ID n° 14 mostra a sequência do peptídeo de HBV.

[000262] SEQ ID n° 4 a SEQ ID n 0 13 e SEQ ID No 23 mostram as sequências de outros peptídeos associados a tumor utilizados na presente invenção.

[000263] SEQ ID n° 25 a SEQ ID n 0 27 mostram as sequências de outros peptídeos associados de Wang et al. (WO 2007/036638).

[000264] SEQ ID n° 28 a SEQ ID n 0 33 mostram as sequências de peptídeos associados a tumor de Piesche.

[000265] SEQ ID n° 34 a SEQ ID n 0 63 mostram as sequências de outros peptídeos conforme projetado no exemplo 3.

[000266] SEQ ID n° 64 a SEQ ID n 0 65 mostram as sequências de outros peptídeos usados no exemplo 4.

[000267] SEQ ID n° 66 a SEQ ID n 0 72 mostram as sequências de outros peptídeos usados no exemplo 5.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: a identificação de peptídeos associados a tumor na superfície da célula Amostras de tecido

[000268] Os tecidos de tumor e saudáveis foram fornecidos pelo Hôpital Cantonal Universitaire de Genève (Laboratório Médico de Oncologia de Imunologia de Tumor) e pela Neurochirurgische Universitãts-Klinik Heidelberg (Laboratório Molecular Biológico). Consentimentos expressos por escrito dos pacientes foram dados antes da cirurgia. Os tecidos foram congelados por choque em nitrogênio líquido imediatamente após a cirurgia e armazenados até o isolamento de peptídeos a -80°C.

Isolamento de peptídeos HLA em amostras de tecido

[000269] Bacias de peptídeos HLA provenientes de amostras de tecidos congelados por choque foram obtidos por precipitação imune a partir de tecidos sólidos de acordo com um protocolo ligeiramente modificados (Falk, K. etal. 1991; Seeger, F.H. et al. T 1999) usando o anticorpo HLA-A*02 específico BB7.2 ou o anticorpo específico HLA-A, -B, -C W6/32, sefarose de CNBr ativado, tratamento ácido, e ultrafiltração.

Método dois

[000270] As obtidas bacias peptídicas de HLA foram separadas de acordo com sua hidrofobicidade por cromatografia de fase revertida (Acquity UPLC system, Waters) e os peptídeos a serem diluídos foram analisados num espectrômetro de massa híbrida LTQ-Orbitrap (ThermoElectron) equipados com uma fonte de ESI. As bacias peptídicas foram carregadas diretamente para coluna analítica de sílica fundida microcapilar (75 pm i.d. x 250 mm) empacotada com 1,7 pm de material C18 de fase revertida (Waters), aplicando um índice de fluxo de 400 nL por minuto. Subsequentemente, os peptídeos foram separados usando um gradiente binário de 180 minutos em dois passos de 10% a 33% B em índices de fluxo de 300 nL por minuto. O gradiente foi composto de Solvente A (0,1% ácido fórmico em água) e solvente B (0,1% de ácido fórmico em acetonitrila). Um tubo capilar revestido de vidro dourado (PicoTip, New Objective) foi usado para introdução na fonte de micro-ESI. O espectrômetro de massa LTQ- Orbitrap foi operado no modo dependente dos dados usando uma estratégia TOP5. Em sumário, um ciclo de escaneamento foi inicializado com um escaneamento pleno de alta exatidão de massa no orbitrap (R = 30 000), que foi seguido por escaneamentos da MS/MS também no orbitrap (R = 7500) nos 5 ions mais abundantes de precursor com a exclusão dinâmica de ions previamente selecionados. Os espectros de massa tandem foram interpretados por SEQUEST e por controle manual adicional. A sequência de peptídeos identificada foi assegurada por comparação do padrão de fragmentação de peptídeo natural gerado com o padrão de fragmentação de um peptídeo de referência sequência idêntica sintética. A figura 1 mostra um espectro de exemplares obtidos a partir de tecido tumoral para o peptídeo associado MHC da classe I NCAN-001.

EXEMPLO 2: a expressão de perfil de genes codificando os peptídeos da invenção

[000271] Não todos os peptídeos identificados como sendo apresentados na superfície de células de tumor por moléculas MHC são adequados para imunoterapia, porque a maioria destes peptídeos é derivada de proteínas celulares normais expressas por muitos tipos de célula. Só alguns destes peptídeos são associados a tumor e provavelmente capazes de induzir células T com uma alta especificidade de reconhecimento para o tumor, do qual eles foram derivados. Para poder identificar tais peptídeos e reduzir o risco para autoimunidade induzida por vacinação, os inventores focaram nesses peptídeos, que são derivados de proteínas que são sobre-expressas em células de tumor comparadas à maioria de tecidos normais.

[000272] O peptídeo ideal será derivado de uma proteína que é exclusiva ao tumor e não presente em qualquer outro tecido. Para identificar peptídeos que são derivados de genes com um perfil de expressão similar ao gene ideal, os peptídeos identificados foram designados às proteínas e genes, respectivamente, dos quais eles foram derivados, e perfis de expressão destes genes foram gerados. Fontes de RNA e preparação

[000273] Espécimes de tecido cirurgicamente retirados foram fornecidos por dois locais clínicos diferentes (vide exemplo 1) depois do consentimento expresso por escrito ter sido obtido de cada paciente. Os espécimes de tecido de tumor foram congelados por estalo em nitrogénio líquido imediatamente depois de cirurgia e, mais tarde, homogeneizados com almofariz e pilão sob nitrogênio líquido. RNA total foi preparado destas amostras usando TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) seguido por uma limpeza com RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemanha); ambos os métodos foram executados de acordo com o protocolo do fabricante.

[000274] RNA total de tecidos humanos saudáveis foi obtido comercialmente (Ambion, Huntingdon, Reino Unido; Clontech, Heidelberg, Alemanha; Stratagene, Amsterdã, Países Baixos; BioChain, Hayward, CA, EUA). O RNA de vários indivíduos (entre 2 e 123 indivíduos) foi misturado, de tal modo que o RNA de cada indivíduo foi igualmente pesado. Os leucócitos foram isolados de amostras de sangue de 4 voluntários saudáveis.

[000275] A qualidade e quantidade de todas as amostras de RNA foram avaliadas num bioanalisador Agilent 2100 (Agilent, Waldbronn, Alemanha) usando o kit 6000 Pico LabChip (Agilent).

Experimentos micromatrix

[000276] A análise de expressão de gene de todas as amostras RNA de tecido tumoral e normal foi executada por micromatrix oligonucleotídea Affymetrix Human Genome (HG) U133A ou HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA). Todas as etapas foram realizadas de acordo com o manual Affymetrix. Em resumo, cDNA de fita dupla foi sintetizado de 5 a 8 pg do RNA total, usando Superscript RTII (Invitrogen) e o iniciador oligo-dT-T7 (MWG Biotech, Ebersberg, Alemanha) como descrito no manual. Uma transcrição in vitro foi executada com o kit de rotulação de transcrição RNA BioArray High Yield (Diagnósticos ENZO, Inc., Farmingdale, NY, EUA) para as séries U133A ou com o kit de rotulação GeneChip IVT (Affymetrix) para as séries U133 Plus 2.0, seguidas por fragmentação de cRNA, hibridação, e coloração com estreptavidina-ficoeritrina e anticorpo de antiestreptavidina de biotina (Molecular Probes, Leiden, Paises Baixos). As imagens foram escaneadas com o scanner Agilent 2500A GeneArray (U133A) ou o scanner Affymetrix Gene-Chip 3000 (U133 Plus 2.0), e dados foram analisados com o software GCOS (Affymetrix), usando cenários padrões para todos os parâmetros. Para a normalização, a 100 genes locais fornecidos pela Affymetrix foram utilizados. Valores relativos de expressão foram calculados das relações do diário de sinal fornecidas pelo software e a amostra normal foi arbitrariamente posta em 1.0.

[000277] O perfil de expressão de fonte do gene NCAN do peptídeo NCAN-001 da presente invenção mostra uma alta expressão em tecido de tumor de glioblastoma, considerando-se que o gene não é expresso ou é expresso em níveis muito baixos em tecidos normais (figura 2).

EXEMPLO 3: motivo HLA-DR de peptídeos de survivina (swissprot: 015392)

[000278] Previsão epitopo: previsão de ligantes potenciais HLA-DR foi realizada através do banco www de dados SYFPEITHI. Resumidamente, a sequência de survivina foi exibida com um padrão de matriz que avalia cada aminoácido dentro da sequência do núcleo nonamer 15mer peptídeos encaixando o respectivo motivo HLA-DR. Aos resíduos de âncora são apresentados valores de até 10; resíduos de outros valores até 3, refletindo as preferências de aminoácidos para certas posições dentro do peptídeo. A pontuação máxima teórica de um peptídeo candidato varia de 28 a 43; escores de ligantes naturais abundantes são tipicamente acima de 20.

[000279] TLGEFLKLDRERAKN (SEQ ID No. 1) (ou versões truncadas) aparecem entre os peptídeos de maior pontuação em cinco das seis previsões. DRB1*01 (pontuação máxima teórica 43) 58 FFCFKELEGWEPDDD (SEQ ID No. 34) 36 98 LGEFLKLDRERAKNK (SEQ ID No. 35) 28 22 FKNWPFLEGCACTPE (SEQ ID No. 36) 28 DRB1*03 (pontuação máxima teórica 40) 99 GEFLKLDRERAKNKI (SEQ ID No. 37) 29 10 WQPFLKDHRISTFKN (SEQ ID No. 38) 26 3 APTLPPAWQPFLKDH (SEQ ID No. 39) 25 DRB1*04 (pontuação máxima teórica 28) 98 LGEFLKLDRERAKNK (SEQ ID No. 40) 28 10 WQPFLKDHRISTFKN (SEQ ID No. 41) 28 3 APTLPPAWQPFLKDH (SEQ ID No. 42) 26 DRB1*07 (pontuação máxima teórica 34) 121 KKEFEETAEKVRRAI (SEQ ID No. 43) 24 128 AEKVRRAIEQLAAMD (SEQ ID No. 44) 24 3 APTLPPAWQPFLKDH (SEQ ID No. 45) 22 16 DHRISTFKNWPFLEG (SEQ ID No. 46) 20 28 LEGCACTPERMAEAG (SEQ ID No. 47) 18 40 EAGFIHCPTENEPDL (SEQ ID No. 48) 18 93 FEELTLGEFLKLDRE (SEQ ID No. 49) 16 103 KLDRERAKNKIAKET (SEQ ID No. 50) 16 DRB1*11 (pontuação máxima teórica 38) 98 LGEFLKLDRERAKNK (SEQ ID No. 51) 32 83 GCAFLSVKKQFEELT (SEQ ID No. 52) 24 58 FFCFKELEGWEPDDD (SEQ ID No. 53) 22 DRB1*15 (pontuação máxima teórica 34) 95 ELTLGEFLKLDRERA (SEQ ID No. 54) 30 19 ISTFKNWPFLEGCAC (SEQ ID No. 55) 28 55 AQCFFCFKELEGWEP (SEQ ID No. 56) 28

Etapas conducentes á decisão sobre a sequência

[000280] Para cada peptídeo, uma sequência 9mer de núcleo é necessária para HLA-DR vinculativa. Previsão de sequências principais: DRBV01 FLKLDRERA (SEQ ID No. 57) DRBV03 LKLDRERAK (SEQ ID No. 58) DRBV04 FLKLDRERA (SEQ ID No. 59) DRB1*11 FLKLDRERA (SEQ ID No. 60) DRBV15 LGEFLKLDR (SEQ ID No. 61)

[000281] 2. Sequências de núcleo combinadas para obter uma sequência de núcleo promiscuitiva:

[000282] Combinados: LGEFLKLDRERAK (SEQ ID No. 62)

[000283] 3. Adicionar sequências de acompanhamento a um comprimento final de 15 aminoácidos:

[000284] Final: TLGEFLKLDRERAK (SEQ ID No. 63)

EXEMPLO 4:

[000285] Um estudo clínico foi realizado para confirmar a imunogenicidade do peptídeo com a SEQ ID No: 1. O objetivo primário do estudo foi a investigação do PSA (antígeno prostático específico) baseado na resposta (PSA-R) para a administração subcutânea de um painel de peptídeo específico da próstata (terapia de vacinação) em pacientes com bioquímica recidiva após prostatectomia radical sem detecção de manifestar lesões metastáticas.

[000286] O objetivo do estudo secundário foi a investigação da tolerância e viabilidade de administrar a terapia de vacinação em doentes com carcinoma da próstata, com atenção especial dos fenômenos imunológicos em termos de resposta das células T.

[000287] O estudo foi concebido como um estudo prospective, randomizado de fases l/ll para a indicação de "recidiva bioquímica após prostatectomia radical sem detecção de lesões metastáticas manifestadas".

População do estudo

[000288] Como parte desta fase I / II, foi feita uma tentativa de induzir a regressão PSA como um indicador de interrupção do crescimento do tumor por meio de vacinação com peptídeos específicos do painel de próstata em pacientes HLA-A*02+ com recidiva bioquímica após prostatectomia radical. Uma combinação de peptídeos prostáticos específicos foi administrada por via subcutânea, com avaliação da extensão da resposta imune no respectivo âmbito de várias formas de gestão das estruturas antigênicas.

[000289] Em contraste com estudos anteriores de vacinação, o estudo planejado estava focado no tratamento de pacientes com um tumor pequeno ainda não detectável pelos procedimentos de imagem. Os pacientes foram imunizados todos da mesma maneira usando-se estruturas antigênicas conhecidas específicas de próstata para melhorar a resposta imune às células malignamente transformadas. Dezenove pacientes foram tratados. Tabela 7: população do estudo

[000290] Após excluir manifestações por lesões metastáticas através de tomografia computadorizada e cintilografia óssea, a vacina de peptídeo específico da próstata foi administrada por via subcutânea de acordo com as diferentes formas de administração a pacientes com recaída PSA detectada após a prostatectomia radical anterior (aumento de PSA em termos de uma elevação de 50% no valor durante duas medições com pelo menos 14 dias de intervalo). A vacina foi administrada 8 x nos dias 0, 7, 14, 28, 42 e 56 (aproximadamente 100 microgramas por peptídeos e injeção de cada vez). Após cada tratamento de vacinação e novamente no dia 70, o PSA foi medido para avaliação da resposta terapêutica.

[000291] Se a resposta do tumor (remissão completa [PSA-CR], remissão parcial [PSA-PR], ou o curso clínico estável [nenhuma mudança, PSA-NC]) for detectado, o paciente recebeu a vacina uma vez por mês como terapia de manutenção de acordo com a forma de administração selecionada. A resposta do paciente à terapia de vacinação foi avaliada em detalhe como segue:

[000292] Remissão completa (PSA-CR): normalização de um nível de PSA, inicialmente elevado, confirmado por medição após um intervalo de pelo menos 4 semanas. A normalização é definida como um nadir de PSA <0,2 ng / ml, o que seria de esperar após a prostatectomia radical com ou extirpação completa do tumor de próstata.

[000293] Remissão parcial: a) PSA-PR < 80% (redução de um nível de PSA elevado inicialmente em 80%, confirmada por medição após um intervalo de pelo menos 4 semanas) e b) PSA-PR 50% de redução (em um primeiro nível elevado de PSA em 50%, confirmada por medição após um intervalo de pelo menos 4 semanas).

[000294] Doença estável (PSA-SD): nenhuma mudança significativa ao longo de um período de pelo menos quatro semanas. Isso inclui a estabilização e redução de menos de 50% e um aumento inferior a 10%, confirmada pela medida após um intervalo de pelo menos 4 semanas.

[000295] Progressão (PSA-PD): aumento do nível de PSA em mais de 10%. No evento da progressão da PSA, o estudo foi encerrado.

[000296] Após a inscrição dos pacientes no estudo, a vacina epitopo específica foi usada, as proteínas especificamente expressas em células epiteliais da próstata (por exemplo, PSMA / PSCA) foram levadas em consideração. Além de investigar a eficácia geral da vacina administrada no que diz respeito ao acompanhamento do crescimento das frações de tumor residual, avaliada pelo acompanhamento PSA, este estudo investigou os efeitos de diferentes métodos de vacinação no que diz respeito à modulação eficaz do sistema imunológico. Além disso, a administração subcutânea simples dos peptídeos sozinhos de acordo com a invenção, várias combinações com adjuvantes também foram utilizadas. A vacina inclui uma combinação de pelo menos 6 peptídeos derivados do PSA, PSCA, PSMA, Survivina, TRP-P8 e Prosteina, respectivamente. Um peptídeo derivado de gripe MP foi usado como controle positivo. Peptídeos derivados da PSMA e Survivina foram usados em epitopos T auxiliares. Em particular, foram usados depósito e atividade adjuvante de vacinas de peptídeos de Montanide (uma formulação do clássico adjuvante incompleto de Freund é adequada para uso em seres humanos), que foi recentemente descrito de forma muito favorável. Para o efeito, 500 pl da solução de peptídeo foi misturado com 500 pl de Montanide e, em seguida, administrado. Assim, uma emulsão de água em óleo que é construída lentamente libera o antígeno contido na fase aquosa durante semanas. A estabilidade física da emulsão é muito elevada, como a 4 °C e pode ser armazenada por mais de três meses sem fase importante de separação. A função de depósito de Montanide tem sido explorada em vários ensaios de vacinação com bons resultados (Oka et al.et al.., 2004).

[000297] Um ramo do estudo investigou a eficácia da vacinação durante a estimulação concomitante do sistema imunológico por fatores de crescimento, a GM-CSF, Leukine® solução para injeção. GM-CSF é um adjuvante muito comumente utilizado em ensaios de vacinação de peptídeo com seus vários relatórios clínicos avançados e suas respostas de células T. Inicialmente, GM-CSF é um recrutamento de células dendríticas e o fator de diferenciação é projetado para aumentar o número de células dendríticas no local das vacinas injetáveis. Embora a GM-CSF, por si mesma, só não ativar células apresentadoras de antígenos como as células dendríticas e macrófagos, uma ativação indireta in vivo tem sido relatada (Molenkamp etal., 2005).

[000298] Outro ramo do estudo investigou a eficácia da vacinação durante a ativação das células dendríticas concomitantes com o uso de imiquimode epicutâneo. Imiquimode foi administrado como uma pomada 5% (Aldara). Ele tem um forte imunoestimulatório através do seu efeito sobre células TLR7 positivas (por exemplo, DCs plasmacitoida, células de Langerhans, DCs dérmicas), que ativa a via MyD88-dependente. APCs ativadas liberam estimulação de células T inflamatórias e citoquina estimulantes, sobrerregula coestimulação e migram para os linfonodos de drenagem. Foi demonstrado em modelos animais que o potencial de iniquimoda para melhorar respostas CTL induzidas por peptídeos misturando os antígenos para a pomada ou por aplicação de Aldara sobre o local da injeção s.c. ou i.d. para os antígenos.

[000299] Outro ramo do estudo investigou a eficácia da vacinação durante a ativação concomitante das células dendríticas, misturando- as com protamina estabilizada mRNA codificando mucina-1 para ativar TLR 08/07. mRNA mostra uma ampla ativação nas células imunes de populações humanas e de ratos. A presença da proteína protamina polibase na formulação aumenta a meia-vida do mRNA e induz a formação de partículas potencialmente deformadas em depósito (sedimentação). Este adjuvante pode, portanto, combinar-se formando o depósito ativando propriedades APC.

[000300] Em resumo, as formas de administração da vacina incluem as seguintes abordagens:

[000301] a administração subcutânea da vacina peptídica emulsionada em Montanide;

[000302] a administração subcutânea da vacina peptídica emulsionada em 500 pl de Montanide em combinação com a administração tópica de 225 pl de GM-CSF, com o objetivo de alcançar uma resposta imune mais forte desencadeada pela administração concomitante de fatores de crescimento;

[000303] a administração subcutânea da vacina peptídica emulsionada em 500 pl de Montanide em combinação com hipertermia local, com o objetivo de alcançar uma resposta imune termicamente induzida e mais forte;

[000304] a administração subcutânea da vacina peptídica emulsionada em 500 pl de Montanide em combinação com imiquimode epicutânea a fim de ativar as células dendríticas via TLR 7;

[000305] a administração subcutânea da vacina peptídica emulsionada em 500 pl de Montanide em combinação com 55 pl de mucina-1 mRNA/protamina a fim de ativar as células dendríticas via TLR 7/8.

Plano cronológico

[000306] A duração total do estudo foi de 3 anos. Vacinas peptídicas específicas da próstata foram administradas aos pacientes nos dias 0, 7, 14, 28, 42 e 56. Em pacientes com doença estável ou uma resposta objetiva do tumor (PSA-CR ou PSA-PR), a vacinação foi recebida uma vez por mês de modo i.d. até ocorrer uma progressão detectável. Com base na experiência disponível até agora, as injeções de peptídeos são toleradas sem reações adversas significativas. Devido ao fato da resposta à terapia de vacinação ter sido avaliada exclusivamente sorologicamente com base na medição de PSA, o teste foi realizado no início do estudo para determinar se a vacina administrada interfere com a medição de PSA in vitro, que poderiam simular uma resposta clínica. Nos dias 0, 7, 14, 28, 42, 56 e 70, amostras de sangue foram colhidas para exames laboratoriais, níveis de PSA, hemograma diferencial, análise FACS, e citoquinas. Se o tratamento for continuado depois de passado o dia 70, seis semanas de monitoração PSA foi realizada a fim de detectar a falha do tratamento em tempo hábil.

[000307] O tratamento foi encerrado, se documentada a progressão da doença ocorrida em termos de elevação de PSA contínuo.

[000308] Começando no dia 84, a terapia de imunização foi continuada em intervalos de 4 semanas até a progressão documentada ou até 420 dias (15 meses). As decisões sobre a continuação do tratamento (em casos de sucesso), fora deste estudo foram feitas em uma base caso a caso. Reações adversas inesperadas não ocorreram neste estudo.

[000309] Os exames laboratoriais incluem coagulação, eletrólitos, LDH, B2-M, CK, enzimas hepáticas, bilirrubina, creatinina, ácido úrico, proteína total, coagulação, CRP, contagem diferencial de sangue com baciloscopia, nível de PSA, citoquinas, FACS, Elispot.

[000310] Análise da reação cutânea para definir antígenos de bactérias e fungos (48 a 72 horas após a administração, tipo hipersensibilidade retardada (DTH), mediada por células T, servirá como uma análise do sistema celular imunitário do paciente antes do início do estudo).

[000311] Os peptídeos necessários para o estudo (nona-peptídeos) foram fabricados no laboratório de PD Dr. Stefan Stevanovic no departamento do Prof H.-G. Rammensee. Esses peptídeos foram purificados por HPLC e analisados por espectrometria de massa. A pureza dos peptídeos também pode ser verificada por HPLC, espectrometria de massa e sequenciamento Edman. Usando esses métodos, a pureza de até 98% pode ser documentada (que deve ser considerado como o limite máximo de acordo com o estado atual dos métodos). Os peptídeos sintetizados foram dissolvidos em DMSO (CryoSure, WAK Chemie Medicai GmbH, 10 mg/ml), diluído a 1:10 em Ampuwa (Fresenius Kabi) e alíquotas em condições estéreis.

Resposta clínica

[000312] Em dois pacientes PET-CT pode revelar recorrência local após o local do tumor ter sido detectado através de exame retal digital contínuo. Nos restantes 17 pacientes a localização da atividade da doença não pôde ser verificada ao final do estudo.

[000313] Avaliação laboratorial repetida da contagem diferencial de sangue ou de química clínica extensiva não revelou nenhuma anormalidade nem alterações durante o estudo.

[000314] Dos 19 pacientes, 16 pacientes reagiram ao peptídeo Survivina II (ELISPOT IFN-g +/- ICS), de acordo com a SEQ ID No: 1. Entre eles estavam 12 pacientes com a indução de uma resposta de célula T anti-Survivina depois de vacinação, 2 com células T anti- Survivina pré-existentes e 2 pacientes dos quais não foi determinado, se células T pré-existentes anti-Survivina eram abundantes.

Resposta bioquímica

[000315] A resposta completa foi considerada como um valor de PSA não detectável de acordo com o valor mais baixo detectável do laboratório colaborador após PSA inicialmente elevado. A medição teve que ser confirmada após um intervalo de pelo menos quatro semanas. Uma PR > 80% e > 50% teve de ser reavaliada após quatro semanas de conformidade. O PSA dentro da faixa de redução inferior a 50% ou aumento de menos de 10% reflete uma doença estável se, pelo menos, confirmada depois de quatro semanas. Um aumento de mais de 10% do PSA no início do tratamento foi considerado como doença progressiva.

[000316] Respostas bioquímicas em pacientes que terminaram o estudo foram seguidas até que eles receberem tratamento adicional com radioterapia local ou terapia anti-hormonal. 19 pacientes consentiram em participar e os dados foram analisados com mais tempo de seguimento com duração de aproximadamente 3,75 anos.

Estabilidade PSA e aumento de DT

[000317] Valores de PSA de dois pacientes (10,2%) apresentaram estabilidade de acordo com os critérios acima mencionados da resposta bioquímica, que afirmam que sem aumento do valor de PSA superior a 10% no início do tratamento tinha ocorrido no final do estudo (figura 6, tabelas 8, 9 e 10). Acompanhamento nos dois casos foi realizado 14 e 16 meses após a última aplicação da vacina. A duração média de estabilidade de 24 meses (28 e 31) com dados de corte, com uma média de 18 vacinas (14 e 20) aplicadas.

[000318] Fora destes dois pacientes, um paciente apresentou resposta parcial > 50% por um período de nove meses, seguido por um período de elevação PSA lento com um tempo de duplicação de 20,5 em comparação com 9,8 meses de vacinação prévia. Recaída PSA inicial começou 18 meses após a cirurgia para um tumor de Gleason 5 pT2pN0.

[000319] Na análise dos dados, o paciente 8 apresentou doença estável desde o início do programa de vacinação, 28 meses atrás. Ele parou o tratamento devido a uma reação alérgica depois de 10 meses e da 14a vacinação. Ele tinha uma situação pT3b Gleason 3+4 desfavorável com um nadir de PSA após a prostatectomia radical não abaixo de 0,6 ng/ml e progressão PSA sem demora de tempo após o declínio inicial pós-operatório. O tempo de duplicação desacelerou de 6,6 meses para 148 meses.

[000320] Estes dois pacientes receberam Imiquimode dérmica no local de aplicação de cada vacina peptídica (figura 9, 10 e 11, tabela 13).

Aumento PSA DT sem estabilidade PSA

[000321] PSA DT do paciente 11 foi aumentada de 1,5 para 10,1 meses, durante seis meses em estudo. Desde que começou com um PSA de 10,8 ng/ml e evoluiu para 17,8 ng/ml, ele terminou os procedimentos do estudo para receber monoterapia antiandrogena sem lesões malignas visualizadas em PET-CT. Ele recebeu Aldara como adjuvante.

[000322] Paciente 16 começou em tratamento de vacina e Mucina-1- mRNA/protamina com um tempo de duplicação de 6,1 meses. A velocidade de PSA diminuiu em um tempo meia-vida de 2,7 meses para cinco meses, seguido por um aumento estatisticamente calculado de PSA DT de 14,4 meses, que continua mesmo 16 meses após início do tratamento. Com um PSA inicial de 0,29 ng/ml, ele caiu para 0,19 ng/ml, durante os primeiros cinco meses de tratamento do estudo, aumentou para 0,4 ng/ml nos seguintes oito meses e terminou o estudo por protocolo com 0,41 ng/ml 19 meses após o início do tratamento (figura 7, tabela 8 e 10).

Progressão de PSA

[000323] Paciente 5 progrediu durante o estudo de acordo com o tempo estimado de duplicação PSA antes da vacinação. No entanto, ele experimentou um declínio de PSA com um meio-tempo de vida de 20,2 meses após o final do tratamento por um período contínuo de 10 meses na data de retirada. Ele ainda não estava recebendo qualquer tratamento secundário após o término da vacinação. Ele foi vacinado com Montanide como único adjuvante (figura 8, tabela 13). Tabela 8: tempo de duplicação PSA em meses

[000324] PSA DT no final do estudo ou no final da continuação não foi incluída por Pat. 5 devido ao declínio de PSA Tabela 9: estabilidade PSA sem aumento superior a 10% da linha de base PSA

[000325] Tabela 10: permanente aumento do PSA DT em meses, durante vacinação

Tabela 11: nenhuma alteração de PSA DT nos meses durante vacinação, mas declínio posterior

Tabela 12: PSA DT provisório declínio / estabilidade em meses seguidos de crescimento acelerado

Tabela 13: adjuvantes e a resposta do paciente. Nenhuma resnosta PSA (-), a queda PSA e ascensão acelerada posterior (+/-). aumento DT PSA (+)

Síntese

[000326] Os peptídeos foram sintetizados usando um sintetizador plenamente automático no peptídeo EPS 221 fabricado pela Abimed. O programa segue a síntese de protocolos padrão do fabricante. Na medida do possível, os números de lote dos reagentes de lotes são registrados para cada peptídeo.

Processamento para o peptídeo bruto

[000327] O processamento do peptídeo bruto foi efetuado por cisão da resina de síntese e liberação dos grupos de proteção da cadeia lateral, por TFA fenol / ditiol etano / tioanisol / água (90/3.75/1.25/2.5/2.5, volume por cento, respectivamente) 1 h ou 3 h (peptídeos com arginina). Precipitação do peptídeo bruto em metil- terc-butiléter, lavagem com metil-terc-butiléter e duas vezes com dietiléter, secagem e dissolução do sedimento peptídeo em ácido acético. Outra precipitação em dietiléter, secagem, ressuspensão em água, e liofilização.

HPLC preparativa

[000328] Sistema de HPLC Varian "Star", cromatografia em coluna 250 x 10 mm C18 5 pm (Fabricante Ziemer). Solvente móvel A: água com 0,1% TFA, móveis solventes B: acetonitrila com 0,08% de TFA. O gradiente utilizado para a separação é orientado para a hidrofobicidade do peptídeo. As frações peptídicas separadas são liofilizadas.

Análise

[000329] Para cada peptídeo, um cromatograma HPLC e espectrometria de massa MALDI foram registrados, a fim de provar a identidade (via massa molar da espectrometria de massa) e pureza (via áreas de picos no cromatograma HPLC).

Peptídeos sintéticos e estímulos

[000330] Peptídeos sintéticos utilizados para a estimulação e para testes funcionais foram o resumo HIV derivado (164-181 gag de HIV: YVDRFYKTLRAEQASQEV (SEQ ID No: 65), controle negativo), PSMA 459-473: NYTLRVDCTPLMYSL (SEQ ID No: 64) e Survivina 97-111: TLGEFLKLDRERAKN (SEQ ID No: 1). Staphylococcus enterotoxina B (SEB, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha) foi utilizado como controle positivo para a estimulação de células T CD4+ em Interferon-y ELISPOT.

Amplificação in vitro de células T específicas

[000331] Células mononucleares periféricas de sangue de pacientes com carcinoma da próstata foram obtidas em diferentes pontos durante o tempo de vacinação e criopreservadas em 90% de soro fetal bovino e 10% DMSO em nitrogênio líquido. Após o descongelamento, cerca de 5 x 106 células foram cultivadas (cultura de 24 poços da placa celular, Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha), em meio suplementado com IMDM 50U/mL de penicilina, 50 pg/ml de Estreptomicina (todos da Biowhittaker, Verviers, Bélgica), 10% de soro humano inativado pelo calor (c.c. pro, Neustadt, Alemanha) e 50 pM beta-mercaptoetanol a 37°C e 7,5% de CO2 Peptídeos HLA sintéticos mistos da classe II de ligação foram adicionados no dia 1, cada um com 5 pg/ml e a cultura foi suplementada com proteína recombinante humana IL-2 (r-hlL2, R & D Systems GmbH, Wiesbaden, Alemanha), nos dias 2, 5, 7 e 9 da estimulação de células T.

Ensaio do ponto de ligação de enzima imunossorvente (ELISPQT)

[000332] A funcionalidade de expansão de célula T foi testada em um ensaio Interferon-y ELISPOT padrão de acordo com as recomendações do Painel Observatório CIMT (www.c-imt.org). Resumidamente, as células foram colhidas após a cultura de 12 dias, lavadas, contadas e semeadas em meio de cultura em uma placa de ELISPOT (Millipore, Schwalbach, Alemanha). Entre 0,15 e 0,25 x 106 células foram testadas em duplicata ou triplicata, na presença dos peptídeos sintéticos de 2,5 pg/ml ou SEB a 1 pig/ml. Produção de IFN-y foi detectada com um par de anticorpos monoclonais específicos (1D1 k-7 e B6-1, ambos Mabtech, Nacka Strand, Suécia), após 26 horas de incubação a 37°C e 5% de CO2 Alcalina ExtraAvidin- fosfatase e substrato BCIP/NBT (ambos do Sigma-Aldrich) foram adicionados para uma hora e 10 min, respectivamente. Análise ELISPOT foi realizada com os leitores ImmunoSpot (Série 3A e 5 Cellular Technology Ltd, Aalen, Alemanha).

Coloração intracelular de citoquinas

[000333] Células recuperadas do ELISPOT foram posteriormente cultivadas na presença de 2 ng / ml r-hlL2 por nove dias adicionais. Após este período de re-estimulação, efetores foram colhidos, lavados e estimulados em um ensaio padrão, com os peptídeos de 5 pg/ml ou PMA e lonomicina (50ng/mL e 1 p. M, respectivamente) na presença de Golgi-STOP (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) seguindo as instruções dos fabricantes. Após um período de incubação de 6 horas, as células foram lavadas em PBS 1% FCS 0,02% Naish e coradas com anticorpos monoclonais (AcMo) CD4-APC-Cy7 (BD Biosciences) e CD8-PE-Cy7 (Beckman Coulter) por 20 min a 4°C no escuro. Depois de uma etapa de lavagem, as células foram permeabilizadas 20 min com reagente Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), em seguida, coradas para citoquinas intracelulares por 30 min. MoAb utilizados foram IFN-y-FITC, IL-10-PE (ambos BD Biosciences), IL-5-APC (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) e TNF-a-Pacific Blue (Biolegend, San Diego, CA). Aquisição celular foi realizada em um Canto Cytometer II usando o software Diva e análise com FlowJo (BD Biosciences).

EXEMPLO 5: a ligação de BIR-11, BIR-12, e BIR-13 para HLA-A*0211

[000334] O objetivo desta análise foi avaliar a afinidade do BIR-004 (ELTLGEFLKLDRERAKN (SEQ ID No: 2)) C-terminal de peptídeos à molécula MHC codificada pelo HLA-A*0211 alelo como esse alelo com uma capacidade relatada de ligar peptídeos com resíduos de asparagina C-terminal. Ligantes MHC com N terminal c não são muito frequentes, e temos apenas 66 peptídeos testados com N no terminal C. A grande maioria é de não ligantes, no entanto, existem algumas exceções: RLYNFSFLN (SEQ ID No: 66) liga-se fortemente a A*0211 e também YADGGQWYN (SEQ ID No: 67) liga-se a A*0211...").

[000335] Os testes indicaram claramente que a ligação ao HLA- A*0211 foi encontrado para BIR-11 (nonâmero C-terminal: KLDRERAKN (SEQ ID No: 68)) e BIR-13 (decâmero C-terminal: LKLDRERAKN (SEQ ID No: 69)) em concentrações mais elevadas, mas não para BIR-12 (octãmero C-terminal: LDRERAKN (SEQ ID No: 70)). O peptídeo de controle positivo (sequência: FLPSDYFPSV (SEQ ID No: 71)) mostrou claras propriedades de ligação.

Princípio do teste

[000336] Um ensaio foi constituído da seguinte forma: complexos HLA/peptídeo estáveis consistem em três moléculas: HLA de corrente pesada, beta-2 microglobulina (b2m) e o ligando peptídico. A atividade de moléculas de corrente pesada do recombinante desnaturado HLA- A*0211 sozinhos podem ser conservadas, fazendo delas os equivalentes funcionais das "moléculas HLA-A*0211 vazias". Quando diluídas em tampões aquosos contendo b2m e um peptídeo apropriado, estas moléculas dobram rapidamente e eficientemente numa maneira inteiramente dependente de peptídeo. A disponibilidade destas moléculas é usada num ensaio baseado em ELISA para medir a afinidade de interação entre peptídeo e molécula HLA da classe de I {Sylvester-Hvid, 2002 SYLVESTERHVID2002 /id}.

[000337] Moléculas purificadas HLA-A*0211 de recombinante foram incubadas juntos com doses b2m e graduadas do peptídeo de interesse. A quantidade de complexos HLA/peptídeo dobrados foi determinada por ELISA quantitativa. As constantes de dissociação (valores KD) foram calculadas usando-se uma curva padrão registrada de diluições de um complexo HLA/peptídeo calibrante. O desvio em relação às medições era muito grande para poder fornecer informações confiáveis de valores de KD, embora possa ser dito que o valor de KD para BIR13 está na escala do controlo positivo, no qual o valor de KD para BIR-11 é maior. Um menor valor de KD reflete maior afinidade para HLA-A*0211.

[000338] Pontuação de ligação do nonâmero BIR-11 e do nonãmero BIR-11 contra vários alelos utilizando-se SYFPEITHI KLDRERAKD Alelo-id Nome do alelo Pontuaçã Pontuaçã (SEQ ID No: 72) o Rei o KLDRERAKD 74 A*0301 0,45 20 KLDRERAKD 65 A*0201 0,42 15 KLDRERAKD 99 B*1501 (B62) 0,36 10 KLDRERAKD 334 A*0101 0,28 14 KLDRERAKN Alelo-id Nome do alelo Pontuaçã Pontuaçã (SEQ ID No: 68) o Rei o KLDRERAKN 74 A*0301 0.45 20 KLDRERAKN 65 A*0201 0.42 15 KLDRERAKN 99 B*1501 (B62) 0.36 10 KLDRERAKN 334

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Claims

1. Uso de um peptídeo que consiste na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 3, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento contra o câncer, em que o dito medicamento é de preferência uma vacina.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é selecionado a partir de astrocitoma, astrocitoma pilocítica, tumor neuroectodérmico disembrioplástico, oligodendroglioma, ependimoma, glioblastoma multiforme, gliomas mistos, oligoastrocitomas, meduloblastoma, retinoblastoma, neuroblastoma, germinoma, teratoma, gangliogliomas, gangliocitoma, gangliocitoma central, tumores neuroectodérmico primitivo (PNET, por exemplo, meduloblastoma, meduloepitelioma, neuroblastoma, retinoblastoma ependimoblastoma,), tumores do parênquima pineal pineocitoma (por exemplo, pineoblastoma), tumores de células ependimárias, tumores do plexo coroide, tumores gliais de origem incerta (por exemplo, gliomatose cerebral, astroblastoma), tumor de próstata glioblastoma, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma de células renais, carcinoma claro de células renais, câncer de pulmão, SNC, ovário, câncer melanoma de pâncreas, carcinoma epidermoide, leucemia, meduloblastoma, e outros tumores ou cânceres mostrando uma superexpressão de survivina ou neurocan.

3. Uso de um peptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é em combinação com pelo menos um peptídeo selecionado do grupo constituído de peptídeos de acordo com SEQ ID NOs: 4 a 13e24.