JP2953782B2 - 治療用抗体断片 - Google Patents

治療用抗体断片

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、治療における免疫グロブリンFab断片の使
用に関する。
抗体は、微生物または外部の高分子に対する免疫反応
の一部として形成される。これらは免疫グロブリン（I
g）であって、症状の悪化の診断、モニタリング、予防
および治療用に広く臨床的に使用されている。
全ての抗体分子を形成する基本ユニットが、Porter
（1959）Biochem J.73,119-126によって、特定のタンパ
ク質分解酵素を用いて解明された。最も重要な免疫グロ
ブリンであるIgGは、二本の重鎖と二本の軽鎖を備え、
重鎖はジスルフィド結合によりそのヒンジ領域で対をな
している。上記結合のパパインによる切断により、図１
に示されるように、二つの抗体結合断片（Fab）とクリ
スタリン断片（Fc）が放出される。ヒンジ部下方のペプ
シンでの切断により、図１に示すように、少し小さいFc
断片と二つの結合部位を備えた一つのＦ（ab′）２断片
になる。各Fab断片は、軽鎖と一部の重鎖の両方を備
え、微生物または外部の高分子に対する特異的結合に重
要な配列を含む。Fcは、二つの重鎖の残余からなり、こ
れに相補的なマクロファージおよび多形核白血球細胞が
結合可能な部位である。二つの重鎖（軽鎖ではない）
は、抗体の各クラス、すなわちIgG、IgM、IgAおよびIgE
で異なる。IgGは、濃度の点で主要な循環する免疫グロ
ブリンである。これは、単一の基本的な免疫グロブリン
ユニットからなり、特徴として、その特異的抗原に対す
る高い親和性を備えている。さらに詳細な抗体の構造お
よび機能については、Roitt（1991）Essential Immunol
ogy,7th Edition,Blackewell Scientific Publication
s,Oxfordに記載されている。
微生物病原体は、可溶性の毒素を放出することにより
有害な影響を引き起こす。これらは、ジフテリアおよび
テタヌスバチルス属によって放出される神経性外毒素お
よびグラム陰性菌の細胞壁からのリポポリサッカリド
（LPS）およびグラム陽性の生物からのペプチドグリカ
ン等の種々の内毒素を含む。1890年に、von Behring
は、可溶性抗原に対する外因性の抗体が治療的価値を有
すること、すなわち、ジフテリアによる子供の死が、ジ
フテリアトキソイドで高度免疫されたウマの血清の全身
性投与によって減少したことを示した。類似した試み
が、テタヌス患者でも成功した。受動免疫化は、1984年
にCalmetteおよび他の研究者によって、ヘビにかまれた
人にも急速に広がった。
敗血症性ショック症候群（septic shock syndrome）
の発達には、細胞レベル（例えば、内皮細胞における酸
化窒素シンターゼ）において、イニシエーター（LPS
等）、メディエーター（TNFα、IL-1およびIL-6を含
む）およびエフェクターが含まれる。全てのイニシエー
ターとメディエーターは、抗原となる可能性があり、こ
れらの高分子に対する抗体は、敗血症性ショックの予防
および治療に使用することができる。いくつかのグルー
プは、成功の度合いは異なるが、LPSに対するポリクロ
ーナル抗体（PcAb）またはモノクローナル抗体（McAb）
を用いた。同時に、TNFαに対するPcAbによって、BALB/
Cマウスにおけるこのサイトカインの致死効果が妨げら
れることが示された（Beutleら（1985）Science 229,86
9-871）。Traceyとその同業者（（1987）Nature 330,66
2-664）により、ヒヒにおける細菌試験（チャレンジ）
の１時間前に与えられた、TNFαに対するMcAbが、器官
損傷に対して部分的な保護を示し、二時間前に与えた場
合には、より完全に保護することが示された。言い換え
れば、抗TNFαMcAbが予防的に用いられた。
いくつかのグループが、通常はウサギにおいて、LPS
およびTNFに対するPcAbを生成し、敗血症性ショックの
動物モデルでその効果を示した。また、LPSに対するPcA
bがヒトで生成され、使用も成功した（zieglerら（198
2）New Engl.J.Med.307,1225-1230）。ヒト抗体の使用
は、アレルギー性の併発症の危険を避けるものである
が、ウイルスの混入（HIVおよび肝炎）の可能性を含
む、倫理的かつロジスティック等の理由から広い適用が
妨げられる。それゆえ、ほとんどのグループは、McABの
生成に労力をつぎ込んでいる。McAbは、例えば、均一で
あることや、多くの場合に、他のタンパクから抗体を分
離するためにプロテインＡまたはプロテインＧとのアフ
ィニティークロマトグラフィーによるダウンストリーム
処理（down-stream processing）が比較的単純であるこ
と等の多くの利点を与える。
敗血症性ショックに対する治療の開発に関わるどのグ
ループも、特異的なFab断片を調製または使用していな
い。またどのグループも、ショックの臨床的発現後に、
敗血症性ショックの患者を治療するのに抗TNF Fab断片
を使用することを示していない。
発明の要約 我々は、TNFαに反応するFab断片の投与が、“敗血症
性ショック”症状の患者に有益であることをヒトで証明
した。
実施例でより詳細に記載するように、TNFαに対する
ポリクローナル抗体から得られたFab断片が、TNFαに対
する完全なIgGよりも、TNFの影響を減少させるのにより
効果的であることを予期せず見いだした。
しかして、本発明の一つの態様は、TNFαに反応するF
ab断片を患者に投与することを含む、TNFαの中和から
利益を得る患者におけるTNFαの中和方法を提供する。
患者としては、敗血症性ショックもしくは敗血症性シ
ョックの症状を有する者が適切である。しかして、本発
明の更なる態様は、TNFαに反応するIgG Fab断片を患者
に投与することを含む、患者における敗血症性ショック
もしくは敗血症性ショック症状の予防または改善方法を
提供する。
Fab断片は、当該技術分野でよく知られた、実施例に
開示した方法で、TNFαに反応する実質的に純粋なIgGか
ら生成することができる。
本発明の更なる態様は、薬剤中に使用するための、TN
Fαに反応するIgGFab断片を提供する。
本発明の更なる態様は、TNFαの中和から利益を得る
患者の治療用薬剤の製造における、TNFαに反応するIgG
・Fab断片の使用を提供する。
IgG Fab断片が、ポリクローナル抗血清から得られた
ものであればさらに好ましい。ポリクローナル抗血清
（ポリクローナルIgGを含む）は、ヒツジ、ヤギ、ウマ
等を免疫することによって得られる。哺乳動物として
は、スクレーピーおよび人獣共通伝染病ウイルスを有し
ていないヒツジが好ましい。TNFαに反応する、ポリク
ローナルヒツジIgGから得られたFab断片の調製方法を、
実施例に記載する。
TNFαに反応するFab断片は、循環するTNFαのレベル
の増加に特徴を有する症状の治療に使用できる。このよ
うな症状としては、例えば敗血症性ショック等のショッ
ク、および、腫瘍治療の状況における過剰のTNFαを含
む。敗血症性ショックは、特にグラム陰性菌の感染等の
細菌感染後および敗血症中に起こる。また、ショック
は、事故または外科手術後の外傷も含める。更なる使用
は、国際特許WO89/08460号に記載された抗リンパ球抗体
治療に関連した治療、および欧州特許第355067号に記載
されたガンの化学療法に関連した治療を含む。
ヒトリンパ球に対するラプリン（laprine）またはウ
マのポリクローナル抗体の静脈注射が、急性腎臓同種移
植片拒絶反応（aute renal allograft rejection）の治
療を助けるのに非常に効果的であることがわかってい
る。このような生成物は、依然として使用されている。
Ortho Pharmaceutical Coは、臨床試験の後、腎臓移植
後の移植片拒絶反応防止を補助するために、マウスのモ
ノクローナル抗体、OKT3を慣例的に使用することに対し
て、1986年にFDAからライセンスを許可された。この生
成物は、腎臓、肝臓および心臓移植後の急性拒絶反応の
治療に極端に効果的であることを示し、OKT3は、ライセ
ンスが許可されたモノクローナル抗体をベースとした治
療生成物（monoclonal-based therapeutic product）の
みを残している。
OKT3は、全ての成熟Ｔリンパ球上に見られるCD-3複合
体に特異的に結合する。通常、CD-3は、抗原認識と細胞
刺激に関係し、この両方は、マウス抗体の存在による立
体障害のために妨げられる。
モノクローナル抗体OKT3を発現するハイブリドーマ
は、America Type Culture Collection,12301 Parklawn
Drive,Rockville,Maryland 20852 USA、加入番号ATCC
CRL8001から得られる。これは、IgG2aイソタイプであ
り、ヒトヘルパーＴ細胞サブセットに反応する。ハイブ
リドーマおよび抗体は、参照としてここに取り込まれた
米国特許第4381295号に引用される。OKT3を用いた治療
法は、参照としてここに取り込んだOrtho Study Group
（1985）N.Engl.J.Med.313,337-342に記載されている。
しかしながら、このような抗Ｔリンパ球治療により、
疑う余地のなり利益とともに副作用が生じる。ポリクロ
ーナル抗リンパ球グロブリンの最初の注入とそれに次ぐ
OKT3の最初の注射の間に、実際に全ての患者がひどい徴
候および症状を経験する。これらは、少なくとも90％の
被験者における発熱、頭痛、悪心および嘔吐、下痢、全
身的な倦怠感および極端な疲労、呼吸困難、筋肉痛およ
び頻拍を含む。数人の患者では、急性肺水腫が引き起こ
された。治療の第二期では、副作用は最小限であり、以
下の期間では全く現れなかった。
このような臨床的な発現は、TNFの注入後または敗血
症性ショックに見られるものに類似している。抗リンパ
球グロブリン注入は、インターロイキン−１ベータ（IL
-1β）が測定可能ではないが、循環するTNFを検出不可
能なレベルから111〜731ng/Lの値まで顕著に増加させる
ことを示した。TNFにおけるこの増加は、密接に発熱を
伴う（38.4〜40.4℃）。
本発明の目的は、OKT3または抗リンパ球グロブリン処
置後のショック様症状を減少することである。
しかして、一つの好ましい実施態様では、例えば腎臓
移植における急性拒絶反応を減少するために、TNFαに
反応するIgG Fab断片、もしくは機能的に同等のポリク
ローナル抗血清を、モノクローナル抗体OKT3が与えられ
た患者を治療するために使用する。TNFαに反応するIgG
またはFab断片は、OKT3または機能的に同等の抗体で処
置した際のショック様副作用を減少させる。
スピロヘータである回帰熱ボレリアによって引き起こ
されるラウス−ボーン再発性熱（Louse-borne relapsin
g fever）（LBRF）は、今世紀にヨーロッパ、アフリカ
および中東で大規模に流行したが、現在はエチオピア高
地の固有の地域に限定されている。流行中は、未治療の
死亡率は40％を超えたが、ペニシリン、テトラサイクリ
ン、クロラムフェニコールおよびエリスロマイシンを含
む抗生物質を用いて５％未満まで減少した。臨床的治療
は、恐ろしく、かつ、時には致死のヤーリッシュ−ヘル
クスハイマー反応（JHR）を誘発する抗生物質の使用に
よってのみ成される。静脈のテトラサイクリンは、予想
通り処置から約１時間以内に開始される、典型的な“内
毒素”または“ショック”反応（Warrellら（1970）Cli
n.Sci.39,123-145）である硬直、潮紅および解熱期の三
段階からなる反応を引き起こす。患者は、潮紅段階早期
における熱の、またはショックのピークにおける超高
熱、もしくは潮紅／解熱段階における急性の心筋の不全
を伴って、この反応の間に死ぬことがある。
Negussieと彼の同僚（（1992）J.Exp.Med.175,1203-1
207）は、JHR中に、TNFαと、それに次いでIL-6およびI
L-8が爆発的に放出されることを証明した。
しかして、さらなる実施態様では、TNFαに反応するI
gG Fab断片を、ヤーリッシュ−ヘルクスハイマー反応で
示されたような敗血症性ショックの徴候を有する患者を
治療するために用いる。
このJHRは、適切にラウス−ボーン再発熱性の抗生物
質処置に関連する。
JHRまたは類似反応は、梅毒、ティック−ボーン再発
性熱、ヴァンサンアンギナ、そ毒熱（rat-bite feve
r）、レプトスピラ症、フランベジア、ブルセラ症およ
びアフリカトリパノソーマ症を含む、種々の他の寄生性
かつ侵害性生物疾患の抗生物質処置に関することが知ら
れている。
実施例に記載したような抗TNF Fabを用いたLBRFの抗
生物質処置に係る徴候の処置は、JHRもしくは上記疾患
の抗生物質処置に係る類似反応を処置するために用いら
れることが認識される。
ラウス−ボーン再発性熱のJHRは、抗TNFαインターベ
ンション（intervention）の臨床試験用の倫理的なモデ
ルを提供することが認識され、JHRにおけるTNFαのレベ
ルが増加することがよく知られている。
本発明の更なる態様は、TNFαに反応するIgG Fab断片
および生理学的に許容できるキャリアーを有する薬学的
組成物を提供する。
一般に、IgG Fab断片は、患者のTNFαを中和したいと
きはいつでも使用できる。投与される量は、患者の体重
および状態を参考に決定されるが、典型的に、200-2000
mgの特異的抗TNFα Fab断片が、成人に、２ないし３日
以上投与される。
慣例的に、Fab断片がポリクローナル抗血清から得ら
れ、アフィニティー精製がされていない場合には、約20
mg/kgの特異的抗TNFα Fabを含有する120mg/kgの全Fab
が投与される。
Fab断片が実質的に純粋で、発熱原性でないことが好
ましい。Fab断片は、陽イオン交換クロマトグラフィー
またはアフィニティークロマトグラフィー等のクロマト
グラフィー技術を用いて実質的に精製することができ
る。
本発明のIgG Fab断片またはその製剤は、非経口的
（例えば、静脈内、皮下あるいは筋内）注射を含む通常
の全身性の方法で投与することができる。この処置は、
一回の投与もしくはある期間をおいて複数回の投与から
なる。
本発明のIgG Fab断片は、単独で投与することもでき
るが、一つ以上の使用可能なキャリアーを備えた薬学的
な製剤とすることが好ましい。このキャリアーは、Fab
断片に適しており、被投与者にとって有害ではないとい
う意味で“使用可能”でなければならない。
IgG Fab断片の製剤は、都合良く単位投与形態とさ
れ、薬学においてよく知られた方法で調製することがで
きる。このような方法は、IgG Fab断片と、一つ以上の
補助成分からなるキャリアーとを組み合わせる段階を含
む。一般に、この製剤は、一様かつ密接に活性成分と液
体キャリアーとを組み合わせることによって調製され
る。
非経口投与に適した製剤は、酸化防止剤、バッファ
ー、静菌薬、およびこの製剤を被投与者の血液と等張に
する溶質を含有することができる水性および非水性の無
菌の注射液；および懸濁剤と増粘剤を含む水性および非
水性の無菌の懸濁液を含む。製剤は、密封されたアンプ
ルおよびバイアル等の単位投与もしくは多数回投与用容
器で提供することができ、例えば直ちに使用できる注射
用の水等の無菌液体キャリアーの添加のみを必要とする
冷凍乾燥条件（凍結乾燥）で保存することができる。即
席の注射液および懸濁液を調製することができる。好ま
しい単位投与製剤は、活性成分の日々の投与量または単
位、日々の副投与（sub-dose）またはその適切な画分を
含むものである。
本発明を、以下の実施例および図面を参照して記載す
る。
図１は、抗体分子の構造を示す図である。
図２は、ヒツジにおける肺動脈圧およびリンパ液の流
れに対する完全な抗TNFα抗体の効果を示す。
図３は、マウスにおけるリポポリサッカリド誘発致死
に対する抗TNFα Fab断片の効果を示す。
図４は、L929細胞に抗TNFα IgGまたはFabとTNFαと
を共在させた場合の効果を示す。
図５は、TNFαを処置してから２時間後に抗TNFα IgG
またはFab断片を適用した場合の効果を示す。
図６は、TNFαを処置してから４時間後に抗TNFα IgG
またはFab断片を適用した場合の効果を示す。
図７は、最初の温度が正常である場合の、患者の体温
に対する抗TNFα Fab断片または食塩水の影響を示す。
図８は、最初の温度を高くした場合の、患者の体温に
対する抗TNFα Fab断片または食塩水の影響を示す。
図９は、食塩水、対照のFabもしくは抗TNFα Fabで処
理された患者におけるTNFαピークレベルを示す。
実施例1:ヒツジを免疫するためのTNFα免疫原の調製 手順 活性なTNFα免疫原を含むバイアルの調製 バイアルは、新規で、塵がなく、バイアルに免疫原が
付着することを前もって防止するためにシアリナーティ
ング流体（sialinating fluid）で48時間処理されるべ
きである。新鮮なシアリナーティング液は、24時間ごと
に作製する必要がある。
シアリナーティングは、以下の方法で行われる。
ａ）ドラフトチャンバー内で、バイアルを金属のトレー
に並べる。
ｂ）製造元の説明に従ってシアリナーティング溶液を作
製する。0.1％溶液に希釈する。0.2％溶液は、99部の水
に対して１部のAQUASIL（商品名）とすることによって
成される。絶え間なく攪拌する。その溶液にバイアルを
浸す。次いで、最低でも24時間風乾する。
TNFαを４℃での保存状態から移し、少なくとも30分
間室温で平衡化させる。
全体の群の一ヶ月ごとの免疫化用のTNFαの全量を、
天秤を用いて無菌の150mlのSterilin（商品名）フラス
コに量り分けた。必要な計算は、以下の“免疫原調製に
係る計算”に記載する。これは、以下に記載した計算に
おいてＥとして表される。調製した残りの免疫原は、保
存して後日に使用することができる。
この免疫原を、0.9％食塩水に溶かす。この溶液を、
最低でも30分間エンドオーバーエンドローテーション
（end-over-end rotation）で混合する。用いた食塩水
の量は、以下の記載のＦである。
調製された免疫原溶液を、無菌のピペットおよびPipe
tteman（商品名）装置を用いてバイアルに分注する。
免疫原調製に係る計算 各バイアルは、ヒツジ３頭分に十分な免疫原を含むべ
きである。それゆえ、免疫化用のヒツジの全体数（Ａ）
を３で割り、次の整数に繰り上げる。
A/3＝Ｂ 例えば、49/3＝16.33であるから17 量り分けられるTNFαの量は、各ヒツジ当たりに必要
とされる免疫原の量（Ｃ）をかけた3Bである。
（３×Ｂ）Ｃ＝Ｄ 例えば、調製した免疫化の投与量が各ヒツジ当たり80
μｇなら、（３×17）80＝4080μｇ＝4.08mg 一つごとに異なる、塩内容物に対するTNFαの量は、
免疫原を量り分ける際に考慮しなければならない。
（D/供給物質におけるTNFαのパーセント）100＝Ｅ 例えば、提供物質が95％の塩と５％のTNFαを含有す
る場合には、（4.08/5）100＝81.6mg 量り分けられた免疫原を、使用されるバイアルの数と
４をかけて計算された適切な量の0.9％食塩水に溶か
す。各バイアルは、4mlの食塩水を含むべきである。
Ｂ×４＝Ｆ 例えば、17×４＝68ml 実施例2:免疫化、抗TNFαヒツジのサンプルおよび採血
のプロトコール この表は、TNFαに対して免疫されたヒツジを得るた
めの、免疫化の投与量、採血量および個々のサンプルも
しくは貯蔵されたサンプルの処理に関する年間の隔週計
画を示す。
免疫化の前に各動物からサンプルをとる。このレベル
が、各ヒツジのバックグラウンドのレベルである。
以下の定義を用いる。
I ：最初の免疫化 Ｒ＃ ：最初の免疫化後の再免疫化の数 サンプル：力価を評価するための各動物からの5-10mlの
血液サンプル 採血 ：体重のkg当たりに得られた10mlの血液 IS ：個々の性能を評価するための個々のサンプル P ：全ての個体からの採血の貯蔵 実施例3:部分精製されたIgGからの抗TNFα Fab断片の調
製 ヒツジを、投与反応の研究に基づいて選択され、かつ
実施例１および２に記載されたようなrhTNFαの量で、
一連の計画に従って免疫した。適当な循環する特異的抗
体レベルが得られたら（少なくとも3g/L）、ヒツジから
無菌かつ発熱物質のないガラス瓶に採血する；回転瓶技
術により凝固を促進し、瓶を遠心し、血清を層流キャビ
ネットで吸引により回収し、0.2μｍの濾過にかけ、−2
0℃に保存する。細菌および発熱物質の混入が防止さ
れ、この生成物を厳格に品質管理する。
他の動物からの抗血清を貯蔵し、アルブミンを含む他
の多くの血清タンパク質から分離するために、25℃で免
疫グロブリンを硫酸ナトリウムで沈殿させた。IgGクラ
スの抗体を広範に含むその免疫グロブリンを、無菌の硫
酸ナトリウムで洗浄し、食塩水に再度懸濁した。
パパイン処理：次の段階は、システインおよびEDTAで
活性化されたパパインを用いてFabおよびFcに抗体を切
断することである。これは、完全なIgGを確実に切断す
る条件下で行う。クリスタリンFcは、遠心により除去す
る。パパイン切断および遠心後の上清は、以下を含む。
（１）注目の可溶性抗原に対する特異的なFab;（２）多
数の別のエピトープに対する非特異的なFabであって治
療には価値がないもの；（３）少量のタンパク質（アル
ブミンを含む）と他の混入物；および（４）不活性化し
たパパイン。
アフィニティークロマトグラフィー： アフィニティー精製．ヒト腫瘍壊死ファクター（huma
n tumor necrosis factor）（抗TNF）Fab断片のアフィ
ニティー精製は、rTNFα（組換えヒトTNFα）が結合し
た架橋結合したアガロース（セファロース）媒体を用い
て行う。rTNFαの媒体への結合は、イソ−ウレア（iso-
urea）結合が用いられる。
アガロース−rTNFαアフィニティーカラムマトリックス
の作製 材料 臭化シアン活性化セファロース4B（Pharmacia,Uppsala,
Sweden） rTNFα（R/D Systems Minneapolis.USA） BPGアフィニティーカラム容器（Pharmacia） 大きなガラス焼結漏斗 ブフナーフラスコ 真空ポンプ ガラス棒 ナルゲンボトル（Nalgene bottle） バッファーおよび溶液 全てのバッファーは、無菌かつ発熱物質が無いもので
なければならない（SOP0.2、治療用製品のための無菌、
発熱物質の無いバッファーの調製参照）。
塩酸（1mM、200ml/g、氷冷） 塩化ナトリウム（0.5M）を含む炭酸水素ナトリウム（0.
1M、pH8.3） エタノールアミン（1.0M、pH8.0） 塩化ナトリウム（0.5M）を含む酢酸ナトリウム（0.1M、
pH4.0） 手順．治療用製品のためのカラムを作製する際に、全て
の工程をクラス100条件における層流下で行い、全ての
装置は無菌かつ発熱物質の無いものとするべきである。
ゲルの膨潤および洗浄：必要量の冷凍乾燥されたセフ
ァロースパウダーをプラスチックのナルゲンボトルに量
り分け、HC1（氷冷）に懸濁する。ゲルがすぐに膨潤
し、同じ液体（200ml/g（ゲル））で、焼結されたガラ
スフィルター上で15分間洗浄する。この溶液を、いくつ
かの分割量に添加し、最後の分割量の後にひび割れが表
面に現れるまでゲルを乾燥させる。
リガンドの結合:TNFリガンド（5mg/g（用いられるゲ
ル））を、プラスチックナルゲンボトル中の炭酸水素ナ
トリウムバッファー（0.1M、pH8.3、7ml/g（用いられる
ゲル））に溶解する。溶解させた後、分注量（全体の0.
25％）をとり、リガンド溶液を底から跳ね上げないよう
に注意しながら、風乾したゲルを添加する。この混合物
を、４℃で一晩、エンドオーバーエンドで循環させる。
ゲルの活性基のブロッキング：一晩結合させた後、この
ゲル溶液をガラス焼結漏斗に移し、リガンド溶液を吸引
し回収する。次いで、このゲルを200mlのエタノールア
ミンで洗浄する。全ての洗浄物を回収する。
次いで、このゲルをエタノールアミン（1.0M、pH8.
0）を含有するナルゲンボトルに移し、この混合物を上
述のように一晩循環させる。
ゲルの洗浄：ブロックされたゲルを焼結漏斗に移し、エ
タノールアミン溶液を吸い上げ、回収する。このゲルを
結合バッファー（重炭酸塩）、酢酸塩バッファー、次い
で二度目の結合バッファーで洗浄する。
このゲルを、カラム容器に移して収容し、食塩水（0.
9％）を通して洗浄する。
結合効率を、洗浄におけるタンパク質の量を測定する
ことによって決定し、これを最初のリガンド溶液分注量
と比較する。
各材料が完了した後で、かつ、全体のFab切断溶液の
最初の添加の前に、カラムをグアニジニウムヒドロクロ
リド（6.0M）を用いて殺菌する。
このFab溶液は、18℃で、最低でも２時間、1ml/分の
流速で循環させる。
アフィニティー支持体からのrTNFα抗毒素Fabの放出 支持体に結合したヒツジのrTNFα Fab断片を、グリシ
ン（10mM、pH2.5）でカラムを洗浄することによって遊
離させる。流出液を、クエン酸塩バッファー（0.6M、pH
8.0:2.5％の終濃度）に回収し、ナルゲン、２リッター
使い捨て回収ボトルに保存する。サンプルをQC試験（GF
FPLC、pH、タンパク質濃度、無菌性およびLAL試験）に
用いる。
アフィニティーカラムを、リン酸バッファー（10mM、
pH7.3）を用いて、流出後のpHが約5.5になるまで再度平
衡化する。次いで、このカラムを、次のサイクル用に調
製するために食塩水（0.9％）で平衡化する。
付加的もしくは選択的に、陽イオン交換クロマトグラ
フィーを用いることができる。
陽イオン交換クロマトグラフィー 全体のFab溶液（酢酸アンモニウムバッファー）を、
ほとんどのFab（＞80％）が結合するような陽イオン交
換カラム（将来的にはより弱く結合するカラムに変わる
が、現在のところBioRad MacroPrep S）に添加する。生
成物を殺菌し、プリオンまたはウイルスによる混入を防
止するために、このカラムおよびこれに結合したFab
を、３カラム容量のバッファー（酢酸アンモニウム、pH
4.0）で洗浄する。
洗浄後、結合した全体のFabを、塩化ナトリウム（0.5
M）を含有するアプリケーションバッファーでカラムを
洗浄することにより溶出させる。次いで、酢酸アンモニ
ウムバッファーを除くために溶出されたFabを限外ろ過
および食塩水で洗浄し、必要に応じて濃縮し、無菌のプ
ラスチックトランスファーバッグに収容する。このバッ
グは、充填装置に直接連結することができる。この生成
物を、最後に濾過し、充填かつ最終的に充填し、凍結乾
燥する。
このイオン交換カラムは、水酸化ナトリウム（1.0M）
を用いて使用の合間に滅菌し、次いで次回のサイクルの
準備のために酢酸アンモニウムバッファーで再度平衡化
する。
実施例4:ヒツジ抗TNFα IgGの生物学的効果 完全な、アフィニティー精製されていない抗体と、敗
血症性ショックのヒツジモデルとを用いた研究の結果
を、図２に示す。この抗体は、ヒツジの抗TNFα IgGを
与えない対照のグループで見られる肺動脈圧の上昇およ
び肺のリンパ液の流れの上昇を部分的に妨げた。
実施例5:マウスにおけるヒツジ抗TNFα Fab断片の生物
学的効果 特異的なヒツジ抗TNFα Fabを、致死量の内毒素を注
射したマウスに用いた研究の結果を図３に示す。内毒素
のみを与えたマウスの90％が、４日までに死亡した。こ
の値は、特定のFabを2mg/kgおよび20mg/kg投与すること
により、それぞれ80％および30％まで減少した。
実施例6:TNFの細胞毒性効果に対する抗TNFα IgGおよび
抗TNFα Fab断片の保護効果の比較 L929細胞でTNFαの細胞毒性に対する抗TNFα IgGおよ
び抗TNFα Fabの保護効果を調べた。単離された細胞をi
n vitroで培養した場合、培地に10ng/mlのTNFαを添加
することにより、これらの細胞が破壊された（図４に示
した光学密度の下降によって証明される）。同時に、10
0μg/mlのIgGまたはFabを添加することにより、TNFに結
合および中和することにより細胞がかなり保護された。
IgGの方が、Fabよりわずかに優れていた。
図５および特に図６は、全体として予期せぬ結果を示
した。抗体の添加をTNFの添加後２または４時間遅らせ
た場合には、Fabが、完全なIgGより顕著に保護的であっ
た。実際に、特異的なFabの添加の遅延は、保護効果を
増幅するらしい。
この結果は、敗血症性ショックにおけるTNFの増加後
２もしくは４時間遅らせて投与すれば、Fab断片をin vi
voでも使用できることを示すものであると考えられる。
実施例7:ラウス−ボーン再発性熱の抗生物質処理後にお
けるヤーリッシュ−ヘルクスハイマー反応（JHR）を防
止または改善するための抗TNFα Fab断片使用の臨床試
験 アフリカ、中東およびヨーロッパでは全国的に流行で
あったが、エチオピアは、ラウス−ボーン再発性熱（LB
RF）の固有の地域を残している。ある流行病では未治療
の致死率が50％を超えるが、抗生物質処置は回帰熱ボレ
リアスピロヘータを除き再発を防止するのに効果的であ
るものの、古典的な内毒素反応に似たヤーリッシュ−ヘ
ルクスハイマー反応（JHR）という生命的な危険性があ
る。JHRは、腫瘍壊死ファクター（TNF）、IL-6およびIL
-8の爆発的な放出を伴う。新規のヒツジポリクローナル
Fab抗TNF抗体の任意に二重結合が調節された試験を、Ad
dis AbabaでLBRFの49人の患者で行った。ペニシリンで
処理される前の30分間に、特異的抗TNF Fab（20人の患
者）、対照のFab（19人）もしくは等張食塩水（10人）
の静脈注射を患者に行った。JHRの硬直等の臨床的な徴
候は、対照の26/29と比べて特異的Fabが与えられた10/2
0に観察された（ｐ＜0.01）。対照のグループと比較し
て、JHRにおける体温、心拍および収縮期のBPは、抗TNF
処理されたグループではかなり低かった（それぞれｐ＜
0.01、＜0.0001、＜0.01）。
近所のブラックライオン病院（Black Lion Hospita
l）または診療所に来る患者を、血液の膜にボレリアス
ピロヘータが観察された場合にこの研究に募集した。
除外基準 1.子供（12歳未満） 2.妊婦 3.老人（60歳より高齢）または、例えば低血圧、明らか
な黄疸、深刻なるいそうおよび栄養失調の他の徴候、深
刻な出血傾向、発疹チフス、活性な肺結核もしくは肺硬
化の症状、昏睡状態、髄膜炎、心臓、呼吸の昏睡および
羽ばたき振せん、最近の発作履歴および焦点の神経学的
徴候等の他の急性疾患のひどい臨床的な徴候のあるかな
り衰弱した患者 4.持続した激しい硬直、低血圧もしくは高熱、および他
の自発的反応の徴候（“発症”）のある患者 5.他の抗生物質が与えられている患者 病院の承認、調査および治療に同意を示す患者だけを
この研究に募集した。
ベースライン情報（Baseline information） 症状の継続期間および範囲を含む臨床履歴および身体
検査の結果を標準的なプロフォーマ（pro forma）に記
録した。
調査 ポリテトラフルオロエチレンカニューレを肘前の静脈
に装着し、３ウェイタップで固定し、ヘパリン化した食
塩水で開存させておいた。ベースライン血液サンプル
を、ミクロヘマトクリット（microhaematocrit）、全体
の白血球細胞数（WBC）スピロヘータ数、ビリルビン、
肝臓の酵素類、クレアチニンまたは尿素用に採血した。
血液の培養は、関連する細菌の感染（特に腸チフス）を
検出するように構成された。
最低でも30人かつ最大でも50人の患者を、任意に、ポ
リクローナル抗TNFヒツジ免疫グロブリンFab断片（ATNF
Fab）もしくは同様に見えるプラシーボ（対照のFab）
で静脈に処置する。10人の患者は、等張食塩水のみを受
けた。
研究の早期、患者はベッドに安静に寝かせられた。直
腸電子体温計のプローブを挿入した。血圧、脈拍および
呼吸の速さを記録した。
処置 ベースライン直腸温度が、30分間以上0.5℃より大き
く変動しなかった患者において、100mlのATNF Fabまた
は対照のFab（注射用の水10mlに溶けた冷凍乾燥された
全体のFabの４×1.5gのバイアルの内容物と等張食塩水
で100mlまで希釈された）もしくは100mlの等張食塩水を
30分以上かけてゆっくりした静脈注射によって注射し
た。全体の免疫グロブリンFabのこの投与量は、20mgの
特異的抗TNF Fabを含んだ約120mg/kgの投与量に相当す
る。
この30分の注射が完了したら、600000ユニットのプロ
カインペニシリンを用いた標準的な抗生物質処置を、必
要であれば二つの部分の間の分けられた前の大腿に筋肉
内注射によって与えた。
評価 直腸温度、血圧、脈拍、呼吸の速さおよび症状を、以
下の時間（０＝ペニシリン処置）：−60、−45、−30、
０、15、30、45、60、75、90、105、120、150、180分;
4、８、および24時間に記録した。
患者は、一貫して、飲むことが許されていた。
激しいJHRは、ペニシリン処理後60−90分で起こるこ
とが予想された。
材料と方法 臨床試験に用いたTNF特異的ヒツジ全Fabを調製するた
めに、以下の方法を使用した。
免疫原： TNFα抗毒素は、ヒト組換えTNFα（hrTNFα）を用い
てヒツジを免疫化することによって作製されたヒツジの
Fabである。hrTNFαは、ヒトTNFに対する市販されたcDN
A（British Biotechnologyのものを商業的に利用でき
る）の配列に基づいた配列を備えた合成遺伝子を発現す
ることによりE.coliで産生される。組換えタンパク質
は、約17.5kDの分子量を有し、97％以上の純度に精製さ
れる。各ロットごとの免疫原は、ヒツジに注射する前
に、純度、分子量および細胞毒性活性が調べられた。後
者は、L929マウスの接続組織細胞の検定を用いて評価さ
れる。
（ｉ）免疫化 10頭の雌ヒツジのグループを、６ヶ所で皮下に免疫化
した。免疫化は、hrTNFαの減少する投与量で行われ、
フロイント完全または不完全アジュバントと混合され、
実施例１および２に概説したプロトコールに従う。ヒツ
ジは、月毎に免疫化される。
（ii）サンプリングおよび採血 免疫化して２週間後に、ヒツジは、頸静脈を介してサ
ンプル（5ml）もしくは採血（500-700ml）された。血液
は、無菌で発熱物質のない瓶に移され、凝結（5mlのサ
ンプルの場合）もしくは凝結を開始および促進するため
にゆっくりと回転（採血の場合）させた。凝結物（血
餅）を遠心し、血清（上清）を殺菌（0.22μｍ）フィル
ターを介して吸引し、ガンマ線を放射したプラスチック
バッグに移した。
（iii）サンプル／採血の評価 最初の免疫化から６および22週後、群の各ヒツジの抗
体力価を単純な酵素結合免疫測定法（ELISA）を用いて
評価した。
TNFαを固体相免疫測定プレート（96ウェル）に高いp
H（9.6）で結合させ、増加する希釈の血清とインキュベ
ートした。血清中のhrTNFα特異的抗体はプレートに結
合し、次いで結合しなかった抗体を洗浄した。次いで、
ヒツジの免疫グロブリンに対しロバで産生された、酵素
（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、HRP）が結合
する第二の抗体を添加した。適切な基質の存在下では、
HRPは、色素形成反応を触媒し、その生成物はヒツジ血
清における抗体の濃度に比例する。1/30000より大きい
力価の採血は、10頭のヒツジの血清貯蔵物を成すために
後で合わせられる。この力価を成さないヒツジは、群か
ら外した。
22週のサンプルの後では、個々のヒツジは、評価しな
かった。
（iv）血清貯蔵物の評価 無菌性および外毒素の試験を、製品に使用されるよう
に、無菌であり、かつ、1.25Eu/ml未満を含まなければ
ならない各血清貯蔵物に行った。
貯蔵、および全ての後の作製段階は、クラス100の条
件（class 100 conditions）で行った。
貯蔵物は、月ごとに、ELISAで力価を、また小規模の
アフィニティー精製を用いてその特異的抗体の濃度を評
価した。この技術は、hrTNFα特異的IgGの選択的濃度を
備えた、小量（1g）のhrTNFα−セファロースアフィニ
ティーカラムにおける免疫血清の通過を含む。これらの
IgGを溶出し、その濃度を決定した。
貯蔵物は、製品に使用される少なくとも2g/1の特異的
抗体を含有しなければならない。
（iv）免疫グロブリン精製 血清免疫グロブリン画分を、塩沈降により他の非治療
的な血清タンパク質から分離する。
簡潔に述べると、硫酸ナトリウム（USPグレード36
％、25℃アピロジェニック（apyrogenic）および無菌）
を、15分以上、25℃を維持しながら貯蔵された血清と混
合する。この工程による沈降物を、遠心によりペレット
化し、上清を吸引する。このペレットを、無菌濾過した
リン酸ナトリウム溶液（18％）で二度洗浄し、洗浄毎に
遠心して沈降物を濃縮する。最終のペレットを、無菌の
等張（0.9％）食塩水に再度懸濁し、無菌（0.2μｍ）濾
過する。
無菌性、内毒素の純度および力価の評価を、以下の方
法によって、この段階で行った。
（ｉ）USP無菌性試験（７日間生育フリー（7days growt
h free）） （ii）LALゲル凝結内毒素試験（The LAL gel clot endo
toxin test） （iii）ゲル濾過（GF）FPLC （iv）未処理血清と比較したELISA検定 未処理の血清の85％以上の純度および85％以上の力価
を備えたサンプルを、Fabの産生に使用した。この段階
における免疫グロブリンの濃度は、280nmでの光学密度
測定によって判断すると（IgG、１％280nmでは、吸光係
数が15であることを使用して）、約25g/1であった。
（ｖ）酵素による切断 免疫グロブリンのFab断片は、精製された免疫グロブ
リンと植物酵素パパインとをインキュベートすることに
よって調製され、この酵素そのものは、切断後に切断混
合物から酵素を除くことができる固体相マトリックスに
結合される。
この酵素マトリックスは、還元剤であるシステインと
EDTA（酵素活性を維持するため）の存在下でIgG調製物
に添加され、切断を24時間、37℃で行うことができる。
この後、この反応を、溶液から固定された酵素を除き、
大量のヨードアセトアミドブロッキング剤を添加する必
要性を除く、混合物の遠心によって終結させる。次い
で、この溶液を10kDのポリスルホンウルトラフィルター
（0.45μｍのガラス繊維プレフィルターを含む）を通し
て限外濾過し、全ての微量なシステイン、EDTAおよびFc
断片を除去するために10ボリュームの食塩水（0.9％、
無菌、アピロジェニック（apyrogenic））で洗浄する。
洗浄工程により、塩混入レベルが確実に2ppm以下となっ
た。
無菌、アピロジェニックなFabを、最後に0.22μｍの
滅菌フィルターを介して濾過した。品質評価のためにこ
の段階でサンプルを除去し、切断の効率を調べるために
GF FPLCに再度添加し、切断段階でhrTNFα結合能力が失
われないことを保証するために小規模のアフィニティー
精製も行った。無菌性およびLAL試験も、この段階で分
光学的に濃度決定して行った。この段階におけるFabの
濃度は、約60g/1であった。
Fabへの完全な切断を示し（すなわち、完全なIgGが存
在しない）、元の血清の結合能の少なくとも85％を維持
した、無菌の、アピロジェニック（＜10Eu/ml）なサン
プルは、充填に適していると考えられる。
（vi）充填 30mlの、中性のホウケイ酸塩ガラスバイアルを、6.0g
のFab溶液で満たし、ブチルゴム冷凍乾燥栓を用いてキ
ャップした。このバイアルを−70℃で最低でも30分間冷
凍し、次いで無菌の冷凍乾燥ユニットに移した。このバ
イアルを最低でも48時間乾燥させ、真空で密封した。
バイアルは、注射用（10ml）に水で戻される。
以下の試験を、乾燥したFabに行った。
（ａ）完全なUSP無菌性およびLAL並びにウサギ発熱物質
内毒素試験 （ｂ）μKjeldahl窒素分析を用いた戻されたバイアルの
タンパク質濃度 （ｃ）残余水分 （ｄ）GF FPLCによる純度 （ｅ）L929細胞の細胞毒性検定を用いたhrTNFα中和能
力 OC試験 以下の試験を行った。
in vitro 純度を調べるための高速液体クロマトグラフィー（FP
LC）。
無菌性。
発熱物質のためのリムルス変形細胞溶解（Limulus Am
oebocyte Lysate）（LAL）試験。
in vivo 発熱物質のためウサギにおける試験。
マウスおよびモルモットにおける急性の毒性。
全ての一回分から、任意にダブルラインド試験に使用
した。
白血球細胞の数 全てのWBCを、血球計測チャンバーを用いて計測し
た。
スピロヘータ 血液の膜をライト染色（Wright′s stain）で染色
し、光学顕微鏡で調べた。
サイトカイン TNFα、IL-1β、IL-8およびIL-6を免疫定量法で測定
した。
これらのサイトカイン用の免疫放射検定キットは、Me
dgenix Diagnostics SA,B-6220 Fleurus,Belgiumから購
入された。
結果 1.患者が対照である食塩水を与えられた場合に、深刻な
臨床的な反応が見られた。時間が０のところでペニシリ
ンを与えた後にスピロヘータが減少することに続いて、
温度が107°Ｆになるほど呼吸が速くなった。
2.研究に入るときには正常な体温であった二人の患者に
処置を行った。食塩水が与えられた患者は、熱の上昇に
至ったが、抗TNFα Fabが与えられた患者では、温度は
一定のままであった（図７）。
3.研究に入るときには高温であった二人の患者に処置を
行った。食塩水が与えられた患者の体温は上昇して急激
に正常に戻り、抗TNFα Fabが与えられた患者の体温は
上昇が防がれた（図８）。
4.研究59。対照の食塩水が与えられた患者におけるサイ
トカインレベル（IL-6、TNFα、IL-8およびIL-1β）
は、−30時間から０時間（０＝ペニシリン処理）の間に
レベルの変化が見られなかった。ほとんどの患者では、
レベルは４時間でピークを迎えた。
研究027。対照のFabが与えられた患者におけるサイト
カインレベルは、−30時間から０時間（０＝ペニシリン
処理）の間にレベルの変化が見られなかった。レベルピ
ークは４時間であった。
研究004。抗TNFα Fabが与えられた患者におけるサイ
トカインレベル。鋭いコントラストのTNFαレベルは、
−30時間から０時間（０＝ペニシリン処理）の間に急激
に低下した。他のサイトカインレベルは、最初のレベル
のままであるか、非常に低いピークを示した。
図９は、抗TNFα Fabまたは対照のFabで処置された患
者におけるTNFαピークレベルの平均値を、食塩水の場
合の平均値と比較して示している。また、表２は、IL-8
とIL-6に関する同様のデータを示す。
表３は、食塩水の対照またはFabの対照もしくは抗TNF
α Fabで処置された患者におけるヤーリッシュ−ヘルク
スハイマー反応の結果を示している。２＋（並の）およ
び３＋（深刻な反応）は、抗TNFα Fabを処置した後に
は見られなかった。JHR、硬直後の臨床的な徴候は、26/
29の対照と比較して、特異的抗TNF Fabが与えられた10/
20に見られた（ｐ＜0.01）。対照のグループと比較し
て、JHRにおける体温、心拍および収縮期の血圧は、抗T
NF処理されたグループではかなり低かった（それぞれｐ
＜0.01、＜0.0001、＜0.01）。
実施例8:抗TNFα Fab断片を用いたOKT3処置を受けた患
者の処置 OKT3は、親ハイブリドーマの種のロットから得られる
（American Type Culture Collection,12301 Parklawn
Drive,Rockville,MD 20852-1776,USAから利用できるATC
C CRL8001）。この免疫グロブリンは、腹水から精製さ
れ、調製される。OKT3を用いた治療法は、Ortho Study
Group（1985）N.Engl.J.Med.313,337-342に記載されて
いる。
OKT3を用いた治療方法は、カダベリック（cadaveri
c）腎臓移植の拒絶反応を有する患者に、静脈内に２〜
４分のコースで5mgを注射し、かつ、これを10もしくは1
4日間繰り返すことである（全体で50または70mgのマウ
スモノクローナル抗体に相当する）。［ポリクローナル
抗Ｔリンパ球抗血清（アフィニティー精製されていない
もの）も静脈内に注入することができるが、長期間（約
６時間）で非常に高い投与量（100〜300mg）である。ま
た、この注入も10〜15日間毎日行う必要がある。］ OKT3の最初の注入の間に、実際に各患者が、少なくと
も90％の被験者における発熱、頭痛、悪心および嘔吐を
含む徴候および症状を示した。
実施例３または７に記載したように、Fab断片を調製
した。内在性のTNFレベルは、１μg/1またはそれ未満で
あり、細胞外流体区分に制限される（約15 1）。増大し
たTNFレベルの影響およびOKT3処置によって誘発された
ショックの徴候を改善するために、5mgまたは10mgの抗T
NFα Fab断片の投与を、OKT3の最初の投与と同時に与え
る。OKT3および抗TNFα Fab断片で処置する前に、患者
に、一日当たりに1.0mg/kgのブレドニソンおよび142mg/
kgのアザチオプリン等の通常の免疫抑制剤を与える。OK
T3および抗TNFα Fab断片での処置を開始した後、患者
に一日当たりに0.6mg/kgのプレドニソンおよび30mg/kg
のアザチオプリンを与える。
フロントページの続き (72)発明者 ランドン，ジョン イギリス国 ＥＣ１Ａ ７ＢＥ ロンド ン ウエスト スミスフィールド エス ティー バーソロミューズ ホスピタル メディカル カレッジ デパートメン ト オブ リプロダクティヴ フィズィ オロジー セラピューティク アンティ ボディーズ インク（番地なし) (56)参考文献 特開 平５−96（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−109994（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−503890（ＪＰ，Ａ) 特表 平６−502629（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−505592（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−505010（ＪＰ，Ａ) Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．229（1985) ｐ．869−871 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 39/39 ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】TNFαに反応するポリクローナルIgGから得
    られたIgG Fab断片からなることを特徴とする、中和が
    有益な患者におけるTNFαを中和するための薬剤。
  2. 【請求項２】患者が敗血症性ショックまたは敗血症性シ
    ョックの症状を示すことを特徴とする、請求項１記載の
    薬剤。
  3. 【請求項３】敗血症性ショックの症状が、モノクローナ
    ル抗体OKT3もしくは機能的に同等な抗体の投与によって
    引き起こされたことを特徴とする、請求項２記載の薬
    剤。
  4. 【請求項４】敗血症性ショックの症状が、ヤーリッシュ
    −ヘルクスハイマー反応によって引き起こされたことを
    特徴とする、請求項２または３記載の薬剤。
  5. 【請求項５】請求項１ないし４のいずれか一項に記載の
    薬剤および生理学的に寛容できるキャリヤーを含むこと
    を特徴とする、中和が有益な患者におけるTNFαを中和
    するための薬学的組成物。
  6. 【請求項６】患者における敗血症性ショックまたは敗血
    症性ショックの症状を予防または改善することを特徴と
    する、請求項５記載の薬学的組成物。
  7. 【請求項７】請求項１ないし４のいずれか一項に記載の
    薬剤を添加することを含むことを特徴とする、請求項５
    または６記載の薬学的組成物の製造方法。
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