JP6421371B2 - トランスポーターに対する抗体およびその用途 - Google Patents

Description

本発明は、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域に特異的に結合し、直接的にアミノ酸輸送活性を阻害、あるいはリンパ球と共同して間接的に細胞障害性因子を誘導することで腫瘍細胞を細胞死へと導く抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８モノクローナル抗体に関する。本発明はさらに抗体および／もしくはイムノコンジュゲート組成物ならびに腫瘍を治療すること、予防することおよび／もしくは診断することにおけるそれらの使用に関する。

生物は生命の維持活動に必要な栄養素やシグナル伝達物質等を取得するために種々の機構を有しており、個々の細胞膜上に多様に存在する輸送体や受容体はその一例である。中でも生体を構成する主要要素であるアミノ酸の輸送については、１９６０年代から研究がなされてきた。１９９０年に入ってからアミノ酸輸送を担う分子が同定され始め、現在ではおよそ３０種類ほど支配遺伝子が同定されている。これら輸送体は輸送するアミノ酸の性質によって、塩基性アミノ酸輸送体、中性アミノ酸輸送体、酸性アミノ酸輸送体の３種に大別されるが、ＣＤ９８とのヘテロ２量体型アミノ酸輸送体は以下で述べるＬＡＴ1を含め６種類である。

ＬＡＴ１は他の輸送体に対し比較的広い基質選択性を持つ、ナトリウム非依存的な中性アミノ酸輸送体である。１９９８年にクローニングされた１２回膜貫通型のタンパク質で、細胞膜表面に存在する。６種類のＣＤ９８ｌｃのうちの一つであり、１回膜貫通タンパク質の４Ｆ２ｈｃ（ＣＤ９８）とジスルフィド結合することでヘテロ二量体を形成し、アミノ酸輸送の活性を示す。４Ｆ２ｈｃは特定の輸送体に連結して細胞膜まで移行させるシャペロン様分子である（例えば、金井好克， 蛋白質 核酸 酵素 Ｖｏｌ．４６， Ｎｏ．５， ｐｐ．６２９−６３７， ２００１（非特許文献１））。

現在までにＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体が腫瘍細胞において高発現しているという事例が多数報告されている（Ｙａｎａｇｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ Ｖｏｌ．１５１４， ｐｐ． ２９１−３０２， ２００１（非特許文献２）、Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ． Ｖｏｌ．９９， Ｎｏ．５， ｐｐ．１０００−１００７， ２００８（非特許文献３）、Ｋａｉｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ． Ｖｏｌ．９９， Ｎｏ．１２， ｐｐ．２３８０−２３８６， ２００８（非特許文献４）、Ｋａｉｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ． Ｖｏｌ．１００， Ｎｏ．２， ｐｐ．２４９−２５４， ２００９（非特許文献５））。アミノ酸は細胞増殖において不可欠な物質であり、無秩序に増殖を繰り返す腫瘍細胞は通常より多くのアミノ酸を必要とすると考えられる。そのため、正常細胞よりも腫瘍細胞においてアミノ酸輸送体の発現量が増加しているものと推測される。従ってＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体は腫瘍の治療における標的分子として有用であることが示唆される。

特開２０１１−２４５３７

金井好克， 蛋白質 核酸 酵素 Ｖｏｌ．４６， Ｎｏ．５， ｐｐ．６２９−６３７， ２００１ Ｙａｎａｇｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ Ｖｏｌ．１５１４， ｐｐ． ２９１−３０２， ２００１ Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ． Ｖｏｌ．９９， Ｎｏ．５， ｐｐ．１０００−１００７， ２００８ Ｋａｉｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ． Ｖｏｌ．９９， Ｎｏ．１２， ｐｐ．２３８０−２３８６， ２００８ Ｋａｉｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ． Ｖｏｌ．１００， Ｎｏ．２， ｐｐ．２４９−２５４， ２００９ Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８１ Ａｐｒ；１２６（４）：１４０９−１４． Ｍａｓｕｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９８５ Ｍａｙ；７６（５）：３８６−９４．

ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体に対し特異的に結合し活性を阻害する、あるいは細胞障害を誘導するモノクローナル抗体は分子標的薬として有望であると考えられるが、抗体医薬の性質上、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域を認識する抗体である必要がある。これまでのところ、ＣＤ９８を特異的に認識する抗体はいくつか報告されているが（Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８１ Ａｐｒ；１２６（４）：１４０９−１４．（非特許文献６）；Ｍａｓｕｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９８５ Ｍａｙ；７６（５）：３８６−９４．（非特許文献７））、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域をエピトープとする抗体として唯一の報告があるのみである（特開２０１１−２４５３７：特許文献１）。しかし、特開２０１１−２４５３７に開示される抗体はヒトを治療するためには抗体力価が十分でなく、抗腫瘍剤として実用に供するには不十分であった。

したがって、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域をエピトープとして認識する抗体（「抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８抗体」）としてより優れたたものが求められている。

このような状況に鑑み、本発明は、腫瘍細胞特異的に高発現の見られるＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域を認識し、その活性を阻害あるいは細胞障害性因子を誘導することで腫瘍細胞を細胞死へと導くモノクローナル抗体を提供する。さらに、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ、本発明の抗体と殺細胞活性および／または抗腫瘍活性を有する化合物あるいは放射性同位体との複合体（イムノコンジュゲート）を提供する。

本発明者らは特開２０１１−２４５３７に開示される抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８抗体のＣＤＲのアミノ酸配列とは異なるＣＤＲアミノ酸配列を有し、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域に対する結合性の顕著により優れた抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８抗体の作製に成功した。また該抗体が顕著な細胞障害誘導活性、およびインターナリゼーション活性を有することを確認した。

したがって、本発明は、以下を提供する。
［１］ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞のＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
（１）軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、および軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）として、それぞれ、配列番号７、配列番号８、および配列番号９のアミノ酸配列、または配列番号７、配列番号８、および配列番号９のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異をそれぞれ有するアミノ酸配列を含み、
重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）として、それぞれ、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２のアミノ酸配列、もしくは配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異をそれぞれ有するアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合断片、
（２）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３として、それぞれ、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５のアミノ酸配列、もしくは配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異をそれぞれ有するアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３として、それぞれ、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異をそれぞれ有するアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合断片、
（３）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３として、それぞれ、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１、もしくは配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異をそれぞれ有するアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３として、それぞれ、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４のアミノ酸配列、もしくは配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有する各アミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合断片、または
（４）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３として、それぞれ、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７のアミノ酸配列、もしくは配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異をそれぞれ有するアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３として、それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０のアミノ酸配列、もしくは配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異をそれぞれ有するアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合断片。
［２］ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞のＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
（１）Ｘ_１ＡＳＱＸ_２ＶＧＮＮＶＡ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）ＹＡＳＸ_３ＲＸ_４Ｔ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、
（３）ＱＲＸ_５ＹＫＳＰＹＴ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
（４）ＧＦＳＬＰＴＳＳＶＳ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）ＶＩＷＳＮＧＮＴＤＹＳＳＸ_６Ｘ_７ＫＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および
（６）ＮＦＲＮＸ_８ＰＧＶＭＤＡ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）
（但し、Ｘ_１〜Ｘ_８は、任意の天然に存在するアミノ酸残基である）
を含む、抗体またはその抗原結合断片。
［３］Ｘ_１が、ＲまたはＫであり、
Ｘ_２が、ＮまたはＴであり、
Ｘ_３が、ＳまたはＮであり、
Ｘ_４が、ＨまたはＮであり、
Ｘ_５が、ＶまたはＩであり、
Ｘ_６が、ＡまたはＲであり、
Ｘ_７が、ＩまたはＦである、
Ｘ_８が、ＤまたはＮである、項［２］に記載の抗体またはその抗原結合断片。
［４］（１）Ｘ_１がＲ、Ｘ_２がＮ、Ｘ_３がＮ、Ｘ_４がＮ、Ｘ_５がＩ、Ｘ_６がＡ、Ｘ_７がＩ、Ｘ_８がＤであるか、
（２）Ｘ_１がＫ、Ｘ_２がＮ、Ｘ_３がＳ、Ｘ_４がＨ、Ｘ_５がＶ、Ｘ_６がＲ、Ｘ_７がＦ、Ｘ_８がＤであるか、
（３）Ｘ_１がＫ、Ｘ_２がＴ、Ｘ_３がＳ、Ｘ_４がＨ、Ｘ_５がＶ、Ｘ_６がＲ、Ｘ_７がＦ、Ｘ_８がＤであるか、または
（４）Ｘ_１がＫ、Ｘ_２がＮ、Ｘ_３がＳ、Ｘ_４がＨ、Ｘ_５がＶ、Ｘ_６がＲ、Ｘ_７がＩ、Ｘ_８がＮである、項［２］に記載の抗体またはその抗原結合断片。
［５］項［１］〜［４］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片であって、
（１）配列番号３１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＨ）、および
配列番号３１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＬ）、
（２）配列番号３３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＨ）、および
配列番号３４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＬ）、
（３）配列番号３５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＨ）、および
配列番号３６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＬ）、または
（４）配列番号３７のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＨ）、および
配列番号３８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＬ）、
を含有する、抗体もしくはその抗原結合断片。
［６］項［１］〜［５］のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片であって、
（１）配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、および
配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（２）配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、および
配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（３）配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、および
配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、または
（４）配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、および
配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
を含有する、抗体もしくはその抗原結合断片。
［７］ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞に対する細胞障害活性および／またはインターナリゼーション活性を有する、項［１］〜［６］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
［８］サブクラスがＩｇＧである、項［１］〜［７］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
［９］上記ＩｇＧが、ＩｇＧ_２ａまたはＩｇＧ_１である、項［８］に記載の抗体またはその抗原結合断片。
［１０］上記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、それらのダイマー、ミニボディ（ｍｉｎｏｂｏｄｉｅｓ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、およびマルチマー、または二重特異性抗体断片である、項［１］〜［９］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
［１１］モノクローナル抗体である、項［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
［１２］ラット、マウス、霊長類、またはヒト抗体である、項［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
［１３］キメラ抗体またはヒト化抗体である、項［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
［１４］項［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と少なくとも１つの細胞毒性薬、抗腫瘍剤または放射性同位体を含んでなるイムノコンジュゲート。
［１５］項［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
［１６］項［１５］に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
［１７］項［１５］に記載の核酸分子を含むかまたは該核酸分子を導入した、項［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞または遺伝子導入細胞。
［１８］項［１７］に記載の細胞を培養し、得られる培養物からＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体に特異的に結合する抗体を採取することを含む、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
［１９］項［１７］に記載の細胞から抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して上記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清または宿主の分泌物からＬＡＴ１／ＣＤ９８の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体を採取することを含む、ＬＡＴ１／ＣＤ９８の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
［２０］上記宿主が、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または哺乳動物である、項［１９］に記載の製造方法。
［２１］項［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片またはイムノコンジュゲートを含有する組成物であって、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞に適用して該細胞のアポトーシスを誘導するために使用する、組成物。
［２２］項［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片またはイムノコンジュゲートを含有する、腫瘍の予防または治療のための医薬。
［２３］項［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片またはイムノコンジュゲートを含有する組成物であって、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞を検出するために使用する、組成物。
［２４］項［２３］の組成物と、生体から採取された試料とを反応させ、反応したシグナルを検出することを特徴とする、腫瘍の検出方法。
［２５］項［２３］の組成物を癌細胞と接触する工程を含む試験管内の腫瘍の免疫検出方法。
［２６］項［２３］の組成物を個体に投与する工程および近赤外光イメージング、ＰＥＴ、ＭＲＩまたは超音波イメージングによって得られる検出映像を得る工程を含む生体内で腫瘍の映像化方法。
［２７］項［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片またはイムノコンジュゲートを含有する、腫瘍の診断のための医薬。
［２８］上記腫瘍が、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、口腔癌、胆嚢癌、甲状腺癌、中皮腫、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される少なくとも１つである、項［２２］または項［２７］に記載の医薬。
［２９］以下の（１）〜（６）からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（１）配列番号７、１３、１９、または２５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）配列番号８、１４、２０、または２６のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、
（３）配列番号９、１５、２１、または２７のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
（４）配列番号１０、１６、２２、または２８のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）配列番号１１、１７、２３、または２９のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および
（６）配列番号１２、１８、２４、または３０のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）。

本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域を特異的に認識し、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の活性を阻害またはＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体発現細胞において細胞障害性因子を誘導し、その細胞死を引き起こすことができる。また本発明の抗体またはその抗原結合断片に殺細胞活性および／または抗腫瘍活性を有する化合物あるいは放射性同位体を結合させたイムノコンジュゲートにより、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体発現細胞において、細胞死を引き起こすことができる。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域を特異的に認識することができることから、抗癌抗体医薬として特に有用である。本発明は、これまで報告されているＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域を特異的に認識する抗体と比較して格別顕著な効果を奏する。

（Ａ）ヒト大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）、ヒト肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１９４４、Ａ５４９）、ヒト子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）に対するＬＧ９１１１モノクローナル抗体、ＬＧ９１１２モノクローナル抗体、ＬＧ９１１３モノクローナル抗体、ＬＧ９１１４モノクローナル抗体、およびＬＧｔｒａ０１−０１モノクローナル抗体の結合性を示す図である。赤線は各モノクローナル抗体を反応させたときのヒストグラム、青線はＣｏｎｔｒｏｌとしてラットＩｇＧを反応させたときのヒストグラムを示す。（Ｂ）（Ａ）に記載のヒストグラムをグラフにより示す。値は、抗体反応時のＭＦＩ（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）からＣｏｎｔｒｏｌのＭＦＩを引いた値（ΔＭＦＩ）を示す。 （Ａ）ＬＧ９１１１ヒトキメラ抗体、ＬＧ９１１３ヒトキメラ抗体を用いたＡＤＣＣ活性を示す図である。各ヒトキメラ抗体をそれぞれ、１．２５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ加えた状態、およびＣｏｎｔｒｏｌとして抗体を含まずエフェクター細胞と標的細胞のみの状態における細胞障害率（％）を示す。（Ｂ）ＬＧ９１１１ヒトキメラ抗体、ＬＧ９１１３ヒトキメラ抗体のヒト大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）、ヒト肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１９４４）に対するＡＤＣＣ活性を示す図である。 （Ａ）ＬＧ９１１１モノクローナル抗体、ＬＧ９１１２モノクローナル抗体、ＬＧ９１１３モノクローナル抗体、ＬＧ９１１４モノクローナル抗体のインターナリゼーション活性を示す図である。（Ｂ）（Ａ）に示されるインターナリゼーション活性が、モノクローナル抗体が剥がれたことによる擬陽性ではないことを示す図である。値は３７℃（インターナリゼーションが誘導される温度）および４℃（インターナリゼーションが誘導されない温度）の各条件下においてモノクローナル抗体を反応させたときのＭＦＩからラットＩｇＧを反応させたＣｏｎｔｒｏｌのＭＦＩを引いた値（ΔＭＦＩ）を示す。

１．ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域を特異的に認識する抗体
本発明は、１つの実施形態において、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域に特異的に結合する抗体（本明細書中、「抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８抗体」と呼ぶこともある。）およびその抗原結合断片を提供する。すなわち、本発明は、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域のアミノ酸配列の一部または全部をエピトープとする抗体およびその抗原結合断片を提供する。

アミノ酸輸送系Ｌの第一のアイソフォームである「ヒトＬＡＴ１（Ｌ−ｔｙｐｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｔｒａｎｐｓｏｒｔｅｒ １）」は、５０７アミノ酸残基からなる１２回膜貫通型の膜タンパク質である。ヒトＬＡＴ１のアミノ酸配列、ｍＲＮＡ配列等の情報は、それぞれＡＡＤ２０４６４、ＡＦ１０４０３２等のアクセッション番号でＧｅｎＢａｎｋ等の公にアクセス可能なデータベースから入手することができる。また、マウスや他の哺乳動物（例えば、ラット、ウシなど）のＬＡＴ１も同様に、公にアクセス可能なデータベースから入手することができる。
ヒトＬＡＴ１と細胞膜上で複合体を形成する「ヒトＣＤ９８」は、６３０アミノ酸残基からなる１回膜貫通II型の膜タンパク質である。ヒトＣＤ９８のアミノ酸配列、ｍＲＮＡ配列等の情報は、それぞれＮＰ＿００２３８５、ＮＭ＿００２３９４等のアクセッション番号でＧｅｎＢａｎｋ等の公にアクセス可能なデータベースから入手することができる。また、マウスや他の哺乳動物（例えば、ラット、ウシなど）のＣＤ９８も同様に、公にアクセス可能なデータベースから入手することができる。

本明細書中、単に「ＬＡＴ１／ＣＤ９８」という場合、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体タンパク質のことを指すものとする。場合によっては、ＬＡＴ１タンパク質ならびにＣＤ９８タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子（または単にＬＡＴ１遺伝子ならびにＣＤ９８遺伝子）を単にＬＡＴ１ならびにＣＤ９８と呼ぶ場合もありうるが、その場合には当業者にとっては文脈からＬＡＴ１遺伝子ならびにＣＤ９８遺伝子を指すことが明らかであろう。本明細書中、ＬＡＴ１ならびにＣＤ９８は、典型的には、ヒトＬＡＴ１ならびにヒトＣＤ９８であるが、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウシなど）のＬＡＴ１ならびにＣＤ９８であってもよい。

本明細書中、「ＬＡＴ１／ＣＤ９８の細胞外領域」とは、細胞表面にＬＡＴ１／ＣＤ９８が発現された場合に、細胞膜の細胞質とは反対側（すなわち、細胞の外側）の細胞表面に露出するＬＡＴ１／ＣＤ９８の領域をいう。本発明の抗体またはその抗原結合断片が、ＬＡＴ１／ＣＤ９８の細胞外領域に結合しているか否かは、例えば、本願明細書の実施例２に記載されるように、ヒト腫瘍細胞株を用いたＦＣＭ（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙの略）解析によって確認することができる。なお、ＬＡＴ１の細胞外領域として、ＵｎｉＰｒｏｔ等の公にアクセス可能なデータベースでは、例えば、７１位〜８３位のアミノ酸残基、１４１位〜１４５位のアミノ酸残基、１９１位〜１９８位のアミノ酸残基、２６４位〜２７３位のアミノ酸残基、３４０位〜３９５位のアミノ酸残基、４５２位〜４５７位のアミノ酸残基にわたる領域がアミノ酸配列から予測されている。

本明細書中、抗体またはその抗原結合断片が、ＬＡＴ１／ＣＤ９８の細胞外領域に「特異的に結合する」とは、その抗体または抗原結合断片が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、これらの領域の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能なほどに高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋ_ａ）が少なくとも１０^７Ｍ^−１、好ましくは、少なくとも１０^８Ｍ^−１、より好ましくは、１０^９Ｍ^−１、さらにより好ましくは、１０^１０Ｍ^−１、１０^１１Ｍ^−１、１０^１２Ｍ^−１またはそれより高い、例えば、最高で１０^１３Ｍ^−１またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。

本明細書中、「抗体」は、インタクトな免疫グロブリンの全てのクラスおよびサブクラスを含むものとする。好ましくは、本発明の抗体は、ＩｇＧサブクラスのものであり、より好ましくは、ヒトＩｇＧ_１サブクラスのものである。「抗体」は、特に、モノクローナル抗体を含む。

本明細書中、「抗原結合断片」は、インタクトな、および／またはヒト化された、および／またはキメラな抗体の抗原結合領域または可変領域を有するフラグメント、たとえば、上記抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ＳｃＦｖフラグメントを含む。従来、こうしたフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解によって、たとえばパパイン分解によって（たとえば、国際公開ＷＯ９４／２９３４８を参照）作製されているが、遺伝子組換えによる形質転換宿主細胞から直接産生させることもできる。ＳｃＦｖの作製については、Ｂｉｒｄら、（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２， ４２３−４２６に記載の方法が使用できる。さらに、抗体フラグメントは、下記のさまざまな遺伝子工学技術を用いて作製することができる。

Ｆｖフラグメントは、その２つの鎖の相互作用エネルギーがＦａｂフラグメントより低いと思われる。ＶＨおよびＶＬドメインの結合を安定化するために、これらのドメインは、ペプチド（Ｂｉｒｄら、（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２， ４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ， ８５， ５８７９−５８８３）、ジスルフィド架橋（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら、（１９９０） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２９， １３６２−１３６７）、および「ｋｎｏｂ ｉｎ ｈｏｌｅ」変異（Ｚｈｕら、（１９９７）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．， ６， ７８１−７８８）によって連結されている。ＳｃＦｖフラグメントは、当業者によく知られている方法によって作製することができる（Ｗｈｉｔｌｏｗら、（１９９１） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， ２， ９７−１０５およびＨｕｓｔｏｎら、（１９９３） Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １０， １９５−２１７を参照）。ＳｃＦｖは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）などの細菌細胞内で産生させることができるが、真核細胞内で産生させる方が好ましい。ＳｃＦｖの不利な点は、産物が一価であること、そのために多価結合による結合力の増加が不可能になること、ならびに半減期が短いことである。こうした問題を克服するための試みには、二価（ＳｃＦｖ’）_２があるが、これは、追加のＣ末端システインを含有するＳｃＦｖから、化学的カップリングによって（Ａｄａｍｓら、（１９９３） Ｃａｎ．Ｒｅｓ ５３， ４０２６−４０３４、およびＭｃＣａｒｔｎｅｙら、（１９９５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８， ３０１−３１４）、または不対Ｃ末端システイン残基を含有するＳｃＦｖの、自然発生的な部位特異的二量体化によって（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、（１９９５） Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｐｈｙｓ ２６， １８７−２０４を参照）作製される。あるいはまた、ペプチドリンカーを３〜１２残基に短縮して「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」を形成することによって、ＳｃＦｖに多量体を形成させることができる。Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＰＮＡＳ （１９９３）， ９０， ６４４４−６４４８を参照。リンカーをさらに小さくすることで、ＳｃＦｖ三量体（「トリアボディ」、Ｋｏｒｔｔら、（１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ， １０， ４２３−４３３を参照）および四量体（「テトラボディ」、Ｌｅ Ｇａｌｌら、（１９９９） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， ４５３， １６４−１６８を参照）をもたらすことができる。二価ＳｃＦｖ分子の構築は、「ミニ抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）」（Ｐａｃｋら、（１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１， １５７９−１５８４を参照）および「ミニボディ」（Ｈｕら、（１９９６）， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６， ３０５５−３０６１を参照）を形成することができるタンパク質二量体化モチーフとの遺伝子融合によっても、達成することができる。ＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデム（（ＳｃＦｖ）_２）は、第３のペプチドリンカーによって２つのＳｃＦｖ単位を連結することによって作製することもできる（Ｋｕｒｕｃｚら、（１９９５） Ｊ．Ｉｍｍｏｌ．１５４， ４５７６−４５８２を参照）。二重特異性ダイアボディは、ある抗体のＶＬドメインに短いリンカーで連結された、別の抗体由来のＶＨドメインからなる、２つの一本鎖融合産物の非共有結合によって作製することができる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、（１９９８）， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎ ７７， ７６３−７７２を参照）。このような二重特異性ダイアボディの安定性は、ジスルフィド架橋、もしくは上記の「ｋｎｏｂ ｉｎ ｈｏｌｅ」変異を導入することによって、または２つのハイブリッドＳｃＦｖフラグメントがペプチドリンカーを介して連結される、一本鎖ダイアボディ（ＳｃＤｂ）を形成することによって、高めることができる（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら、（１９９９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２６ １７９−１８８を参照）。四価の二重特異性分子は、たとえば、ＳｃＦｖフラグメントを、ＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインに、またはヒンジ領域を介してＦａｂフラグメントに、融合することによって得られる（Ｃｏｌｏｍａら、（１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５， １５９−１６３を参照）。あるいはまた、四価の二重特異性分子は、二重特異性一本鎖ダイアボディの融合によって作製されている（Ａｌｔら、（１９９９） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４５４， ９０−９４を参照）。より小さい四価の二重特異性分子は、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフ含有リンカーによるＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデムの二量体化（ＤｉＢｉミニ抗体、Ｍｕｌｌｅｒら、（１９９８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４３２， ４５−４９を参照）、または分子内対合を妨げる配向で４つの抗体可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を含む一本鎖分子の二量体化（タンデムダイアボディ、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、（１９９９） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２９３， ４１−５６を参照）のいずれかによって、作製することもできる。二重特異性Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントの化学的カップリングによって、またはロイシンジッパーによるヘテロ二量体化によって作製することができる（Ｓｈａｌａｂｙら、（１９９２） Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７５， ２１７−２２５、およびＫｏｓｔｅｌｎｙら、（１９９２）， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８， １５４７−１５５３を参照）。また、単離されたＶＨおよびＶＬドメイン（Ｄｏｍａｎｔｉｓ ｐｌｃ）も利用できる。

本明細書中、「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（または抗体断片）を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。概して異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性の他に、ハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンによる混入がないという点で、モノクローナル抗体は有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示すものであって、ある特定の方法による抗体の産生を必要とすることを意味するためのものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５ ［１９７５］に最初に記載されたハイブリドーマ法によって作成してもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作成してもよい。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２： ６２４−６２８ ［１９９１］およびＭａｒｋｓ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２： ５８１−５９７ （１９９１） に記載された技術を用いて、ファージ抗体ライブラリから単離した抗体断片（Ｆｖクローン）を含む抗原認識および結合部位のクローンを含む。

「モノクローナル抗体」は、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、それは、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種から誘導されたまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導されたまたは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りにおいて、それらの抗体の断片の対応する配列と同一または相同である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： ６８５１−６８５５ ［１９８４］）。

非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２あるいは抗体の他の抗原結合性配列）である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、そのレシピエントＣＤＲ由来の残基が、マウス、ラット、ウサギ、霊長類（例えば、サル）などのヒト以外の種のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する所望の特異性、親和性および容量を持つ残基で置換されている。ある場合は、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移植されるＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精密かつ最適化するために施される。一般にヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質上全てがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含有しうる。また、最適なヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含有しうる。

本明細書中、「ＬＡＴ１／ＣＤ９８の活性」とは、中性アミノ酸輸送活性、アミノ酸類似薬物輸送活性等を意味する。ＬＡＴ１／ＣＤ９８のアミノ酸輸送活性は、例えば、標識アミノ酸の細胞内取り込みによって測定することができる。「ＬＡＴ１／ＣＤ９８の活性を阻害する」とは、上記のＬＡＴ１／ＣＤ９８の活性を顕著に低下させるかまたは除くことを意味する。「ＬＡＴ１／ＣＤ９８の活性を顕著に低下させるかまたは除く」とは、ＬＡＴ１／ＣＤ９８の生物学的活性の少なくとも５％またはそれ以上低下させることを意味する。

本明細書中、「細胞障害活性」とは、細胞に対して細胞障害を引き起こす能力を意味し、本発明の場合、ＬＡＴ１／ＣＤ９８発現細胞に本発明の抗体またはその抗原結合断片が特異的に結合して、該細胞に細胞障害性因子を誘導して、該細胞を細胞死またはアポトーシスに至らしめる能力をいうものとする。細胞障害活性は、例えば、本発明の実施例２に記載される方法で測定し、細胞障害率として評価することができる。

本明細書中、「細胞死」は「アポトーシス」を意味する。「アポトーシス」は、個体発生のプログラム、デス因子刺激、放射線などによる染色体ＤＮＡの重度の損傷、異常タンパク質の蓄積などによる重度の処方体ストレスなどさまざまな生理的、病理的要因により誘導される機能的、能動的な細胞死の典型であり、細胞体や核の膨潤を伴う壊死（ネクローシス）とは逆に、細胞体や核の収縮や断片化が起こる。

本発明の抗体またはその抗原結合断片の例としては、
（１）配列番号：１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）配列番号：２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、
（３）配列番号：３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
（４）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および
（６）配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、
のうちの少なくとも１つを含む、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞のＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。

本明細書中、「１個または数個のアミノ酸残基の変異」とは、元となるアミノ酸配列中の１個または数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、または付加されていることを意味する。このような変異の存在により、対象アミノ酸配列は、元となるアミノ酸配列に対して、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性（％）を有することができる。本明細書中、そのような変異を元となるアミノ酸配列中の対応する位置に有するアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合断片は、元となるアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合断片と同等の生物学的活性を有する。ここで、「同等の生物学的活性」としては、（ｉ）元となるアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合断片が特異的に結合する抗原に対して特異性をもって結合する能力、（ｉｉ）ＬＡＴ１／ＣＤ９８のアミノ酸輸送活性に対する阻害能力、（ｉｉｉ）ＬＡＴ１／ＣＤ９８発現細胞上のＬＡＴ１／ＣＤ９８に結合した場合における、該細胞に対する細胞障害活性、または（ｉｖ）これらのいずれか２つ以上もしくは全てが挙げられる。最も好ましくは、「同等の生物学的活性」とは、上記（ｉｖ）を意味する。また、上記の「１個または数個のアミノ酸残基の変異」における変異したアミノ酸残基の数の上限は、このような同等の特異性を保持することができるか否かという基準（ｃｒｉｔｅｒｉａ）によって制限される。

一般的には、天然に存在するタンパク質を構成しているアミノ酸は、それらの側鎖の特性によって群分け可能であり、例えば、同様な特性を有するアミノ酸群としては、芳香族アミノ酸（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性アミノ酸（セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン）、炭化水素鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン）、およびその他（グリシン、メチオニン、システイン）の群などに分類できる。

非天然型のアミノ酸も含めた相互に置換可能なアミノ酸残基の例としては、下記の様な群わけもあり、同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン。

なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（PNAS, 1990 (vol.87) p2264 ; PNAS, 1993 (vol.90) p5873）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（J Mol Biol , 1990 (vol.215) p403）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=50、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。もしくは、タンパク質のアミノ酸配列の同一性を求める際、比較する2種類のタンパク質のアミノ酸配列を並べ、目視で同じアミノ酸残基である部分の数を数えることにより「（同一なアミノ酸残基数／タンパク質全長のアミノ酸残基数）×１００（％）」により求めることもできる。

本発明の抗体またはその抗原結合断片の好ましい例としては、
（１）軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、および軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）として、それぞれ、配列番号７、配列番号８、および配列番号９のアミノ酸配列、または配列番号７、配列番号８、および配列番号９のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異をそれぞれ有するアミノ酸配列を含み、
重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）として、それぞれ、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２のアミノ酸配列、もしくは配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異をそれぞれ有するアミノ酸配列を含む、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞のＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、
（２）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３として、それぞれ、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５のアミノ酸配列、もしくは配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異をそれぞれ有するアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３として、それぞれ、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異をそれぞれ有するアミノ酸配列を含む、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞のＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、
（３）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３として、それぞれ、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１、もしくは配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異をそれぞれ有するアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３として、それぞれ、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４のアミノ酸配列、もしくは配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有する各アミノ酸配列を含む、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞のＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、または
（４）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３として、それぞれ、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７のアミノ酸配列、もしくは配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異をそれぞれ有するアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３として、それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０のアミノ酸配列、もしくは配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異をそれぞれ有するアミノ酸配列を含む、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞のＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。

あるいは、本発明の抗体またはその抗原結合断片の好ましい例としては、
（１）配列番号３１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＨ）、および
配列番号３１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＬ）、
（２）配列番号３３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＨ）、および
配列番号３４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＬ）、
（３）配列番号３５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＨ）、および
配列番号３６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＬ）、または
（４）配列番号３７のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＨ）、および
配列番号３８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＬ）、
を含有する、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞のＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片が挙げられる。

なお、上記同一性のパーセンテージは、具体的には、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。

２．本発明の抗体をコードする核酸
本発明は、別の実施形態において、ＬＡＴ１／ＣＤ９８の細胞外領域に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子を提供する。核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。本発明の核酸分子は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を作製するために使用することができる。

したがって、これに関連する本発明の別の実施形態では、本発明のハイブリドーマ細胞から抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して前記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清または宿主の分泌物からＬＡＴ１／ＣＤ９８の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体を採取することを含む、ＬＡＴ１／ＣＤ９８の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法が提供される。

本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードするＤＮＡは、常法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に分離されて、配列決定される。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。一旦分離されると、組換え宿主細胞でモノクローナル抗体を合成するために、このＤＮＡを発現ベクターへ挿入し、それをこの状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、ヒトＨＥＫ２９３胎児腎由来細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞へトランスフェクトしうる。例えば、相同的なマウス配列をヒト重鎖および軽鎖定常ドメインの配列で置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８１：６８５１［１９８４］）、または免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を共有結合させることによって、このＤＮＡを修飾しうる。本発明の抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８モノクローナル抗体の結合特異性を有するように、「キメラ」または「ハイブリッド」抗体は調製される。

３．本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞
本発明はさらに別の実施形態において、ＬＡＴ１／ＣＤ９８の細胞外領域に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片を産生するハイブリドーマ細胞を提供する。本発明はまた、ＬＡＴ１／ＣＤ９８の細胞外領域に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片をコードする核酸分子を含有するハイブリドーマを提供する。

本発明のハイブリドーマ細胞の調製は、具体的には、以下のように行うことができるが、この方法に限定されるわけではない。

（１）抗原の調製
抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８モノクローナル抗体を作製するために必要な抗原としては、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を産生する細胞あるいはその細胞画分等を用いることができる。

（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
６〜２４週令のマウスまたはラットに、（１）に示した方法で作製された抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバントまたは、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原の投与は、１回目の投与の後２〜３週間おきに３〜７回行う。各投与後５〜１０日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊 １９７６年〕などで調べる。抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源として供する。脾細胞を骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後３〜４日目に、免疫したマウスまたはラットより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓を血清無添加の基礎培地（以下洗浄用培地という。）中で細断し、遠心分離して細胞を回収後、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で２〜３分間処理し赤血球の除去を行い、洗浄用培地で洗浄した後に融合用脾細胞として提供する。

（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）〔Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−１、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６， ５１１−５１９（１９７６）〕、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔Ｎａｔｕｒｅ ２７６， ２６９−２７０ （１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２３， １５４８−１５５０ （１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５−４９７ （１９７５）〕などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０^−５Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）を１０％加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０^７個以上の細胞数を確保する。

（４）細胞融合
（２）で免疫した抗体産生細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞を洗浄用培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合させる。細胞回収後、細胞をよくほぐし、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１，５００（ＰＥＧ−１，５００）２ｇ、洗浄用培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液０．２〜１ｍｌ／１０８抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎に洗浄用培地１〜２ｍｌを数回加え、全量が５０ｍｌになるまで洗浄する。細胞回収後、ゆるやかに細胞をほぐしながら、ＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４Ｍ）、チミジン（１．５×１０^−５Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり、例えばＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇの略）などを用いて、ＬＡＴ１／ＣＤ９８タンパク質に特異的に反応する抗体を選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。

したがって、これに関連する本発明の別の実施形態では、ハイブリドーマ細胞を培養し、得られる培養物からＬＡＴ１／ＣＤ９８に特異的に結合する抗体を採取することを含む、ＬＡＴ１／ＣＤ９８の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法が提供される。

４．本発明の抗体のイムノコンジュゲート
本発明はまた、別の実施形態において、本発明の抗体およびその抗原結合断片に殺細胞活性および／または抗腫瘍活性を有する化合物あるいは放射性同位体を結合させたイムノコンジュゲートを提供する。

本発明の抗体は、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する標的腫瘍細胞内へのインターナリゼーション活性に優れたものである。そのため、殺細胞活性および／または抗腫瘍活性を有する化合物を結合させたイムノコンジュゲートは、これら化合物を腫瘍細胞に直接かつ選択的に作用させることができる。

５．医薬組成物
本発明はまた、さらに別の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片またはそれらとのイムノコンジュゲートを有効成分として含有する、腫瘍の予防または治療または診断のための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得る担体を含有する。

後述の実施例に示されるように、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞（例：腫瘍細胞）のＬＡＴ１／ＣＤ９８の細胞外領域に特異的に結合して、ＬＡＴ１／ＣＤ９８の活性を阻害するか、または細胞障害因子を誘導し、該細胞を細胞死に至らしめることができる。さらに、インターナリゼーション活性を有するため、殺細胞活性および／または抗腫瘍活性を有する化合物を結合させたイムノコンジュゲートは、これら化合物を腫瘍細胞に直接かつ選択的に作用させることができる。そのような化合物としては、例えば、細胞毒性薬、抗腫瘍剤、または放射性同位体が挙げられる。したがって、本発明の医薬組成物は、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を細胞表面に発現する腫瘍細胞を死滅させるため、またはそのような細胞で特徴付けられる腫瘍および、同様の機序により生ずる疾患の予防または治療のために使用することができる。

上記「腫瘍」の例としては、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、口腔癌、胆嚢癌、甲状腺癌、中皮腫、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫、およびウィルムス腫瘍等が挙げられる。より好ましくは、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、膀胱癌、リンパ腫、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、および前立腺癌が挙げられる。本発明の抗体またはその抗原結合断片を医薬として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、水溶液もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用でき、また、該抗体をＩｇＡ化し、分泌成分を結合した後に必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に例えば、該抗体またはその抗原結合断片を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。

「薬学的に許容し得る」という用語は、正常な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比を有し、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、またはその他の問題もしくは合併症を示すことのない、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために、本明細書において利用される。

本発明の腫瘍の予防または治療のための医薬組成物の投与経路は、周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、皮下、筋肉内、眼内、動脈内、脳内脊髄、または病巣内経路での注射または注入、または徐放系による。またさらに、該抗体またはその抗原結合断片を直接腫瘍部位へ投与する手段として、カテーテル等による投与等も可能である。

また、本発明の腫瘍の予防または治療のための医薬は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、ヒトを含む哺乳動物に対して投与することができる。該抗体またはその抗原結合断片またはその塩の投与量は、投与対象、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、子宮内膜症患者または子宮腺筋症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば６０ｋｇの患者に対して、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与することができる。

６．本発明の腫瘍の診断方法
本発明はまた、さらに別の実施形態において、上記の本発明の抗体またはその抗原結合断片に少なくとも１つの診断または検出剤を結合した診断用イムノコンジュゲートにより、腫瘍を検出することを特徴とする。好ましくは、診断または検出剤は、放射性核種、造影剤、蛍光剤、化学発光剤、生物発光剤、常磁性イオン、酵素、および光活性診断剤からなる群から選択される。１つの実施形態では、診断用イムノコンジュゲートと生体から採取された試料、例えば組織片または血液等と反応させ、シグナルを検出することにより、腫瘍を検出することができる。測定法としては、例えばＥＬＩＳＡ法、ＥＩ法、ＲＩＡ法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法等が挙げられる。また別の実施形態では、診断用放射性核種を結合させた診断用イムノコンジュゲートによるＰＥＴイメージングに使用することができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に記載するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。

［実施例１］
（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８モノクローナル抗体を作製するために、ラットに、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を高発現している細胞株（例えば、ヒト大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６））を免疫して、その脾臓より抗体産生細胞を採取した。免疫は、ラットの皮下、腹腔、または静脈内に抗原として細胞３×１０^６個を投与することにより行った。抗原の投与は、１回目の投与の３週間後および６週間後に２回行った。脾細胞を骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原の最終投与後３日後に、免疫したラットより脾臓を摘出し脾細胞を採取した。脾臓を血清無添加の基礎培地（以下洗浄用培地という。）中で細断し、遠心分離して細胞を回収後、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で２〜３分間処理し赤血球の除去を行い、洗浄用培地で洗浄した後に融合用脾細胞として用いた。

（２）ハイブリドーマの作製
実施例１（２）で得られたマウスまたはラット脾細胞とマウス骨髄腫細胞株Ｘ６３とを４：１の比率で混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１５００（ＰＥＧ−１５００）２ｇ、ＤＭＥＭ培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液を０．２〜１ｍｌ／１０^８個マウス脾細胞の割合で加え、さらに１〜２分間毎にＤＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＤＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるようにした。９００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てＨＡＴ培地１００ｍｌ中に細胞をゆるやかに懸濁した。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。

（３）抗体スクリーニング
実施例１（３）で得られたハイブリドーマ培養上清をＬＡＴ１／ＣＤ９８を高発現し、かつ抗原に用いた細胞株とは異なる細胞株（例えば、ヒト肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１９４４））と反応させ、ＦＣＭ解析を行うことによりＬＡＴ１／ＣＤ９８特異的抗体を産生しているかの１次スクリーニングを行った。
ＦＣＭの反応は９６ウェルプレートにて行った。ＬＡＴ１／ＣＤ９８高発現細胞株をＰＢＳにて２．５×１０^５〜３×１０^６個／ウェルになるように５０μｌずつチューブに分注した。この細胞浮遊液にハイブリドーマの培養上清５０μｌを加え、４℃で４５分反応させた。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ１００μＬを加え、５００ｇで３分間、４℃で遠心する洗浄を３回行い、細胞ペレットに２００倍希釈したＰＥ−ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を５０μＬ加え、遮光状態で４℃で４５分間反応させた。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ１００μＬを加え、５００ｇで３分間、４℃で遠心する洗浄を３回行い、ＰＢＳ５００μＬに懸濁し、ＦＣＭチューブに移した。死細胞を除くため測定直前にＰＩ１００μＬを添加し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて測定した。陽性反応が得られたクローンを選別し、４種の抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８抗体産生ハイブリドーマ株（ＬＧ９１１１、ＬＧ９１１２、ＬＧ９１１３およびＬＧ９１１４）を樹立した。

（４）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雄マウス（ＫＳＮ）に実施例１（４）で得られたハイブリドーマ株を１×１０^７細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜１５日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから腹水を採取し、２０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心し、５０％飽和硫酸アンモニウムにて塩析し、沈渣を溶かして１００００ｇで１０分間、４℃でした。プレフィルター、メンブランフィルター（０．２２μｍ）を通過させた後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ (ＧＥヘルスケア バイオサイエンス)を用いて精製した後、ＰＢＳで透析(３時間以上x４回)を行った。その結果得られた４種の抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８モノクローナル抗体をＬＧ９１１１モノクローナル抗体、ＬＧ９１１２モノクローナル抗体、ＬＧ９１１３モノクローナル抗体及びＬＧ９１１４モノクローナル抗体とした。

［実施例２］
腫瘍細胞株に対するモノクローナル抗体の結合性の検討
ヒト腫瘍細胞株４種を用いて抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８モノクローナル抗体の結合性をＦＣＭ解析により測定した。ヒト腫瘍細胞株をＰＢＳにて１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように調整し、５０μＬずつチューブに分注した。この細胞浮遊液に４０μｇ／ｍＬに調製した各モノクローナル抗体５０μＬを加え、４℃で４５分反応させた。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ１００μＬを加え、５００ｇで３分間、４℃で遠心する洗浄を３回行い、細胞ペレットに２００倍希釈したＰＥ−ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を５０μＬ加え、遮光状態で４℃で４５分間反応させた。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ１００μＬを加え、５００ｇで３分間、４℃で遠心する洗浄を３回行い、ＰＢＳ５００μＬに懸濁し、ＦＣＭチューブに移した。死細胞を除くため測定直前にＰＩ１００μＬを添加し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて測定した。図１に示すように、取得した４種のモノクローナル抗体は種々の癌細胞株に対して結合活性を示し、特に大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６に対してより高い結合活性が認められた。また、ＬＧｔｒａ０１−０１モノクローナル抗体（特開２０１１−２４５３７に開示された抗体）に比べて、１０倍以上高い結合活性が認められた。

［実施例３］
ヒトキメラ抗体の作製
樹立した抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８抗体産生ハイブリドーマ株からｔｏｔａｌ ＲＮＡを分離し、ＳＭＡＲＴｅｒ^ＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ. Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ (クロンテック)を使ってｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡよりｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法により重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅し、クローニングベクターにサブクローニングした。得られた ｃＤＮＡの塩基配列を解析し、常法（＜http://www.bioinf.org.uk/abs/＞に記載）により各抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号３１〜３８）及びＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ（ＣＤＲ）のアミノ酸配列（配列番号７〜３０）を決定した。ＣＤＲ配列特異的プライマーを合成し、それを用いて、抽出したプラスミドＤＮＡからＣＤＲを増幅し、ヒトキメラ抗体重鎖発現ベクターもしくはヒトキメラ抗体軽鎖発現ベクターに組み込んだ。得られたプラスミドはＬｉｇａｓｅを用いて結合し、ヒトキメラ抗体産生プラスミドを作製した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ (インビトロジェン)を用いて、ヒトキメラ抗体産生プラスミドをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞 (インビトロジェン)に遺伝子導入し、９６時間 旋回培養 (ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ ２９３培地, ３７℃, ８%ＣＯ_２, １３５ｒｐｍ)後の培養上清を取得した。培養上清はＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ (ＧＥヘルスケア バイオサイエンス)を用いて精製した後、ＰＢＳで透析(３時間以上x４回)を行い、ヒトキメラＬＡＴ１／ＣＤ９８抗体を取得した。

［実施例４］
ヒトキメラ抗体による抗体依存性細胞障害活性の検討
ヒトより血液をヘパリン採血管（テルモ ＶＰ−Ｈ１００Ｋ）に採取した。ＰＢＳを加え２倍に希釈し、希釈したヘパリン血１８ｍＬをリンフォセパール I（ＩＢＬ ２３０１０）１２ｍＬに対し静かに重層した。４００ｇで３０分間遠心後、上層の血漿層を静かに除去し、中間層の単核球画分を分取した。ＰＢＳを加え２倍に希釈し、２００ｇで１０分間遠心し、上清を除去した。ＰＢＳ１０ｍＬを加え、２００ｇで１０分間遠心する洗浄を２回行い、５％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０ に懸濁した細胞をエフェクター細胞懸濁液とした。一方、標的細胞としてヒト腫瘍細胞を２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０で懸濁し、Ｕ底９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように５０μＬずつ分注した。ヒトキメラ抗体５０μＬ加え、４℃で１５分間インキュベート後、遠心し上清を捨てた。エフェクター細胞懸濁液１００μＬを加え（同時にコントロールとして、エフェクター細胞のみのｗｅｌｌ（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）、標的細胞のみのｗｅｌｌ（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）を作製）、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベート（同時にコントロールとして、終了の４５分前に標的細胞に１０ｘＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを加えたｗｅｌｌ（Ｔｅｒｇｅｔ Ｍａｘ）を作製）した。インキュベート後、軽くシェイクし、２００ｇで５分間遠心し、上清５０μＬを平底９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移した。Ｃｙｔｏｔｏｘ９６ Ｎｏｎ―Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ１７８０）を用い、キットに添付のプロトコールに従って反応させ、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）を用いて４９０ｎｍ蛍光波長を測定し、次の式で細胞障害率を算出した。細胞障害率（％）＝（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ - Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ - Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）／（Ｔａｒｇｅｔ Ｍａｘ - Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）×１００。図２に示すようにＬＧ９１１１ヒトキメラ抗体及びＬＧ９１１３ヒトキメラ抗体において、抗体濃度依存的なＡＤＣＣ活性が検出され、ヒト大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）に対し抗体濃度２０μｇ／ｍＬでそれぞれ７９％、４６％の細胞障害率が認められた。また、ヒト肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１９４４）に対し３５％以上の細胞障害率が認められた。

［実施例５］
モノクローナル抗体のインターナリゼーション活性の検討
ヒト腫瘍細胞株を用いて抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８モノクローナル抗体のインターナリゼーション活性をＦＣＭ解析により測定した。ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで懸濁し、Ｕ底９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように５０μＬずつ分注した。この細胞浮遊液に２０μｇ／ｍＬに調製した各モノクローナル抗体５０μＬを加え、４℃で４５分反応させた。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ１５０μＬを加え、５００ｇで３分間、４℃で遠心する洗浄を３回行い、モノクローナル抗体を結合させた細胞ペレットを得た。この細胞ペレットに０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ１００μＬを加え、３７℃（インターナリゼーションが誘導される温度）または４℃（インターナリゼーションが誘導されない温度）で、それぞれ１時間インキュベートした。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ１５０μＬを加え、５００ｇで３分間、４℃で遠心する洗浄を３回行った。２００倍希釈したＰＥ−ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を５０μＬ加え、遮光状態で４℃で３０分間反応させた。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ１５０μＬを加え、５００ｇで３分間、４℃で遠心する洗浄を３回行い、ＰＢＳ５００μＬに懸濁し、ＦＣＭチューブに移した。死細胞を除くため測定直前にＰＩ１００μＬを添加し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて測定した。図３（Ａ）に示すように、４℃でインキュベートした場合に比べ、３７℃でインキュベートした場合においてモノクローナル抗体の結合による蛍光強度の減少が認められた。

また、蛍光強度の減少の要因が、インキュベート間に抗原と結合したモノクローナル抗体が抗原から剥がれたことではないことを確認するために、上記細胞ペレットに同様の方法でＰＥ−ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ Ｒａｔ ＩｇＧを反応させ、洗浄後、３７℃（インターナリゼーションが誘導される温度）または４℃（インターナリゼーションが誘導されない温度）で、それぞれ１時間インキュベートした。洗浄後、同様にＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにて測定した。図３（Ｂ）に示すように、４℃でインキュベートした場合と３７℃でインキュベートした場合とで蛍光強度の差は認められなかった。

これらの結果から、モノクローナル抗体が抗原に結合することによって、細胞表面上の抗原−抗体複合体が減少、即ちインターナリゼーションが生じたことが示された。

実施例２〜４に示されるように、本発明の抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８抗体は、これまでに報告されている抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８抗体と比較してＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域に対する顕著により優れた結合性を有し、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体を発現する細胞に対する細胞障害活性も優れている。

産業上の利用分野

本発明は、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を高発現する腫瘍細胞のアポトーシス誘導、またはＬＡＴ１／ＣＤ９８を高発現する腫瘍細胞で特徴付けられる腫瘍の病態解析、予防、治療等に有用である。

配列番号：７ ＬＧ９１１１軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）
配列番号：８ ＬＧ９１１１軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）
配列番号：９ ＬＧ９１１１軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）
配列番号：１０ ＬＧ９１１１重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）
配列番号：１１ ＬＧ９１１１重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）
配列番号：１２ ＬＧ９１１１重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）
配列番号：１３ ＬＧ９１１２軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）
配列番号：１４ ＬＧ９１１２軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）
配列番号：１５ ＬＧ９１１２軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）
配列番号：１６ ＬＧ９１１２重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）
配列番号：１７ ＬＧ９１１２重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）
配列番号：１８ ＬＧ９１１２重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）
配列番号：１９ ＬＧ９１１３軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）
配列番号：２０ ＬＧ９１１３軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）
配列番号：２１ ＬＧ９１１３軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）
配列番号：２２ ＬＧ９１１３重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）
配列番号：２３ ＬＧ９１１３重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）
配列番号：２４ ＬＧ９１１３重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）
配列番号：２５ ＬＧ９１１４軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）
配列番号：２６ ＬＧ９１１４軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）
配列番号：２７ ＬＧ９１１４軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）
配列番号：２８ ＬＧ９１１４重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）
配列番号：２９ ＬＧ９１１４重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）
配列番号：３０ ＬＧ９１１４重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）
配列番号：３１ ＬＧ９１１１軽鎖可変領域
配列番号：３２ ＬＧ９１１１重鎖可変領域
配列番号：３３ ＬＧ９１１２軽鎖可変領域
配列番号：３４ ＬＧ９１１２重鎖可変領域
配列番号：３５ ＬＧ９１１３軽鎖可変領域
配列番号：３６ ＬＧ９１１３重鎖可変領域
配列番号：３７ ＬＧ９１１４軽鎖可変領域
配列番号：３８ ＬＧ９１１４重鎖可変領域

Claims (23)

1. ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞のＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片であって、
   （１）配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、および
   配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
   （２）配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、および
   配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
   （３）配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、および
   配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、または（４）配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、および
   配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、を含有する、抗体もしくはその抗原結合断片。
2. ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞に対する細胞障害活性および／またはインターナリゼーション活性を有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
3. サブクラスがＩｇＧである、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
4. 前記ＩｇＧが、ＩｇＧ_２ａまたはＩｇＧ_１である、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
5. 前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、それらのダイマー、ミニボディ（ｍｉｎｏｂｏｄｉｅｓ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、およびマルチマー、または二重特異性抗体断片である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
6. モノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
7. ラット、マウス、霊長類、またはヒト抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
8. キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と少なくとも１つの細胞毒性薬、抗腫瘍剤または放射性同位体を含んでなるイムノコンジュゲート。
10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
11. 請求項１０に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
12. 請求項１０に記載の核酸分子を含むかまたは該核酸分子を導入した、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞または遺伝子導入細胞。
13. 請求項１２に記載の細胞を培養し、得られる培養物からＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体に特異的に結合する抗体を採取することを含む、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
14. 請求項１２に記載の細胞から抗ＬＡＴ１／ＣＤ９８モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主（ヒトを除く）に導入して前記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清または宿主の分泌物からＬＡＴ１／ＣＤ９８の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体を採取することを含む、ＬＡＴ１／ＣＤ９８の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
15. 前記宿主が、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物（ヒトを除く）細胞、植物細胞、または哺乳動物（ヒトを除く）である、請求項１４に記載の製造方法。
16. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片またはイムノコンジュゲートを含有する組成物であって、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞に適用して該細胞のアポトーシスを誘導するために使用する、組成物。
17. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片またはイムノコンジュゲートを含有する、ＬＡＴ１／ＣＤ９８をその細胞表面に発現する腫瘍細胞によって特徴付けられる腫瘍の予防または治療のための医薬。
18. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片またはイムノコンジュゲートを含有する組成物であって、ＬＡＴ１／ＣＤ９８を発現する細胞を検出するために使用する、組成物。
19. 請求項１８の組成物と、生体から採取された試料とを反応させ、反応したシグナルを検出することを特徴とする、腫瘍の検出方法。
20. 請求項１８の組成物を癌細胞と接触する工程を含む試験管内の腫瘍の免疫検出方法。
21. 請求項１８の組成物を投与された個体において、近赤外光イメージング、ＰＥＴ、ＭＲＩまたは超音波イメージングによって得られる検出映像を得る工程を含む生体内で腫瘍の映像化方法。
22. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片またはイムノコンジュゲートを含有する、ＬＡＴ１／ＣＤ９８をその細胞表面に発現する腫瘍細胞によって特徴付けられる腫瘍の診断のための医薬。
23. 前記腫瘍が、大腸癌、肺癌、または子宮頸癌である、請求項１７または請求項２２に記載の医薬。