JP2011024537A - トランスポーターに対する抗体およびその用途 - Google Patents
トランスポーターに対する抗体およびその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011024537A JP2011024537A JP2009176315A JP2009176315A JP2011024537A JP 2011024537 A JP2011024537 A JP 2011024537A JP 2009176315 A JP2009176315 A JP 2009176315A JP 2009176315 A JP2009176315 A JP 2009176315A JP 2011024537 A JP2011024537 A JP 2011024537A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- antibody
- seq
- acid sequence
- cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 77
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 103
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 96
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 84
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 84
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 83
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 76
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 61
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 45
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 42
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 39
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 12
- 102000052922 Large Neutral Amino Acid-Transporter 1 Human genes 0.000 claims description 11
- 108091006232 SLC7A5 Proteins 0.000 claims description 11
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 claims description 3
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000172 Medulloblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000003445 Mouth Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 3
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000009565 Pharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010034811 Pharyngeal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims description 3
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 claims description 3
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010062129 Tongue neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006593 Urologic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 claims description 3
- 201000006828 endometrial hyperplasia Diseases 0.000 claims description 3
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002222 hemangioblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010023841 laryngeal neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000015347 renal cell adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 3
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000009657 thyroid sarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000006134 tongue cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000003163 Cavernous Hemangioma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004404 Neurofibroma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 14
- 101000605020 Homo sapiens Large neutral amino acids transporter small subunit 1 Proteins 0.000 abstract description 8
- 102000057630 human SLC7A5 Human genes 0.000 abstract description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 12
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 11
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 11
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 11
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 6
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 102100033400 4F2 cell-surface antigen heavy chain Human genes 0.000 description 2
- 102000034263 Amino acid transporters Human genes 0.000 description 2
- 108050005273 Amino acid transporters Proteins 0.000 description 2
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102100038204 Large neutral amino acids transporter small subunit 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010036505 Neutral Amino Acid Transport Systems Proteins 0.000 description 2
- 102000012106 Neutral Amino Acid Transport Systems Human genes 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 2
- 108091006313 SLC3A2 Proteins 0.000 description 2
- 101100462087 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) LAT1 gene Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229940093430 polyethylene glycol 1500 Drugs 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- HHLJUSLZGFYWKW-UHFFFAOYSA-N triethanolamine hydrochloride Chemical compound Cl.OCCN(CCO)CCO HHLJUSLZGFYWKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005946 Acidic Amino Acid Transport Systems Human genes 0.000 description 1
- 108010005990 Acidic Amino Acid Transport Systems Proteins 0.000 description 1
- 108010055672 Amino Acid Transport System L Proteins 0.000 description 1
- 102000000325 Amino Acid Transport System L Human genes 0.000 description 1
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108700003861 Dominant Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009905 Neurofibromatoses Diseases 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- HCBIBCJNVBAKAB-UHFFFAOYSA-N Procaine hydrochloride Chemical compound Cl.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 HCBIBCJNVBAKAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102400001107 Secretory component Human genes 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- XUQZEVMFWFYTBT-UHFFFAOYSA-N amino hydroxy sulfate Chemical compound NOS(=O)(=O)OO XUQZEVMFWFYTBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004637 bakelite Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- XFLVBMBRLSCJAI-UHFFFAOYSA-N biotin amide Natural products N1C(=O)NC2C(CCCCC(=O)N)SCC21 XFLVBMBRLSCJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001876 chaperonelike Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 201000009274 endometriosis of uterus Diseases 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Chemical group 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 201000004931 neurofibromatosis Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 1
- 229960001309 procaine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【課題】ヒトLAT1に結合でき、癌細胞に対して特異的に抗体依存性細胞障害を誘導する新規な抗体を有効成分として含有する、現在治療困難な固形腫瘍をはじめとした各種悪性腫瘍の予防または治療剤の提供。
【解決手段】ヒトLAT1に対する抗体および該抗体を含む腫瘍の予防または治療剤。
【選択図】なし
【解決手段】ヒトLAT1に対する抗体および該抗体を含む腫瘍の予防または治療剤。
【選択図】なし
Description
本発明は、LAT1細胞外領域に特異的に結合し、直接的にアミノ酸輸送活性を阻害、あるいはリンパ球と共同して間接的に細胞障害性因子を誘導することで腫瘍細胞を細胞死へと導く抗LAT1モノクローナル抗体およびその用途に関する。
生物は生命の維持活動に必要な栄養素やシグナル伝達物質等を取得するために種々の機構を有しており、個々の細胞膜上に多様に存在する輸送体や受容体はその一例である。中でも生体を構成する主要要素であるアミノ酸の輸送については、1960年代から研究がなされてきた。1990年に入ってからアミノ酸輸送を担う分子が同定され始め、現在ではおよそ30種類ほど支配遺伝子が同定されている。これら輸送体は輸送するアミノ酸の性質によって、塩基性アミノ酸輸送体、中性アミノ酸輸送体、酸性アミノ酸輸送体の3種に大別されるが、ヘテロ2量体型アミノ酸輸送体は以下で述べるLAT1を含め6種類である。
LAT1は他の輸送体に対し比較的広い基質選択性を持つ、ナトリウム非依存的な中性アミノ酸輸送体である。1998年にクローニングされた12回膜貫通型のタンパク質で、細胞膜表面に存在する。1回膜貫通タンパク質の4F2hc(CD98)とジスルフィド結合することでヘテロ二量体を形成し、アミノ酸輸送の活性を示す6種類のCD98lcのうちの一つである。4F2hcは特定の輸送体に連結して細胞膜まで移行させるシャペロン様分子である(例えば、金井好克, 蛋白質 核酸 酵素 Vol.46, No.5, pp.629−637, 2001(非特許文献1))。
現在までにLAT1が腫瘍細胞において高発現しているという事例が多数報告されている(Yanagida et al., Biochimica et Biophysica Acta Vol.1514, pp. 291−302, 2001(非特許文献2)、Ohno et al., Cancer Sci. Vol.99, No.5, pp.1000−1007, 2008(非特許文献3)、Kaira et al., Cancer Sci. Vol.99, No.12, pp.2380−2386, 2008(非特許文献4)、Kaira et al., Cancer Sci. Vol.100, No.2, pp.249−254, 2009(非特許文献5))。アミノ酸は細胞増殖において不可欠な物質であり、無秩序に増殖を繰り返す腫瘍細胞は通常より多くのアミノ酸を必要とすると考えられる。そのため、正常細胞よりも腫瘍細胞においてアミノ酸輸送体の発現量が増加しているものと推測される。従ってLAT1は腫瘍の治療における標的分子として有用であることが示唆される。
金井好克, 蛋白質 核酸 酵素 Vol.46, No.5, pp.629−637, 2001
Yanagida et al., Biochimica et Biophysica Acta Vol.1514, pp. 291−302, 2001
Ohno et al., Cancer Sci. Vol.99, No.5, pp.1000−1007, 2008
Kaira et al., Cancer Sci. Vol.99, No.12, pp.2380−2386, 2008
Kaira et al., Cancer Sci. Vol.100, No.2, pp.249−254, 2009
LAT1特異的に結合し活性を阻害する、あるいは細胞障害を誘導するモノクローナル抗体は分子標的薬として有望であると考えられるが、抗体医薬の性質上、LAT1の細胞外領域を認識する抗体である必要がある。しかし、数々の試みにも拘らずこれまでのところLAT1の細胞外領域をエピトープとする抗体は取得できていなかった。
したがって、LAT1の細胞外領域をエピトープとする抗体が求められている。
このような状況に鑑み、本発明は、腫瘍細胞特異的に高発現の見られるLAT1の細胞外領域を認識し、その活性を阻害あるいは細胞障害性因子を誘導することで腫瘍細胞を細胞死へと導くモノクローナル抗体を提供する。本発明者らは作製の極めて困難であったLAT1細胞外領域を認識するモノクローナル抗体を世界で初めて作製し、該抗体が細胞障害誘導活性を有することを確認した。
本発明者らは、GFP融合LAT1を強制発現させた細胞を免疫原に用いてハイブリドーマを作製し、該細胞に特異的に反応するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を樹立し、該ハイブリドーマを動物に投与して腹水化して高濃度の抗体を採取、精製することによりモノクローナル抗体を得た。これを用いてFACS解析を行い、該モノクローナル抗体がLAT1細胞外領域に反応することを見出した。
すなわち、本発明は、以下を提供する。
[1]LAT1の細胞外領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
[2]LAT1を発現する細胞のLAT1に結合し、上記細胞に対する細胞障害活性を有する、上記[1]に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[3]上記抗体またはその抗原結合断片が、:
(1)(i)配列番号:1のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号1の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)(i)配列番号:2のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号2の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、
(3)(i)配列番号:3のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号3の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
(4)(i)配列番号:4のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号4の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)(i)配列番号:5のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号5の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および
(6)(i)配列番号:6のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号6の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、
のうちの少なくとも1つを含む、上記[1]または[2]に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[4]上記抗体またはその抗原結合断片が、
(1)(i)配列番号:1のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号1の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)(i)配列番号:2のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号2の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、および
(3)(i)配列番号:3のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号3の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
を含む少なくとも1つの軽鎖、ならびに
(4)(i)配列番号:4のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号4の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)(i)配列番号:5のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号5の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および
(6)(i)配列番号:6のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号6の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、
を含む少なくとも1つの重鎖
を含む、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[5]サブクラスがIgGである、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[6]上記IgGが、IgG1である、上記[5]に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[7]上記抗原結合断片が、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、dsFv、ds−scFv、それらのダイマー、ミニボディ(minobodies)、ダイアボディ(diabodies)、およびマルチマー、または二重特異性抗体断片である、上記[1]〜[6]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[8]モノクローナル抗体である、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[9]ラット、マウス、霊長類、またはヒト抗体である、上記[1]〜[8]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[10]キメラ抗体またはヒト化抗体である、上記[1]〜[8]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[11]受領番号FERM AP−21823で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[1]LAT1の細胞外領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
[2]LAT1を発現する細胞のLAT1に結合し、上記細胞に対する細胞障害活性を有する、上記[1]に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[3]上記抗体またはその抗原結合断片が、:
(1)(i)配列番号:1のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号1の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)(i)配列番号:2のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号2の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、
(3)(i)配列番号:3のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号3の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
(4)(i)配列番号:4のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号4の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)(i)配列番号:5のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号5の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および
(6)(i)配列番号:6のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号6の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、
のうちの少なくとも1つを含む、上記[1]または[2]に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[4]上記抗体またはその抗原結合断片が、
(1)(i)配列番号:1のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号1の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)(i)配列番号:2のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号2の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、および
(3)(i)配列番号:3のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号3の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
を含む少なくとも1つの軽鎖、ならびに
(4)(i)配列番号:4のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号4の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)(i)配列番号:5のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号5の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および
(6)(i)配列番号:6のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号6の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、
を含む少なくとも1つの重鎖
を含む、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[5]サブクラスがIgGである、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[6]上記IgGが、IgG1である、上記[5]に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[7]上記抗原結合断片が、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、dsFv、ds−scFv、それらのダイマー、ミニボディ(minobodies)、ダイアボディ(diabodies)、およびマルチマー、または二重特異性抗体断片である、上記[1]〜[6]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[8]モノクローナル抗体である、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[9]ラット、マウス、霊長類、またはヒト抗体である、上記[1]〜[8]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[10]キメラ抗体またはヒト化抗体である、上記[1]〜[8]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[11]受領番号FERM AP−21823で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[12]上記[1]〜[11]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
[13]上記[12]に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
[14]上記[12]に記載の核酸分子を含む、ハイブリドーマ細胞。
[15]上記[1]〜[10]のいずれかに記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞。
[16]受領番号FERM AP−21823で特定されるハイブリドーマ細胞。
[13]上記[12]に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
[14]上記[12]に記載の核酸分子を含む、ハイブリドーマ細胞。
[15]上記[1]〜[10]のいずれかに記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞。
[16]受領番号FERM AP−21823で特定されるハイブリドーマ細胞。
[17]上記[14]〜[16]のいずれかに記載のハイブリドーマ細胞を培養し、得られる培養物からLAT1に特異的に結合する抗体を採取することを含む、LAT1の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
[18]上記[15]または[16]に記載のハイブリドーマ細胞から抗LAT1モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して上記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清または宿主の分泌物からLAT1の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体を採取することを含む、LAT1の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
[19]上記宿主が、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または哺乳動物である、上記[18]に記載の製造方法。
[18]上記[15]または[16]に記載のハイブリドーマ細胞から抗LAT1モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して上記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清または宿主の分泌物からLAT1の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体を採取することを含む、LAT1の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
[19]上記宿主が、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または哺乳動物である、上記[18]に記載の製造方法。
[20]上記[1]〜[11]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含有する組成物であって、LAT1を発現する細胞に適用して該細胞のアポトーシスを誘導するために使用する、組成物。
[21]上記[1]〜[11]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含有する、腫瘍の予防または治療のための医薬。
[22]上記腫瘍が、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、T細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、口腔癌、胆嚢癌、甲状腺癌、中皮腫、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される少なくとも1つである、上記[21]に記載の医薬。
[21]上記[1]〜[11]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含有する、腫瘍の予防または治療のための医薬。
[22]上記腫瘍が、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、T細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、口腔癌、胆嚢癌、甲状腺癌、中皮腫、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される少なくとも1つである、上記[21]に記載の医薬。
[23]以下の(1)〜(6)からなる群から選択される単離された相補性決定領域(CDR):
(1)配列番号:1のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)配列番号:2のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、
(3)配列番号:3のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
(4)配列番号:4のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)配列番号:5のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および
(6)配列番号:6のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)。
(1)配列番号:1のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)配列番号:2のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、
(3)配列番号:3のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
(4)配列番号:4のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)配列番号:5のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および
(6)配列番号:6のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)。
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、LAT1を特異的に認識し、LAT1の活性を阻害またはLAT1発現細胞において細胞障害性因子を誘導し、その細胞死を引き起こすことができる。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、LAT1の細胞外領域を特異的に認識することができることから、抗癌抗体医薬として特に有用である。本発明は、これまで取得することが非常に困難であったLAT1の細胞外領域を特異的に認識する抗体を提供する点で、格別顕著な効果を奏する。
1.LAT1の細胞外領域を特異的に認識する抗体
本発明は、1つの実施形態において、LAT1の細胞外領域に特異的に結合する抗体(本明細書中、「抗LAT1抗体」と呼ぶこともある。)およびその抗原結合断片を提供する。すなわち、本発明は、LAT1の細胞外領域のアミノ酸配列の一部または全部をエピトープとする抗体およびその抗原結合断片を提供する。
本発明は、1つの実施形態において、LAT1の細胞外領域に特異的に結合する抗体(本明細書中、「抗LAT1抗体」と呼ぶこともある。)およびその抗原結合断片を提供する。すなわち、本発明は、LAT1の細胞外領域のアミノ酸配列の一部または全部をエピトープとする抗体およびその抗原結合断片を提供する。
本発明の抗体およびその抗原結合断片は、典型的には、LAT1を発現する細胞(例:腫瘍細胞)に発現しているLAT1に結合し、LAT1の活性を阻害するかまたは細胞障害性因子を誘導して、その細胞を細胞死(アポトーシス)に至らしめることができる。
アミノ酸輸送系Lの第一のアイソフォームである「ヒトLAT1(L−type amino acid tranpsorter 1)」は、507アミノ酸残基からなる12回膜貫通型の膜タンパク質である。ヒトLAT1のアミノ酸配列、mRNA配列等の情報は、それぞれAAD20464、AF104032等のアクセッション番号でGenBank等の公にアクセス可能なデータベースから入手することができる。また、マウスや他の哺乳動物(例えば、ラット、ウシなど)のLAT1も同様に、公にアクセス可能なデータベースから入手することができる。
本明細書中、単に「LAT1」という場合、LAT1タンパク質のことを指すものとする。場合によっては、LAT1タンパク質をコードする遺伝子(または単にLAT1遺伝子)を単にLAT1と呼ぶ場合もありうるが、その場合には当業者にとっては文脈からLAT1遺伝子を指すことが明らかであろう。本明細書中、LAT1は、典型的には、ヒトLAT1であるが、ヒト以外の哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウシなど)のLAT1であってもよい。
本明細書中、「LAT1の細胞外領域」とは、細胞表面にLAT1が発現された場合に、細胞膜の細胞質とは反対側(すなわち、細胞の外側)の細胞表面に露出するLAT1の領域をいい、UniProt等の公にアクセス可能なデータベースでは、例えば、71位〜83位のアミノ酸残基、141位〜145位のアミノ酸残基、191位〜198位のアミノ酸残基、264位〜273位のアミノ酸残基、340位〜395位のアミノ酸残基、452位〜457位のアミノ酸残基にわたる領域がそれに該当するとアミノ酸配列から予測されている。本発明の抗体またはその抗原結合断片が、LAT1の細胞外領域に結合しているか否かは、例えば、本願明細書の実施例2に記載されるように、LAT1強制発現細胞やヒトがん細胞株を用いたFACS解析によって確認することができる。
本明細書中、抗体またはその抗原結合断片が、LAT1の細胞外領域に「特異的に結合する」とは、その抗体または抗原結合断片が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、これらの領域の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能なほどに高い親和性を意味し、典型的には、結合定数(Ka)が少なくとも107M−1、好ましくは、少なくとも108M−1、より好ましくは、109M−1、さらにより好ましくは、1010M−1、1011M−1、1012M−1またはそれより高い、例えば、最高で1013M−1またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。
本明細書中、「抗体」は、インタクトな免疫グロブリンの全てのクラスおよびサブクラスを含むものとする。好ましくは、本発明の抗体は、IgGサブクラスのものであり、より好ましくは、ヒトIgG1サブクラスのものである。「抗体」は、特に、モノクローナル抗体を含む。
本明細書中、「抗原結合断片」は、インタクトな、および/またはヒト化された、および/またはキメラな抗体の抗原結合領域または可変領域を有するフラグメント、たとえば、上記抗体のFab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ScFvフラグメントを含む。従来、こうしたフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解によって、たとえばパパイン分解によって(たとえば、国際公開WO94/29348を参照)作製されているが、遺伝子組換えによる形質転換宿主細胞から直接産生させることもできる。ScFvの作製については、Birdら、(1988) Science, 242, 423−426に記載の方法が使用できる。さらに、抗体フラグメントは、下記のさまざまな遺伝子工学技術を用いて作製することができる。
Fvフラグメントは、その2つの鎖の相互作用エネルギーがFabフラグメントより低いと思われる。VHおよびVLドメインの結合を安定化するために、これらのドメインは、ペプチド(Birdら、(1988) Science 242, 423−426、Hustonら、PNAS, 85, 5879−5883)、ジスルフィド架橋(Glockshuberら、(1990) Biochemistry, 29, 1362−1367)、および「knob in hole」変異(Zhuら、(1997), Protein Sci., 6, 781−788)によって連結されている。ScFvフラグメントは、当業者によく知られている方法によって作製することができる(Whitlowら、(1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97−105およびHustonら、(1993) Int.Rev.Immunol 10, 195−217を参照)。ScFvは、大腸菌(E. coli)などの細菌細胞内で産生させることができるが、真核細胞内で産生させる方が好ましい。ScFvの不利な点は、産物が一価であること、そのために多価結合による結合力の増加が不可能になること、ならびに半減期が短いことである。こうした問題を克服するための試みには、二価(ScFv’)2があるが、これは、追加のC末端システインを含有するScFvから、化学的カップリングによって(Adamsら、(1993) Can.Res 53, 4026−4034、およびMcCartneyら、(1995) Protein Eng. 8, 301−314)、または不対C末端システイン残基を含有するScFvの、自然発生的な部位特異的二量体化によって(Kipriyanovら、(1995) Cell. Biophys 26, 187−204を参照)作製される。あるいはまた、ペプチドリンカーを3〜12残基に短縮して「ダイアボディ(diabody)」を形成することによって、ScFvに多量体を形成させることができる。Holligerら、PNAS (1993), 90, 6444−6448を参照。リンカーをさらに小さくすることで、ScFv三量体(「トリアボディ」、Korttら、(1997) Protein Eng, 10, 423−433を参照)および四量体(「テトラボディ」、Le Gallら、(1999) FEBS Lett, 453, 164−168を参照)をもたらすことができる。二価ScFv分子の構築は、「ミニ抗体(miniantibody)」(Packら、(1992) Biochemistry 31, 1579−1584を参照)および「ミニボディ」(Huら、(1996), Cancer Res. 56, 3055−3061を参照)を形成することができるタンパク質二量体化モチーフとの遺伝子融合によっても、達成することができる。ScFv−ScFvタンデム((ScFv)2)は、第3のペプチドリンカーによって2つのScFv単位を連結することによって作製することもできる(Kuruczら、(1995) J.Immol.154, 4576−4582を参照)。二重特異性ダイアボディは、ある抗体のVLドメインに短いリンカーで連結された、別の抗体由来のVHドメインからなる、2つの一本鎖融合産物の非共有結合によって作製することができる(Kipriyanovら、(1998), Int. J. Can 77, 763−772を参照)。このような二重特異性ダイアボディの安定性は、ジスルフィド架橋、もしくは上記の「knob in hole」変異を導入することによって、または2つのハイブリッドScFvフラグメントがペプチドリンカーを介して連結される、一本鎖ダイアボディ(ScDb)を形成することによって、高めることができる(Kontermannら、(1999) J. Immunol. Methods 226 179−188を参照)。四価の二重特異性分子は、たとえば、ScFvフラグメントを、IgG分子のCH3ドメインに、またはヒンジ領域を介してFabフラグメントに、融合することによって得られる(Colomaら、(1997) Nature Biotechnol. 15, 159−163を参照)。あるいはまた、四価の二重特異性分子は、二重特異性一本鎖ダイアボディの融合によって作製されている(Altら、(1999) FEBS Lett 454, 90−94を参照)。より小さい四価の二重特異性分子は、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフ含有リンカーによるScFv−ScFvタンデムの二量体化(DiBiミニ抗体、Mullerら、(1998) FEBS Lett 432, 45−49を参照)、または分子内対合を妨げる配向で4つの抗体可変領域(VHおよびVL)を含む一本鎖分子の二量体化(タンデムダイアボディ、Kipriyanovら、(1999) J.Mol.Biol. 293, 41−56を参照)のいずれかによって、作製することもできる。二重特異性F(ab’)2フラグメントは、Fab’フラグメントの化学的カップリングによって、またはロイシンジッパーによるヘテロ二量体化によって作製することができる(Shalabyら、(1992) J.Exp.Med. 175, 217−225、およびKostelnyら、(1992), J.Immunol. 148, 1547−1553を参照)。また、単離されたVHおよびVLドメイン(Domantis plc)も利用できる。
本明細書中、「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体(または抗体断片)を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。概して異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性の他に、ハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンによる混入がないという点で、モノクローナル抗体は有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示すものであって、ある特定の方法による抗体の産生を必要とすることを意味するためのものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256: 495 [1975]に最初に記載されたハイブリドーマ法によって作成してもよいし、組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号参照)によって作成してもよい。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352: 624−628 [1991]およびMarks等, J. Mol. Biol., 222: 581−597 (1991) に記載された技術を用いて、ファージ抗体ライブラリから単離した抗体断片(Fvクローン)を含む抗原認識および結合部位のクローンを含む。
「モノクローナル抗体」は、「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を含み、それは、重鎖および/または軽鎖の一部が特定の種から誘導されたまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導されたまたは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りにおいて、それらの抗体の断片の対応する配列と同一または相同である(Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851−6855 [1984])。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらの断片(例えば、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2あるいは抗体の他の抗原結合性配列)である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であって、そのレシピエントCDR由来の残基が、マウス、ラット、ウサギ、霊長類(例えば、サル)などのヒト以外の種のCDR(ドナー抗体)に由来する所望の特異性、親和性および容量を持つ残基で置換されている。ある場合は、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移植されるCDRまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精密かつ最適化するために施される。一般にヒト化抗体は、CDR領域の全てまたは実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域の全てまたは実質上全てがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全部を含有しうる。また、最適なヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含有しうる。
本明細書中、「LAT1の活性」とは、中性アミノ酸輸送活性、アミノ酸類似薬物輸送活性等を意味する。LAT1のアミノ酸輸送活性は、例えば、標識アミノ酸の細胞内取り込みによって測定することができる。「LAT1の活性を阻害する」とは、上記のLAT1の活性を顕著に低下させるかまたは除くことを意味する。「LAT1の活性を顕著に低下させるかまたは除く」とは、LAT1の生物学的活性の少なくとも5%またはそれ以上低下させることを意味する。
本明細書中、「細胞障害活性」とは、細胞に対して細胞障害を引き起こす能力を意味し、本発明の場合、LAT1発現細胞に本発明の抗体またはその抗原結合断片が特異的に結合して、該細胞に細胞障害性因子を誘導して、該細胞を細胞死またはアポトーシスに至らしめる能力をいうものとする。細胞障害活性は、例えば、本発明の実施例2に記載される方法で測定し、細胞障害率として評価することができる。
本明細書中、「細胞死」は「アポトーシス」を意味する。「アポトーシス」は、個体発生のプログラム、デス因子刺激、放射線などによる染色体DNAの重度の損傷、異常タンパク質の蓄積などによる重度の処方体ストレスなどさまざまな生理的、病理的要因により誘導される機能的、能動的な細胞死の典型であり、細胞体や核の膨潤を伴う壊死(ネクローシス)とは逆に、細胞体や核の収縮や断片化が起こる。
本発明の抗体またはその抗原結合断片の例としては、
(1)(i)配列番号:1のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号1の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)(i)配列番号:2のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号2の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、
(3)(i)配列番号:3のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号3の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
(4)(i)配列番号:4のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号4の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)(i)配列番号:5のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号5の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および
(6)(i)配列番号:6のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号6の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、
のうちの少なくとも1つを含む、抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
(1)(i)配列番号:1のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号1の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)(i)配列番号:2のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号2の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、
(3)(i)配列番号:3のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号3の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
(4)(i)配列番号:4のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号4の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)(i)配列番号:5のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号5の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および
(6)(i)配列番号:6のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号6の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、
のうちの少なくとも1つを含む、抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
本明細書中、「1個または数個のアミノ酸残基の変異」とは、元となるアミノ酸配列中の1個または数個(例えば、2個、3個、4個、5個)のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、または付加されていることを意味する。本明細書中、そのような変異を元となるアミノ酸配列中の対応する位置に有するアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合断片は、元となるアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合断片と同等の生物学的活性を有する。ここで、「同等の生物学的活性」としては、(i)元となるアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合断片が特異的に結合する抗原に対して特異性をもって結合する能力、(ii)LAT1のアミノ酸輸送活性に対する阻害能力、(iii)LAT1発現細胞上のLAT1に結合した場合における、該細胞に対する細胞障害活性、または(iv)これらのいずれか2つ以上もしくは全てが挙げられる。最も好ましくは、「同等の生物学的活性」とは、上記(iv)を意味する。また、上記の「1個または数個のアミノ酸残基の変異」における変異したアミノ酸残基の数の上限は、このような同等の特異性を保持することができるか否かという基準(criteria)によって制限される。
本発明の抗体またはその抗原結合断片のより好ましい例としては、
(1)(i)配列番号:1のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号1の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)(i)配列番号:2のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号2の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、および
(3)(i)配列番号:3のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号3の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
を含む少なくとも1つの軽鎖、ならびに
(4)(i)配列番号:4のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号4の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)(i)配列番号:5のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号5の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および
(6)(i)配列番号:6のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号6の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、
を含む少なくとも1つの重鎖
を含む、抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
(1)(i)配列番号:1のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号1の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)(i)配列番号:2のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号2の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、および
(3)(i)配列番号:3のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号3の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
を含む少なくとも1つの軽鎖、ならびに
(4)(i)配列番号:4のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号4の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)(i)配列番号:5のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号5の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および
(6)(i)配列番号:6のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号6の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、
を含む少なくとも1つの重鎖
を含む、抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
本発明の抗体またはその抗原結合断片の最も好ましい例としては、茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに2009年6月23日付で寄託された、受領番号FERM AP−21823で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
2.本発明の抗体をコードする核酸
本発明は、別の実施形態において、LAT1の細胞外領域に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子を提供する。核酸分子は、RNAまたはDNAである。本発明の核酸分子は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を作製するために使用することができる。
本発明は、別の実施形態において、LAT1の細胞外領域に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子を提供する。核酸分子は、RNAまたはDNAである。本発明の核酸分子は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を作製するために使用することができる。
したがって、これに関連する本発明の別の実施形態では、本発明のハイブリドーマ細胞から抗LAT1モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して前記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清または宿主の分泌物からLAT1の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体を採取することを含む、LAT1の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法が提供される。
本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードするDNAは、常法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)容易に分離されて、配列決定される。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい供給源となる。一旦分離されると、組換え宿主細胞でモノクローナル抗体を合成するために、このDNAを発現ベクターへ挿入し、それをこの状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、ヒトHEK293胎児腎由来細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞へトランスフェクトしうる。例えば、相同的なマウス配列をヒト重鎖および軽鎖定常ドメインの配列で置換することによって(Morrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6851[1984])、または免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を共有結合させることによって、このDNAを修飾しうる。本発明の抗LAT1モノクローナル抗体の結合特異性を有するように、「キメラ」または「ハイブリッド」抗体は調製される。
3.本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞
本発明はさらに別の実施形態において、LAT1の細胞外領域に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片を産生するハイブリドーマ細胞を提供する。本発明はまた、LAT1の細胞外領域に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片をコードする核酸分子を含有するハイブリドーマを提供する。最も好ましい本発明のハイブリドーマ細胞としては、茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに2009年6月23日付で寄託された、受領番号FERM AP−21823で特定されるハイブリドーマ細胞が挙げられる。
本発明はさらに別の実施形態において、LAT1の細胞外領域に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片を産生するハイブリドーマ細胞を提供する。本発明はまた、LAT1の細胞外領域に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片をコードする核酸分子を含有するハイブリドーマを提供する。最も好ましい本発明のハイブリドーマ細胞としては、茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに2009年6月23日付で寄託された、受領番号FERM AP−21823で特定されるハイブリドーマ細胞が挙げられる。
本発明のハイブリドーマ細胞の調製は、具体的には、以下のように行うことができるが、この方法に限定されるわけではない。
(1)抗原の調製
抗LAT1モノクローナル抗体を作製するために必要な抗原としては、LAT1を産生する細胞あるいはその細胞画分、またはLAT1をコードするDNAにより形質転換された宿主細胞、すなわち、大腸菌などの原核性宿主細胞および昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核性宿主細胞中に、LAT1をコードするcDNAの全長または部分断片を公知の方法を用いて組み込み、そのままあるいは融合蛋白として発現、精製された蛋白質、さらには、ペプチド合成機を用いて合成されたLAT1の部分ペプチド等を用いることができる。
抗LAT1モノクローナル抗体を作製するために必要な抗原としては、LAT1を産生する細胞あるいはその細胞画分、またはLAT1をコードするDNAにより形質転換された宿主細胞、すなわち、大腸菌などの原核性宿主細胞および昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核性宿主細胞中に、LAT1をコードするcDNAの全長または部分断片を公知の方法を用いて組み込み、そのままあるいは融合蛋白として発現、精製された蛋白質、さらには、ペプチド合成機を用いて合成されたLAT1の部分ペプチド等を用いることができる。
(2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
6〜24週令のマウスまたはラットに、(1)に示した方法で作製された抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバントまたは、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原の投与は、1回目の投与の後2〜3週間おきに3〜7回行う。各投与後5〜10日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法(ELISA法):医学書院刊 1976年〕などで調べる。免疫に用いたペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源として供する。脾細胞を骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後3〜4日目に、免疫したマウスまたはラットより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓を血清無添加の基礎培地(以下洗浄用培地という。)中で細断し、遠心分離して細胞を回収後、トリス−塩化アンモニウム緩衝液(pH7.65)で2〜3分間処理し赤血球の除去を行い、洗浄用培地で洗浄した後に融合用脾細胞として提供する。
6〜24週令のマウスまたはラットに、(1)に示した方法で作製された抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバントまたは、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原の投与は、1回目の投与の後2〜3週間おきに3〜7回行う。各投与後5〜10日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法(ELISA法):医学書院刊 1976年〕などで調べる。免疫に用いたペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源として供する。脾細胞を骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後3〜4日目に、免疫したマウスまたはラットより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓を血清無添加の基礎培地(以下洗浄用培地という。)中で細断し、遠心分離して細胞を回収後、トリス−塩化アンモニウム緩衝液(pH7.65)で2〜3分間処理し赤血球の除去を行い、洗浄用培地で洗浄した後に融合用脾細胞として提供する。
(3)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、8−アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1(P3−U1)〔Current Topics in Microbiology and Immunology−1、European J. Immunology, 6, 511−519(1976)〕、SP2/O−Ag14(SP−2)〔Nature 276, 269−270 (1978)〕、P3−X63−Ag8653(653)〔J.Immunology 123, 1548−1550 (1979)〕、P3−X63−Ag8(X63)〔Nature 256, 495−497 (1975)〕などが用いられる。これらの細胞株は、8−アザグアニン培地〔RPMI−1640培地にグルタミン(1.5mM)、2−メルカプトエタノール(5×10−5M)、ジェンタマイシン(10μg/ml)および牛胎児血清(FCS)を10%加えた培地(以下、正常培地という。)に、さらに8−アザグアニン(15μg/ml)を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日2×107個以上の細胞数を確保する。
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、8−アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1(P3−U1)〔Current Topics in Microbiology and Immunology−1、European J. Immunology, 6, 511−519(1976)〕、SP2/O−Ag14(SP−2)〔Nature 276, 269−270 (1978)〕、P3−X63−Ag8653(653)〔J.Immunology 123, 1548−1550 (1979)〕、P3−X63−Ag8(X63)〔Nature 256, 495−497 (1975)〕などが用いられる。これらの細胞株は、8−アザグアニン培地〔RPMI−1640培地にグルタミン(1.5mM)、2−メルカプトエタノール(5×10−5M)、ジェンタマイシン(10μg/ml)および牛胎児血清(FCS)を10%加えた培地(以下、正常培地という。)に、さらに8−アザグアニン(15μg/ml)を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日2×107個以上の細胞数を確保する。
(4)細胞融合
(2)で免疫した抗体産生細胞と(3)で得られた骨髄腫細胞を洗浄用培地またはPBS(リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水1リットル、pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜10:1になるよう混合させる。細胞回収後、細胞をよくほぐし、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1,500(PEG−1,500)2g、洗浄用培地2mlおよびジメチルスルホキシド0.7mlの混液0.2〜1ml/108抗体産生細胞を加え、1〜2分間毎に洗浄用培地1〜2mlを数回加え、全量が50mlになるまで洗浄する。細胞回収後、ゆるやかに細胞をほぐしながら、HAT培地〔正常培地にヒポキサンチン(10−4M)、チミジン(1.5×10−5M)およびアミノプテリン(4×10−7M)を加えた培地〕100ml中に懸濁する。この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で7〜14日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり、例えば(5)に述べる酵素免疫測定法あるいはFACS(Fluorescence−Activated Cell Sortingの略)などを用いて、LAT1タンパク質に特異的に反応する抗体を選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを2回繰り返し〔1回目は、HT培地(HAT培地からアミノプテリンを除いた培地)、2回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗LAT1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
(2)で免疫した抗体産生細胞と(3)で得られた骨髄腫細胞を洗浄用培地またはPBS(リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水1リットル、pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜10:1になるよう混合させる。細胞回収後、細胞をよくほぐし、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1,500(PEG−1,500)2g、洗浄用培地2mlおよびジメチルスルホキシド0.7mlの混液0.2〜1ml/108抗体産生細胞を加え、1〜2分間毎に洗浄用培地1〜2mlを数回加え、全量が50mlになるまで洗浄する。細胞回収後、ゆるやかに細胞をほぐしながら、HAT培地〔正常培地にヒポキサンチン(10−4M)、チミジン(1.5×10−5M)およびアミノプテリン(4×10−7M)を加えた培地〕100ml中に懸濁する。この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で7〜14日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり、例えば(5)に述べる酵素免疫測定法あるいはFACS(Fluorescence−Activated Cell Sortingの略)などを用いて、LAT1タンパク質に特異的に反応する抗体を選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを2回繰り返し〔1回目は、HT培地(HAT培地からアミノプテリンを除いた培地)、2回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗LAT1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
したがって、これに関連する本発明の別の実施形態では、ハイブリドーマ細胞を培養し、得られる培養物からLAT1に特異的に結合する抗体を採取することを含む、LAT1の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法が提供される。
4.本発明の腫瘍の予防または治療のための医薬
本発明はまた、さらに別の実施形態において、上記の本発明の抗体またはその抗原結合断片を含有する、腫瘍の予防または治療のための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得る担体を含有する。
本発明はまた、さらに別の実施形態において、上記の本発明の抗体またはその抗原結合断片を含有する、腫瘍の予防または治療のための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得る担体を含有する。
後述の実施例に示されるように、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、LAT1を発現する細胞(例:腫瘍細胞)のLAT1の細胞外領域に特異的に結合して、LAT1の活性を阻害するか、または細胞障害因子を誘導し、該細胞を細胞死に至らしめることができる。したがって、本発明の抗体またはその抗原結合断片を含有する医薬組成物は、LAT1を細胞表面に発現する腫瘍細胞を死滅させるため、またはそのような細胞で特徴付けられる腫瘍および、同様の機序により生ずる疾患の予防または治療のために使用することができる。
上記「腫瘍」の例としては、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、T細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、口腔癌、胆嚢癌、甲状腺癌、中皮腫、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫、およびウィルムス腫瘍等が挙げられる。より好ましくは、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、膀胱癌、リンパ腫、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、および前立腺癌が挙げられる。本発明の抗体またはその抗原結合断片を医薬として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、水溶液もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用でき、また、該抗体をIgA化し、分泌成分を結合した後に必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に例えば、該抗体またはその抗原結合断片を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
「薬学的に許容し得る」という用語は、正常な医学的判断の範囲内で、合理的な利益/リスク比を有し、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、またはその他の問題もしくは合併症を示すことのない、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、化合物、材料、組成物、および/または剤形を指すために、本明細書において利用される。
本発明の腫瘍の予防または治療のための医薬組成物の投与経路は、周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、皮下、筋肉内、眼内、動脈内、脳内脊髄、または病巣内経路での注射または注入、または徐放系による。またさらに、該抗体またはその抗原結合断片を直接腫瘍部位へ投与する手段として、カテーテル等による投与等も可能である。
また、本発明の腫瘍の予防または治療のための医薬は、例えば、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、ヒトを含む哺乳動物に対して投与することができる。該抗体またはその抗原結合断片またはその塩の投与量は、投与対象、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、子宮内膜症患者または子宮腺筋症患者(60kgとして)においては、一日につき約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば60kgの患者に対して、一日につき約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を静脈注射により投与することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に記載するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
[実施例1]
(1)免疫原の調製
抗LAT1モノクローナル抗体を作製するために必要な抗原として、GFP融合LAT1発現ラット肝がん細胞株RH7777細胞株を樹立した。LAT1をコードするcDNAの全長を公知の方法を用いて組み込み融合蛋白として発現させ、発現が強いものを薬剤選択性および限界希釈法にて単一クローン化し安定発現株とした。
(1)免疫原の調製
抗LAT1モノクローナル抗体を作製するために必要な抗原として、GFP融合LAT1発現ラット肝がん細胞株RH7777細胞株を樹立した。LAT1をコードするcDNAの全長を公知の方法を用いて組み込み融合蛋白として発現させ、発現が強いものを薬剤選択性および限界希釈法にて単一クローン化し安定発現株とした。
(2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
ラットに、(1)に示した方法で作製された抗原を免疫して、その脾臓より抗体産生細胞を採取した。免疫は、ラットの皮下、腹腔、または静脈内に抗原としてGFP−LAT1発現RH7777細胞3×106個を投与することにより行った。抗原の投与は、1回目の投与の3週間後および6週間後に2回行った。脾細胞を骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原の最終投与後3日後に、免疫したラットより脾臓を摘出し脾細胞を採取した。脾臓を血清無添加の基礎培地(以下洗浄用培地という。)中で細断し、遠心分離して細胞を回収後、トリス−塩化アンモニウム緩衝液(pH7.65)で2〜3分間処理し赤血球の除去を行い、洗浄用培地で洗浄した後に融合用脾細胞として用いた。
ラットに、(1)に示した方法で作製された抗原を免疫して、その脾臓より抗体産生細胞を採取した。免疫は、ラットの皮下、腹腔、または静脈内に抗原としてGFP−LAT1発現RH7777細胞3×106個を投与することにより行った。抗原の投与は、1回目の投与の3週間後および6週間後に2回行った。脾細胞を骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原の最終投与後3日後に、免疫したラットより脾臓を摘出し脾細胞を採取した。脾臓を血清無添加の基礎培地(以下洗浄用培地という。)中で細断し、遠心分離して細胞を回収後、トリス−塩化アンモニウム緩衝液(pH7.65)で2〜3分間処理し赤血球の除去を行い、洗浄用培地で洗浄した後に融合用脾細胞として用いた。
(3)ハイブリドーマの作製
実施例1(2)で得られたマウスまたはラット脾細胞とマウス骨髄腫細胞株X63とを4:1の比率で混合し、1,200rpmで5分間遠心した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1500(PEG−1500)2g、DMEM培地2mlおよびジメチルスルホキシド0.7mlの混液を0.2〜1ml/108個マウス脾細胞の割合で加え、さらに1〜2分間毎にDMEM培地1〜2mlを数回加えた後、DMEM培地を加えて全量が50mlになるようにした。900rpmで5分間遠心し、上清を捨てHAT培地100ml中に細胞をゆるやかに懸濁した。この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で10〜14日間培養した。
実施例1(2)で得られたマウスまたはラット脾細胞とマウス骨髄腫細胞株X63とを4:1の比率で混合し、1,200rpmで5分間遠心した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1500(PEG−1500)2g、DMEM培地2mlおよびジメチルスルホキシド0.7mlの混液を0.2〜1ml/108個マウス脾細胞の割合で加え、さらに1〜2分間毎にDMEM培地1〜2mlを数回加えた後、DMEM培地を加えて全量が50mlになるようにした。900rpmで5分間遠心し、上清を捨てHAT培地100ml中に細胞をゆるやかに懸濁した。この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で10〜14日間培養した。
(4)抗体スクリーニング
実施例1(3)で得られたハイブリドーマ培養上清をGFP−LAT1トランスフェクタントと反応させ、FACS解析を行うことによりLAT1特異的抗体を産生しているかの1次スクリーニングを行った。FACSの反応は96ウェルプレートにて行った。トランスフェクタントを2.5×105〜3×106個/ウェルになるように50μlずつチューブに分注した。この細胞浮遊液にハイブリドーマの培養上清50μlを加え、氷冷化で60分反応させた。チューブに0.2%BSA−PBS200〜500μlを加え、190g、4℃で5分間遠心し上清を捨てる操作を3回繰り返して洗浄した後、2次抗体としてFITC標識抗ラット抗体を添加し遮光氷冷下で45分間反応させた。ウェルを遠心し洗浄した後0.2%BSA−PBS500μlに懸濁し、40μlのナイロンメッシュを通した。死細胞を除くために測定直前にDAPIを1mg/mlの濃度になるよう添加し、BDLSR(BectonDickinson)にて蛍光強度を測定した。陽性反応が得られたクローンを選別し、抗LAT1抗体産生ハイブリドーマ株を樹立した。
実施例1(3)で得られたハイブリドーマ培養上清をGFP−LAT1トランスフェクタントと反応させ、FACS解析を行うことによりLAT1特異的抗体を産生しているかの1次スクリーニングを行った。FACSの反応は96ウェルプレートにて行った。トランスフェクタントを2.5×105〜3×106個/ウェルになるように50μlずつチューブに分注した。この細胞浮遊液にハイブリドーマの培養上清50μlを加え、氷冷化で60分反応させた。チューブに0.2%BSA−PBS200〜500μlを加え、190g、4℃で5分間遠心し上清を捨てる操作を3回繰り返して洗浄した後、2次抗体としてFITC標識抗ラット抗体を添加し遮光氷冷下で45分間反応させた。ウェルを遠心し洗浄した後0.2%BSA−PBS500μlに懸濁し、40μlのナイロンメッシュを通した。死細胞を除くために測定直前にDAPIを1mg/mlの濃度になるよう添加し、BDLSR(BectonDickinson)にて蛍光強度を測定した。陽性反応が得られたクローンを選別し、抗LAT1抗体産生ハイブリドーマ株を樹立した。
(5)モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した8週令ヌード雄マウス(KSN)に実施例1(4)で得られたハイブリドーマ株を1×107細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。10〜15日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから腹水を採取し、2000rpmで5分間、4℃で遠心し、50%飽和硫酸アンモニウムにて塩析し、沈渣を溶かして10000gで10分間、4℃でした。プレフィルター、メンブランフィルター(0.22μm)を通過させた後、ProteinG(GEヘルスケア バイオサイエンス)を用いて液体クロマトグラフィーシステムAKTAにより精製し、抗LAT1モノクローナル抗体とした。
プリスタン処理した8週令ヌード雄マウス(KSN)に実施例1(4)で得られたハイブリドーマ株を1×107細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。10〜15日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから腹水を採取し、2000rpmで5分間、4℃で遠心し、50%飽和硫酸アンモニウムにて塩析し、沈渣を溶かして10000gで10分間、4℃でした。プレフィルター、メンブランフィルター(0.22μm)を通過させた後、ProteinG(GEヘルスケア バイオサイエンス)を用いて液体クロマトグラフィーシステムAKTAにより精製し、抗LAT1モノクローナル抗体とした。
[実施例2]
(1)免疫沈降によるモノクローナル抗体の特異性の検討
HeLa細胞に0.5mg/mL Sulfosuccinimidyl−6’−(biotinamide)−6−hexanamidehezanoate(EZ−Link Sulfo−NHS−LC−LC−Biotin, Pierce)-PBS(pH 8.0)溶液200μLを加え、室温で30分反応させ、細胞表面のビオチン標識を行った。HeLa細胞に3.0×107cells/mLとなるようにLysisBuffer[PBS containing 1% Nonidet P−40, protease inhibitor cocktail(ナカライテスク)およびbenzonase(Merck)]を加え、氷上で60分間インキュベートすることにより可溶化したのち、14,500rpmで20分間、4℃で遠心した上清を細胞可溶化物として免疫沈降に用いた。得られた細胞可溶化物にLGtra01−01産生モノクローナル抗体5μgを加えた後、二次抗体としてRabbit Anti−Rat Ig抗体(Sigma)5μgを加え、4℃で一時間反応させた。続いてProtein G Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare)の50%懸濁液を25μL加え、4℃にて終夜反応させた。Protein G Sepharoseに結合した抗原−抗体複合体をlysis bufferにて5回洗浄後、sample buffer(45mM Tris−HCl, pH6.8, 1% SDS, 50mM DTT, 10% glycerol,および0.01% BPB)と混合し、95℃で5分間処理することによりタンパクを溶出した。可溶化された細胞可溶化物はsample buffer(45mM Tris−HCl, pH 6.8, 1% SDS, 50mM DTT, 10% glycerol, and 0.01% BPB)と混合し、95℃で5分間処理した。separating gel[10% acrylamide/bis solution (29:1), 0.375M Tris−HCl (pH 8.8), 0.1% Sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.03%Amino peroxodisulfate (APS), 0.0005% N,N,N’,N’−tetramethoenediamine(TEMED)]とstacking gel [10% acrylamide/bis solution(29:1), 0.25M Tris−HCl(pH 8.8), 0.2% Sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.6% Amino peroxodisulfate (APS), 0.002% N,N,N’,N’−tetramethoenediamine (TEMED)]を用いて20mA定電流にて分離した。分離されたアクリルアミドゲルは、30分間1.5V定電圧にてPVDF膜(MILLIPORE)上に転写した。転写後、膜をblockingmilkで4℃、終夜ブロッキングした。細胞表面を標識したビオチンをElite ABC kit(VECTOR Laboratories)を用いて検出した。図2に示すように、LGtra01−01産生モノクローナル抗体はLAT1に反応した。LAT1の理論値は40Kダルトンで、実測値として35Kダルトン前後の特異的バンドとして認められた。
(1)免疫沈降によるモノクローナル抗体の特異性の検討
HeLa細胞に0.5mg/mL Sulfosuccinimidyl−6’−(biotinamide)−6−hexanamidehezanoate(EZ−Link Sulfo−NHS−LC−LC−Biotin, Pierce)-PBS(pH 8.0)溶液200μLを加え、室温で30分反応させ、細胞表面のビオチン標識を行った。HeLa細胞に3.0×107cells/mLとなるようにLysisBuffer[PBS containing 1% Nonidet P−40, protease inhibitor cocktail(ナカライテスク)およびbenzonase(Merck)]を加え、氷上で60分間インキュベートすることにより可溶化したのち、14,500rpmで20分間、4℃で遠心した上清を細胞可溶化物として免疫沈降に用いた。得られた細胞可溶化物にLGtra01−01産生モノクローナル抗体5μgを加えた後、二次抗体としてRabbit Anti−Rat Ig抗体(Sigma)5μgを加え、4℃で一時間反応させた。続いてProtein G Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare)の50%懸濁液を25μL加え、4℃にて終夜反応させた。Protein G Sepharoseに結合した抗原−抗体複合体をlysis bufferにて5回洗浄後、sample buffer(45mM Tris−HCl, pH6.8, 1% SDS, 50mM DTT, 10% glycerol,および0.01% BPB)と混合し、95℃で5分間処理することによりタンパクを溶出した。可溶化された細胞可溶化物はsample buffer(45mM Tris−HCl, pH 6.8, 1% SDS, 50mM DTT, 10% glycerol, and 0.01% BPB)と混合し、95℃で5分間処理した。separating gel[10% acrylamide/bis solution (29:1), 0.375M Tris−HCl (pH 8.8), 0.1% Sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.03%Amino peroxodisulfate (APS), 0.0005% N,N,N’,N’−tetramethoenediamine(TEMED)]とstacking gel [10% acrylamide/bis solution(29:1), 0.25M Tris−HCl(pH 8.8), 0.2% Sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.6% Amino peroxodisulfate (APS), 0.002% N,N,N’,N’−tetramethoenediamine (TEMED)]を用いて20mA定電流にて分離した。分離されたアクリルアミドゲルは、30分間1.5V定電圧にてPVDF膜(MILLIPORE)上に転写した。転写後、膜をblockingmilkで4℃、終夜ブロッキングした。細胞表面を標識したビオチンをElite ABC kit(VECTOR Laboratories)を用いて検出した。図2に示すように、LGtra01−01産生モノクローナル抗体はLAT1に反応した。LAT1の理論値は40Kダルトンで、実測値として35Kダルトン前後の特異的バンドとして認められた。
(2)FACSによるモノクローナル抗体の特異性の検討
細胞をPBSにて2.5×105〜1×106cells/wellになるように調整し、50μLずつチューブに分注した。この細胞浮遊液にLGtra01−01産生モノクローナル抗体50μLを加え、氷冷下で60分反応させた。0.2%BSA−PBS 200〜500μLを加え、120gで5分間、4℃で遠心する洗浄を3回行い、細胞ペレットにFITC標識またはPE標識の二次抗体(1%BSA−PBSで200倍希釈)を50μL加え、遮光氷冷下45分間反応させた。遠心洗浄後、0.2%BSA−PBS500μLにサスペンドし、40μmのナイロンメッシュ(BD Falcon #35−2340)を通した後、死細胞を除くため測定直前にDAPIを1μg/mLの濃度になるように添加し、BD LSR(Becton Dickinson)にて測定した。図3に示すように、LGtra01−01産生モノクローナル抗体はLAT1のファミリーであるCD98lightchain強制発現細胞には反応せず、LAT1の強制発現細胞にのみに特異的反応を示した。
細胞をPBSにて2.5×105〜1×106cells/wellになるように調整し、50μLずつチューブに分注した。この細胞浮遊液にLGtra01−01産生モノクローナル抗体50μLを加え、氷冷下で60分反応させた。0.2%BSA−PBS 200〜500μLを加え、120gで5分間、4℃で遠心する洗浄を3回行い、細胞ペレットにFITC標識またはPE標識の二次抗体(1%BSA−PBSで200倍希釈)を50μL加え、遮光氷冷下45分間反応させた。遠心洗浄後、0.2%BSA−PBS500μLにサスペンドし、40μmのナイロンメッシュ(BD Falcon #35−2340)を通した後、死細胞を除くため測定直前にDAPIを1μg/mLの濃度になるように添加し、BD LSR(Becton Dickinson)にて測定した。図3に示すように、LGtra01−01産生モノクローナル抗体はLAT1のファミリーであるCD98lightchain強制発現細胞には反応せず、LAT1の強制発現細胞にのみに特異的反応を示した。
(3)酵素免疫測定法によるモノクローナル抗体の特異性の検討
polyvinylchrolide 96−well plates(Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan)に抗原捕捉抗体としてHH25anti−humanCD98hchumanmAb,10μg/mLを50μL、3ウェルずつ4℃にて終夜固相化したのち、BlockAce(Dainipponn)にてブロッキングした。抗原にはHeLa細胞可溶化物(3x107cells/mL)を用い、検出抗体(10μg/mL)とあらかじめプレインキュベートしたものを50μLずつ各ウェルに加えた。1時間37℃にてインキュベート、0.05%Tween20含有PBS(PBS−T)洗浄後に、ビオチン標識抗ラットIgG抗体(JacksonImmunoResearch)を用いた。各抗体間はPBS−Tにて洗浄した。その後、0.1%BSA−PBSにて200倍希釈したElite ABC reagent (Vector)を加えて、37℃で45分間インキュベートした。PBS−Tで洗浄後、3,3’,5,5’−tetramethylbenzidine(0.1mg/mL)と0.01%H2O2を含む0.1Mcitric−acetate buffer(pH6.0)を用いて呈色したのち、0.5MH2SO4 75μLを加えて反応を停止した。450nmにおける吸光度はModel550microplate reader (Bio−Rad, Hercules, CA, USA)にて測定した。450nmにおける吸光度はModel550microplatereaderを用いて測定した。図4に示すように、LGtra01−01産生モノクローナル抗体がLAT1とCD98hc複合体に結合することが認められた。
polyvinylchrolide 96−well plates(Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan)に抗原捕捉抗体としてHH25anti−humanCD98hchumanmAb,10μg/mLを50μL、3ウェルずつ4℃にて終夜固相化したのち、BlockAce(Dainipponn)にてブロッキングした。抗原にはHeLa細胞可溶化物(3x107cells/mL)を用い、検出抗体(10μg/mL)とあらかじめプレインキュベートしたものを50μLずつ各ウェルに加えた。1時間37℃にてインキュベート、0.05%Tween20含有PBS(PBS−T)洗浄後に、ビオチン標識抗ラットIgG抗体(JacksonImmunoResearch)を用いた。各抗体間はPBS−Tにて洗浄した。その後、0.1%BSA−PBSにて200倍希釈したElite ABC reagent (Vector)を加えて、37℃で45分間インキュベートした。PBS−Tで洗浄後、3,3’,5,5’−tetramethylbenzidine(0.1mg/mL)と0.01%H2O2を含む0.1Mcitric−acetate buffer(pH6.0)を用いて呈色したのち、0.5MH2SO4 75μLを加えて反応を停止した。450nmにおける吸光度はModel550microplate reader (Bio−Rad, Hercules, CA, USA)にて測定した。450nmにおける吸光度はModel550microplatereaderを用いて測定した。図4に示すように、LGtra01−01産生モノクローナル抗体がLAT1とCD98hc複合体に結合することが認められた。
(4)がん細胞株におけるLAT1の発現量の検討
FACS法によりLGtra01−01産生モノクローナル抗体を用いてヒトがん細胞株26種におけるLAT1の発現量を測定した。図5に示すように、LAT1は種々のがん細胞株で発現し、その中でHeLa細胞で最も高い発現量が認められた。
FACS法によりLGtra01−01産生モノクローナル抗体を用いてヒトがん細胞株26種におけるLAT1の発現量を測定した。図5に示すように、LAT1は種々のがん細胞株で発現し、その中でHeLa細胞で最も高い発現量が認められた。
(5)モノクローナル抗体による抗体依存性細胞障害活性の検討
KSNヌードマウスより脾臓を摘出し、培地中でほぐしてリンパ球を分取する。150gで5分間遠心し、ペレットをTris−HCl5mLで懸濁し、赤血球を溶血させる。37℃で5分間インキュベートし、ペレットを培地5mLに懸濁後30秒間静置する。組織片が沈殿したら上清を分取し、再度沈殿物に培地5mLを加え、30秒間静置し、上清を分取する。最終濃度が500J.U./mLになるようIL250μL加え、終夜培養した細胞をエフェクター細胞とした。一方、標的細胞としてHeLa細胞を1×106cells/mLとなるように5mLの培地で調整し、1mg/mLのcalsein−Am−solution50μLを加え、37℃で30間インキュベートする。培地を5mL加え、150gで5分間遠心し、上清を捨てる。さらに培地10mLで懸濁し、150gで5分間遠心し、上清を捨てる工程を2回繰り返す。培地5mLで懸濁し、丸底96wellplateに50μLずつ分注する。エフェクター/ターゲット比が30になるように、LGtra01−01産生モノクローナル抗体100μL、エフェクター細胞50μLを順に加え、37℃で2時間インキュベートする。テラスキャン(MINERVATECH)を用いて520nm蛍光波長を測定し、次の式で細胞障害率を算出した。細胞障害率(%)=(sample release - spontaneous release)/(total release - spontaneous release)×100。図6に示すようにLGtra01−01産生モノクローナル抗体のADCC活性が検出された。エフェクター細胞と標的細胞を混合したControlで3.5%であり、抗体を加えることにより、ADCCが起こり、30.4%の細胞障害率が認められた。
KSNヌードマウスより脾臓を摘出し、培地中でほぐしてリンパ球を分取する。150gで5分間遠心し、ペレットをTris−HCl5mLで懸濁し、赤血球を溶血させる。37℃で5分間インキュベートし、ペレットを培地5mLに懸濁後30秒間静置する。組織片が沈殿したら上清を分取し、再度沈殿物に培地5mLを加え、30秒間静置し、上清を分取する。最終濃度が500J.U./mLになるようIL250μL加え、終夜培養した細胞をエフェクター細胞とした。一方、標的細胞としてHeLa細胞を1×106cells/mLとなるように5mLの培地で調整し、1mg/mLのcalsein−Am−solution50μLを加え、37℃で30間インキュベートする。培地を5mL加え、150gで5分間遠心し、上清を捨てる。さらに培地10mLで懸濁し、150gで5分間遠心し、上清を捨てる工程を2回繰り返す。培地5mLで懸濁し、丸底96wellplateに50μLずつ分注する。エフェクター/ターゲット比が30になるように、LGtra01−01産生モノクローナル抗体100μL、エフェクター細胞50μLを順に加え、37℃で2時間インキュベートする。テラスキャン(MINERVATECH)を用いて520nm蛍光波長を測定し、次の式で細胞障害率を算出した。細胞障害率(%)=(sample release - spontaneous release)/(total release - spontaneous release)×100。図6に示すようにLGtra01−01産生モノクローナル抗体のADCC活性が検出された。エフェクター細胞と標的細胞を混合したControlで3.5%であり、抗体を加えることにより、ADCCが起こり、30.4%の細胞障害率が認められた。
(6)モノクローナル抗体によるLAT1のInternalizationの検討
LGtra01−01産生モノクローナル抗体存在下にて、HeLa細胞を終夜培養。4%PFA固定後、二次抗体としてFITC標識抗ラットIgG抗体を用いて染色したのち、LEITZDMR蛍光顕微鏡を用いて観察する。図7に示すように、ControlではLAT1の局在を示すFITCシグナルが細胞膜に局在しているのに対し、LGtra01−01産生モノクローナル抗体の結合によりLAT1のInternalizationが起こり、細胞内に局在していることが示された。
LGtra01−01産生モノクローナル抗体存在下にて、HeLa細胞を終夜培養。4%PFA固定後、二次抗体としてFITC標識抗ラットIgG抗体を用いて染色したのち、LEITZDMR蛍光顕微鏡を用いて観察する。図7に示すように、ControlではLAT1の局在を示すFITCシグナルが細胞膜に局在しているのに対し、LGtra01−01産生モノクローナル抗体の結合によりLAT1のInternalizationが起こり、細胞内に局在していることが示された。
(7)免疫組織染色法による乳がん組織におけるLAT1発現量の検討
市販のLAT1ポリクローナル抗体Anti Human L−type Amino Acid Transporter 1 (LAT1) Polyclonal Antibody,Rabbit(Transgenic #KE026)を用い、添付のプロトコルに従って、乳がん組織アレイ
市販のLAT1ポリクローナル抗体Anti Human L−type Amino Acid Transporter 1 (LAT1) Polyclonal Antibody,Rabbit(Transgenic #KE026)を用い、添付のプロトコルに従って、乳がん組織アレイ
(8)モノクローナル抗体のin vivoでの抗腫瘍効果の検討
ヒト子宮頚がん細胞HeLaをKSNヌードマウスに皮下投与し、腫瘍を形成させた。腹腔内にプリスタン500ul/匹を投与後、マウスを各4匹の2群に分けた。一方の群の腹腔内にハイブリドーマLGtra01−01を投与し、もう一方群の腹腔内に陰性コントロールとして、HeLaに結合しない抗マウスCD44抗体を産生するハイブリドーマを投与し、腹水が貯留した時点で各マウスの腫瘍容量を測定した。図8に示すように、陰性コントロール群に比べ、ハイブリドーマLGtra01−01投与群で腫瘍の増殖抑制が認められた。
ヒト子宮頚がん細胞HeLaをKSNヌードマウスに皮下投与し、腫瘍を形成させた。腹腔内にプリスタン500ul/匹を投与後、マウスを各4匹の2群に分けた。一方の群の腹腔内にハイブリドーマLGtra01−01を投与し、もう一方群の腹腔内に陰性コントロールとして、HeLaに結合しない抗マウスCD44抗体を産生するハイブリドーマを投与し、腹水が貯留した時点で各マウスの腫瘍容量を測定した。図8に示すように、陰性コントロール群に比べ、ハイブリドーマLGtra01−01投与群で腫瘍の増殖抑制が認められた。
本発明は、LAT1を高発現する腫瘍細胞のアポトーシス誘導、またはLAT1を高発現する腫瘍細胞で特徴付けられる腫瘍の病態解析、予防、治療等に有用である。
配列番号:1 軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)
配列番号:2 軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)
配列番号:3 軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)
配列番号:4 重鎖相補性決定領域1(CDRH1)
配列番号:5 重鎖相補性決定領域2(CDRH2)
配列番号:6 重鎖相補性決定領域3(CDRH3)
配列番号:2 軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)
配列番号:3 軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)
配列番号:4 重鎖相補性決定領域1(CDRH1)
配列番号:5 重鎖相補性決定領域2(CDRH2)
配列番号:6 重鎖相補性決定領域3(CDRH3)
Claims (23)
- LAT1の細胞外領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
- LAT1を発現する細胞のLAT1に結合し、前記細胞に対する細胞障害活性を有する、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、:
(1)(i)配列番号:1のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号1の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)(i)配列番号:2のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号2の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、
(3)(i)配列番号:3のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号3の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
(4)(i)配列番号:4のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号4の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)(i)配列番号:5のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号5の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および
(6)(i)配列番号:6のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号6の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、
のうちの少なくとも1つを含む、請求項1または2に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、
(1)(i)配列番号:1のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号1の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)(i)配列番号:2のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号2の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、および
(3)(i)配列番号:3のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号3の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
を含む少なくとも1つの軽鎖、ならびに
(4)(i)配列番号:4のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号4の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)(i)配列番号:5のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号5の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および
(6)(i)配列番号:6のアミノ酸配列、または(ii)1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号6の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、
を含む少なくとも1つの重鎖
を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。 - サブクラスがIgGである、請求項1〜4のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記IgGが、IgG1である、請求項5に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合断片が、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、dsFv、ds−scFv、それらのダイマー、ミニボディ(minobodies)、ダイアボディ(diabodies)、およびマルチマー、または二重特異性抗体断片である、請求項1〜6のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- モノクローナル抗体である、請求項1〜7のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- ラット、マウス、霊長類、またはヒト抗体である、請求項1〜8のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項1〜8のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 受領番号FERM AP−21823で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
- 請求項12に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項12に記載の核酸分子を含む、ハイブリドーマ細胞。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞。
- 受領番号FERM AP−21823で特定されるハイブリドーマ細胞。
- 請求項14〜16のいずれかに記載のハイブリドーマ細胞を培養し、得られる培養物からLAT1に特異的に結合する抗体を採取することを含む、LAT1の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
- 請求項15または16に記載のハイブリドーマ細胞から抗LAT1モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して前記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清または宿主の分泌物からLAT1の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体を採取することを含む、LAT1の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
- 前記宿主が、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または哺乳動物である、請求項18に記載の製造方法。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含有する組成物であって、LAT1を発現する細胞に適用して該細胞のアポトーシスを誘導するために使用する、組成物。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含有する、腫瘍の予防または治療のための医薬。
- 前記腫瘍が、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、T細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、口腔癌、胆嚢癌、甲状腺癌、中皮腫、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項21に記載の医薬。
- 以下の(1)〜(6)からなる群から選択される単離された相補性決定領域(CDR):
(1)配列番号:1のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)配列番号:2のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、
(3)配列番号:3のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
(4)配列番号:4のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)配列番号:5のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および
(6)配列番号:6のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009176315A JP2011024537A (ja) | 2009-07-29 | 2009-07-29 | トランスポーターに対する抗体およびその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009176315A JP2011024537A (ja) | 2009-07-29 | 2009-07-29 | トランスポーターに対する抗体およびその用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011024537A true JP2011024537A (ja) | 2011-02-10 |
Family
ID=43634047
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009176315A Pending JP2011024537A (ja) | 2009-07-29 | 2009-07-29 | トランスポーターに対する抗体およびその用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2011024537A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012141285A1 (ja) * | 2011-04-15 | 2012-10-18 | ジェイファーマ株式会社 | 乳癌のバイオマーカー |
WO2013183786A1 (ja) | 2012-06-08 | 2013-12-12 | 学校法人近畿大学 | トランスポーターに対する抗体およびその用途 |
-
2009
- 2009-07-29 JP JP2009176315A patent/JP2011024537A/ja active Pending
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012141285A1 (ja) * | 2011-04-15 | 2012-10-18 | ジェイファーマ株式会社 | 乳癌のバイオマーカー |
KR20140019833A (ko) * | 2011-04-15 | 2014-02-17 | 제이 파마 가부시끼가이샤 | 유방암의 바이오마커 |
JP6075881B2 (ja) * | 2011-04-15 | 2017-02-08 | ジェイファーマ株式会社 | 乳癌のバイオマーカー |
US9618512B2 (en) | 2011-04-15 | 2017-04-11 | J-Pharma Co., Ltd. | Biomarker for breast cancer |
KR101976219B1 (ko) * | 2011-04-15 | 2019-05-07 | 제이 파마 가부시끼가이샤 | 유방암의 바이오마커 |
WO2013183786A1 (ja) | 2012-06-08 | 2013-12-12 | 学校法人近畿大学 | トランスポーターに対する抗体およびその用途 |
CN104662153A (zh) * | 2012-06-08 | 2015-05-27 | 学校法人近畿大学 | 针对转运体的抗体及其用途 |
JPWO2013183786A1 (ja) * | 2012-06-08 | 2016-02-01 | 学校法人近畿大学 | トランスポーターに対する抗体およびその用途 |
EP2878670A4 (en) * | 2012-06-08 | 2016-03-02 | Univ Kinki | ANTIBODY DIRECTED AGAINST A CARRIER AND USE THEREOF |
US9725519B2 (en) | 2012-06-08 | 2017-08-08 | Kinki University | Antibody against transporter and use thereof |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6908722B2 (ja) | 抗pd−1抗体及びその使用 | |
JP7143452B2 (ja) | CD47とSIRPaの相互作用を遮断できる抗体及びその応用 | |
WO2021027674A1 (zh) | 一种含有抗体的肿瘤治疗剂的开发和应用 | |
US11685787B2 (en) | Treatment of cancer with anti-GITR agonist antibodies | |
CN111511760B (zh) | 对btn2具有特异性的抗体及其用途 | |
JP6421371B2 (ja) | トランスポーターに対する抗体およびその用途 | |
WO2021217893A1 (zh) | 结合tigit抗原的抗体及其制备方法与应用 | |
CA3128104A1 (en) | Anti-pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof | |
JP7377590B2 (ja) | 抗cd3イプシロン抗体およびそれを使用する方法 | |
WO2020034941A1 (zh) | 抗IL-1β的抗体、其药物组合物及其用途 | |
WO2015076425A1 (ja) | 新規モノクローナル抗体 | |
JP2024026820A (ja) | 医薬組成物、その製造方法及び用途 | |
WO2011007853A1 (ja) | 癌特異的アイソフォームに対するモノクローナル抗体 | |
WO2022100694A1 (zh) | 抗体及其制备方法 | |
JP2011024537A (ja) | トランスポーターに対する抗体およびその用途 | |
JP2011050355A (ja) | トランスポーターに対する抗体およびその用途 | |
WO2019174637A1 (zh) | 一种针对tim-3的全人源化抗体分子、抗原结合片段及其医药用途 | |
WO2023186111A1 (zh) | 一种靶向cd40的抗原结合蛋白及其制备和应用 | |
WO2024002308A1 (zh) | 一种新型多特异肿瘤抑制剂的开发和应用 | |
WO2023241656A1 (zh) | 包含抗cldn18.2抗体的双特异性抗体、药物组合物及用途 | |
WO2024022478A1 (zh) | 结合大麻素受体cb1的抗体及其用途 | |
US20220387417A1 (en) | Pharmaceutical Combination and Use Thereof |