KR20140019833A

KR20140019833A - 유방암의 바이오마커

Info

Publication number: KR20140019833A
Application number: KR1020137029685A
Authority: KR
Inventors: 히또시 엔도; 이사오 오까야스
Original assignee: 제이 파마 가부시끼가이샤
Priority date: 2011-04-15
Filing date: 2012-04-13
Publication date: 2014-02-17
Also published as: JPWO2012141285A1; WO2012141285A1; JP6075881B2; EP2698634B1; US20140106377A1; EP2698634A4; US9618512B2; CN103547923B; EP2698634A1; CN103547923A; ES2656988T3; KR101976219B1

Abstract

본 발명은 유방암 치료의 지침이 되는 마커의 제공에 관한 것이다. 본 발명은 항LAT1 모노클로날 항체를 포함하여 이루어지는 유방암의 진단 키트 및/또는 진단 방법에 관한 것이다. 유관내 종양성 병변 중, 악성인 유관내 비침윤성암은 양성인 유관내 유두종과 비교하여, LAT1이 유의미하게 고발현하고 있는 점에서, 양쪽 병변의 감별에 항LAT1 모노클로날 항체가 유용하다. 또한, 종래의 유방암의 분자 표적 마커이고 ER, PgR, HER2의 어느 쪽에도 음성이고 적절한 분자 표적 치료 방법이 없는 삼중음성 침윤암의 대부분이 LAT1을 고발현하고 있었던 것으로부터, LAT1은 유방암의 새로운 분자 표적 마커가 되고, 본 면역 조직학적 방법으로 LAT1 발현을 진단함과 함께, LAT1을 대상으로 한 분자 표적 치료 방법의 개발이 유효하다.

Description

유방암의 바이오마커{BIOMARKER FOR BREAST CANCER}

본 발명은 유방암의 바이오마커, 보다 상세하게는 유선종양의 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.

중성 아미노산 트랜스포터[L-type amino acid transporter(LAT)]는 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 히스티딘, L-도퍼 등의 중성 아미노산을 세포 내에 도입하기 위한 막관통형의 단백질이다. 본 발명자들은, 각종 LAT의 탐색을 행하고 있고, 지금까지 LAT1 및 그 아이소폼(isoform)인 LAT2, LAT3 및 LAT4를 발견했다.

이들 중 LAT1은 아미노산 수송 활성화 인자 4F2hc와 공존함으로써, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 히스티딘 등의 대형의 중성 아미노산 및 L-도퍼를 Na⁺ 비의존적으로 수송하는 능력을 갖는 12회 막관통 단백질이다. 또한, LAT1은 생체 내에서는 태반, 비장, 대장, 정소 및 혈액·뇌관문에 주로 발현하고 있다. 또한, LAT1은 인간 위 인환세포암 세포주, 폐소세포암 세포주, 흑색종 세포주, 신경아세포종양 세포주에 발현이 인정되고, 또한, 신장암, 방광암 및 전립선암의 종양 조직에 있어서, 면역 조직 화학 염색에 의해 그 발현이 확인되고 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 1 및 비특허문헌 2 참조). LAT1을 멜팔란, BCH 등의 억제약에 의해 억제함으로써, LAT1을 발현하는 배양 세포의 증식 속도가 현저하게 저하되는 점에서, LAT1에 의한 세포 내에의 필수아미노산 도입은 세포 증식에 있어서 필요 불가결하고, 암세포는 본 LAT1을 고발현함으로써 정상 세포에 비해 우위의 영양 상태를 획득하여, 증식을 우위에 행할 수 있다고 생각되고 있다.

LAT2는 LAT1의 아이소폼인데, LAT1과 마찬가지로, 12회 막관통 구조를 갖고, 4F2hc과의 공존에 의해 대형의 아미노산 외에, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민 등의 소형의 아미노산도 포함한 중성 아미노산 전반을 Na⁺ 비의존적으로 수송하는 넓은 기질 선택성을 갖는다. LAT2는 뇌, 골격근, 신장, 공장, 회장, 정소 및 태반의 정상 조직에 있어서의 발현이 확인되고 있지만, 종양 조직에 있어서는 그 발현은 확인되고 있지 않다(특허문헌 2 및 비특허문헌 3 참조). LAT2의 기질과의 친화성은 LAT1에 비해 낮은 점에서, LAT2는 활발한 세포 증식을 필요로 하지 않는 정상 조직의 세포에 있어서의 중성 아미노산의 수송을 담당하고 있다고 생각되고 있다.

또한, 본 발명자들은 L-체 및 D-체 아미노산을 수송하는 나트륨 비의존성 소형 중성 아미노산 트랜스포터(특허문헌 3 참조), 시스틴, 염기성 아미노산 및 중성 아미노산을 기질로 하는 트랜스포터(특허문헌 4 참조) 등의 각종의 트랜스포터도 발견하고 있다. 트랜스포터는 세포가 필요로 하는 각종 물질을 물질 특이적으로 세포에 도입하기 위한 기능을 갖는 막관통형의 단백질이며, 생체 조직의 유지나 증식에 불가결한 것이다. 이 때문에, 각종 트랜스포터에 의해 질환을 진단하는 방법도 제안되어 있다. 예를 들어, 종양 세포, 종양 조직 또는 종양을 갖는 장기 또는 그 일부를 포함하는 시료 중의 단백의 발현의 유무 또는 발현량을 조사하는 방법(특허문헌 1 참조), 음이온 트랜스포터의 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 폐·흉부 질환의 진단 방법(특허문헌 5 참조), 적혈구 요소 트랜스포터의 단백질 또는 그 단편 또는 핵산의 정량치를 지표로 하여 피험자가 정신분열병으로 이환하고 있는 지의 여부를 진단하는 방법(특허문헌 6 참조), 체강액으로부터 세포학적 제조물을 제조하고, 막관통 글루코스 트랜스포터 GLUT-1에 결합하는 항체를 사용하여, 동일 타입의 조직으로부터의 비악성 조직의 절편으로부터 취득된 조직 시료에서의 GLUT-1 발현 레벨과 비교하여, GLUT-1을 과잉 발현하는 악성 종양으로부터 양성 종양을 식별하는 방법(특허문헌 7 참조) 등이 보고되어 있다.

유방암의 치료를 대상으로 한 바이오마커에는, 주로, 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PgR) 및 HER2(EGFR2라고도 불리는, 증식 요인의 수용체)의 3종류가 알려져 있다. 각각을 종양 조직의 면역 조직 화학 또는 FISH법으로 검사를 하고, 반응을 나타낸 양성예에는 각각을 표적으로 한 치료 방법이 선택되어 있다. 한편, 이들의 3종류의 마커에 모두 음성인 유방암(유방암의 종양 세포에 에스트로겐 호르몬 수용체, 프로게스테론 호르몬 수용체 및 HER2의 3종류의 단백질의 표현이 없는 것)은 삼중음성 유방암이라고 불리고, 전체 유방암 증례의 12 내지 25％를 차지한다고 보고되어 있다(비특허문헌 7 내지 10 참조). 이 삼중음성 유방암에 대한 적절한 치료 방법은 아직 개발되어 있지 않고, 환자의 예후도 기존의 3마커 중의 어느 하나에 양성인 유방암 증례와 비교하여 불량하다(비특허문헌 9 및 10 참조).

또한, 유관내 종양에 있어서, 악성인 비침윤성 유관암(ductal carcinoma in situ; 이하 DCIS라고 하는 경우가 있음)과, 양성의 유관내 유두종(intraductal papilloma)의 감별에는 종래의 HE(헤마톡실린·에오신) 염색 표본에 의한 병리 조직 진단 방법이 행해지고 있지만, 명확한 감별 요소가 뚜렷하지 않아, 감별 곤란한 병변이 많다. 그로 인해, 보다 명확하게 판별 가능한 마커의 개발이 기다려지고 있다.

일본 특허 공개 제 2000-157286호 일본 특허 공개 제 2000-342270호 일본 특허 공개 제 2001-211886호 일본 특허 공개 제 2001-46070호 일본 특허 공개 제 2001-228146호 일본 특허 공개 제 2001-245661호 일본 특허 공표 평 11-511245호

Kanai, Y., et al., J. Biol. Chem., 273, 23629-23632, 1998 Yanagida O., et al., Biochim. Biophys. Acta., 1514(2), 291-302, 2001 Segawa, H., et al., J. Biol. Chem., 274(28), 19745-19751, 1999 Sakata T., et al., Pathol. Int. 59, 7-18, 2009 Ichinohe M., et al., Pathol. Int., 2011 in press Oda K., et al., Cancer Sci., 101, 173-179, 2010 Rakha E. A., et al., Cancer 109, 25-32, 2007 Liedtke C., et al., J. Clin. Oncol. 26, 1275-1281, 2008 Sasaki Y., et al., Breast Cancer 16, 254-259, 2009 Iwase H., et al., Breast Cancer 17, 118-124, 2010 Sinicrope F. A., et al., Cancer Res. 55, 237-241, 1995

본 발명은 유선종양의 진단 방법 및 진단 키트를 제공한다. 상세하게는, 첫째로, 본 발명은 ER, PgR, HER2 중의 어느 것에도 음성인 삼중음성 유방암의 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것이다. 둘째로, 본 발명은 종래 간이한 감별이 곤란했던 유관내 종양에 있어서의 악성도의 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 암세포가 특이적으로 사용하고 있는 암 타입 아미노산 트랜스포터에 주목하여, 암의 분자 표적암 요법의 개발을 목표로 하여 검색을 행하였다. 정상인 세포는 주로 LAT2를 사용하고, 암세포는 아미노산 도입의 효율이 좋은 LAT1을 사용하였다. 본 발명자들은 LAT1에 대한 마우스 모노클로날 항체를 제작하고, 이 항체를 사용한 면역 조직 과학적 검색 방법을 개발했다(비특허문헌 4 참조). 이 방법에 의해, 전립선암이나 위암에서는, LAT1 고발현 증례에서, LAT1 저발현 증례에 비교하여 예후가 유의미하게 불량한 것을 인정하여(비특허문헌 4 및 5 참조), LAT1 특이적 억제 물질의 개발과 함께, 진단과 치료를 일체화한 대암 요법을 개발하고 있다(비특허문헌 4 내지 6 참조).

본 발명자들은 전술한 바와 같이 LAT1이 암에 고율로 발현하고, 효율이 좋은 아미노산의 도입을 행하고, 증식하는 지견을 살려서, 이 LAT1을 대상으로 한 유방암의 분자 표적 치료를 목표로 하여, 항LAT1 모노클로날 항체를 사용하여, 유관내 종양의 LAT1 발현에 대하여 면역 조직학적으로 예의 연구를 행하였다. 그 결과, 비침윤성 유관암에 있어서는 유관내 유두종에 비하여 LAT1이 높게 발현하고 있어, 면역 염색 방법이 유관내 종양의 양성 또는 악성의 감별에 유용한 것을 발견하였다.

또한, 항LAT1 모노클로날 항체를 ER, PgR 및 HER2 중의 어느 것에도 음성인, 소위 삼중음성 유방암 조직에 사용함으로써, 그 17예 중 14예라고 하는 고비율에 있어서 LAT1이 고발현하고 있는 것을 발견하였다.

즉, 본 발명자들은 신장이나 방광암에 특이적인 필수아미노산 트랜스포터의 LAT1 및 정상 세포에 존재하는 LAT2를 발견해 왔다. 본 발명자들은, 놀랍게도 항LAT1 모노클로날 항체를 사용함으로써, 유관내 종양에 있어서 종양의 악성 또는 양성의 감별을 할 수 있는 것 및 소위 삼중음성의 유방암 조직에 있어서 고확률로 LAT1이 발현하고 있는 것을 발견하였다.

본 발명 (1)은 유선종양의 진단에 있어서 LAT1의 검출, 동정 또는 정량을 위한, 항LAT1 모노클로날 항체를 함유하는 진단 키트에 관한 것이다.

본 발명 (2)는 상기 유선종양이 유관내 종양이며, 그 악성도를 진단하기 위한, 전항 (1)에 기재된 진단 키트에 관한 것이다.

본 발명 (3)은 상기 유선종양이 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 HER2 중의 어느 것에도 음성인 삼중음성의 유방암인, 전항 (1)에 기재된 진단 키트에 관한 것이다.

본 발명 (4)는 에스트로겐 수용체의 면역 염색 키트, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 키트 및 HER2의 면역 염색 키트와, LAT1의 면역 염색 키트를 포함하는 조합을 함유하는, 유선종양의 진단 키트에 관한 것이다.

본 발명 (5)는 피험자로부터 적출된 유선 조직에 항LAT1 모노클로날 항체를 접촉시켜, 상기 조직 중의 LAT1을 검출, 동정 또는 정량하는 공정을 포함하는, 유선종양의 진단 방법에 관한 것이다.

본 발명 (6)은 상기 유선종양이 유관내 종양이며, 그 악성도를 진단하는, 전항 (5)에 기재된 진단 방법에 관한 것이다.

본 발명 (7)은 상기 유선종양이 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 HER2 중의 어느 것에도 음성인 삼중음성의 유방암인, 전항 (5)에 기재된 진단 방법에 관한 것이다.

본 발명 (8)은 에스트로겐 수용체의 면역 염색, 프로게스테론 수용체의 면역 염색, HER2의 면역 염색 및 LAT1의 면역 염색을 함유하여 이루어지는, 유선종양의 진단 방법.

본 발명 (1) 및 (5)에 따르면, 지금까지 곤란했던, 유선종양에 있어서의 치료 지침을 나타내기 위한 진단을 용이하게 행할 수 있다. 즉, 유선종양의 항LAT1 항체를 사용한 면역 염색으로 유방암의 LAT1 발현을 검사함으로써, LAT1을 표적으로 하는 유방암의 항암 요법이 유효하게 된다.

본 발명 (2) 및 (6)에 따르면, 진단 곤란한 유관내 종양의 양성(유관내 유두종) 또는 악성(비침윤성 유관내암)의 감별을 용이하게 행할 수 있다.

본 발명 (3) 및 (7)에 따르면, ER, PrG 및 HER2 중의 어느 것에도 음성인 삼중음성 유방암이 예후 불량인 것이 많았던 바, 그 치료 지침을 제공할 수 있다.

본 발명 (4) 및 (8)에 따르면, 종래부터 알려지는 ER, PgR 및 HER2 외에 항LAT1 모노클로날 항체를 합쳐서 사용함으로써, 유방암의 진단에 있어서 보다 정밀도가 높은 치료 지침을 부여할 수 있다.

본 발명에 있어서, 유선종양이란, 유선 조직에 종양이 포함되는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 유관내 유두종, 유두부 선종 등의 양성 종양, 비침윤암(비침윤성 유관암 등), 침윤암[침윤성 유관암(유두선관암, 충실선관암, 경암), 특수형], 파제트병 등의 악성 종양을 대표적인 것으로서 들 수 있다. 또한, 유선종양은 별도의 분류에 따라, 악성 종양인 유방암과, 양성 종양으로 나뉘어진다.

상기 유관내 종양이란, 유관내에 종양이 포함되는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 유관내 유두종(양성 종양) 및 비침윤성 유관암(악성 종양)을 대표적인 것으로서 들 수 있다.

도 1은 LAT1 발현 강도의 표준을 도시한다. 이 염색도를 기초로, LAT1의 발현도를 구한다.
도 2는 유관내 유두종과 비침윤성 유관내암에 있어서의 LAT1 발현의 비교를 도시한다.
도 3은 ER, PgR 및 HER2 중의 어느 것에도 음성인 삼중음성 유방암 조직에 있어서 LAT1이 높게 발현하고 있는 예를 도시한다.
도 4는 HER2 음성의 유방암 조직에 있어서 LAT1이 발현하고 있는 예를 도시한다.
도 5는 HER2 양성의 유방암 조직에 있어서 LAT1이 발현하고 있는 예를 도시한다.
도 6은 유선종양성 병변에 있어서의 LAT1 발현의 비교를 도시한다.

본 발명에서 사용하는 LAT는, 세포의 증식에 필요한 필수아미노산의 세포막 수송능을 갖는 기능성 단백으로서, 특히 암세포에 특이적으로 발현하는 LAT는 암의 증식을 뒷받침하는 필수아미노산의 세포막 수송능과 일치하는 기능성 단백이므로, 이들 LAT의 상이한 종류를 포함하는 2종 이상을 사용하는 본 발명의 방법에 의해, 암의 유무뿐만 아니라, 암의 악성도를 적확하게 평가하는 것이 가능해진다.

본 발명의 특징의 하나는, 유선종양의 항LAT1 항체를 사용한 면역 염색으로 유방암의 LAT1 발현을 검사함으로써, LAT1을 표적으로 하는 유방암의 항암 요법이 유효해지는 것이다.

본 발명에 있어서의 정상 세포에 발현하는 LAT로서는, 예를 들어 LAT2를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서의 종양 세포에 발현하는 LAT로서는, 예를 들어 LAT1을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 시료로서는, 인간 등의 포유 동물의 유선종양 세포를 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 시료 중의 LAT의 검출, 동정 또는 정량으로서는, LAT를 검출, 동정 또는 정량할 수 있는 방법이면 특별히 제한은 없지만, 바람직한 방법으로서는 상기 LAT의 항체를 사용하는 방법을 들 수 있다. LAT의 항체로서는, LAT 단백의 전체 길이 또는 그 일부에 반응성을 갖는 항체이며, LAT에 특이성이 있으면 특별히 제한은 없지만, 보다 고정밀도로 행하기 위해서는 특이성이 높은 모노클로날 항체를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 항체는, 공지된 항체의 제조 방법에 준하여 제조할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 LAT 또는 그 일부(천연체, 조환체, 화학합성물을 포함함), 또는 상기 단백을 발현하고 있는 세포를 면역원으로서 사용하고, 통상법에 따라, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 닭, 토끼, 염소, 양 등의 비인간 포유 동물에 면역함으로써 얻어지는 천연형 항체, 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있는 재조합 키메라 모노클로날 항체 및 재조합 인간형 모노클로날 항체(CDR-그래프트된(grafted) 항체), 및 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물 등을 사용하여 제조될 수 있는 인간 항체 중 어느 것이어도 된다. 모노클로날 항체의 경우에는, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 등 중의 어느 하나의 아이소타입을 갖는 모노클로날 항체도 포함한다. 바람직하게는, IgG 또는 IgM이다.

본 발명의 항체를 사용하는 경우에는, 이 결과를 검출, 동정 또는 정량 가능한 시그널로 하기 위해서, 표식화 또는 표식화 가능한 것으로 해 두는 것이 바람직하다. 본 발명의 표식화 항체로서는, 효소, 형광 물질, 화학 발광 물질, 비오틴, 아비딘 또는 ³H, ¹⁴C, ¹²⁵I 등의 방사성 동위체 등으로 표식하여 이루어지는 항체 또는 이러한 표식화 물질과 결합능을 갖는 항체이다.

본 발명의 항체를 표식하기 위한 「단독으로 또는 다른 물질과 반응함으로써 검출 가능한 시그널을 야기할 수 있는 표지 물질」이란, 그것들을, 상기한 항체에 물리적 또는 화학적인 결합 등에 의해 결합시킴으로써 상기 모노클로날 항체의 존재를 검출 가능하게 하기 위하여 사용되는 물질을 의미한다. 구체적으로는, 효소, 형광 물질, 화학 발광 물질, 비오틴, 아비딘 또는 상기 방사성 동위체 등이다. 구체적으로는, 퍼옥시다아제[예를 들어, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 등], 알칼리포스파타아제, β-D-갈락토시다아제, 글루코스옥시다아제, 글루코스-6-포스페이트디히드로게나아제, 알코올 탈수소 효소, 말산 탈수소 효소, 페니실리나아제, 카탈라아제, 아포글루코스옥시다아제, 우레아제, 루시페라아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제 등의 효소, 플루오레세인이소티오시아네이트, 피코빌리 단백, 희토류 금속 킬레이트, 단실 클로라이드 또는 테트라메틸로다민이소티오시아네이트 등의 형광 물질, ³H, ¹⁴C, ¹²⁵I 등의 방사성 동위체, 비오틴, 아비딘 또는 화학 발광 물질을 들 수 있다.

여기서, 방사성 동위체 및 형광 물질은 단독으로 검출 가능한 시그널을 야기할 수 있는데, 효소, 화학 발광 물질, 비오틴 및 아비딘은 단독으로는 검출 가능한 시그널을 야기할 수 없기 때문에, 또한 1종 이상의 다른 물질과 반응함으로써 검출 가능한 시그널을 발생시키는 것이 가능해진다. 예를 들어, 효소의 경우에는 적어도 기질이 필요하고, 효소 활성을 측정하는 방법(비색법, 형광법, 생물 발광법 또는 화학 발광법 등)에 의존하여 다양한 기질이 사용된다. 예를 들어, 퍼옥시다아제의 경우에는, 기질로서 과산화수소를 사용한다. 또한, 비오틴의 경우에는 적어도 아비딘 또는 효소 수식 아비딘(예를 들어, 스트렙트아비딘-β-갈락토시다아제)을 기질로서 반응시키는 것이 일반적인데, 이에 한정되지 않는다. 필요에 따라 또한 상기 기질에 의존하는 다양한 발색 물질이 사용된다. 예를 들어, 비오틴의 기질로서 스트렙트아비딘-β-갈락토시다아제를 사용하는 경우에는, 발색 물질로서 4-메틸-움벨리페릴-β-D-갈락토시드를 사용할 수 있다.

본 발명의 표식화 항체는, 본 발명의 LAT를 검출, 동정 또는 정량하기 위하여 사용할 수 있고, 그를 위한 측정 방법으로서는, 관용되고 있는 면역 조직학적 기술을 사용하여 통상법에 따라서 실시할 수 있다(예를 들어, 실험 의학별책, 「세포 공학 핸드북」, 요도샤, 201 내지 213 페이지, 1992년 참조). 또한, 본 발명의 표식화 항체는, 상기한 면역 조직학적 시험뿐만 아니라, 시료 중의 세포, 조직 또는 장기 또는 그 일부로부터, 통상법에 따라서 가용성 막단백을 제조하고, 상기 가용성 막단백에 표식화 항체를 반응시킴으로써 가용성 막단백 중의 본 발명의 LAT의 존부를 확인하는 웨스턴 블로팅법에서도 사용할 수 있다. 상기와 같은 면역학적 측정 방법에 있어서는, 상기 중의 어느 하나의 표지 물질로 표식한 표식화 항체도 사용 가능한 데, 검출 감도 또는 정량 감도의 높이 및 조작의 편리성의 점을 고려하면, 퍼옥시다아제 등의 효소 또는 비오틴으로 표식한 모노클로날 항체를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 LAT의 검출, 동정 또는 정량하는 방법으로서는, 상기 면역 조직학적 기술 등에 의해 행할 수 있는데, 구체적으로는, 예를 들어 하기 (1) 및 (2)의 공정을 포함하는 방법을 들 수 있다.

(1) 시료에 본 발명의 표식화 항LAT 항체를 접촉시키는 공정; 및

(2) 상기 시료 중의 LAT에 결합한 표식화 항체를, 상기 표식화 항체에 결합하고 있는 표지 물질의 종류에 따라, 형광, 화학 발광 또는 방사 활성을 검출함으로써 측정하는 공정.

더욱 구체적으로는, 예를 들어 하기와 같은 공정을 포함할 수 있다.

(공정 1) 피검체로부터 채취된 시료를 파라포름알데히드 등에 의해 고정화하여, 고정화 시료를 제작하는 공정;

(공정 2) 상기 고정화 시료에 비오틴 또는 퍼옥시다아제 등의 효소에 의해 표식한 본 발명의 표식화 항체를 첨가해 항원 항체 반응을 행하게 하는 공정;

(공정 3) 이어서, 상기 고정화 시료를 필요에 따라 세정한 후, 사용한 효소의 종류에 따라 여러가지의 기질 또는 아비딘 또는 스트렙트아비딘-β-갈락토시다아제 등의 효소 수식 아비딘을 첨가하고, 상기 기질, 아비딘 또는 효소 수식 아비딘과 표지 항체 상의 표지 물질을 반응시키는 공정;

(공정 4) 공정 3에서 효소 수식 아비딘을 첨가한 경우에는, 상기 수식에 사용한 효소의 종류에 따라 여러가지의 기질(예를 들어, 4-메틸-움벨리페릴-β-D-갈락토시드 등)을 첨가하여, 아비딘에 결합한 효소와 기질을 반응시키는 공정;

(공정 5) 필요에 따라 고정화 시료를 세정하여, 효소 반응 및 발색 반응을 정지시키는 공정; 및

(공정 6) 고정화 시료를 현미경 하에서 관찰함으로써, 비색 강도, 형광 강도 또는 발광 강도를 측정하는 공정.

본 발명의 검출, 동정 또는 정량 방법으로서, 면역 염색법을 사용한, 유선 조직 중의 암세포의 검출법을 예로 하여 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명의 방법은 유선 조직으로부터 암세포 및 그 파편을 검출하고, 그 악성도를 진단하는 것이다. 본 발명의 방법에서는 LAT1의 유무를 면역 염색에 의해 직접 시각적으로 관찰 할 수 있는 점에서, 음성 또는 양성의 판단에 특수한 능력을 필요로 하지 않고, 간편하게 또한 확실하게 행할 수 있다.

본 발명의 검출, 동정 또는 정량 방법의 구체예로서는, 예를 들어 다음의 (1) 내지 (4)에 드는 방법을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다.

(1) 조직 및 스미어(Smear)법에 의한 암세포의 검출

적출 조직을 포르말린 고정·파라핀 포매(包埋) 후에 3 ㎛ 두께의 조직 절편을 제작하고, 슬라이드 글래스 상에 얹는다. 이 절편을 탈파라핀한 후에, 각각 아미노산 트랜스포터에 특이적으로 결합하는 항LAT1 및 LAT2 항체로 처리한다(1차 항체 처리). 1차 항체 처리 후, 샘플을 각각의 1차 항체에 특이적으로 결합하는 효소 또는 DAB(3,3'-디아미노벤지딘4염산염), 메틸그린, 마이어 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin) 등의 형광 색소 등으로 표식된 2차 항체에 의해 처리한다(표식 2차 항체 처리). 효소 표식한 2차 항체를 사용한 경우에는 기질 용액을 첨가하여, 발색시킨 후, 광학 현미경을 사용하여 세포를 관찰하여 양성 또는 음성의 판정을 행한다. 형광 색소에 의해 표식한 2차 항체를 사용하는 경우에는 2차 항체 처리 후, 형광 현미경을 사용하여 관찰하고, 암세포의 유무를 판정한다. 또한, 스미어법에서는, 적출 세포를 그대로 유리에 도포 또는 원심 분리기로 분리하여 세포 성분과 액 성분으로 나누고, 세포 성분(침전물)에 대하여 면역 염색을 행한다. 즉, 침전물을 슬라이드 글래스 상에 도포하고, 에탄올액 또는 10％ 포르말린액 등으로 고정한 후, 조직 절편과 동일한 면역 염색을 행하여 판정한다.

(2) 동결 포매법에 의한 암세포의 검출

적출 조직을 OCT 컴파운드 포매 후에 액체 질소로 급속 동결하고, 크라이오스탯(cryostat)에서 얇게 썰어서 슬라이드 표본을 제작한다. 이 표본을 10％ 포르말린이나 에탄올액 등으로 고정한 후에, 상기 (1)에 기재한 방법으로 면역 염색을 행한다. 적출 세포의 경우에는 원심 분리기로 분리하고, 침전물 성분에 10％ 포르말린으로 고정한 후, 다시 원심하고, 상청(上淸)을 버려서 세포 성분을 얻는다. 세포 성분을 히트 블록 등으로 따뜻하게 하면서, 2％ 아가로오스를 50 μL 첨가하여 혼화하고, 4℃ 하에서 고화시키고, 침전물 성분을 겔 내에 봉입한다. 고화한 겔을 OCT 컴파운드로 봉입하여, 동결 블록을 제작하고, 동결 블록을 크라이오스탯에서 얇게 썰어서 슬라이드 표본을 제작한다. 슬라이드 표본 상의 세포를 통상적인 방법에 따라서 처리하고, 면역 조직 형광 염색을 행한 후, 염색 후의 표본을 형광 현미경으로 관찰하고, 암세포의 유무를 판정한다.

(3) 적출 세포의 파라핀 포매법에 의한 암세포의 검출

상황에 따라, 침전물을 봉입한 겔을 이하의 방법으로 처리하고, 파라핀 표본에서의 검사도 가능하다. 겔을 4％ 포르말린에 의해 4℃에서 밤새 처리한 후, PBS로 세정하고, 통상적인 방법에 따라서 탈수, 투철을 행한다. 투철 후, 겔을 통상적인 방법에 따라 파라핀에 포매하여 파라핀 블록을 제작한다. 제작한 블록을 마이크로톰(microtome)으로 얇게 썰어서 슬라이드 표본을 제작한다. 제작한 슬라이드 표본을 통상적인 방법에 따라서 탈파라핀 처리한 후, 면역 조직 형광 염색을 행한 후, 염색 후의 표본을 형광 현미경으로 관찰하고, 암세포의 유무를 판정한다. 본 방법에 의해, 유방암 조직을 면역 조직 화학의 방법 등으로 식별할 수 있다.

(4) ELISA법을 사용한 암세포의 검출

ELISA법을 사용하여, 적출 조직에 포함되는 LAT 단백을 검출함으로써 적출 조직 중의 LAT 단백질량을 수치화할 수 있어, 보다 정량적인 판정이 가능해진다. 샘플을 계면 활성제 및 초음파로 처리한 후, 초원심으로 4℃, 100,000×g로 원심 분리하고, 상청을 버려서 단백 펠릿을 얻는다. 펠릿에 10％ BSA/PBST를 적당량 가하고, 초음파 처리에 의해 현탁시킨다. 이것을 샘플로 하여 ELISA법을 행한다.

우선, 샘플을 면역 플레이트에 100 μL/웰 첨가하고, 4℃ 하에서 밤새 방치한다. 샘플 용액을 버리고, 블로킹 용액을 첨가하고, 실온에서 1시간 방치한다. 웰 내의 블로킹 용액을 버리고, 적절히 희석한 항LAT 1차 항체 용액을 첨가하고, 실온에서 2시간 방치한다(이 동안에 항LAT 항체가 웰의 저면의 각 LAT 단백질에 결합함). 1차 항체액을 버리고, PBST로 세정한 후, 적절히 희석한 표식 2차 항체를 첨가하고, 실온에서 1시간 방치한다. 웰 내를 PBST로 세정하고, 기질 용액을 첨가하여 발색 또는 화학 발광시키고, 그 색소량 또는 발광의 정도를 분광 광도계 또는 루미노미터(luminometer)로 측정함으로써, LAT 단백질의 존재의 유무를 확인하고, 판정한다.

본 발명의 다른 특징은 유관내 종양 조직 중의 종양의 악성도를 판정할 수 있는 것이다. 본 발명의 시료 중의 유관내 종양 중의 종양의 악성도를 판정하는 방법은 정상 세포에 발현하는 LAT를 정량함으로써, 정상 세포의 양을 알 수 있다. 또한 종양 세포에 발현하는 LAT를 정량함으로써, 종양 세포의 양을 알 수 있다. 게다가, 이들 세포는 동종의 LAT를 필요로 하는 것이기 때문에, 이 양자의 정량치로부터, 전체의 어느 정도가 종양 세포화하고 있는지를 알 수 있다. 따라서, 본 발명은 시료 중의 정상 세포에 발현하는 LAT2를 정량하고, 또한 종양 세포에 발현하는 LAT1을 정량하고, 양자의 정량치를 비교하는 것을 포함하는 시료 중의 세포의 종양의 악성도를 판정하는 방법도 제공한다.

본 발명의 다른 특징은, 유선종양이 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 HER2 중의 어느 것에도 음성인 삼중음성 유방암인, 유선종양의 치료 지침을 부여할 수 있는 것이다. 삼중음성 유방암의 대다수에 있어서 LAT1이 고발현하고 있는 점에서, 지금까지 치료가 곤란했던 삼중음성 유방암에 LAT1을 표적으로 한 치료가 유효한 것을 알 수 있다. 또한, 삼중음성인지 여부에 관계 없이, 유방암 전반에 있어서 LAT1 발현의 유무를 조사함으로써, LAT1을 표적으로 한 치료가 유효하다.

본 발명의 다른 특징은, ER(에스트로겐 수용체)의 면역 염색, PgR(프로게스테론 수용체)의 면역 염색 및 HER2의 면역 염색과 LAT1의 면역 염색을 조합함으로써 유방암의 진단을 할 수 있는 것이다. 본 발명에 있어서, ER, PgR 및 HER2의 면역 염색 외에 항LAT1 모노클로날 항체를 사용한 LAT1의 면역 염색을 사용하면, 보다 정확하게 유방암을 진단할 수 있다. ER, PgR 및 HER2의 면역 염색에는 시판하는 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, ER 및 PgR의 면역 염색에는 벤타나 XT 시스템(벤타나 재팬, 도쿄, 일본)을 사용할 수 있고, 또한, HER2의 면역 염색 키트로서는 DAKO EGFR pharmDx 키트(다코 노스 아메리카 인크.(Dako North America Inc.), 카핀테리아, 캘리포니아주, 미국)을 사용할 수 있지만, ER, PgR 및 HER2를 측정할 수 있는 수단이면, 이것들에 한정되지 않는다. ER 및 PgR 발현 상태의 유무를 평가함으로써, 에스트로겐, 프로게스테론 또는 이들의 유사체 등의 호르몬 요법의 효과를 추정할 수 있다. HER2 유전자 발현 상태의 유무를 평가함으로써, 유방암에서의 항HER2 약제의 효과를 추정할 수 있다. 이것들과 마찬가지로, 항LAT1 모노클로날 항체를 사용한 LAT1의 면역 염색 키트에 의해 LAT1 발현 상태의 유무를 평가함으로써, LAT1 트랜스포터 제어제의 효과를 추정할 수 있다. 이들 면역 염색은 동시에 행해도 되고, 각각 독립적으로 행해도 된다.

(키트)

또한 본 발명은 상기 본 발명의 각 방법 중 어느 하나를 행하기 위한 진단 키트를 제공한다. 즉 본 발명은 유선종양의 진단에 있어서 LAT1의 검출, 동정 또는 정량을 위한, 항LAT1 모노클로날 항체를 함유하는 진단 키트에 관한 것이다. 이러한 진단 키트는, 유선종양이 유관내 종양이며, 그 악성도를 진단하기 위한 것이어도 되고, 유선종양이 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 HER2 중의 어느 것에도 음성인 삼중음성 유방암인 것이어도 된다. 또한, 본 발명은 에스트로겐 수용체의 면역 염색 키트, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 키트 및 HER2의 면역 염색 키트와, LAT1의 면역 염색 키트를 포함하는 조합을 함유하는, 유선종양의 진단 키트에 관한 것이기도 하다. 또한, 본 발명은 유선종양의 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체나 HER2의 검색 결과가 양성·음성에 관계 없이, LAT1의 발현을 동정하는 키트에 관한 것이기도 하다.

상세하게는, 시료 중의 정상 세포에 발현하는 LAT2를 검출, 동정 또는 정량하기 위한 키트 및 자료 중의 종양 세포에 발현하는 LAT1을 검출, 동정 또는 정량하기 위한 키트를 함유하여 이루어지는, 피검체로부터 채취한 시료 중의 종양 세포를 검출, 동정 또는 정량하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 LAT를 검출, 동정 또는 정량하기 위한 진단 키트는 LAT를 검출, 동정 또는 정량할 수 있기 위한 자재를 포함하여 이루어지고, 예를 들어 상기의, 단독으로 또는 다른 물질과 반응함으로써 검출 가능한 시그널을 야기할 수 있는 표지 물질로 표식하여 이루어지는 표식화 항체 등을 함유하는 것이다. 본 발명의 키트에 있어서의, 정상 세포에 발현하는 LAT를 검출, 동정 또는 정량하기 위한 키트 및 종양 세포에 발현하는 LAT를 검출, 동정 또는 정량하기 위한 키트는, 모두 LAT를 검출, 동정 또는 정량하기 위한 키트의 1종이며, 정량하기 위해서는 동일한 종류의 측정용의 세트로 하는 것이 바람직하지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.

예를 들어, 정상 세포에 발현하는 LAT(예를 들어, LAT2)를 검출, 동정 또는 정량하기 위한 키트를 형광 물질로 표식화한 것으로 하고, 종양 세포에 발현하는 LAT(예를 들어, LAT1)를 검출, 동정 또는 정량하기 위한 키트를 방사성 동위체로 표식화한 것으로 할 수 있지만, 파장의 상이한 형광 물질로 표식화한 것과는 상이한 방사성 동위체로 표식화한 것으로 하는 것이 바람직하다.

(실험 방법)

본 발명에 있어서의 LAT의 작용에 대하여 보다 구체적으로 설명한다. 우선, 본 발명자들은 LAT의 면역 조직학적 검토를 행하였다. 외과적 처치에 의해 적출하고, 파라핀 포매한 유선종양 세포의 조직 표본을 탈파라핀 및 블로킹을 행한 후, 최종 농도 2 μg/mL의 항LAT 항체(LAT1은 마우스 항인간 LAT1 모노클로날 항체(비특허문헌 1의 23, 631 페이지 도 3A 참조), LAT2는 래빗 항인간 LAT2 폴리클로날 항체(항hEST3A-N 항체, 가부시끼가이샤 트랜스제닉, 구마모토)로 4℃ 하에서 밤새 처리한다. PBS에 의한 세정 후, 모두 ChemMate DAKO ENVISION 시스템 키트(DAKO ChemMate ENVISION 시스템 HRP 키트)의 유니버설 항체를 첨가하고, 실온에서 30분간 처리 후, DAB(3,3'-디아미노 벤지딘4염산염) 기질 용액에 의해 발색한다.

이 결과, LAT1 항체에 의한 암세포의 특이적인 염색이 보이는 한편, LAT2에 대해서는 특이적인 염색은 보이지 않았다. 도 1 내지 도 5에 항LAT1 모노클로날 항체를 사용한 염색 시험의 결과를 도시한다. 예를 들어, 도 1은 LAT1 발현 강도를 나타내는 표준, 도 2에서는 악성인 비침윤성 유관내암에 있어서의 LAT1의 발현예, 도 3에서는 삼중음성 유방암에 있어서의 LAT1의 고발현예, 도 4에서는 HER2 음성인 유방암에 있어서의 LAT1의 발현예, 도 5는 HER2 양성인 유방암에 있어서의 LAT1의 발현예를 도시한다. 이하, 각각에 대하여 설명한다.

도 1은 LAT1 발현 강도의 표준을 도시한다. LAT1 발현은 시니크로프(Sinicrope)의 방법(비특허문헌 11 참조)을 개변한 방법(비특허문헌 4 참조)에 의해, 발현의 강도(intensity)[0(음성), 1(경도의 양성), 2(중도의 양성) 및 3(강도의 양성)]과 발현 영역의 면적(area)[0(음성), 1(국소적, 10％ 이하), 2(부분적, 10％보다 큼, 30％ 이하) 및 3(미만성(diffuse), 30％보다 큼)]의 곱에 의해 얻어진 값을 평가값(스코어)으로 한다. 이 염색도를 기초로 LAT1의 발현도를 구한다. 도 1은 LAT1 발현 강도의 목표를 나타내고, 좌측으로부터 순서대로 강도 0, 강도 1, 강도 2, 강도 3을 나타낸다.

(유관내 종양에 있어서의 악성, 양성의 감별)

도 2는 모두 유관내 종양인, 유관내 유두종과 비침윤성 유관내암의 비교를 도시한다. 상단은 HE(헤마톡실린·에오신) 염색, 하단은 LAT1 면역 염색에 의한 처리를 행한 것이다. 좌측 상단이 양성인 유관내 유두종, 우측 상단이 악성인 비침윤성 유관내암의 HE 염색 사진이다. 좌측 하방이 LAT1 처리를 행한 유관내 유두종, 우측 하방이 LAT1 처리를 행한 비침윤성 유관내암의 사진이다. 도 2로부터 명백해진 바와 같이, 유관내 유두종에 있어서는, LAT1의 발현이 거의 보이지 않는 한편, 비침윤성 유관내암의 세포막에 LAT1이 강한 발현이 보인다. 비침윤 유관내암군의 LAT1 발현 스코어는, 유관내 유두종군의 LAT1 발현 스코어와 비교하여 유의미하게 높다. 따라서, LAT1을 바이오마커로 함으로써, 지금까지 감별이 곤란했던 유관내 유두종과 비침윤성 유관내암을 간편한 방법으로 진단할 수 있다.

유관내 종양 중, 양성인 유관내 유두종과 악성인 비침윤 유관내암과의 감별은 조직 진단상 중요해서, 수술적 절제의 필요성의 판단에 불가결하다. 그러나, 양 종양의 감별에는 종래의 HE 염색 표본에 의한 병리 조직 진단 방법으로는 확실한 감별 요소가 명확하지 않아, 감별 곤란한 병변이 많다. 본 발명에 의해, 양성의 유관내 유두종에서는 LAT1 발현이 매우 낮아, 고발현하고 있었던 악성의 비침윤 유관내암과는 대조적인 것이 발견되었다. 따라서, LAT1의 면역 조직학적 발현의 평가에 의해 양성 또는 악성의 감별이 가능해진다.

(삼중음성 유방암의 진단)

도 3은 ER(에스트로겐 수용체), PgR(프로게스테론 수용체), HER2 중의 어느 것에도 음성인 삼중음성 유방암세포에 있어서의 LAT1 발현의 소견을 도시한다. 좌측으로부터 순서대로 HE(헤마톡실린·에오신) 염색(표준 염색), HER2, ER, PgR, LAT1로 처리한 경우를 나타낸다. 이 예는, ER, PgR 및 HER2의 어느 쪽에도 음성이었던 삼중음성 유방암세포가 LAT1에 있어서는 강도 3(고강도)의 양성을 나타낸 예이다. 삼중음성군 17예 중 14예(약 83％)가 LAT1 고발현(스코어 6 이상)하고 있는 점에서, LAT1이 삼중음성 유방암의 바이오마커로서 유용하다고 생각된다.

침윤암 중에서, 삼중음성 유방암에는 유효한 분자 표적 치료가 지금까지 없었던 바, 이 삼중음성 유방암군의 대부분에 LAT1의 고발현이 보였다. 삼중음성 유방암은 임상적으로 예후 불량의 증례가 많은 점에서, 이 소견은, LAT1 고발현의 전립선암 예가 LAT1 저발현예와 비교하여 예후가 불량했던 것과 일치한다. 따라서, 삼중음성 유방암에 항LAT1 분자 표적 요법(항LAT1 항체, LAT1 트랜스포터에게 작용하는 물질 등)이 유용한 것을 시사하고 있어, 금후 LAT1을 표적으로 한 항암 요법의 도입이 기대된다.

도 4는 침윤성암 중, HER2 음성예(허셉 테스트(Hercep Test)에 있어서의 스코어 0)이며 LAT1 양성인 유방암의 예를 도시한다. 좌측으로부터 순서대로 ER, PgR, HER2 및 LAT1로 처리한 경우이다. 이 예에서는, ER 및 PgR에서는 핵에 양성, HER2에서는 음성, LAT1에서는 세포막에 중강도의 양성(강도 2)을 나타냈다.

도 5는 침윤성암 중, HER2 양성예(허셉 테스트에 있어서의 스코어 3)이며 LAT1이 고발현의 양성인 유방암의 예를 도시한다. 좌측으로부터 순서대로 HE(헤마톡실린·에오신) 염색, HER2로 처리한 경우, LAT1로 처리한 경우이다. 이 결과, HER2 양성예(허셉 테스트에 있어서의 스코어 3)에 있어서 LAT1 항체에서도 강도 3(고강도)의 염색이 인정되었다. 도 4 및 도 5에 있어서, 침윤성암 중, HER2 양성예(허셉 테스트에 있어서의 스코어 3)군에 있어서의 LAT1 발현 스코어는 HER2 음성예(허셉 테스트에 있어서의 스코어 0)군과 비교하여 유의미하게 높았다.

이상으로부터, LAT1은 종래 진단이 곤란하였던 유관내 종양의 양성 또는 악성의 감별을 위한 새로운 진단 툴이 될 수 있다. 또한, LAT1은 지금까지의 ER, PrG 및 HER2 중의 어느 것에도 음성인 삼중음성 유방암의 치료에 있어서 극히 유망한 바이오마커가 될 수 있다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는 데, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.

참고예 1 실험 샘플의 추출

본 발명자들이 소속된 시설에 있어서 2005년부터 2009년까지 외과적으로 절제된 유선의 종양성 병변을 무작위적으로 추출하고, 유관내 유두종(intraductal papilloma) 10예, 비침윤성 유관암(DCIS) 10예 및 침윤암(invasive carcinoma) 67예의 계 87예의 수술 재료의 병리 검체를 사용하였다. 이 중, ER, PgR, HER2 모두 음성인 삼중음성 침윤암은 17예였다.

실시예 1 항 LAT 항체를 사용한 염색

참고예 1에서 추출한 유선의 종양성 병변에 대하여 모두, 10％ 포르말린 고정 파라핀 포매 블록을 제작하고, 또한 종양성 병변의 최대 할면(割面)의 대표적 블록으로부터 3 ㎛의 얇게 썬 절편을 제작하고, 5분간의 마이크로웨이브에 의한 부활 후에 본 발명자들이 제작한 마우스 항LAT1 모노클로날 항체(비특허문헌 1의 23, 631 페이지 도 3A 참조)를 4℃ 이하의 온도에서 밤새 반응시켰다. DAKO ChemMate ENVISION 시스템 HRP 키트의 유니버설 항체를 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시킨 후에, DAB(3,3'-디아미노 벤지딘4염산염) 기질 용액에 의해 발색시켰다. 핵 염색에는 메틸 그린 또는 마이어 헤마톡실린 염색을 시공하였다. ER 및 PgR의 면역 염색에는 벤타나 XT 시스템(벤타나 재팬, 도쿄, 일본)을 사용하고, HER2의 면역 염색은 DAKO EGFR pharmDx 키트(다코 노스 아메리카 인크., 카핀테리아, 캘리포니아주, 미국)에 의해 행하였다. 또한, LAT2에 대해서는, 래빗 항인간 LAT2 폴리클로날 항체(항hEST3A-N 항체, 가부시끼가이샤 트랜스제닉, 구마모토)을 사용하였다.

이 결과, 대부분의 유방암세포에는 LAT1이 발현하고 있고(LAT1 발현 스코어는 0 내지 9), LAT2도 경도이지만 발현하고 있었다(LAT2 발현 스코어는 0 내지 3). 한편, 정상 세포에 있어서의 LAT1 발현 스코어는 0 내지 1이며, LAT2 스코어는 1 내지 4였다.

LAT1 발현은 시니크로프의 방법(비특허문헌 11 참조)을 개변한 방법(비특허문헌 4 참조)에 의해, 발현의 강도(intensity)[0(음성), 1(경도의 양성), 2(중도의 양성), 3(강도의 양성)]와 발현 영역의 면적(area)[0(음성), 1(국소적, 10％ 이하), 2(부분적, 10％보다 대, 30％ 이하), 3(미만성, 30％보다 큼)]의 곱에 의해 얻어진 값을 평가값(스코어)으로 하였다. 통계 처리는, 각 군의 평균값±표준 편차로서 표현하고, 2군 간의 비교는 비파라미터 만-휘트니(Mann-Whitney) U 테스트에 의해, 위험율 5％ 이하에서 유의로 하였다.

결과

실시예 1의 결과를 도 6에 도시하였다. 도 6은, 유선종양에 있어서의 LAT1 발현의 비교를 도시한다.

(1) 비침윤성 유관내암과 유관내 유두종의 LAT1 발현의 비교

악성인 비침윤성 유관암(DCIS)군의 LAT1 발현 스코어는 5.1±3.2로서, 양성의 유관내 유두종(intraductal papilloma)군의 1.5±2.1과 비교하여 유의미하게 높았다(p=0.0156).

(2) HER2 양성예와 음성예의 LAT1 발현의 비교

침윤성암(invasive carcinoma) 중 HER2 양성예(허셉 테스트에 있어서의 스코어 3)군에 있어서의 LAT1 발현 스코어는 6.6±2.8로서, HER2 음성예(허셉 테스트에 있어서의 스코어 0)군의 3.6±2.4와 비교하여 유의미하게 높았다(p=0.0008). 이것으로부터, HER2 양성예는 LAT1 스코어가 높고, 세포 증식의 면으로부터, 악성도가 높다고 할 수 있다.

(3) 삼중음성 유방암군에 있어서의 LAT1 발현

ER, PgR 및 HER2의 모두 음성인, 삼중음성 유방암군의 대부분은 LAT1 고발현 증례(스코어가 6 이상이었던 것이 17예 중 14예, 즉 약 83％)이며, 그 17예의 LAT1 발현 스코어는 6.8±2.6으로 최고치를 나타냈다. 이것으로부터, 삼중음성 유방암군의 대부분은 LAT1 스코어가 높아, LAT1을 대상으로 한 분자 표적 치료가 유효하다고 생각된다.

Claims

유선종양의 진단에 있어서 LAT1의 검출, 동정 또는 정량을 위한, 항LAT1 모노클로날 항체를 함유하는 진단 키트.
제1항에 있어서, 상기 유선종양이 유관내 종양이며, 그 악성도를 진단하기 위한 진단 키트.
제1항에 있어서, 상기 유선종양이 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 HER2 중의 어느 것에도 음성인 삼중음성 유방암인 진단 키트.
에스트로겐 수용체의 면역 염색 키트, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 키트 및 HER2의 면역 염색 키트와, LAT1의 면역 염색 키트를 포함하는 조합을 함유하는, 유선종양의 진단 키트.
피험자로부터 적출된 유선 조직에 항LAT1 모노클로날 항체를 접촉시켜, 상기 조직 중의 LAT1을 검출, 동정 또는 정량하는 공정을 포함하는, 유선종양의 진단 방법.
제5항에 있어서, 상기 유선종양이 유관내 종양이며, 그 악성도를 진단하는, 진단 방법.
제5항에 있어서, 상기 유선종양이 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 HER2 중의 어느 것에도 음성인 삼중음성 유방암인 진단 방법.
에스트로겐 수용체의 면역 염색, 프로게스테론 수용체의 면역 염색, HER2의 면역 염색 및 LAT1의 면역 염색을 함유하여 이루어지는, 유선종양의 진단 방법.