IT201800004137A1 - Metodo di screening in vitro per diagnosi precoce dei tumori del cavo orale e relativo kit, basato in particolare su saggio elisa - Google Patents

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Description

METODO DI SCREENING IN VITRO PER DIAGNOSI PRECOCE DEI TUMORI
DEL CAVO ORALE E RELATIVO KIT, BASATO IN PARTICOLARE SU
SAGGIO ELISA
SETTORE DELL’INVENZIONE
La presente invenzione rientra nel campo della diagnosi precoce di tumori del cavo orale. In particolare, l’invenzione si riferisce ad un metodo per la diagnosi e/o per la predizione del rischio di sviluppare tumori del cavo orale comprendente il rilevamento in estratti cellulari di determinati marcatori di tumori del cavo orale utilizzando saggi immunologici, ad esempio ELISA (saggio immunoassorbente legato ad un enzima). L’invenzione si riferisce anche al relativo kit per la diagnosi e/o per la predizione del rischio di sviluppare tumori del cavo orale.
TECNICA ANTERIORE
Il carcinoma del cavo orale è tra le 10 forme di tumore più diffuse al mondo, ogni anno infatti, vengono diagnosticati più di 500.000 nuovi casi. Nell’ambito delle manifestazioni tumorali del distretto testa-collo, diversi sono i tessuti che possono essere interessati da tumori maligni del cavo orale: le mucose orali, linguale, faringea, laringea e palatina e l’epitelio ghiandolare. L’80% dei carcinomi del cavo orale sono carcinomi a cellule squamose (SSC), i quali registrano, a 5 anni dalla prognosi, una mortalità elevata a causa della diagnosi tardiva, non essendoci al momento marcatori specifici. Non esistono al momento metodi di screening scientificamente affidabili, non invasivi, per la prevenzione del tumore del cavo orale.
Esiste pertanto la necessità di fornire un metodo per una diagnosi precoce dei tumori del cavo orale, che permetta di identificare soggetti a rischio di sviluppare la patologia e sottoporli ad una diagnosi di certezza, basata su prelievo istologico e conferma anatomopatologica.
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE
Lo scopo della presente invenzione è quello di offrire un kit innovativo, rapido, economico, sensibile e non invasivo, utile allo screening della diagnosi precoce per individuare forme neoplastiche negli stadi pre-sintomatici. In particolare, gli autori si sono concentrati sull’espressione di specifici marcatori del carcinoma del cavo orale, ossia il recettore del fattore di crescita epiteliale (EGFR) e i recettori steroidei, recettore dell’androgeno (AR) e recettore dell’estrogeno (ER), proteine che il kit oggetto dell’invenzione permette di valutare, in particolare attraverso il saggio ELISA.
Nel contesto della presente invenzione, la sequenza di EGFR corrisponde preferibilmente alla sequenza disponibile nel database NCBI con N. di accesso: NM_005228.3 o alla sequenza proteica codificata.
Nel contesto della presente invenzione, la sequenza di AR corrisponde preferibilmente alla sequenza disponibile nel database NCBI con N. di accesso: NM_000044.4 o alla sequenza proteica codificata.
Nel contesto della presente invenzione, la sequenza di ER corrisponde preferibilmente alla sequenza disponibile nel database NCBI con N. di accesso XP_495993 o NP_001428.1 o alla sequenza nucleotidica codificante.
La presente invenzione fornisce pertanto un ausilio diagnostico non invasivo di screening dell’eventuale presenza di lesioni precancerose utile nel supportare la diagnosi precoce dei tumori del cavo orale, in un’ottica di prevenzione terziaria. Il metodo e il kit dell’invenzione sono infatti rivolti in particolare a soggetti che presentano condizioni flogistiche che possono preludere a trasformazioni cellulari.
La presente invenzione rientra nel campo dei dispositivi basati su saggi immunologici, preferibilmente essa si basa su un’analisi di proteine su estratti cellulari mediante ELISA. L’invenzione si riferisce inoltre alla realizzazione di un prodotto innovativo costruito attraverso l’assemblaggio di semilavorati anche disponibili in commercio. Il prodotto comprende uno strumento utile per prelevare le cellule potenzialmente pericolose, e il necessario per consentire al professionista (odontoiatra) di analizzarle e verificare la presenza di biomarcatori, interpretando il risultato del test stesso. Il prodotto ha una modalità di utilizzo estremamente semplice.
Forma pertanto un oggetto della presente invenzione un metodo in vitro per la predizione del rischio di sviluppare e/o per la diagnosi e/o per la prognosi e/o per monitorare la progressione di e/o per lo screening di un trattamento terapeutico di un tumore del cavo orale in un soggetto comprendente le seguenti fasi:
a) rilevare e/o quantificare almeno il recettore dell’androgeno (AR) e/o il recettore dell’estrogeno (ER) in un campione biologico ottenuto dal soggetto, preferibilmente dal cavo orale del soggetto; e
b) comparare rispetto ad un campione di controllo.
Preferibilmente il campione ottenuto dal soggetto è ottenuto dal cavo orale del soggetto, più preferibilmente dalle mucose orali, linguale, faringea, laringea e palatina e epitelio ghiandolare. Preferibilmente il campione ottenuto dal soggetto è ottenuto dalla lingua. In una forma di realizzazione preferita, nella fase a) è ulteriormente rilevato e/o quantificato il recettore del fattore di crescita epiteliale (EGF-R).
Preferibilmente, la presenza di AR e/o ER e/o EGF-R, e/o una quantità più elevata di AR e/o ER e/o EGF-R rispetto alla quantità nel campione di controllo indica che il soggetto è a rischio di sviluppare o è affetto da un tumore del cavo orale.
Preferibilmente, la fase a) comprende:
- contattare e/o incubare detto campione biologico con almeno un anticorpo anti-AR e/o un anticorpo anti-ER e/o un anticorpo anti-EGF-R in condizioni tali che l’AR e/o l’ER e/o l’EGF-R si leghino a detti anticorpi e formino un complesso anticorpo-antigene se AR e/o ER e/o EGF-R sono presenti; e
- rilevare e/o quantificare AR e/o ER e/o EGF-R legato all’anticorpo, preferibilmente utilizzando mezzi di rilevamento e/o quantificazione per detti anticorpi.
In un’ulteriore forma di realizzazione preferita, il soggetto nel quale è stata rilevata e/o quantificata la presenza di AR e/o ER e/o EGF-R e/o dei relativi anticorpi come sopra definiti è successivamente sottoposto ad ulteriori metodi di diagnosi di un tumore del cavo orale, quali ad esempio prelievo istologico e conferma anatomopatologica. Tali metodi diagnostici attualmente utilizzati risultano essere costosi ed invasivi. Pertanto, il metodo secondo l’invenzione permette di effettuare un primo screening dei soggetti potenzialmente a rischio che risulta essere efficace, veloce e non invasivo.
Preferibilmente, detto campione biologico proviene da un’area infiammata del cavo orale. Ancora preferibilmente, detto campione biologico è un campione cellulare, preferibilmente sottoposto a lisi cellulare, o tissutale o un fluido, ad esempio saliva, sangue o siero.
Preferibilmente, detto tumore del cavo orale è selezionato dal gruppo costituto da: tumore delle mucose orali, tumore linguale, tumore faringeo, tumore laringeo, tumore palatino, tumore dell’epitelio ghiandolare, carcinoma a cellule squamose (SSC), carcinoma epidermale della bocca, carcinoma laringeo, carcinoma della lingua e carcinoma del labbro.
Forma un ulteriore oggetto della presente invenzione un kit comprendente:
- mezzi di rilevamento e/o quantificazione di AR e ER e opzionalmente EGF-R;
- opzionalmente mezzi di controllo.
In una forma di realizzazione preferita, il kit comprende:
(a) almeno un anticorpo anti-AR e/o un anticorpo anti-ER;
(b) mezzi di rilevamento e/o quantificazione di almeno un complesso AR-anticorpo e/o un complesso ER-anticorpo.
Il kit preferibilmente comprende opzionalmente mezzi di controllo.
Preferibilmente, il kit comprende ulteriormente un anticorpo anti-EGF-R e mezzi di rilevamento e/o quantificazione per un complesso EGF-R-anticorpo.
Preferibilmente, nel kit secondo l’invenzione, l’anticorpo anti-AR e/o l’anticorpo anti-ER e/o l’anticorpo anti-EGF-R sono immobilizzati ad un supporto solido.
Preferibilmente, detto supporto solido è una striscia di plastica, preferibilmente PVDF (polivinilidenfluoruro).
In una forma di realizzazione particolarmente preferita, il kit comprende un dispositivo con due estremità, in cui la prima estremità comprende l’anticorpo anti-AR e/o l’anticorpo anti-ER e/o l’anticorpo anti-EGF-R e la seconda estremità comprende uno scovolino per prelevare un campione biologico da un soggetto. Preferibilmente, la prima estremità comprende inoltre un controllo positivo e/o un controllo negativo.
In un’ulteriore forma di realizzazione preferita, il kit comprende: almeno una soluzione tampone e/o una soluzione di lisi e/o un sistema di rivelazione. Preferibilmente, detto sistema di rivelazione comprende o è costituito da un anticorpo secondario provvisto di sistema enzimatico rivelatore e/o un substrato per la rivelazione dell’anticorpo secondario, ad esempio mediante reazione colorimetrica.
Preferibilmente, detta soluzione tampone e/o soluzione di lisi e/o sistema di rivelazione sono forniti in diversi pozzetti, preferibilmente collocati in una singola scatola.
La presente invenzione fornisce inoltre un uso del kit come sopra descritto per eseguire il metodo come sopra descritto.
In una forma di attuazione preferita, detto uso comprende le seguenti fasi:
- immersione di detto campione biologico in una soluzione di lisi per ottenere una prima soluzione nella quale AR e/o ER e/o EGF-R sono rilasciati, se presenti nel campione;
- immersione di detti anticorpi anti-AR e/o anti-ER e opzionalmente anti-EGF-R in detta prima soluzione comprendente per ottenere dei primi complessi anticorpo-antigene;
- immersione di detti primi complessi anticorpo-antigene in una seconda soluzione comprendente un anticorpo secondario provvisto di sistema enzimatico rivelatore per ottenere dei secondi complessi anticorpo-antigene;
- immersione di detti secondi complessi anticorpo-antigene in una terza soluzione comprendente un substrato per la rivelazione dell’anticorpo secondario;
- rilevare e/o quantificare AR e/o ER e/o EGF-R rispetto ad un campione di controllo. Un ulteriore oggetto della presente invenzione è un kit come sopra descritto per uso nel metodo come sopra descritto.
Forma un ulteriore oggetto della presente invenzione un dispositivo comprendente due estremità, in cui la prima estremità comprende l’anticorpo anti-AR e/o l’anticorpo anti-ER e opzionalmente l’anticorpo anti-EGF-R e la seconda estremità comprende uno scovolino per prelevare un campione biologico da un soggetto. Preferibilmente, la prima estremità comprende inoltre un controllo positivo e/o un controllo negativo. Preferibilmente, la prima estremità comprende una striscia di PVDF caricata con gli anticorpi sopra definiti. La presente invenzione fornisce inoltre un uso del dispositivo come sopra descritto per eseguire il metodo come sopra descritto.
I marcatori “AR”, “EF”, “EGF-R” nel contesto della presente invenzione includono il rispettivo gene, mRNA, cDNA o la proteina da essi codificata, inclusi frammenti, derivati, varianti, isoforme etc. Preferibilmente, detti marcatori sono caratterizzati dai numeri di Accesso NCBI sopra definiti.
Nella presente invenzione, l’espressione “proteine” si riferisce preferibilmente a il recettore dell’androgeno, il recettore dell’estrogeno e/o il recettore del fattore di crescita epiteliale, preferibilmente umani, e l’espressione “anticorpi” si riferisce preferibilmente ai relativi anticorpi anti-AR (ad esempio Ab N-20 sc 816; Santa Cruz Biotechnologies Inc.), anti-ER (ad esempio anti-ERα antibody sc 543; Santa Cruz Biotechnologies Inc.) e/o anti-EGFR (ad esempio antibody sc-03-G, Santa Cruz Biotechnologies Inc.).
L'espressione “proteina” si intende come comprendente anche la corrispondente proteina codificata da geni ortologhi od omologhi corrispondenti, mutanti funzionali, derivati funzionali, frammenti funzionali o analoghi, loro isoforme.
Nel contesto della presente invenzione, il termine “polipeptide” o “proteina” comprende: i. la proteina intera, varianti alleliche e loro ortologhi;
ii. qualsiasi frammento funzionale sintetico, ricombinante o proteolitico;
iii. qualsiasi equivalente funzionale, come ad esempio analoghi funzionali sintetici o ricombinanti.
Nella presente invenzione, le espressioni “metodo per la predizione del rischio di sviluppare”, “metodo per la diagnosi”, “metodo di screening” e/o lo “screening” comprendono preferibilmente lo screening di soggetti potenzialmente a rischio di essere affetti o sviluppare un tumore del cavo orale.
Nella presente invenzione, il “campione di controllo” e/o i “mezzi di controllo” possono essere un campione isolato da un soggetto sano o da un paziente affetto da un altro disturbo o da un paziente affetto da un tumore del cavo orale prima di un trattamento terapeutico, un paziente affetto da un tumore del cavo orale durante un trattamento terapeutico, un paziente affetto da un tumore del cavo orale in momenti diversi durante il corso della malattia. I mezzi di controllo possono essere usati per comparare la presenza dei marcatori come sopra definiti rispetto ad un appropriato controllo. Il controllo può essere ottenuto per esempio, con riferimento agli standard noti, sia da un soggetto normale che da una popolazione normale.
In particolare, nella presente invenzione, l’espressione “controllo positivo” si riferisce preferibilmente ad un campione che contiene le proteine sopra definite e/o acidi nucleici codificanti per dette proteine e/o a RNA messaggeri trascritti da detti acidi nucleici o ad un anticorpo anti-actina, mentre l’espressione “controllo negativo” si riferisce ad un campione che non li contiene, quali ad esempio cellule derivate da differenti tumori.
Nel caso di un metodo per monitorare la progressione del tumore del cavo orale, il campione di controllo potrebbe essere un campione isolato dal medesimo soggetto in vari punti temporali prima dell'inizio della terapia, in vari punti temporali nel corso della terapia, ecc.
Nel caso di un metodo per lo screening di un trattamento terapeutico di un tumore del cavo orale, il campione di controllo può essere un campione prelevato da soggetto senza trattamento o da soggetto trattato con una sostanza da saggiare o da soggetto trattato con un trattamento di riferimento. In questo caso, se la quantità dei marcatori sopra definiti nel campione biologico isolato è minore o uguale al valore di controllo, la sostanza testata potrebbe essere efficace per il trattamento del tumore.
Nei metodi secondo l’invenzione, quando la quantità dei marcatori sopra definiti nel campione biologico isolato è più alta rispetto a quella del valore di controllo può indicare che il soggetto ha una prognosi sfavorevole.
Come usato qui, il termine “soggetto” comprende qualsiasi essere umano o non umano, ad esempio mammiferi e non-mammiferi, come i primati non umani, pecore, cani, gatti, cavalli, mucche, polli, anfibi, rettili, ecc.
I mezzi di rilevamento o sistemi di rivelazione nel contesto della presente invenzione comprendono preferibilmente mezzi in grado di rilevare e/o misurare la quantità dei marcatori sopra definiti. Nel caso in cui si rilevi una proteina, i mezzi per il rilevamento sono ad esempio almeno un anticorpo specifico per la proteina, analoghi funzionali o derivati dello stesso. Nel caso in cui si debba rilevare un complesso antigene-anticorpo, i mezzi di rilevamento sono ad esempio anticorpi secondari coniugati a un enzima, substrati luminescenti, biglie magnetiche rivestite con anticorpi di cattura, cocktail di anticorpi liofilizzati personalizzati e/o colonne con cartucce di filtrazione dimensionale e/o combinati con un filtro con anticorpi specifici (SAF). Preferibilmente detto anticorpo secondario è provvisto di un sistema enzimatico rivelatore e detto sistema di rivelazione comprende ulteriormente un substrato per la rivelazione dell’anticorpo secondario, ad esempio mediante reazione colorimetrica.
I kit secondo l'invenzione possono inoltre comprendere usuali componenti ausiliari, come tamponi, vettori, coloranti, ecc. e/o istruzioni per l'uso. Preferibilmente detto kit comprende inoltre un supporto solido in cui l'anticorpo viene immobilizzato. Preferibilmente il kit dell’invenzione è un kit per saggio immunologico, più preferibilmente un kit ELISA.
Il kit può comprendere inoltre mezzi di controllo per confrontare l'aumento della quantità dei marcatori con un valore di controllo appropriato. Il valore di controllo può essere ottenuto per esempio, con riferimento a standard noti, sia da un soggetto normale o da popolazione normale.
Nella presente invenzione, l'espressione “rilevare” o “rilevamento” in relazione ad una proteina o ad un acido nucleico (DNA o RNA) o relativi anticorpi, si riferisce ad esempio a qualsiasi metodo di osservazione, accertamento o quantificazione dei segnali indicativi della presenza della proteina in un campione o la quantità assoluta o relativa di detta proteina bersaglio in un campione, ad esempio tramite chemiluminescenza, fluorimetria, spettrofotometria, ecc. I metodi possono essere combinati con metodi di marcatura di proteine o acidi nucleici per fornire un segnale, per esempio: colorazione immunoistochimica, ELISA, sospensione cellulare, citologia, fluorescenza, radioattività, colorimetria, gravimetria, diffrazione di raggi X o adsorbimento, magnetismo, attività enzimatica e simili. Nella presente invenzione, il rilevamento della presenza dell’RNA messaggero trascritto dall’acido nucleico o relative proteine o anticorpi come sopra definiti può essere effettuato tramite qualsiasi tecnica nota all’esperto dell’arte, quali ad esempio Northern blotting o metodologie RT-PCR quantititative o semi-quantitative utilizzando primer oligonucleotidici appropriati.
La rilevazione e/o quantificazione dei marcatori sopra definiti può corrispondere alla misurazione della quantità o alla misurazione di un’alterazione nella quantità del marcatore, più in particolare ad un aumento o una diminuzione della sua quantità. Una rilevazione di un aumento può essere correlata ad un peggioramento del disturbo, mentre una diminuzione può essere correlata ad un miglioramento del disturbo o al recupero del soggetto.
In una forma di realizzazione preferita, il metodo comprende inoltre la rilevazione e/o quantificazione di almeno un ulteriore marcatore e il confronto con un appropriato campione di controllo.
Nella presente invenzione, l’espressione “quantificare” o “quantificazione” può essere intesa come una misura della quantità o concentrazione o di detti recettori o dei rispettivi anticorpi, preferibilmente semi - quantitativa o quantitativa. Il termine "quantità", come usato nella descrizione si riferisce ma non è limitato alla quantità assoluta o relativa di proteine o anticorpi, e qualsiasi altro valore o parametro associato con lo stesso o che può derivare da questi. Tali valori o parametri comprendono valori di intensità del segnale ottenuto sia da proprietà fisiche o chimiche della proteina o anticorpo, ottenuti mediante misurazione diretta, per esempio, valori di intensità in un immunodosaggio, spettroscopia di massa o una risonanza magnetica nucleare. Inoltre, questi valori o parametri includono quelli ottenuti mediante misurazione indiretta.
I sopra definiti anticorpi comprendono anticorpi monoclonali umani e animali o loro frammenti, anticorpi a singola catena e loro frammenti e minianticorpi, anticorpi bispecifici, diacorpi, triacorpi, o loro dimeri, oligomeri o multimeri. Preferibilmente, l'anticorpo è selezionato dal gruppo costituito da un'immunoglobulina intatta (oppure un anticorpo), un Fv, un scFv (frammento Fv a catena singola), un Fab, un F(ab')2, un dominio di tipo anticorpale, un dominio mimetico anticorpale, un singolo dominio anticorpale, un anticorpo multimerico, un peptide o un frammento proteolitico contenente la regione di legame dell'epitopo. Nella presente invenzione, il termine “anticorpo” è usato nel senso più generale e comprende vari anticorpi e strutture di mimetici anticorpali, compresi, ma non limitati a, anticorpi monoclonali, anticorpi policlonali, anticorpi multi-specifici (ad esempio anticorpi bi-specifici), anticorpi umani, anticorpi umanizzati, anticorpi deimmunizzati, anticorpi chimerici, nanocorpi, derivati di anticorpi, frammenti di anticorpi, anticaline, DARPin, ““affibody””, ““affilin””, affimeri, affitine, ““alphabody””, avimeri, finomeri, minicorpi e altri domini di legame, a condizione che essi mostrino l'attività di legame desiderata per l'antigene.
La presente invenzione verrà descritta in esempi non limitativi, facendo riferimento alle seguenti figure:
Figura 1. Componentistica: dispositivo provvisto di scovolino (lato a) e striscia di PVDF su supporto plastico (lato b) e scatola di rivelazione.
Figura 2. Componentistica: dispositivo provvisto di scovolino (lato a) e striscia di PVDF su supporto plastico armata con anticorpi primari (lato b) e scatola di rivelazione con venti pozzetti con buffer, sistemi lisanti e rivelazione utili per due pazienti.
Figura 3. Schema di funzionamento del device: (a) prelievo delle cellule dalla mucosa orale con lo scovolino; (b) immersione dello scovolino nel primo pozzetto.
Figura 4. Schema di utilizzo del dispositivo: (a) estrazione dello scovolino; (b) estrazione della striscia di PVDF.
Figura 5. Schema di immersione della striscia di PVDF nel primo pozzetto e successivi quattro lavaggi.
Figura 6. Schema di immersione della striscia nel pozzetto 6 per la reazione con l’anticorpo secondario, nei pozzetti 7, 8 e 9 per i lavaggi e nel pozzetto 10 per la rilevazione con il substrato.
Figura 7. Espressione colorimetrica relativa ai risultati.
Figura 8. Fasi di preparazione della striscia.
Figura 9. (a) e (b) Schema formazione della striscia e (c) successivo sviluppo.
Figura 10. Western blot per EGFR in cellule KB e HEP-2.
Figura 11. Western blot per AR in cellule KB e HEP-2.
Figura 12. Western blot per ER in cellule KB e HEP-2.
MATERIALI E METODI
Protocollo di preparazione della striscia di PVDF
Le fasi di preparazione della striscia di PVDF armata con gli anticorpi primari di interesse sono le seguenti:
1) Idratazione della striscia di PVDF (ThermoFisher Scientific Catalog Number LC2002) con Metanolo per 5 minuti (Fig.8, Pannello A).
2) Lavaggio con acqua per 5 minuti (Fig.8, Pannello B).
3) Due lavaggi con PBS per 5 minuti (Fig.8, Pannello B).
4) Incubazione con la proteina A-biotina da Staphylococcus aureus (Sigma-Aldrich, 10 µg/mL) per 1 ora in PBS (Fig.8, Pannello B).
5) Due lavaggi con PBS (Fig.8, Pannello B).
6) Blocking con soluzione 3% BSA in PBS per 1 ora (Fig.8, Pannello B).
7) Tre lavaggi con PBS per 5 minuti (Fig.8, Pannello B).
8) Montaggio del PVDF su apparato multi canale BioRad (Fig.8, Panneli C, D, E). 9) Incubazione con soluzione di anticorpi di coniglio (anti-AR antibody: Ab N-20 sc 816; Santa Cruz Biotechnologies Inc., Santa Cruz, CA; anti-ERα antibody sc 543; Santa Cruz Biotechnologies Inc., Santa Cruz, CA; and anti-EGFR antibody sc-03-G, Santa Cruz Biotechnologies Inc., Santa Cruz, CA) circa 400 µL per canale, in agitazione O.N. (Fig.8, Pannello F).
10) Tre lavaggi con PBS per 5 minuti in ogni canale (Fig.8, Pannello F).
11) Due lavaggi del filtro con PBS TEA 0,2 M (Fig.8, Pannello F).
12) Incubazione con DMP 25 mM in TEA HCl 0,2 M pH 8,2 (Fig.8, Pannello F, G, H) 13) Incubazione con TEA 0,2 M+20 mM etanolammina (Fig.8, Pannello F, G, H) 14) Due lavaggi con PBS per 5 minuti (Fig.8, Pannello F, G, H).
15) Conservazione in 0,02 NaN3 in PBS (Fig.8, Pannello F ,G, H).
16) Il filtro viene tagliato (Fig. 9a) in maniera perpendicolare ai canali in cui sono stati caricati gli anticorpi primari anti-EGFR, anti-AR e anti-ER (per la cattura dei relativi antigeni rilasciati dal campione citologico raccolto) per ottenere una striscia di larghezza pari a circa 0,4 cm che verrà montata sul supporto del dispositivo (Fig. 9b). La striscia è stata poi trattata con metodo ELISA allo scopo di evidenziare gli antigeni specifici presenti nel campione citologico testato (Fig. 9c).
Le linee cellulari derivate dalla mucosa del cavo orale, esprimono il recettore del fattore di crescita epiteliale (EGFR), pertanto, non idonee come controllo negativo di uno screening basato sulla positività dell’espressione di recettori ormonali.
Il controllo negativo caricato (CTR-) deriva da cloni di cellule tumorali derivanti dal cancro della mammella (MDA-MB-453, ATCC HTB-131) le cui peculiari caratteristiche sono di seguito elencate:
i) il clone, MDA-MB-453, pur essendo di derivazione epiteliale tumorale non esprime il recettore del fattore di crescita epiteliale (EGF-R);
ii) il clone, MDA-MB-453, pur essendo di natura cellulare mammaria tumorale non esprime il recettore dell’androgeno (AR) e il recettore dell’estrogeno (ER) (Kristina Subik et al., Breast Cancer (Auckl). 2010; 4: 35–41).
Il controllo positivo (CTR+) è un anticorpo anti-actina (Sigma–Aldrich, A2066).
Protocollo ELISA della striscia di PVDF in cellule del cavo orale
Le cellule KB (ATCC CCL-17) derivate dal carcinoma epidermale della bocca e le cellule HEP-2 (ATCC CCL-23) derivate dal carcinoma laringeo, vengono lisate in un buffer di lisi, le proteine estratte vengono separate mediante SDS-PAGE. Al termine della corsa elettroforetica, le proteine vengono trasferite, per 2 ore, su un filtro di PVDF, a temperatura ambiente. In seguito il filtro viene lavato in tampone PBS contenente Tween-20 pH 7,2 (PBST-buffer, PBS Sigma-Aldrich P5368 e Tween-20 allo 0,02% Sigma-Aldrich P1379) e 3% di albumina sierica bovina (BSA) per due ore allo scopo di bloccare i siti aspecifici. Successivamente, il filtro viene incubato per almeno due ore con gli anticorpi primari specifici anti AR, anti ER e anti EGFR (anti-AR antibody: Ab N-20 sc 816; Santa Cruz Biotechnologies Inc., Santa Cruz, CA; anti-ERα antibody sc 543; Santa Cruz Biotechnologies Inc., Santa Cruz, CA; and anti-EGFR antibody sc-03-G, Santa Cruz Biotechnologies Inc., Santa Cruz, CA). Infine, il filtro dopo tre lavaggi di dieci minuti con PBST-buffer, viene incubato con gli anticorpi secondari specifici ed il segnale sarà rilevato mediante un kit a rilascio di chemioluminescenza (ECL, Amersham Pharmacia Inc.). L’analisi densitometrica semiquantitativa è stata elaborata mediante lo Scan LKB (Amersham Pharmacia Inc.).
DESCRIZIONE DEL DISPOSITIVO
Strumentazione d’analisi e sua composizione
1) dispositivo in plastica simile ad una penna con due estremità funzionali una dotata di brush e tappo giallo (Lato A) l’altra dotata di supporto per la striscia di PVDF (Immobilon) armata con gli anticorpi primari di interesse, con tappo trasparente (Lato B) Fig.1 e Fig.2; 2) scatola organizzata in file di 10 pozzetti chiuse con strip led di alluminio contenti buffer e sistemi lisanti e di rivelazione; Fig 1 e Fig 2.
Modalita’ di utilizzo
L’odontoiatra, in presenza di lesioni potenzialmente cancerose, può prelevare un campione di cellule utilizzando l’apposito strumento di raccolta presente nel kit e procedere come segue:
1) Raccolta del campione citologico: prelievo delle cellule dal cavo orale sulla mucosa sospetta con l’apposito scovolino presente all’estremità (Lato A) del dispositivo provvisto di tappo giallo; Fig 3a.
2) Immersione dello scovolino per 15 minuti nel primo pozzetto contenente il tampone di lisi, che consente il rilascio in soluzione delle proteine ossia gli antigeni di interesse EGFR, AR e ER presenti nell’estratto delle cellule del cavo orale; Fig 3b.
3) Si richiude il tappo del device lato A; Fig 4.
4) Si apre il tappo del device lato B; Fig 4b.
5) Immersione dell’estremità (lato B) del supporto con la striscia di PVDF per 5 minuti, nel primo pozzetto per consentire l’interazione delle proteine (antigeni) con gli anticorpi primari adesi alla striscia di PVDF allo scopo di formare l’immunocomplesso (anti-AR antibody: Ab N-20 sc 816; Santa Cruz Biotechnologies Inc., Santa Cruz, CA; anti-ERα antibody sc 543; Santa Cruz Biotechnologies Inc., Santa Cruz, CA; and anti-EGFR antibody sc-03-G, Santa Cruz Biotechnologies Inc., Santa Cruz, CA); Fig 5.
6) Lavaggi (tre) del supporto con la striscia di PVDF in pozzetti contenenti PBST-buffer per eliminare le proteine aspecificamente adese all’immunocomplesso; Fig 5.
7) Immersione del supporto con la striscia di PVDF per 10 minuti nel pozzetto contenente l’anticorpo secondario provvisto di sistema enzimatico rivelatore (Fosfatasi alcalina, Sigma-Aldrich A2306); Fig 6.
8) Lavaggi (due) del supporto con la striscia di PVDF nei pozzetti contenenti PBST-buffer per eliminare l’eccesso di anticorpo secondario; Fig 6.
9) Immersione del supporto con la striscia di PVDF nel pozzetto contenente il substrato (BCIP/NBT, ROCHE 11681451001) necessario per la reazione colorimetrica; Fig 6.
10) Lavaggi (due) della striscia nel pozzetto contenente PBST-buffer per eliminare l’eccesso; Fig 6.
11) Si noterà la reazione colorimetrica in presenza delle proteine di interesse; Fig 7.
RISULTATI
L’invenzione proposta è frutto di studi scientifici svolti dall’autore sul crosstalk tra i recettori EGF e estradiolo (ER) e androgeno (AR) nei tumori epiteliali. Tali studi sono stati il presupposto traslazionale per la formulazione di uno strumento utile per la diagnosi precoce di patologie neoplastiche. Tale impiego trova solidità nei risultati che dimostrano che il complesso dei recettori steroidei (AR / ER / Src) è richiesto per l'azione dell'EGF (1,2). L’utilizzo delle tecniche ELISA riportate nei lavori scientifici dell’autore hanno reso possibile la realizzazione del sistema rivelatore del dispositivo.
Gli estratti cellulari utilizzati in laboratorio scelti per la validazione dello strumento ideato, provengono da cellule KB derivate da carcinoma epidermale della bocca e dalle HEP-2, cellule derivate da carcinoma laringeo. Nella Fig. 9c sono mostrati i risultati riguardanti la coespressione delle proteine di interesse (EGFR, AR e ER), sulla striscia di PVDF del dispositivo. A conferma dei risultati ottenuti con il device, gli estratti cellulari sono stati sottoposti ad analisi di Western blot per i singoli recettori ed i risultati sono mostrati nelle Figure 10, 11, 12. Nella Fig. 10 sono evidenti le bande relative al recettore EGFR in cellule KB e HEP-2, i campioni sono stati caricati in triplicato ed il recettore è ben evidente nei due tipi cellulari mentre non risulta evidente nel controllo negativo rappresentato da cellule MDA-MB-453 (Kristina Subik et al. Breast Cancer (Auckl). 2010; 4: 35–41). Nella Fig. 11 si vede la presenza nelle stesse cellule del recettore AR (i campioni sono stati caricati in duplicato), anche in questo caso la banda è visibile solo nelle cellule del cavo orale (KB ed HEP-2) e non nel controllo negativo (MDA-MB-453). Nella Fig. 12 si evidenzia, infine, il recettore ER (i campioni sono stati caricati in duplicato) anche in questo caso il recettore è stato evidenziato solo nelle cellule del cavo orale (KB ed HEP-2) e non nel controllo negativo (MDA-MB-453).
Il test proposto garantisce un indice di predittività significativamente alto poiché l’espressione contemporanea di questi tre recettori correla con il cambiamento del fenotipo cellulare da benigno a maligno.
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Claims (20)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo in vitro per la predizione del rischio di sviluppare e/o per la diagnosi e/o per la prognosi e/o per monitorare la progressione di e/o per lo screening di un trattamento terapeutico di un tumore del cavo orale in un soggetto comprendente le seguenti fasi: a) rilevare e/o quantificare almeno il recettore dell’androgeno (AR) e il recettore dell’estrogeno (ER) in un campione biologico ottenuto dal soggetto, preferibilmente dal cavo orale del soggetto; e b) comparare rispetto ad un campione di controllo.
  2. 2. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui nella fase a) è ulteriormente rilevato e/o quantificato il recettore del fattore di crescita epiteliale (EGF-R).
  3. 3. Il metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la presenza di AR e/o ER, e opzionalmente EGF-R, e/o una quantità di AR e/o ER, e opzionalmente EGF-R, più elevata rispetto alla quantità nel campione di controllo indica che il soggetto è a rischio di sviluppare o è affetto da un tumore del cavo orale.
  4. 4. Il metodo secondo la rivendicazione 1, 2 o 3, in cui la fase a) comprende: - contattare ed incubare detto campione biologico con almeno un anticorpo anti-AR e un anticorpo anti-ER e opzionalmente un anticorpo anti-EGF-R in condizioni tali che l’AR e l’ER e opzionalmente l’EGF-R si leghino a detti anticorpi e formino un complesso anticorpo-antigene se AR e/o ER e/o EGF-R sono presenti; e - rilevare e/o quantificare AR e/o ER e/o EGF-R legato all’anticorpo, preferibilmente utilizzando mezzi di rilevamento e/o quantificazione per detti anticorpi.
  5. 5. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il soggetto nel quale è stata rilevata e/o quantificata la presenza di AR e/o ER e opzionalmente EGF-R e/o di un anticorpo anti-AR e/o un anticorpo anti-ER e opzionalmente un anticorpo anti-EGF-R è successivamente sottoposto ad ulteriori metodi di diagnosi di un tumore del cavo orale.
  6. 6. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto campione biologico proviene da un’area infiammata del cavo orale.
  7. 7. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto campione biologico è un campione cellulare, preferibilmente sottoposto a lisi cellulare, o tissutale o un fluido, ad esempio saliva, sangue o siero.
  8. 8. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto tumore del cavo orale è selezionato dal gruppo costituto da: tumore delle mucose orali, tumore linguale, tumore faringeo, tumore laringeo, tumore palatino, tumore dell’epitelio ghiandolare, carcinoma a cellule squamose (SSC), carcinoma epidermale della bocca, carcinoma laringeo, carcinoma della lingua e carcinoma del labbro.
  9. 9. Un kit comprendente: - mezzi di rilevamento e/o quantificazione di AR e ER e opzionalmente EGF-R; - opzionalmente mezzi di controllo.
  10. 10. Un kit secondo la rivendicazione 9 comprendente: (a) almeno un anticorpo anti-AR e un anticorpo anti-ER; (b) mezzi di rilevamento e/o quantificazione di almeno un complesso AR-anticorpo e un complesso ER-anticorpo.
  11. 11. Il kit secondo la rivendicazione 10 ulteriormente comprendente un anticorpo anti-EGF-R e mezzi di rilevamento e/o quantificazione per un complesso EGF-R-anticorpo.
  12. 12. Il kit secondo la rivendicazione 10 o 11, in cui l’anticorpo anti-AR, l’anticorpo anti-ER e opzionalmente l’anticorpo anti-EGF-R sono immobilizzati ad un supporto solido.
  13. 13. Il kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 12 comprendente un dispositivo con due estremità, in cui la prima estremità comprende l’anticorpo anti-AR, l’anticorpo anti-ER e opzionalmente l’anticorpo anti-EGF-R e la seconda estremità comprende uno scovolino per prelevare un campione biologico da un soggetto, preferibilmente la prima estremità comprende inoltre un controllo positivo e/o un controllo negativo.
  14. 14. Il kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 13 comprendente almeno una soluzione tampone e/o una soluzione di lisi e/o un sistema di rivelazione.
  15. 15. Il kit secondo la rivendicazione 14 in cui detta soluzione tampone e/o soluzione di lisi e/o sistema di rivelazione sono forniti in diversi pozzetti, preferibilmente collocati in una singola scatola.
  16. 16. Uso del kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 15 per eseguire il metodo come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8.
  17. 17. L’uso secondo la rivendicazione 16 comprendente le seguenti fasi: - immersione di detto campione biologico in una soluzione di lisi per ottenere una prima soluzione nella quale AR e/o ER e/o EGF-R siano rilasciati, se presenti nel campione; - immersione di detti anticorpi anti-AR e anti-ER e opzionalmente anti-EGF-R in detta prima soluzione per ottenere dei primi complessi anticorpo-antigene; - immersione di detti primi complessi anticorpo-antigene in una seconda soluzione comprendente un anticorpo secondario provvisto di sistema enzimatico rivelatore per ottenere dei secondi complessi anticorpo-antigene; - immersione di detti secondi complessi anticorpo-antigene in una terza soluzione comprendente un substrato per la rivelazione dell’anticorpo secondario; - rilevare e/o quantificare AR e/o ER e/o EGF-R rispetto ad un campione di controllo.
  18. 18. Un kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 17 per uso nel metodo come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8.
  19. 19. Un dispositivo comprendente due estremità, in cui la prima estremità comprende l’anticorpo anti-AR, l’anticorpo anti-ER e opzionalmente l’anticorpo anti-EGF-R e la seconda estremità comprende uno scovolino per prelevare un campione biologico da un soggetto, preferibilmente la prima estremità comprende inoltre un controllo positivo e/o un controllo negativo.
  20. 20. Uso del dispositivo secondo la rivendicazione 19 per eseguire il metodo come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8.
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