CN107200779B

CN107200779B - 稳定过表达LAT3的β细胞株的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN107200779B
Application number: CN201710532909.5A
Authority: CN
Inventors: 李全宏; 刘桂梅
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-07-03
Filing date: 2017-07-03
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2037-07-03
Also published as: CN107200779A

Abstract

本发明公开了稳定过表达LAT3的β细胞株制备方法及应用。本发明将合成的全基因LAT3序列成功插入慢病毒表达骨架质粒载体中，得到过表达LAT3的慢病毒质粒，并通过慢病毒转染获得过表达LAT3的β细胞株。实验结果证明：过表达LAT3的β细胞株可显著、持续、稳定的过表达LAT3，经亮氨酸处理后胰岛素的分泌量显著提高，说明亮氨酸依赖LAT3基因参与调控β细胞胰岛素分泌水平。本发明为研究LAT3及支链氨酸在胰岛素分泌作用提供一种有力的工具。

Description

稳定过表达LAT3的β细胞株的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种稳定过表达LAT3的β细胞株的制备方法，以及稳定过表达LAT3的β细胞株在研究支链氨基酸及其转运载体LAT3调控β细胞胰岛素分泌中应用。

背景技术

支链氨基酸(BCAAs)作为营养信号直接或间接的影响代谢，BCAAs包括亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸三种必需氨酸。富含BCAAs的食品通过调节体重，肌肉蛋白的合成以及葡萄糖稳态和机体健康代谢正相关。但是胰岛素抵抗和II型糖尿病的人和啮齿类动物出现高水平BCAAs，这种BCAAs看似矛盾的现象会引发如下思考：一是BCAAs或者富含高BCAAs的食品对胰岛素和葡萄糖的稳态有利还是有害？二是BCAAs是否是胰岛素抵抗或II型糖尿病的前兆或者诱因？三是胰岛素抵抗或者病理状态下，高水平的BCAAs的产生的诱因？因此开展以BCAAs为代表的信号氨基酸在II型糖尿病中的重要作用以及作用机制的研究，有利于解释富含BCAAs的功能性食品对II型糖尿病等典型代谢性疾病的改善。

BCAA参与正常机体蛋白质的合成，更重要的作用是作为信号因子参与调控细胞生长。L型氨基酸转运载体(L-type amino acid transporter，LAT)将BCAA转运到细胞内发挥作用，在四种L型转运载体中，LAT3和LAT4转运谱偏好性转运BCAA以及蛋氨酸，且LAT3主要在胰腺和肝脏中表达。研究表明在不同的癌细胞中，LATs介导蛋白翻译和细胞生长，在前列腺癌形成过程中LAT3高表达，在癌细胞迁移过程中LAT1高表达。在体外敲降LAT3或LAT1的表达能够抑制mTORC1活性，细胞生长和细胞周期。然而LAT3在胰岛素分泌及抵抗中的作用尚不清楚。

发明内容

本发明的一个目的是提供L型氨基酸转运载体3(LAT3)的新用途。

本发明提供了L型氨基酸转运载体3在如下(1)-(4)中任一种中的应用：

(1)调控胰岛素分泌；

(2)制备调控胰岛素分泌的产品；

(3)调控胰岛β细胞胰岛素分泌；

(4)制备调控胰岛β细胞胰岛素分泌的产品；

本发明还提供了L型氨基酸转运载体3和亮氨酸在共同调控胰岛素分泌中的应用；

本发明还提供了L型氨基酸转运载体3和亮氨酸在共同调控胰岛β细胞胰岛素分泌中的应用；

所述L型氨基酸转运载体3是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

本发明还提供了与L型氨基酸转运载体3相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与L型氨基酸转运载体3相关的生物材料在如下(1)-(5)中任一种中的应用：

(1)调控胰岛素分泌；

(2)制备调控胰岛素分泌的产品；

(3)调控胰岛β细胞胰岛素分泌；

(4)制备调控胰岛β细胞胰岛素分泌的产品；

(5)制备胰岛素分泌量提高的转基因细胞；

上述应用中，所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码L型氨基酸转运载体3的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因细胞系。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码L型氨基酸转运载体3的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码L型氨基酸转运载体3的cDNA分子或基因组DNA分子。

上述应用中，所述调控为促进。

本发明还有一个目的是提供一种制备胰岛素分泌量提高的转基因细胞的方法。

本发明提供的制备胰岛素分泌量提高的转基因细胞的方法包括提高受体细胞中L型氨基酸转运载体3的表达量和/或活性，得到转基因细胞的步骤；所述转基因细胞的胰岛素分泌量高于受体细胞。

上述方法中，所述提高受体细胞中L型氨基酸转运载体3的表达量和/或活性的方法为在受体细胞中过表达L型氨基酸转运载体3。

上述方法中，所述过表达的方法为将所述L型氨基酸转运载体3的编码基因导入受体细胞。

上述方法中，所述L型氨基酸转运载体3的编码基因通过过表达L型氨基酸转运载体3的慢病毒质粒导入受体细胞。所述过表达L型氨基酸转运载体3的慢病毒质粒的制备方法如下：将序列1所示的DNA分子插入到pENTR_L1-MCS-2A-EGFP-2A-Puro-L2载体的NotI-HF和SpeI酶切位点间，得到中间质粒，然后将中间质粒、pLV'-R4-ccdB-R2和pENTR_L4_Hef1a_R1病毒载体在LR酶作用下经过重组得到过表达L型氨基酸转运载体3的慢病毒质粒pHS-AVC-YW246。

所述慢病毒质粒pHS-AVC-YW246与辅助质粒共同转染包装细胞HEK 293FT进行包装，得到慢病毒液pHS-AVC-YW246，再将慢病毒液pHS-AVC-YW246转染受体细胞，经过筛选，即可得到胰岛素分泌量提高的转基因细胞。

上述方法中，所述L型氨基酸转运载体3的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

上述方法中，所述受体细胞为胰岛β细胞；所述胰岛β细胞具体为RIN-M5F细胞。

上述方法制备得到的胰岛素分泌量提高的转基因细胞也属于本发明的保护范围。

本发明还有一个目的是提供一种促进胰岛素分泌的产品。

本发明提供的促进胰岛素分泌的产品的活性成分为L型氨基酸转运载体3或由L型氨基酸转运载体3与亮氨酸组成的组合物。

本发明的最后一个目的是提供一种促进胰岛素分泌的方法。

本发明提供促进胰岛素分泌的方法包括在胰岛β细胞中过表达L型氨基酸转运载体3的步骤。

本发明将合成的全基因LAT3序列成功插入慢病毒表达骨架质粒载体中，得到过表达LAT3的慢病毒质粒，并通过慢病毒转染获得过表达LAT3的β细胞株。实验结果证明：过表达LAT3的β细胞株可显著、持续、稳定的过表达LAT3，并经亮氨酸处理后胰岛素的分泌量显著提高，说明亮氨酸依赖LAT3基因参与调控β细胞胰岛素分泌。本发明为研究LAT3及支链氨酸在胰岛素分泌中的作用提供一种有力的工具。

附图说明

图1为过表达LAT3的慢病毒载体的双酶切鉴定结果及测序结果。图1(a)为3个过表达LAT3的慢病毒载体的单克隆的酶切鉴定图；其中，第一泳道为Marker，从下至上依次是300bp、500bp、800bp、1000bp、1500bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、8000bp和10000bp。图1(b)为LAT3(Slc43a1)基因测序比对结果。

图2为0.4ug/ml嘌呤霉素筛选细胞的结果。

图3为嘌呤霉素筛选细胞后Real-time PCR检测LAT3表达量。

图4为嘌呤霉素筛选细胞后Western-blotting检测LAT3表达量。

图5为亮氨酸刺激稳定细胞株胰岛素分泌结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的KRBH缓冲液(Krebs-Ringer bicarbonate buffer，KRBH)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，各溶质及其浓度如下：129mmol/L NaCl，4.8mmol/L KCl，1.2mmol/LMgSO₄，1.2mmol/L KH₂PO₄，2.5mmol/L CaCl₂，5mmol/L NaHCO₃，0.1％BSA，10mmol/L HEPES；pH 7.4。

下述实施例中的含葡萄糖KRBH缓冲液是将葡糖糖与KRBH缓冲液混匀得到的溶液，其中葡糖糖在含葡萄糖KRBH缓冲液中的浓度为3mM。

下述实施例中的含葡萄糖和亮氨酸的KRBH缓冲液是将葡糖糖、亮氨酸与KRBH缓冲液混匀得到的溶液，其中葡糖糖在含葡萄糖和亮氨酸的KRBH缓冲液中的浓度为3mM，亮氨酸在含葡萄糖和亮氨酸的KRBH缓冲液中的浓度为10mM。

实施例1、一种稳定过表达LAT3的β细胞株的制备

一、稳定过表达LAT3的慢病毒质粒的构建及包装

1、LAT3基因序列的合成

利用美国国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation，NCBI)网站数据库，查询获得编码LAT3的基因mRNA序列(mRNA ID:NM_001107742)，根据LAT3的mRNA序列进行全基因合成，合成的LAT3基因的核苷酸序列如序列1所示。

2、中间质粒的构建

使用NotI-HF(NEB，货号：R3189V)和SpeI(NEB，货号：RO133V)酶切骨架载体pENTR_L1-MCS-2A-EGFP-2A-Puro-L2(BioGeek，pHS-BVC-B027)，得到酶切后的骨架载体；然后将合成的LAT3目的片段(序列1)和酶切后的骨架载体以等摩尔的比例加入到15ul的Gibsonassembly mix(BioGeek，BG14201S)中，水补足20ul体系，50℃放置1h，80℃失活20min进行Gibson拼装，得到中间质粒。最后将中间质粒转化感受态DH5α，涂布于含Amp抗性的LB培养基平板，37℃恒温培养箱过夜；菌落PCR挑取阳性克隆，提取阳性克隆的质粒进行酶切鉴定，并送测序。

测序结果表明：中间质粒为将序列1所示的DNA分子插入骨架载体pENTR_L1-MCS-2A-EGFP-2A-Puro-L2的NotI-HF和SpeI酶切位点间，且保持骨架载体pENTR_L1-MCS-2A-EGFP-2A-Puro-L2其他序列不变后得到的质粒。

按照上述方法，将序列3所示的GFP的编码基因插入骨架载体pENTR_L1-MCS-2A-EGFP-2A-Puro-L2的NotI-HF和SpeI酶切位点间，且保持骨架载体pENTR_L1-MCS-2A-EGFP-2A-Puro-L2其他序列不变，得到中间对照质粒。

3、过表达LAT3的慢病毒质粒的构建

将步骤2制备的中间质粒、pLV'-R4-ccdB-R2(BioGeek，pT590)和pENTR_L4_Hef1a_R1(BioGeek，pZ529)分别稀释至浓度为20nM，然后各取0.5ul加入到0.5ul的

II Enzyme mix(thermo fisher，货号：11791020)中，水补足2.5ul体系，室温放置2-3h，得到混合物。然后将混合物转化，涂板，挑取单克隆培养，并进行酶切鉴定，鉴定正确的克隆即为过表达LAT3的慢病毒质粒，将其命名为pHS-AVC-YW246载体。pHS-AVC-YW246载体表达LAT3蛋白，LAT3蛋白的氨基酸序列如序列2所示。

酶切鉴定的具体步骤如下：取3个单克隆提取质粒，用限制性内切酶NotI-HF和speI对pHS-AVC-YW246载体进行酶切鉴定。酶切体系如下：Cut smart buffer 1ul、plasmid500ng、NotI-HF 0.5ul、SpeI 0.5ul、ddH₂O补足10ul。

酶切鉴定结果如图1(a)所示。从图中可以看出：pHS-AVC-YW246载体预期酶切电泳条带为1277bp/1835bp/2368bp/7084bp。从图中可以看出：所挑选的3个单克隆，酶切鉴定均正确，选择1号单克隆载体用于下述实验。

慢病毒质粒PT080制备方法与过表达LAT3的慢病毒质粒的制备方法相同，仅将中间质粒替换为中间对照质粒，即得到过表达GFP的慢病毒质粒，将其命名为慢病毒质粒PT080。

二、慢病毒包装

1、HEK 293FT细胞准备

将(3-5)×10⁶个HEK 293FT细胞(BioGeek，BG23002)传代接种至100mm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO₂的培养箱中，培养16-24h。传代过程中将细胞充分消化为单细胞悬液，以获得较好的包装效果。

2、慢病毒包装系统转染

①使用ddH₂O分别将慢病毒包装试剂盒(BioGeek，BG20401S)中的包装质粒混合物(Package Plasmid Mix)及慢病毒表达质粒(过表达LAT3的慢病毒质粒pHS-AVC-YW246)稀释为终浓度1.0μg/μL的质粒溶液；

②取1支1.5mL离心管(标记为A管)，加入300μL Opti-MEM培养基(lifetechnologies，31985-070)及40μL EpFectTM Transfection Reagent(BioGeek，BG20201S)，混匀后室温静置5min；

③取1支1.5mL离心管(标记为B管)，加入2.5μL终浓度为1.0μg/μL的慢病毒表达质粒溶液及7.5μL的包装质粒混合物(Package Plasmid Mix)，充分混匀；

④将A管中溶液加入B管中，得到混合溶液，充分混匀，室温静置15-30min；

⑤将混合溶液逐滴接种至含有HEK 293FT细胞培养液(HEK 293FT细胞培养液是将HEK 293FT细胞和DMEM完全培养基混匀得到的，HEK 293FT细胞接合度为80％-85％)的培养皿中，轻微水平震荡培养皿以混匀，得到培养体系；然后将培养体系置于37℃，5％CO₂培养6h；再将培养体系中的培养基更换为37℃水浴预热新鲜的RPMI-1640完全培养基。RPMI-1640完全培养基是将血清和RPMI-1640培养基(22400089，Gibco)混匀得到的培养基，其中，血清的体积分数为15％。

3、慢病毒收集及浓缩

①转染48h后，收集含有慢病毒的上清液；向培养皿中补充10-15mL新鲜的RPMI-1640完全培养基(22400089，Gibco)，继续培养24h，进行第二次病毒上清液收集；

②将两次收集的病毒上清液混合，并使用0.45μm滤器进行过滤，过滤后的病毒液可以进行浓缩或直接感染目的细胞；

③按照病毒上清液：浓缩试剂(BioGeek，BG201001L)＝5：1的比例进行混合，得到混合液，4℃放置2h或过夜；

④将混合液按照4℃，4000g离心30min，可见管底有米白色沉淀；

⑤小心移去上清，切勿碰触沉淀物，加入适量体积PBS溶液(Solarbio，P1020-500)，用微量移液器轻轻吹打重悬沉淀物，得到病毒浓缩液，即慢病毒液pHS-AVC-YW246；

⑥将病毒浓缩液分装，保存于-80℃，即取即用，切忌反复冻融。

对照慢病毒液PT080的制备方法与慢病毒液pHS-AVC-YW246制备方法相同，只是转染时将慢病毒表达质粒pHS-AVC-YW246替换成慢病毒质粒PT080。

四、慢病毒转导RIN-m5f细胞

①将生长状态良好的RIN-M5F细胞(ATCC编号为CRL-11605)消化计数后，稀释至3×10⁵个/mL，按照2.5mL/孔接种于6孔培养板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养16-24h；

②待细胞汇合度达到70-80％，将RPMI-1640完全培养基替换为使用37℃水浴预热的新鲜的RPMI-1640完全培养基；

③向含有新鲜的RPMI-1640完全培养基的培养孔中分别加入最优MOI(MOI为10)的慢病毒液pHS-AVC-YW246和对照慢病毒液PT080，同时加入终浓度为8μg/mL的促感染试剂polybrene(BioGeek，BG20301S)；

④感染24h后，将RPMI-1640完全培养基替换为使用37℃水浴预热的新鲜的RPMI-1640完全培养基；

⑤感染48-72h后，根据细胞状态每24-48h更换新鲜的RPMI-1640完全培养基，并向培养基中添加嘌呤霉素(A1113802，Thermo Fisher)，使其在培养基中的浓度为0.4ug/ml，筛选5-7天，分别得到过表达LAT3的RIN-M5F细胞和对照细胞(图2)，分别将其命名为RIN-M5F-YW246细胞和RIN-M5F-PT080细胞，冻存备用。

五、Real-time PCR检测LAT3mRNA表达量

分别接种RIN-M5F-PT080细胞(对照组)、RIN-M5F-YW246细胞(LAT3基因过表达组)于六孔板中，待细胞密度为80-90％时，收集细胞。分别提取对照组和LAT3基因过表达组的RNA，反转录cDNA并进行Real-time PCR，检测LAT3mRNA表达量。引物序列如下：

HS-AVC-ZY029：GAGTTCCTCGTGACTGGTGG；

HS-AVC-ZY030：TCCCATCTCTGGCATCTCCA。

反转录体系(总体积为10μL)：Mgcl₂ 2μl、10×RT Buffer 1μl、RNase Free dH₂O3.75μl、dNTP Mixture 1μl、RNase Inhibitor 0.25μl、AMV0.5μl、Oligo dT 0.5μl、RNA 1μl；上述反转录体系混匀后放入PCR仪，执行以下程序：42℃，20min；99℃，5min；5℃，5min；4℃保存。

Real-time PCR反应体系(总体积为25μL)：模板2μL、SYBR Premix Ex TaqTM 12.5μL、上游引物0.5μL(10μmol/L)、下游引物0.5μL(10μmol/L)、去离子水10.5μL。上述Real-time PCR反应体系混匀后放入ABI7500Real Time PCR仪，执行以下程序：Stage1，95.0℃，10S；Stage2，95.0℃，5S，58℃，15S；Stage3，95.0℃，15S，60℃，1h，95.0℃，15S。

结果如图3所示。从图中可以看出：RIN-M5F-YW246细胞(LAT3基因过表达组)中的目的基因LAT3的表达量显著高于对照组，LAT3表达量提高了18倍左右，实现了LAT3基因在β细胞中显著、持续、稳定的表达。

六、Western-blotting检测LAT3蛋白表达量

1、细胞蛋白提取

分别接种RIN-M5F-PT080细胞(对照组)、RIN-M5F-YW246细胞(LAT3基因过表达组)于六孔板中，待细胞密度为80-90％时，收集细胞。分别提取对照组和LAT3基因过表达组蛋白。具体步骤如下：将75μl RIPA裂解液直接加入到6孔细胞培养板，细胞刮将细胞刮下，转移至1.5ml离心管中混匀，超声仪进行细胞超声波破碎(一次3s，每次间隔1s，超3次)；细胞破碎后，4℃，12000g离心5min，上清转移到新的1.5ml离心管中并置于-20℃保存。

2、蛋白浓度的测定

1)BCA蛋白浓度测定试剂盒检测，首先将标准蛋白稀释为浓度为0.5mg/ml的标准品；

2)按照BCA试剂A:BCA试剂B为50：1配置工作液；

3)将蛋白样品稀释10倍备用；

4)标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板中，不足20μl的PBS补齐；

5)取20μl已稀释蛋白样品加入96孔板，每个样品重复3次

6)每孔加入200μl已配置的BCA工作液；

7)恒温培养箱，37℃孵育30min；

8)酶标仪测定在波长570nm处OD值；

9)根据标准品OD值与浓度做标准曲线，计算对照组和LAT3基因过表达组蛋白浓度分别为22.78μg/ml和24.29μg/ml。

3、蛋白变性

根据本研究中上样为40μg蛋白样品，20μl体积，计算蛋白上样量。加入1/5终体积的5×SDS蛋白上样缓冲液，其余用裂解液补充至终体积(20μl)，本研究中每次变性10次量上样次数，据此换算相应添加量，混匀，分装，100℃加热5min，-20℃保存。

4、Western Blotting检测

Western Blotting方法参照Laemrnli(1970)的方法，具体步骤如下：

1)分离胶和浓缩胶配置：配置本研究所需7.5％、12％的分离胶和4％的浓缩胶，灌胶备用；

2)SDS-PAGE电泳，电流18mA电泳2h，后调电流为20mA再电泳2h，直至溴酚蓝刚跑出胶时停止电泳；

3)转膜，准备滤纸和硝酸纤维素膜，膜用甲醇活化0.5h，转移胶和膜，200mA转移2h；

4)转膜后，将膜移出至平皿，封闭液室温摇床封闭1h；

5)孵育一抗，1:1000稀释后的一抗(ab70117，Abcam)10ml加入膜中，4℃过夜孵育后，TBST洗涤三次，每次10min；

6)孵育二抗，1:1000稀释后的二抗(A0208，Beyotime)加入上述洗后的膜中，4℃孵育4h，TBST洗涤三次，每次10min；

7)显色，ECL显色液覆盖膜1min，置于蛋白凝胶成像仪器下成像；

8)FUSION软件进行分析成像结果。

结果如图4所示。从图中可以看出：和对照组相比，稳定过表达LAT3的细胞株的LAT3蛋白水平显著提高。

实施例2、L型氨基酸转运载体3在调控胰岛素分泌水平中的应用

该实施例通过用亮氨酸处理RIN-M5F-PT080和RIN-M5F-YW246细胞，研究亮氨酸对稳定过表达LAT3的细胞株的胰岛素分泌水平的影响。具体步骤如下：

1、分别接种实施例1制备得到的RIN-M5F-PT080和RIN-M5F-YW246细胞于六孔板中，待细胞密度为70-80％时，收集细胞。

2、用KRBH缓冲液清洗2遍，然后在含葡萄糖KRBH缓冲液中37℃平衡20min，再用含葡萄糖和亮氨酸的KRBH缓冲液处理细胞1h，收集上清。

3、采用大鼠胰岛素ELISA试剂盒(Mlbil，ml302840-2)检测亮氨酸处理后细胞中的胰岛素分泌水平。具体检测方法如下：

(1)标准品的加样

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

(2)加样

分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

(3)温育

用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

(4)配液

将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。

(5)洗涤

小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

(6)加酶

每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

(7)温育

操作同(3)。

(8)洗涤

操作同(5)。

(9)显色

每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

(10)终止

每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)，依序测量450nm波长下各孔的吸光度。

结果如图5所示。从图中可以看出：和对照组细胞相比，亮氨酸处理后的过表达LAT3的β细胞中的胰岛素分泌量显著提高，说明亮氨酸依赖LAT3基因参与调控β细胞胰岛素分泌。

序列表

<110>中国农业大学

<120>稳定过表达LAT3的β细胞株的制备方法及其应用

<160>3

<210>1

<211>1879bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gagaattcca attggcggcc gcgccaccat gcggtttgga attgggatcc tgggtctccg 60

gagatccgga gtgtggaagc gccgcggaga cactgtgtta ccccgggtgt caacagctgt 120

gggaggcaag tttgtcgggg acagagtctc ggccaccatg gcccccacgc tgaagcaggc 180

gtaccgcagg cgctggtgga tggcttgcac cgctgtggtg gagaacctct tcttctccgc 240

ggtgctcctg ggctgggcct ccctgctgat catgctcaag aaggaaggct tctattccag 300

tctatgccca gccgagaaca ggaccaatac cacccaagac gaacagcagt ggataagctg 360

tgaccagcag gaagagatgc tcaatctggg tttcaccatt ggctccttcc tgctgagcgc 420

taccacactg cctctgggga ttctcatgga ccgctttggg cccaggcccc tgcgcctggt 480

aggcagtgcc tgctttgccg catcctgcac tcttatggcc ttggcctccc gggacactga 540

agttttgtct ccgttgatat tcctggcact gtccttgaat gggtttgctg gcatctgcct 600

aacgtttacc tcacttactc tgcccaacat gtttgggaat ttgcgatcca ctttcatggc 660

cctcatgatt ggttcctatg cgtcttccgc catcacattt cctggaatca agctgatcta 720

cgatgctgga gtctccttca tggtcatcat gttcacgtgg tctggcctgg cctgtcttat 780

ctttctgaac tgcgctctca actggcctgc agaagccttt cctgcccccg aggaagttga 840

ctacacgaag aagatcaaac tcattgggtt agccttggac cacaaggtca caggtgaccg 900

cttctacacc catgtaacca ttgtgggtca gcggctgagt cagaagaccc ccagcctgga 960

ggaggggact gacggcttta tttcgtcctc ggatatccct ggtacctcag aaaagactcc 1020

tgaaaagtct gtcccttttc gcaagagcct ctgctccccc attttcctgt ggagcctggt 1080

caccatgggt atgacccagc ttcgggtcat cttctacatg ggggccatga acaagatcct 1140

ggagttcctc gtgactggtg gcaaggaatg tgagacgaat gagcagagac agaaggtaga 1200

agagacagtt gagttctact cttctatctt cggagtcatg cagctgctgt gtcttctcac 1260

ctgccccctc attggttaca tcatggactg gcgcatcaag gactgcgtgg atgatccaac 1320

ggagggcact ctgaatgaga gcgcttcctt tggagatgcc agagatggga ctatcaccaa 1380

gttcaccaaa ccacgctacc gcaagataca gaagctcacc aatgccatca atgccttcac 1440

cctgaccaac atcctgcttg tgggttttgg catcacctgc ctcatcaaga acttacacct 1500

gcagttggtg gcctttgtcc tgcacaccgt tgttcgtggt ttcttccact cggcctgtgg 1560

aggtctctac gctgcagtgt tcccgtccaa tcattttggg acgttgacag gtcttcagtc 1620

cctcatcagt gccgtgtttg ctctactgca gcagctactc ttcatggcca tggtggggcc 1680

cctgcacgga gatcccttct gggtgaatct gggcctcctg attctctcac tcctgggatt 1740

tctcctacct tcctacctct actactaccg gtctcgattg gagagagagt atgccacgaa 1800

tttgctagat ccacagaagg tgctcaatac ttcgaaggtg gctacgacta gtgagggccg 1860

cggcagcctg ctgacctgc 1879

<210>2

<211>606

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Met Arg Phe Gly Ile Gly Ile Leu Gly Leu Arg Arg Ser Gly Val Trp

1 5 10 15

Lys Arg Arg Gly Asp Thr Val Leu Pro Arg Val Ser Thr Ala Val Gly

20 25 30

Gly Lys Phe Val Gly Asp Arg Val Ser Ala Thr Met Ala Pro Thr Leu

35 40 45

Lys Gln Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Trp Met Ala Cys Thr Ala Val Val

50 55 60

Glu Asn Leu Phe Phe Ser Ala Val Leu Leu Gly Trp Ala Ser Leu Leu

65 70 75 80

Ile Met Leu Lys Lys Glu Gly Phe Tyr Ser Ser Leu Cys Pro Ala Glu

85 90 95

Asn Arg Thr Asn Thr Thr Gln Asp Glu Gln Gln Trp Ile Ser Cys Asp

100 105 110

Gln Gln Glu Glu Met Leu Asn Leu Gly Phe Thr Ile Gly Ser Phe Leu

115 120 125

Leu Ser Ala Thr Thr Leu Pro Leu Gly Ile Leu Met Asp Arg Phe Gly

130 135 140

Pro Arg Pro Leu Arg Leu Val Gly Ser Ala Cys Phe Ala Ala Ser Cys

145 150 155 160

Thr Leu Met Ala Leu Ala Ser Arg Asp Thr Glu Val Leu Ser Pro Leu

165 170 175

Ile Phe Leu Ala Leu Ser Leu Asn Gly Phe Ala Gly Ile Cys Leu Thr

180 185 190

Phe Thr Ser Leu Thr Leu Pro Asn Met Phe Gly Asn Leu Arg Ser Thr

195 200 205

Phe Met Ala Leu Met Ile Gly Ser Tyr Ala Ser Ser Ala Ile Thr Phe

210 215 220

Pro Gly Ile Lys Leu Ile Tyr Asp Ala Gly Val Ser Phe Met Val Ile

225 230 235 240

Met Phe Thr Trp Ser Gly Leu Ala Cys Leu Ile Phe Leu Asn Cys Ala

245 250 255

Leu Asn Trp Pro Ala Glu Ala Phe Pro Ala Pro Glu Glu Val Asp Tyr

260 265 270

Thr Lys Lys Ile Lys Leu Ile Gly Leu Ala Leu Asp His Lys Val Thr

275 280 285

Gly Asp Arg Phe Tyr Thr His Val Thr Ile Val Gly Gln Arg Leu Ser

290 295 300

Gln Lys Thr Pro Ser Leu Glu Glu Gly Thr Asp Gly Phe Ile Ser Ser

305 310 315 320

Ser Asp Ile Pro Gly Thr Ser Glu Lys Thr Pro Glu Lys Ser Val Pro

325 330 335

Phe Arg Lys Ser Leu Cys Ser Pro Ile Phe Leu Trp Ser Leu Val Thr

340 345 350

Met Gly Met Thr Gln Leu Arg Val Ile Phe Tyr Met Gly Ala Met Asn

355 360 365

Lys Ile Leu Glu Phe Leu Val Thr Gly Gly Lys Glu Cys Glu Thr Asn

370 375 380

Glu Gln Arg Gln Lys Val Glu Glu Thr Val Glu Phe Tyr Ser Ser Ile

385 390 395 400

Phe Gly Val Met Gln Leu Leu Cys Leu Leu Thr Cys Pro Leu Ile Gly

405 410 415

Tyr Ile Met Asp Trp Arg Ile Lys Asp Cys Val Asp Asp Pro Thr Glu

420 425 430

Gly Thr Leu Asn Glu Ser Ala Ser Phe Gly Asp Ala Arg Asp Gly Thr

435 440 445

Ile Thr Lys Phe Thr Lys Pro Arg Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Thr

450 455 460

Asn Ala Ile Asn Ala Phe Thr Leu Thr Asn Ile Leu Leu Val Gly Phe

465 470 475 480

Gly Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asn Leu His Leu Gln Leu Val Ala Phe

485 490 495

Val Leu His Thr Val Val Arg Gly Phe Phe His Ser Ala Cys Gly Gly

500 505 510

Leu Tyr Ala Ala Val Phe Pro Ser Asn His Phe Gly Thr Leu Thr Gly

515 520 525

Leu Gln Ser Leu Ile Ser Ala Val Phe Ala Leu Leu Gln Gln Leu Leu

530 535 540

Phe Met Ala Met Val Gly Pro Leu His Gly Asp Pro Phe Trp Val Asn

545 550 555 560

Leu Gly Leu Leu Ile Leu Ser Leu Leu Gly Phe Leu Leu Pro Ser Tyr

565 570 575

Leu Tyr Tyr Tyr Arg Ser Arg Leu Glu Arg Glu Tyr Ala Thr Asn Leu

580 585 590

Leu Asp Pro Gln Lys Val Leu Asn Thr Ser Lys Val Ala Thr

595 600 605

<210>3

<211>735bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

agtaaaggag aagaactttt cactggagtt gtgacaattc ttgttgaatt agatggtgat 60

gttaatggtc acaaattttc tgttagtgga gagggtgaag gtgatgcaac atacggaaaa 120

cttaccctta aatttatttg tactactgga aaactacctg ttccctggcc aacacttgtt 180

actactttga cttatggtgt tcaatgtttt tcaagatacc cagatcacat gaaacggcac 240

gactttttca agagtgcaat gcccgaaggt tatgtacaag aaagaactat ttttttcaaa 300

gatgacggta actacaagac acgtgctgaa gttaagtttg aaggtgatac ccttgttaat 360

agaatcgagt taaaaggtat tgattttaaa gaagatggaa acattcttgg acacaaattg 420

gaatacaact ataactcaca caatgtatac attatggcag acaaacaaaa gaatggaatc 480

aaagttaact tcaaaattag acacaacatt gaagatggaa gtgttcaact agcagaccat 540

tatcaacaaa atactccaat tggcgatggc cctgttcttt taccagacaa ccattacctg 600

tccacacaat ctgctctttc taaagatccc aacgaaaaga gagaccatat ggtgcttctt 660

gagtttgtaa cagctgctgg tattacacac ggtatggatg aactatacaa acaccatcac 720

catcaccatc actag 735

Claims

1.L型氨基酸转运载体3和亮氨酸在如下（1）或（2）中的应用：

（1）制备调控胰岛素分泌的产品；

（2）制备调控胰岛β细胞胰岛素分泌的产品；

所述L型氨基酸转运载体3的氨基酸序列如序列2所示。

2.与L型氨基酸转运载体3相关的生物材料与亮氨酸在如下（1）-（3）中任一种中的应用：

（1）制备调控胰岛素分泌的产品；

（2）制备调控胰岛β细胞胰岛素分泌的产品；

（3）制备胰岛素分泌量提高的转基因细胞；

所述生物材料为下述A1）至A12）中的任一种：

A1）编码L型氨基酸转运载体3的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；

A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；

A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；

A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；

A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物；

A9）含有A1）所述核酸分子的转基因细胞系；

A10）含有A2）所述表达盒的转基因细胞系；

A11）含有A3）所述重组载体的转基因细胞系；

A12）含有A4）所述重组载体的转基因细胞系；

所述L型氨基酸转运载体3的氨基酸序列如序列2所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1）所述核酸分子为序列1所示的cDNA分子或DNA分子。

4.根据权利要求1-3中任一种中的应用，其特征在于：所述调控为促进。

5.一种制备亮氨酸处理后可提高胰岛素分泌量的转基因细胞的方法，包括提高受体细胞中L型氨基酸转运载体3的表达量和/或活性，得到转基因细胞的步骤；所述转基因细胞的胰岛素分泌量高于受体细胞；

所述L型氨基酸转运载体3的氨基酸序列如序列2所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述提高受体细胞中L型氨基酸转运载体3的表达量和/或活性的方法为在受体细胞中过表达L型氨基酸转运载体3；

所述过表达的方法为将所述L型氨基酸转运载体3的编码基因导入受体细胞；

所述L型氨基酸转运载体3的编码基因通过表达L型氨基酸转运载体3的慢病毒质粒导入受体细胞。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述受体细胞为胰岛β细胞；所述胰岛β细胞具体为RIN-M5F细胞。

8.按照权利要求5-7中任一所述的方法制备得到的转基因细胞。

9.一种促进胰岛素分泌的产品，其活性成分为由L型氨基酸转运载体3与亮氨酸组成的组合物；

所述L型氨基酸转运载体3的氨基酸序列如序列2。