CN103808937B - 用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒，包括捕获抗体，所述捕获抗体包括半乳糖凝集素、糖链抗原15-3和人类天冬胺酰基β－羟化酶分别制得的单克隆抗体；所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体包括半乳糖凝集素、糖链抗原15-3和人类天冬胺酰基β－羟化酶分别制得的多克隆抗体。本发明的有益效果如下：具有灵敏度高准确性强的特点，其灵敏度及准确性均达到90%以上。
Description
技术领域：
本发明涉及癌症诊断检测用的试剂盒领域，具体为一种用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒及其检测方法。
背景技术：
乳腺癌是全世界女性最常见的癌病，世界上每年约有50万人死于乳腺癌。在欧美国家，平均每四个女性癌症患者中就有一个罹患的是乳腺癌，可见患病率是极高的。东方女性的好发病年龄多发生在40～50岁，而西方女性的多好发病年龄在30～40岁。据统计，近年我国乳腺癌发病率的增长速度高出高发国家1～2个百分点。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位，乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题。临床治疗发现，第一期乳腺癌治疗后的存活率达百分之八十，零期乳腺癌治疗后的存活率更接近百分之百，因此早期发现及治疗非常重要。
肿瘤标志物(tumormarkers，TM)是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身合成、释放，或由机体对肿瘤细胞反应而产生的标志肿瘤存在和生长的一类物质。这些物质在正常成人中不存在或者是在癌症患者中出现的水平显著高于正常人。目前肿瘤标志物检测技术被认为是早期发现无症状微灶肿瘤的唯一途径，这一检测技术可先于X光片、超声、CT、MRI或PET-CT等物理检查发现肿瘤。可用于高危人群恶性肿瘤的筛查，肿瘤诊断与鉴别诊断，评估治疗的效果，预测或监视肿瘤复发或转移。目前，医院出现的乳腺癌诊断试剂盒都是检测一些常见的肿瘤标记物，灵敏性及准确性都偏低。因主要是选定的肿瘤标记物单项检测往往有很大的局限性，难以满足早期快速诊断的要求。
目前，市场上还没有针对乳腺癌的快速高效诊断试剂盒问世，严重影响到乳腺癌早期发现及治疗。
发明内容：
本发明的目的是针对以上述现有乳腺癌诊断存在的不足，提供一种灵敏度高、准确性强且使用方便高效的用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒。
本发明另一目的是提供一种用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒的检测方法。
为了实现本发明目的，本发明采取的技术方案是：用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒，包括捕获抗体，所述捕获抗体包括半乳糖凝集素和糖链抗原15-3（CA15-3）分别制得的单克隆抗体；
所述捕获抗体还包括人类天冬胺酰基β－羟化酶（HAAH）制得的单克隆抗体；
所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体包括半乳糖凝集素、糖链抗原15-3（CA15-3）和人类天冬胺酰基β－羟化酶（HAAH）分别制得的多克隆抗体。
所述捕获抗体为将半乳糖凝集素、糖链抗原15-3（CA15-3）和人类天冬胺酰基β－羟化酶（HAAH）克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应单克隆抗体。
所述捕获抗体的制备方法包括的步骤如下：
（1）抗原的制备：把半乳糖凝集素、糖链抗原15-3（CA15-3）和人类天冬胺酰基β－羟化酶（HAAH）的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；
（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的单克隆抗体为捕获抗体。
所述检测抗体为将半乳糖凝集素、糖链抗原15-3（CA15-3）和人类天冬胺酰基β－羟化酶（HAAH）的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应多克隆抗体。
所述检测抗体的制备方法包括的步骤如下：
（1）抗原的制备：把半乳糖凝集素、糖链抗原15-3（CA15-3）和人类天冬胺酰基β－羟化酶（HAAH）的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；
（2）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的多克隆抗体为检测抗体。
所述半乳糖凝集素优选半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素-8。
所述捕获抗体预先包被于微量滴定板的孔内，可以简化步骤，提高检测效率。
用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：
（1）抗原的制备：将半乳糖凝集素、糖链抗原15-3（CA15-3）和人类天冬胺酰基β－羟化酶（HAAH）的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作为标准品用；
（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；
（3）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；
（4）捕获抗体包被：
①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；②.封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜；③.弃去包被液（碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体），并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μlPBST（磷酸盐吐温缓冲液），在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃环境中备用。
（5）封闭和加样：每孔添加200μl封闭缓冲液（1.2％BSA/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。
用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒的检测方法，其包括以下步骤：
（1）抗原的制备：将半乳糖凝集素、糖链抗原15-3（CA15-3）和人类天冬胺酰基β－羟化酶（HAAH）的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原；
（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；
（3）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；
（4）捕获抗体包被：
①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；
②.封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜；
③.弃去包被液（碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体），并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μlPBST（磷酸盐吐温缓冲液），在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃环境中备用。
（5）封闭
①.在微量滴定板的每个孔添加200μl封闭缓冲液（1.2％BSA/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点；
②.封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；
（6）加样
①.将100μl的样品添加到每个孔，在37℃孵育60分钟;要得到准确的定量结果，通常做法是比较未知样品与标准曲线的信号。每个酶标板都必须测定标准品（两重测定或三重测定）和空白样，以确保准确性；
②.弃去样品，并洗涤微量滴定板三次，每次在微孔中加入200μlPBST（磷酸盐吐温缓冲液）；
③.将100μl浓度为0.5μg/ml的检测抗体添加到每个孔；
④.封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；
⑤.用PBST洗涤微量滴定板四次；
⑥.添加100μl标记二抗；
⑦.封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时。
⑧.用PBST洗涤微量滴定板四次。
(7)检测
①.将TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）溶液添加到每个孔，孵育15-30分钟，添加等体积的终止液，然后在450nm处读取光密度。
②.由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线，浓度标在X轴（对数标度）上，而吸光度标在Y轴（线性标度）上。通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。
本发明从众多的肿瘤标记物中，通过各种不同的排列组合，筛选出3个肿瘤标记物（半乳糖凝集素-3，人类天冬胺酰基β-羟化酶(HAAH)，糖链抗原15-315-3（CA15-3）组成乳腺癌快速诊断试剂盒。其中，人类天冬胺酰基β－羟化酶(HumanAspartyl/Asparaginylβ-hydroxylase，HAAH)是胚胎期即存在于细胞内的一种酶，属于依赖α-酮戊二酸双加氧酶家族，可催化特定蛋白中表皮生长因子(EGF)受体样结构域的天冬氨酸或天冬酰胺残基上的β－碳原子羟基化。研究表明HAAH在肿瘤细胞表面的高表达，是一种新型恶性肿瘤高特异性的分子标记物。最近的研究也证实HAAH是乳腺癌的理想标记物。半乳糖凝集素-3(Gal-3)是一种半乳糖结合蛋白,是Glectin家族中唯一具有嵌合结构的成员。半乳糖凝集素-3(Galectin-3)广泛分布于肿瘤组织中，半乳凝素-3的表达同其肿瘤的侵袭和转移密切相关。Galectin-3可与细胞表面糖基化的CD98结合促使整合素在细胞表面聚集成簇，间接增强整合素与其配体的亲和力;也能直接结合整合素α1β1和CD11b／18，正性或负性调节整合素的活性，影响整合素与细胞外配体的结合。Galectin-3还可以增加整合素在细胞表面的表达，并促进胶原在细胞间隔的分泌。由于半乳糖凝集素-3对多聚糖有亲和力，它也可以直接结合糖基化的细胞外基质成分，介导细胞与基质的黏附。研究显示乳腺癌患者血清中Galectin-3水平明显超过健康人群。CA15-3虽然是比较经典的乳腺癌标志物，多年前已应用于临床，但其灵敏度及准确性还不到50%，显然，仅靠CA15-3检测效果并不理想。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：具有灵敏度高准确性强的特点，其灵敏度及准确性均达到90%以上。
附图说明
图1是本发明用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒的原理图；
图2是本发明用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒的检测抗体最佳工作浓度的选择对比图；
图3是本发明用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒的对临床血清标本的诊断及鉴别诊断对比说明图；
图4是本发明用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒在乳腺癌治疗前后血中检测到HAAH的变化（n=175；P<0.05）对比图；
图5是本发明用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒在乳腺癌治疗前后血中检测到Galectin-3的变化（n=175；P<0.05）对比图；
图6是本发明用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒在乳腺癌治疗前后血中检测到CA15-3的变化（n=175；P<0.05）对比图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒进行详细的描述说明。
用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒，包括捕获抗体，捕获抗体封闭缓冲液，标准品，标记抗体，洗涤液及显色液等。所述标记抗体选用HRP标记 二抗。所述捕获抗体包括半乳糖凝集素和糖链抗原15-3（CA15-3）分别制得的单克隆抗体；通过对半乳糖凝集素和糖链抗原15-3（CA15-3）的共同快速检测，可以有效的提高检测准确率和灵敏度，有效的克服单凭检测CA15-3导致的不足。
所述捕获抗体还包括人类天冬胺酰基β－羟化酶（HAAH）制得的单克隆抗体，通过检测半乳糖凝集素、糖链抗原15-3（CA15-3）以及人类天冬胺酰基β－羟化酶（HAAH），使其灵敏度及准确性均达到90%以上。
所述捕获抗体为将半乳糖凝集素、糖链抗原15-3（CA15-3）和人类天冬胺酰基β－羟化酶（HAAH）克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应单克隆抗体。
其中，所述半乳糖凝集素优选半乳糖凝集素-3或者半乳糖凝集素-8。
所述捕获抗体的制备方法包括的步骤如下：
（1）抗原的制备：通过分子克隆的方法把Galectin-3，HAAH及CA15-3基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；所述抗原的制备也可以使用现有常规方法制备，在此不再累赘。
（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的单克隆抗体为捕获抗体。所述哺乳动物是小鼠及兔子，优选小鼠。所述捕获抗体的制备也可以使用现有常规方法制备，在此不再累赘。
所述检测抗体包括半乳糖凝集素、糖链抗原15-3（CA15-3）和人类天冬胺酰基β－羟化酶（HAAH）分别制得的多克隆抗体。
所述捕检测抗体为将半乳糖凝集素、糖链抗原15-3（CA15-3）和人类天冬胺酰基β－羟化酶（HAAH）的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应多克隆抗体。所述检测抗体的制备方法包括的步骤如下：
（1）抗原的制备：通过分子克隆的方法把Galectin-3，HAAH及CA15-3基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；
（2）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的多克隆抗体为检测抗体。所述哺乳动物是小鼠及兔子，优选兔子。
其中，所述捕获抗体可以预先包被于PVC材质的微量滴定板的孔内，可以简化步骤，提高检测效率。
用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：
（1）抗原的制备：通过分子克隆的方法将Galectin-3，HAAH及CA15-3基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作为标准品用；
（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；
（3）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；
（4）捕获抗体包被：
①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被于微量滴定板的孔；
②.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜；
③.弃去包被液（碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体），并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μlPBST（磷酸盐吐温缓冲液），在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃环境中备用；所述洗涤液为PBS（磷酸盐缓冲液）中加入一定量的Tween20，所述Tween20的质量百分比浓度为0.05%；
（5）封闭
①.在微量滴定板的每孔添加200μl封闭缓冲液（为含1.2％BSA（牛血清白蛋白）的PBS（磷酸盐缓冲液）），用于封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点；
②.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时。
用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒的检测方法，其包括以下步骤：
（1）抗原的制备：通过分子克隆的方法将Galectin-3，HAAH及CA15-3基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作为标准品用；
（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；
（3）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；
（4）捕获抗体包被：
①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；
②.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜；
③.弃去包被液（碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体），并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μlPBST（磷酸盐吐温缓冲液，可以是含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液），在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃环境中备用；所述洗涤液为PBS（磷酸盐缓冲液）中加入一定量的Tween20，所述Tween20的质量百分比浓度为0.05%；
（5）封闭
①.在微量滴定板的每个孔添加200μl封闭缓冲液（1.2％BSA/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点；
②.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；
（6）加样
①.将100μl适当稀释（稀释20倍）的样品添加到每个孔，在37℃下孵育60分钟;要得到准确的定量结果，通常做法是比较未知样品与标准曲线的信号。每个酶标板都必须测定标准品（两重测定或三重测定）和空白样，以确保准确性；
②.弃去样品，并洗涤微量滴定板三次，每次在微孔中加入200μlPBST（磷酸盐吐温缓冲液）；
③.将100μl浓度为0.5μg/ml的检测抗体添加到每个孔；
④.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；
⑤.用PBST洗涤微量滴定板四次；
⑥.添加100μl标记二抗，其在使用前便已在PBS中稀释10000倍（1：10000）。所述标记二抗可以为HRP标记羊抗兔。
⑦.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时。
⑧.用PBST洗涤微量滴定板四次。
(7)检测
①.将TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）溶液添加到每个孔，孵育15-30分钟，添加等体积的终止液(2MH2SO4)，然后用酶联免疫检测仪在450nm处读取光密度。
②.由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线，浓度标在X轴（对数标度）上，而吸光度标在Y轴（线性标度）上。通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。
本发明用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒包括半乳糖凝集素-3（Galectin-3），人类天冬胺酰基β-羟化酶（HAAH），CA15-3三项指标中两项同时升高作为诊断早中期乳腺癌的标准,检测原理如图1所示；半乳糖凝集素-3（Galectin-3），人类天冬胺酰基β-羟化酶（HAAH），CA15-3三项指标中两项同时下降作为乳腺癌治疗效果评估的标准。可以用于临床上通过检测血中3个肿瘤标记物水平的高低对乳腺癌的治疗效果进行动态评估。另外还可以用于临床上对乳腺癌的复发转移及预后判断的应用；也可用于食道癌早中期快速诊断。
试验效果说明
双抗体夹心ELISA最佳实验条件的选择
包被鼠抗人Galectin-3，HAAH及CA15-3单抗最佳工作浓度的选择：根据方阵法确定包被浓度为1ug/mL时，单克隆抗体的OD值为1.05，所以其最佳包被浓度为1ug/mL。如图2所示，兔抗人Galectin-3，HAAH及CA15-3多抗最佳工作浓度的选择：随着单抗稀释倍数的增加，待测乳腺癌病例血清和正常人血清OD值有递减的趋势，当抗体浓度为1：200时，阳性对照(阳性对照OD值减去空白对照OD值)与正常对照(正常对照OD值减去空白对照OD值)A450nm之比(简称P／N值)较高，故选择兔抗人抗体最佳工作浓度为1：200。血清摸索的最佳工作浓度为1：25。封闭液摸索最佳工作溶度为1.2％BSA。
临床血清标本检测
共检测了500份血清标本，以医院经病理确诊为乳腺癌患者血清为阳性对照组（180例（其中早期乳腺癌85例，晚期乳腺癌95例）），非乳腺癌患者包括小叶增生、正常人群血清为阴性对照组（320例（正常210例，乳腺病110例）），PBST为空白对照，通过上述双抗夹心ELISA法进行定性及定量检测临床血清标本。如图3所示，以P／N值>2为双抗夹心ELISA阳性判定标准，以病理诊断为标准对临床血清标本进行检测，早期乳腺癌结果检测灵敏性（SN）为91％（77/85），晚期乳腺癌检测灵敏性（SN）为96％（91/95），准确率（SP）达到95.6％（478/500）。
临床对乳腺癌的治疗效果进行动态评估
为确定本试剂盒能否用于对乳腺癌的治疗效果进行动态评估，我们收集了175份乳腺癌患者治疗前后的血清。175个患者的检测结果参见4-6，结果显示乳腺癌患者治疗前后的血清中Galectin-3，HAAH及CA15-3的水平有显著差异（P<0.05）。有效治疗后血清中Galectin-3，HAAH及CA15-3的水平会大大下降，提示本试剂盒能用于对乳腺癌的治疗效果进行动态评估。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例，应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明构思在现有技术基础上通过逻辑分析、推理或者根据有限的实验可以得到的技术方案，均应该在由本权利要求书所确定的保护范围之中。
Claims (1)
1.用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，其特征于，其包括以下步骤：
(1)抗原的制备：将半乳糖凝集素、糖链抗原15-3和人类天冬胺酰基β－羟化酶基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原；
(2)捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；
(3)检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；
(4)捕获抗体包被：
①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；
②.封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜；
③.弃去包被液，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μlPBST，除去洗涤液和剩余的液滴，晾干放于4℃环境中；
(5)封闭：每孔添加200μl封闭缓冲液，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。
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Denomination of invention: Rapid diagnostic kit for early and middle stage breast cancer and its detection method Effective date of registration: 20201208 Granted publication date: 20151118 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Guangzhou Panyu branch Pledgor: GUANGZHOU HENGTAI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2020440000389 |
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Date of cancellation: 20220927 Granted publication date: 20151118 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Guangzhou Panyu branch Pledgor: GUANGZHOU HENGTAI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2020440000389 |
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Denomination of invention: Rapid diagnostic kit for early and middle stage of breast cancer and its detection method Effective date of registration: 20221014 Granted publication date: 20151118 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Guangzhou Panyu branch Pledgor: GUANGZHOU HENGTAI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2022980018084 |
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Granted publication date: 20151118 |
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