CN108956997A - Cd151蛋白表达量elisa检测方法及试剂盒 - Google Patents

Cd151蛋白表达量elisa检测方法及试剂盒 Download PDF

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周莹
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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体是CD151蛋白表达量ELISA检测方法及试剂盒，CD151蛋白表达量的ELISA试剂盒包括CD151抗体包被96孔反应板；CD151抗体‑HRP酶标记第二抗体；TMB显色液；H2SO4终止液。本发明提供的一种CD151蛋白表达量ELISA检测方法及试剂盒，该检测方法能够快速检测血清中CD151蛋白表达量，研究显示CD151蛋白在各种肿瘤患者血清中高表达。提示CD151蛋白作为一种潜在的血清学诊断标志物，可为临床快速诊断、治疗效果判断和预后判断提供参考。

Description

CD151蛋白表达量ELISA检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种CD151蛋白表达量ELISA检测方法及试剂盒。
背景技术
恶性肿瘤已经成为严重威胁人类健康的主要疾病。我国肿瘤发生人数不断升高，死亡率从70年代的83.65/10万上升到90年代的108.26/10万，上升了29.42％。广西的恶性肿瘤死亡率也呈上升趋势，仅1996年(34700人死亡)就比1991年增加12700人，增长近57.73％；广西的恶性肿瘤死亡标化减寿率为9.88‰；广西居民一生(按出生至74岁计算)死于恶性肿瘤的风险约为1/10左右(累积危险度10.66％)；恶性肿瘤使广西人口平均期望寿命减少2.13岁。恶性肿瘤引发了沉重的社会经济负担，据估算每年用于癌症病人的医疗费用约800亿元，约占卫生总费用的20％。全国因癌症损失的失能调整生命年为185.1万人年，以此估算的经济损失高达1432.3亿元。肿瘤的早诊早治是目前预防治疗肿瘤的有效手段。
CD151是四跨膜蛋白超家族(transmembrane 4superfamily，TM4SF)中的一个成员，它能将整合素接收到的生物信号转导到细胞内的其他关键蛋白质(如激酶)，参与细胞的黏附、迁移、形成半桥粒结构等多种病理生理过程，在肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移中起重要作用，其过表达与多种癌症的预后不良有关。研究发现，CD151是癌蛋白，在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、膀胱癌、胆囊癌等肿瘤中高表达。动物实验发现小鼠模型中敲除CD151后肿瘤发生延迟，原发性肿瘤减少。因此，CD151是肿瘤诊断和预后判断的一个标志，也是靶向治疗的一个潜在重要靶点。CD151蛋白除了在细胞膜表达外，其分子的胞外片断部分在酶的作用下可发生水解而释放到血循环中，并可能反应肿瘤的发展状态，是一种潜在的血清学诊断标志物。开展CD151蛋白的表达水平及血清学指标检测，有利于开展临床快速诊断、治疗效果判断和预后判断的研究和应用
目前，国内外报道的CD151检测方法都不很成熟，而且仅用于科研实验，尚未开发成适用于临床检测的试剂盒，不利于临床常规使用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述缺陷，提供一种CD151蛋白表达量ELISA检测方法及试剂盒。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
CD151蛋白表达量的ELISA试剂盒，包括CD151抗体包被96孔反应板；CD151抗体- HRP酶标记第二抗体；TMB显色液；H2SO4终止液；洗涤液；ELISA试剂盒组成：
此外，本发明还提供如下附属技术方案：
优选地，所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，包括如下步骤：
(1)制备ELISA反应试剂和优化反应条件：制备单抗杂交瘤细胞-小鼠腹水模型；单抗杂交瘤-小鼠腹水CD151抗体的纯化；CD151抗体-HRP酶标记筛选；纯化CD151抗体-HRP 酶标记结合物；
(2)单抗杂交瘤-小鼠腹水CD151抗体的纯化；CD151抗体-HRP酶标记筛选；纯化CD151抗体-HRP酶标记结合物；
(3)采用ELISA技术对正常对照和待测样本血清中CD151蛋白进行检测；
(4)抗原抗体结合后留于固相载体；
(5)与酶标抗体反应后形成产物；
(6)加入显色液反应后，加入H2SO4终止反应，根据有色产物的深浅进行结果分析。
优选地，所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，采用ELISA技术对正常血清或待检标本血清进行检测，具体为：
A、取正常血清或待检标本血清，与固相载体表面的CD151抗体进行第一次孵育，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原-抗体复合物与液体中的其他物质分开；
B、再加入HRP酶标记抗体进行第二次孵育。
优选地，步骤A中CD151抗体稀释到2μg/mL，包板100uL，包板条件为2—5℃放置8—15小时。
优选地，步骤A中取100uL待检血清加入孔板中，40—50min后PBST清洗3—5 次，每次洗板后拍板。
优选地，步骤A中CD151抗体第一次孵育温度为37℃，时间为40—50min，在使用PBST清洗3—5次，每次洗板后拍板。
优选地，步骤B中CD151抗体第二次孵育温度为37℃，时间为40—50min，在使用PBST清洗3—5次，每次洗板后拍板。
优选地，所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，清洗完毕后加入90— 110uLTMB显色液，4—8min后加入40—60uL2M H2SO4终止反应，得到实验结果。
CD151蛋白在正常组织中无表达或表达很低，而在各种癌组织中则出现过表达。其分子的胞外片断部分在酶的作用下可发生水解而释放到血循环中，并可能反映肿瘤的发展状态，是一种潜在的血清学诊断和监控标志物。
本发明有益效果在于：
本发明提供的一种CD151蛋白表达量ELISA检测方法及试剂盒，该检测方法能够快速检测血清中CD151蛋白表达量，研究显示CD151蛋白在各种肿瘤患者血清中高表达。提示CD151蛋白作为一种潜在的血清学诊断标志物，可为临床快速诊断、治疗效果判断和预后判断提供参考。
附图说明
图1为CD151标准抗原的ELISA结果；
图2为CD151抗原线性范围；
图3A乳腺癌患者血清样本中CD151的表达；
3B正常健康对照血清样本中CD151的表达
具体实施方式
以下结合较佳实施例对本发明技术方案作进一步非限制性的详细说明。
实施例1
CD151蛋白表达量的ELISA试剂盒，其特征在于：包括CD151抗体包被96孔反应板；CD151抗体-HRP酶标记第二抗体；TMB显色液；H2SO4终止液；洗涤液；ELISA试剂盒组成：
所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，包括如下步骤：
(1)制备ELISA反应试剂和优化反应条件：制备单抗杂交瘤细胞-小鼠腹水模型；单抗杂交瘤-小鼠腹水CD151抗体的纯化；CD151抗体-HRP酶标记筛选；纯化CD151抗体-HRP 酶标记结合物；
(2)单抗杂交瘤-小鼠腹水CD151抗体的纯化；CD151抗体-HRP酶标记筛选；纯化CD151抗体-HRP酶标记结合物；
(3)采用ELISA技术对正常对照和待测样本血清中CD151蛋白进行检测；
(4)抗原抗体结合后留于固相载体；
(5)与酶标抗体反应后形成产物；
(6)加入显色液反应后，加入H2SO4终止反应，根据有色产物的深浅进行结果分析。
所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，采用ELISA技术对正常血清或待检标本血清进行检测，具体为：
A、取正常血清或待检标本血清，与固相载体表面的CD151抗体进行第一次孵育，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原-抗体复合物与液体中的其他物质分开；
B、再加入HRP酶标记抗体进行第二次孵育。
步骤A中CD151抗体稀释到2μg/mL，包板100uL，包板条件为2℃放置8小时。
步骤A中取100uL待检血清加入孔板中，40min后PBST清洗3次，每次洗板后拍板。
步骤A中CD151抗体第一次孵育温度为37℃，时间为45min，在使用PBST清洗 4次，每次洗板后拍板。
步骤B中CD151抗体第二次孵育温度为37℃，时间为40min，在使用PBST清洗 4次，每次洗板后拍板。
所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，清洗完毕后加入110uLTMB显色液， 4min后加入40uL2M H2SO4终止反应，得到实验结果。
实施例2
CD151蛋白表达量的ELISA试剂盒，其特征在于：包括CD151抗体包被96孔反应板；CD151抗体-HRP酶标记第二抗体；TMB显色液；H2SO4终止液；洗涤液；ELISA试剂盒组成：
所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，包括如下步骤：
(1)制备ELISA反应试剂和优化反应条件：制备单抗杂交瘤细胞-小鼠腹水模型；单抗杂交瘤-小鼠腹水CD151抗体的纯化；CD151抗体-HRP酶标记筛选；纯化CD151抗体-HRP 酶标记结合物；
(2)单抗杂交瘤-小鼠腹水CD151抗体的纯化；CD151抗体-HRP酶标记筛选；纯化CD151抗体-HRP酶标记结合物；
(3)采用ELISA技术对正常对照和待测样本血清中CD151蛋白进行检测；
(4)抗原抗体结合后留于固相载体；
(5)与酶标抗体反应后形成产物；
(6)加入显色液反应后，加入H2SO4终止反应，根据有色产物的深浅进行结果分析。
所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，采用ELISA技术对正常血清或待检标本血清进行检测，具体为：
A、取正常血清或待检标本血清，与固相载体表面的CD151抗体进行第一次孵育，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原-抗体复合物与液体中的其他物质分开；
B、再加入HRP酶标记抗体进行第二次孵育。
步骤A中CD151抗体稀释到2μg/mL，包板100uL，包板条件为3℃放置10小时。
步骤A中取100uL待检血清加入孔板中，50min后PBST清洗5次，每次洗板后拍板。
步骤A中CD151抗体第一次孵育温度为37℃，时间为50min，在使用PBST清洗 5次，每次洗板后拍板。
步骤B中CD151抗体第二次孵育温度为37℃，时间为50min，在使用PBST清洗 5次，每次洗板后拍板。
所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，清洗完毕后加入100uLTMB显色液， 5min后加入60uL2M H2SO4终止反应，得到实验结果。
实施例3
CD151蛋白表达量的ELISA试剂盒，其特征在于：包括CD151抗体包被96孔反应板；CD151抗体-HRP酶标记第二抗体；TMB显色液；H2SO4终止液；洗涤液；ELISA试剂盒组成：
所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，包括如下步骤：
(1)制备ELISA反应试剂和优化反应条件：制备单抗杂交瘤细胞-小鼠腹水模型；单抗杂交瘤-小鼠腹水CD151抗体的纯化；CD151抗体-HRP酶标记筛选；纯化CD151抗体-HRP 酶标记结合物；
(2)单抗杂交瘤-小鼠腹水CD151抗体的纯化；CD151抗体-HRP酶标记筛选；纯化CD151抗体-HRP酶标记结合物；
(3)采用ELISA技术对正常对照和待测样本血清中CD151蛋白进行检测；
(4)抗原抗体结合后留于固相载体；
(5)与酶标抗体反应后形成产物；
(6)加入显色液反应后，加入H2SO4终止反应，根据有色产物的深浅进行结果分析。
所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，采用ELISA技术对正常血清或待检标本血清进行检测，具体为：
A、取正常血清或待检标本血清，与固相载体表面的CD151抗体进行第一次孵育，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原-抗体复合物与液体中的其他物质分开；
B、再加入HRP酶标记抗体进行第二次孵育。
步骤A中CD151抗体稀释到2μg/mL，包板100uL，包板条件为5℃放置10小时。
步骤A中取100uL待检血清加入孔板中，45min后PBST清洗4次，每次洗板后拍板。
步骤A中CD151抗体第一次孵育温度为37℃，时间为45min，在使用PBST清洗 4次，每次洗板后拍板。
步骤B中CD151抗体第二次孵育温度为37℃，时间为45min，在使用PBST清洗 4次，每次洗板后拍板。
所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，清洗完毕后加入110uLTMB显色液， 8min后加入60uL2M H2SO4终止反应，得到实验结果。
实施例4
CD151蛋白表达量的ELISA试剂盒，其特征在于：包括CD151抗体包被96孔反应板；CD151抗体-HRP酶标记第二抗体；TMB显色液；H2SO4终止液；洗涤液；ELISA试剂盒组成：
所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，包括如下步骤：
(1)制备ELISA反应试剂和优化反应条件：制备单抗杂交瘤细胞-小鼠腹水模型；单抗杂交瘤-小鼠腹水CD151抗体的纯化；CD151抗体-HRP酶标记筛选；纯化CD151抗体-HRP 酶标记结合物；
(2)单抗杂交瘤-小鼠腹水CD151抗体的纯化；CD151抗体-HRP酶标记筛选；纯化CD151抗体-HRP酶标记结合物；
(3)采用ELISA技术对正常对照和待测样本血清中CD151蛋白进行检测；
(4)抗原抗体结合后留于固相载体；
(5)与酶标抗体反应后形成产物；
(6)加入显色液反应后，加入H2SO4终止反应，根据有色产物的深浅进行结果分析。
所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，采用ELISA技术对正常血清或待检标本血清进行检测，具体为：
A、取正常血清或待检标本血清，与固相载体表面的CD151抗体进行第一次孵育，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原-抗体复合物与液体中的其他物质分开；
B、再加入HRP酶标记抗体进行第二次孵育。
步骤A中CD151抗体稀释到2μg/mL，包板100uL，包板条件为2℃放置8小时。
步骤A中取100uL待检血清加入孔板中，45min后PBST清洗4次，每次洗板后拍板。
步骤A中CD151抗体第一次孵育温度为37℃，时间为45min，在使用PBST清洗 4次，每次洗板后拍板。
步骤B中CD151抗体第二次孵育温度为37℃，时间为45min，在使用PBST清洗 4次，每次洗板后拍板。
所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，清洗完毕后加入90—110uLTMB显色液，4—8min后加入40—60uL2M H2SO4终止反应，得到实验结果。
病例实施例1
在本发明所述的阳性是指，所述待检血清呈色反应高于空白对照和阴性对照，则CD151蛋白表达阳性。
在本发明所述的表达量高是指，所述待检血清呈色反应高于空白对照和阴性对照，且其呈色反应越深，CD151蛋白表达量越高。
在本发明提供的CD151蛋白表达量ELISA检测方法及试剂盒中所用生物材料、试剂或仪器均可由市场购得。
一、材料和方法
1、病人血清样本
为了进行EILSA检测，共收集广西壮族自治区人民医院2014年1月-2016年12月份46例乳腺癌患者和46例正常健康体检对照的血清标本。收集标准为乳腺癌的病理学诊断，初诊和未经治疗的，没有其他肿瘤的病史。原位癌排除在研究之外。临床样本仅用于研究，经过广西壮族自治区人民医院伦理委员会批准。
临床样本包括46例女性乳腺癌患者，年龄在35-55岁之间，平均年龄42.6岁。所有病人接受乳腺癌切除术。本研究的组织病理学分级和临床分期依据世界卫生组织(WHO) 和第六版pTMN国际抗癌联盟(UICC,2002)的标准定义。由广西壮族自治区人民医院的两位病理医师对所有肿瘤的组织学类型和分级进行评估。
2、ELISA
CD151 ELISA试剂盒组成：
将试剂1：96孔酶标抗体包被板从4℃中取出，在室温下放置5-10min；将试剂2：已知浓度的CD151抗原标准品，用PBS进行稀释，稀释后浓度分别为：0，3.125，6.25， 12.5，25，50，100ng/ml。将已知浓度的CD151抗原，10ug/ml用1×PBS稀释1:100。每个ELISA板使用5ul进行1:100稀释，第一管终浓度为100ng/ml，再按1：2序列稀释，使最后一管终浓度为3.125ng/ml。将已知浓度的CD151抗原和待测样品各100uL，加入 ELISA微孔板中，室温孵育时间为45min；将试剂3：10×PBS和试剂4：Tween-20从冰箱中取出，按试剂准备中PBST的准备方法制备，一个板大概需要360ml，PBST；用PBST 清洗ELISA微孔板4次，每孔300ul，每次洗板后进行拍板；清洗完毕后，加入试剂5： CD151-37号克隆酶标抗体，每孔100ul。酶标抗体用1XPBS稀释，稀释倍数为1/300(终浓度2ug/ml)，室温孵育45min；用PBST清洗4次，每次洗板后进行拍板；清洗完毕后，加入试剂6：TMB显色液进行显色，每孔100ul，室温孵育5min；室温孵育5min加入试剂7： 2M H2SO4终止反应，每孔50ul；用酶标仪在OD450nm测定各孔的OD450nm值。
3、效果评估
CD151在一定浓度范围内显示很好的线性关系，超出该范围会呈现出“S”曲线。因此，如果部分样品中CD151的抗原浓度高于上述范围，表现为OD值高于最高的点，则需要对样品稀释后进行ELISA反应。典型的结果如图1CD151标准抗原的ELISA结果、图2CD151 抗原线性范围所示：不同浓度(0，3.125，6.25，12.5，25，50，100ng/ml，顺序从左到右)
4、统计学分析
用t检验评估乳腺癌病人和正常健康体检对照血清中CD151蛋白表达量。用SPSS 22.0软件进行统计学分析。P＜0.05，认为差异有显著性。
二、结果
1、乳腺癌病人CD151高表达
为分析CD151在乳腺癌患者和正常健康对照之间的表达差异，本研究用ELISA方法检测46 例乳腺癌患者和46例正常健康对照的血清样本中CD151的表达水平。其中24例(52.2％)乳腺癌患者血清样本中CD151高表达(P＜0.05)，如图3A所示。46例正常健康对照血清样本中无表达如图3B所示。
图3A乳腺癌患者血清样本中CD151的表达和3B正常健康对照血清样本中CD151 的表达所示的OD值经t检验比较，CD151蛋白在乳腺癌患者和正常人中表达有显著性差异 (P＜0.05)。
需要指出的是，上述较佳实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.CD151蛋白表达量的ELISA试剂盒，其特征在于：包括CD151抗体包被96孔反应板；CD151抗体-HRP酶标记第二抗体；TMB显色液；H2SO4终止液；洗涤液；ELISA 试剂盒组成：
。
2.根据权利要求1所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）制备ELISA反应试剂和优化反应条件：制备单抗杂交瘤细胞-小鼠腹水模型；单抗杂交瘤-小鼠腹水CD151抗体的纯化；CD151抗体-HRP酶标记筛选；纯化CD151抗体-HRP酶标记结合物；
（2）单抗杂交瘤-小鼠腹水CD151抗体的纯化；CD151抗体-HRP酶标记筛选；纯化CD151抗体-HRP酶标记结合物；
（3）采用ELISA技术对正常对照和待测样本血清中CD151蛋白进行检测；
（4）抗原抗体结合后留于固相载体；
（5）与酶标抗体反应后形成产物；
（6）加入显色液反应后，加入H2SO4终止反应，根据有色产物的深浅进行结果分析。
3.根据权利要求1所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，其特征在于：所述采用ELISA技术对正常血清或待检标本血清进行检测，具体为：
A、取正常血清或待检标本血清，与固相载体表面的CD151抗体进行第一次孵育，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原-抗体复合物与液体中的其他物质分开；
B、再加入HRP酶标记抗体进行第二次孵育。
4.根据权利要求3所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，其特征在于：步骤A中CD151抗体稀释到2μg/mL，包板100uL，包板条件为2—5℃放置8—15小时。
5.根据权利要求4所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，其特征在于：步骤A中取100uL待检血清加入孔板中，40—50min后PBST清洗3—5次，每次洗板后拍板。
6.根据权利要求3所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，其特征在于：步骤A中CD151抗体第一次孵育温度为37℃，时间为40—50min，在使用PBST清洗3—5次，每次洗板后拍板。
7.根据权利要求3所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，其特征在于：步骤B中CD151抗体第二次孵育温度为37℃，时间为40—50min，在使用PBST清洗3—5次，每次洗板后拍板。
8. 根据权利要求5—7任一项所述的CD151蛋白表达量ELISA检测方法，其特征在于：清洗完毕后加入90—110uLTMB显色液，4—8min后加入40—60uL2M H2SO4终止反应，得到实验结果。
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