KR20140055145A - 동일 검체에서 여러 항원을 검출하기 위한 순차적 다중 면역염색법 - Google Patents
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Abstract
동일 검체에서 여러 항원을 검출하기 위한 순차적 다중 면역염색 방법에 관한 것이다. 상기 면역염색 방법은 적은 양의 검체를 대상으로 한 발현 단백질의 정성 또는 정량 분석, 유전자 분석, 형태학적 분석을 위해 사용될 수 있다.
Description
동일 검체에서 여러 항원을 검출하기 위한 순차적 다중 면역염색법에 관한 것이다.
암의 진단은 일반적으로 조직 병리학 (histopathology)에 의한 진단 기법을 이용한다. 그러나, 검체를 채취한 조직에 종양이 존재하는지 여부가 불확실하고, 다른 지점으로의 전이 여부를 확인하는데 한계가 있다. 최근에는 세포 검사의 정확성이 향상되면서 간편하고 정확한 진단이 가능하게 되었다. 암세포는 조직으로부터 추출하거나 체액 (혈액, 림프액)으로부터 분리하여 검사할 수 있다. 그러나, 병변의 크기가 작고 세포 수가 한정되어 있어 검사수의 한계가 명확하다.
혈중 종양 세포 (circulating tumor cell, CTC)는 전이암 환자의 혈액 중에 존재하는 미량의 종양 세포이다. CTC는 종양이 최초로 검출되기 이전에 환자에게서 발견된다고 알려져 있고, 수술을 통해 암세포를 제거한 후에도 CTC가 발견되는 경우가 있다. CTC의 검출, 분리 또는 분리된 CTC의 분석은 암의 조기 진단, 조기 암 전이 여부 진단 또는 재발 가능성 예측에 있어서 중요하다. 그러나, CTC는 혈액 내에 매우 소량으로 존재하고 세포가 연약하여 그 특성을 분석하기가 매우 어렵다.
혈액과 같이 다양한 특성을 가진 세포가 혼합되어 있는 용액 내에서 암세포를 확인하기 위해서는 기본적으로 3종 (Cytokeratin, CD45, 핵염색)의 염색이 필요하다. 현재 사용하는 발색 또는 형광 염료를 이용한 면역염색을 할 경우, 동시에 사용할 수 있는 염료의 수는 제한된다. 따라서, 확인된 암세포를 대상으로 유전자 또는 단백질 분석을 하기 위해 이용가능한 염료는 제한될 수밖에 없다. 동일 검체에서 여러 번의 항원-항체 반응을 할 경우, 기존의 방법은 항체를 항원으로부터 떼어내는 과정을 수반한다. 상기 과정은 매우 낮은 pH나 변화된 이온 농도하에서 단백질의 구조를 일시적으로 변형시키므로, 세포에 손상을 입혀 추후 검사에 영향을 미칠 수 있다.
한정된 시료로 다양한 검사를 하는 것은 암세포의 특성 파악, 치료방법의 강구, 약제의 선정 및 예후 판정에 있어서 필수적이다. 한정된 검체에서 세포에 손상을 주지 않으면서 다양한 항원을 검사하기 위한 방법이 요구된다.
일 양상은 표적 물질에 결합하는 물질, 상기 표적 물질에 결합하는 물질에 결합된 절단가능한 링커, 및 상기 링커에 결합된 형광 염료를 포함한 염료 복합체를 이용하여 세포에 존재하는 물질을 확인하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 표적 물질에 결합하는 물질, 상기 표적 물질에 결합하는 물질에 결합된, 빛에 의해 절단가능한 링커, 및 상기 링커에 결합된 형광 염료를 포함하는 염료 복합체를 제공한다.
일 양상은 표적 물질에 결합하는 물질, 상기 표적 물질에 결합하는 물질에 결합된 절단가능한 링커, 및 상기 링커에 결합된 형광 염료를 포함한 염료 복합체를, 세포를 포함하는 시료와 접촉시켜 염료 복합체가 결합된 세포를 형성하는 단계; 및 염료 복합체가 결합된 세포로부터 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 세포에 존재하는 물질을 확인하는 방법을 제공한다.
상기 접촉시키는 단계는 상기 염료 복합체의 표적 물질에 결합하는 물질과 상기 시료에 포함된 세포에 존재하는 표적 물질 간 결합을 유도하는 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 예를 들면, 항체와 항원 간 특이적 결합을 유도하는 조건에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 염료 복합체는 각각 서로 다른 표적 물질에 결합하는 서로 다른 물질 및 서로 다른 형광 염료를 포함하고 있는 복수 개의 염료 복합체의 집합일 수 있다. 각 염료 복합체에서 상기 표적 물질에 결합하는 물질은 예를 들면, 항체, 항원, 앱타머, 수용체, 리간드, 효소 기질, 효소 저해제, 효소 보조인자 및 효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 절단가능한 링커는 빛에 의해 절단가능한 화합물 (photocleavable compound)일 수 있다. 예를 들면, 2-니트로벤질 및 (쿠마린-4-일)메틸기를 포함하는 화합물일 수 있다. 상기 형광 염료는 예를 들면, FITC, DAPI, Cy5, Cy3, Texas Red 및 Rhodamine으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 각 염료 복합체는 예를 들면, 항체가 빛에 의해 절단가능한 링커를 통해 형광 염료에 결합된 것일 수 있다.
상기 시료는 표적 세포가 존재할 수 있는 어떠한 생물학적 시료라도 가능하다. 예를 들면, 상기 시료는 생검시료, 조직시료, 분리된 세포를 액체 매질에 현탁시킨 세포 현탁물, 세포 배양물 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 시료는 동물의 체액일 수 있다. 상기 체액은 예를 들면, 혈액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 뇨, 점막액, 양수 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 시료는 혈중 종양 세포가 포함되어 있는 혈액일 수 있다.
상기 시료에 포함된 세포는 예를 들면, 혈중 종양 세포 (circulating tumor cell), 암 줄기 세포, 면역 세포, 태아 줄기 세포, 태아 세포, 암 세포 및 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 세포에 존재하는 표적 물질은 예를 들면, 시료 중 암 세포를 다른 종류의 세포로부터 구별할 수 있도록 하는 물질일 수 있다. 예를 들면, 상기 표적 물질은 단백질, 당, 지질, 핵산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 표적 물질은 세포의 표면 또는 내부에 존재하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 표적 물질은 시토케라틴 (cytokeratin)과 같은 세포의 내부에 존재하는 단백질, 또는 EpCAM, IGFR, EGFR, HER2와 같은 세포 표면에 위치하는 단백질일 수 있다.
상기 시료는 염료 복합체와 접촉되기 전에, 예를 들면, 표적 세포를 고정시키는 단계 (fixing), 세포의 투과성을 증진시키는 단계 (permeabilizing), 및/또는 비특이적 반응을 줄이기 위한 블로킹 단계 (blocking)를 거칠 수 있다.
상기 측정하는 단계는 상기 세포에 존재하는 표적 물질에 결합된 염료 복합체로부터 발생하는 신호를 측정하는 것일 수 있다. 상기 측정은, 예를 들면, 염료 복합체의 형광 염료에 의해 발생되는 신호를 형광 현미경으로 측정하는 것일 수 있다. 상기 측정 단계는, 측정된 신호로부터 염료 복합체에 해당하는 신호가 있는 경우, 상기 세포는 상기 표적 물질이 존재하는 것으로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 암 특이적 마커에 결합하는 물질을 포함한 염료 복합체에 해당하는 신호가 있는 경우, 상기 세포를 암 세포로 결정할 수 있다. 또한, 상기 측정 단계는 상기 시료에서 표적 물질과 특이적으로 결합하지 않은 염료 복합체를 세척 용액으로 씻어낸 후 수행되는 것일 수 있다. 상기 세척 용액은 예를 들면, 물, 완충액 (예를 들면, PBS), 생리 식염수 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 방법은, 측정된 시료에 빛을 조사하여 상기 절단가능한 링커를 절단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 조사되는 빛의 파장은 상기 링커의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 100 nm 내지 600 nm 또는, 340 nm 내지 370 nm, 예를 들면, 365 nm일 수 있다. 상기 조사 단계는 예를 들면, 세포에 결합한 복합체 중 표적 물질과 특이적으로 결합한 항체 및 링커의 일부를 남겨두고, 상기 링커의 나머지 부분 및 형광 염료를 제거하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조사 단계 이후, 표적물질에 결합하는 물질, 상기 표적물질에 결합하는 물질에 결합된 절단가능한 링커, 및 상기 링커에 결합된 형광 염료를 포함한 염료 복합체를, 세포를 포함하는 시료와 접촉시켜 염료 복합체가 결합된 세포를 형성하는 단계; 염료 복합체가 결합된 세포로부터 신호를 측정하는 단계; 및 측정된 시료에 빛을 조사하여 상기 절단가능한 링커를 절단하는 단계;를 순서대로 1회 이상 반복할 수 있다. 최종 회는 예를 들면, 상기 접촉 단계 및 측정 단계를 수행하는 것일 수 있다. 각 회 (cycle)에서, 시료에 접촉시키는 염료 복합체는 전 회의 염료 복합체와 표적물질에 결합하는 물질이 다른 염료 복합체, 예를 들면, 전 회의 염료 복합체에 포함된 항체와 항원 특이성이 다른 항체를 포함하는 복합체일 수 있다. 각 회의 염료 복합체의 형광 염료는 전 회의 염료 복합체에 포함된 염료와 동일한 것일 수 있다. 또한, 각 회에서 염료 복합체는 각각 서로 다른 표적 물질에 결합하는 서로 다른 물질 및 서로 다른 형광 염료를 포함하고 있는 복수 개의 염료 복합체의 집합일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 조사 단계 이후, 상기 세포에서 인 시투 (in situ) 혼성화 또는 면역조직화학 분석하는 단계를 수행할 수 있다. 인 시투 혼성화는 예를 들면, 형광 표지된 핵산 탐침으로 표적 세포에서 표적 핵산의 위치를 확인하는 것, 예를 들면, FISH (fluorescent in situ hybridization)일 수 있다. 면역조직화학 분석은 예를 들면, 표적 세포 내에서 발현되는 단백질을 항원-항체 반응에 의해 확인하는 것일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 조사 단계 이후, 표적물질에 결합하는 물질, 상기 표적물질에 결합하는 물질에 결합된 절단가능한 링커, 및 상기 링커에 결합된 형광 염료를 포함한 염료 복합체를, 세포를 포함하는 시료와 접촉시켜 염료 복합체가 결합된 세포를 형성하는 단계; 염료 복합체가 결합된 세포로부터 신호를 측정하는 단계; 및 측정된 시료에 빛을 조사하여 상기 절단가능한 링커를 절단하는 단계;를 순서대로 1회 이상 반복한 후, 인 시투 혼성화 또는 면역조직화학 분석을 수행할 수 있다. 각 회에서, 세포에 접촉시키는 염료 복합체는 전 회의 염료 복합체와 표적물질에 결합하는 물질이 다른 염료 복합체, 예를 들면, 전 회의 염료 복합체에 포함된 항체와 항원 특이성이 다른 항체를 포함하는 복합체일 수 있다. 각 회의 염료 복합체의 형광 염료는 전 회의 염료 복합체에 포함된 염료와 동일한 것일 수 있다. 또한, 각 회에서 염료 복합체는 각각 서로 다른 표적 물질에 결합하는 서로 다른 물질 및 서로 다른 형광 염료를 포함하고 있는 복수 개의 염료 복합체의 집합일 수 있다.
다른 양상은 표적 물질에 결합하는 물질, 상기 표적 물질에 결합하는 물질에 결합된, 빛에 의해 절단가능한 링커, 및 상기 링커에 결합된 형광 염료를 포함하는 염료 복합체를 제공한다. 상기 표적물질에 결합하는 물질, 빛에 의해 절단가능한 링커, 및 형광 염료에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 양상에 따른 순차적 다중 염색방법은 소량의 검체를 대상으로 발현 단백질의 정성 또는 정량 분석, 유전자 분석, 형태학적 분석을 위해 사용될 수 있다.
도 1은 복합체의 구성 및 이를 이용한 세포의 순차적 다중 염색 원리를 나타내는 모식도이다.
도 2는 복합체가 결합하지 않은 SK-BR3의 DAPI 형광 영상, 항-cytokeratin 7,8,18 항체 - PC 링커 - FITC 복합체가 결합된 SK-BR3의 형광 영상, 항-EpCAM 항체 - PC 링커 - Rhodamine 복합체가 결합된 SK-BR3의 형광 영상을 나타낸다.
도 3는 BT474 유방암 세포에 결합된 FITC 및 Rhodamine 염료의 노광에 따른 형광 신호 변화를 나타낸다.
도 4는 1차 염색 및 노광 후 2차 염색한 세포와, 1차 염색한 대조군 세포의 염색 효율을 정량적으로 비교한 결과를 나타낸다.
도 5는 SK-BR3 유방암 세포에서 5종의 항원 발현 여부를 3회의 순차적 염색과정을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 복합체가 결합하지 않은 SK-BR3의 DAPI 형광 영상, 항-cytokeratin 7,8,18 항체 - PC 링커 - FITC 복합체가 결합된 SK-BR3의 형광 영상, 항-EpCAM 항체 - PC 링커 - Rhodamine 복합체가 결합된 SK-BR3의 형광 영상을 나타낸다.
도 3는 BT474 유방암 세포에 결합된 FITC 및 Rhodamine 염료의 노광에 따른 형광 신호 변화를 나타낸다.
도 4는 1차 염색 및 노광 후 2차 염색한 세포와, 1차 염색한 대조군 세포의 염색 효율을 정량적으로 비교한 결과를 나타낸다.
도 5는 SK-BR3 유방암 세포에서 5종의 항원 발현 여부를 3회의 순차적 염색과정을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
실시예
1: 항체- 빛에 의해 절단가능한 (
photocleavable
,
PC
) 링커-복합체에 의한 암세포 표지
DMF 중 50 nmol의 직접 제작한 heterobifunctional photocleavable 링커 (하기 화학식 참조) 10 ㎕ 와 인산 버퍼 (50 mM, pH 5) 중 50 nmol 염료 용액 (Fluorescein PEG Thiol (MW 5000), Rhodamine PEG Thiol, (MW 5000), Nanocs Inc.) 15 ㎕를 실온에서 30분간 반응시켰다. 여기에 1X PBS 용액 중 10 nmol의 항-cytokeratin 7,8,18 항체 또는 항-EpCAM 항체 100 ㎕를 첨가한 후 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 그 후, Amicon® Ultra centrifugal filter (Millipore, MW 30,000)로 반응하지 않은 염료를 제거하고 5배 농축하였다. 얻어진 항체-PC 링커-복합체 5 ㎕를 1% BSA가 들어 있는 PBS 완충액에 첨가하고 상기 완충액을 유방암 세포 SK-BR3에 첨가하여 1 시간 동안 15 rpm에서 교반한 다음, SK-BR3과 상기 복합체의 결합 여부를 형광 현미경 (Olympus IX81)을 사용하여 확인하였다.
도 2는 상기 복합체가 결합하지 않은 SK-BR3의 DAPI 형광 영상, 항-cytokeratin 7,8,18 항체 - PC 링커 - FITC 복합체가 결합된 SK-BR3의 형광 영상, 항-EpCAM 항체 - PC 링커 - Rhodamine 복합체가 결합된 SK-BR3의 형광 영상을 나타낸다. 암세포가 상기 첨가된 복합체로 표지됨을 확인할 수 있었다.
실시예
2: 노광에 따른 염료 제거 (
dye
dissection
) 검증
BT474 유방암 세포를 4% paraformaldehyde 용액으로 10분간 고정시키고, 0.2% Trition-X 100을 10분간 처리하여 투과성을 증진시켰다. 1% BSA 용액을 첨가한 후, 항-cytokeratin 항체 - PC 링커 - FITC 복합체 또는 항-IGFR 항체 - PC 링커 - Rhodamine 복합체로 상온에서 60분간 염색하였다. 그 후 1X PBS로 씻어내고, 365 nm 광의 조사 강도 (J)를 증가시키면서 형광 현미경으로 관찰하였다.
도 3은 BT474 유방암 세포에 결합된 FITC 및 Rhodamine 염료의 노광에 따른 형광 신호 변화를 나타낸다. 조사 강도가 증가할수록 형광 신호의 세기가 감소하였고, 따라서 제거되는 염료의 비율이 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예
3: 리셋 (
reset
)된 세포의 염색
SK-BR3 유방암 세포를 4% 파라포름알데히드 용액으로 10분간 고정시키고, 0.2% Trition-X 100을 10분간 처리하여 투과성을 증진시켰다. 1% BSA 용액을 첨가한 후, 항-cytokeratin 항체 - PC 링커 - FITC 복합체 또는 항-IGFR 항체 - PC 링커 - Rhodamine 복합체로 상온에서 60분간 염색하였다. 그 후 1X PBS로 씻어내고, 365 nm 광 (20 J)에 노출시킨 후, 각각 항-EpCAM 항체 - PC 링커 - FITC 복합체 또는 항-EGFR 항체 - PC 링커 - Rhodamine 복합체로 상온에서 60분간 염색하고 형광 강도를 측정하였다. 대조군 세포는 상기와 동일하게 세포 고정, 투과성 증진 및 BSA blocking 과정을 거친 후, 항-EpCAM 항체 - PC 링커 - FITC 복합체 또는 항-EGFR 항체 - PC 링커 - Rhodamine 복합체로 상온에서 60분간 염색하고 형광 강도를 측정하였다.
도 4는 1차 염색 및 노광 후 2차 염색한 세포와, 1차 염색한 대조군 세포의 염색 효율을 정량적으로 비교한 결과를 나타낸다. 항-EpCAM 항체 - PC 링커 - FITC 복합체 또는 항-EGFR 항체 - PC 링커 - Rhodamine 복합체로 염색한 경우 모두, 노광 후 2차 염색의 형광 강도는 1차 염색 후 형광 강도와 비교하여 오차 범위 내에서 동등한 수준을 나타내어, 노광이 세포 염색에 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다.
실시예
4: 순차적 다종 세포 염색을 이용한 5종 항원 검사
SK-BR3 유방암 세포를 4% 파라포름알데히드 용액으로 10분간 고정시키고, 0.2% Trition-X 100을 10분간 처리하여 투과성을 증진시킨 후 1% BSA 용액을 처리하였다. 상기 처리된 세포를 항-cytokeratin 항체 - PC 링커 - FITC 복합체 및 항-IGFR 항체 - PC 링커 - Rhodamine 복합체로 상온에서 60분간 1차 염색을 하고, 1X PBS로 씻어내었다. 그 후 세포를 365 nm 광 (20 J)에 노출시키고, 항-EpCAM 항체 - PC 링커 - FITC 복합체 및 항-EGFR 항체 - PC 링커 - Rhodamine 복합체로 상온에서 60분간 2차 염색을 하였다. 다시 1X PBS로 씻어낸 후, 세포를 365 nm 광 (20 J)에 노출시키고, 항-HER2 항체 - PC 링커 - Rhodamine 복합체로 상온에서 60분간 3차 염색을 하였다. 각 1차, 2차, 3차 염색 및 노광 후 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다
도 5는 SK-BR3 유방암 세포에서 5종의 항원 발현 여부를 3회의 순차적 염색과정을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
10: 세포
20: 항원
30, 31, 32: 항체
40: 절단가능한 링커
50: 형광 염료
20: 항원
30, 31, 32: 항체
40: 절단가능한 링커
50: 형광 염료
Claims (14)
- 표적 물질에 결합하는 물질, 상기 표적 물질에 결합하는 물질에 결합된 절단가능한 링커, 및 상기 링커에 결합된 형광 염료를 포함한 염료 복합체를, 세포를 포함하는 시료와 접촉시켜 염료 복합체가 결합된 세포를 형성하는 단계; 및
염료 복합체가 결합된 세포로부터 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 세포에 존재하는 물질을 확인하는 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 표적 물질에 결합하는 물질은 항체, 항원, 앱타머, 수용체, 리간드, 효소 기질, 효소 저해제, 효소 보조인자 및 효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 절단가능한 링커는 빛에 의해 절단가능한 화합물 (photocleavable compound)인 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 형광 염료는 FITC, DAPI, Cy5, Cy3, Texas Red 및 Rhodamine으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 표적 물질은 단백질, 당, 지질, 핵산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 혈중 종양 세포 (circulating tumor cell), 암 줄기 세포, 면역 세포, 태아 줄기 세포, 태아 세포, 암 세포 및 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 청구항 3에 있어서, 측정된 시료에 빛을 조사하여 상기 절단가능한 링커를 절단하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 조사 단계 (irradiating) 이후 상기 접촉 단계, 측정 단계, 및 조사 단계를 순서대로 1회 이상 반복하고, 최종 회에서 접촉 단계 및 측정 단계를 수행하는 것인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 조사 단계 이후 상기 표적 세포에서 인 시투 (in situ) 혼성화 또는 면역조직화학 분석하는 단계를 수행하는 것인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 조사 단계 이후 상기 접촉 단계, 측정 단계, 및 조사 단계를 순서대로 1회 이상 반복한 후, 인 시투 (in situ) 혼성화 또는 면역조직화학 분석하는 단계를 수행하는 것인 방법.
- 청구항 8 또는 10에 있어서, 각 회 (cycle)의 반복은 전 회의 염료 복합체와 다른 염료 복합체를 사용하는 것인 방법.
- 청구항 11에 있어서, 다른 염료 복합체는 표적 물질에 결합하는 물질이 다른 염료 복합체인 것인 방법.
- 표적 물질에 결합하는 물질, 상기 표적 물질에 결합하는 물질에 결합된, 빛에 의해 절단가능한 링커, 및 상기 링커에 결합된 형광 염료를 포함하는 염료 복합체.
- 청구항 13에 있어서, 상기 표적 물질에 결합하는 물질은 항체, 항원, 앱타머, 수용체, 리간드, 효소 기질, 효소 저해제, 효소 보조인자 및 효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 염료 복합체.
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