ES2434491T3

ES2434491T3 - An�lisis inmunohistoqu�mico multiplex in situ

Info

Publication number: ES2434491T3
Application number: ES06816876T
Authority: ES
Inventors: Stefan Hamann; Michael J. Donovan; Mark Clayton; Angeliki Kotsianti
Original assignee: Funda O D Anna Sommer Champalimaud E Dr Carlos Montez Champalimaud; Fundacao D Anna Sommer Champalimaud e Dr Carlos Montez Champalimaud
Current assignee: Funda O D Anna Sommer Champalimaud E Dr Carlos Montez Champalimaud; Fundacao D Anna Sommer Champalimaud e Dr Carlos Montez Champalimaud
Priority date: 2005-10-13
Filing date: 2006-10-13
Publication date: 2013-12-16
Anticipated expiration: 2026-10-13
Also published as: US8093012B2; WO2007047450A1; US20070154958A1; EP1934607A1; PT1934607E; EP1934607B1

Abstract

Un método inmunohistoquímico para detectar simultáneamente la presencia o ausencia de al menos tres dianasen una muestra biológica, que comprende las etapas de:(a) realizar recuperación de antígenos en la muestra biológica, en donde dicha recuperación de antígenoscomprende las etapas: i. desparafinar y rehidratar la muestra biológica; y ii. llevar a ebullición en tampón de recuperación de antígenos; (b) realizar reducción de autofluorescencia en la muestra biológica antes de la etapa (a), la etapa (c) o la etapa(d), en donde dicha reducción de autofluorescencia comprende incubar dicha muestra biológica en una soluciónque comprende ácido clorhídrico al 1 % y etanol al 70 %; (c) poner en contacto a la muestra biológica con (1) un primer anticuerpo específico para una primera diana, (2)un primer reactivo de marcado en donde dicho primer reactivo de marcado comprende un resto de unión alanticuerpo para dicho primer anticuerpo y un primer resto de detección, (3) un segundo anticuerpo específicopara una segunda diana, (4) un segundo reactivo de marcado que comprende un resto de unión al anticuerpopara dicho segundo anticuerpo y un segundo resto de detección, (5) un tercer anticuerpo específico para unatercera diana, y (6) un tercer reactivo de marcado que comprende un resto de unión al anticuerpo para dichotercer anticuerpo y un tercer resto de detección; y (d) detectar cada uno de dichos primer, segundo y tercer reactivos de marcado, respectivamente, en dichamuestra biológica con lo que la presencia de dichos primer, segundo y tercer reactivos de marcado,respectivamente, indica la presencia de dichas primera, segunda o tercera dianas, respectivamente, en dichamuestra biológica y la ausencia de dichos primer, segundo o tercer reactivos de marcado indica la ausencia dedichas primera, segunda o tercera dianas, respectivamente, en dicha muestra biológica, en el que dicha muestra biológica es tejido humano incluido en parafina.

Description

An�lisis inmunohistoqu�mico multiplex in situ

5 La inmunofluorescencia es un m�todo para detectar la distribuci�n de un ant�geno en una muestra biol�gica a trav�s de la uni�n espec�fica de un anticuerpo que, a su vez, est� acoplado a un agente fluorescente. El anticuerpo se une espec�ficamente a la mol�cula diana de modo que la marca fluorescente indica cualitativa y/o cuantitativamente la presencia de la diana.

Se han desarrollado diferentes m�todos para la uni�n de la marca fluorescente. El m�todo de marcado directo utiliza un anticuerpo primario (un anticuerpo que reconoce a la diana) que es acoplado a continuaci�n al agente fluorescente. Este m�todo requiere mucho trabajo y cierta cantidad de anticuerpo podr�a inactivarse en el proceso (si la propia marca se une a la regi�n de reconocimiento del ant�geno del anticuerpo).

15 El m�todo indirecto utiliza un anticuerpo secundario - un anticuerpo que reconoce al anticuerpo primario - acoplado a un agente fluorescente para unirse a la marca. Se han descrito varias variaciones diferentes de este m�todo. A menudo el anticuerpo primario se aplica primero a la muestra, seguido por una etapa de lavado y la aplicaci�n de un anticuerpo secundario espec�fico de especie que porta una marca fluorescente. Esto da como resultado, a menudo, problemas de fondo debido a uni�n inespec�fica del anticuerpo secundario al tejido. Otra estrategia ha utilizado complejos de anticuerpo primario-secundario formados previamente (Tuson et al. 1990). Este m�todo permite el marcado indirecto de anticuerpos primarios derivados de la misma especie, pero el uso de anticuerpos secundarios divalentes puede conducir a complejos entrecruzados.

Una estrategia similar que evita este problema es el uso de fragmentos Fab espec�ficos de Fc monovalentes para la

25 generaci�n de complejos formados previamente y ha sido comercializada por Molecular Probes (Zenon; Eugene, OR). Otros han modificado este m�todo utilizando fragmentos Fab que reconocen las regiones tanto Fc como f(ab')2 del anticuerpo primario (Brown et al. 2004). Esta estrategia se describe en la solicitud estadounidense 10/118.204 presentada el 5 de abril de 2002 y en el documento WO 03/030817.

Todos los m�todos anteriores tienen en com�n que el anticuerpo primario se marca antes de ponerlo en contacto con una muestra biol�gica. El anticuerpo primario es marcado directamente con un fluor�foro (a trav�s de medios qu�micos, mediante uni�n al anticuerpo secundario o un fragmento Fab marcado con un agente fluorescente) o los anticuerpos primarios son detectados con un anticuerpo secundario bivalente que est� marcado con un fluor�foro (habitualmente por medios qu�micos). Esto puede causar problemas, especialmente en una muestra de tejido

35 incluida en parafina y fijada que es generalmente menos accesible a mol�culas grandes que otras muestras biol�gicas (por ejemplo c�lulas cultivadas permeabilizadas y fijadas). Por ejemplo, un anticuerpo en un complejo formado previamente con un anticuerpo secundario tiene dos veces el peso molecular del anticuerpo primario. Un anticuerpo en un complejo formado previamente con fragmentos Fab tiene aproximadamente dos veces el peso molecular del anticuerpo primario si est�n unidos tres fragmentos Fab por anticuerpo.

El mayor tama�o de estos complejos puede impedir la penetraci�n suficiente del tejido y, por lo tanto, restringir o inhibir la detecci�n de la mol�cula diana, causar una excesiva tinci�n de fondo y, por lo tanto, complicar la detecci�n de la mol�cula diana. Esto es especialmente relevante para la detecci�n de un biomarcador nuclear, donde los complejos anticuerpo - Fab son incapaces de penetrar en la prote�na complejada del n�cleo y en su lugar se

45 encuentran acumulados en el citoplasma. Por lo tanto, existe una necesidad de m�todos mejorados para analizar ant�genos intracelulares.

El documento G.M. Wessel y D.R. McClay, Journal of Histochemistry and Cytochemistry vol 34, no. 6 p�gs. 703-706 (1986) desvela un m�todo inmunohistoqu�mico en el que la muestra se pone en contacto con anticuerpos no marcados espec�ficos para un ant�geno diana dado y posteriormente se pone en contacto con reactivo de marcado. El m�todo se usa para detectar dos (y no m�s) dianas, espec�ficamente en tejido de erizo de mar.

El documento M Semar et al. (1969) Quantitative Comparison Immunohistochemistry. Clinical Chemistry 15(6) p�gs. 505-508 desvela la autofluorescencia de prote�nas tisulares. El documento S.A. Pilen et al. (1997) Journal of

55 Pathology 183, p�gs. 116-123 proporciona una comparaci�n de diferentes m�todos de t�cnicas de recuperaci�n de ant�genos en inmunohistoqu�mica.

Existen cada vez m�s evidencias de que la proliferaci�n de c�lulas tumorales tiene importancia en el pron�stico para diversos tumores que se producen habitualmente, incluyendo linfoma (Braylan R. C., Diamond L. W., Powell M.L., Harty-Golder B. Percentage of cells in the S phase of the cell cycle in human lymphoma determined by flow cytometry: Correlation with labeling index and patient survival. Cytometry 1980; 1: 171-174; y Bauer K. D., Merkel D.E., Winter J.N., et al. Prognostic implications of ploidy and proliferative activity in diffuse large cell lymphomas. Cancer Res 1986; 46: 3173-3178), c�ncer de mama (Clark G.M., Dressler L.G:, Owens M.A., Pounds G., Oldaker T., McGuire W.L. Predictions of relapse or survival in patients with mode-negative breast cancer by DNA flow cytometry. 65 N. Engl J Med 1989; 320: 627-633; Silvestrini R., Daidone M. G., Gasparini G. Cell kinetics as a prognostic marker in node-negative breast cancer. Cancer 1985; 56: 982-1987; y Sigurdsson H, Baldetorp B, Borg A., et al. Indicators of

prognosis in node negative breast cancer. N Engl J Med 1990; 322: 1045-1053) y c�ncer de colon (Bauer K. D., Lincoln S. T., Vera-Roman J.M., et al. al. Prognostic implications of proliferative activity and DNA aneuploidy in colonic adenocarcinomas Lab Invest 1987; 57: 329 -335). En algunos estudios, la proliferaci�n de c�lulas tumorales tiene importancia en el pron�stico independiente, incluso aunque el an�lisis del contenido total de ADN (“ploid�a”) no

5 la tenga (Visscher D. W., Zarbo R. J., Greenawald K. A., Crissman J. D. Prognostic significance of morphological parameters and flow cytometric DNA analysis in carcinoma of the breast. Pathol Ann 1990; 25 (Parte-I): 171-210).

La citometr�a de flujo (FCM) se ha usado ampliamente para determinar la actividad del ciclo celular, principalmente mediante cuantificaci�n de la parte de fase S del an�lisis del contenido de ADN (“ploid�a”). Este m�todo padece una serie de graves limitaciones t�cnicas, sin embargo. En primer lugar, puede ser dif�cil obtener suspensiones de c�lulas individuales a partir de tumores s�lidos, y pueden perderse cantidades variables de c�lulas tumorales durante la preparaci�n. En segundo lugar, las c�lulas tumorales son diluidas de forma variable por c�lulas normales e inflamatorias benignas, lo que puede conducir a subestimaci�n de la fracci�n de fase S, particularmente para tumores con ADN diploide. En tercer lugar, la complejidad del an�lisis del contenido de ADN (“ploid�a”), que est�

15 constituida por una serie de curvas solapantes, puede excluir el uso preciso de algoritmos de ajuste de curva para medir la parte de fase S del histograma. Estudios multicentro han mostrado mala reproducibilidad para fracci�n de fase S de citometr�a de flujo, haciendo a la utilidad cl�nica pr�ctica de la medici�n algo dudosa. Otro problema asociado con la medici�n de la cin�tica celular mediante citometr�a de flujo es que, normalmente, s�lo se determina la fracci�n de fase S, mientras que una proporci�n significativa de la poblaci�n de c�lulas tumorales puede residir en la fase G1 del ciclo celular, compuesta por c�lulas dispuestas a entrar en el ciclo pero que a�n no sintetizan ADN. Posiblemente, dos tumores pueden tener fracciones de fase S id�nticas pero diferir significativamente en la fracci�n total de c�lulas en estado no de reposo y, por lo tanto, pueden mostrar cin�tica de crecimiento y respuesta a agentes quimioterap�uticos dependientes del ciclo diferentes.

25 Por todas estas razones, m�todos in situ de an�lisis del ciclo de c�lulas tumorales pueden proporcionar m�s informaci�n biol�gicamente significativa de la que puede obtenerse usando c�lulas tumorales desagregadas (Weinberg D. S. Relative applicability of image analysis and flow cytometry in clinical medicine. En: Bauer K. D., Duque R. E., eds. Flow cytometry: Principles and applications. Baltimore: Williams y Wllkins; 1992: 359-372; y Weinberg D. S. Proliferation indices in solid tumors. Adv Pathol Lab Med 1992; 5: 163--191). Adem�s de garantizar que las mediciones adquiridas se realizan espec�ficamente en las c�lulas tumorales, los m�todos in situ pueden permitir un muestreo m�s amplio del tumor y la determinaci�n de la heterogeneidad de las c�lulas tumorales.

Sumario de la invenci�n

35 La presente invenci�n se basa en parte en el sorprendente descubrimiento de que combinar una t�cnica de recuperaci�n de ant�geno �nico y t�cnicas de eliminaci�n de autofluorescencia de hibridaci�n fluorescente in situ (FISH) permite la detecci�n inmunohistoqu�mica altamente sensible de m�ltiples ant�genos diana en muestras de tejido. Por consiguiente, la invenci�n proporciona un m�todo para detectar al menos tres mol�culas diana en muestras biol�gicas que son secciones de tejido incluidas en parafina.

La invenci�n proporciona m�todos de detecci�n de tres o m�s dianas en una muestra biol�gica. Tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, quince o m�s dianas son detectadas en una muestra biol�gica.

Por lo tanto, de acuerdo con la invenci�n se proporciona un m�todo inmunohistoqu�mico para detectar

45 simult�neamente la presencia o ausencia de al menos tres dianas en una muestra biol�gica que comprende las etapas de:

(a): realizar recuperaci�n de ant�genos en la muestra biol�gica, en el que dicha recuperaci�n de ant�genos comprende las etapas de:

i. desparafinar y rehidratar la muestra biol�gica; y

ii. llevar a ebullici�n en tamp�n de recuperaci�n de ant�genos;

(b): realizar reducci�n de autofluorescencia en la muestra biol�gica antes de la etapa (a), la etapa (c) o la etapa

55 (d), en el que dicha reducci�n de autofluorescencia comprende incubar dicha muestra biol�gica en una soluci�n que comprende �cido clorh�drico al 1 % y etanol al 70 %;

(c): poner en contacto a la muestra biol�gica con (1) un primer anticuerpo espec�fico para una primera diana, (2) un primer reactivo de marcado en donde dicho primer reactivo de marcado comprende un resto de uni�n al anticuerpo para dicho primer anticuerpo y un primer resto de detecci�n, (3) un segundo anticuerpo espec�fico para una segunda diana, (4) un segundo reactivo de marcado que comprende un resto de uni�n al anticuerpo para dicho segundo anticuerpo y un segundo resto de detecci�n, (5) un tercer anticuerpo espec�fico para una tercera diana, y (6) un tercer reactivo de marcado que comprende un resto de uni�n al anticuerpo para dicho tercer anticuerpo y un tercer resto de detecci�n; y

(d): detectar cada uno de dichos primer, segundo y tercer reactivos de marcado, respectivamente, en dicha

65 muestra biol�gica con lo que la presencia de dichos primer, segundo y tercer reactivos de marcado, respectivamente, indica la presencia de dichas primera, segunda o tercera dianas, respectivamente, en dicha muestra biol�gica y la ausencia de dichos primer, segundo o tercer reactivos de marcado indica la ausencia de dichas primera, segunda o tercera dianas, respectivamente, en dicha muestra biol�gica,

en el que dicha muestra biol�gica es tejido humano incluido en parafina.

5 Las dianas se detectan poniendo en contacto a una muestra biol�gica con un reactivo de detecci�n y un reactivo de marcado en condiciones en las que la diana, el reactivo de detecci�n y el reactivo de marcado son capaces de formar un complejo. El reactivo de detecci�n unido al reactivo de marcado es detectado a continuaci�n por el sistema de detecci�n apropiado (por ejemplo, microscopio de fluorescencia). La presencia del reactivo de marcado indica la presencia de la diana en la muestra biol�gica. An�logamente, la ausencia del reactivo de marcado indica la ausencia de la diana en la muestra biol�gica. Adicionalmente la concentraci�n de la diana en la muestra biol�gica se determina comparando la cantidad de reactivo de marcado detectado con una muestra de control. La determinaci�n de las concentraciones de la diana permite determinar relaciones de dos o m�s dianas en una muestra. La relaci�n est� relacionada con un intervalo predeterminado para indicar un estado de una enfermedad. La muestra de control es por ejemplo una micromatriz de p�ptidos. En algunos aspectos, la detecci�n de la diana es indicativa de la

15 heterogeneidad de las c�lulas tumorales. Opcionalmente, la muestra biol�gica se lava antes y/o despu�s de la adici�n del reactivo de detecci�n. La muestra biol�gica se pone en contacto con el reactivo de detecci�n y el reactivo de marcado de forma secuencial. Como alternativa, la muestra biol�gica se pone en contacto con el reactivo de detecci�n y el reactivo de marcado de forma concurrente. Opcionalmente, se permite que un primer reactivo de detecci�n forme un complejo con un primer reactivo de marcado antes de entrar en contacto con la muestra biol�gica.

La muestra biol�gica es una secci�n de tejido humano incluida en parafina o una secci�n de tejido conservada criog�nicamente. La muestra biol�gica est� inmovilizada sobre una superficie, en algunos aspectos la muestra biol�gica est� sustancialmente libre de �cidos nucleicos antes de la detecci�n del reactivo de marcado.

25 El reactivo de detecci�n es, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo espec�fico para la diana de inter�s. El anticuerpo es, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal. La diana es un ant�geno de la superficie celular, un ant�geno intracelular o un ant�geno nuclear. Por ejemplo, la diana es una oncoprote�na. Las dianas ejemplares incluyen un receptor de andr�genos, una prote�na citoqueratina 18 o una prote�na PTEN.

El reactivo de marcado contiene un resto de uni�n al reactivo de detecci�n y un resto de detecci�n, es decir, una marca. Un resto de uni�n al anticuerpo es, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monovalente tal como un fragmento Fab o Fab'. El resto de uni�n al anticuerpo se deriva de un anticuerpo policlonal o monoclonal. El fragmento de uni�n al anticuerpo es un fragmento de anticuerpo anti-Fc, un fragmento de anticuerpo anti-cadena

35 ligera kappa, un fragmento de anticuerpo anti-cadena ligera lambda o un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. Como alternativa, el resto de uni�n al anticuerpo es una prote�na no de anticuerpo tal como prote�na G, una prote�na A, una prote�na L y una lectina. El resto de detecci�n es, por ejemplo, un resto fluorescente, un resto radiactivo o una enzima.

Aunque no de acuerdo con la presente invenci�n seg�n las reivindicaciones, podr�a proporcionarse una plataforma para evaluaci�n antig�nica cuantitativa multiplexada que combina detecci�n por inmunofluorescencia (IF) (por ejemplo, usando cualquiera de los m�todos descritos en el presente documento) con an�lisis de im�genes asistido por ordenador. Las mediciones generadas por ordenador que reflejan la presencia, intensidad y distribuci�n de marcas fluorescentes en im�genes del tejido est�n sujetas a enfoques matem�ticos supervisados para generar

45 modelos, por ejemplo, para el diagn�stico y el pron�stico de la enfermedad.

A menos que se definan de otra forma, todos los t�rminos t�cnicos y cient�ficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la invenci�n. Aunque en la puesta en pr�ctica o a prueba de la presente invenci�n pueden usarse m�todos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuaci�n se describen m�todos y materiales adecuados.

Adem�s, los materiales, m�todos y ejemplos son solamente ilustrativos.

55 Otras caracter�sticas y ventajas de la invenci�n ser�n evidentes a partir de la siguiente descripci�n detallada, y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripci�n de los dibujos

La figura 1 es una representaci�n esquem�tica de los m�todos de la invenci�n. La figura 2 son fotograf�as que muestran la detecci�n del receptor de andr�genos en tejido de pr�stata con IgG policlonal de conejo usando m�todos convencionales (panel izquierdo) y los m�todos de la invenci�n (panel derecho). La figura 3 es una representaci�n esquem�tica de detecci�n Multiplex de biomarcadores.

65 La figura 4 son fotograf�as que muestran la detecci�n simult�nea de Ki-67 y el receptor de andr�genos (AR) con IgG anti-AR policlonal de conejo e IgM anti-AR monoclonal de rat�n.

La figura 5 es una representaci�n esquem�tica de detecci�n Multiplex de biomarcadores en secciones de tejido incluidas en parafina. La figura 6 es una representaci�n esquem�tica del uso de una matriz de p�ptidos para cuantificar la expresi�n de un biomarcador.

5 La figura 7 es un gr�fico que muestra la curva patr�n de la matriz de p�ptidos de pTyr. La figura 8 es un gr�fico que muestra la curva patr�n de la matriz de p�ptidos de AR. La figura 9 es una representaci�n esquem�tica de amplificaci�n con los m�todos de la invenci�n. La figura 10 es una serie de fotograf�as que comparan detecci�n de biomarcador no amplificado frente a amplificado usando los m�todos de la invenci�n. La figura 11 son fotograf�as que muestran una �nica regi�n de inter�s en el paciente ID 4752-1. La figura 12 son fotograf�as que muestran una �nica regi�n de inter�s en el paciente ID 4754-2. La figura 13 son fotograf�as que muestran M-plex duplex con CD4 y CD8. N�tese la localizaci�n estromal adyacente a c�lulas epiteliales positivas para CK18. La figura 14 son fotograf�as que muestran M-plex triplex con CD25, 69 y 86. N�tese la localizaci�n estromal

15 adyacente a c�lulas epiteliales positivas para CK18 La figura 15 son fotograf�as que muestran M-plex duplex en bazo que ilustran la distribuci�n y la localizaci�n celular de CD8 y 86. N�tese la abundancia de linfocitos CD8 presentes en el bazo junto con las c�lulas B activadas maduras esperadas, tal como se demuestra mediante la tinci�n con CD86. (AF= Autofluorescencia). La figura 16 es un esquema que ilustra la detecci�n espectral de CD8 y CD86 en tejido espl�nico. La figura 17 son fotograf�as que muestran M-plex triplex en bazo que ilustran la distribuci�n y la localizaci�n celular de CD4, 25 y 69. N�tese la abundancia de linfocitos CD4 en el bazo tal como se esperaba con cantidades variables de CD25 y CD69. La figura 18 son fotograf�as que muestran un quintplex. La figura 19 son fotograf�as que muestran un 7-plex en tejido de la pr�stata.

25 La figura 20 son fotograf�as que muestran un quintplex en l�neas celulares. La figura 21 son fotograf�as que muestran un quintplex en l�neas celulares.

Descripci�n detallada

La invenci�n proporciona un m�todo mejorado para la detecci�n de tres o m�s dianas en una muestra biol�gica. M�s espec�ficamente, la presente invenci�n se basa en un m�todo de an�lisis in situ simult�neo de m�ltiples dianas intracelulares. Los m�todos de la invenci�n permiten una elevada resoluci�n espacial para una precisa localizaci�n celular de ant�geno y elevada resoluci�n espectral para permitir la detecci�n simult�nea de m�ltiples tinciones inmunohistoqu�micas. Los m�todos son particularmente adecuados para la detecci�n de ant�genos nucleares. Los

35 m�todos son �tiles en una serie de campos tales como, por ejemplo, en diagn�stico y pron�stico del c�ncer.

La presente invenci�n es ventajosa respecto a m�todos descritos anteriormente ya que proporciona los beneficios del marcado indirecto con la facilidad y la flexibilidad del marcado directo para la determinaci�n de una diana deseada en una muestra biol�gica. Los reactivos de marcado espec�ficos para un anticuerpo de uni�n a la diana son complejados despu�s de la adici�n con una muestra biol�gica. Los reactivos de marcado de acuerdo con la presente invenci�n normalmente comprenden un fragmento de anticuerpo monovalente (Fab) que se une a la parte Fc y/o F(ab')2 del anticuerpo primario y est� unido covalente o no covalentemente a una marca fluorescente. Por lo tanto, a diferencia de m�todos descritos anteriormente, el reactivo de marcado aplicado de forma independiente no comprende un anticuerpo bivalente que reconoce al anticuerpo primario, sino un fragmento de anticuerpo

45 monovalente mucho m�s peque�o, (Fab) o F(ab')2 que tiene un mayor potencial para penetrar en tejido incluido en parafina y fijado con formalina. Por lo tanto, la presente invenci�n proporciona numerosas ventajas respecto a los m�todos convencionales de inmunomarcado.

Definiciones

“Afinidad” se define como la fuerza de la interacci�n de uni�n de dos mol�culas, tales como un ant�geno y su anticuerpo, que se define para anticuerpos y otras mol�culas con m�s de un sitio de uni�n como la fuerza de uni�n del ligando en un sitio de uni�n espec�fico. Aunque la uni�n no covalente de un ligando a un anticuerpo normalmente no es tan fuerte como una uni�n covalente, “Alta afinidad” es para un ligando que se une a un

55 anticuerpo que tiene una constante de afinidad (Ka) de m�s de 104 M-1, normalmente 105-1011 M-1; seg�n lo determinado mediante ELISA de inhibici�n o una afinidad equivalente determinada mediante t�cnicas comparables tales como, por ejemplo, gr�ficos de Scatchard o usando Kd/constante de disociaci�n, que es la rec�proca de la Ka, etc. “Anticuerpo” se define como una prote�na de la superfamilia de la inmunoglobulina (Ig) que se une de forma no covalente a ciertas sustancias (por ejemplo ant�genos e inmun�genos) para formar un complejo ant�genoanticuerpo, incluyendo, aunque sin limitarse a, anticuerpos producidos por l�neas celulares de hibridoma, mediante inmunizaci�n para provocar una respuesta de anticuerpo policlonal, mediante s�ntesis qu�mica y mediante c�lulas hu�sped recombinantes que han sido transformadas con un vector de expresi�n que codifica el anticuerpo. En seres humanos, los anticuerpos de inmunoglobulina se clasifican como IgA, IgD, IgE, IgG e

65 IgM y se dice que miembros de cada clase tienen el mismo isotipo. Los isotipos de IgA e IgG humana est�n subdivididos adicionalmente en subtipos IgG1, e IgA2, e IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Los ratones generalmente

tienen los mismos isotipos que los seres humanos, pero el isotipo de IgG se subdivide en subtipos IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3. Por lo tanto, se entender� que el t�rmino “anticuerpo” tal como se usa en el presente documento incluye dentro de su alcance (a) cualquiera de las diversas clases o subclases de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgM, IgE derivadas de cualquiera de los animales usados convencionalmente y (b) anticuerpos policlonales y monoclonales, tales como anticuerpos murinos, quim�ricos o humanizados. Las mol�culas de anticuerpo tienen regiones de secuencia de amino�cidos que pueden actuar como determinante antig�nico, por ejemplo la regi�n Fc, la cadena ligera kappa, la cadena ligera lambda, la regi�n bisagra, etc. Un anticuerpo que se genera contra una regi�n seleccionada se denomina anti-(regi�n), por ejemplo anti-Fc, anti-cadena ligera kappa, anticadena ligera lambda, etc. Un anticuerpo se genera normalmente contra un ant�geno inmunizando un organismo con una macromol�cula para iniciar la activaci�n de linfocitos para expresar la prote�na inmunoglobulina. El t�rmino anticuerpo, tal como se usa en el presente documento, tambi�n abarca cualquier polip�ptido, fragmento de anticuerpo, o prote�na que tiene un dominio de uni�n que es, o es hom�logo a, un dominio de uni�n al anticuerpo, incluyendo, sin limitaci�n, mol�culas Fv de cadena sencilla (scFv), en las que un dominio VH y un dominio VL est�n enlazados por un enlazador pept�dico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de uni�n al ant�geno (Bird et al., Science 242, 423 (1988) y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85,)). Estos pueden derivarse de fuentes naturales, o pueden producirse parcial o totalmente de forma sint�tica. “Fragmentos de anticuerpo” se define como fragmentos de anticuerpos que conservan las principales caracter�sticas de uni�n electivas del anticuerpo completo. En la t�cnica son conocidos fragmentos particulares, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')2, que se obtienen mediante digesti�n con diversas proteasas y que carecen del fragmento Fc de un anticuerpo intacto o los llamados fragmentos de “media-mol�cula” obtenidos mediante escisi�n reductiva de los puentes disulfuro que conectan los componentes de cadena pesada en el anticuerpo intacto. Dichos fragmentos tambi�n incluyen fragmentos aislados constituidos por la regi�n variable de cadena ligera, fragmentos “Fv” constituidos por las regiones variables de las cadenas pesada y ligera y mol�culas polipept�dicas de cadena sencilla recombinantes en las que regiones variables ligera y pesada est�n conectadas por un enlazador pept�dico. Otros ejemplos de fragmentos de uni�n incluyen (i) el fragmento Fd, constituido por los dominios VH y CHl; (ii) el fragmento dAb (Ward, et al., Nature 341, 544 (1989)), que est� constituido por un dominio VH; (iii) regiones CDR aisladas; y (iv) mol�culas Fv de cadena sencilla (scFv) descritas anteriormente, adem�s, usando tecnolog�a recombinante pueden fabricarse fragmentos arbitrarios que conservan caracter�sticas de reconocimiento del ant�geno. “Ant�geno” se define como una mol�cula que induce, o es capaz de inducir, la formaci�n de un anticuerpo o a la que un anticuerpo se une selectivamente, incluyendo aunque sin limitarse a, un material biol�gico. Ant�geno tambi�n se refiere a “inmun�geno”. Un anticuerpo se une selectivamente a un ant�geno cuando existe una falta relativa de reactividad cruzada con o interferencia por otras sustancias presentes. “Muestra biol�gica” o “material biol�gico” se define como una muestra recuperada de seres humanos en particular. La muestra puede ser de un tejido sano, tejido enfermo o tejido del que se sospecha que es tejido enfermo. La muestra puede ser una biopsia tomada, por ejemplo, durante un procedimiento quir�rgico. La muestra puede recogerse por medio de aspiraci�n a trav�s de aguja fina, raspando o lavando una cavidad para recoger c�lulas o tejido de ella. La muestra puede ser de un tumor por ejemplo, tumores s�lidos y hematopoy�ticos as� como de tejido sano adyacente. La muestra es una secci�n de tejido incluida en parafina. Normalmente, la muestra comprende tejido, c�lula o c�lulas, extractos celulares, homogenados de c�lulas, prote�nas purificadas o reconstituidas, prote�nas recombinantes, fluidos corporales y otros fluidos biol�gicos, virus o part�culas virales, priones, componentes subcelulares o prote�nas sintetizadas. Posibles fuentes de material celular usadas para preparar la muestra de la invenci�n incluyen sin limitaci�n plantas, animales, hongos, protistas, bacterias, arqueobacterias o l�neas celulares derivadas de dichos organismos. “Complejo” se define como dos o m�s mol�culas que se mantienen juntas mediante uni�n no covalente, que son normalmente combinaciones no covalentes de biomol�culas tales como una prote�na complejada con otra prote�na. En contraste, una prote�na est� marcada covalentemente con una sustancia cuando existe un enlace qu�mico covalente entre la sustancia y la prote�na. "Distinta detectable" se define como la se�al que es distinguible o separable mediante una propiedad f�sica mediante observaci�n o de forma instrumental. Por ejemplo, aunque sin limitaci�n, un fluor�foro es f�cilmente distinguible, mediante caracter�sticas espectrales o mediante intensidad de fluorescencia, ciclo de vida, polarizaci�n o velocidad de fotoblanqueo de otro fluor�foro en la muestra, as� como de materiales adicionales que opcionalmente est�n presentes. “Detectable directamente” se define para significar que la presencia de un material o la se�al generada a partir del material es inmediatamente detectable mediante observaci�n, instrumentaci�n o pel�cula sin requerir modificaciones qu�micas. “Inmunoconjugados” se definen para significar que se marcan prote�nas de la invenci�n, donde en lugar de que una marca detectable est� unida a la prote�na, est� unido un agente o f�rmaco terap�utico. El t�rmino inmunoconjugado se usa de forma intercambiable con prote�na marcada con un f�rmaco. “Fragmento de anticuerpo monovalente” se define como un fragmento de anticuerpo que tiene solamente un sitio de uni�n al ant�geno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo monovalentes incluyen, aunque sin limitarse a, fragmentos Fab (sin regi�n bisagra), fragmentos Fab' (fragmentos monovalentes que contienen una regi�n bisagra de cadena pesada) y prote�nas variables de fragmento de cadena sencilla (ScFv). “Identificaci�n Multiplex” se refiere a la identificaci�n simult�nea de una o m�s dianas en una �nica mezcla. Por ejemplo, una amplificaci�n dos-plex se refiere la identificaci�n simult�nea, en una �nica mezcla de reacci�n, de dos dianas diferentes. “Se une selectivamente” se define como la situaci�n en la que un miembro de un par de uni�n intra- o interespecies espec�fico no mostrar� ninguna uni�n significativa a mol�culas diferentes de su socio de uni�n intra- o inter-especies espec�fico (por ejemplo, una afinidad de aproximadamente 100 veces menos), es decir

5 reactividad cruzada m�nima.

M�todo de detecci�n

En diversos aspectos, la invenci�n proporciona: m�todos de detecci�n de al menos tres dianas en una muestra biol�gica. Las dianas se detectan poniendo en contacto una muestra biol�gica con un reactivo de detecci�n de la diana, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo y un reactivo de marcado. Las dianas se detectan mediante la presencia o ausencia del complejo reactivo de detecci�n-reactivo de marcado. Preferentemente, la muestra biol�gica se pone en contacto con el reactivo de detecci�n de la diana y el reactivo de marcado de forma secuencial. Por ejemplo, la muestra biol�gica se incuba con el reactivo de detecci�n en condiciones que permiten

15 que se forme un complejo entre el reactivo de detecci�n y la diana. Despu�s de la formaci�n del complejo, la muestra biol�gica se lava opcionalmente una o m�s veces para eliminar el reactivo de detecci�n no unido. La muestra biol�gica se pone en contacto, adem�s, con un reactivo de marcado que se une espec�ficamente al reactivo de detecci�n que est� unido a la diana. La muestra biol�gica se lava opcionalmente una o m�s veces para eliminar el reactivo de marcado no unido. La presencia o ausencia de la diana en la muestra biol�gica se determina a continuaci�n detectando el reactivo de marcado. Como alternativa, la muestra biol�gica se pone en contacto con el reactivo de detecci�n de la diana y el reactivo de marcado de forma concurrente.

La invenci�n posibilita la detecci�n de dianas m�ltiples en una muestra. Dianas m�ltiples incluyen el ep�topo discreto por el que tiene afinidad el anticuerpo de uni�n a la diana, as� como mol�culas o estructuras a las que est� unido el

25 ep�topo. Por lo tanto, la identificaci�n de dianas m�ltiples incluye el fenotipado de c�lulas basado en la concentraci�n del mismo marcador de la superficie celular en diferentes c�lulas. De esta manera, la identificaci�n de dianas m�ltiples no est� limitada al ep�topo discreto al que se une el anticuerpo de uni�n a la diana, aunque �sta es claramente una manera en la que pueden identificarse dianas m�ltiples, es decir bas�ndose en la afinidad del anticuerpo de uni�n a la diana.

Dianas m�ltiples se identifican poniendo en contacto a la muestra biol�gica con reactivos de detecci�n adicionales seguido por un reactivo de marcado adicional espec�fico para los reactivos de detecci�n adicionales usando el m�todo descrito anteriormente. Por ejemplo, se preparan subconjuntos de reactivo de marcado con distintas marcas, por ejemplo, fluor�foros que se distinguen por sus espectros de emisi�n, por ejemplo, uno que emite en los

35 espectros verdes y uno que emite en los espectros rojos. Los subconjuntos de reactivo de marcado se a�aden a continuaci�n a la muestra biol�gica que contiene complejos de reactivo de detecci�n-diana en una relaci�n controlada, por ejemplo, dos partes de un reactivo de marcado (por ejemplo, emisi�n verde) y una parte del otro reactivo de marcado (por ejemplo, emisi�n roja) por anticuerpo de uni�n a la diana, de esta manera los complejos inmunomarcados pueden usarse para detectar una diana. Si se a�ad�an complejos madre inmunomarcados a la muestra, la diana original pod�a distinguirse de la diana detectada posteriormente.

En m�todos alternativos, se identifican tres o m�s dianas en una muestra biol�gica mezclando previamente un primer reactivo de detecci�n con un primer reactivo de marcado para formar un primer complejo. Opcionalmente, despu�s de la formaci�n del complejo, la mezcla se purifica para eliminar el reactivo de detecci�n y el reactivo de

45 marcado no complejados. La muestra biol�gica se incuba con el primer complejo y un segundo reactivo de detecci�n. Opcionalmente, se detectan 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o m�s dianas en una muestra. Dependiendo del n�mero de dianas a detectar, pueden usarse 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o m�s reactivos de detecci�n. Posteriormente, la muestra biol�gica se incuba con un segundo reactivo de marcado que se une espec�ficamente al segundo reactivo de detecci�n que est� unido a la segunda diana. Opcionalmente, antes de incubar con el segundo reactivo de marcado, la muestra biol�gica se lava una o m�s veces para eliminar el primer complejo y el segundo reactivo de detecci�n no unidos. La presencia o ausencia de la diana en la muestra biol�gica se determina a continuaci�n detectando el reactivo de marcado. Opcionalmente, antes de detectar el reactivo de marcado, la muestra biol�gica se lava una o m�s veces para eliminar reactivos de marcado no unidos.

55 La muestra se define para incluir cualquier material que pueda contener una diana por la que un anticuerpo tiene afinidad. Normalmente, la muestra es de origen biol�gico y comprende tejido, una c�lula o una poblaci�n de c�lulas, extractos celulares, homogenados celulares, prote�nas purificadas o reconstituidas, prote�nas recombinantes, fluidos corporales y otros fluidos biol�gicos, virus o part�culas virales, priones, componentes subcelulares o prote�nas sintetizadas. La muestra es una secci�n de tejido humano incluida en parafina. Los ejemplos de fuentes de dichas muestras incluyen m�sculo, ojo; piel, g�nadas, ganglios linf�ticos, coraz�n, cerebro, pulm�n, h�gado, ri��n, bazo, tumores s�lidos, macr�fagos o mesotelio. La muestra se prepara de una manera que hace a la diana, que es determinada por el usuario final, en la muestra accesible a los complejos inmunomarcados. Normalmente, las muestras usadas en la invenci�n est�n compuestas por tejido o c�lulas. Preferentemente, el tejido o las c�lulas a ensayar se obtendr�n mediante procedimientos quir�rgicos, por ejemplo, biopsia. El tejido o las c�lulas est�n fijadas,

65 para permitir el seccionado histol�gico. Se usa detecci�n in situ para determinar la presencia de una diana particular y para determinar la distribuci�n de la diana en el tejido examinado. Las t�cnicas generales de detecci�n in situ son bien conocidas por los expertos en la materia. V�ase, por ejemplo, el documento Ponder, “Cell Marking Techniques and Their Application” en Mammalian Development: A Practical Approach, Monk (ed.), 115 (1987). Pueden usarse tratamientos que permeabilizan la membrana plasm�tica, tales como electroporaci�n, tratamientos de choque o elevado ATP extracelular, para introducir reactivos en el interior de las c�lulas.

5 Los m�todos de la invenci�n proporcionan ventajas significativas respecto a la tecnolog�a existente, dado que no dependen de hibridaciones de �cido nucleico. Por lo tanto, los m�todos de la invenci�n pueden realizarse en presencia de nucleasas, por ejemplo, nucleasas no espec�ficas, ANDasa y ARNasa.

La diana es cualquier compuesto de origen biol�gico o sint�tico que est� presente como una mol�cula o como un grupo de mol�culas. Normalmente, la diana es un material biol�gico o determinante antig�nico. La identidad qu�mica del ant�geno diana puede ser conocida o desconocida. Los materiales biol�gicos incluyen, aunque sin limitarse a, anticuerpos, amino�cidos, prote�nas, p�ptidos, polip�ptidos, enzimas, sustratos enzim�ticos, hormonas, linfoquinas, metabolitos, ant�genos, haptenos, lectinas, avidina, estreptavidina, toxinas, venenos, contaminantes

15 medioambientales, carbohidratos, oligosac�ridos, polisac�ridos, glucoprote�nas, glucol�pidos, nucle�tidos, oligonucle�tidos, �cidos nucleicos y �cidos nucleicos derivatizados (incluyendo �cidos desoxirribo- y ribonucleicos y �cidos peptidonucleicos), fragmentos de ADN y ARN y fragmentos derivatizados (incluyendo fragmentos de cadena sencilla y de cadena m�ltiple), f�rmacos naturales y sint�ticos, receptores, part�culas de virus, part�culas bacterianas, componentes de virus, c�lulas biol�gicas, componentes celulares (incluyendo membranas y org�nulos celulares), ves�culas lip�dicas naturales y sint�ticas, y membranas polim�ricas. Normalmente, el material diana est� presente como componente o contaminante de una muestra tomada de un sistema biol�gico o medioambiental.

La diana es un marcador transmembrana. Como alternativa, la diana es un ant�geno intracelular o nuclear. Los ant�genos intracelulares incluyen, por ejemplo, alfa-fetoprote�na (AFP), gonadotropina cori�nica humana (HCG),

25 ant�geno-p espec�fico del colon (CSAp), fosfatasa �cida prost�tica, ant�geno oncofetal pancre�tico, fosfatasa alcalina placentaria, parathormona, calcitonina, ant�geno polipept�dico tisular, galactosil transferasa-II (GT-II), ant�geno asociado a gp-52 viral, ant�geno asociado a cistadenocarcinoma de ovario (OCAA), ant�geno espec�fico de tumor de ovario (OCA), ant�genos de c�ncer del cuello del �tero (CA-58, CCA, TA-4), fetoprote�na b�sica (BFP), desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), ant�genos asociados al melanoma citoplasm�tico, ant�geno asociado al astrocitoma humano (HAAA), ant�geno de glioma com�n (CGA), ant�geno glioembrionario (GEA), prote�na �cida fibrilar glial (GFA), ant�geno de meningioma com�n (CMA), pMTOR, pAKT, PSMA, ant�geno espec�fico de pr�stata (PSA), x-metilacil-CoA racemasa (AMACR), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y factor de angiog�nesis tumoral (TAF). Los ant�genos nucleares incluyen, por ejemplo, PTEN, Ki67, Ciclina D1, EZH2, p53, IGFBP2, p-STAT-3. Otras dianas incluyen aquellas enumeradas en las tablas 1 y 2 a continuaci�n.

35 El reactivo de detecci�n es un compuesto que es capaz de unirse espec�ficamente a la diana de inter�s. El reactivo de detecci�n se selecciona bas�ndose en la diana deseada. El reactivo de detecci�n es, por ejemplo, un polip�ptido tal como un anticuerpo espec�fico de la diana o un fragmento del mismo. Tal como se usa en el presente documento, el t�rmino “anticuerpo” se refiere a mol�culas de inmunoglobulina y partes inmunol�gicamente activas de mol�culas de inmunoglobulina (Ig), es decir, mol�culas que contienen un sitio de uni�n al ant�geno que se une espec�ficamente a (inmunorreacciona con) un ant�geno. Dichos anticuerpos incluyen, policlonal, monoclonal, quim�rico, de cadena sencilla, fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2, y una biblioteca de expresi�n de Fab. Por “se une espec�ficamente a” o “inmunorreacciona con” se entiende que el anticuerpo reacciona con uno o m�s determinantes antig�nicos del ant�geno deseado y no reacciona (es decir, no se une) con otros polip�ptidos o lo hace con una con afinidad muy

45 baja (Kd > 10-6) con otros polip�ptidos.

Los anticuerpos monoclonales son particularmente ventajosos para poner en pr�ctica los m�todos de la presente invenci�n. Generalmente, los anticuerpos monoclonales son m�s sensibles y espec�ficos que los anticuerpos policlonales. Adem�s, a diferencia de los anticuerpos policlonales, que dependen de la longevidad del animal que produce el anticuerpo, el suministro de anticuerpos monoclonales es indefinido. Los anticuerpos policlonales, sin embargo, son �tiles cuando es necesario usar anticuerpos con m�ltiples isotipos, dado que generalmente la mayor�a de los anticuerpos monoclonales son de la subclase IgG1.

Tal como se usa en el presente documento, el t�rmino “ep�topo” incluye cualquier determinante prote�nico capaz de

55 uni�n espec�fica a una inmunoglobulina, un scFv, o un receptor de c�lulas T. El t�rmino “ep�topo” incluye cualquier determinante prote�nico capaz de uni�n espec�fica a una inmunoglobulina o receptor de c�lulas T. Los determinantes epit�picos habitualmente est�n constituidos por agrupamientos superficiales qu�micamente activos de mol�culas tales como amino�cidos o cadenas laterales de az�car y habitualmente tienen caracter�sticas estructurales tridimensionales espec�ficas, as� como caracter�sticas de carga espec�ficas.

Tal como se usan en el presente documento, las expresiones “uni�n inmunol�gica” y “propiedades de uni�n inmunol�gica” se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se producen entre una mol�cula de inmunoglobulina y un ant�geno para el que la inmunoglobulina es espec�fica. La fuerza, o afinidad de interacciones de uni�n inmunol�gica puede expresarse en t�rminos de la constante de disociaci�n (Kd) de la interacci�n, en las

65 que una Kd m�s peque�a representa una mayor afinidad. Las propiedades de uni�n inmunol�gica de polip�ptidos seleccionados se cuantifican usando m�todos bien conocidos en la t�cnica. Uno de dichos m�todos conlleva medir las velocidades de formaci�n y disociaci�n del complejo sitio de uni�n al ant�geno/ant�geno, en el que esas velocidades dependen de las concentraciones de los socios del complejo, la afinidad de la interacci�n, y par�metros geom�tricos que influyen por igual la velocidad en ambas direcciones. Por lo tanto, tanto la “constante de asociaci�n” (Kon) como la “constante de disociaci�n” (Koff) pueden determinarse mediante el c�lculo de las

5 concentraciones y las velocidades reales de asociaci�n y disociaci�n. (V�ase Nature 361: 186-87 (1993)). La relaci�n de Koff /Kon permite la cancelaci�n de todos los par�metros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociaci�n Kd. (V�ase, en general, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59: 439-473).

El reactivo de marcado contiene un resto de uni�n al anticuerpo y un resto de detecci�n. El resto de uni�n al anticuerpo y el resto de detecci�n est�n enlazados covalentemente. Como alternativa, el resto de uni�n al anticuerpo y el resto de detecci�n est�n enlazados no covalentemente.

El resto de uni�n al anticuerpo se une selectivamente y con alta afinidad a una regi�n seleccionada del reactivo de detecci�n, por ejemplo, el anticuerpo de uni�n a la diana. La regi�n de uni�n para el resto de uni�n al anticuerpo

15 puede ser un enlazador pept�dico seleccionado (que incluye la regi�n J), cadena ligera o cadena pesada del anticuerpo de uni�n a la diana; preferentemente la prote�na de marcado se une a la regi�n Fc del anticuerpo de uni�n a la diana.

El resto de uni�n al anticuerpo es un anticuerpo o fragmento del mismo, tal como, aunque sin limitarse a, anti-Fc, un isotipo anti-Fc, anti-cadena J, anti-cadena ligera kappa, anti-cadena ligera lambda, o una prote�na variable de fragmento de cadena sencilla. Preferentemente, el resto de uni�n al anticuerpo es monovalente. Como alternativa, el resto de uni�n al anticuerpo es un p�ptido o prote�na no anticuerpo, tal como, por ejemplo aunque sin limitarse a, receptor de Fc soluble, prote�na G, prote�na A, prote�na L, lectinas o un fragmento de las mismas. Opcionalmente, la prote�na o p�ptido no anticuerpo est� acoplada con alb�mina tal como alb�minas de suero humano y bovino y

25 ovoalb�mina.

Normalmente, el resto de uni�n al anticuerpo es un fragmento Fab espec�fico para la parte Fc del anticuerpo de uni�n a la diana o para un isotipo de la parte Fc del anticuerpo de uni�n a la diana. Los fragmentos Fab monovalentes se producen a partir de anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales murinos generados en diversos animales, por ejemplo aunque sin limitarse a, conejo o cabra. Estos fragmentos pueden generarse a partir de cualquier isotipo tal como IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3 murino.

El resto de detecci�n, es decir, la marca, es cualquier sustancia usada para facilitar la identificaci�n y/o la cuantificaci�n de una diana. Los restos de detecci�n son observados o medidos directamente u observados o 35 medidos indirectamente. Los restos de detecci�n incluyen, aunque sin limitarse a, radiomarcas que pueden medirse con dispositivos de recuento de radiaci�n; pigmentos, colorantes u otros crom�genos que pueden observarse visualmente o medirse con un espectrofot�metro; marcas de esp�n que pueden medirse con un analizador de marcas de esp�n; y restos fluorescentes, donde la se�al de salida es generada por la excitaci�n de un aducto molecular adecuado y que puede visualizarse mediante excitaci�n con luz que es absorbida por el colorante o puede medirse con fluor�metros o sistemas de imaginolog�a convencionales, por ejemplo. El resto de detecci�n puede ser una sustancia luminiscente tal como un f�sforo o fluor�geno; una sustancia bioluminiscente; una sustancia quimioluminiscente, donde la se�al de salida es generada mediante modificaci�n qu�mica del compuesto se�al; una sustancia que contiene un metal; o una enzima, donde se produce una generaci�n secundaria de se�al dependiente de enzima, tal como la formaci�n de un producto coloreado a partir de un sustrato incoloro. El resto de detecci�n 45 tambi�n puede asumir la forma de un producto qu�mico o bioqu�mico, o una part�cula inerte, incluyendo aunque sin limitarse a oro coloidal, microesferas, puntos cu�nticos o cristales inorg�nicos tales como nanocristales o f�sforos (v�ase, por ejemplo, el documento Beverloo, et al., Anal. Biochem. 203, 326-34 (1992)). La expresi�n resto de detecci�n tambi�n se refiere a una “etiqueta” o hapteno que puede unirse selectivamente a una mol�cula marcada de modo que la mol�cula marcada, cuando se a�ade posteriormente, se usa para generar una se�al detectable. Por ejemplo, puede usarse biotina, iminobiotina o destiobiotina como etiqueta y a continuaci�n usar un conjugado de avidina o estreptavidina de peroxidasa de r�bano rusticano (HRP) para unirse a la etiqueta, y a continuaci�n usar un sustrato crom�geno (por ejemplo, tetrametilbencidina) o un sustrato fluor�geno tal como Amplex Red o Amplex Gold. (Molecular Probes, Inc.) para detectar la presencia de HRP. An�logamente, la etiqueta puede ser un hapteno o ant�geno (por ejemplo, digoxigenina), y puede usarse un anticuerpo marcado de forma enzim�tica, de forma

55 fluorescente o de forma radiactiva para unirse a la etiqueta. Los expertos en la materia conocen numerosas marcas e incluyen, aunque sin limitarse a, part�culas, colorantes fluorescentes, haptenos, enzimas y sus sustratos crom�genos, fluor�genos y quimioluminiscentes, y otras marcas que se describen en el documento Molecular Probes Handbook Of Fluorescent Probes And Research Chemicals de Richard P. Haugland, 6� Ed., (1996), y sus posteriores actualizaciones de 7� edici�n y 8� edici�n editadas en CD ROM en noviembre de 1999 y mayo de 2001, respectivamente y en otras fuentes publicadas.

Un fluor�foro es cualquier resto qu�mico que muestra un m�ximo de absorci�n m�s all� de 280 nm, y cuando est� unido covalentemente a un reactivo de marcado conserva sus propiedades espectrales. Los fluor�foros incluyen, sin limitaci�n; un pireno (incluyendo cualquiera de los compuestos derivados correspondientes desvelados en la Patente 65 de Estados Unidos N� 5.132.432), un antraceno, un naftaleno, una acridina, un estilbeno, un indol o bencindol, un oxazol o benzoxazol, un tiazol o benzotiazol, un 4-amino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBD), una cianina (incluyendo cualesquiera compuestos correspondientes en los documentos estadounidenses de N� de serie 09/968.401 y 09/969.853 ), una carbocianina (incluyendo cualesquiera compuestos correspondientes en los documentos estadounidenses de N� de serie 09/557.275; 09/969.853 y 09/968.401; Patentes de Estados Unidos N� 4.981.977; 5.268.486; 5.569.587; 5.569.766; 5.486.616; 5.627.027; 5.808.044; 5.877.310; 6.002.003; 6.004.536; 5 6.008.373; 6.043.025; 6.127.134; 6.130.094; 6.133.445; y publicaciones WO 02/26891, WO 97/40104, WO 99/51702, WO 01/21624; EP 1 065 250 A1), un carboestirilo, una porfirina, un salicilato, un antranilato, un azuleno, un perileno, una piridina, una quinolina, un borapoliazaindaceno (incluyendo cualesquiera compuestos correspondientes desvelados en las Patentes de Estados Unidos N� 4.774.339; 5.187.288; 5.248.782; 5.274.113; y 5.433.896), un xanteno (incluyendo cualesquiera compuestos correspondientes desvelados en las Patentes de Estados Unidos N� 6.162.931; 6.130.101; 6.229.055; 6.339.392; 5.451.343 y documentos estadounidenses con N� de serie 09/922.333), una oxazina (incluyendo cualesquiera compuestos correspondientes desvelados en la Patente de Estados Unidos N� 4.714.763) o una benzoxazina, una carbazina (incluyendo cualesquiera compuestos correspondientes desvelados en la Patente de Estados Unidos N� 4.810.636 ), una fenalenona, una coumarina (incluyendo compuestos correspondientes desvelados en las Patentes de Estados Unidos N� 5.696.157; 5.459.276;

15 5.501.980 y 5.830.912), un benzofurano (incluyendo compuestos correspondientes desvelados en las Patentes de Estados Unidos N� 4.603.209 y 4.849.362) y benzofenalenona (incluyendo cualesquiera compuestos correspondientes desvelados en la Patente de Estados Unidos N� 4.812.409) y sus derivados. Tal como se usan en el presente documento, oxazinas incluyen resorrufinas (incluyendo cualesquiera compuestos correspondientes desvelados en la patente No 5.242.805), aminooxazinonas, diaminooxazinas y sus an�logos benzosustituidos.

Cuando el fluor�foro es un xanteno, el fluor�foro es opcionalmente una fluoresce�na, un rodol (incluyendo cualesquiera compuestos correspondientes desvelados en las Patentes de Estados Unidos N� 5.227.487 y 5.442.045), o una rodamina (incluyendo cualesquiera compuestos correspondientes en las Patentes de Estados Unidos N� 5.798.276; 5.846.737; documentos estadounidenses con N� de serie 09/129.015). Tal como se usa en el 25 presente documento, fluoresce�na incluye benzo- o dibenzofluoresce�nas, seminaftofluoresce�nas o naftofluoresce�nas. An�logamente, tal como se usa en el presente documento, rodol incluye seminaftorodafluoros (incluyendo cualesquiera compuestos correspondientes desvelados en la Patente de Estados Unidos N� 4.945.171). Como alternativa, el fluor�foro es un xanteno que est� unido mediante un enlace que es un �nico enlace covalente en la posici�n 9 del xanteno. Los xantenos preferidos incluyen derivados de 3H-xanten-6-ol-3-ona unidos en la posici�n 9, derivados de 6-amino-3H-xanten-3-ona unidos en la posici�n 9, o derivados de 6-amino-3H-xanten-3imina unidos en la posici�n 9. Los fluor�foros preferidos de la invenci�n incluyen xanteno (rodol, rodamina, fluoresce�na y derivados de los mismos) coumarina, cianina, pireno, oxazina y boropoliazaindaceno. Los m�s preferidos son xantenos sulfonados, xantenos fluorados, coumarinas sulfonadas, coumarinas fluoradas y cianinas sulfonadas. La elecci�n del fluor�foro unido al reactivo de marcado determinar� las propiedades de absorci�n y

35 emisi�n de fluorescencia del reactivo de marcado y el complejo inmunomarcado. Las propiedades f�sicas de una marca fluor�fora incluyen caracter�sticas espectrales (absorci�n, emisi�n y desplazamiento de Stokes), intensidad de fluorescencia, ciclo de vida, polarizaci�n y velocidad de fotoblanqueo todas las cuales pueden usarse para distinguir un fluor�foro de otro.

Normalmente el fluor�foro contiene uno o m�s anillos arom�ticos o heteroarom�ticos, que est�n opcionalmente sustituidos una o m�s veces por diversos sustituyentes, incluyendo sin limitaci�n, sistema de anillo hal�geno, nitro, ciano, alquilo, perfluoroalquilo, alcoxi, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilalquilo, acilo, arilo o heteroarilo, benzo u otros sustituyentes normalmente presentes en fluor�foros conocidos en la t�cnica.

45 En un aspecto de la invenci�n, el fluor�foro tiene un m�ximo de absorci�n m�s all� de 480 nm. En una realizaci�n particularmente �til, el fluor�foro absorbe a o cerca de 488 nm a 514 nm (particularmente adecuado para excitaci�n por la salida de la fuente de excitaci�n por l�ser de iones de arg�n) o cerca de 546 nm (particularmente adecuado para excitaci�n por una l�mpara de arco de mercurio).

Preferentemente, el resto de detecci�n es un colorante fluorescente. El colorante fluorescente incluye, por ejemplo, Fluoresce�na, Rodamina, Texas Red, Cy2, Cy3, Cy5, Cy0, Cy0.5, Cyl, Cy1.5, Cy3.5, Cy7, VECTOR Red, ELF™ (por Enzyme-Labeled Fluorescence), FluorX, Calce�na, Calce�na-AM, CRYPTOFLUOR™'S, Orange (42 kDa), Tangerina (35 kDa), Gold (31 kDa), Red (42 kDa), Crimson (40 kDa), BHMP, BHDMAP, Br-Oregon, Lucifer Yellow, familia de colorantes Alexa, N-(6-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-il)amino)capro�lo) (NBD), BODIPY™, dipirrometeno difluoruro

55 de boro, Oregon Green, MITOTRACKER™ Red, DiOC7 (3), DiIC18, ficoeritrina, ficobiliprote�nas BPE (240 kDa) RPE (240 kDa) CPC (264 kDa) APC (104 kDa), Spectrum Blue, Spectrum Aqua, Spectrum Green, Spectrum Gold, Spectrum Orange, Spectrum Red, NADH, NADPH, FAD, Colorantes Infrarrojos (IR), GDP-Ribosa c�clica (cGDPR), Calcofluor White, Tirosina y Tript�fano.

Muchos de los fluor�foros tambi�n puede funcionar como crom�foros y, por lo tanto, los fluor�foros descritos tambi�n son crom�foros preferidos.

Adem�s de los fluor�foros, las enzimas tambi�n son �tiles como restos detectables. Las enzimas son restos detectables deseables debido a que la amplificaci�n de la se�al detectable puede obtenerse dando como resultado 65 mayor sensibilidad del ensayo. La propia enzima no produce una respuesta detectable pero funciona para descomponer un sustrato cuando entra en contacto con ella un sustrato apropiado, de modo que el sustrato

convertido produce una se�al fluorescente, colorim�trica o luminiscente. Las enzimas amplifican la se�al detectable debido a que una enzima en un reactivo de marcado puede dar como resultado m�ltiples sustratos que se convierten en una se�al detectable. Esto es ventajoso cuando hay una baja cantidad de diana presente en la muestra o no existe un fluor�foro que dar� una se�al comparable o m�s fuerte que la enzima. Sin embargo, los

5 fluor�foros son los m�s preferidos dado que no requieren etapas de ensayo adicionales y, por lo tanto, reducen el tiempo global requerido para completar un ensayo. El sustrato enzim�tico se selecciona para dar el producto medible preferido, por ejemplo calorim�trico, fluorescente o quimioluminescencia. Dichos sustratos se usan ampliamente en la t�cnica, muchos de los cuales se describen en el documento MOLECULAR PROBES HANDBOOK, anterior.

Una combinaci�n de sustrato calorim�trico o fluor�geno y enzima preferida usa oxidorreductasas tales como peroxidasa de r�bano rusticano y un sustrato tal como 3,3'-diaminobencidina (DAB) y 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), que producen un color distintivo (marr�n y rojo, respectivamente). Otros sustratos de oxidorreductasa calorim�tricos que producen productos detectables incluyen, aunque sin limitarse a: �cido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiaz-olin-615 sulf�nico) (ABTS), o-fenilendiamina (OPD), 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), o-dianisidina, �cido 5-aminosalic�lico, 4-cloro-1-naftol. Los sustratos fluor�genos incluyen, aunque sin limitarse a, �cido homovan�lico o �cido 4-hidroxi-3metoxifenilac�tico, fenoxazinas reducidas y benzotiazinas reducidas, incluyendo reactivo Amplexe Red y sus variantes (Patente de Estados Unidos N� 4.384.042) y dihidroxantenos reducidos, incluyendo dihidrofluoresce�nas (Patente de Estados Unidos N� 6.162.931) y dihidrorrodaminas incluyendo dihidrorrodamina 123. Los sustratos de peroxidasa que son tiramidas (Patentes de Estados Unidos N� 5.196.306; 5.583.001 y 5.731.158) representan una clase �nica de sustratos de peroxidasa, ya que pueden ser intrinsecamente detectables antes de la acci�n de la enzima pero est�n “fijados en su lugar” por la acci�n de una peroxidasa en el proceso descrito como amplificaci�n de se�ales por tiramida (TSA). Estos sustratos se utilizan ampliamente para marcar dianas en muestras que son c�lulas, tejidos o matrices para su posterior detecci�n mediante microscop�a, citometr�a de flujo, barrido �ptico y

25 fluorometr�a.

Una combinaci�n adicional de sustrato calorim�trico (y en algunos casos fluor�geno) y enzima usa una enzima fosfatasa tal como una fosfatasa �cida, una fosfatasa alcalina o una versi�n recombinante de dicha fosfatasa en combinaci�n con un sustrato calorim�trico tal como fosfato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo (BCIP), fosfato de 6-cloro-3indolilo, fosfato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo, fosfato de p-nitrofenilo o fosfato de o-nitrofenilo o con un sustrato fluor�geno tal como fosfato de 4-metilumbeliferilo, fosfato de 6,8-difluoro-7-hidroxi-4-metilcoumarinilo (DiFMUP, Patente de Estados Unidos N� 5.830.912) bifosfato de fluoresce�na, fosfato de 3-O-metilfluoresce�na, fosfato de resorrufina, fosfato de 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona-7-ilo) (fosfato de DDAO), o ELF 97, ELF 39 o fosfatos relacionados (Patentes de Estados Unidos N� 5.316.906 y 5.443.986).

35 Las glucosidasas, en particular beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa y beta-glucosidasa, son enzimas adecuadas adicionales. Los sustratos colorim�tricos apropiados incluyen, aunque sin limitarse a, 5-bromo4-cloro-3-indolil betaD-galactopiran�sido (X-gal) e indolil galact�sidos similares, gluc�sidos y glucur�nidos, o-nitrofenil beta-Dgalactopiran�sido (ONPG) y p-nitrofenil beta-D-galactopiran�sido. Los sustratos fluor�genos preferidos incluyen resorrufina beta-D-galactopiran�sido, fluoresce�na digalact�sido (FDG), fluoresce�na diglucur�nido y sus variantes estructurales (Patentes de Estados Unidos N� 5.208.148; 5.242.805; 5.362.628; 5.576.424 y 5.773.236), 4metilumbeliferil beta-D-galactopiran�sido, carboxiumbeliferil beta-D-galactopiran�sido y coumarin beta-Dgalactopiran�sidos fluorados (Patente de Estados Unidos N� 5.830.912).

45 Enzimas adicionales incluyen, aunque sin limitarse a, hidrolasas tales como colinesterasas y peptidasas, oxidasas tales como glucosa oxidasa y citocromo oxidasas, y reductasas para las que se conocen sustratos adecuados.

Se prefieren enzimas y sus sustratos apropiados que producen quimioluminiscencia para algunos ensayos. �stas incluyen, aunque sin limitarse a, formas naturales y recombinantes de luciferasas y aequorinas. Sustratos que producen quimioluminiscencia para fosfatasas, glucosidasas y oxidasas tales como aquellos que contienen dioxetanos estables, luminol, isoluminol y �steres de acridinio son adicionalmente �tiles. Por ejemplo, la enzima es luciferasa o aequorina. Los sustratos son luciferina, ATP, Ca++ y coelenterazina.

Adem�s de enzimas, haptenos tales como biotina son restos detectables �tiles. La biotina es �til porque puede

55 funcionar en un sistema enzim�tico para amplificar adicionalmente la se�al detectable, y puede funcionar como una etiqueta para usarla en cromatograf�a de afinidad para fines de aislamiento. Para fines de detecci�n, se usa un conjugado enzim�tico que tiene afinidad por biotina, tal como avidina-HRP. Posteriormente se a�ade un sustrato de peroxidasa para producir una se�al detectable.

Los haptenos tambi�n incluyen hormonas, f�rmacos de origen natural y sint�ticos, contaminantes, al�rgenos, mol�culas afectoras, factores de crecimiento, quimoquinas, citoquinas, linfoquinas, amino�cidos, p�ptidos, intermedios qu�micos o nucle�tidos.

Un resto detectable es una prote�na fluorescente. Las prote�nas fluorescentes ejemplares incluyen la prote�na verde

65 fluorescente (GFP) las ficobiliprote�nas y los derivados de las mismas, luciferasa o aequorina. Las prote�nas fluorescentes, especialmente ficobiliprote�na, son particularmente �tiles para crear colorante marcado en t�ndem y

reactivos de marcado. Estos colorantes en t�ndem comprenden una prote�na fluorescente y un fluor�foro para los fines de obtener un mayor desplazamiento de Stokes en el que los espectros de emisi�n est�n mucho m�s desplazados de la longitud de onda de los espectros de absorci�n de la prote�na fluorescente. Esto es particularmente ventajoso para detectar una baja cantidad de una diana en una muestra en la que la luz fluorescente 5 emitida est� optimizada al m�ximo, en otras palabras, poca o ninguna de la luz emitida es reabsorbida por la prote�na fluorescente. Para que esto funcione, la prote�na fluorescente y el fluor�foro funcionan como un par de transferencia de energ�a en el que la prote�na fluorescente emite a la longitud de onda a la que absorbe el fluor�foro y el fluor�foro emite a continuaci�n a una longitud de onda m�s alejada de las prote�nas fluorescentes de la que podr�a haberse obtenido con solamente la prote�na fluorescente. Una combinaci�n particularmente �til es las ficobiliprote�nas desveladas en las Patentes de Estados Unidos N� 4.520.110; 4.859.582; 5.055.556 y los fluor�foros de sulforrodamina desvelados en la Patente N� 5.798.276, o los fluor�foros de cianina sulfonada desvelados en los documentos estadounidenses de N� de serie 09/968401 y 09/969853; los derivados de xanteno sulfonados desvelados en la Patente N� 6.130.101 y aquellas combinaciones desveladas en la Patente de Estados Unidos

4.542.104. Como alternativa, el fluor�foro funciona como donador de energ�a y la prote�na fluorescente es el aceptor 15 de energ�a.

La preparaci�n de un reactivo de marcado usando colorantes reactivos de bajo peso molecular es conocida por los expertos en la materia y est� bien documentada, por ejemplo, por Richard P. Haugland, Molecular Probes Handbook Of Fluorescent Probes And Research Chemicals, Cap�tulos 1-3 (1996) y por Brinkley, Bioconjugate Chem. 3, 2 (1992). Las prote�nas de marcado normalmente son el resultado de mezclar colorantes reactivos apropiados y la prote�na a conjugar en un disolvente adecuados en el que ambos son solubles. La mayor�a de los colorantes preferidos de la invenci�n son f�cilmente solubles en soluciones acuosas, facilitando reacciones de conjugaci�n con la mayor�a de los materiales biol�gicos. Para aquellos colorantes reactivos que est�n fotoactivados, la conjugaci�n requiere iluminaci�n de la mezcla de reacci�n para activar el colorante reactivo.

25 Los m�todos de visualizaci�n del resto de detecci�n dependen de la marca.

En cualquier momento despu�s de la adici�n del complejo inmunomarcado a la muestra, la muestra se ilumina con una longitud de onda de luz seleccionada para dar una respuesta �ptica detectable, y se observa con un medio para detectar la respuesta �ptica. El equipo que es �til para iluminar los compuestos fluorescentes de la presente invenci�n incluye, aunque sin limitarse a, l�mparas ultravioleta de mano, l�mparas de arco de mercurio, l�mparas de xen�n, l�seres y diodos l�ser. Estas fuentes de iluminaci�n est�n �pticamente integradas en esc�neres l�ser, lectores o patrones de microplacas fluorescentes o microfluor�metros. El grado y/o la ubicaci�n de la se�al, en comparaci�n con un respuesta patr�n o esperada, indica si y en qu� grado posee la muestra una caracter�stica

35 dada, es decir la diana deseada.

La respuesta �ptica es detectada opcionalmente mediante inspecci�n visual, o mediante el uso de cualquiera de los siguientes dispositivos: c�mara CCD, videoc�mara, pel�cula fotogr�fica, dispositivos de barrido con l�ser, fluor�metros, fotodiodos, contadores cu�nticos, microscopios de epifluorescencia, microscopios de barrido, cit�metros de flujo, lectores de microplacas de fluorescencia o mediante medios para amplificar la se�al tales como tubos fotomultiplicadores. Donde la muestra es examinada usando un cit�metro de flujo, el examen de la muestra opcionalmente incluye clasificar partes de la misma de acuerdo con su respuesta de fluorescencia.

Cuando se usa una marca detectable de forma indirecta, entonces la etapa de iluminaci�n normalmente incluye la

45 adici�n de un reactivo que facilita una se�al detectable tal como un sustrato enzim�tico colorim�trico. Los radiois�topos tambi�n se consideran indirectamente detectables en los que no se requiere un reactivo adicional sino que en su lugar el radiois�topo debe ser expuesto a una pel�cula de rayos X o alg�n otro mecanismo para registrar y medir la se�al del radiois�topo. Esto tambi�n puede ser cierto para algunas se�ales quimioluminiscentes que se observan mejor despu�s de la exposici�n a la pel�cula.

Aplicaci�n

Una realizaci�n de la invenci�n se refiere a un m�todo inmunohistoqu�mico de detecci�n de al menos tres ep�topos diana en una muestra biol�gica. El ep�topo puede ser cualquier ep�topo en un ant�geno. El ant�geno puede ser

55 cualquier ant�geno tisular incluyendo, por ejemplo, un ant�geno nuclear, un ant�geno citoplasm�tico o un ant�geno unido a la membrana. El m�todo comprende las siguientes etapas

(a) realizar recuperaci�n de ant�genos en la muestra biol�gica, en el que dicha recuperaci�n de ant�genos comprende las etapas:

i. desparafinar y rehidratar la muestra biol�gica; y

ii. llevar a ebullici�n en tamp�n de recuperaci�n de ant�genos;

65 (b) realizar eliminaci�n de autofluorescencia en la muestra biol�gica antes de la etapa (a), la etapa (c) o la etapa (d), en el que dicha eliminaci�n de autofluorescencia comprende incubar dicha muestra biol�gica en una soluci�n que comprende �cido clorh�drico al 1 % y etanol al 70 %;

(c) poner en contacto a la muestra biol�gica con un primer anticuerpo espec�fico para una diana, un primer reactivo de marcado en el que dicho primer reactivo de marcado comprende un resto de uni�n al anticuerpo para dicho primer anticuerpo y un primer resto de detecci�n, un segundo anticuerpo espec�fico para una

5 segunda diana, un segundo reactivo de marcado que comprende un resto de uni�n al anticuerpo para dicho segundo anticuerpo y un segundo resto de detecci�n, un tercer anticuerpo espec�fico para una tercera diana, y un tercer reactivo de marcado que comprende un resto de uni�n al anticuerpo para dicho tercer anticuerpo y un tercer resto de detecci�n; y

(d) detectar cada uno de dichos primer, segundo y tercer reactivos de marcado, respectivamente, en dicha muestra biol�gica con lo que la presencia de dichos primer, segundo y tercer reactivos de marcado, respectivamente, indica la presencia de la diana en dicha muestra biol�gica y la ausencia de dicho reactivo de marcado indica la ausencia de dicha diana en dicha muestra biol�gica, indica la presencia de dichas primera, segunda o tercera dianas, respectivamente, en dicha muestra biol�gica y la ausencia de dichos primer, segundo

o tercer reactivos de marcado indica la ausencia de dichas primera, segunda o tercera dianas, respectivamente, 15 en dicha muestra biol�gica.

La puesta en contacto (etapa (c)) puede implicar, por ejemplo, incubar la muestra en PBS y a�adir un primer anticuerpo, suspendido en PBS, a la muestra. Dado que el primer anticuerpo es espec�fico para el primer ep�topo diana, �ste se unir� solamente en la ubicaci�n en la que el ep�topo est� presente. La muestra biol�gica es una secci�n de tejido humano incluida en un agente solidificante que es parafina. Despu�s de un periodo de incubaci�n apropiado que puede incluir una incubaci�n con agitaci�n (por ejemplo, sacudiendo o volteando), los primer, segundo y tercer anticuerpos no unidos pueden eliminarse de la secci�n de tejido lavando la secci�n con PBS u otro tamp�n apropiado (una primera etapa de lavado). El lavado puede realizarse, por ejemplo, incubando (sacudiendo o volteando) la secci�n de tejido en recipientes con PBS.

25 Despu�s de la eliminaci�n de primeros anticuerpos no unidos, la muestra biol�gica unida al primer anticuerpo se pone en contacto con un fragmento Fab (prote�na de marcado) de segundos anticuerpos dirigidos contra sus regiones Fc del primer anticuerpo. El fragmento Fab est� marcado con una marca detectable. En una realizaci�n preferida, el fragmento Fab es un reactivo Zenon™ (Invitrogen, Carlsbad, Ca). Por ejemplo, si el primer anticuerpo es una IgG de rat�n, el segundo anticuerpo puede ser un anticuerpo IgG de cabra anti-rat�n. El fragmento Fab se unir� al primer anticuerpo para producir un primer anticuerpo unido a Fab.

La marca en el fragmento Fab puede ser detectada directamente sin una etapa de lavado. La distribuci�n de la marca corresponder� a la distribuci�n del ep�topo. Si la marca detectable es un resto fluorescente, la marca puede

35 detectarse usando un microscopio de fluorescencia. El uso de un microscopio de fluorescencia para la detecci�n de una secci�n de tejido marcada es bien conocido.

Opcionalmente, la secci�n de tejido puede lavarse para eliminar fragmentos Fab no unidos antes de que se detecte la marca. La etapa de lavado puede comprender las mismas etapas que la primera etapa de lavado descrita anteriormente.

El ep�topo diana puede ser cualquier ep�topo en una c�lula, incluyendo, por ejemplo un ep�topo en un ant�geno. El ant�geno puede ser una oncoprote�na (por ejemplo bcl-2, c-erbB-2) o una prote�na que es indicativa de heterogeneidad de c�lulas tumorales (p53). Los ant�genos �tiles incluyen, por ejemplo, ep�topos para el receptor de

45 andr�genos (AR), Citoqueratina 18 o PTEN.

En una realizaci�n preferida, el primer anticuerpo penetra en la secci�n de tejido y est� unido a un ep�topo en el interior de la secci�n. La adici�n del fragmento Fab permite la formaci�n de un complejo primer anticuerpo-Fab dentro de la secci�n de tejido.

Aplicaci�n Multiplex

Los m�todos de la invenci�n se usan para detectar una pluralidad de (al menos tres) dianas (ep�topos) en una muestra biol�gica usando las siguientes etapas:

55 Etapa A Un primer anticuerpo espec�fico para una primera diana se satura con prote�na de marcado para crear un complejo formado previamente. Etapa B El exceso de prote�na de marcado se elimina despu�s de la formaci�n del complejo formado previamente (por ejemplo, mediante filtraci�n en gel). Etapa C El complejo formado previamente se pone en contacto con una muestra biol�gica. Etapa D Un segundo anticuerpo espec�fico para una segunda diana se pone en contacto con la misma muestra biol�gica. El segundo anticuerpo no est� marcado y no est� complejado con una prote�na de marcado. La etapa D puede realizarse antes, despu�s o simult�neamente con la etapa C. Etapa E El exceso de anticuerpo y el exceso de complejo formado previamente pueden eliminarse en una etapa

65 de lavado opcional. Etapa F Una segunda prote�na de marcado que es al menos espec�fica para el segundo anticuerpo, se aplica a la muestra biol�gica.

En el m�todo anterior, la segunda prote�na de marcado que se a�ade en la etapa F solamente se unir� al segundo anticuerpo, dado que todos los potenciales sitios de uni�n en el primer anticuerpo ya estar�n saturados con el 5 fragmento Fab marcado de forma fluorescente (v�ase la figura 5).

Dado que el primer anticuerpo se aplica como un complejo formado previamente, se prefiere que el primer anticuerpo sea espec�fico para un ant�geno nuclear donde se ha descubierto que la penetraci�n en el tejido es menos cr�tica para la detecci�n.

10 Esta detecci�n “multiplexada” (descrita en el ejemplo 1) est� multiplexada adicionalmente para detectar al menos tres dianas mediante dos m�todos alternativos. En el m�todo alternativo 1, la etapa A puede implicar la producci�n de un “complejo primer anticuerpo/primera prote�na de marcado” y un “complejo tercer anticuerpo/tercer marcado” preparados en recipientes de reacci�n diferentes. Tanto el primer complejo como el tercer complejo pueden

15 aplicarse en la etapa C. El resultado ser�a una muestra biol�gica marcada con tres complejos diferentes de anticuerpo/prote�nas de marcado (es decir, 1� anticuerpo/1� prote�na de marcado; 2� anticuerpo/2� prote�na de marcado; 3� anticuerpo/3� prote�na de marcado). Si la primera, segunda y tercera prote�na de marcado comprende marcas detectables diferentes, entonces pueden detectarse un total de tres marcas diferentes en la muestra biol�gica.

20 En el m�todo alternativo 2, un segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo pueden a�adirse en la etapa D, en el que el segundo anticuerpo y el tercer anticuerpo son espec�ficos para diferentes dianas. En la etapa F, puede a�adirse una segunda y una tercera prote�na de marcado. La segunda prote�na de marcado es espec�fica para el segundo anticuerpo mientras que la tercera prote�na de marcado es espec�fica para el tercer anticuerpo. Por ejemplo, el

25 segundo anticuerpo y el tercer anticuerpo pueden ser de diferentes subclases de IgG y la segunda y tercera prote�nas de marcado pueden ser espec�ficas para una subclase de IgG. Usando este m�todo, pueden detectarse un total de tres marcas diferentes en la muestra biol�gica.

Aunque el m�todo alternativo 1 y el m�todo alternativo 2 descritos anteriormente describen el uso de dos complejos

30 formados previamente (etapa B) o dos anticuerpos (etapa D), se entiende que el m�todo de la invenci�n no est� limitado a dos complejos formados previamente o dos anticuerpos. Puede usarse cualquier n�mero de complejos formados previamente o anticuerpos en el m�todo de la invenci�n. Adem�s, el m�todo alternativo 1 y el m�todo alternativo 2 pueden combinarse. Por ejemplo, si el m�todo alternativo 1 y el m�todo alternativo 2 tal como se han descrito anteriormente se combinaron, puede detectarse un total de cuatro dianas diferentes en una muestra

35 biol�gica. Adicionalmente si el m�todo alternativo 1 y el m�todo alternativo 2 se combinan, el m�todo alternativo 2 puede repetirse para detectar un total de siete o m�s dianas diferentes en una muestra biol�gica.

Para todos los m�todos de la invenci�n, los complejos de inmunomarcado no unidos que no se unen a la diana pueden eliminarse opcionalmente de la muestra mediante m�todos convencionales, tales como lavado. En una

40 etapa opcional para todos los m�todos de la invenci�n, los complejos de inmunomarcado unidos que se unen a la diana pueden estar fijados en su lugar con los fijadores (por ejemplo formaldeh�do, glutaraldeh�do) y m�todos de fijaci�n habituales. La fijaci�n puede utilizarse para mejorar la durabilidad de la muestra y para impedir la transferencia de la prote�na de marcado complejada de forma no covalente a otros anticuerpos de direcci�n en la muestra que tienen la misma regi�n de uni�n espec�fica.

45 Otra realizaci�n de la invenci�n se refiere a un m�todo para determinar una diferencia en la cantidad de al menos tres dianas en una secci�n de tejido de un tejido a ensayar con respecto a la cantidad y distribuci�n de dichas dianas en una secci�n de tejido de un tejido normal. Dicha comparaci�n puede usarse para determinar si una muestra muestra una distribuci�n anormal de ep�topos o ant�genos. En primer lugar, el m�todo implica la etapa de detectar

50 una distribuci�n de al menos tres dianas en una primera muestra usando el m�todo de la reivindicaci�n 1. En segundo lugar, una distribuci�n de dianas correspondientes en una muestra normal se detecta usando el m�todo de la reivindicaci�n 1. En tercer lugar, se compara la distribuci�n de ep�topos o ant�genos de la primera muestra y la muestra normal para determinar si existe una diferencia de distribuci�n entre las dos muestras.

55 Tambi�n se desvela un m�todo para an�lisis in situ de una muestra biol�gica. En primer lugar, un primer anticuerpo que es espec�fico para un primer ep�topo se pone en contacto con un primer Fab que es espec�fico para la parte Fc del primer anticuerpo para producir un complejo primer anticuerpo-Fab. El exceso de Fab, no unido al primer anticuerpo puede eliminarse en una etapa opcional. La muestra biol�gica se pone en contacto a continuaci�n con este complejo primer anticuerpo-Fab y un segundo anticuerpo que es espec�fico para un segundo ep�topo para

60 generar una muestra biol�gica de anticuerpo. En una etapa opcional, el complejo primer anticuerpo-Fab no unido y el segundo anticuerpo no unido pueden eliminarse mediante lavado. Un segundo Fab, que comprende una segunda marca detectable distinguible de la primera marca detectable se pone en contacto a continuaci�n con la muestra biol�gica. El segundo Fab es espec�fico para la parte Fc del segundo anticuerpo y forma un complejo anticuerpo-Fab con el segundo anticuerpo.

65 En una etapa opcional, el exceso de segundo Fab puede eliminarse mediante lavado. En la etapa final, la primera y segunda marcas detectables se detectan para determinar la ubicaci�n y distribuci�n de los ep�topos. Se entiende que cada marca detectable es detectable individualmente en presencia de todas las dem�s marcas detectables en la muestra biol�gica.

5 Aunque no de acuerdo con la presente invenci�n de acuerdo con las reivindicaciones, podr�a proporcionarse una plataforma para evaluaci�n cuantitativa multiplexada de ant�genos, que combina detecci�n de inmunofluorescencia (IF) con an�lisis de im�genes asistido por ordenador. El equipo inform�tico (hardware y/o software) podr�a medir la presencia, intensidad y/o distribuci�n de marca o marcas fluorescentes en im�genes del tejido que resultan de

10 detecci�n de IF, donde cada marca en una imagen que indica la presencia de un ant�geno diana. Este equipo inform�tico podr�a incluir, por ejemplo, el paquete Definiens Cellenger Developer Studio (v. 4.0) disponible en el mercado adaptado para segmentar y clasificar las im�genes del tejido en objetos (por ejemplo, estroma, luz, n�cleos, citoplasma, etc.) y/o para detectar las marcas fluorescentes (figuras 11A, 12A, 20 y 21). El producto Definiens Cellenger puede estar adem�s dise�ado y adaptado para ejecutar secuencias de comandos que miden la

15 presencia, intensidad y/o distribuci�n de las marcas fluorescentes localizadas dentro de compartimentos celulares del tejido espec�ficos (por ejemplo, tales como, las marcas fluorescentes dentro de n�cleos o c�lulas epiteliales). Estas mediciones (en solitario o en combinaci�n con otras observaciones tales como observaciones cl�nicas, moleculares y/o morfom�tricas) pueden estar sujetas a enfoques matem�ticos supervisados, incluyendo m�todos de aprendizaje autom�ticos tales como regresi�n de vector de soporte para datos censurados (SVRc), para generar

20 modelos para (por ejemplo) diagn�stico y pron�stico de una enfermedad. Los m�todos y sistemas para generar modelos y para extraer mediciones a partir de im�genes tisulares se describen en la Publicaci�n estadounidense de propiedad com�n N� 20050262031.

Aunque no de acuerdo con la presente invenci�n de acuerdo con las reivindicaciones, muestras de tejido

25 procesadas con los m�todos de detecci�n de IF descritos en el presente documento podr�an colocarse en un microscopio de fluorescencia automatizado Nikon 9Oi. Se adquieren im�genes fluorescentes usando una c�mara multiespectral CRI Nuance (Cambridge Research & Instrumentation, Inc.) montada en el microscopio y controlada por el software en l�nea MetaMorph. Tambi�n podr�a usarse otro equipo adecuado para adquisici�n de im�genes. La siguiente descripci�n ilustra el uso de adquisici�n y an�lisis de im�genes de IF para detectar la presencia del

30 Receptor de Andr�genos (AR) en el tejido. Un foco del estudio era identificar factores vinculados al crecimiento y el avance del c�ncer de pr�stata.

DAPI (4'-6-Diamidino-2-fenilindol), acoplado con los anticuerpos para Citoqueratina18 (CK) (DAPI para n�cleos y CK18 para c�lulas epiteliales), y el receptor de andr�genos se aplicaron a tejido en portaobjetos de micromatriz

35 tisular (TMA). Se adquirieron im�genes fluorescentes que representaban a cada uno de los n�cleos de TMA usando el equipo descrito anteriormente. M�s particularmente, se capturaron im�genes de DAPI de 12 bits con la c�mara ajustada a 480 nm usando un ajuste de saturaci�n al 50 %. CK 18, marcada con Alexa 488, se adquiri� usando un filtro pasabanda FITC (Chroma). Se capturaron im�genes de 12 bits en incrementos de 10 nm partiendo de 520 nm. AR, marcado con Alexa 568 se captur� usando un filtro de paso de onda larga (Chroma). Se capturaron im�genes

40 de 12 bits en incrementos de 10 nm partiendo a 570 nm. Las pilas de im�genes se desmezclaron usando el software de an�lisis CRI. Se usaron colorantes Alexa 488 y 568 puros como espectros de referencia para el proceso de desmezclado. Regiones t�picas de autofluorescencia y otros objetos fluorescentes (por ejemplo eritrocitos) se asignaron a los perfiles espectrales. Una vez completado el proceso de desmezclado, se almacenaron im�genes cuantitativas en escala de grises en formato tiff para el an�lisis. Despu�s del desmezclado, las im�genes en escala

45 de grises se combinan para producir una imagen compuesta para an�lisis mediante las secuencias de comandos del Definiens Cellenger. Cuando se combinan las im�genes, se usan ID del fragmento y el donador �nicos que asocian las im�genes con un paciente.

Las secuencias de comandos del Definiens Cellenger segmentan y clasifican las im�genes para detectar y

50 cuantificar la se�al de AR presente dentro de n�cleos de c�lulas epiteliales. Tambi�n se tomaron mediciones bas�ndose en intensidades del biomarcador y �reas nucleares definidas por segmentaci�n con DAPI, donde las mediciones reflejaban la intensidad global y la distribuci�n de AR presente en tipos celulares espec�ficos. La tabla a continuaci�n incluye una lista de las mediciones derivadas de las im�genes se proporciona en la tabla a continuaci�n.

Caracter�sticas cuantitativas inmunofluorescentes del receptor de andr�genos

Caracter�sticas Definici�n

averageip0001 Intensidad promedio del marcador AR en n�cleos epiteliales averageip0002 Intensidad promedio de AR en n�cleos epiteliales y del estroma averageipstroma0003 Intensidad promedio del marcador AR en n�cleos del estroma maxip0007 Intensidad m�xima de AR en n�cleos epiteliales maxip0008 Intensidad m�xima de AR en n�cleos epiteliales y de estroma objetos maxipstroma0009 Intensidad m�xima de AR en n�cleos del estroma minip0010 Intensidad m�nima de AR en n�cleos epiteliales

Caracter�sticas Definici�n

minip0011 Intensidad m�nima de AR en n�cleos del estroma y epiteliales minipstroma0012 AR m�nimo en n�cleo del estroma �rea de n�cleos epiteliales con AR positivo/ �rea de n�cleos epiteliales con

ratioareaepithnucversusepith0013

AR negativo correlaobject10005 Coeficiente de correlaci�n lineal entre DAPI e im�genes de AR

A partir de la lista de mediciones derivadas para AR, se determin� mediante estrategias matem�ticas supervisadas que la caracter�stica “ratioareaepithnucversusepith0013” estaba asociada de forma independiente con la recurrencia de PSA cuando se analizaba de forma univariada. Esta caracter�stica representa la relaci�n de las �reas de n�cleos

5 epiteliales expresados positiva y negativamente con AR. Por lo tanto, estos datos sugieren (por ejemplo) que la cantidad total de AR presente en elementos tanto tumorales como no tumorales es un factor importante en el crecimiento y el avance del c�ncer de pr�stata.

REFERENCIAS BIBLIOGR�FICAS 10

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5 REFERENCIAS DE PATENTES

EP 1065 250

US 4520110 US 4859582 US 5055556 US 5208148 US 5242805 US 5362628 15 US 5576424 US 5773236 US 5830912 US 5316906 US 5443986 US 5132432 US 4981977 US 5268486 US 5569587 US 5569587 25 US 5569766 US 5486616 US 5627027 US 5808044 US 5877310 US 6002003 US 6004536 US 6008373 US 6043025 US 6127134 35 US 6130094 US 6133445 US 4774339 US 5187288 US 5248782 US 5274113 US 5433896 US 6162931 US 6130101 US 6229055 45 US 6339392 US 5451343 US 4714763 US 4810636

US 5696157 US 5459276 US 5501980 US 5830912 US 4603209 55 US 4849362 US 4812409 US 5242805 US 5227487 US 5442045 US 5798276 US 5846737 US 4945171

US 09/968401

65 US 09/968401 US 09/557275

US 09/557275 US 09/969853 US 09/968401 US 09/922333 5 US 09/129015 US 09/968401 US 09/ 969853

US 2005/262031

10 WO 03/030817 WO 02/26891 WO 02/26891 WO 97/40104

15 WO99/51702 WO 01/21624

Ejemplos

20 EJEMPLO 1: M�TODOS GENERALES DE PREPARACI�N DE MUESTRAS

Los siguientes m�todos se usan generalmente durante los m�todos de detecci�n Multiplex de acuerdo con la invenci�n

25 Recuperaci�n de ant�genos:

1.: Desparafinar y rehidratar las muestras de tejido seg�n el Leica 5020 SOP convencional.

2.: Precalentar 250 ml de soluci�n de recuperaci�n de ant�genos Reveal 1X a ebullici�n en un ba�o de agua en microondas (calentar la soluci�n durante siete (7) minutos al nivel de potencia siete (7)).

30 3. Colocar portaobjetos en el recipiente de la soluci�n Reveal 1X en ebullici�n. Permitir la ebullici�n durante 8,0 minutos tal como se ha descrito anteriormente.

4.: Una vez completado, retirar el recipiente del ba�o de agua de microondas y dejar enfriar durante 20 minutos.

5.: Aclarar los portaobjetos en PBS brevemente seguido por 1 x 5 minutos a temperatura ambiente.

6. Colocar los portaobjetos en el aparato Nemesis 7200 y comenzar el programa de autotinci�n. 35

Permeabilizaci�n del tejido:

Incubar portaobjetos en PBT (PBS con Triton-X al 0,2 %) durante 30 minutos. El PBT se prepara de la siguiente manera: 40

Reactivo: Proveedor N� de cat�logo Diluci�n / [Conc.] Cantidad Volumen final

Tamp�n Difco FA: Fisher 223142 1X 1,0 g

Triton-X 100: Fisher BP151-500 0,2 % 2,0 ml

Tween 20 al 20 %: BioCar e TWN20H 1,0 % 50,0 ml

ddH2O: --- --- --- 948,0 ml 1000 ml

Eliminaci�n de la autofluorescencia:

Incubar portaobjetos en �cido-alcohol (HCL al 1 % en EtOH al 70 %) durante 20 minutos. El �cido-alcohol se prepara 45 de la siguiente manera:

EtOH de grado 200: Sigma E7023-4L grado 140 7,28 ml

HCl: Fisher A144S-500 1,0 % 0,1 ml

Tween 20 al 20 %: BioCar e TWN20H 1,0 % 0,52 ml

ddH2O: --- --- --- 2,5 ml 10,4 ml

Etapas de tratamiento previas al anticuerpo

50 Para ayudar a penetrar en las estructuras celulares del tejido, las muestras se incubaron en PBS que conten�a Triton-X 100 al 0,2 % (PBT) a temperatura ambiente durante treinta minutos, seguido por tres aclarados de tres minutos cada uno en PBS. Para ayudar a reducir la autofluorescencia en el tejido, las muestras se incubaron en HCl al 1 % en etanol al 70 % a temperatura ambiente durante veinte minutos, seguidos por tres aclarados de tres minutos cada uno en PBS. El bloqueo de sitios de uni�n no espec�ficos se realiz� incubando los portaobjetos en reactivo de bloqueo al 1 % (10,0 mg/ml de BSA en PBS) a temperatura ambiente durante veinte minutos. No se realizaron lavados entre la etapa de bloqueo y la posterior etapa de hibridaci�n.

Hibridaci�n de anticuerpos espec�ficos de diana con muestras biol�gicas

Los anticuerpos espec�ficos para una diana se hibridan, por ejemplo, de la siguiente manera:

10 Un c�ctel de anticuerpo anti-citoqueratina 18 (CK18) (Calbiochem) diluido a 1:7000 y anticuerpo receptor de andr�genos (AR) (clon AR441, LabVision) diluido a diluci�n 1:5 se prepar� en reactivo de bloqueo al 1 %. Aproximadamente 100 μl de este c�ctel del anticuerpos se aplic� a la muestra de tejido, y se permiti� hibridar a los anticuerpos y las muestras de tejido en una c�mara h�meda a temperatura ambiente durante una hora. A la hibridaci�n le siguieron dos aclarados de seis minutos cada uno en PBT, un aclarado de seis minutos en PBS y un

15 aclarado de tres minutos en PBS.

Marcado de anticuerpos espec�ficos de diana hibridados

Anticuerpos espec�ficos de diana hibridados se marcan de forma fluorescente, por ejemplo, de la siguiente manera:

20 Un c�ctel de fragmento Fab de IgG anti-conejo Zenon Alexa Fluor 488 y fragmento Fab de igG1 anti-rat�n Zenon Alexa Fluor 568 (Invitrogen, Carlsbad, CA) se prepar� en reactivo de boqueo al 1 % a dos veces las concentraciones recomendadas por el fabricante (diluci�n 1:50 para cada fragmento Fab). Aproximadamente 100 μl de este c�ctel de marcado se aplicaron a las muestras de tejido, que se incubaron a continuaci�n en una c�mara h�meda a

25 temperatura ambiente durante 30 minutos. A la reacci�n de marcado le segu�an dos aclarados de seis minutos cada uno en PBT, un aclarado de seis minutos en PBS y un aclarado de tres minutos en PBS.

Detecci�n Multiplex

30 M�ltiples dianas en una �nica muestra se detectan usando, por ejemplo, el siguiente protocolo. Para identificar 5 dianas en una �nica secci�n de pr�stata usando el siguiente protocolo: Se prepar� un c�ctel de anti-racemasa (AMACR; clon 13H4, Zeta Corporation) a una diluci�n 1:50 con anticuerpo sin diluir contra citoqueratina de alto peso molecular + p63 (HMW CK + p63; BioCare Medical). Aproximadamente 100 μl de este c�ctel de anticuerpos se aplicaron a la muestra de tejido, y se dej� que los anticuerpos se unieran en una c�mara h�meda a temperatura

35 ambiente durante una hora. A la incubaci�n le segu�an dos aclarados de seis minutos cada uno en PBT, un aclarado de seis minutos en PBS y un aclarado de tres minutos en PBS.

Para la etapa de marcado, un c�ctel de fragmento Fab de IgG anti-conejo Zenon Alexa Fluor 488, fragmento Fab de IgG1 anti-rat�n Zenon Alexa Fluor 555, y fragmento Fab de IgG2a anti-rat�n Zenon Alexa Fluor 594 se prepar� en

40 reactivo de boqueo al 1 % a dos veces las concentraciones recomendadas por el fabricante (diluci�n 1:50 para cada fragmento Fab). Aproximadamente 100 μl de este c�ctel de marcado se aplicaron a las muestras de tejido, y las muestras de tejido se incubaron en una c�mara h�meda a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la reacci�n de marcado le segu�an dos aclarados de seis minutos cada uno en PBT, un aclarado de seis minutos en PBS y un aclarado de tres minutos en PBS.

45 Las muestras de tejido se trataron a continuaci�n con una segunda ronda de uni�n a anticuerpo y marcado. Un c�ctel de anti-CK-18 a una diluci�n 1:6000 y anti-AR a una diluci�n 1:5 se prepar� en reactivo de boqueo al 1 %. Aproximadamente 100 μl de este c�ctel de anticuerpos se aplicaron a la muestra de tejido, y se dej� que los anticuerpos se unieran en una c�mara h�meda a temperatura ambiente durante una hora. A la hibridaci�n le

50 siguieron dos aclarados de seis minutos cada uno en PBT, un aclarado de seis minutos en PBS y un aclarado de tres minutos en PBS.

Para la segunda etapa de marcado, un c�ctel de fragmento Fab de IgG anti-conejo Zenon Alexa Fluor 647 y fragmento Fab de IgG1 anti-rat�n Zenon Alexa Fluor 568 se prepar� en reactivo de boqueo al 1 % a la concentraci�n

55 recomendada por el fabricante (diluci�n 1:100 para cada fragmento Fab). Aproximadamente 100 μl de este c�ctel de marcado se aplicaron a las muestras de tejido, y las muestras de tejido se incubaron y se aclararon tal como se ha descrito para la primera etapa de marcado.

EJEMPLO 2: DETECCI�N MULTIPLEX DEL RECEPTOR DE ANDR�GENOS, CITOQUERATINA Y AMACR

60 Se ha descubierto que el receptor de andr�genos (AR), Citoqueratina 18 y AMACR son importantes biomarcadores para la evaluaci�n del tejido con c�ncer de pr�stata. La distribuci�n cualitativa y cuantitativa de estos marcadores en secciones de tejido incluidas en parafina, fijadas con formalina o micromatrices tisulares se detectaron tal como se describe a continuaci�n. En este estudio se usaron muestras de hasta 16 a�os de antig�edad.

1.) Recuperaci�n de ant�genos (en soluci�n Reveal, tamp�n citrato o proteinasa K) Para la recuperaci�n de ant�genos, secciones de tejido o TMA se calentaron en soluci�n Reveal 1X (BioCare Medical) en una c�mara de recuperaci�n “decloaking chamber” de acuerdo con un protocolo convencional y a continuaci�n se les deja enfriar durante 15 minutos. M�todos alternativos de recuperaci�n de ant�genos incluyen: 1)

5 calentar secciones de tejido o TMA en tamp�n citrato 10 mM, pH 6,0, durante 15 minutos en un microondas calibrado seguido por refrigeraci�n durante 15 minutos o 2) digerir enzim�ticamente secciones de tejido o TMA en una soluci�n de proteinasa K (disponible en el mercado de Fisher como reactivo listo para usar para recuperaci�n de ant�genos durante 12 - 15 minutos. Despu�s de aclarar en agua destilada durante 15 minutos (esta etapa se salta para recuperaci�n de ant�genos con proteinasa K), los portaobjetos se lavaron 3 veces durante 5 minutos en soluci�n salina tamponada por fosfato (PBS).

2.) Eliminaci�n de autofluorescencia

La autofluorescencia se redujo incubando los portaobjetos en HCl al 1 %/ EtOH al 70 % durante 10 minutos a 15 temperatura ambiente. Los portaobjetos se aclararon a continuaci�n 3 veces durante 5 minutos en PBS.

3.) Permeabilizaci�n del tejido

El tejido se permeabiliz� posteriormente en PBS que conten�a Triton X al 0,2 % (PBT) durante 30 minutos a temperatura ambiente.

4.) Bloqueo con IgG inespec�fica

La uni�n no espec�fica de anticuerpo o fragmento Fab se bloque� mediante incubaci�n con 0,5 μg/ul de BSA en PBT 25 durante 20 minutos en una c�mara h�meda. Los portaobjetos se aclararon posteriormente en PBT durante 5 minutos.

5.) Preparaci�n del complejo formado previamente para Citoqueratina 18 y Fab

Se incub� Citoqueratina 18 monoclonal de rat�n con fragmento Fab espec�fico de rat�n marcado con Alexa 488 para preparar un complejo formado previamente durante 10 minutos a temperatura ambiente. Despu�s, ese Fab no unido se neutraliz� a�adiendo una IgG de rat�n no espec�fica IgG en exceso.

6.) Incubaci�n de anticuerpos primarios no tratados y el complejo formado previamente en tejido

35 El complejo de Citoqueratina 18-Fab formado previamente y CD34 policlonal de conejo no tratado y anticuerpo pTEN monoclonal de rat�n se incubaron en el tejido durante 1 hora a temperatura ambiente en una c�mara h�meda.

7.) Eliminaci�n de anticuerpo no unido

El exceso de anticuerpo se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 10 minutos en PBT seguido por 3 veces durante 5 minutos en PBS.

8.) Incubaci�n con Fab marcado de forma fluorescente

45 Un fragmento Fab espec�fico de rat�n y de conejo marcados con Alexa 555 y Alexa 594 respectivamente se a�adieron al portaobjetos y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en una c�mara h�meda.

9.) Eliminaci�n de Fab no unido

El fragmento Fab no unido se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 10 minutos en PBT seguido por 3 veces durante 5 minutos en PBS.

10.) Fijaci�n

55 El tejido se fij� en formalina al 10 % durante 10 minutos. Los portaobjetos se aclararon 2 veces durante 5 minutos en PBS.

11.) Montaje

Despu�s de a�adir 100 μl de soluci�n AntiFade que conten�a contratinci�n nuclear, los portaobjetos se cubrieron con cubreobjetos y se prepararon para la captura de im�genes.

12.) Adquisici�n de im�genes 65 Las muestras se colocaron en un microscopio de fluorescencia automatizado 90i. Las regiones de inter�s se

identificaron moviendo los ejes y-x de la platina del microscopio. El tiempo de exposici�n de la imagen se ajust� al nivel de brillo m�s alto posible sin causar sobreexposici�n. Las im�genes se adquirieron con la c�mara Nikon 1200DXM CCD o un sistema comparable (como alternativa podr�a usarse una c�mara de imaginolog�a espectral para separaci�n espectral avanzada de colorantes fluorescentes). Las im�genes se guardaron en formato tiff y se

5 sometieron a an�lisis cuantitativo de la imagen.

EJEMPLO 3: DETECCI�N MULTIPLEX DE EGFR, FOSFO-EGFR Y CITOQUERATINA 18

El receptor del factor de crecimiento epid�rmico (EGFR) y miembros de se�alizaci�n cadena abajo han demostrado

10 recientemente estar sobreexpresados en ciertos tipos de tumor. Como resultado, otro grupo de biomarcadores en an�lisis son EGFR, fosfo-EGFR y Citoqueratina 18. Para medir, la distribuci�n cualitativa y cuantitativa de estos biomarcadores en secciones de tejido incluidas en parafina, fijadas con formalina o micromatrices tisulares se detectaron de la siguiente manera:

15 Desparafinaci�n y rehidrataci�n de muestras de tejido realizada en la m�quina de procesamiento de portaobjetos automatizada Discovery XT (Ventana Medical, Tuscan AZ).

1.) Recuperaci�n de ant�genos (Proteinasa K)

20 Para recuperaci�n de ant�genos, se incubaron secciones de tejido o TMA en una soluci�n de proteinasa K (disponible en el mercado como un reactivo listo para usar para recuperaci�n de ant�genos) durante 12 - 15 minutos. Esto se aplic� a portaobjetos en la etapa de “pretratamiento 1” del protocolo de la m�quina usando un dispensador rellenable por el usuario (pretratamiento 3).

25 2.) Permeabilizaci�n del tejido

Muestras de tejido se permeabilizaron posteriormente en PBS que conten�a Triton X al 0,2 % (PBT) durante 28 minutos a temperatura ambiente, aplicado en la etapa de “pretratamiento 2” del protocolo usando un dispensador rellenable por el usuario (enzima 3).

30 3.) Eliminaci�n de autofluorescencia

La autofluorescencia se redujo incubando los portaobjetos en HCl al 1 %/EtOH al 70 % durante 16 minutos a temperatura ambiente, aplicado en la etapa de pretratamiento 3 del protocolo usando un dispensador rellenable

35 (pretratamiento 4).

4.) Bloqueo con IgG inespec�fica

La uni�n no espec�fica de anticuerpo o fragmentos Fab se bloque� mediante incubaci�n con 0,5 μg/ul de BSA en

40 PBT durante 20 minutos en una c�mara h�meda. Esto se aplic� a portaobjetos la etapa “Opci�n” del protocolo usando un dispensador rellenable por el usuario (opci�n 1).

5.) Incubaci�n de anticuerpos primarios no tratados

45 Se diluyeron EGFR monoclonal de rat�n y anticuerpo fosfo-EGFR policlonal de conejo juntos en su diluci�n de trabajo respectiva y se aplicaron manualmente a portaobjetos durante la etapa de valoraci�n manual en el aparato Discovery XT (Ventana Medical, Tuscan AZ). El funcionamiento del Discovery XT se reinici� durante un periodo de incubaci�n de una hora.

50 6.) Incubaci�n con Fab marcado de forma fluorescente

Fragmentos Fab espec�fico de rat�n y de conejo marcados con Alexa 594 y Alexa 555 respectivamente se a�adieron de forma manual al portaobjetos y se incubaron durante 30 minutos. El funcionamiento del Discovery XT se reinici� y se le dej� funcionar hasta que se complet�.

55 8.) Eliminaci�n del anticuerpo no unido

Una vez completado el funcionamiento, los portaobjetos se retiraron del Discovery XT, se colocaron en una gradilla para portaobjetos 2 veces durante 6 minutos cada una en PBT a temperatura ambiente. A continuaci�n los

60 portaobjetos se aclararon de nuevo 2 veces durante 3 minutos en PBS.

7.) Incubaci�n del tercer anticuerpo primario no tratado

Citoqueratina 18 monoclonal de rat�n se diluy� a su diluci�n de trabajo y se a�adi� a los portaobjetos para 65 incubaci�n de una hora a temperatura ambiente.

8.) Incubaci�n con el tercer Fab marcado de forma fluorescente

El fragmento Fab espec�fico de rat�n marcado con Alexa 488 se a�adi� al portaobjetos y se incub� en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. 5 9.) Eliminaci�n del anticuerpo no unido

El exceso de anticuerpo se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 6 minutos en PBT seguidas por 3 veces durante 3 minutos en PBS.

9.) Eliminaci�n de Fab no unido

El fragmento Fab no unido se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 10 minutos en PBT seguidas por 3 veces durante 5 minutos en PBS.

15 10.) Fijaci�n

Los tejidos se fijaron en formalina al 10 % durante 10 minutos. Los portaobjetos se aclararon a continuaci�n 2 veces durante 5 minutos en PBS.

11.) Montaje

25 12.) Adquisici�n de im�genes

Las muestras se colocaron en un microscopio de fluorescencia automatizado 90i. Las regiones de inter�s se identificaron moviendo los ejes y-x de la platina del microscopio. El tiempo de exposici�n de la imagen se ajust� dentro de la c�mara al nivel de brillo m�s alto posible sin causar sobreexposici�n. Las im�genes se adquirieron con la c�mara Nikon 1200DXM CCD o un sistema comparable (como alternativa podr�a usarse una c�mara de imaginolog�a espectral para separaci�n espectral avanzada de colorantes fluorescentes). Las im�genes se guardaron en formato tiff y se sometieron a an�lisis cuantitativo de la imagen.

35 EJEMPLO 4: DETECCI�N MULTIPLEX DE VEGF, KDR, P-KDR Y CD34

La angiog�nesis es un proceso cr�tico para el crecimiento y la met�stasis tumorales. Se ha descubierto que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y su receptor VEGFR-2 (KDR) junto con CD34 son importantes biomarcadores para la evaluaci�n de la neovascularizaci�n y la angiog�nesis. Para medir, la distribuci�n cualitativa y cuantitativa de estos biomarcadores en secciones de tejido incluidas en parafina, fijadas con formalina o micromatrices tisulares se detectaron de la siguiente manera;

1.) Recuperaci�n de ant�genos (en soluci�n Reveal)

45 Para la recuperaci�n de ant�genos, secciones de tejido o TMA se calentaron en soluci�n Reveal 1X (BioCare Medical) en una c�mara de recuperaci�n “decloaking chamber” de acuerdo con un protocolo convencional y a continuaci�n se les deja enfriar durante 15 minutos. M�todos alternativos de recuperaci�n de ant�genos incluyen: 1) calentar secciones de tejido o TMA en tamp�n citrato 10 mM, pH 6,0, durante 15 minutos en un microondas calibrado seguido por refrigeraci�n durante 15 minutos. Despu�s de aclarar en agua destilada durante 15 minutos, los portaobjetos se lavar�an 3 veces durante 5 minutos en soluci�n salina tamponada por fosfato (PBS).

2.) Permeabilizaci�n del tejido

Muestras de tejido se permeabilizaron posteriormente en PBS que conten�a Triton X al 0,2 % (PBT) durante 30 55 minutos a temperatura ambiente.

3.) Eliminaci�n de autofluorescencia

La autofluorescencia se redujo incubando los portaobjetos en HCl al 1 %/EtOH al 70 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se aclararon a continuaci�n 3 veces durante 5 minutos en PBS.

4.) Bloqueo con IgG inespec�fica

La uni�n no espec�fica de anticuerpo o fragmento Fab se bloque� mediante incubaci�n con 0,5 μg/ul de BSA en PBT

65 durante 20 minutos en una c�mara h�meda. Los portaobjetos se aclararon posteriormente en PBT durante 5 minutos.

5.) Incubaci�n de anticuerpos primarios no tratados

VEGF monoclonal de rat�n y KDR policlonal de conejo se diluyeron juntos a diluci�n de trabajo y se a�adieron a portaobjetos para incubaci�n de una hora en una c�mara h�meda. 5 6.) Eliminaci�n del anticuerpo no unido

El exceso de anticuerpo se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 6 minutos en PBT seguidas por 2 veces durante 3 minutos en PBS.

7.) Incubaci�n con Fab marcado de forma fluorescente

Fragmentos Fab espec�fico de rat�n y de conejo marcados con Alexa 488 y Alexa 555 respectivamente se a�adieron al portaobjetos y se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos.

15 8.) Eliminaci�n del anticuerpo no unido

El exceso de anticuerpo se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 10 minutos en PBT seguidas por 3 veces durante 5 minutos en PBS.

9.) Incubaci�n del segundo agrupamiento de anticuerpos primarios no tratados

CD34 monoclonal de rat�n y fosfo-KDR policlonal de conejo se diluyeron juntos a diluci�n de trabajo y se a�adieron a portaobjetos para incubaci�n de una hora en una c�mara h�meda.

25 10.) Eliminaci�n del anticuerpo no unido

El exceso de anticuerpo se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 6 minutos en PBT seguidas por 2 veces durante 3 minutos en PBS

11.) Incubaci�n con Fab marcado de forma fluorescente

Fragmentos Fab espec�fico de rat�n y de conejo marcados con Alexa 568 y Alexa 594 respectivamente se a�adieron al portaobjetos y se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos.

35 12.) Eliminaci�n del anticuerpo no unido

10.) Fijaci�n

El tejido se fij� en formalina al 10 % durante 10 minutos. Los portaobjetos se aclarar�an a continuaci�n 2 veces durante 5 minutos en PBS.

45 11.) Montaje

12.) Adquisici�n de im�genes

Las muestras se colocaron en un microscopio de fluorescencia automatizado 90i. Las regiones de inter�s se identificaron moviendo los ejes y-x de la platina del microscopio. El tiempo de exposici�n de la imagen se ajust�

55 dentro de la c�mara al nivel de brillo m�s alto posible sin causar sobreexposici�n. Las im�genes se adquirieron con la c�mara Nikon 1200DXM CCD o un sistema comparable (como alternativa podr�a usarse una c�mara de imaginolog�a espectral para separaci�n espectral avanzada de colorantes fluorescentes). Las im�genes se guardaron en formato tiff y se sometieron a an�lisis cuantitativo de la imagen.

EJEMPLO 5: DETECCI�N MULTIPLEX DEL RECEPTOR DE ANDR�GENOS, CITOQUERATINAS, α-METILACIL-COA-RACEMASA, P63, CD34 Y NFKB

Se ha descubierto que el receptor de andr�genos (AR, IgG1 de rat�n), Citoqueratina-18 (IgG de conejo), Metilacil-CoA Racemasa (AMACR, IgG de conejo), Citoqueratina de alto peso molecular (HMWCK, IgG1 de rat�n), P63

65 (IgG2a de rat�n), CD34 (IgG1 de rat�n) y NFKB (IgG de conejo) son importantes biomarcadores para la evaluaci�n de tejido con c�ncer de pr�stata. La distribuci�n cualitativa y cuantitativa de estos marcadores en secciones de tejido incluidas en parafina, fijadas con formalina o micromatrices tisulares, se detectaron de la siguiente manera:

1.) Recuperaci�n de ant�genos (en soluci�n Reveal, tamp�n citrato o proteinasa K)

5 Para la recuperaci�n de ant�genos, secciones de tejido o TMA se calentaron en soluci�n Reveal 1X (BioCare Medical) en una c�mara de recuperaci�n “decloaking chamber” de acuerdo con un protocolo convencional y a continuaci�n se les deja enfriar durante 15 minutos. M�todos alternativos de recuperaci�n de ant�genos incluyen: 1) calentar secciones de tejido o TMA en tamp�n citrato 10 mM, pH 6,0, durante 15 minutos en un microondas calibrado seguido por refrigeraci�n durante 15 minutos o 2) digerir enzim�ticamente secciones de tejido o TMA en una soluci�n de proteinasa K (disponible en el mercado como un reactivo listo para usar para recuperaci�n de ant�genos) durante 12 -15 minutos. Despu�s de aclarar en agua destilada durante 15 (esta etapa se salta para recuperaci�n de ant�genos con proteinasa K), los portaobjetos se lavaron 3 veces durante 5 minutos en soluci�n salina tamponada por fosfato (PBS).

15 2.) Eliminaci�n de autofluorescencia

3.) Permeabilizaci�n del tejido

25 4.) Bloqueo con IgG inespec�fica

La uni�n no espec�fica de anticuerpo o fragmento Fab se bloque� mediante incubaci�n con 0,5 μg/ul de BSA en PBT durante 20 minutos en una c�mara h�meda. Los portaobjetos se aclararon posteriormente en PBT durante 5 minutos.

5.) Preparaci�n del complejo formado previamente para c�ctel de Citoqueratina de alto peso molecular/p63 y AMACR.

Anticuerpos citoqueratina de alto peso molecular monoclonal de rat�n/P63 y AMACR policlonal de conejo se

35 valoraron con el mismo anticuerpo de uni�n no espec�fico y se incubaron en tejido durante 1 h a temperatura ambiente en una c�mara h�meda.

6.) Eliminaci�n del anticuerpo no unido

El exceso de anticuerpo se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 5 minutos en PBT seguidas por 2 en PBS, 5 y 3 minutos respectivamente.

7.) Incubaci�n con Fab marcado de forma fluorescente

45 Fragmentos Fab espec�ficos de rat�n y de conejo marcados con Alexa 488, Alexa 555 y Alexa 594 respectivamente se a�adieron al portaobjetos y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en una c�mara h�meda.

8.) Eliminaci�n de Fab no unido

El fragmento Fab no unido se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 5 minutos en PBT seguidas por 2 en PBS 5 y 3 minutos respectivamente.

9.) Preparaci�n del complejo formado previamente para Citoqueratina 18 y el receptor de andr�genos

55 Anticuerpos Receptor de andr�genos (AR) monoclonal de rat�n y Citoqueratina 18 policlonal de conejo se valoraron con el mismo anticuerpo de uni�n no espec�fico y se incubaron en tejido durante 1 h a temperatura ambiente en una c�mara h�meda

10) Eliminaci�n del anticuerpo no unido

11) Incubaci�n con Fab marcado de forma fluorescente

65 Fragmentos Fab espec�fico de rat�n y de conejo marcados con Alexa 680 y Alexa 568 respectivamente se a�adieron

al portaobjetos y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en una c�mara h�meda. 12) Eliminaci�n de Fab no unido

5 El fragmento Fab no unido se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 5 minutos en PBT seguidas por 2 en PBS 5 y 3 minutos respectivamente. 13) Preparaci�n para una aplicaci�n durante una noche de anticuerpo CD34 Anticuerpo CD34 monoclonal de rat�n se valor� con el mismo anticuerpo de uni�n no espec�fico y se incub� durante

una noche a 4 grados en una c�mara h�meda cerrada. 14) Recuperaci�n de portaobjetos refrigerados

15 Despu�s de retirar los portaobjetos del refrigerador, los portaobjetos se dejaron a temperatura ambiente dentro de la c�mara h�meda cerrada durante 1 h. 15) Eliminaci�n del anticuerpo no unido El exceso de anticuerpo se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 5 minutos en PBT seguidas por 2 en

PBS, 5 y 3 minutos respectivamente. 16) Incubaci�n con Fab marcado de forma fluorescente

25 Fragmento Fab espec�fico de rat�n y de conejo marcado con Alexa 647 se a�adi� al portaobjetos y se incub� durante 30 minutos a temperatura ambiente en una c�mara h�meda. 17) Eliminaci�n de Fab no unido El fragmento Fab no unido se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 5 minutos en PBT seguidas por 2 en

PBS 5 y 3 minutos respectivamente. 18) Preparaci�n para una aplicaci�n de anticuerpo NFKB

35 NFKB policlonal de conejo se valor� con el mismo anticuerpo de uni�n no espec�fico y se incub� en tejido durante 1 h a temperatura ambiente en una c�mara h�meda. 19) Eliminaci�n del anticuerpo no unido El exceso de anticuerpo se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 5 minutos en PBT seguidos por 2 en

PBS, 5 y 3 minutos respectivamente. 20) Incubaci�n con Fab marcado de forma fluorescente

45 Se a�adi� fragmento Fab espec�fico de conejo marcado con Alexa 660 al portaobjetos y se incub� durante 30 minutos a temperatura ambiente en una c�mara h�meda. 21) Eliminaci�n de Fab no unido El fragmento Fab no unido se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 5 minutos en PBT seguidas por 2 en

PBS 5 y 3 minutos respectivamente. 22) Fijaci�n

55 El tejido se fij� en formalina al 10 % durante 10 minutos. Los portaobjetos se aclararon 2 veces durante 5 minutos en PBS. 20 23) Montaje Despu�s de a�adir 100 μl de soluci�n AntiFade que conten�a contratinci�n nuclear, los portaobjetos se cubrieron con

cubreobjetos y se prepararon para la captura de im�genes. 24) Adquisici�n de im�genes 65 Las muestras se colocaron en un microscopio de fluorescencia automatizado 90i. Las regiones de inter�s se identificaron moviendo los ejes y-x de la platina del microscopio. El tiempo de exposici�n de la imagen se ajust� al

nivel de brillo m�s alto posible sin causar sobreexposici�n. Las im�genes se adquirieron con la c�mara Nikon 1200DXM CCD o un sistema comparable (como alternativa podr�a usarse una c�mara de imaginolog�a espectral para separaci�n espectral avanzada de colorantes fluorescentes). Las im�genes se guardaron en formato tiff y se sometieron a an�lisis cuantitativo de la imagen.

5 EJEMPLO 6: DETECCI�N MULTIPLEX DE CITOQUERATINA 18, AMACR RACEMASA, RECEPTOR DE ANDR�GENOS, QUERATINA DE ALTO PESO MOLECULAR Y P63 EN TEJIDO DE PR�STATA

Se us� el ensayo MultiPlex convencional para detectar 5 marcadores incluyendo CK18 (Citoqueratina 18), AMACR (Racemasa), AR (Receptor de andr�genos), HMWK (Queratina de alto peso molecular), p63 (c�lulas basales) y DAPI para identificar n�cleos en secciones de tejido de pr�stata incluidas en parafina, fijadas con formalina.

Se estudiaron una secci�n te�ida con H&E (Hematoxilina y Eosina) y cinco secciones en parafina no te�idas de 6 pacientes individuales. Las secciones de H&E fueron evaluadas por dos pat�logos para la calidad global y el

15 contenido tumoral. Utilizando un protocolo multiplex convencional descrito en los EJEMPLOS 1-4 anteriores, se realiz� un ensayo quintplex que inclu�a una evaluaci�n de CK18, AMACR, AR, HMWK y p63 en un �nico portaobjetos de cada paciente. Se utiliz� una tinci�n con DAPI para identificar n�cleos. Se realizaron en paralelo muestras de tejido de pr�stata de control positivas y negativas a partir de una micromatriz tisular. Se adquirieron tres im�genes a partir de regiones seleccionadas, se procesaron y se analizaron posteriormente. Se exportaron datos y se asociaron medidas cuantitativas con im�genes individuales.

Todas las muestras de los seis pacientes conten�an grados variables de tumor con elementos benignos y PIN asociados. La calidad global del material seccionado era aceptable y todas las muestras se ensayaron con el M-Plex quintplex. Se adquirieron im�genes por triplicado de cada secci�n de tejido de pr�stata. Se procesaron im�genes

25 individuales en escala de grises en formato tiff usando software de imaginolog�a espectral y a continuaci�n se analizaron con los algoritmos inmunofluorescentes para generar caracter�sticas cuantitativas. Se generaron unas 90 caracter�sticas individuales usando las secuencias de comandos de an�lisis de im�genes. Las caracter�sticas representan diversas caracter�sticas fenot�picas de compartimentos celulares y su asociaci�n con un biomarcador espec�fico. Por ejemplo, los ant�genos/biomarcador en cuesti�n son interrogados bas�ndose en su distribuci�n celular as� como la media y la desviaci�n est�ndar globales con respecto a su intensidad (cantidad) que se deriva de los niveles de p�xel (px). Las secuencias de comandos individuales para el ensayo quintplex se han normalizado previamente para justificar variaciones con respecto a grosor del tejido, variabilidad en penetraci�n de fijador y calidad/acceso de ant�geno. Como medio de ilustraci�n, dos de los seis pacientes se analizar�n en las siguientes secciones.

35 Las im�genes adquiridas de las muestras de tejido de ensayo se evaluaron bas�ndose en una revisi�n de las im�genes segmentadas (figura 11A; n�tese la clave de color para clasificaci�n espec�fica) y de escala de grises para AR (figura 11B) y AMACR (figura 11C; NS se refiere a la uni�n no espec�fica de AMACR al estroma).

Para el paciente ID 4754-2, la intensidad promedio de AR presente dentro de c�lulas epiteliales que son positivas para AMACR era de 0,45 frente a 0,43 para c�lulas negativas para AMACR, ilustrando que, incluso aunque hay m�s gl�ndulas positivas para AMACR presentes, la intensidad promedio de AR dentro del grupo positivo para AMACR es baja cuando se compara con la poblaci�n celular negativa para AMACR. Adem�s, la cantidad promedio de intensidad de AR en el estroma era de 3,09, el �rea relativa de n�cleos epiteliales que son positivos para AR y

45 positivos para AMACR era de 0,20, el �rea relativa de todos los n�cleos epiteliales que son positivos para AR era de 0,61 y finalmente la intensidad global de AMACR era de 324.849 p�xeles. Los resultados de caracter�sticas de imaginolog�a definen sutiles diferencias entre regiones de inter�s seleccionadas, tipos celulares y sus ant�genos asociados; permitiendo que estas diferencias sean cuantificadas y a continuaci�n incluidas dentro de modelos predictivos o evaluadas individualmente con respecto a resultado/respuesta. Para la construcci�n de modelos, se eval�an caracter�sticas espec�ficas con respecto a un resultado y su nivel de precisi�n es evaluado mediante un intervalo de confianza. Las caracter�sticas son cribadas inicialmente dentro del contexto de un conjunto de formaci�n y a continuaci�n se validan en una cohorte externa para confirmaci�n.

Este estudio confirma la capacidad para aplicar el ensayo multiplex quintplex en secciones de tejido incluidas en

55 parafina, fijadas con formalina externas. El ensayo tuvo �xito en las muestras de los 6 pacientes r, con completa adquisici�n de im�genes, procesamiento y generaci�n de caracter�sticas cuantitativas que eval�an los niveles y la intensidad del receptor de andr�genos y AMACR en muestras de tejido individuales.

Adem�s, el quintplex se realiz� en LNCaP y PC3 fijadas con formalina e incluidas en parafina que se conoce de numerosas publicaciones que muestran niveles tanto altos (LNCaP) como bajos (PC3) de expresi�n de AR, respectivamente. La asociaci�n de un valor cuantitativo al contenido de AR dentro de estas l�neas celulares es el primer paso hacia el entendimiento de la modulaci�n de AR y el impacto sobre mol�culas efectoras aguas abajo tal como se demuestra mediante la reducci�n de AMACR dentro de las c�lulas PC3. Estas estrategias in vitro son el primer paso hacia el examen de la respuesta de AR a un f�rmaco (es decir terapia de privaci�n de andr�genos 65 (ADT), inhibidores de histona desacetilasa, HDAC)) y puede prolongarse f�cilmente a muestras cl�nicas del paciente incluyendo aspirados con aguja, muestras de biopsia para determinar la respuesta (sobre la diana), la valoraci�n y la

eficacia de un f�rmaco.

EJEMPLO 7: DETECCI�N MULTIPLEX DE CD4, CD8, CD25, CD69 Y CD86

5 El objeto de este estudio era desarrollar los ensayos Multiplex (M-Plex) inmunofluorescentes necesarios para los CD4, CD8, CD25, CD69 y CD86 propuestos m�s CK18. La CK18 es retenida dentro de los dos ensayos m-plex finales para identificar compartimentos tisulares (epitelial frente a estroma) para desarrollo de una secuencia de comandos cuantitativa. Este proceso conlleva la identificaci�n de fuentes comerciales apropiadas para todos los reactivos, desarrollo de ensayo incluyendo valoraci�n, selecci�n del fluor�cromo Alex y an�lisis usando ambas

10 muestras de tejido de control no de pr�stata. El objetivo era completar el desarrollo de los ensayos tanto simplex como M-plex para cada uno de los marcadores y adquirir im�genes que puedan utilizarse posteriormente para desarrollo de una secuencia de comandos cuantitativa.

Varias fuentes comerciales para los ant�genos/anticuerpos espec�ficos que se incluyeron en el desarrollo de los 15 ensayos M-plex (v�ase la tabla 1).

Tabla 1

Anticuerpo: Proveedor N� de cat�logo Clon Isotipo Diluci�n

CK-18 (R): CalBiochem AP1021 p�ptido sint�tico RIgG 1:1250

CD4: Vector Labs VP-C318 1F6 MIgG1 1:10

CD8: Vector Labs VP-C325 1A5 MIgG1 1:10

CD25: LabVision MS-203-P1 4C9 MIgG1 1:200

CD69: BioLegend 310902 FN50 MIgG1 1:10

CD86: GeneTex 74653 BU63 MIgG1 1:10

Utilizando una serie de muestras de tejido de control incluyendo am�gdalas, ganglio linf�tico y bazo se valoraron

20 cada uno de los anticuerpos individuales y fueron evaluados por el pat�logo para fondo, y especificidad/sensibilidad de la se�al bas�ndose en la distribuci�n y la localizaci�n celular. Los anticuerpos son ensayados, cada uno, individualmente en un formato simplex IF y a continuaci�n se hicieron avanzar r�pidamente al ensayo m-plex de acuerdo con los m�todos perfilados a continuaci�n.

25 Inmunofluorescencia cuantitativa

Se realizaron desparafinaci�n y rehidrataci�n de muestras de tejido mediante procedimientos convencionales en un aparato para autotinci�n Leica 5020. Se realiz� recuperaci�n de ant�genos llevando a ebullici�n los portaobjetos en un horno microondas durante 7,0 minutos en soluci�n Reveal 1X. Se dej� enfriar a los portaobjetos durante 20

30 minutos a temperatura ambiente y a continuaci�n se lavaron dos veces durante tres minutos en PBS.

Todas las muestras de tejido se ti�eron a temperatura ambiente en un aparato para tinci�n de portaobjetos automatizado Nemesis 7200 de BioCare Medical. Las muestras de tejido se sometieron a las siguientes etapas de tratamiento prehibridaci�n. Para ayudar a penetrar en las estructuras celulares del tejido, las muestras se incubaron

35 en PBT (PBS + Triton-X 100 al 0,2 %) durante treinta minutos, seguidos por un aclarado de tres minutos en TBS. Para ayudar a reducir la autofluorescencia en el tejido, las muestras se incubaron en HCl al 1 % en EtOH al 70 % durante veinte minutos, seguidos por un aclarado de tres minutos en TBS. El bloqueo de sitios de uni�n no espec�ficos se realiz� incubando los portaobjetos en reactivo de bloqueo (PBT que conten�a 1,0 mg/ml de BSA) durante veinte minutos. No se realizaron lavados entre la etapa de bloqueo y la posterior etapa de hibridaci�n.

40 Para el multiplex triplex I final, se prepar� una diluci�n 1:200 de CD25 (4C9) en reactivo de bloqueo. Para el multiplex duplex final, una diluci�n 1:10 de CD8 (1A5) se prepar� en reactivo de bloqueo. Aproximadamente 400,0 μl del anticuerpo apropiado se aplicaron a la muestra de tejido, y se permiti� hibridar a los anticuerpos y las muestras de tejido durante una hora. A la hibridaci�n le segu�a un aclarado de tres minutos en TBS.

45 El multiplex triplex se marc� con Zenon Alexa Fluor de rat�n 532, diluido en reactivo de bloqueo a dos veces las concentraciones recomendadas por el fabricante (diluci�n 1:50). El multiplex duplex se marc� con Zenon Alexa Fluor de rat�n 594, diluido tal como se ha descrito. Aproximadamente 400,0 μl de la marca apropiada se aplicaron a las muestras de tejido, y las muestras de tejido se incubaron durante treinta minutos. A la reacci�n de marcado le

50 segu�a un aclarado de tres minutos en TBS.

Las muestras de tejido para ambos ensayos multiplex se trataron a continuaci�n con una segunda ronda de hibridaci�n y marcado. Para el triplex, se prepar� una diluci�n 1:10 de CD69 (FN50) en reactivo de bloqueo. Para el duplex, se prepar� un c�ctel de Citoqueratina 18 (CK-18) a una diluci�n 1:1.000 y CD86 (BU63) a una diluci�n 1:10

55 en reactivo de bloqueo. Aproximadamente 400,0 μl del c�ctel de anticuerpos apropiado se aplicaron a la muestra de tejido, y se permiti� hibridar a los anticuerpos y las muestras de tejido durante una hora. A la hibridaci�n le segu�a un aclarado de tres minutos en TBS.

Para la segunda etapa de marcado, el triplex se marc� con Zenon Alexa Fluor de rat�n 555, diluido tal como se ha

5 descrito. El duplex se marc� con un c�ctel de Zenon Alexa Fluor de rat�n 555 y Zenon Alex Fluor de conejo 647, diluido tal como se ha descrito. Aproximadamente 400,0 μl de la marca o marcas apropiadas se aplicaron a las muestras de tejido, y las muestras de tejido se incubaron durante treinta minutos. A la reacci�n de marcado le segu�a un aclarado de tres minutos en TBS.

Las muestras de tejido para el triplex se trataron a continuaci�n con una tercera ronda de hibridaci�n y marcado. El duplex se hizo avanzar a la etapa de fijaci�n descrita a continuaci�n. Para el triplex, se prepar� un c�ctel de Citoqueratina 18 (CK-18) a una diluci�n 1:1.000 y CD4 (1F6) a una diluci�n 1:10 en reactivo de bloqueo. Aproximadamente 400,0 μl del c�ctel de anticuerpos se aplicaron a la muestra de tejido, y se permiti� hibridar a los anticuerpos y las muestras de tejido durante una hora. A la hibridaci�n le segu�a un aclarado de tres minutos en

15 TBS.

Para el tercer marcado, el triplex se marc� con un c�ctel de Zenon Alexa Fluor de rat�n 594 y Zenon Alex Fluor de conejo 647, diluido tal como se ha descrito. Aproximadamente 400,0 μl del c�ctel de marcas se aplic� a las muestras de tejido, y las muestras de tejido se incubaron durante treinta minutos. A la reacci�n de marcado le segu�an dos aclarados de tres minutos en TBS.

Se realiz� una etapa de fijaci�n incubando las muestras en formalina al 10 % durante 10 minutos, seguidos por dos aclarados de tres minutos cada uno en TBS. Los portaobjetos se retiraron a continuaci�n del aparato para tinci�n de portaobjetos automatizado Nemesis 7200 de BioCare Medical.

25 El reactivo montante de fluorescencia SlowFade Gold de Molecular Probe con DAPI (aproximadamente 25,0 μl) se aplic� a las muestras, que a continuaci�n se cubrieron con cubreobjetos. Las muestras se almacenaron a -20�C hasta que pod�a realizarse el an�lisis.

Los cinco anticuerpos se dividieron entre dos ensayos M-plex debido al isotipo com�n de reactivos disponibles. Los anticuerpos se desarrollaron y analizaron en primer lugar en un ensayo inmunofluorescente simplex usando muestras de tejido linfoide (es decir bazo, am�gdala, ganglio linf�tico) donde se anticip� que todos los marcadores estar�an presentes. Los resultados del ensayo simplex tuvieron �xito en que cada uno de los marcadores identificaba subconjuntos de linfocitos que coincid�an con el compartimento celular (es decir membrana celular) y se identificaron

35 dentro de fol�culos intermedios y/o centros germinales. Los experimentos simplex originales se agruparon a continuaci�n en formatos M-plex que se aplicaron en tejidos de control similares as� como en muestras de tejido de pr�stata dom�sticas donde infiltrados linfoc�ticos fueron identificados por evaluaci�n de H&E. Los ejemplos de los datos derivados de estos ensayos M-plex originales se ilustran en la figura 13A y 13B. Tal como se demostr�, se desarrollaron dos ensayos M-plex. M-plex I es un duplex que conten�a CD4 y CD8 (+ CK18) mientras que un segundo M-plex II era un triplex que conten�a CD25, 69 y 86 (+CK18).

Posteriores al desarrollo de los anteriores formatos M-plex, se generaron dos combinaciones M-plex adicionales para evaluar subconjuntos seleccionados de c�lulas T dentro de secciones de tejido dadas (por ejemplo c�lulas T activadas - CD4+CD69+ y c�lulas T mixtas: CD4+ y CD25+. Los nuevos formatos M-plex estaban constituidos por

45 un duplex que conten�a CD8 y 86 y un triplex que conten�a CD4, 25 y 69. Estos nuevos ensayos M-plex se ensayaron en muestras de tejido espl�nico y la am�gdala y se ilustran en la figura 14A y 14B. Estos son los formatos m-plex que se aplicar�n en las muestras de prostatectom�a tratadas del paciente cuando llegan a Aureon.

Para cada experimento M-plex, se eval�a un perfil espectral que identifica el perfil de emisi�n de Alexa Fluor individual para la calidad de la se�al, diferenciaci�n de otros perfiles, intensidad, y evaluaci�n de la calidad inicial para cuantificaci�n para el desarrollo de secuencia de comandos (se�al/ruido). Los fluor�cromos de Alexa se seleccionan bas�ndose en sus perfiles espectrales para conservar la pureza de la se�al con la m�nima cantidad de solapamiento. Tal como se ilustra en la figura 14B, los perfiles espectrales para el M-plex duplex identifican ant�genos/anticuerpos individuales, as� como autofluorescencia del tejido. Tambi�n se realiz� un an�lisis similar para

55 el m-plex triplex.

A trav�s de una evaluaci�n de la localizaci�n dentro de fol�culos linfoides y tipos de tejido linfoide individuales, los presentes anticuerpos dentro de estos formatos de M-plex fueron capaces de identificar de forma selectiva poblaciones de linfocitos. Las im�genes en escala de grises (tal como se perfila en las figuras) se utilizar�n para el desarrollo de algoritmos y secuencias de comandos para cuantificar con �xito estos ant�genos en secciones de tejido.

El desarrollo de ensayos tanto IF simplex como IF M-plex para la evaluaci�n de los 5 anticuerpos/ant�genos - CD4, CD8, CD25, CD69 y CD86 se ha completado con �xito. Estos 5 anticuerpos se han acoplado (en formatos M-plex

65 espec�ficos) para maximizar la superposici�n para el desarrollo de secuencias de comandos de modo que subconjuntos de poblaciones de c�lulas linfoc�ticas activadas.

EJEMPLO 8: MICROMATRIZ DE P�PTIDOS PARA MEDIR EL INTERVALO DIN�MICO Y LA CUANTIFICACI�N DE LA DETECCI�N DE LA DIANA.

5 Los p�ptidos son cortas secuencias de amino�cidos (normalmente de 10 a 30 residuos) que se usan a menudo como inmun�genos para la producci�n de anticuerpos. Dado que pueden ser sintetizados in vitro, pueden producirse p�ptidos purificados en grandes cantidades. Normalmente, las micromatrices de p�ptidos est�n constituidas por p�ptidos unidos covalentemente a una superficie de vidrio. Si un anticuerpo reconoce una secuencia pept�dica espec�fica, una matriz de p�ptidos puede utilizarse de este modo para medir el intervalo din�mico (el intervalo entre la menor y la mayor concentraci�n de la diana) que puede detectarse con dicho m�todo. Adicionalmente, dado que una concentraci�n de p�ptido dada en la micromatriz est� vinculada a una intensidad fluorescente espec�fica, la concentraci�n de diana desconocida puede evaluarse de forma cuantitativa.

Se dise�� una micromatriz de p�ptidos que conten�a un p�ptido que es reconocido espec�ficamente por NeoMarkers

15 (Lab Vision Corp.) anticuerpo anti-receptor de andr�genos NM-MS443 (Secuencia pept�dica: STEDTAEYSPFKGGYTK). Adicionalmente, la micromatriz conten�a un p�ptido de control positivo (Secuencia: NFLMDNA(pY)FCEADAKKK) que es detectado espec�ficamente por un anticuerpo anti-fosfo-Tirosina (Sigma) y un p�ptido de control negativo que no est� relacionado con ninguna prote�na conocida (Secuencia: SFYGATGESYDPTTKEK). Todos los p�ptidos se localizaron por trip0licado en las siguientes concentraciones: 100, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 15,63, 7,81, 3,91 y 1,95 micromolar. La micromatriz fue fabricada por JPT Peptide Technologies, Alemania. La tinci�n de la micromatriz de p�ptidos se realiz� de la siguiente manera:

1.) Unir la c�mara al portaobjetos de la micromatriz de p�ptidos

25 Cada marco adhesivo se intercal� entre una l�mina de poli�ster fina y una gruesa (mientras que la l�mina fina cubre el marco adhesivo completamente, la l�mina gruesa tiene una parte central retirada). El poli�ster grueso se retir�, dejando el marco azul unido a la l�mina fina. A continuaci�n, el marco adhesivo azul en la l�mina fina de poli�ster se coloc� en el portaobjetos de vidrio mientras se evitaba el contacto con la superficie que presentaba el p�ptido. El marco azul se presion� firmemente hacia abajo sin atrapar aire debajo del adhesivo. La segunda l�mina fina de poli�ster se retir� a continuaci�n de la parte superior del marco azul adhesivo. El marzo azul en solitario permanec�a unido al portaobjetos.

2.) Preparar la soluci�n de ensayo con primario

35 Un volumen de 1,0 μg del anticuerpo AR monoclonal de rat�n (NeoMarkers, Lab Vision Corp.) se ajust� a 20 μl de 1x tamp�n PBS en un tubo Eppendorf. Para experimentar marcado con anticuerpo primario con un fluor�foro, 5 μl de IgG1 de rat�n Zenon 555 Alexa Flour se a�adieron a continuaci�n. La soluci�n se pipete� arriba y abajo para mezclar e incubar durante 10 minutos. Como control, 7 μg/ml de anticuerpo fosfo-Tirosina marcado con FITC(Sigma) se diluyeron en el tubo junto con anticuerpo AR adicional a su diluci�n de trabajo para un volumen de soluci�n de ensayo final de 330 μl. La soluci�n se agit� en v�rtice para garantizar el mezclado, y partiendo de un extremo del marcado adhesivo, todo el volumen se pipete� por toda la superficie del portaobjetos.

3.) Incubaci�n

45 La micromatriz de p�ptidos se incub� a continuaci�n durante 4 horas a 4�C en una c�mara h�meda protegida de la luz.

4.) Retirar la c�mara de incubaci�n

La soluci�n de ensayo se decant� y la c�mara de incubaci�n se retira cuidadosamente sujetando el portaobjetos con una mano y tirando hacia arriba suavemente de un borde del marco azul adhesivo. El marco azul se levant� de los bordes del portaobjetos cuidadosamente para evitar que quede cualquier adhesivo, lo que alterar�a los siguientes lavados.

55 5.) Eliminaci�n del anticuerpo no unido

El exceso de anticuerpo se elimin� lavando el portaobjetos 5 veces durante 5 minutos con agua filtrada doblemente destilada. El portaobjetos se lav� a continuaci�n 5 veces durante 5 minutos en metanol.

6.) Montaje

Despu�s de que el portaobjetos se sec� al aire (libre de part�culas de polvo) se a�adieron 100 μl de soluci�n AntiFade que conten�a contratinci�n nuclear y a continuaci�n se cubri� con un cubreobjetos y se prepar� para la

65 adquisici�n de im�genes.

7.) Adquisici�n de im�genes

Las matrices de p�ptidos se colocaron en un microscopio de fluorescencia automatizado 90i. Se localizaron los

5 puntos moviendo los ejes y-x de la platina del microscopio. El tiempo de exposici�n de la imagen se ajust� dentro de la c�mara al nivel de brillo m�s alto posible sin causar sobreexposici�n. Las im�genes se adquirieron con la c�mara Nikon 1200DXM CCD o un sistema comparable (como alternativa podr�a usarse una c�mara de imaginolog�a espectral para separaci�n espectral avanzada de colorantes fluorescentes). Las im�genes se guardaron en formato tiff y se sometieron a an�lisis cuantitativo de la imagen. Finalmente, los valores de brillo se representaron

10 gr�ficamente contra concentraciones de p�ptido para visualizar el intervalo din�mico de detecci�n de la diana. Algunos ant�genos se expresan solamente en cantidades secundarias en el tejido de inter�s. Para conseguir la detecci�n de esas dianas, dicho m�todo puede modificarse de la siguiente manera: Despu�s de a�adir el anticuerpo primario y de la eliminaci�n del anticuerpo no unido mediante una etapa de lavado, se a�ade un anticuerpo secundario espec�fico de especie. Por ejemplo, si el anticuerpo primario es IgG de rat�n, se a�adir�a un anticuerpo

15 anti-rat�n de cabra en la segunda etapa. Despu�s de que el anticuerpo espec�fico de especie se ha eliminado (en este caso la IgG anti-rat�n de cabra), el anticuerpo secundario se detectar�a con Fab marcado de forma fluorescente. Dado que m�s de un anticuerpo anti-rat�n de cabra puede unirse a cada IgG de rat�n, m�s fragmentos Fab fluorescentes se unir�n al complejo de detecci�n.

20 EJEMPLO 9: AMPLIFICACI�N DE LA SE�AL

Algunos ant�genos se expresan solamente en cantidades secundarias en el tejido de inter�s. Para conseguir la detecci�n de esas dianas, los m�todos simplex y multiplex de la invenci�n se modifican de la siguiente manera: despu�s de a�adir el anticuerpo primario y de la eliminaci�n del anticuerpo no unido mediante una etapa de lavado,

25 se a�ade un anticuerpo secundario espec�fico de especie. Por ejemplo, si el anticuerpo primario es IgG de rat�n, se a�adir�a un anticuerpo anti-rat�n de cabra en la segunda etapa. Despu�s de que el anticuerpo espec�fico de especie es eliminado (en este caso la IgG anti-rat�n de cabra), el anticuerpo secundario se detectar�a con Fab marcado de forma fluorescente. Dado que m�s de un anticuerpo anti-rat�n de cabra puede unirse a cada IgG de rat�n, m�s fragmentos Fab fluorescentes se unir�n al complejo de detecci�n.

30 Se ha descubierto que el receptor de andr�genos (AR) es un importante biomarcador para la evaluaci�n de tejido con c�ncer de pr�stata. Para incrementar la intensidad de la se�al obtenida para medir la distribuci�n cualitativa y cuantitativa de estos marcadores en secciones de tejido incluidas en parafina, fijadas con formalina o tejido, se us� el siguiente m�todo, se detectaron de la siguiente manera:

35 1) Recuperaci�n de ant�genos (en soluci�n Reveal)

Para recuperaci�n de ant�genos, secciones de tejido o TMA se calentaron a ebullici�n en soluci�n Reveal 1X (BioCare Medical) (10 cc) en un horno microondas de alta potencia calibrado durante 7 ½ minutos y a continuaci�n

40 se les deja enfriar durante 20 minutos. Despu�s de enfriarse, los portaobjetos se lavaron 3 veces durante 5 minutos en soluci�n salina tamponada por fosfato (PBS).

2) Permeabilizaci�n del tejido

45 Muestras de tejido se permeabilizaron posteriormente en PBS que conten�a Triton-X al 0,2 % (PBT) durante 30 minutos a temperatura ambiente.

3) Eliminaci�n de autofluorescencia

50 La autofluorescencia se redujo incubando los portaobjetos en HCl al 1 %/EtOH al 70 % durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se aclararon a continuaci�n 3 veces durante 5 minutos en PBS.

4) Bloqueo con IgG inespec�fica

55 La uni�n no espec�fica de anticuerpo o fragmento Fab se bloque� mediante incubaci�n con 0,5 μg/ul de BSA en PBT durante 20 minutos en una c�mara h�meda. Los portaobjetos no se aclararon antes de la adici�n del anticuerpo primario a la muestra de tejido.

5) Incubaci�n de anticuerpo primario no tratado en el tejido

60 Anticuerpo receptor de andr�genos monoclonal de rat�n no tratado se incub� en el tejido durante 1 hora a temperatura ambiente en una c�mara h�meda.

6) Eliminaci�n del anticuerpo no unido

El exceso de anticuerpo se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 10 minutos en PBT seguidas por 3 veces durante 5 minutos en PBS. 5 7) Incubaci�n con anticuerpo secundario IgG anti-rat�n de cabra

Se diluy� IgG anti-rat�n de cabra en PBT y se incub� en el tejido durante 20 minutos a temperatura ambiente en una c�mara h�meda. 10 8) Eliminaci�n de IgG anti-rat�n de cabra no unida

El exceso de anticuerpo se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 10 minutos en PBT seguidas por 3 veces durante 5 minutos en PBS. 15 9) Incubaci�n con Fab marcado de forma fluorescente

Fragmento Fab espec�fico de rat�n marcado con Alexa 568 se a�adi� al portaobjetos y se incub� durante 30 minutos a temperatura ambiente en una c�mara h�meda. 20 9.) Eliminaci�n de Fab no unido

El fragmento Fab no unido se elimin� lavando los portaobjetos 2 veces durante 10 minutos en PBT seguidas por 3 veces durante 5 minutos en PBS. 25 10) Fijaci�n

El tejido se fij� en formalina al 10 % durante 10 minutos. Los portaobjetos se aclararon 2 veces durante 5 minutos en PBS. 30 11) Montaje

Despu�s de a�adir 100 μl de soluci�n AntiFade que conten�a contratinci�n nuclear, los portaobjetos se cubrieron con cubreobjetos y se prepararon para la adquisici�n de im�genes. 35 12) Adquisici�n de im�genes

40 dentro de la c�mara al nivel de brillo m�s alto posible sin causar sobreexposici�n. Las im�genes se adquirieron con la c�mara Nikon 1200DXM CCD o un sistema comparable (como alternativa podr�a usarse una c�mara de imaginolog�a espectral para separaci�n espectral avanzada de colorantes fluorescentes). Las im�genes se guardaron en formato tiff y se sometieron a an�lisis cuantitativo de la imagen.

45 EJEMPLO 10: REACTIVOS DE DETECCI�N

La siguiente lista de anticuerpos se han marcado de forma inmunofluorescente con �xito con la t�cnica de marcado secundaria que emplea el marcado con Zenon™ Alexa Fluor de anticuerpos despu�s de que el anticuerpo se ha hibridado con la fuente de tejido. Estos son anticuerpos adecuados para su uso en los m�todos simplex / multiplex

50 de la invenci�n.

TABLA 2 ANTICUERPO COMPA��A FUENTE N� DE CAT�LOGO ISOTIPO

Actina Zymed Laboratories 18-0106 IgG2a de rat�n fosfo-AKT Abcam Incorporated ab4802 IgG de conejo AMACR Zeta Corporation Z2001 IgG de conejo Receptor de andr�genos NeoMarkers (Lab Vision Corp.) NM-MS443 IgG1 de rat�n Bax Abcam Incorporated ab7977 IgG de conejo Bcl-2 DakoCytomation M0887 IgG1 de rat�n Caspasa 3 (activada) Chemicon International, Inc. ab3623 IgG de conejo CD-34 DakoCytomation M7165 IgG1 de rat�n CD-45 DakoCytomation M0855 IgG1 de rat�n Citoqueratina-14 Vector Laboratories VP-C410 IgG1 de rat�n Citoqueratina-18 Vector Laboratories VP-C414 IgG1 de rat�n Ciclina D1 BioCare Medicals CP236B IgG de conejo Ciclina E Vector Laboratories VP-C396 IgG2a de rat�n

e-caderina: Ventana Medical Systems, Inc. 760-2830 IgG1 de rat�n

EGFR: DakoCytomation K1492 IgG de rat�n

pEGFR (YI068): Abcam Incorporated ab5644 IgG de conejo

EMA: DakoCytomation M0613 IgG1 de rat�n

fosfo-ERK: Cell Signaling Technologies ab4376 IgG de conejo

EZH2: Zymed Laboratories 18-7395 IgG de conejo

Her-2/Neu: DakoCytomation A0485 IgG de conejo

KDR: Upstate 07-158 IgG de conejo

fopsfo-KDR: Upstate 07-374 IgG de conejo

Ki-67: Ventana Medical Systems, Inc. 290-2910 IgG1 de rat�n

fosfo-mTOR: Cell Signaling Technologies ab2971 IgG de conejo

p27: Vector Laboratories VP-P951 IgG2a de rat�n

p53: DakoCytomation M7001 IgG2b de rat�n

p70 S6 quinasa: Cell Signaling Technologies ab9430 IgG de conejo

PI3 quinasa: Cell Signaling Technologies ab3821 IgG de conejo

PSA: Ventana Medical Systems, Inc. 760-2506 IgG de conejo

PSMA: Anogen Y-PSMA-1 IgG2a de rat�n

pTEN: NeoMarkers (Lab Vision Corp.) NM-MS1797 IgG1 de rat�n

α-tubulina: Zymed Laboratories 18-0092 IgG1 de rat�n

VEGF: Abcam Incorporated ab1316 IgG1 de rat�n

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un m�todo inmunohistoqu�mico para detectar simult�neamente la presencia o ausencia de al menos tres dianas

en una muestra biol�gica, que comprende las etapas de: 5

(a)

realizar recuperaci�n de ant�genos en la muestra biol�gica, en donde dicha recuperaci�n de ant�genos comprende las etapas:

i. desparafinar y rehidratar la muestra biol�gica; y

ii. llevar a ebullici�n en tamp�n de recuperaci�n de ant�genos;

(b)

realizar reducci�n de autofluorescencia en la muestra biol�gica antes de la etapa (a), la etapa (c) o la etapa (d), en donde dicha reducci�n de autofluorescencia comprende incubar dicha muestra biol�gica en una soluci�n que comprende �cido clorh�drico al 1 % y etanol al 70 %;

15 (c) poner en contacto a la muestra biol�gica con (1) un primer anticuerpo espec�fico para una primera diana, (2) un primer reactivo de marcado en donde dicho primer reactivo de marcado comprende un resto de uni�n al anticuerpo para dicho primer anticuerpo y un primer resto de detecci�n, (3) un segundo anticuerpo espec�fico para una segunda diana, (4) un segundo reactivo de marcado que comprende un resto de uni�n al anticuerpo para dicho segundo anticuerpo y un segundo resto de detecci�n, (5) un tercer anticuerpo espec�fico para una tercera diana, y (6) un tercer reactivo de marcado que comprende un resto de uni�n al anticuerpo para dicho tercer anticuerpo y un tercer resto de detecci�n; y

(d) detectar cada uno de dichos primer, segundo y tercer reactivos de marcado, respectivamente, en dicha muestra biol�gica con lo que la presencia de dichos primer, segundo y tercer reactivos de marcado, respectivamente, indica la presencia de dichas primera, segunda o tercera dianas, respectivamente, en dicha

25 muestra biol�gica y la ausencia de dichos primer, segundo o tercer reactivos de marcado indica la ausencia de dichas primera, segunda o tercera dianas, respectivamente, en dicha muestra biol�gica,

en el que dicha muestra biol�gica es tejido humano incluido en parafina.
2. Un m�todo inmunohistoqu�mico de acuerdo con la reivindicaci�n 1, en el que la etapa (c) comprende:

poner en contacto dicha muestra biol�gica con

i. un primer complejo, que comprende el primer anticuerpo espec�fico para la primera diana y el primer

35 reactivo de marcado en el que dicho reactivo de marcado comprende un resto de uni�n al anticuerpo espec�fico para dicho primer anticuerpo y un resto de detecci�n;

ii. el segundo anticuerpo espec�fico para la segunda diana y el segundo reactivo de marcado en donde dicho reactivo de marcado comprende un resto de uni�n al anticuerpo espec�fico para dicho segundo anticuerpo y un segundo resto de detecci�n; y

iii. el tercer anticuerpo espec�fico para la tercera diana, y el tercer reactivo de marcado que comprende un anticuerpo que comprende un resto de uni�n al anticuerpo para dicho tercer anticuerpo y un tercer resto de detecci�n.
3. El m�todo de la reivindicaci�n 1 o la reivindicaci�n 2, que comprende adem�s la etapa de lavar dicha muestra 45 biol�gica antes de la etapa (c) o antes de la etapa (d).
4.

El m�todo de la reivindicaci�n 1 o la reivindicaci�n 2, en el que dicho resto de uni�n al anticuerpo de al menos uno de dichos primer, segundo o tercer reactivos de marcado es un fragmento de anticuerpo monovalente o una prote�na no anticuerpo.
5.

El m�todo de la reivindicaci�n 4, en el que dicho fragmento de anticuerpo monovalente es un fragmento Fab o Fab'.
6.

El m�todo de la reivindicaci�n 5, en el que dicho fragmento Fab o Fab' se selecciona entre el grupo constituido por

55 un fragmento de anticuerpo anti-Fc, un fragmento de anticuerpo anti-cadena ligera kappa, un fragmento de anticuerpo anti-cadena ligera lambda y un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla.
7. El m�todo de la reivindicaci�n 4, en el que

(a)

dicho fragmento de anticuerpo monovalente se deriva de un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal; o

(b)

dicha prote�na no anticuerpo se selecciona entre el grupo constituido por una prote�na G, una prote�na A, una prote�na L y una lectina.

65 8. El m�todo de la reivindicaci�n 1 o la reivindicaci�n 2, en el que dicha muestra biol�gica tiene al menos 10 a�os de antig�edad.
9. El m�todo de la reivindicaci�n 1 o la reivindicaci�n 2, en el que al menos una de dichas dianas es una prote�na nuclear o una oncoprote�na.
10. El m�todo de la reivindicaci�n 1 o la reivindicaci�n 2, en el que la presencia de al menos una de dichas dianas 5 es indicativa de la heterogeneidad de las c�lulas tumorales.
11. El m�todo de la reivindicaci�n 1 o la reivindicaci�n 2, en el que al menos una de dichas dianas es un receptor de andr�genos, una citoqueratina 18 o una prote�na PTEN.

10 12. El m�todo de la reivindicaci�n 1 o la reivindicaci�n 2, en el que al menos uno de dichos anticuerpos es un anticuerpo monoclonal.
13. El m�todo de la reivindicaci�n 1 o la reivindicaci�n 2, en el que se forma al menos un complejo prote�na de

marcado-anticuerpo dentro de dicha secci�n de tejido. 15
14. El m�todo de la reivindicaci�n 1 o la reivindicaci�n 2, en el que al menos uno de dichos restos de detecci�n se selecciona entre el grupo constituido por un resto fluorescente, un resto radiactivo y una enzima.
15. El m�todo de la reivindicaci�n 1, en el que dicha muestra biol�gica est� sustancialmente libre de �cidos 20 nucleicos antes de dicha etapa de detecci�n.
16. El m�todo de la reivindicaci�n 1, que comprende adem�s la etapa de permeabilizaci�n del tejido antes de la etapa (c).

25 17. El m�todo de la reivindicaci�n 16, en el que dicha permeabilizaci�n del tejido comprende incubar dicha muestra biol�gica en soluci�n salina tamponada por fosfato con Triton-X 100 al 0,2 %.
18. El m�todo de la reivindicaci�n 1 o la reivindicaci�n 2, en el que dicha muestra biol�gica tiene al menos 20 a�os

de antig�edad. 30
19. Un m�todo de detecci�n inmunohistoqu�mica para determinar simult�neamente la concentraci�n o la cantidad de al menos tres dianas en una muestra biol�gica que comprende las etapas de:

(a) realizar recuperaci�n de ant�genos en la muestra biol�gica usando el m�todo de la reivindicaci�n 1; 35 (b) realizar reducci�n de autofluorescencia en la muestra biol�gica usando el m�todo de la reivindicaci�n 1;

(c) poner en contacto a la muestra biol�gica con (1) un primer anticuerpo espec�fico para una primera diana, (2) un primer reactivo de marcado en donde dicho primer reactivo de marcado comprende un resto de uni�n al anticuerpo para dicho primer anticuerpo y un primer resto de detecci�n, (3) un segundo anticuerpo espec�fico para una segunda diana, (4) un segundo reactivo de marcado que comprende un resto de uni�n al anticuerpo

40 para dicho segundo anticuerpo y un segundo resto de detecci�n, (5) un tercer anticuerpo espec�fico para una tercera diana, y (6) un tercer reactivo de marcado que comprende un resto de uni�n al anticuerpo para dicho tercer anticuerpo y un tercer resto de detecci�n;

(d) detectar dichos primer, segundo y tercer reactivos de marcado en dicha muestra biol�gica usando el m�todo

de la reivindicaci�n 1; 45 (e) comparar la cantidad de reactivos de marcado detectados en la etapa (d) con una muestra de control,

en el que dicha muestra biol�gica es una secci�n de tejido humano incluida en parafina y en el que si se ha de determinar la concentraci�n de las dianas, la concentraci�n de dichas primera, segunda y tercera dianas en dicha muestra de control es conocida de modo que la concentraci�n de dicha diana en dicha muestra biol�gica se

50 determina de este modo.
20. Un m�todo de detecci�n inmunohistoqu�mica de acuerdo con la reivindicaci�n 19, que comprende adem�s determinar una diferencia en la cantidad de dichas al menos tres dianas en un tejido de muestra con respecto a la distribuci�n de las respectivas dianas en un tejido normal en donde la etapa (e) comprende:

(i)

detectar las cantidades de las dianas correspondientes en dicho tejido normal usando el m�todo de la reivindicaci�n 1; y

(ii)

comparar las cantidades en dicha muestra biol�gica con dicho tejido normal para determinar una diferencia

de dichas dianas en la muestra biol�gica con respecto al tejido normal. 60
21. El m�todo de la reivindicaci�n 19 o la reivindicaci�n 20, en el que al menos una de dichas dianas es un ant�geno nuclear.
22.

El m�todo de la reivindicaci�n 1 o la reivindicaci�n 2, que comprende adem�s poner en contacto a dicha muestra 65 biol�gica con un anticuerpo espec�fico para una cuarta diana y un cuarto reactivo de marcado.
23. El m�todo de la reivindicaci�n 22, que comprende adem�s poner en contacto a dicha muestra biol�gica con un anticuerpo espec�fico para una quinta diana y un quinto reactivo de marcado.
24.

El m�todo de la reivindicaci�n 23, que comprende adem�s poner en contacto a dicha muestra biol�gica con un 5 anticuerpo espec�fico para una sexta diana y un sexto reactivo de marcado.
25. El m�todo de la reivindicaci�n 24, que comprende adem�s poner en contacto a dicha muestra biol�gica con un anticuerpo espec�fico para una s�ptima diana y un s�ptimo reactivo de marcado.

10 26. Un m�todo de detecci�n inmunohistoqu�mica para determinar la cantidad de al menos tres dianas en una muestra biol�gica de acuerdo con la reivindicaci�n 19, en el que dicha muestra de control es una micromatriz.
27. Un m�todo para el diagn�stico o la monitorizaci�n del avance de una enfermedad que comprende:

15 (a) proporcionar una muestra biol�gica de un paciente, en donde dicha muestra biol�gica es una secci�n de tejido humano incluida en parafina;

(b)

realizar recuperaci�n de ant�genos en la muestra biol�gica usando el m�todo de la reivindicaci�n 1;

(c)

realizar reducci�n de autofluorescencia en la muestra biol�gica usando el m�todo de la reivindicaci�n 1;

(d)

poner en contacto a la muestra biol�gica con (1) un primer anticuerpo espec�fico para una primera diana, (2)

20 un primer reactivo de marcado en donde dicho primer reactivo de marcado comprende un resto de uni�n al anticuerpo para dicho primer anticuerpo y un primer resto de detecci�n, (3) un segundo anticuerpo espec�fico para una segunda diana, (4) un segundo reactivo de marcado que comprende un resto de uni�n al anticuerpo para dicho segundo anticuerpo y un segundo resto de detecci�n, (5) un tercer anticuerpo espec�fico para una tercera diana, y (6) un tercer reactivo de marcado que comprende un resto de uni�n al anticuerpo para dicho

25 tercer anticuerpo y un tercer resto de detecci�n;

(e)

detectar simult�neamente una primera cantidad de cada una de al menos tres dianas en dicha muestra biol�gica usando el m�todo de la reivindicaci�n 1 en un primer momento puntual:

(f)

detectar simult�neamente una segunda cantidad de cada una de dichas al menos tres dianas en dicha muestra biol�gica usando el m�todo de la reivindicaci�n 1 en un segundo momento puntual;

30 (g) determinar una relaci�n de las primeras cantidades y las segundas cantidades de dichas al menos tres dianas en dicha muestra biol�gica y relacionar las relaciones con un intervalo predeterminado como indicativo de un estado de dicha enfermedad.
28. El m�todo de la reivindicaci�n 27, en el que dicha enfermedad es enfermedad de Alzheimer, c�ncer o una 35 enfermedad inflamatoria.
29. El m�todo de la reivindicaci�n 28, en el que dicho c�ncer es un tumor s�lido o en el que dicho c�ncer es leucemia o linfoma.

40 30. El m�todo de la reivindicaci�n 28, en el que dicho trastorno inflamatorio es artritis reumatoide o un trastorno inflamatorio del intestino.
31. El m�todo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 19, 20 o 27, en el que dicha diana se selecciona entre el grupo constituido por receptor de andr�genos, Ki67, Ciclina D1, P-PKC zeta, x-metilacil-CoA racemasa (AMACR),

45 receptor del factor de crecimiento epid�rmico (EGFR), PI3 quinasa (PI3K), factor nuclear Kappa B (NFkB), receptor 2 del VEGF (P-KDR), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), CD34, pAKT y Caspasa 3a.
32. El m�todo de la reivindicaci�n 27, en el que dicha diana es un ant�geno nuclear.

N�CLEO

SIN MEZCLAR

Sin clasificar